CN103613668B - 犬、猫长效融合干扰素及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由犬、猫血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No1或2所示。本发明的犬、猫长效融合干扰素以延长干扰素半衰期、提高干扰素动物体内生物学活性，可以降低干扰素医疗制剂的成本，应用于犬、猫等动物疾病的防治工作中。

Description

犬、猫长效融合干扰素及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及动物疾病预防治疗技术领域，具体地涉及犬、猫长效融合干扰素及其制备方法与应用。

背景技术

干扰素（Interferon,IFN）是一类重要的细胞因子，是生物体细胞受到病毒或其它异源物质诱生剂做用而产生的分泌型糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖、免疫调节等多种生物作用，对病毒病、细菌病、肿瘤等疾病都有良好的治疗效果。但是干扰素在临床应中半衰期短、在机体内易发生降解，这些难题限制了干扰素生物作用的完全发挥，直接影响了干扰素在临床中的有效应用，所以如何延长干扰素半衰期，提高干扰素生物学活性的发挥效果成为研究的重点。目前除了PEG、微囊缓释技术等化学、物理修饰方法外，还有利用基因工程方法对干扰素蛋白进行重组改造，这些方法都显示出了广泛的应用前景。

当前已经投入临床使用的犬、猫干扰素制品，均为原核表达系统表达生产的基因工程重组干扰素。这些产品没有进行改良，其半衰期短，且成本高，限制了干扰素制品的实际应用。

目前，已有将人血清蛋白和干扰素α基因融合，通过基因重组表达技术获得重组人血清白蛋白干扰素α融合蛋白，可以有效延长药物蛋白的半衰期。但是，利用INFα与HSA融合蛋白是极其复杂的，如何设计融合蛋白的结构，使两者都能保持相对独立的生物学活性；如何构建高表达菌株并分离制备高纯度的融合蛋白，对获得的融合蛋白结构和生物学功能鉴定均需要进行充分的研究。目前还未见融合蛋白延长干扰素半衰期的方法在犬、猫干扰素中的应用。

发明内容

本发明目的是提供犬、猫长效融合干扰素，以用于犬、猫类动物疾病的临床防治。

本发明另一目的是提供编码上述犬、猫长效融合干扰素的基因。

本发明又一目的是提供上述犬、猫长效融合干扰素的制备方法，以适用于工业扩大化生产。

本发明再一目的是提供上述犬、猫长效融合干扰素在制备治疗犬、猫类动物疾病的药物中的应用。

本发明的犬长效融合干扰素的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，全长777个氨基酸组成，自氨基末端第1位至第608位为犬血清白蛋白，自氨基末端第614位至第777位为犬干扰素α，自氨基末端第609位至613位为柔性linker，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明的猫长效融合干扰素的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，全长883个氨基酸组成，自氨基末端第1位至第690位为猫白蛋白，自氨基末端第696位至第883位为猫干扰素α，自氨基末端第第691位至695位为柔性linker，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

本发明还提供含有上述基因的的表达载体，含有上述融合蛋白或基因或表达载体的工程菌。

本发明还提供扩增上述基因中任一片段的引物序列。

本发明的犬、猫长效融合干扰素是用犬、猫血清白蛋白作为干扰素的修饰及稳定保护剂，将血清白蛋白和干扰素基因用柔性Linker基因连接后插入到酵母多拷贝表达载体pPIC3.5k的多克隆酶切位点区，并利用同源重组方法将表达基因重组进酵母基因组中，发酵培养重组酵母、诱导融合蛋白表达，纯化得到犬、猫长效融合干扰素融合蛋白。

具体地，本发明犬、猫长效融合干扰素的制备工艺，包括以下步骤：

1、基因扩增与质粒构建：根据犬、猫血清白蛋白基因设计引物，PCR扩增得到犬、猫血清白蛋白基因的开放阅读框，以犬、猫血清白蛋白天然信号肽作为融合蛋白的表达信号肽，在犬、猫血清白蛋白N端引入EcoRⅠ酶切位点基因、C端去除终止密码子后引入柔性Linker基因及酶切位点BamHⅠ酶切位点基因；

根据犬、猫干扰素基因设计引物，PCR扩增得到犬、猫干扰素基因的开放阅读框，去掉干扰素基因起始密码子，在犬、猫干扰素基因N端与C端分别引入BglⅡ、EcoRⅠ酶切位点基因，用T4连接酶对犬、猫血清白蛋白基因与犬、猫干扰素基因在BamHⅠ和BglⅡ酶切位点处连接，并将连接的犬、猫血清白蛋白-干扰素融合基因插入经过EcoRⅠ酶切的pPIC3.5k、pPIC9k或其它毕赤酵母表达载体中，分别构建犬、猫血清白蛋白-干扰素融合蛋白重组表达载体质粒；

2、酵母转化与诱导培养：用同源重组法将经SalⅠ酶切线性化的重组表达载体转化入酵母真菌SMD1168、GS115或其它毕赤酵母真菌基因组中，以甘油为唯一碳原和能源的培养基发酵培养重组酵母，以甲醇为唯一碳原和能源的培养基诱导表达融合蛋白；

3、蛋白纯化与活性检测：表达蛋白产物经SDS-PAGE电泳分析蛋白表达产物，经超滤浓缩、亲和层析、脱盐层析纯化，采用体外细胞攻毒和体内接种后相关细胞因子检测的方法检测长效融合干扰素蛋白的生物学活性。

本发明还提供一种用于治疗多种肿瘤及病毒性疾病的药物，所述药物含有上述融合蛋白。所述药物还包括加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂等。

本发明旨在于利用犬血清白蛋白（CSA）和猫血清白蛋白（FSA）的运输和稳定性调节功能，使干扰素免受胰蛋白酶等消化酶的降解破坏，也可以降低动物肾小球滤过系统对干扰素融合蛋白代谢排除率，分别对犬干扰素（cIFN）、猫干扰素（fIFN）进行融合修饰，分别制备犬血清白蛋白-干扰素（CSA-cIFN）融合蛋白、猫血清白蛋白-干扰素（FSA-fIFN）融合蛋白，不仅延长了动物干扰素的半衰期，还有效的提高了干扰素动物机体内的治疗及免疫调节功能，并充分发挥干扰素的生物学活性，达到更好的对动物疾病的防治目的。

本发明的积极效果在于：选用了犬、猫血清白蛋白与干扰素进行融合表达制备犬长效融合干扰素、猫长效融合干扰素，以延长干扰素半衰期、提高干扰素动物体内生物学活性和治疗效果。本发明获得的犬、猫长效融合干扰素制剂以酵母表达制备融合蛋白，下游的蛋白纯化工艺简便，产品成本降低，也更利于融合干扰素制品的推广，应用于犬、猫等动物疾病的防治工作中。

附图说明

图1为pPIC3.5k-CSA-cIFN载体构建示意图；

图2为pPIC3.5k-FSA-fIFN载体构建示意图；

图3为犬、猫重组干扰素融合蛋白SDS-PAGE鉴定图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1犬、猫长效融合干扰素的制备

分别以CSA、FSA、cIFN、fIFN，进行重组犬、猫血清白蛋白-干扰素融合蛋白表达载体的构建。

犬、猫血清白蛋白-干扰素融合蛋白的制备步骤：

1、参照犬血清白蛋白（CSA）基因（NM_001003026.1）、猫血清白蛋白（FSA）基因（NM_001009961.1）序列开放阅读框及酵母表达载体pPIC3.5k物理图谱设计引物并引入酶切位点，其间保留血清白蛋白天然信号肽，去除血清白蛋白终止密码子，去除干扰素信号肽、起始密码子。

（1）CSA上游引物：

CSA1：

5`-GCGAATTCGCCATGAAGTGGGTAACTTTTATTTCCCTCTTCTTTC-3`，其中5`端含有EcoRⅠ酶切位点；

CSA下游引物：

CSA2：

5`-TAGGATCCACCACCACCGACTAAGGCAGCTTGAGCAGCAGCAACGAG-3`，其中5`端含有BamHⅠ酶切位点和柔性Linker基因；

（2）犬α干扰素（M28624.1）上游引物：

α-cIFN1：

5`-GCAGATCTAATATAGCGCAGCCAGGCCCAC-3`，其中5`端含有BglⅡ酶切位点；

犬α干扰素下游引物：

α-cIFN2：

5`-GCCTTAAGGGTCTCATTTCCTCCTCCTGATTCT-3`，其中5`端含有EcoRⅠ酶切位点；

（3）FSA上游引物：

FSA1：

5`-GCGAATTCGCCATGGTCGACTTTGGCACAATGAAGT-3`，其中5`端含有EcoRⅠ酶切位点；

FSA下游引物：

FSA2：

5`-TAGGATCCACCACCACCGCAGCTGAGAGTCCCATCCGACTCTTA-3`，其中5`端含有BamHⅠ酶切位点和柔性Linker基因；

（4）猫α干扰素（DQ220469.1）上游引物：

α-fIFN1：

5`-GCAGATCTGCGCTGTCCTCTTCCTT-3`，其中5`端含有BglⅡ酶切位点；

猫α干扰素下游引物：

α-fIFN12：

5`-GCGAATTCTCATTTCTCGCTCCTTAA-3`，其中5`端含有EcoRⅠ酶切位点；

2、利用上述引物序列进行PCR反应

犬、猫血清白蛋白基因PCR体系：pfu530聚合酶0.2μl，Buffer4μl，2.5mM dNTP1.6μl，0.5μM上下游引物各1.6μl，模板DNA200ng，二馏水补充体系至20μl；

犬、猫干扰素基因PCR体系：pfu530聚合酶0.2μl，Buffer4μl，2.5mM dNTP1.6μl，0.5μM上下游引物各0.5μl，模板DNA30ng，二馏水补充体系至20μl；

PCR反应条件：犬、猫PCR反应通用参数：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环后于72℃延伸10min；

将各个PCR产物纯化回收后，分别联入pEASY-T1载体（购自北京全式金生物技术有限公司），并测序及酶切鉴定。分别将CSA与cIFN酶切产物连接、FSA与fIFN酶切产物连接，纯化回收后再分别连入经EcoRⅠ酶切的pPIC3.5k载体（购自Invitrogen公司），制备CSA-cIFN融合蛋白酵母表达载体pPIC3.5k-CSA-cIFN（图1所示），及FSA-fIFN融合蛋白酵母表达载体pPIC3.5k-FSA-fIFN（图2所示），酶切和测序鉴定后，用SalⅠ分别线性化两种表达载体，同源重组法分别转化入毕赤酵母菌株SMD1168中，G418抗生素梯度抗性筛选，得到高效表达的优势表达菌株毕赤酵母菌。

2、以甘油为唯一碳原和能源的培养基发酵培养重组酵母，以甲醇为唯一碳原和能源的培养基诱导表达融合蛋白。

以甘油为唯一碳原和能源的培养基，即BufferedGlycerol-complex Medium(BMGY)培养基，配制方法如下：

1%酵母提取物

2%蛋白胨

100mM磷酸盐缓冲液，pH6.0

1.34%YNB

4×10-5%生物素

1%甘油

以甲醇为唯一碳原和能源的培养基，即BufferedMethanol-complex Medium(BMMY)培养基，配制方法如下：

1%酵母提取物

2%蛋白胨

100mM磷酸盐缓冲液，pH6.0

1.34%YNB

4×10^-5%生物素

0.5%甲醇

用BMGY培养基250～300转/分钟，震荡发酵培养重组酵母菌至浓度OD600=2～6之间，3000转/分钟常温离心收集重组酵母菌，改换BMMY培养基重悬重组酵母菌至浓度OD600=1，250～300转/分钟，震荡培养重组酵母菌，诱导表达融合蛋白。

3、采用超滤浓缩、亲和层析和脱盐层析纯化长效融合干扰素蛋白。

超滤浓缩用30KD的超滤膜，4000转/分钟水平离心超滤，100倍浓缩。

亲和层析采用HiTrap Blue Hp柱，特异性亲和层析血清白蛋白-干扰素融合蛋白。

脱盐层析，用HiTrap Desalting柱脱盐处理血清白蛋白-干扰素融合蛋白。经纯化后得到犬、猫长效融合干扰素蛋白，结果如图3所示，目的蛋白的纯度在最初原液中为51.2%，纯化后的蛋白纯度达到88.7%，犬长效融合干扰素蛋白分子量约为95KD，猫长效融合干扰素蛋白分子量约为92KD，均与经过一定糖基化修饰后的蛋白分子量大小相符。

实施例2犬、猫长效融合干扰素的活性检测

1、体外生物学活性检测：采用WISH-VSV微量细胞病变抑制法检测犬、猫长效融合干扰素体外生物学活性，将细胞计数为2.5×105～3.5×105个/ml的WISH细胞悬液接种于96孔细胞板，每孔100μl，37℃，5%CO₂条件下培养4～6h。准备完全培养液：10%牛血清MEM，测定培养液：7%牛血清MEM，攻毒培养液：3%牛血清MEM。用测定培养液稀释标准样品至103IU/ml，再将标准样品稀释液和待测诱导培养上清液做4倍倍比稀释，共稀释至412倍。将倍比稀释的阳性对照标准品和待测的诱导培养上清液按浓度梯度对应加入已经铺被WISH细胞的96孔板中，每孔100μl，37℃5%CO₂培养18～24h。弃上清，每孔加入100μl的VSV，攻毒剂量100TCID50，37℃，5%CO₂培养24h，显微镜观察病变情况。经检测犬长效融合干扰素效价为25×10⁴IU/ml，猫长效融合干扰素效价为22×10⁴IU/ml。

综上所述本发明的犬、猫长效融合干扰素蛋白有较好的体外抗病毒活性。

2、体内生物学活性检测：由于动物体内2`,5`-寡腺苷酸合成酶含量水平是检测干扰素含量的一种指标，采用荧光定量PCR法，分别检测接种犬、猫长效融合蛋白的实验动物体内2`,5`-寡腺苷酸合成酶含量水平，检测时间分别为0天，0.5天，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，15天，16天，得出结论两种长效融合干扰素蛋白在动物体内可持续13天，具有较长的半衰期和较好的体内生物学活性。所得到的融合干扰素的长效结果明显优于已经广泛报道的非长效犬或猫干扰素制剂。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (13)

1.一种由犬血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No 1所示。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 3所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.含有权利要求1所述融合蛋白的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的宿主细胞。

7.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：将权利要求4所述的表达载体导入宿主细胞，诱导表达得到融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母，所述表达载体为毕赤酵母表达载体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为SMD1168或GS115。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pPIC3.5k或pPIC9k。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述表达载体将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列插入pPIC3.5k的EcoR Ⅰ酶切位点。

12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以甲醇为唯一的碳原和能源的培养基诱导表达，表达产物经过超滤浓缩、亲和层析、脱盐层析纯化得到融合蛋白。

13.一种预防和/或治疗肿瘤，和/或抑制病毒的药物，其特征在于，含有权利要求1所述的融合蛋白。