CN101062952B

CN101062952B - 由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101062952B
Application number: CN200710099325XA
Authority: CN
Inventors: 刘志敏; 赵洪亮; 薛冲; 王洋; 熊向华; 姚学勤; 李献玉
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2007-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2027-05-16
Also published as: CN101062952A

Abstract

本发明公开了一种由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用。该融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有干扰素α2b活性的由(a)衍生的蛋白质。与已公开的同类融合蛋白(如美国HGS公司的Albuferon)不同，该融合蛋白中干扰素部分处于融合蛋白的N末端而人血清白蛋白部分处于融合蛋白的C末端。由于以上改进使得该融合蛋白比Albuferon具有更好的均一性，更高的稳定性和更高的回收率。该融合蛋白可用于治疗多种肿瘤及病毒性疾病。

Description

由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是一类具有抗病毒、抗增殖以及免疫调节活性的细胞因子。根据其活性和产生细胞的类型不同，干扰素可分为α干扰素，β干扰素和γ干扰素等。其中α干扰素在临床上被广泛用于治疗多种病毒性疾病和肿瘤。然而天然α干扰素的半衰期较短，只有频繁的给药(在临床治疗中往往采用每周注射三次的用药方式)才能获得令人满意的疗效。如此频繁的用药方式再加上较长的治疗周期(6-12个月)使得病人较难承受。因此迫切需要研制出作用时间长的重组人α干扰素。

人血清白蛋白(HSA)是机体中一种稳定的且半衰期较长的蛋白。研究表明许多蛋白药物与该白蛋白交联或融合后可以显著地使药物蛋白的半衰期延长，从而使用药次数减少。HGS(Human Genome Sciences)公司的Albuferon是一个不含接头的人血清白蛋白和干扰素α2b的融合蛋白(HSA-IFN-α2b)，在该融合融合蛋白中干扰素部分处于融合蛋白的C末端，人血清白蛋白部分处于融合蛋白的N末端。目前Albuferon已进入了III期临床研究。研究结果表明Albuferon具有较长的体内半衰期，较高的安全性及较好的疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定的由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因。

本发明所提供的融合蛋白，名称为IFN-α2b-HSA，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有干扰素α2b活性的由(a)衍生的蛋白质。

为了使(a)中的IFN-α2b-HSA便于纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tagII	8	WSHPQFEK
c-myc	11	EQKLISEEDL

上述(b)中的IFN-α2b-HSA可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的IFN-α2b-HSA的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №：2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

序列表中的序列1由750个氨基酸残基组成，自氨基末端第1-165位为IFN-α2b的氨基酸残基序列，自氨基末端第166-750位为HSA的氨基酸残基序列。

上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。IFN-α2b-HSA的编码基因，具体可为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的序列2由2253个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第2250位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述融合蛋白的方法。

本发明所提供的表达上述融合蛋白方法，是将含有上述融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到融合蛋白。

所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌。

所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115，KM71(可购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(可购自美国Invitrogen公司)。

所述大肠杆菌可为E.coli JM109，E.coliHB101，E.coli Top10等。

用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。

当所述宿主为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)时，需用甲醇进行诱导表达，甲醇的终浓度可为0.5％(体积百分含量)。

上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

培养含有本发明的融合蛋白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

本发明还提供了一种可用于治疗多种肿瘤及病毒性疾病的药物。

本发明所提供的可用于治疗多种肿瘤及病毒性疾病的药物，它的活性成分为上述融合蛋白。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射剂。该剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为每个成人每次注射500-1000μg的融合蛋白，每隔14-28天给药一次，疗程为3至12个月。

本发明人通过研究发现Albuferon具有以下缺陷：(1)不均一性：在非还原电泳上呈“双带”；(2)不稳定性：在溶液中易发生共价聚合；(3)回收率较低，仅为10％左右。本发明人通过实验进一步发现通过改变融合蛋白的相位，即将人血清白蛋白部分置于融合蛋白的C末端，将干扰素部分置于融合蛋白的N末端后可显著提高融合蛋白的均一性，稳定性和回收率。

实验证明，本发明的融合蛋白稳定性高、半衰期较长，在医学上也具有较高的安全性及较好的疗效；该融合蛋白的表达量高，易纯化，并具有生产周期短，生产规模大，成本低的优点，具有重要的应用前景和实际意义。

附图说明

图1是融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的非还原SDS-PAGE电泳图谱。

图2是比较融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的纯化过程。

图3是利用非还原SDS-PAGE比较融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA在液体剂型中的稳定性。

图4是利用细胞病变抑制法测定IFN-a2b及融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的活性。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的主要试剂：

1.DNA限制性内切酶、T₄DNA连接酶、聚合酶等分别购自GIBCO-BRL、Pharmacia、Bio-Labs及华美生物工程有限公司

2.PCR扩增试剂盒 (瑞典Pharmacia公司产品)

3.DNA序列分析试剂盒 (美国USB公司产品)

4.酪蛋白水解物 (德国MERK公司产品)

5.Bacto-酵母抽提物 (美国Difco公司产品)

6.酵母菌原生质体转化法的一些溶液配制

(1)SED：1M山梨醇，25mM EDTA，50mM DTT，pH8.0。

(2)SCE：9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠，0.168g EDTA，pH5.8。

(3)CaS：1M山梨醇，10mM CaCl₂。

(4)SOS：1M山梨醇，0.3×YPD，10mM CaCl₂。

(5)CaT：20mM Tris-HCl，pH7.5，20mM CaCl₂。

(6)PEG：20％PEG-3350，10mM CaCl₂，10mM Tris-HCl(pH7.4)。

(7)1M PBS缓冲液：132ml 1M K₂HPO₄，868ml 1M KH₂PO₄，pH6.0。

7.引物：(由上海生工合成)

AIF：CGAAGGATCCAAACGATGAAGTGGGTTACT

AIR：GGGAATTCTCATTACTCCTTGGATCTCAAG

CF：GCTTCTCAAGCTGCTTTGGGTTTGTGTGACTTGCCACAAACCCACTCC

CR：GGAGTGGGTTTGTGGCAAGTCACACAAACCCAAAGCAGCTTGAGAAGC

IAF：CCCTCGAGAAAAGATGTGACTTGCCACAAACCCACTCC

IAR：GGGAATTCCTATTACAAACCCAAAGCAGCTTGAGAAGC

NF：CAAGAGTCCTTGAGATCCAAGGAGGACGCTCACAAGTCTGAAGTTGCT

NR：AGCAACTTCAGACTTGTGAGCGTCCTCCTTGGATCTCAAGGACTCTTG

实施例1、人血清白蛋白和干扰素融合蛋白的制备

1、人血清白蛋白和干扰素融合蛋白基因的获得

(1)干扰素-α2b基因

干扰素-α2b基因是根据巴斯德毕赤酵母偏爱密码子合成的人工基因。干扰素-α2b基因的合成按照文献(Martinez et al：PCR-based gene synthesis as anefficient approach for expression of the A+T-rich malaria genome.ProteinEngineering.1999，12(12)：1113-1120)中描述的方法进行。

(2)HSA基因

HSA基因系由刘志敏等根据巴斯德毕赤酵母偏爱密码子合成的人工基因。HSA基因的合成按照文献(刘志敏等：人血清白蛋白改构基因、表达载体及其宿主。中国发明专利专利号CN 99102794.9)中描述的方法进行。

(3)人血清白蛋白和干扰素融合蛋白基因的获得

本发明中所涉及的人血清白蛋白和干扰素融合蛋白基因均利用重叠PCR方法构建。

融合蛋白HSA-IFN-α2b基因的构建：以步骤(2)中得到的HSA基因为模板，在引物AIF和引物CR的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增HSA基因；以步骤(1)中得到的IFN-α2b基因为模板，在引物CF和引物AIR的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增IFN-α2b基因。以上述两步中的扩增产物为模板以引物AIF和引物AIR为引物扩增出HSA-IFN-α2b融合蛋白基因。PCR反应的扩增体系为：

HSA基因 1μl

IFN-a2b基因 1μl

引物AIF 2μl

引物AIR 2μl

dNTP 1μl

10x pfu酶缓冲液 5μl

pfu酶 1μl

蒸馏水 37μl

总体积 50μl。

反应条件为：94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 4分钟，共进行30个循环。

将酵母表达载体pPIC9(购自Invitrogen公司)和得到的HSA-IFN-α2b基因分别用BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切后，用T₄DNA连接酶将HSA-IFN-α2b基因克隆入pPIC9，得到重组表达载体HSA-IFN-α2b/pPIC9。并用DNA序列分析试剂盒(美国USB公司产品)对该重组载体进行测序，结果表明HSA-IFN-α2b基因序列与预期相符，其核苷酸序列是序列表中的序列3。

融合蛋白IFN-α2b-HSA基因的构建：以步骤(2)中得到的HSA基因为模板，在引物NF和引物IAR的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增HSA基因；以步骤(1)中得到的IFN-α2b基因为模板，在引物IAF和引物NR的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增IFN-α2b基因。以上述两步中的扩增产物为模板，以引物IAF和引物IAR为引物扩增出IFN-α2b-HSA融合蛋白基因。PCR反应的扩增体系为：

HSA基因 1μl

IFN-α2b基因 1μl

引物IAF 2μl

引物IAR 2μl

dNTP 1μl

10x pfu酶缓冲液 5μl

pfu酶 1μl

蒸馏水 37μl

总体积 50μl。

将酵母表达载体pPIC9和得到的IFN-α2b-HSA基因分别用XhoI和EcoRI限制性内切酶酶切后，用T₄DNA连接酶将IFN-α2b-HSA基因克隆入pPIC9，得到重组表达载体IFN-α2b-HSA/pPIC9。并用DNA序列分析试剂盒(美国USB公司产品)对该重组载体进行测序，结果表明IFN-α2b-HSA基因序列与预期相符，其核苷酸序列是序列表中的序列2。

2、人血清白蛋白和干扰素融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将上述表达载体HSA-IFN-α2b/pPIC9和IFN-α2b-HSA/pPIC9分别用酵母原生质体转化法转化巴斯德毕赤酵母GS115 his4(Mut⁺his^-)NRRLY-15851(Invitrogen公司)，将转化产物涂布在MD平板上，得到转化子。随机挑取24个转化子，接种于4ml BMGY培养基(1％(质量百分含量)酵母抽提物，2％(质量百分含量)胰蛋白胨，1.34％(体积百分含量)YNB，4×10^-5％(质量百分含量)生物素，1％(体积百分含量)甘油，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液)培养液中，每隔12小时加入0.5％(体积百分含量)甲醇进行诱导表达，在30℃，200rpm下培养36-48小时。将培养液用5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，将样品分别进行10％SDS-PAGE电泳鉴定，用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴定出1个转入HSA-IFN-α2b/pPIC9的高表达克隆和1个转入IFN-α2b-HSA/pPIC9的高表达克隆。然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％(体积百分含量)甘油低温保菌、斜面培养，用于作为进一步表达的工程菌。

挑取上述工程菌接种于4ml上述BMGY液体培养基中，30℃100rpm摇培12-24小时。取1ml酵母菌液转接于50ml上述BMGY培养液内，继续摇培18-24小时，再按4％接菌量将40ml种子接入1000ml上述BMGY培养基内，在30℃，200rpm继续摇培24-30小时，将培养液用5000rpm离心5min，弃上清，然后将工程菌用200ml BMMY(1％(质量百分含量)酵母抽提物，2％(质量百分含量)胰蛋白胨，1.34％(体积百分含量)YNB，4×10^-5％(质量百分含量)生物素，0.5％(体积百分含量)甲醇，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液)诱导表达培养基悬浮菌体，在30℃100rpm摇培3-4天，每隔24小时补加甲醇(用100％甲醇加至终浓度为0.5％(体积百分含量))。这时巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度已达到18-20个OD₆₀₀，表达的融合蛋白大多数分泌到液体培养基内。发酵培养基在4℃10000rpm(6000g)离心20min，弃菌体，获得含大量融合蛋白表达产物的上清液，将其进行非还原SDS-PAGE电泳鉴定，结果表明转入HSA-IFN-α2b/pPIC9的工程菌表达的HSA-IFN-α2b在非还原电泳上呈“双带”(85kDa)，转入IFN-α2b-HSA/pPIC9的工程菌表达的IFN-α2b-HSA在非还原电泳上呈单带(85kDa)(图1)。电泳结果表明IFN-α2b-HSA具有比HSA-IFN-α2b更好的均一性。图1中，泳道1为分子量标准，泳道2为HSA-IFN-α2b，泳道3为IFN-α2b-HSA。

3、融合蛋白的分离纯化

将步骤2中的培养上清液的pH调至4.5，并用蒸馏水稀释5倍后用Sepharose F.F(Amersham Bioscience公司)进行初步纯化。阳离子交换层析所用平衡缓冲液为50mMpH4.5的醋酸缓冲液，洗脱缓冲液为含1M NaCl的50mM pH4.5醋酸缓冲液。经阳离子交换层析后再用Phenyl Sepharose HP(Amersham Bioscience公司)疏水层析进行纯化。疏水层析所用平衡缓冲液为含1M(NH₄)₂SO₄的pH为6.0的20mM磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为pH为6.0的20mM磷酸盐缓冲液。经疏水层析纯化的样品用Sephadex G25(Amersham Bioscience公司)将缓冲体系交换为pH为6.0的20mM磷酸盐缓冲液后用Source 30Q(Amersham Bioscience公司)阴离子交换层析进行纯化。阴离子交换层析所用平衡缓冲液为pH为6.0的20mM磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含200mM NaCl的pH为6.0的20mM磷酸盐缓冲液。最后用Superdex200(Amersham Bioscience公司)分子筛进行进一步纯化获得最终产物，分子筛所用缓冲液为pH为6.0的20mM磷酸盐缓冲液。将HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA表达上清，以及分别依次经阳离子交换层析，疏水层析，阴离子交换层析和分子筛层析纯化的样品进行10％非还原SDS-PAGE电泳，经凝胶光密度扫描，IFN-α2b-HSA的回收率是HSA-IFN-α2b的2.5倍。结果表明IFN-α2b-HSA具有比HSA-IFN-α2b更高的回收率。HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的纯化结果见图2。其中泳道1为HSA-IFN-α2b表达上清，泳道2-5分别为依次经阳离子交换层析，疏水层析，阴离子交换层析和分子筛层析纯化的HSA-IFN-α2b样品。泳道6为IFN-α2b-HSA表达上清，泳道7-10分别为经阳离子交换层析，疏水层析，阴离子交换层析和分子筛层析纯化的IFN-α2b-HSA样品。

将依次经阳离子交换层析，疏水层析，阴离子交换层析和分子筛层析纯化的IFN-α2b-HSA和HSA-IFN-α2b样品进行N-末端氨基酸序列测定，结果表明IFN-α2b-HSA的N-末端15个氨基酸残基是CDLPQTHSLGSRRTL，HSA-IFN-α2b的N-末端15个氨基酸残基是DAHKSEVAHRFKDLG，表明表达的IFN-α2b-HSA和HSA-IFN-α2b的序列正确。

实施例2、融合蛋白稳定性的比较

将融合蛋白的蛋白浓度调整至1mg/ml后将样品在4℃和37℃下放置不同时间后取10μl样品用非还原SDS-PAGE检测共价聚体的含量，结果如图3所示。在该图中泳道1为经最后一步纯化后马上进行电泳的HSA-IFN-α2b样品，泳道2为在4℃下放置60天后的HSA-IFN-α2b样品，泳道3，4分别为在37℃下放置1天和10天后的HSA-IFN-α2b样品。泳道5为经最后一步纯化后马上进行电泳的IFN-α2b-HSA样品，泳道6为在4℃下放置60天后的IFN-α2b-HSA样品，泳道7，8分别为在37℃下放置1天和10天后的IFN-α2b-HSA样品。电泳结果表明HSA-IFN-α2b放置后易产生共价聚体，而IFN-α2b-HSA在37℃放置10天后仍无共价聚体生成，说明IFN-α2b-HSA具有比HSA-IFN-α2b更高的稳定性。

实施例3、融合蛋白抗病毒活性的测定

利用细胞病变抑制法测定IFN-α2b(天津华立达生物工程公司的安福隆)及最后一步纯化的融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的活性。

细胞培养：Wish细胞(中国药品生物制品检定所)为贴壁细胞，采用0.25％(质量百分含量)胰酶消化，含10％(体积百分含量)小牛血清的RPMI 1640培养基加入双抗(青霉素链霉素各100单位)，37℃，5％二氧化碳培养隔天传代。

灰鸽子变种VSV病毒制备：取9～10日龄的鸡胚，去头、翅膀、内脏制成细胞悬液，接种在细胞培养瓶中培养24小时形成致密的单细胞层，接种VSV病毒(中国药品生物制品检定所)在细胞瓶中培养30小时收取培养上清-45℃保存待用。

微量板染色法：将处理干净的微量板放在紫外线灯下照射30分钟，每孔加入100μl Wish细胞培养液，IFN-α2b、HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA预稀释后在微量板上进行倍比稀释(设立对照孔及空白孔，对照孔加入细胞但不加入干扰素进行保护，而空白孔则不加入细胞)，每孔加入100μl细胞悬液(细胞浓度为40万个/ml)，加盖静置放入二氧化碳培养箱培养6～8小时，显微镜下观察，细胞已生长成为单层每孔加入100μl VSV病毒悬液开始攻毒20～30小时，观察病毒对照孔(未加入IFN-α2b、HSA-IFN-α2b或IFN-α2b-HSA)细胞全部病变倒去培养液，取50mg结晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml进行染色(约30～40分钟)，倒去染液冲洗干净晾干，每孔加入200μl脱色液(50％乙醇，50％蒸馏水，0.1％乙酸(体积比))脱色后用酶联仪(在A570nm)处读取结果进行计算。以A570nm为纵坐标，干扰素蛋白浓度的对数为横坐标作图，EG₅₀定义为最大A570nm的一半所对应的干扰素的蛋白浓度。融合蛋白抗病毒活性的测定的结果见图4。IFN-α2b及融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的EC₅₀分别为1.42±0.28ng/ml，120±12.5ng/ml，和160±11.3ng/ml。

序列表

<160>3

<210>1

<211>750

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1 5 10 15

Phe Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

130 135 140

Ala GluIle Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe

165 170 175

Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe

180 185 190

Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val

195 200 205

Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala

210 215 220

Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

225 230 235 240

Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys

245 250 255

Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp

260 265 270

Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met

275 280 285

Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu

290 295 300

Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu

305 310 315 320

Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala

325 330 335

Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp

340 345 350

Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu

355 360 365

Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu

370 375 380

Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val

385 390 395 400

Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu

405 410 415

Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn

420 425 430

Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu

435 440 445

Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro

450 455 460

Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

465 470 475 480

Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu

485 490 495

Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu

500 505 510

Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala

515 520 525

Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro

530 535 540

Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe

545 550 555 560

Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr

565 570 575

Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser

580 585 590

Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala

595 600 605

Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln

610 615 620

Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys

625 630 635 640

Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu

645 650 655

Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe

660 665 670

Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile

675 680 685

Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala

690 695 700

Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

705 710 715 720

Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu

725 730 735

Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

740 745 750

<210>2

<211>2253

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tgtgacttgc cacaaaccca ctccttgggt tccagaagaa ccttgatgtt tttggctcaa 60

atgagaagaa tctccttgtt ctcttgtttg aaggacagac acgacttcgg tttcccacaa 120

gaggagttcg gtaaccaatt ccaaaaggct gagaccatcc cagttttgca cgagatgatc 180

caacaaatct tcaacttgtt ctccaccaag gactcctccg ctgcttggga cgagaccttg 240

ttggacaagt tctacaccga gttgtaccaa caattgaacg acttggaggc ttgtgttatc 300

caaggtgttg gtgttaccga gaccccattg atgaaggagg actccatctt ggctgttaga 360

aagtacttcc aaagaatcac cttgtacttg aaggagaaga agtactcccc atgtgcttgg 420

gaggttgtta gagctgagat catgagatcc ttctccttgt ccaccaactt gcaagagtcc 480

ttgagatcca aggaggacgc tcacaagtct gaagttgctc acagattcaa ggacttgggt 540

gaagaaaact tcaaggcttt ggttttgatt gctttcgctc aatacttgca acaatgtcca 600

ttcgaagacc acgttaagtt ggttaacgaa gttactgaat ttgctaagac ttgtgttgct 660

gacgaatctg ctgaaaactg tgacaagtct ttgcacactt tgttcggtga caagttgtgt 720

actgttgcta ctttgagaga aacttacggt gaaatggctg actgttgtgc taagcaagaa 780

ccagaaagaa acgaatgttt cttgcaacac aaggacgaca acccaaactt gccaagattg 840

gttagaccag aagtcgacgt tatgtgtact gctttccacg acaacgaaga aactttcttg 900

aagaagtact tgtacgaaat tgctagaaga cacccatact tctacgctcc agaattgttg 960

ttcttcgcta agagatacaa ggctgctttc actgaatgtt gtcaagctgc tgacaaggct 1020

gcttgtttgt tgccaaagtt ggacgaattg agagacgaag gtaaggcttc ttctgctaag 1080

caaagattga agtgtgcttc tttgcaaaag ttcggtgaaa gagctttcaa agcttgggct 1140

gttgctagat tgtctcaaag attcccaaag gctgaatttg ctgaagtttc taagttggtt 1200

actgacttga ctaaggttca cactgaatgt tgtcacggtg acttgttgga atgtgctgac 1260

gacagagctg acttggctaa gtacatttgt gaaaaccaag actctatttc ttctaagttg 1320

aaggaatgtt gtgaaaagcc attgttggaa aagtctcact gtattgctga agttgaaaac 1380

gacgaaatgc cagctgactt gccatctttg gctgctgact tcgttgaatc taaggacgtt 1440

tgtaagaact acgctgaagc taaggacgtt ttcttgggta tgttcttgta cgaatacgct 1500

agaagacacc cagactactc tgttgttttg ttgttgagat tggctaagac ttacgaaact 1560

actttggaaa agtgttgtgc ggccgctgac ccacacgaat gttacgctaa ggttttcgac 1620

gaatttaagc cattggttga agaaccacaa aacttgatta agcaaaactg tgaattgttc 1680

gaacaattgg gtgaatacaa gttccaaaac gctttgttgg ttagatacac taagaaggtt 1740

ccacaagttt ctactccaac tttggttgaa gtttctagaa acttgggtaa ggttggttct 1800

aagtgttgta agcacccaga agctaagaga atgccatgtg ctgaagacta cttgtctgtt 1860

gttttgaacc aattgtgtgt tttgcacgaa aagactccag tttctgacag agttactaag 1920

tgttgtactg aatctttggt taacagaaga ccatgtttct ctgctttgga agttgacgaa 1980

acttacgttc caaaggaatt taacgctgaa actttcactt tccacgctga catttgtact 2040

ttgtctgaaa aggaaagaca aattaagaag caaactgctt tggttgaatt ggttaagcac 2100

aagccaaagg ctactaagga acaattgaag gctgttatgg acgacttcgc tgctttcgtt 2160

gaaaagtgtt gtaaggctga cgacaaggaa acttgtttcg ctgaagaagg taagaagttg 2220

gttgctgctt ctcaagctgc tttgggtttg taa 2253

<210>3

<211>2328

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atgaagtggg ttactttcat ttctttgttg ttcttgttct cttctgctta ctccagaggt 60

gttttccgta gagacgctca caagtctgaa gttgctcaca gattcaagga cttgggtgaa 120

gaaaacttca aggctttggt tttgattgct ttcgctcaat acttgcaaca atgtccattc 180

gaagaccacg ttaagttggt taacgaagtt actgaatttg ctaagacttg tgttgctgac 240

gaatctgctg aaaactgtga caagtctttg cacactttgt tcggtgacaa gttgtgtact 300

gttgctactt tgagagaaac ttacggtgaa atggctgact gttgtgctaa gcaagaacca 360

gaaagaaacg aatgtttctt gcaacacaag gacgacaacc caaacttgcc aagattggtt 420

agaccagaag tcgacgttat gtgtactgct ttccacgaca acgaagaaac tttcttgaag 480

aagtacttgt acgaaattgc tagaagacac ccatacttct acgctccaga attgttgttc 540

ttcgctaaga gatacaaggc tgctttcact gaatgttgtc aagctgctga caaggctgct 600

tgtttgttgc caaagttgga cgaattgaga gacgaaggta aggcttcttc tgctaagcaa 660

agattgaagt gtgcttcttt gcaaaagttc ggtgaaagag ctttcaaagc ttgggctgtt 720

gctagattgt ctcaaagatt cccaaaggct gaatttgctg aagtttctaa gttggttact 780

gacttgacta aggttcacac tgaatgttgt cacggtgact tgttggaatg tgctgacgac 840

agagctgact tggctaagta catttgtgaa aaccaagact ctatttcttc taagttgaag 900

gaatgttgtg aaaagccatt gttggaaaag tctcactgta ttgctgaagt tgaaaacgac 960

gaaatgccag ctgacttgcc atctttggct gctgacttcg ttgaatctaa ggacgtttgt 1020

aagaactacg ctgaagctaa ggacgttttc ttgggtatgt tcttgtacga atacgctaga 1080

agacacccag actactctgt tgttttgttg ttgagattgg ctaagactta cgaaactact 1140

ttggaaaagt gttgtgcggc cgctgaccca cacgaatgtt acgctaaggt tttcgacgaa 1200

tttaagccat tggttgaaga accacaaaac ttgattaagc aaaactgtga attgttcgaa 1260

caattgggtg aatacaagtt ccaaaacgct ttgttggtta gatacactaa gaaggttcca 1320

caagtttcta ctccaacttt ggttgaagtt tctagaaact tgggtaaggt tggttctaag 1380

tgttgtaagc acccagaagc taagagaatg ccatgtgctg aagactactt gtctgttgtt 1440

ttgaaccaat tgtgtgtttt gcacgaaaag actccagttt ctgacagagt tactaagtgt 1500

tgtactgaat ctttggttaa cagaagacca tgtttctctg ctttggaagt tgacgaaact 1560

tacgttccaa aggaatttaa cgctgaaact ttcactttcc acgctgacat ttgtactttg 1620

tctgaaaagg aaagacaaat taagaagcaa actgctttgg ttgaattggt taagcacaag 1680

ccaaaggcta ctaaggaaca attgaaggct gttatggacg acttcgctgc tttcgttgaa 1740

aagtgttgta aggctgacga caaggaaact tgtttcgctg aagaaggtaa gaagttggtt 1800

gctgcttctc aagctgcttt gggtttgtgt gacttgccac aaacccactc cttgggttcc 1860

agaagaacct tgatgttttt ggctcaaatg agaagaatct ccttgttctc ttgtttgaag 1920

gacagacacg acttcggttt cccacaagag gagttcggta accaattcca aaaggctgag 1980

accatcccag ttttgcacga gatgatccaa caaatcttca acttgttctc caccaaggac 2040

tcctccgctg cttgggacga gaccttgttg gacaagttct acaccgagtt gtaccaacaa 2100

ttgaacgact tggaggcttg tgttatccaa ggtgttggtg ttaccgagac cccattgatg 2160

aaggaggact ccatcttggc tgttagaaag tacttccaaa gaatcacctt gtacttgaag 2220

gagaagaagt actccccatg tgcttgggag gttgttagag ctgagatcat gagatccttc 2280

tccttgtcca ccaacttgca agagtccttg agatccaagg agtaatga 2328

Claims

1.一种由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白，是由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述的由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列是序列表中的序列2。

4.含有权利要求2或3所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.一种表达权利要求1所述的由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白的方法，是将含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述宿主为巴氏毕赤酵母GS115，KM71或SMD1168。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用于构建所述重组表达载体的出发载体为pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将核苷酸序列是序列表中的序列2的核苷酸片段插入pPIC9的XhoI和EcoRI酶切位点间得到的重组表达载体IFN-α2b-HSA/pPIC9。

10.一种预防和/或治疗肿瘤，和/或抑制病毒的药物，它的活性成分为权利要求1所述的由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白。