CN1193914A - 防止血小板生成素(tpo)吸附的方法及含tpo的稳定组合物 - Google Patents

防止血小板生成素(tpo)吸附的方法及含tpo的稳定组合物 Download PDF

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Abstract

一种含TPO的组合物,它包含不具有糖链部分的TPO蛋白和至少一种药用添加物,所述添加物选自蛋白、纤维素衍生物、硫酸化多糖、表面活性剂、聚乙烯醇、聚乙二醇和氨基乙酸;一种应用含上述添加物的组合物来防止TPO被容器壁吸附的方法,由此可防止因吸附而造成的滴度降低。

Description

防止血小板生成素(TPO)吸附的方法 及含TPO的稳定组合物
                       发明背景
1.发明领域
本发明涉及一种稳定组合物，该组合物包含不具有糖链部分的TPO蛋白，更具体地说，本发明涉及含TPO的稳定组合物，该组合物可有效地防止作为活性成分的TPO的损失或滴度降低，所述损失或滴定降低是由于容器壁的吸附或TPO间的缔合或聚合等引起的。本发明还涉及防止由容器壁吸附所引起的TPO滴度减少的方法，所述容器装有本发明的组合物。
2.相关技术的公开
人类TPO(血小板生成素)是作为细胞因子受体超家族的成员之一Mpl的配体而被克隆的一种蛋白(de Sauvage等，自然(伦敦)，369卷，533-565(1994)；Bartley，T.D.等，细胞，77卷，1117-1124(1994))。在患有血小板减少症的动物(如人，鼠，狗等)的血清和血浆中可检测到Mpl配体，已经证实该配体与巨核细胞和血小板的生成有关。
为了开发一种用于治疗血小板减少症的药剂，本发明人通过测定其刺激大鼠骨髓中高度纯化的巨核细胞祖细胞生成巨核细胞的活力，从患有血小板减少症的大鼠的血浆中提纯了大鼠TPO，并且成功地克隆了大鼠TPO的cDNA及基于部分氨基酸序列的人类TPO的cDNA，通过重组DNA技术获得了大量的同源人类TPO(H.Miyazaki等，实验血液学，22卷，838(1994))。这样获得的人类TPO的氨基酸序列与上面所提到的以人类Mpl配体得到的因子的序列一致(参见后文描述的SEQ ID NO：1)。
本发明人发现本发明的TPO对治疗血小板减少症是有效的，因为当将人类TPO施用给患血小板减少症的小鼠时，观察到抑制血小板减少的效果，增强血小板生成的效果和增加的造血功能，所述小鼠发生骨髓抑制，该抑制是由施用制癌剂或免疫抑制剂或放射线或BMT诱导的。
因为TPO的活性高，所以它可以极小量地应用，即它作为活性成分通常每天施用几次，剂量为0.05μg/kg体重-1mg/kg体重，优选0.5μg/kg体重-50μg/kg体重，依病情、性别和施用途径而不同。因此，有必要用极小量的TPO制备包含TPO的药物制剂，但是在这种情况下不可避免地出现因容器(例如小瓶、安瓿等)的吸附而引起TPO的滴度下降，以及滴注时制剂与输注液混合后TPO成分吸附于输注装置(瓶或管)而引起损失。
在这种情况下，本发明人研制了一种不含TPO的稳定组合物，它可防止具有糖链部分的TPO蛋白的吸附，当制备TPO药物制剂或当它与输注液混合时，可达到防止TPO滴度降低的目的。结果，现在已发现给TPO蛋白添加药用蛋白，纤维素衍生物，硫酸化多糖表面活性剂，聚乙烯醇，聚乙二醇或氨基乙酸(又名甘氨酸)可达到这一效果。
                    发明概述
因此，依照本发明，为防止因容器壁吸附而引起TPO滴度减少提供了一种方法，所述容器装有包含不具有糖链部分的TPO蛋白的组合物，该方法包括给组合物添加至少一种药用添加物，所述添加物选自蛋白，纤维素衍生物，硫酸化多糖表面活性剂，聚乙烯醇聚乙二醇和氨基乙酸。
本发明还提供一种含TPO的组合物，它包含不具有糖链部分的TPO蛋白及至少一种选自蛋白，纤维素衍生物，硫酸化多糖表面活性剂，聚乙烯醇聚乙二醇和氨基乙酸的药用添加物。
                   附图简述
图1是ELISA测定的表明TPO(1-163)/E.coli浓度与相应吸收值之间(450nm/650nm)关系的标准曲线。
图2表明当添加不同浓度的人血清白蛋白(HSA)时，TPO(1163)/E.coli的回收百分率随时间的变化。
                     发明详述
本发明的TPO可以用具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的蛋白，该蛋白不具有糖链部分，只要产品是高纯度的分离的蛋白，其制备方法没有具体限制。本发明所应用的TPO也可以是这样一种蛋白，它包含这样的氨基酸序列，该氨基酸序列在SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列中有部分修改(通过替代、删除、插入和/或添加)，但不具有糖链部分，条件是它保持TPO活性。
换言之，也可应用氨基酸序列基本上为SEQ ID NO：1中所示但不具有糖链部分的蛋白。术语“氨基酸序列基本上为SEQ ID NO：1所示指除SEQ ID NO：1中的氨基酸序列外还包括SEQ ID NO：1中的氨基酸序列经部分替代，删除，插入和/或添加而形成的氨基酸序列，只要仍保持TPO活性即可。
已经发现即使SEQ ID NO：1中C末端的氨基酸序列缺失到第152位，或即使N末端的氨基酸残基缺失到第6位，重组的人TPO蛋白还保留TPO活性。具体数据如表1所示。
                           表1
          衍生物                      活性
          位置1-231                     +
          位置1-211                     +
          位置1-191                     +
          位置1-171                     +
          位置1-163                     +
          位置1-157                     +
          位置1-156                     +
          位置1-155                     +
          位置1-154                     +
          位置1-153                     +
          位置1-151                     +
          位置1-150                     -
          位置7-163                     +
          位置8-163                     -
          位置13-231                    -
因此，本发明的TPO蛋白是这样一种不具有糖链部分的蛋白，它所包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示的7-151位的一致并且具有TPO活性。更具体而言，该蛋白包括不具有糖链部分但具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列中1-231，1-211，1-191，1-171，1-163，1-157，1-156，1-155，1-154，1-153，1-151或7-163位的多肽链的蛋白。
本发明的TPO蛋白还包括这样一种不具有糖链部分的蛋白，其多肽链中至少有一种上述SEQ ID NO：1中7-151序列内或外的氨基酸残基经过替代，删除，插入和/或添加，而TPO活性并没受到破坏。
本发明的TPO蛋白可包括这样的蛋白，其中SEQ ID NO：1中所示人类TPO氨基酸序列中，至少Ser1和Ala3被Ala和Val替代；或其中Arg25被Asn替代；或其中His33被Thr替代；或其中Arg25被Asn替代；Glu231被Lys替代；并且包括这样的蛋白，其中多肽Thr Ser Ile Gly Tyr Pro Tyr AspVal Pro Asp Tyr Ala Gly Val His His His His His His被加到上述蛋白的C末端。
本发明还包括这样的不具有糖链部分的蛋白，它们在SEQ ID NO：1的序列中至少有下列氨基酸残基的缺失和/或添加，即，其中的His33被删除；或其中Gly116被删除；或其中Arg117被删除；或其中苏氨酸残基插在His33和Pro34间；或其中丙氨酸残基插在His33和Pro34间；或其中甘氨酸残基插在His33和Pro34间；或其中甘氨酸残基插在His33和Pro34间，且Pro38被Ser替代；或其中天冬酰胺残基插在Gly116和Arg117间；或其中丙氨酸残基插在Gly116和Arg117间；或其中甘氨酸残基插在Gly116和Arg117间。本发明TPO蛋白的实例还包括这样的蛋白，其中至少Leu129被Arg替代；或其中His133被Arg替代；或其中Met143被Arg替代；或其中Gly82被Leu代替；或其中Gly146被Leu替代；或其中Ser148被Pro替代；或其中Lys59被Arg替代；或其中Gln115被Arg替代。
本发明的不具有糖链部分的TPO蛋白还包括这样的非糖基化蛋白，其中甲硫氨酸和赖氨酸残基分别被加到具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的人类TPO蛋白和上述衍生物的-2和-1位置；或其中甲硫氨酸残基连接于具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的人类TPO蛋白和衍生物的-1位置。
优选地，本发明的TPO蛋白可这样获得：用含有它们的cDNA、染色体DNA或化学合成的DNA的重组载体转化宿主细胞，从宿主细胞中分离和纯化TPO蛋白。作为宿主，可应用原核细胞(例如细菌，优选大肠杆菌)。
在制备本发明的含TPO稳定组合物时所应用的添加物可以是蛋白，纤维素衍生物，硫酸化多糖，表面活性剂，聚乙烯醇，聚乙二醇，氨基乙酸等。这些添加物的类型不受具体限制，条件是它们能防止TPO吸附于由玻璃，树脂等(包括下面给出的材料)制成的容器、管(输液管)等。
至于蛋白，可以用人血清白蛋白、明胶、牛血清白蛋白、酪蛋白、胶原、人血清球蛋白等。
至于纤维素衍生物，可以用甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟乙基纤维素等。
表面活性剂的实例包括聚氧乙烯氢化蓖麻油；聚氧乙烯蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，如吐温80，聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(又名吐温20)等；聚氧乙烯聚氧丙烯甘醇，山梨糖醇酐脂肪酸酯，如山梨醇酐一油酸酯等；蔗糖脂肪酸酯，如蔗糖一月桂酸酯等；卵黄磷脂，如来自卵黄的磷脂等；芳族季铵盐，如氯苄乙铵，氯苄烷铵等；烷基硫酸盐，如月桂基硫酸钠等。
至于硫酸化多糖，可以用硫酸软骨素钠盐，肝素钠等。
当把含TPO的组合物制备成水溶液形式的时候，本发明中所应用的上述添加物的浓度范围为0.001％-10％，也希望每重量份的TPO蛋白(作活性成分)对应的添加物的范围为0.02-10000重量份。
此外，本发明含TPO的组合物也可包括稀释剂，助溶剂，抗菌剂，抗氧化剂，赋形剂，等渗剂等等，这依赖于制备组合物的目的。
本发明含TPO的稳定组合物可制备成剂量形式，如溶液剂，悬液剂，片剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或冷冻干燥制剂，这依赖于各种用药途径，包括胃肠外施用(如注射)，经肺施用，经鼻施用和口服施用。本发明中所应用的TPO和添加物可制备成在开始时应共同存在于同一组合物中，或者可选地将TPO和添加物单独预配制，在应用时混合。
下面的试验和工作实施例对本发明作进一步说明。
                   实施例
下面的试验实施例中，TPO的酶免疫方法如下进行。
用抗人TPO的单克隆抗体进行酶联免疫吸附实验(ELISA)
抗人TPO单克隆抗体(即，L3-1的亚克隆L3-1-54)是固相抗体，识别人TPO的HT-1区(与SEQ ID NO：1中所示8-28氨基酸序列一致)，在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.2)中配成20μg/ml，96孔微滴度板(Nunc-Immuno Plate MaxiSorpTM，InterMed制，Ca.No.4-42404)中每孔50μl。当板在微板混合仪(ADVANTEC TS-96，东京，日本)上振荡时，固相抗体完全铺散在每孔的底部。用封底器(SUMILON制，Ca.NO.MS-30020)封板，37℃放置2小时，或4℃过夜，以吸附板上的固相抗体。接着用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl/0.5M NaCl/0.1％吐温20(pH7.5))洗涤后，每孔加入300μl4×Block Ace(Dainippon Pharmaceuticals，日本，Ca.No.UK-B25)，用封板物封板，37℃放置1小时或4℃过夜。用洗涤缓冲液洗4次后，每孔加入50μl的被测样品或用10×Block Ace稀释的已知浓度的TPO标准品，用微板混合仪振荡板，用封板物封板，然后37℃放置2小时，4℃过夜。反应完全后，用洗涤缓冲液洗板4次。接着用生物素标记另一种抗人TPO单克隆抗体(即，L4-1的亚克隆L4-1-31)，它作为首抗识别人TPO的HT-2区(与SEQ ID NO：1所示的47-62氨基酸序列相应)，由10×Block Ace稀释为500ng/ml，每孔50μl，板在微板混合仪上振荡后用封板仪封板，然后放置37℃2小时或4℃过夜。反应完全，随后用洗涤缓冲液洗涤(×4)之后，把过氧化酶标记的抗生物素蛋白(超抗生物素蛋白TM-辣根过氧化物酶，Leinco Technologies制，Ca.No.A106)在10×Block Ace中稀释2000倍，每孔加50μl。在微板混合仪上振荡后，用封板物封板，37℃反应1小时。反应完全，随后用洗涤缓冲液洗涤(×4)之后，每孔加入100μl的显色剂，它是在测过氧化酶的显色试剂盒的TMB2显色剂中加入1/100体积的底物溶液而配制成的(试剂盒为SUMILON产，Ca.No.ML1120T)，微板混合仪上振荡后，封板物封板，室温下进行反应。约30分钟后，每孔加入100μl的反应终止液，用微板仪振荡以终止颜色反应。用酶标仪(THERMOmax，Molecular Devices产)在波长450nm/650nm处测吸收值。
用已知浓度TPO(1-163)/E.coli的吸收值制作标准曲线，用参照实施例(见图1)中描述的步骤来获得吸收值。
在这种情况下，杂交瘤L4-1的亚克隆(L4-1-31)和杂交瘤L3-1的亚克隆(L3-1-54)均可制备抗人TPO单克隆单体，已于1994年9月27日保藏于日本国际贸易和工业部，工业科技机构，国家生物科学和人类技术研究所，保藏号分别为FERM BP-4956和FERMBP-4955。上述的亚克隆也已保藏于中国的保藏机构(CCTCC)，保藏号分别是鼠-鼠杂交瘤L4-31的为CCTCC-C95003和鼠-鼠杂交瘤L3-1-54的为CCTCC-C95002。试验实施例1
试验样品的制备是把人血清白蛋白加到10mM Tris缓冲液(pH7.5)中，终浓度为0.005％，0.01％，0.02％，0.05％，0.1％，0.2％或0.5％。单用10mM Tris缓冲液(pH7.5)作为对照。
含3μg TPO的1.5μl溶液是经后面参照实施例的步骤而获得，把它加到含1000μl各样品的玻璃试管中放置于室温。0.5分钟、1小时或2小时后从试管中取10μl溶液，用ELISA测量溶液中TPO的量，以计算它在期望值基础上的回收(％)。
结果如图2所示。图中，BLANK指仅用10mM Tris缓冲液(pH7.5)，HSA指人血清白蛋白。发现人血清白蛋白有阻止吸附的效果。试验实施例2
把用参照实施例中描述的步骤获得的含3μg TPO(即TPO(1-163)/E.coli)的2.7μl溶液加到含1000μl溶液的玻璃试管中，试管中溶液的制备是，把表2列出的各种添加物溶到10mM Tris缓冲液(pH7.5)中，终浓度为0.1％，放置24小时后用ELISA测回收率。结果如表2所示。
                   表2添加物(添加量，1mg/ml)                       回收率
                                          (％)人血清白蛋白                                  41.3纯化明胶(A型)                                 41.2纯化明胶(B型)                                 24.9氨基乙酸                                      21.7甲基纤维素                                    44.0羟丙基纤维素                                  51.5羟乙基纤维素                                  23.3硫酸软骨素钠盐                                61.6肝素钠                                        41.4聚乙二醇400                                   24.4聚乙烯醇(部分皂化)                            36.7聚氧乙烯氢化蓖麻油                            50.3吐温80                                        67.8聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯                  57.6聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)甘醇                 33.7山梨糖醇酐一油酸酯                            89.6蔗糖单月桂酸酯                                59.2卵黄磷脂                                      20.8氯化苄乙氧胺                                  97.6十二烷基硫酸钠                                72.6未加                                          16.2
如表中所示，所有被试添加物均可防止TPO与玻璃试管接触时的吸附。
本发明含TPO组合物的实施例将在下面给出。实施例1
无菌制备10ml 5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中含1000μg TPO，0.025g 人血清白蛋白和87.66mg氯化钠的水溶液，每小瓶中分装1ml，随后密封。实施例2
除用0.1g纯化明胶(B型)替代0.025g人血清白蛋白外，重复实施例1的操作配制药品。实施例3
无菌制备10ml 1mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中含2500μgTPO，10mg吐温80和0.5g山梨糖醇的水溶液，每小瓶中分装1ml，随后密封。实施例4
无菌制备在10ml 10mM Tris缓冲液(pH6.5)中含2500μgTPO，10mg聚氧乙烯氢化蓖麻油60和81.82mg氯化钠的水溶液，每小瓶中分装1ml，随后密封。
作为参照实施例，下面叙述作为本发明活性成分TPO的制备方法。参照实施例：在大肠杆菌中制备TPO(1-163)/E.coli的实施例(1)表达hMKT(1-163)的E.coli表达质粒pAMG11-hMKT(1-163)的构建及它在E.coli中的表达
为了在E.coli(大肠杆菌)中表达具有SEQ ID NO：1所示1-163位氨基酸序列的蛋白质(此后称作“TPO(1-163)/F.coli”)，用E.coli的优选密码子化学合成编码这一氨基酸序列的DNA片段。此外，新加到N末端编码甲硫氨酸和赖氨酸残基的核苷酸与DNA片段连接，编码终止密码子的DNA序列加到与C末端相符的部位。SEQ IDNO：2显示了这一DNA所编码蛋白质的氨基酸序列，即这样一种蛋白质：Met-Lys附着于SEQ ID NO：1中1-163位氨基酸序列的N末端(此后称作“hMKT(1-163)”)。
按上述方法合成的hMKT(1-163)基因片段，其5′端和3′端分别具有XbaI和HindIII的限制性位点，并且它包含有核糖体结合位点，ATG起始密码子，编码hMKT(1-163)氨基酸序列的序列，和终止密码子。
上面的片段克隆到乳糖可诱导表达载体pAMG11的XbaI-HindIII位点。pAMG11这一载体是低复制数的质粒，有源于pR 100的复制起端。表达载体pAMG11可从质粒pCFM1656而获得(ATCC，No.69576，1994年2月24日保藏)，它是伴随PCR，通过诱变而引起一系列的定点诱变形成的。该质粒有BglII的位点(质粒bp#180)，在质粒复制启动子PcopB的5′侧直接开始，PcopB之后是复制基因。碱基对的突变如表3所示。
                      表3pAMG11中           pCFM1656         在pAMG11中碱基对变成碱基对号           中的碱基对#204                 T/A                  C/G#428                 A/T                  G/C#509                 G/C                  A/T#617                 --                   插入2对G/C#679                 G/C                  T/A#980                 T/A                  C/G#994                 G/C                  A/T#1004                A/T                  C/G#1007                C/G                  T/A#1028                A/T                  T/A#1047                C/G                  T/A#1178                G/C                  T/A#1466                G/C                  T/A#2028                G/C                  缺失#2187                C/G                  T/A#2480                A/T                  T/A#2499-2502           AGTG                 CTCA
                 TCAC                 CAGT#2642                TCCGAGC              缺失
                 AGGCTCG#3435                G/C                  A/T#3446                G/C                  A/T#3643                A/T                  T/A#4489-4512            --                  插入下列碱基对
                                 GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG
                                 CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC
紧接着，唯一的AatII和ClaI位点间的DNA序列被下面的寡核苷酸替代。
AatII(#4358)
5′    CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAATTCTT-
3′TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-
-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT  3′
-CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC  5′
                                    ClaI(#4438)
插入pAMG11中的hMKT(1-163)基因的表达，可由合成的乳糖可诱导启动子进行诱导，如具有下列序列的Ps4启动子：
5′GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-
     -ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3′
Ps4启动子所诱导的hMKT(1-163)基因表达可被E.coli lacI的基因产物乳糖抑制子(LacI)所抑制。
紧接着用质粒pAMG11-hMKT(1-163)转化含有等位基因IaqIq的E.coli K-12株。等位基因Iaq Iq在lacI启动子内有突变，这增强了LacI基因的表达，由此导致Ps4启动子对蛋白表达更为严格地控制。结果是，缺少乳糖时，hMKT(1-163)的表达被LacI抑制。当加入乳糖时，LacI蛋白与Ps4启动子的操纵子部位的结合增加，Ps4启动子启动hMKT(1-163)基因的剪切。本例中所用作宿主细胞的E.coli已于1994年11月30日保藏于ATCC，保藏号为ATCC No.69717。
E.coli株(ATCC No.69717)由质粒pAMG11-hMKT(1-163)进行转化，在下面的条件下进行培养。(2)能够表达hMKT(1-163)的重组E.coli株的培养和TPO(1-163)/E.coli的产物。
已获得的转染子在LB培养基上，于30℃培养近12小时。然后把细胞无菌转移到含有批量培养基(20g/L酵母提取物；3.4g/L柠檬酸；15g/L K2HPO4；15ml Dow P2000；5g/L葡萄糖；1g/L MgSO4-7H2O；5.5ml/L微量金属；5.5ml/L维生素)的发酵罐中。培养一直继续到培养物的光密度(O.D.)在600nm达到5.0±1.0。接着，供给第一种补料培养基(700g/L葡萄糖；6.75g/L MgSO4-7H2O)，依照建立的时间表每隔2小时调整一次补加的速度。当培养物在600nm的O.D.值达到20-25时，开始补充第二个补料培养基(129g/L胰化蛋白胨；258g/L酵母提取物)。添加第二个补料培养基时保持恒定的流速，而加第一种补料培养基的流速继续进行调整。
整个培养过程中，温度保持在30℃左右，培养物的pH保持在7左右，如果有必要可加酸或碱调整。所期望的溶解氧的水平通过搅动速率，发酵罐中的换气率和氧气注入的速率来调整。当培养物在600nm的O.D.值达到57-63时，以恒定的流速把第三种补料培养基(300g/L乳糖)加到发酵罐中。停止添加第三种补料培养基，第二种补料培养基的流速换到一新的恒定的速度。第三种补料培养基添加开始之后，培养继续进行十小时以上。培养结束时，把培养物冷却到15±5℃，通过离心收集细胞。所得细胞团于-60℃或以下保存。
在E.coli中制备的hMKT(1-163)的纯化及TPO(1-163)/E.coli的制备按如下方式进行。
将1800g细胞团悬在约18L 10mM EDTA中，在15000psi下通过高压匀浆器。把打碎的细胞悬液离心，沉淀重悬于10L 10mM的EDTA中。把悬液离心，200g沉淀物溶于2L 10mM的Tris缓冲液，缓冲液为pH8.7，含有8M盐酸胍，10mM DTT和5mM EDTA。该溶液缓慢在200L的10mM CAPS中稀释，CAPS的pH为10.5，含有3M尿素，30％甘油，3mM胱胺和1mM半胱氨酸。
稀释的溶液在室温缓慢搅拌16小时，调pH为6.8。调pH后，澄清溶液，加样到2-L CM Sepharose柱，柱用含1.5M尿素和15％甘油，pH为6.8的10mM磷酸钠缓冲液平衡。加样后，用pH7.2含15％甘油的10mM磷酸钠缓冲液洗柱。用线性梯度液洗脱hMKT(1-163)，梯度液为pH7.2，10mM磷酸钠缓冲液中氯化钠从0M到0.5M。
从CM Sepharose柱洗脱得到的级分用膜(截止分子量为10000的)进行浓缩，同时用pH6.5，10mM磷酸钠缓冲液更换原缓冲液。浓缩的溶液(蛋白质：约2mg/ml)用组织蛋白酶C(蛋白质底物∶酶＝500∶1(摩尔比))在环境温度下处理90分钟。
把反应混合物加样到用pH7.2，含15％甘油的10mM磷酸钠缓冲液平衡的1.2L SP高效Sepharose柱。加样后，用pH7.2，10mM磷酸钠中氯化钠从0.1M到0.25M这样的线性洗脱液洗脱具有TPO活性的蛋白质TPO(1-163)/E.coli，其中N末端的Met-Lys从hMKT(1-163)切割下来。
把硫酸铵加到从SP高效柱得到的洗脱物中，使浓度为0.6M。然后洗脱物加样到1.6L Phenyl Toyopearl柱(Toso公司，日本)，柱用pH7.2，含0.6M磷酸铵的10mM磷酸钠缓冲液平衡。TPO(1-163)/E.coli的峰用pH7.2，10mM磷酸钠中硫酸铵从0.6M到0M的线性梯度液进行洗脱。
从Phenyl Toyopearl柱得到的洗脱物用膜(截止分子量为10,000的)进行浓缩，同时缓冲液用pH7.5，含5％山梨糖醇的10mM Tris缓冲液交换。
                            序列表SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
   (A)长度：332个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
   (A)有机体：人(智人)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1               5                  10                  15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val
         20                  25                  30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
     35                  40                  45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu
 50                  55                  60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65                  70                  75                  80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln
             85                  90                  95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu
        100                 105                 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe
    115                 120                 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130                 135                 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145                 150                  55                 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn
            165                 170                 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr
        180                 185                 190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile
    195                 200                 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly
210                 215                 220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225                 230                 235                 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly
            245                 250                 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser
        260                 265                 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu
    275                 280                 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro
290                 295                 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305                 310                 315                 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly
            325                 330SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
   (A)长度：535个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：合成的DNA
(vi)来源：
   (A)有机体：人(智人)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA                                       28ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA      76Met Lys Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys
     +1               5                  10CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG     124Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro15                  20                  25                  30GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC     172Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe
             35                  40                  45TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC     220Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp
         50                  55                  60ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT     268Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg
    65                   70                  75GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT     316Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser
 80                  85                  90GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG CTT GGC ACC     364Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr95                 100                 105                 110CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT CCG AAC GCT     412Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala
            115                 120                 125ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC AAA GTT CGT TTC CTG     460Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu
        130                 135                 140ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC     508Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr
    145                 150                 155ACT GCT GTT CCG TCT TAATGAAAGC TT                                   535Thr Ala Val Pro Ser
160

Claims (7)

1.一种含血小板生成素(TPO)的组合物，它包含不具有糖链部分的TPO蛋白和至少一种选自蛋白、纤维素衍生物、硫酸化多糖、表面活性剂、聚乙烯醇、聚乙二醇和氨基乙酸的药用添加物。
2.权利要求1的含TPO的组合物，其中当组合物以水溶液形式存在时，所述添加物的量为0.001％-10％。
3.权利要求1或2的含TPO的组合物，其中蛋白是人血清白蛋白和/或明胶。
4.权利要求1或2的含TPO的组合物，其中纤维素衍生物是至少一种选自甲基纤维素、羟丙基纤维素和羟乙基纤维素的化合物。
5.权利要求1或2的含TPO的组合物，其中表面活性剂是至少一种选自聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸脂、蔗糖脂肪酸酯、卵黄磷脂、芳族季铵盐和烷基硫酸盐的化合物。
6.权利要求1或2的含TPO的组合物，其中硫酸化多糖是硫酸软骨素钠盐和/或肝素钠。
7.一种防止因TPO在容器壁上的吸附而引起TPO滴度降低的方法，所述容器装有含不具有糖链部分的TPO蛋白的组合物，该方法包括给组合物添加至少一种选自蛋白、纤维衍生物、硫酸化多糖、表面活性剂、聚乙烯醇、聚乙二醇和氨基乙酸的药用添加物。
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