CN1033759C - 猪生长激素类似物 - Google Patents

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Abstract

公开了一种猪生长激素的类似物，它保留有猪生长激素的致糖尿病效应，胰岛素节省及脂肪分解特性，同时能够促进动物的生长。

Description

猪生长激素类似物
本发明涉及一类新的猪生长激素类似物。具体地说，本发明涉及重组生产的猪生长激素类似物；其中，缺失对应于天然猪生长激素氨基酸顺序中位置32至38的一个或多个残基。本发明进一步涉及含有这种类似物的组合物，以及使用这种类似物及组合物以增加哺乳动物的生长。
正常的哺乳动物脑垂体生成并向血流中分泌一种称为生长激素(GH)的物质。人的(hGH)、牛的(bGH)和猪的(pGH)生长激素的氨基酸顺序都相类似。见Dayhoff，《蛋白质顺序及结构图集》，第5卷，增刊6，National BiochemicalResearch Foundation，Washington，120—121，1976；和Seeburg et al。，DNA 2：37—45，1983。鲑鱼生长激素(sGH)的氨基酸及核苷酸顺序也是公知的，见Sekineet al.，Proc。Natl.Acad.Sci.USA 82：4306—4310，1985。根据bGH、hGH、oGH、pGH及sGH顺序的排列(这些生长激素具有最高的同源性)，可以确定出高度保守的区域。见Dayhoff，同上；及Sekine et al。，同上，
在活体中，生长激素促进由氨基酸形成蛋白质，开始时导致血浆葡萄糖下降，在初始下降后使血浆葡萄糖缓慢上升，以及使脂肪降解为脂肪酸。与生长激素有关的这些效应分别称为生长促进效应(即增加体重)、胰岛素节省效应、致糖尿病效应及脂肪分解效应。抗脂肪分解的效应也有报道，但这似乎是该激素的类胰岛素活性的一个方面。Goodman，Metabolism 19：849—855，1970。
此外，生长激素在结构上类似于催乳激素，并能诱导同样的效应。例如，hGH与人胎盘催乳激素有大约15％的残基不同。Walliset al。，《生长激素及相关肽》，Pecile et al.，eds.，Excerpta Medica，Amsterdam，1—13，1976。人生长激素有大约25％的残基不同于人催乳激素。Wallis等，同上。皮下注射bGH或重组的bGH(rbGH)会增进奶牛、山羊及绵羊的乳量。Eppaird et al.，J.Dairy Sci.68：1109—1115，1985；Bauman et al.，J.Dairy Sci.68：1352—1362，1985；Hart，Proc.Nutr.Soc.42：181—194，1983；Hart et al。，Biochem.J.218：573—581，1984。
生长激素从脑垂体中的分离涉及溶解与激素生成有关的脑垂体细胞。然而，这些溶解细胞释放的蛋白酶可能至少将部分天然的脑垂体生长激素(nGH)分解成片段。进而，分泌到血流中以后，nGH就要与蛋白酶相接触，这可能使nGH分解成同样或不同的片段。生长激素片段的一个主要研究方面是，确定nGH或其片段或二者，是否都能产生与所提取的或在血流中循环的生长激素相关的活性。在这一点上应当注意，通过化学修饰赖氨酸或精氨酸残基而使hGH类似物具有对胰蛋白酶消化的抗性后，它仍具有显著的(尽管减弱了)生长促进效应、致糖尿病效应及类胰岛素活性。Cameron et al.，Biochem.Biophys.Acta 254—260，1985。不过，nGH分子的独立部分(结构域)被认为导致nGH的一种效应或其他效应。为了用这种方式确定负责nGH这些作用的位置，可以产生片段及类似物，使它们的蛋白合成效应、胰岛素节省效应、致糖尿病效应及脂肪分解效应发生选择性改变。
如下面所用到的那样，将出现在生长激素片段或类似物中的氨基酸残基的位置使用以下标号：用号码表示相应于nGH中相同位置上的残基，用逗号表示缺失。例如，用pGH1—190表示天然的猪生长激素。
可以从脑垂体中分离出来的hGH(22,000道尔顿)的20,000道尔顿的变体(20K)相应于hGH1—31，47—191，它促进垂体切除大鼠的生长，但是在狗中不会促进高血糖或胰岛素过多分泌，在体内或体外既没有胰岛素节省效应，也没有脂肪分解效应，在hGH放射性免疫检测中不及hGH本身反应强烈。Lewis et al.，J.Biol。Chem.253：2679—2687，1978；Frigeri etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.91：778—782，1979；Lewis et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.92：511—516，1980；Lewis et al.，Endocr.Rcs.Commun.8：155—164，1981。该hGH的20K变体是转录后修饰的产物。Lewis et al.，Biochem.Biophys.Res。Commun.，同上。或许是这种情况，hGH的20K变体可能是比能从其体外生物活性预测出的更为重要的生长促进剂，因为它趋向于二聚作用，从而避免了肾降解作用。Baumann et al.，Endocrinology 117：1309—1313，1985。
还公开了包括有从20KhGH中缺失的残基的hGH片段。虽然，这些片段中没有一个有报道促进生长，但某些片段展示出与生长激素致糖尿病分解脂肪特性相关的潜在特性。相应于hGH残基31—44的合成片段在饥饿动物体内和体外具有脂肪分解效应(Yudaev et al.，Biokhimya 41：843—846，1976)，但是仅仅在没有GH的情况下在体外预保温之后(一种非生理状态)才能刺激葡萄糖的吸收(也即胰岛素节省效应)，Yudaev et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.110：866—872，1983。有些hGH的肽类似物是致糖尿病的，而类似物hGH52—57却不是。Lostroh et al。，Diabetes 27：597—598，1978。由hGH20—41组成的肽是缺乏活性的。Reagan，Diabetes 27：883—888，1978。由hGH1—36组成的肽对于血液葡萄糖或者生长没有作用。Chillemi et al.，《生长激素及相关肽》，Pecile et al.，eds.，Excerpta Medica，Amsterdam，50—63，1976。
然而，相应于hGH32—46的肽导致血清中游离脂肪酸的减少，并且，当与胰岛素共同施用于体外(Frigeri et al.，《内分泌学会第64届年会论文集》，San Francisco，101，Abstract88，1982)和体内(Rudman，美专利4,558,033；Stevenson et al.，Diabetes33：149A，Abstract No.572，1984)时，则具有胰岛素节省效应。当与胰岛素共同施用于体内时，hGH32—46片段及类似物(含有异源氨基酸或立体异构体的取代)也具有胰岛素节省效应。Jones等，正待批准和转让中的美国专利申请501,024。
本发明涉及一类猪生长激素的类似物，它们保留有生物活性及天然猪生长激素的特性，同时提高生长速率和饲养效率，增进脂类分解或产乳作用。
具体地说，本发明涉及一种重组的猪生长激素类似物，它含有如下氨基酸顺序：
Z—pGH1—31—(X)n—pGH39—190其中
n是0或1；
Z是氢，MET，ALA或MET—ALA—；及
X是由—Glu—Arg—Ala—Tyr—Ile—Pro—Glu—组成的氨基酸残基的肽，其中，缺失了一个或多个氨基酸；及其等位形式。
本发明进一步涉及具有上述顺序的合成的编码猪生长激素类似物的基因。本发明还涉及构建含有该DNA顺序的可复制的各种克隆载体以及含有该DNA顺序的表达载体，用以在转化细菌或转染细胞系中生产猪生长激素类似物。此外，本发明给出了一种具有上述氨基酸顺序的猪生长激素类似物的编码基因。本发明还包括各种可复制的克隆载体、表达载体以及转化细菌或细胞培养物等；所有这些都含有对于产生本发明猪生长激素类似物必要的各种变化的遗传信息。
本发明的猪生长激素类似物是以相当纯化的形式产生的，因此几乎不存在任何其他的来自猪的蛋白质。猪生长激素类似物可与常规的合适载体和佐剂如其他蛋白质(例如血清清蛋白)制成可以接受的组合物，以促进对宿主动物的有效使用。
本发明还提出了一种促进动物生长的方法，即对动物施用有效剂量的本发明的猪生长激素类似物。
图1是质粒pBR322—Trp—pGH构建的示意图；
图2是质粒pCFM414—Trp—pGH构建的示意图；
图3是寡核苷酸组件的示意图，它们被用来制备Xba1至Apa1的pGH DNA片段，该片段用来构建pGH和pGH—7；以及
图4是用于构建质粒pCFM846—pGH的组分的图示说明。
如上所述，生长激素的生理活性可能归因于完整多肽的不同结构域。这种活性也可能归因于完整多肽的特殊折迭或修饰、调节因子的释放，或归因于其他脑垂体肽的“污染”，例如，α—和β—脂肪酸释放激素，其本身就可能有分解脂肪的活性(Kuhn等，J.Clin。Endocrinol.Metab.56：1338—1340，1983；Frigeri等，Hormone Res.17：197—201，1983)。
从纯化激素的作用中分离污染作用的一种方法，就是检查分离物中来自其他脑垂体成分的生长激素的活性，例如重组的pGH(rpGH)。已经测定pGH基因的顺序，并且以各种形式在原核和真核细胞中进行了表达。Keshet et al.，Nucleic Acids Res9：19—30，1981；Woychik et al.，Nucleic AcidsRes.10：7197—7210，1982；Seeburg et al.，DNA 2：37—45，1983；Kopchick et al.，DNA 4：23—31，1985；George et al.，DNA 4：273—281，1985。
本发明提供了纯化的和分离的多肽产物，它们具有一种或多种天然pGH的生物特性(例如免疫学特性和体外生物活性)和物理特性(如分子量)。这些多肽的特征还在于它们是化学合成方法的产物，或者是外源DNA顺序与原核或真核宿主中(例如培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫及哺乳动物等的细胞)表达的产物，所述DNA顺序通过基因组cDNA克隆或基因合成得到。典型的酵母(如酿酒酵母)或原核(如大肠杆菌)宿主细胞的产物不含有任何哺乳动物的蛋白质。在脊椎动物(如非人类的哺乳动物与鸟类)细胞中的微生物表达产物不含有任何人类蛋白质。根据所用宿主，本发明的多肽可以用哺乳动物或其他真核生物的碳水化合物糖基化，或可以不进行糖基化。本发明的多肽也可以包括起始氨基酸残基蛋氨酸(在—1位置)。
本文所用术语“氨基酸残基的肽”是指包括氨基酸Glu—Arg—Ala—Tyr—Ile—Pro—Glu的肽，其中缺失了一个或多个氨基酸。为了本发明的目的，肽中所述的氨基酸缺失可以是依次的或是随机的。
用于DNA顺序或基因的术语“制备的”是指通过核苷酸碱基组件的完全化学合成或是衍生物的合成。因此，该术语完全排斥通过基因组克隆的cDNA方法“合成”的产物，此方法涉及最初来源于生物的起始物质。
本文所用术语“等位体”是指在不改变类似物生物活性的情况下，对本发明猪生长激素类似物顺序中的一个或多个氨基酸进行修饰。这种等位体很容易为本领域的普通技术人员弄清楚。
应当注意，如果Z是Met—Ala，则最好在加工时去掉Met残基，从而产生Z是Ala的类似物。本发明最佳的猪生长激素类似物是含有公式(I)的猪生长激素类似物，其中n是0，Z是Ala。本发明另一个最佳的猪生长激素类似物是含有公式(I)的猪生长激素类似物，其中的n是1，Z是Ala，而X是具有残基—Glu—Arg—Ala—Glu—(“Ala—pGH1—34，38—190”)的顺序。
本发明另一个最佳的猪生长激素类似物是含有公式(I)的类似物，在此n是1，Z是Ala，而X是一个具有残基—Glu—Arg—Tyr—Ile—Glu(“Ala—pGH1—36，38—190”)的顺序。本发明还有一个最佳的猪生长激素类似物是含有公式(I)的类似物，其中的n是1，Z是Ala，而X是一个具有残基—Glu—Ala—Tyr—Ile—Pro—Glu—(“Ala—pGH1—32，34—190”)的顺序。
表1表示天然pGH的氨基酸顺序。
本发明的组合物及方法使用有效剂量的本发明的猪生长激素类似物。本文所用术语“有效剂量”的猪生长激素类似物，是指给动物施加的猪生长激素的量能够促进生长或某些相关特性，即饲养效率、增长瘦形躯体结构和产乳等。这种有效的剂量，本领域内的普通技术人员是很容易弄清楚的。
以下几个实例用作对本发明的实施方案作出进一步的说明。实例1
由1g猪脑垂体得到60μg poly A RNA。通过Okayamaet al.，Mol.Cell.Biol。2：161(1982)描述的方法，由此poly A RNA产生cDNA，并转化至感受态大肠杆菌HB1011中。用32P—标记的缺口翻译的493bp PvuII cDNA bGH探针筛选五千个集落。在杂交的200个集落中，使5个通过第二级筛选，DNA分离及限制酶谱的测定。2个分离物含有大约900bp的pGH cDNA顺序(1，4)，三个含有大约700bp(2，3，5)。
使1号克隆通过m 13DNA顺序测定，然后转移至pBR322—Trp表达载体中。为了完成这种构建，在靠近插段5′端的HaeII位点以及在克隆1的pBR322区域中cDNA插段3′端之外的HaeII位点切断来自克隆1的质粒DNA，产生一个1100bp的片段。这个1100bp片段用S1核酸酶处理，在其两端与XbaI平头连接子相连。然后将XbaI接头的DNA片段连接到pBR322—Trp表达质粒中；它可以用XbaI进行剪切(图1)。
                           表1
                                                               -10                                  -1pGH                       ACC TCC GTG CTC CTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG CCC TGG ACT CAG GAG GTG GGA GCC
                      thr set val leu leu ala phe ala leu leu cys leu pro trp thr gln glu val gly ala
                                      10                                      20IGH   TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC AGC CTA TTT GCC AAC GCC GTG CTC CGG GCC CAG CAC CTG CAC CAA CTG GCT GCC
  ple pro ala met
Figure C8810202300121
leu ser ser leu phe ala ash ala val leu arg ala glt his leu his gln leu ala ala
                  30                                        40                                      50pGH   GAC ACC TAC AAG GAG TTT GAG CGC GCC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGG TAC TCC ATC CAG AAC GCC CAG GCT GCC
  asp thr tyr lys glu phe glu arg ala tyr lle pro glu gly gln arg tyr ser sle gln asn ala gln ala ala
                                      6O                                      70pGH   TTC TGC TTC TCG GAG ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG GAC GAG GCC CAG CAG AGA TCG GAC GTG GAG CTG CTG
  phe cys phe set glu thr lie pro ala pro thr 9ly lys asp glu ala gln gln arq ser asp val glu leu leu
                  80                                      90                                      100pGH   CCC TTC TCG CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTC GGG CCC GTG CAG TTC CTC AGC AGG GTC TTC ACC AAC AGC CTG
  arg phe set leu leu leu lle gln ser trp leu gly pro va1 gln phe leu set arg val phe thr ash ser leu
                                      110                                     120pGH   GTG TTT GGC ACC TCA GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG GGC ATC CAG GCC CTG ATG CGG GAG
  val phe gly thr ser asp arg val tyr glu lys leu lys asp leu glu glu gly ile gln ala leu net arg glu
                  130                                     140                                     150pGH   CIG GRA GAT GGC AGC CCC CGG GCA GGA CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACA AAC TTG CGC AGT
  leu glu asp gly ser pro arg ala gly gln tle leu lys gln thr tyr asp lys phe asp thr ash leu arg ser
                                      160                                     170pGH   GAT GAC GCG CTG CTT AAG AAC TAC GGG CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC CTG CAC AAG GCT GAG ACA TAC CTG
  asp asp ala leu leu lys asn tyr gly leu leu set cys phe lys lys asp leu his lys ala glu thr tyr leu
                  180                                     190pGH   CGG CTC ATG AAG TGT CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC TGT GCC TTC
  ars val net lys cys arg arg phe val glu set ser cys ala phe
该XbaI平头连接子给出一个5′XbaI位点和3′平头端，以及ATG起始密码子。
        XbaI
5′CTAGAGAATGGC 3′
3′    TCTTACCG 5′
使上述的表达质粒进行PruII及EcoRI消化以释放出355bp的Trp/pGH片段，从而去掉3′端的polyA尾巴。将PvuII—BamHI连接子连接在PvuII切断的3′端，然后再使它与用限制酶EcoRI及BamHI切断的pCFM414表达质粒连接起来(图2)。
该PvuII—BamHI连接子含有二分之一的PvuII位点、一终止密码子(TAA)和一个BamHI位点。
      PvuII          BamHI
5′CTGCGC ATTC TAA G        3′
3′GACGCG TAAG ATT CCTAG    5′
根据顺序测定数据，如同上述的寡核苷酸顺序(pGHwt，pGH—7)那样化学合成两个不同的双链(ds)。使三个DNA的每一个都在5′端上有一个XbaI限制位点，在3′端有一个ApaI限制位点。紧邻ApaI位点的下游加上一个HindIII位点，以利于克隆入mp19噬菌体中。
以下实例中简述的用来构建基因的方法，一般来讲，已在Alton等人共同申请的PCT专利申请WO83/04053中所公开，本申请将它作为参考文献。将这些基因设计成寡核苷酸组分的最初组件以组成多重双螺旋，然后将它们组装成独立的区段。将这些区段设计成易于扩增，并且从该扩增系统中移出来后，能够在合适的表达载体中通过多重的片段连接依次进行组装。实例2
以并行方式构建两个猪生长激素的基因片段。一个基因片段(片设1—pGHwt)含有22K猪生长激素基因顺序，正象由cDNA顺序推测出来的那样。编码22K猪生长激素顺序的第二基因片段(片段2—pGH—7)在“缺失肽”(DP)区域内减去7个氨基酸(以下称21K猪生长激素)。寡聚体15、16、17和18填充了pGH—7中DP编码区起始与终止端之间的空挡，并且编码加入此基因形式中的氨基酸。为这两种基因形式所共有的寡核苷酸片段是1、2、3、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16和18(图3)。
构建两个基因片段所需的这20个寡核苷酸在ABI DNA合成仪上合成，并且用标准的凝胶电泳法纯化，它们列于表2中。将每个纯化的寡核苷酸(低聚的)溶于1ml TE(10mM Tris—HCLpH7.2，0.1mM EDTA)中，并且测定260nm处的吸光度。将吸光度与该寡聚物计算所得的消光系数相比较，从而计算出摩尔浓度。然后，用每微升多少微微摩尔的浓度测定构建基因的各种寡聚物。例如1号寡聚物，它是含有13个腺嘌呤，8个胞嘧啶，9个鸟嘌呤及9个胸腺嘧啶的39聚体，它在260nm处所计算出的消光系数是444700。它在260nm处测定的吸光度为0.379，因此其浓度是0.852微微摩尔/微升。这些寡聚物用Eppendorf氏吸管定量吸入Eppendorf氏试管中。所用的量为对每种要构建的基因片段分配100微微摩尔的每种寡聚物。因此，要使用200微微摩尔的寡聚物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16和18，因为它们对两种基因的构建来说是共同的。要使用100微微摩尔的寡聚物15、17、19和20，因为发现它们仅仅在一个基因构建体中才有。定量的寡聚物进行加速真空干燥，然后用150微升的80％乙醇，20％水再进行干燥。
对这些寡聚物选择性地进行磷酸化，使得最后处在完成的基因构建体终端的寡聚物不会自动连接。因此，寡聚物1及14不被磷酸化，而所有其他的寡聚物都要进行磷酸化。在由50mM HEPESpH7.6，10mM氯化镁及10mM二硫苏糖醇组成的连接缓冲液“LB”中进行所有的激酶反应及连接反应(将LB以10倍浓度的溶液贮存起来，即10×LB，需要时用水稀释)。将寡聚物1及14都溶于60微升的LB中，并在以后需用它之前放置在冰上。
所制备的激酶混合物含有：92μl10×LB，20μl多核苷酸激酶(Boehringer—Mannheim，10单位/微升)，1μl10mM ATP(在TE中)，0.25μl 32P—γ—ATP(它含有80,000,000Cpm的放射性)，810μl水。
该激酶混合物的总量是920μl。将混合物加到干燥的寡聚物中，每100微微摩尔要被磷酸化的寡聚物加20μl。将寡聚物2、3、5、6、7、8、9、10、12、13、16和18(每种都是200微微摩尔)的每一种都溶于40μl激酶混合物之中。将寡聚物15、17、19及20(每种都是100微微摩尔)溶于20μl的激酶混合物之中。然后，所有这些装有溶于激酶混合物中的寡聚物试管在37℃下保温45分钟。从每个试管中取出0.25μl的等分量，分别点在DE—81纸条上。然后，把DE—81纸条在层析箱中用0.35M甲酸铵缓冲液洗脱，直到溶剂前沿达到下垂纸条的底部为止。然后，将这些纸条从箱中取出，放在100℃的干燥炉内烘干，将它们切成纸片后在液闪计数器(Beckman LS800)中分析。这些纸条被切成其中的一片仅含有原点，而另一片含有DE—81纸条的其余部分。然后，将来自DE—81纸条的这些片段放入塑料计数瓶中，并用LS—6800进行干燥计数。计数表明，在每个纸条的原点上掺入有放射性，因而用大为过量的冷ATP追踪其磷酸化反应。再在每个磷酸化反应中加入1μL的10mM ATP，并在DE—81分析之后，使这些试管在37℃下再保温45分钟。然后，使所有试管中的寡聚物(包括未被磷酸化的及14)煮沸5分钟，然后快速冷却。这种处理可破坏激酶。
      1＋8
      2＋9
      3＋10
      5＋12
      6＋13
      7＋14
     15＋17
     16＋18
     19＋20
每个双螺旋取寡核苷酸对中第一个寡聚物的号码。使试管1、2、3、5、6、7、15、16及19混合，煮沸5分钟，然后慢慢冷却至室温。
然后，再使这些退火的双螺旋形成四聚体：
      3＋2
    5＋6
这些四聚体分别取其对中第一试管的号码，即3和5。对每个含有四聚体3和5的试管加进5μl的10mM ATP(产生大约200μM的ATP浓度)。这些四聚体在37℃下退火10分钟。每个试管再加入5μl的连接酶(Boehringer-Mannheim，1单位/微升)。连接反应在37℃下保温5分钟，然后在冰上放一小时。
双螺旋16的一半与双螺旋15结合，而其余的一半与双螺旋19结合。对这些四聚体的每一个加进2μl 10mM ATP。这些四聚体在37℃下退火10分钟，然后每个试管加入2μl连接酶。这些混合物在37℃下保温5分钟，然后在冰上放1小时。
加进更多的双螺旋以产生更长的双螺旋：双螺旋7加到四聚体5上产生六聚体5；双螺旋1加到四聚体3上产生六聚体3；把2.5μl 10mM ATP和2.5μl连接酶加入这些六聚体中。然后，再将这两个试管混合，在37℃下保温10分钟，然后在冰上放一小时。
将三分之一的六聚体5加进分别含有中心寡聚物pGH—7及pGH的试管15及19中。再使试管15及19在37℃下保温10分钟，然后在冰上放2小时。然后，在试管15及19中都加进1/2的六聚体3。对于所有需用于构建的寡聚物，每个试管中都加入10mMATP和5μl连接酶。使含有连接混合物的试管在37℃下保温10分钟，然后于4℃放置5天。
从三种连接物中各取出5μl，在0.75mm厚的分析聚丙烯酰胺凝胶(5％，7M尿素)上进行检测。使32—P标记的HpaII切割的pBR322在邻近泳道上作为标准。把来自每个连接物的等分量以及HpaII标准稀释入20μl80％甲酰胺和20％水中，其中含有0.1％二甲苯苯胺和溴酚蓝(80％甲酰胺加染料)。将这些样品煮沸5分钟，很快放在冰上冷却后加到凝胶上。在400伏下使凝胶电泳45分钟(直到溴酚蓝到达凝胶条底部为止)，然后从玻璃平板中取出，包在Saran Wrap中，再把它放入带有一张DupontCronex X—射线胶片的底片盒中。在-70℃下曝光，使底片显影后便可在放射自显影照片上目测观察到连接的DNA。泳道15上是对应于272bp双螺旋的一个带。泳道19上是对应于293bp双螺旋的一个带。这就表明每种连接物分别对pGH—7和pGH都产生一些所需的DNA构建体。
根据分析凝胶的结果，用大规模凝胶纯化制备三种连接混合物。每种连接物用40μl 3M醋酸钠和1ml 100％乙醇作乙醇沉淀，并在-70℃下冰冻过夜。以10,000xg离心10分钟后，去掉上清液以分离出DNA沉淀，然后用100μl冰冷的80％乙醇进行漂洗。使洗过的沉淀进行快速真空干燥。然后，每种沉淀溶于80μl加有染料的80％甲酰胺中。把它们煮沸5分钟，然后放在冰上快速冷却。然后把每种连接混合物的1/2加在3mm厚的含有7M尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶上。使凝胶在250伏至300伏下电泳2小时。然后，将凝胶放入底片盒，于室温下进行放射性自显影以目测电泳带。然后，将显影过的胶片放在盒中的凝胶旁，标记每个泳道中对应于完全连接的基因片段的带位置，并用安全刀片将所需带从凝胶上切下来。然后，通过3ml注射器(无针头)把凝胶切片挤入Eppendrf氏试管中，从而将每个凝胶片粉碎。再用0.7ml的凝胶洗脱缓冲液(0.5M醋酸铵，0.01M醋酸镁，0.001MEDTA和0.1％醋酸铵，0.01M醋酸镁，0.001M EDTA和0.1％十二烷基磺酸钠)淹没每个粉碎了的凝胶切片，并在37℃下保温过夜。
使凝胶一溶液混合物通过注射器筒中的玻璃纤维滤片过滤，然后用n—丁醇洗涤3次。通过加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，在-70℃下存放一小时。以1000xg离心10分钟，倾出上清液以分离沉淀。使这些沉淀进行快速真空干燥5分钟。将它们再溶于200μl TE中，通过离心沉淀浓缩聚丙烯酰胺残质，随后用20μl 3M醋酸钠和550μl 100％乙醇沉淀。干燥的DNA沉淀用液闪计数器计数。发现每个基因片段含有大约1微微摩尔的DNA。
将每种DNA沉淀再溶于20μl含有2μl 10×LB及1μl放射性标记的ATP(每微升30,000,000cpm)的溶液中。从每个试管中取出0.25μl的等分量点在DE—81纸条上。每个试管再加入1μl多核苷酸激酶，并于37℃保温30分钟。从磷酸化反应取出0.25μl的等分量点在另一组DE—81纸条上。然后，六个纸条用0.35M甲酸铵洗脱，比较它们的原点所保留的放射性强度。对于每种双螺旋在DE—81纸条的前后比较说明，已经发生了磷酸化反应，因此用1μl 10mM ATP追踪每个反应以完成该反应。在37℃下保温45分钟后，将这些试管煮沸5分钟，然后慢慢冷却到室温。在连接缓冲液中退火的磷酸化双螺旋备用于连接入适当的克隆载体中。
将每个合成的pGH构建体克隆入M13mp19中之后，分离单链(ss)及双链(ds)DNA。测定ss DNA的顺序。采用dsDNA作为XbaI至ApaI的ds DNA片段的来源，它含有三个不同的pGH构建体的5′部分。
                      表21  5′-    CTAGAAGGAGGAATAACATATGGCTTTTCCAGCAATGCC  -3＇2  5′-   TCTCTCGAGCCTGTTCCCTAACGCTGTACTGCGTGCTCAG  -3＇3  5′-        CACCTGCATCAACTGGCTGCAGACACTTACAAAGA  -3＇5  5′-         TCCCGGCGCCAACTGGTAAAGACGAAGCTCAACA  -3′6  5′-            GAGATCTGATGTTGAACTGCTGCGTTTCTCT  -3′7  5′-         CTGCTGCTGATTCAATCTTGGCTGGGGCCCTTCA  -3＇8  5′-    GAGAGGCATTGCTGGAAAAGCCATATGTTATTCCTCCTT  -3′9  5′-  AGGTGCTGAGCACGCAGTACAGCGTTAGCGAACAGGCTCGA  -3＇10  5′-         GAATTCTTTGTAAGTGTCTGCAGCCAGTTGATGC  -3′12  5＇-         TCTCTGTTGAGCTTCGTCTTTACCAGTTGGCGCC  -3′13  5′-            GCAGAGAGAAACGCAGCAGTTCAACATCAGA  -3′14  5′-         AGCTTGAAGGGCCCCAGCCAAGATTGAATCAGCA  -3＇15  5′-                     ATTCGGTCAGCGTTACTCTATC  -3＇16  5′       CAGAACGCTCAGGCTGCATTTTGCTTCTCTGAAACCA  -3＇17  5′                     TTCTGGATAGAGTAACGCTGACC  -3′18  5′        GGGATGGTTTCAGAGAAGCAAAATGCAGCCTGAGCG  -3′19  5′ ATTCGAACGTGCTTACATCCCGGAAGGTCAGCGTTACTCTATC  -3′20  5′TTCTGGATAGAGTAACGCTGACCTTCCGGGATGTAAGCACGTTC  -3′
为了构建pGH表达载体，需要三种方式的DNA连接(图4)。组分1是从三个pGHmp19DNA之一中分离出的XbaI至ApaI的ds DNA。组分2是从pCFM414pGH载体中分离出来的含有pGHwt基因3′的ApaI至BamHI的ds DNA片段。组分3是用XbaI及BamHI切割的pCFM846质粒。pCFM846质粒是pCFM836(见下述)的衍生物，它是在pCFM836的单一ClaI与KpnI位点之间插入如顺序而制备的：
5′CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTAC  3′
3′  TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGC      5′
质粒pCFM836是作为pCFM536(ATCC39934)的衍生物而制备的，即通过构建以掺入卡那霉素抗性标记、合成的P1启动子、一串新的限制性克隆位点、以及在所有三个读码框中的一系列用以终止翻译的翻译终止顺序。通过用SstI与XbaI消化pCFM536而首先删除β—内酰胺酶基因。这不仅用作删除标记基因，而且也删除整个“Par”或稳定顺序、P1启动子、以及部分限制位点簇。卡那霉素基因顺序可以作为Tn5质粒的SmaI至HindIII片段得到(Becket al.，Cold Spring Karbor Symp.Quant。Biol.45：107—113，1981)。为了制备用于插入新载体的片段，在SmaI位点加入SstI连接子，在HindIII位点加入NdeI连接子。通过位点特异性诱变破坏卡那要素抗性基因中天然的NcoI限制位点，即使卡那霉素抗性基因羧基端亮氨酸上游的氨基酸残基76蛋氨酸密码子发生诱变，并使ACC密码特异性地变成ACT密码。“Par”位点顺序可作为pSC101(ATCC37032)的HincII至AvaI消化片段得到。为了制备用于插入新载体的“Par”片段，首先用SalI连接子处理HincII，然后用AatII连接子处理。用BamHI连接子处理AvaI位点，然后用NdeI连接子处理。把含有化学合成得到的合成P启动子的DNA顺序或带有用于括在AatII限制位点与XbaI限制位点之间的粘性末端的ds DNA寡核苷酸按如下加入：为了在所有3种框架中加入翻译终止密码子，用BamHI切割质粒，并插入下述ds寡核苷酸：
5′GATCCGCGGATAAATAAGTAAC        3′
3′    GCGCCTATTTATTCATTGCTAG    5′
连接之后，将每一种构建体转化入大肠杆菌FM6中。FM6是AM7(CG608159)的衍生物，它已被赋予对好几种未知噬菌体的抗性，并且含有编码四环素抗性的基因，以及λ噬菌体阻遏物基因，CI857和Cro，而且是整合在染色体中。
转化之后，挑出每种pGH的代表性克隆。分离共价闭合的环状(CCC)质粒DNA，并且用碱变性CCC法测定顺序。表3给出了21KpGH合成部分的顺序。
                         表3
                6         16         26         36         46
           CTAGAA GGAGGAATAA CATATGGCTT TTCCAGCAAT GCTTCTCTCG
               TT CCTCCTTATT GTATACCGAA AAGGTGGTTA CGGAGAGAGC
    56         66         76         86         96        106AGCCTGTTCG CTAACGCTGT ACTGCGTGCT CAGCACCTGC ATCAACTGGC TGCAGACACTTCGGACAAGC GATTGCGACA TGACGCACGA GTCGTGGACG TAGTTCACCG ACGTCTGTCA
   116        126        136        146        l56        166TACAAAGAAT TCGGTCAGCG TTACTCTATC CAGAACGCTC AGGCTGCATT TTGCTTCTCTATGTTTCTTA AGCCAGTCGC AATGAGATAG GTCTTGCGAG TCCGACGTAA AACGAAGAGA
   176        186        196        206        216        226GAAACCATCC CGGCGCCAAC TGGTAAAGAC GAAGCTCAAC AGAGATCTGA TGTTGAACTGCTTTGGTAGC GCCGCGGTTG ACCATTTCTG CTTCGAGTTG TCTCTAGACT ACAACTTGAC
   236        246        256        266        276CTGCGTTTCT CTCTGCTGCT GATTCAATCT TGGCTGGGGC CCTTCAGACGCAAAGA GAGACGACGA CTAAGTTAGA ACCGACCCCG GGAACTTCGA实例3
此外，通过定位诱变可以构建四个另外的pGH类似物。首先，将来自846pGH 22K的XbaI至BamHI小片段克隆入M13mp10中，分离单链的噬菌体DNA。合成每种类似物的引物并用激酶处理，然后与单链DNA退火。加入四种dNTP、ATP、T4 DNA连接酶和Klenow酶，以合成含有所想要的变化的DNA的第二链。将该DNA转染入宿主菌株中，通过平板培养挑出JM103及空斑。与类似物顺序的32P—标记的引物杂交以决定正确的隆。由双脱氧测序法进一步确定这些顺序，并且将来自M13mp10的XbaI至BamHI片段回克隆到p846中。用于这些克隆的引物列表如下：
类似物1：(Tyr，Ile.Pro)TCGAACGTGCTGAAGGTCAGCG
类似物2：(Pro)GTGCTTACATCGAAGGTCAGCG
类似物3：(Arg)CAAAGAATTCGAAGCTTACATCCC第四个克隆(—Glu，Arg……Glu—)需要两个依次的定位诱变。第一个引物(A)将去除Glu，Arg。在此定位诱变之后，纯化单链DNA，然后用将去除第二个Glu的第二个引物(B)进行第二轮定位诱变。
类似物4的引物：
A TACAAAGAATTCGCTTACATCCCG
B CTTACATCCCGGGTCAGCGTTA实例4
对22K及21K都完成发酵过程。使细胞密度达到65的光密度。所形成的猪生长激素或其类似物的量从50至75mg/ODL(3—3.9mg/L)不等。
用大肠杆菌FM6/pCFM856pGH#3(带有22KpGH)以及#8(带有21KpGH)进行发酵。上述每一种都有一个轻易可得的质粒(Walkaway Plasmid)及检查质粒稳定性的卡那霉素药物标记。
         表1    培养基组成成分                批量(8L)            投入(3L)酵母膏                40g                 400g(NH4)2SO4         30g                 15gK2HPO4             56gKH2PO4             64gDow P—2000           2ml葡萄糖                40g                 1300g(MgSO4—7H2O)(1M)  32ml                103ml微量金属溶液          16ml                28ml维生素溶液            16ml                28ml卡那霉素              20μg/ml
发酵在限制碳的情况下以分批方式进行。保持30℃的温度及pH7。溶解氧保持在50％的空气饱和度下。按一定间隔取样以测定生长及乙酸盐水平。采用考马斯亮蓝染色SDS—PAGE以测定pGH浓度。由于得不到纯的pGH，因此用纯的bGH和IFN—aCon作为标准。用Shimodzu积分仪/扫描器扫视凝胶，并且用两个标准的平均值计算pGH浓度及占总蛋白的百分比。
在—25OD下把温度提高到42℃以诱导细胞，并在显微镜下观察其包含体。在诱导大约3—4小时之后，这些细胞含有1—2个内含体。在两种类似物的操作中，在预保温的样品中未发现有pGH。对于野生型(22K)及类似物(21K)，其结果示于表4和表5中。
如在这些表中说明的那样，22KpGH得到了pGH的最大产量(70—75mg/ODL)。对于21KpGH类似物，似乎类似物的产量随着OD达到最大值，然后随着OD的下降而递减，这可能是由于蛋白分解作用造成的。这说明在诱导之后的5—6个小时，可能是停止发酵的最佳时间。实例5
对于重组产生的类似物的生物活性，采用脑垂体衍生的猪生长激素作为标准，通过切除垂体的大鼠于十天内的体重增加的生物检测来进行评价。
将本发明的21KpGH类似物及脑垂体衍生的pGH(pd—pGH)制剂，对切除脑垂体的雌性大鼠，在12天的驯化期之后的0—9天进行皮下注射，每天两次，每次3份0.1ml的剂量。使冷冻干燥的pd—pGH制剂配入pH9.5的碳酸氢盐缓冲液(30mM)中，从而产生浓度为1mg/ml的母液。如同所有的重组样品一样，在“世界卫生组织”(WHO)缓冲液(0.2％乳糖，0.2％甘露糖醇，30mM NaHCO3，pH8.6)中将母液稀释为300，100和30μg/ml。在实验期间，把这些样品贮备在4℃下。取测试材料的等分试样测定蛋白质。
          表4.野生型pGH(22K)的凝胶结果发酵时间(小时)   OD        总蛋白的百分比 mg pGH/ODL开始    18.5     25.4         诱导前—2       6—10诱导    21.0     43.0            10—15       30
    23.0     47.0            20—25       35—40
    25.5     48.5            30           65
    27.5     52.7            30—35       70—75
          表5.pGH类似物(21K)的凝胶结果
发酵时间(小时)    OD     总蛋白的百分比  mg pGH/ODL开始    18.5          24.8    诱导前—0       0—可忽略诱导    21.0          48.0    20              45
    23.0          63.0    25—30          65
    25.5          57.2    30—35          65—70
    27.5          58.3    30—35          60—65化学分析
通过蛋白质的化学分析，发现pd—pGH仅含有85％的pGH单体；因而在冷冻干燥材料的重量基础上施以1.18倍的剂量。采用在WHO缓冲液中的BSA作为标准，借助于Bradford检测法分析所有注射液的蛋白质含量。为了协调所期望的蛋白质浓度，这些制剂有所不同(表6)。由于没有通过消光系数测定pGH注射剂蛋白质浓度的精确方法，因此根据Bradford的结果采用实际使用的剂量。体重的增加
所有的制剂都以剂量相关的方式加速体重增加的速率。因此，通过第0天到第10天实际体重的变化评价其生物反应。本发明的21KpGH类似物在较低的二次剂量下，能诱导出比重组22KpGH及pd—pGH更大的体重增加。最高的21KpGH类似物剂量不能进一步刺激体重的增加；这可能是因为较低的剂量就已经达到了增长的最大速率。表7列出了实际体重的变化。表8示出了每种制剂的相对效力，这是用脑垂体标准的回归系数，通过剂量(对数)对体重变化的线性回归分析而测定的。
 表6.生长激素注射剂的蛋白质浓度样品             理想值    实际值(Bradford)pd—pGH          353       360
             118       118
             35        35pGH(21K类似物)   300       342
             100       127
             30        35pGH(21K类似物)   300       396
             100       138
             30        36pit—bGH“标准”    300       329
             100       109
             30        31
         表6(续)样品              理想值     实际值(Bradford)pGH(21K类似物)      300         314
                106         104
                30          29pGH(21K类似物)      300         268
                100         90
                30          24*仅估计85％重量的pGH单体
              表7.根据Bradford法(蛋白质)
              脑垂体及重组的猪生长激素
          切除垂体大鼠的体重增加的测定TRL031—017
           (体重的变化，克平均值+/-平均标准误差)剂量     缓冲液     pit—bGH标准    22KpGH         21KpGH(μg/鼠/天)              (脑垂体)0       1.5±0.67.0                  14.3±0.7      13.9±1.17.2                                                20.7±1.123.6                  19.4±0.825.4                                 23.6±1.227.6                                                28.4±1.268.4                                 30.2±22
                     表7(续)剂量        缓冲液     pit—bGH标准     22KpGH     21KpGH(μg/鼠/天)                 (脑垂体)72.0         30.2±1.679.2                                                29.6±3.9
          表8生长激素制剂的相对效力当量
               (平均值±平均标准误差)参考制剂          样品        对于参考制剂的相对当量pit—bGH“标准”  pit—bGH“标准”1.01±0.05pit—bGH“标准”  22KpGH          1.06±0.01pit—bGH“标准”  21KpGH          1.40±0.15
虽然在此只根据最佳实施方案描述了本发明，但可以设想本领域内的技术人员根据在此公开的构思一定可能作出种种变更和改进。因此，在这里用附后的权利要求概括本发明申请保护范围的这种等价构思。

Claims (7)

1.一种生产包括下面的氨基酸顺序及其等位体的猪生长激素类似物的方法：
Z—pGH1-31—(X)n—pGH39-191其中，n是0或1；
Z是氢、Met、Ala或Met或Ala；以及
X是包括氨基酸残基—Glu—Arg—Ala—Tyr—Ile—Pro—Glu—的肽，其中，缺失了一个或多个氨基酸；该方法包括下列步骤：分离编码具有所述氨基酸序列的猪生长激素类似物的DNA序列，构建包含所述DNA序列的表达载体，用表达载体转化或转染宿主和在转化或转染的宿主中表达DNA序列以产生具有所述氨基酸序列的猪生长激素类似物。
2.根据权利要求1的方法，其中n是0。
3.根据权利要求2的方法，其中Z是Ala或Met—Ala。
4.根据权利要求3的方法，其中Z是Ala。
5.根据权利要求1的方法，其中n是1，X是
—Glu—Arg—Ala—Glu—；
Ala—Tyr—Ile—Pro—；
—Glu—Arg—Ala—Tyr—Ile—Glu—；或
—Glu—Ala—Tyr—Ile—Pro—Glu—。
6.根据权利要求5的方法，其中Z是Ala或Met—Ala。
7.根据权利要求6的方法，其中Z是Ala。
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