JP2016179951A - 遺伝子組換え動物血清アルブミン、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、安全で大量生産可能であるとともに血液由来の動物血清アルブミンと代替可能な、遺伝子組換え動物血清アルブミンを提供することを目的とする。また、本発明は、安全で大量生産可能な、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、ヒトを除く哺乳類動物の血清アルブミンであり、ピキア属酵母由来の細胞を宿主細胞として、遺伝子組換えにより産生されることを特徴とする。【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子組換え動物血清アルブミン、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体に関する。

日本では動物用血液バンクが法的に認められておらず、動物用血液を備蓄するシステムが存在しない。そのため、輸血療法が必要な重症動物（事故などで大量出血した動物や貧血の動物）を治療する際には、獣医自身が自力で輸血液を入手しなければならず、多くの動物病院では院内に供血犬、供血猫（ドナー）を飼育している。したがって、動物の輸血療法における最大の課題は、ドナーの確保にある。
しかし、人工的に合成される動物用の血液代替物が開発されれば、ドナーの確保が不要になるばかりでなく、採血コスト、輸血コストを大幅に削減できる。また、長期間保存可能な人工血液であれば、緊急時の対応も万全となる。
臨床利用を目的としたヒト用人工血液の開発は、１９７０年代から欧米日を中心に展開されてきている。特に、酸素を輸送する機能を代替できる赤血球代替物（人工酸素運搬体）については、これまで多くの製剤が合成され評価されてきたが、いまだ実用化された製剤はない。例えば、米国では、ヒトヘモグロビンを分子内架橋した分子内架橋ヘモグロビン（例えば、特許文献１参照）、ヒトヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体（例えば、特許文献２参照）、ウシヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体（例えば、特許文献３参照）、ヒトヘモグロビンの分子表面に水溶性高分子であるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を結合させたＰＥＧヘモグロビン（例えば、特許文献４参照）、などが検討され、臨床試験が進められてきた。
これらの中でも、ウシヘモグロビン重合体は、動物用の人工酸素運搬体として米国および英国で製造・販売され、貧血犬の治療に用いられているが、皮膚、粘膜、尿の変色、嘔吐、黒色糞便などの副作用が報告されている。

本願の発明者らは、ヘモグロビンにアルブミンを結合させたコア−シェル型のヘモグロビン−アルブミン複合体を合成し、これが新しい人工酸素運搬体となることを明らかにした（特許文献５参照）。血清アルブミンは、血漿に最も多く含まれる単純タンパク質であり、血液中ではコロイド浸透圧の維持のほか、各種外因性・内因性物質を運搬・貯蔵する役割を担っている。酸素輸送タンパク質であるヘモグロビンを血清アルブミンで包んだ構造のヘモグロビン−血清アルブミン複合体は、分子表面が血清アルブミンと同じように強く負に帯電しているため、生体適合性の高い（例えば、腎排泄や血管からの漏出に伴う血圧亢進などの副作用がない）安全な赤血球代替物として機能する。

ヘモグロビン−血清アルブミン複合体を動物用、特にペット（イヌ、ネコなど）用の赤血球代替物として使用する場合は、解決しなければならない課題がある。ヘモグロビン−血清アルブミン複合体の表面は血清アルブミンで覆われているため、例えば、イヌ用のヘモグロビン−血清アルブミン複合体を製造する場合、イヌ血清アルブミンを成分として用いることが望ましい。イヌ以外の異種アルブミンからなるヘモグロビン−血清アルブミン複合体をイヌに投与すると、抗体が産生され再投与された際、重篤な副作用を引き起こす可能性が否定できない。しかし、原料としてのイヌ血清アルブミンは、イヌの血液（血清）から精製・単離しなければならないため、製造に充分な量を安定確保することは難しい。この問題を解決する方策としては、遺伝子工学的にイヌ血清アルブミンを合成し、ヘモグロビン−血清アルブミン複合体の原料として利用することが考えられる。しかし、遺伝子組換えヒト血清アルブミンの製造技術（例えば、特許文献６参照）が確立されているのに対し、血液由来のイヌ血清アルブミンと同一の物性及び構造を有する遺伝子組換えイヌ血清アルブミンの産生技術は確立されていない。唯一、Ｒｕｄｏｌｆ Ｖａｌｅｎｔａらは、イヌの肝臓からイヌ血清アルブミンのｃＤＮＡを採取し、それをプラスミドに導入し、大腸菌を用いて遺伝子組換えイヌ血清アルブミンを産生している（非特許文献１参照）。しかし、得られる遺伝子組換えイヌ血清アルブミンの量は極微量であり、またその物性及び構造は明らかにされていない。また、遺伝子組換えタンパク質を大腸菌を宿主細胞として用いて得ると、大腸菌由来の毒性のあるリポ多糖（ＬＰＳ）が残存する懸念もある。

特開平１０−３０６０３６号公報 特表平１１−５０２８２１号公報 特表２００６−５１６９９４号公報 特表２００５−５１５２２５号公報 国際公開第２０１２／１１７６８８号 国際公開第９６／１２８１６号

Ｄｕｎｄｈｉ Ｐａｎｄｊａｉｔａｎ，Ｒｕｄｏｌｆ Ｖａｌｅｎｔａら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５，２７９−２８５（２０００）

本発明は、安全で大量生産可能であるとともに血液由来の動物血清アルブミンと代替可能な、遺伝子組換え動物血清アルブミンを提供することを目的とする。また、本発明は、安全で大量生産可能な、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体を提供することを目的とする。

本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、ヒトを除く哺乳類動物の血清アルブミンであり、ピキア属酵母由来の細胞を宿主細胞として、遺伝子組換えにより産生されることを特徴とする。

本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、
（ａ）質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）により得られる分子量が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であり、
（ｂ）等電点電気泳動法により得られる等電点が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であり、
（ｃ）円偏光二色性スペクトル分析により得られるαへリックス含量が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一である、
ことが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合されたシェルとしての、本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンと、を有することを特徴とする。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記ヘモグロビンにおける前記架橋剤との結合部位がリシンであることが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンにおける前記架橋剤との結合部位がシステイン３４であることが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記ヘモグロビンと前記架橋剤との結合がアミド結合であり、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと前記架橋剤との結合がスルフィド結合及びジスルフィド結合のいずれかであることが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの数が１個〜７個であることが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記ヘモグロビンが、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、イヌヘモグロビン、ネコヘモグロビン、ウサギヘモグロビン及びヒトヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンが、遺伝子組換えイヌ血清アルブミン、遺伝子組換えネコ血清アルブミン、遺伝子組換えウサギ血清アルブミン、及び遺伝子組換えウシ血清アルブミンからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの由来となる動物と、前記ヘモグロビンの由来となる動物とが異なり、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの由来となる動物用であることが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記ヘモグロビンが、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビンまたはウマヘモグロビンであり、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンが、遺伝子組換えイヌ血清アルブミン、遺伝子組換えネコ血清アルブミンまたは遺伝子組換えウマ血清アルブミンであることが好ましい。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記架橋剤が、下記一般式（１）〜（３）及び化学式（１）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

一般式（１）中、Ｒ₁は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。

一般式（２）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。

一般式（３）中、Ｒ₂は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記架橋剤が、下記一般式（４）で表されることが好ましい。

一般式（４）中、Ｒ₃は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、Ｒ₄は、下記一般式（５）〜（６）及び下記化学式（２）〜（４）のいずれかを表す。

一般式（５）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。

一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２を表す。

本発明の人工血漿増量剤は、本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミン及び／または本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を含むことを特徴とする。

本発明の人工酸素運搬体は、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を含むことを特徴とする。

本発明によれば、安全で大量生産可能であるとともに血液由来の動物血清アルブミンと代替可能な、遺伝子組換え動物血清アルブミンを提供することができる。また、本発明によれば、安全で大量生産可能な、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体を提供することができる。

図１は、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体の一実施形態を示す図である。

以下に本発明を実施するための一実施形態を例示する。

（遺伝子組換え動物血清アルブミン）
本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、ヒトを除く哺乳類動物の動物血清アルブミンであり、ピキア属酵母由来の細胞を宿主細胞として、遺伝子組換えにより産生される。

＜動物血清アルブミン＞
上記動物血清アルブミンは、ヒトを除く哺乳類動物の血清アルブミンである。

＜＜血清アルブミン＞＞
アルブミン欠乏を伴うヒト患者の治療として、ヒト血清アルブミンが投与されている。血清アルブミンは、血漿において豊富なタンパク質であり、投与にあたり大量に必要となる。また、ヘモグロビン−血清アルブミン複合体の製造においても、血清アルブミンは原料として大量に必要となる。
血清アルブミンを取得する一般的な方法としては、採血した血液の血清分画から精製して得る方法、または、遺伝子組換え技術を用いて、異種の宿主細胞で発現させて得る方法、若しくは無細胞系で発現させて得る方法、などが挙げられる。

本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、遺伝子組換え技術を用いて、異種の宿主細胞で発現させて得る動物血清アルブミンである。

＜ヒトを除く哺乳類動物＞
上記ヒトを除く哺乳類動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、などが挙げられる。
これらの中でも、イヌ、ネコ及びウサギ、特には、イヌ及びネコは、愛玩動物として動物病院での受診頻度が高いことから、潜在的な需要が高く、本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンを好適に適用できる。

＜＜遺伝子組換えイヌ血清アルブミン＞＞
本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、イヌ用であれば、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターを用いて、ピキア属酵母由来の細胞を宿主細胞として、遺伝子組換えにより産生されて得られる。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、イヌの血清アルブミンをコードしたアミノ酸配列である。
前記遺伝子組換えイヌ血清アルブミンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の血清アルブミンに限定されず、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性の血清アルブミンを含む。前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムに基づいて決定することができる。

＜＜遺伝子組換えネコ血清アルブミン＞＞
本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、ネコ用であれば、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターを用いて、ピキア属酵母由来の細胞を宿主細胞として、遺伝子組換えにより産生されて得られる。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ネコの血清アルブミンをコードしたアミノ酸配列である。
前記遺伝子組換えネコ血清アルブミンは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の血清アルブミンに限定されず、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性の血清アルブミンを含む。前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムに基づいて決定することができる。

＜＜遺伝子組換えウサギ血清アルブミン＞＞
本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、ウサギ用であれば、例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターを用いて、ピキア属酵母由来の細胞を宿主細胞として、遺伝子組換えにより産生されて得られる。配列番号３で表されるアミノ酸配列は、ウサギの血清アルブミンをコードしたアミノ酸配列である。
前記遺伝子組換えウサギ血清アルブミンは、配列番号３で表されるアミノ酸配列の血清アルブミンに限定されず、例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性の血清アルブミンを含む。前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムに基づいて決定することができる。

−配列同一性−
上記配列同一性％は、コンピュータープログラムを用いて決定することができる。斯かるコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０））、及びＣｌｕｓｔａｌＷ、などがあげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７））に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら）。

＜宿主細胞＞
上記宿主細胞としては、ピキア属酵母由来の細胞である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５株、ピキア・パストリスＧＳ１９０株、ピキア・パストリスＰＰＦ１株、ピキア・パストリスＫＭ７１株、ピキア・パストリスＳＭＤ１１６８株、野生型ピキア・パストリス、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５株は、ヒスチジン要求性に基づく選択が可能であり、更に収量が高くなる点で特に有利である。

一般的に、遺伝子組換えタンパク質を発現させるための宿主細胞として、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、などが用いられている。分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質及び／又は高等生物のタンパク質を、大腸菌に発現させる場合には、大腸菌の菌体内で発現したタンパク質が不溶化して封入体を形成することが多い。この場合、変性剤等を用いて封入体からタンパク質を抽出してその後リフォールディングをする方法、ペリプラズムへの分泌産生などを促す方法、が採用される。しかし、一般的にそれらの方法により得られるタンパク質の収量は低い。また、仮に前記リフォールディングを行ったとしても、ネイティブのタンパク質の構造と異なることが多い。動物血清アルブミンは、分子内に複数のジスルフィド結合を有するタンパク質であり、遺伝子組換え動物血清アルブミンを大腸菌を宿主細胞にして得たとしても、得られた遺伝子組換え動物血清アルブミンは、血液由来の血清アルブミンと、物性及び／又は構造が異なる可能性がある。
また、前記昆虫細胞及び動物細胞に発現させる場合には、得られるタンパク質の量の割には高コストとなるため、大量生産には不向きである。

一方、ピキア属酵母に発現させる場合には、得られる遺伝子組換え動物血清アルブミンの物性及び構造は、血液由来の動物血清アルブミンの物性及び構造と実質的に同一となる。
ピキア属酵母で動物血清アルブミンを発現させると、動物血清アルブミンが細胞外へ分泌される。したがって、宿主細胞内のプロテアーゼによる影響を受けにくいため、分解しにくく、血清アルブミンを完全長で得られると考えられる。これにより、遺伝子組換え動物血清アルブミンを、大量に製造可能となっていると考えられる。
また、ピキア属酵母で動物血清アルブミンを発現させると、分子内ジスルフィド結合が形成されて、血液由来の動物血清アルブミンと同じ構造の血清アルブミンが得られると考えられる。
さらに、ピキア属酵母で動物血清アルブミンを発現させると、大腸菌の系を用いないことにより、大腸菌を宿主細胞としたときに問題となる、リポ多糖（ＬＰＳ）の混入も回避することができる。

＜＜遺伝子組換え動物血清アルブミンの製造方法＞＞
上記遺伝子組換え動物血清アルブミンの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、
（ａ）血清アルブミンをコードする核酸配列を有した発現ベクターを作製する、発現ベクター作製工程と、
（ｂ）前記発現ベクターをピキア属酵母に由来する細胞に導入して、形質転換した酵母を得る、形質転換工程と、
（ｃ）前記形質転換した酵母を培養液中で培養する、培養工程と、
（ｄ）前記酵母が培養された培養液から遺伝子組換え動物血清アルブミンを分離する、分離工程と、
（ｅ）前記分離した遺伝子組換え動物血清アルブミンを精製する、精製工程と、を含む遺伝子組換え動物血清アルブミンの製造方法を挙げることができる。

−発現ベクター作製工程−
上記発現ベクター作製工程は、血清アルブミンをコードする核酸配列を有した発現ベクターを作製する工程である。
前記血清アルブミンをコードする核酸配列は、血清アルブミンをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）から得ることができる。
前記血清アルブミンをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）は、公知の方法、例えば、動物の肝臓ｃＤＮＡライブラリーを用い、合成核酸をプローブとして用いたハイブリダイゼーション法によって、スクリーニングして得ることができる（例えば、Ｓｈｕｊｉ Ｍｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２４，５５８−５６４（１９８４）を参照して作製することができる）。
前記血清アルブミンをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を鋳型として、ＰＣＲ法（ポリメラーゼチェーンリアクション法）等により血清アルブミンをコードする核酸配列の断片を増幅し、得られた増幅物を所望のベクターに挿入して、発現ベクターを作製することができる。

−−ベクター−−
上記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、染色体外で独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、自己複製可能な発現ベクター、宿主細胞に導入されたときに、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製される発現ベクター、などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし２種以上を併用してもよい。
前記ベクターは、宿主細胞において血清アルブミンを発現するために、上記血清アルブミンをコードする核酸配列の他に、発現を制御する塩基配列、宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー、などを含むことが望ましい。

−−−発現を制御する塩基配列−−−
上記発現を制御する塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロモーターをコードする塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし２種以上を併用してもよい。
前記プロモーターとしては、宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ＡＯＸ遺伝子のプロモーターを有するベクターにおいては、血清アルブミン遺伝子を、ピキア・パストリスのＡＯＸ遺伝子のプロモーターの下流（３’側）に挿入しておくと、メタノール非依存下で血清アルブミン遺伝子の転写を極めて低く抑えることができ、メタノール存在下で血清アルブミン遺伝子の転写を効率良く誘導できる。このため、メタノールを存在させるか否かで、血清アルブミンの発現タイミングを調節することが可能となる。
前記シグナルペプチドとしては、宿主細胞において、タンパク質の分泌に寄与するものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

−−−遺伝子マーカー−−−
上記遺伝子マーカーとしては、発現ベクターを導入した細菌または細胞を選択するためのマーカーである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、栄養要求性を補完する遺伝子、薬剤耐性をコードする遺伝子、などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし２種以上を併用してもよい。
例えば、ピキア属酵母のピキア・パストリスＧＳ１１５株は、ヒスチジン合成酵素の遺伝子が変異しており（ｈｉｓ４）、ヒスチジン要求性を示すが、発現ベクターに上記栄養要求性を補完する遺伝子として変異のない合成酵素の遺伝子（ＨＩＳ４）が組み込まれることによって、形質転換した宿主細胞のヒスチジン要求性はなくなる。これにより発現ベクターが導入された宿主細胞を選択可能となる。
また、アンピシリン等の薬剤に対する薬剤耐性をコードする遺伝子を遺伝子マーカーとして用いて、発現ベクターが導入された形質転換した宿主細胞を選択することもできる。

−形質転換工程−
上記形質転換工程は、上記発現ベクターをピキア属酵母に由来する細胞に導入して、形質転換した酵母を得る工程である。
前記酵母の形質転換の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のスフェロプラスト法、塩化リチウムを用いた方法、エレクトロポレーション法、などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし２種以上を併用してもよい。

−培養工程−
上記培養工程は、上記形質転換した酵母を培養液中で培養する工程である。
前記形質転換した酵母が、ピキア・パストリスを宿主細胞として得られている場合は、前記培養液に含ませる成分として、酵母エキス、無機塩類、ビタミン、炭素源（グリセロール等）を挙げることができる。
これらの成分の他にも、メタノールを前記培養液に加えることにより、血清アルブミンの発現を調節することも可能である。

−分離工程−
上記分離工程は、上記酵母が培養された培養液から遺伝子組換え動物血清アルブミンを分離する工程である。
前記培養液に分泌された遺伝子組換え動物血清アルブミンを分離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫酸アンモニウム等を用いた塩析、透析、限外ろ過濃縮、などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし２種以上を併用してもよい。

−精製工程−
上記精製工程は、上記分離した遺伝子組換え動物血清アルブミンを精製する工程である。
前記分離した遺伝子組換え動物血清アルブミンを精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲルろ過分画操作、イオンクロマトグラフィー操作、疎水クロマトグラフィー操作、アフィニティークロマトグラフィー操作、などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし２種以上を併用してもよい。

＜遺伝子組換え動物血清アルブミンの物性及び構造＞
本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンの物性及び構造を特定する指標としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（ａ）質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）により得られる分子量、（ｂ）等電点電気泳動法により得られる等電点、（ｃ）円偏光二色性スペクトル分析により得られるαへリックス含量、（ｅ）Ｘ線結晶構造解析による三次元構造、（ｆ）糖鎖修飾、（ｇ）吸着脂肪酸量、などが挙げられる。

本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、
（ａ）質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）により得られる分子量が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であり、
（ｂ）等電点電気泳動法により得られる等電点が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であり、
（ｃ）円偏光二色性スペクトル分析により得られるαへリックス含量が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一である、
ことが好ましい。

さらに、本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの上記物性及び構造が、血液由来の動物血清アルブミンの前記物性及び構造と同一であることが特に好ましい。

＜＜分子量＞＞
上記分子量は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）により得られる分子量から判断することができる。
前記分子量が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であるか否かは、例えば、（遺伝子組換え動物血清アルブミンの質量分析による分子量）／（血液由来の動物血清アルブミンの質量分析による分子量）×１００（％）で算出される値が、９５％〜１０５％であるか否かで判断することができ、前記割合が、９５％〜１０５％であると、分子量が同一であるといえる。

−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）−
上記質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）による分子量の測定は、例えばＫｏｉｃｈ Ｔａｎａｋａｒａら、Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２，１５１−１５３（１９８８）などに記載の方法に準じて測定することができる。

＜＜等電点＞＞
上記等電点は、等電点電気泳動法により得られる等電点から判断することができる。
前記等電点が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であるか否かは、例えば、（遺伝子組換え動物血清アルブミンの等電点電気泳動法による等電点）／（血液由来の動物血清アルブミンの等電点電気泳動法による等電点）×１００（％）で算出される値が、９５％〜１０５％であるか否かで判断することができ、前記割合が、９５％〜１０５％であると、等電点が同一であるといえる。

−等電点電気泳動法−
上記等電点電気泳動法による等電点の測定は、例えばＤａｉｋｉ Ｔｏｍｉｔａら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１４，１８１６−１８２５（２０１３）などに記載の方法に準じて測定することができる。

＜＜αへリックス含量＞＞
上記αへリックス含量は、円偏光二色性スペクトル分析により得られるαヘリックス含量から判断することができる。
前記αへリックス含量が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であるか否かは、例えば、（遺伝子組換え動物血清アルブミンの円偏光二色性スペクトル分析によるαへリックス含量）／（血液由来の動物血清アルブミンの円偏光二色性スペクトル分析によるαへリックス含量）×１００（％）で算出される値が、９５％〜１０５％であるか否かで判断することができ、前記割合が、９５％〜１０５％であると、αへリックス含量が同一であるといえる。

−円偏光二色性スペクトル分析−
上記円偏光二色性スペクトル分析によるαへリックス含量の測定は、例えばＹｅｅ−Ｈｓｉｕｎｇ Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４４，１２８５−１２９１（１９７１）などに記載の方法に準じて測定することができる。

（ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体）
本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合されたシェルとしての遺伝子組換え動物血清アルブミンを有し、さらに必要に応じて、その他の部位を有する。
例えば、図１に示すように、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体１００は、コアとしてのヘモグロビン１０と、シェルとしての３個の遺伝子組換え動物血清アルブミン２０とを有する。図１において、ヘモグロビン１０と遺伝子組換え動物血清アルブミン２０とは、架橋剤（不図示）を介して結合されている。

＜遺伝子組換え動物血清アルブミン＞
本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体に用いる遺伝子組換え動物血清アルブミンは、上述した本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンである。
前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの等電点は、７よりも低く、生理条件では、分子表面が強く負に帯電しているため、血管内皮細胞の外側にある基底膜（負に帯電）との静電反発により、血管外に漏れ出しにくい。よって、ヘモグロビンを遺伝子組換え血清アルブミンで包んだ構造のヘモグロビン−遺伝子組換え血清アルブミン複合体は、分子表面が遺伝子組換え血清アルブミンと同じように強く負に帯電しているため、生体適合性の高い（例えば、腎排泄や血管からの漏出に伴う血圧亢進などの副作用がない）安全な赤血球代替物として機能する。
本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、上述の通り、血液由来の動物血清アルブミンの物性及び構造と実質的に同一であることから、動物に投与したときの副作用のリスクを低減することができる。また、イヌ及びネコの血液からアルブミンを大量に得ることは容易ではないが、上述のように本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは大量に得ることが可能であることから、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を大量に製造することが可能となる。

＜ヘモグロビン＞
上記ヘモグロビンの分子は、４つのサブユニットから構成され、各サブユニットは、それぞれ１つのプロトヘムを有する。該プロトヘム内の鉄原子に酸素が結合する。即ち、１つのヘモグロビン分子には、４つの酸素分子が結合する。
前記ヘモグロビンとしては、脊椎動物のものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、イヌヘモグロビン、ネコヘモグロビン、ウサギヘモグロビン、ヒトヘモグロビン、組換えヒトヘモグロビン、分子内架橋ヘモグロビン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
また、前記ヘモグロビンは、赤血球を溶解して得られるヘモグロビン、遺伝子組換え技術により得られるヘモグロビン、これらのヘモグロビンのサブユニットを架橋剤で分子内架橋して得られる分子内架橋ヘモグロビン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、特には、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビンは、産業動物のヘモグロビンとして、供給量の観点で入手が容易なため、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を大量に製造できるようになる点で有利である。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、ヘモグロビンをコアとして、遺伝子組換え動物血清アルブミンがヘモグロビンを覆うように構成される。本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を動物体内に投与すると、遺伝子組換え動物血清アルブミンが異種由来であると、投与された動物の体内において、免疫反応が生じやすい。したがって、遺伝子組換え動物血清アルブミンは、投与しようとする動物と同種に由来することが望ましい。一方、ヘモグロビンは、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を投与しようとする動物と異種に由来していても、免疫反応が生じにくい。したがって、免疫反応の観点で、ヘモグロビンの由来となる動物は、特に限定されず、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの由来となる動物と、前記ヘモグロビンの由来となる動物とが、異なっていてもよい。

食用加工において、ウシ、ブタ及びウマ、特にはウシ及びブタの血液は、多くが廃棄されている。斯かる血液を用いれば、ヘモグロビンの入手が容易となる。したがって、大量生産が可能な本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンと組み合わせて、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン又はウマヘモグロビンを用いることで、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は大量生産が可能となる。

したがって、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、イヌ用であれば、ウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌアルブミン複合体、ブタヘモグロビン−遺伝子組換えイヌアルブミン複合体又はウマヘモグロビン−遺伝子組換えイヌアルブミン複合体が好ましく、ネコ用であれば、ウシヘモグロビン−遺伝子組換えネコアルブミン複合体、ブタヘモグロビン−遺伝子組換えネコアルブミン複合体、又はウマヘモグロビン−遺伝子組換えネコアルブミン複合体が好ましく、ウサギ用であれば、ウシヘモグロビン−遺伝子組換えウサギアルブミン複合体、ブタヘモグロビン−遺伝子組換えウサギアルブミン複合体、又はウマヘモグロビン−遺伝子組換えウサギアルブミン複合体が好ましい。

上記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合する遺伝子組換え動物血清アルブミンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１個〜７個が好ましい。８個以上は、立体障害のため結合することが困難と考えられる。遺伝子組換え動物血清アルブミンの数が２〜５個であると、ヘモグロビンを十分に囲むことができる点で、有利である。
前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの数の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）電気泳動法により測定したヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体全体の分子量と、ヘモグロビンの分子量と、遺伝子組換え動物血清アルブミンの分子量に基づいて算出する方法、（２）シアノメトヘモグロビン法（例えば、アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６−１４）を用いたヘムの定量により算出したヘモグロビンの濃度、及び６６０ｎｍ法（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ社、６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｎｏ．２２６６２）を用いたタンパク質の定量により算出したタンパク質の濃度に基づいて算出する方法、（３）電子顕微鏡で観察する方法などが挙げられる。
また、遺伝子組換え動物血清アルブミンの数が異なるヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体の混合体から、遺伝子組換え動物血清アルブミンの数が所定の個数であるヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を単離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カラムクロマトグラフィーによる単離方法、などが挙げられる。

＜架橋剤＞
上記架橋剤としては、ヘモグロビンと遺伝子組換え動物血清アルブミンとを連結可能な２官能性架橋剤である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（１）〜（４）及び化学式（１）で表される化合物、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、α−（Ｎ−スクシンイミジル）−ω―ピリジルジチオ架橋剤（下記一般式（１）において、Ｒ₁が水素原子であり、ｎが５であるもの）、α−（Ｎ−スクシンイミジル）−ω―マレイミド架橋剤（下記一般式（４）において、Ｒ₃が水素原子であり、Ｒ₄が一般式（５）であるもの、さらには、Ｒ₃が水素原子であり、Ｒ₄が一般式（５）であり、かつｎ＝５であるもの、さらには、Ｒ₃が水素原子であり、Ｒ₄が化学式（３）であるもの）が好ましい。

一般式（１）中、Ｒ₁は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。例えば、ｎ＝５のものなどが一般的に挙げられる。

一般式（２）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。例えば、ｎ＝２のものなどが一般的に挙げられる。

一般式（３）中、Ｒ₂は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。例えば、ｎ＝５のものなどが一般的に挙げられる。

一般式（４）中、Ｒ₃は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、Ｒ₄は、下記一般式（５）〜（６）及び下記化学式（２）〜（４）のいずれかを表す。

一般式（５）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。

一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。

上記架橋剤におけるスクシンイミジル基と、ヘモグロビンにおけるリシン残基のアミノ基（−ＮＨ_2）とは、アミド結合（共有結合）を形成する。
前記アミド結合を形成するための方法としては、例えば、ヘモグロビン及び架橋剤を４℃〜３０℃で０．２時間〜３時間攪拌すること、などが挙げられる。
前記架橋剤におけるピリジルジチオ基と、遺伝子組換え動物血清アルブミン分子におけるシステイン３４（還元型システイン）とは、交換反応により新たなジスルフィド結合（共有結合）を形成する。なお、該ジスルフィド結合は、切断されやすいという特性を有する。
前記ジスルフィド結合を形成するための方法としては、例えば、遺伝子組換え動物血清アルブミン及び架橋剤を４℃〜３０℃で１時間〜４０時間攪拌すること、などが挙げられる。
前記架橋剤におけるマレイミド基と、遺伝子組換え動物血清アルブミン分子におけるシステイン３４（還元型システイン）とは、スルフィド結合（共有結合）を形成する。
前記スルフィド結合を形成するための方法としては、例えば、遺伝子組換え動物血清アルブミン及び架橋剤を４℃〜３０℃で１時間〜４０時間攪拌すること、などが挙げられる。
遺伝子組換え動物血清アルブミン分子において、システイン３４（還元型システイン）は１つしか存在しないため、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、星型のクラスター構造（例えば、図１の構造）となり、分子構造が明確である。

＜その他の部位＞
上記その他の部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子組換え動物血清アルブミン表面に共有結合により導入されたポリ（エチレングリコール）、遺伝子組換え動物血清アルブミンとともにヘモグロビンに結合されたタンパク質、などが挙げられる。

本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体の等電点としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜調整することができるが、４．０〜６．５が好ましく、４．２〜５．５がより好ましい。

以上より、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、酸素結合サイトがヘモグロビンであるため、安定な酸素化体を形成することが可能であり、体組織に効率良く酸素を供給することができる。また、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、コアヘモグロビンの周囲が遺伝子組換え動物血清アルブミンで覆われているので、等電点が遺伝子組換え動物血清アルブミンと同程度に低く、腎排泄、血管内皮細胞からの漏出、血管収縮による血圧亢進も惹起しない。また、ヘモグロビン及び遺伝子組換え動物血清アルブミンは生体物質であるため、代謝が良いと考えられる。さらに、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、調製が比較的容易であるにもかかわらず、三次元構造は明確である。
また、本願発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、ヘモグロビンが酸素結合部位であることにより、酸素結合解離曲線がＳ字曲線となり、特に、末梢細胞の酸素分圧が低下した場合に、酸素運搬能力が向上するという効果を有することが予測される。
以上より、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体は、生体適合性の観点及びＬＰＳを含まない観点で安全であり、大量生産が可能であり、酸素運搬能力を備えているといえる。

（人工血漿増量剤）
本発明の人工血漿増量剤は、本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミン及び／又は本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を含むことを特徴とする。なお、前記人工血漿増量剤とは、出血などにより、循環血液量が不足した患者に対して、循環血液量を回復・維持させる目的で投与される輸液剤乃至輸液製剤である。

（人工酸素運搬体）
本発明の人工酸素運搬体は、本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を含むことを特徴とする。なお、前記人工酸素運搬体とは、酸素分子を運搬可能な物質であり、生体に投与した場合には、赤血球の代替物として機能するものである。

以下、実施例を挙げて本発明の一実施形態をさらに詳しく説明するが、本発明は下記の実施例になんら限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲において適宜変更可能である。

（実施例１、２）
遺伝子組換えイヌ血清アルブミンを下記の通り製造した。

＜発現ベクター作製工程＞
−調製１：イヌ血清アルブミン（ＣＳＡ）遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列のＰＣＲによる増幅−
イヌ肝臓由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＣＳＡ遺伝子のＯＲＦ配列をＰＣＲにより増幅した。テンプレートのｃＤＮＡを０．５μＬ、１０μＭのセンス鎖プライマー（５’−ＴＣＧＡＡＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴ−３’）およびアンチセンス鎖プライマー（５’−ＴＧＴＣＴＡＡＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡ−３’）を各１μＬ、Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ社）を０．５μＬ、滅菌済み超純水２２．５μＬを混合し、（９８℃、１０ｓｅｃ→５８℃、５ｓｅｃ→７２℃、１ｍｉｎ）×３０ｃｙｃｌｅｓの条件でＰＣＲを行った。反応後、１％アガロース電気泳動で目的のサイズ（約１．８ｋｂｐ）のＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。

−調製２：イヌ血清アルブミン（ＣＳＡ）発現ベクターの構築と大腸菌へのクローニング−
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をピキア酵母発現ベクターｐＨＩＬ−Ｄ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のＥｃｏＲＩサイトにＩｎ Ｆｕｓｉｏｎ反応により組み込んだ。調製例１で得た反応液５μＬとＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＴａＫａＲａ社）２μＬを混合し、３７℃で１５分間、さらに８０℃で１５分間インキュベートした。反応後の溶液２μＬ、５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｅｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社）２μＬ、制限酵素ＥｃｏＲＩで直鎖状にした１５ｎｇ／μＬのｐＨＩＬ−Ｄ２溶液４μＬ、及び滅菌済み超純水２μＬを混合し、５０℃で１５分間インキュベートした。
ＸＬ１０−Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）１００μＬにβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを４．０μＬ加え、氷上で１０分間インキュベートした。さらに、上記Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ反応後の溶液１０μＬを加え、氷上で３０分間インキュベートした。４２℃で３０秒間加温後、速やかに氷上で２分間インキュベートすることによりサンプルを急冷し、９００μＬのＬＢ培養液を加え、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間振盪培養した。室温、２，０００ｇで３分間遠心分離した後に上清を９００μＬ除去し、残りの溶液で大腸菌を再懸濁した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に、大腸菌懸濁液を全量播種し、３７℃で１８時間培養することで薬剤耐性クローンのコロニーを形成させた。
アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培養液５ｍＬにコロニーを形成した大腸菌を植菌し、３７℃、２５０ｒｐｍで１８時間振盪培養した。室温、１６，０００ｇで１分間遠心分離することにより集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩ処理によるインサートチェック後、シーケンス解析により遺伝子配列を確認した。

＜形質転換工程＞
−調製３：ピキア酵母の形質転換−
シーケンス確認後のｐＨＩＬ−Ｄ２−ＣＳＡを制限酵素ＳａｌＩ処理により直鎖状とし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。ピキア酵母ＧＳ１１５株（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をＹＰＤ培養液５０ｍＬ中で濁度ＯＤ₆₀₀が約１．５になるまで３０℃、２５０ｒｐｍで振盪培養した。４℃、１，５００ｇで５分間遠心分離した後に上清を除去し、５０ｍＬの滅菌済み超純水で再懸濁することでピキア酵母を洗浄した。同様の操作によりピキア酵母を２５ｍＬの滅菌済み超純水で再度洗浄した。それを遠心分離し、上清を除去した後、１Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ溶液２ｍＬでピキア酵母を再懸濁した。さらにそれを遠心分離し、上清を除去した後、１Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ水溶液を全液量が約１００μＬとなるように加え、ピキア酵母を再懸濁し、氷上に静置した。氷冷したエレクトロポレーション用キュベットに１Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ溶液で懸濁したピキア酵母８０μＬを加え、さらに約１．５μｇ／μＬの直鎖状ｐＨＩＬ−Ｄ２−ＣＳＡを５μＬ入れた。ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）でエレクトロポレーションを行い、速やかに１Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ溶液１ｍＬを加えた。エレクトロポレーション後のピキア酵母懸濁液６００μＬを、アミノ酸を含まないＭＤ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）寒天培地上に播種した。３０℃で３日間培養することでコロニーを形成させ、ヒスチジン要求性によるピキア酵母ｒＣＳＡ発現株の選別を行った。

＜培養工程＞
−調製４：ピキア酵母による遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）の産生−
１０ｍＬのＢＭＧＹ（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−Ｃｏｍｐｌｅｘ）培養液に、ピキア酵母ｒＣＳＡ発現株を植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで回転撹拌しながら、培養液の濁度ＯＤ₆₀₀が１０〜２０になるまで前培養した。バッフル付三角コルベン（２Ｌ容量）に入れたＢＭＧＹ培養液１Ｌに、前培養後の酵母懸濁液２ｍＬを加え、濁度ＯＤ₆₀₀が３０〜３５になるまで再度３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。培養後に室温、３，０００ｇで１０分間遠心分離を行い、上清を除去した。ピキア酵母をＢＭＭＹ（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈａｎｏｌ−Ｃｏｍｐｌｅｘ）培養液２００ｍＬに再懸濁し、バッフル付三角コルベン（２Ｌ容量）に移した後、３０℃、２００ｒｐｍで５〜７日間振盪培養した。この間、２４時間毎にメタノール２ｍＬを添加した。培養後、４℃、１１，０００ｇで１５分間遠心分離し、培養上清を回収した。

＜分離工程＞
−調製５：培養液からの遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）の分離−
回収した培養上清に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるまで加え、４℃で３０分間静置した。４℃、１１，４００ｇで１５分間遠心分離した後に褐色の沈殿を除去し、回収した上清にさらに硫酸アンモニウムを９０％飽和になるまで加え、４℃で３０分間静置した。４℃、１１，４００ｇで３０分間遠心分離することで得られた沈殿を１００ｍＬの純水に溶解し、合計１５Ｌ以上の純水中で２４時間透析を行った。透析後、加圧式限外ろ過（分画分子量５０，０００）により溶液を約３０ｍＬまで濃縮し、セルロースアセテート膜フィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、以下ＤＩＳＭＩＣフィルターという）でろ過した。

＜精製工程＞
濃縮した溶液からのｒＣＳＡの精製は、ゲルろ過クロマトグラフィー後に陰イオン交換クロマトグラフィーを組合せた方法（実施例１）または、アフィニティークロマトグラフィーを用いた方法（実施例２）により行った。

−ゲルろ過クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーによる遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）の精製（実施例１）−
調製５で分離、濃縮したｒＣＳＡを含む水溶液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を加え、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液へと溶媒置換した。まず、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、ｒＣＳＡを含む褐色成分と培養液由来の茶褐色成分を分離した。具体的には、ｒＣＳＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をＵＶ検出器（２８０ｎｍ）及びレコーダーを接続したゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、溶出液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））にかけ、ｒＣＳＡを含む成分のみをサンプル瓶に集めた。
必要に応じ、遠心限外ろ過器（ＶＩＶＡ ＳＰＩＮ ２０、限外分子量３０ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に入れ、遠心分離機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて、４，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で濃縮した後、イオン交換クロマトグラフィーを用いてｒＣＳＡを精製した。具体的には、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐＱ ＦＦイオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にかけ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で洗浄後、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）緩衝液でｒＣＳＡを溶出した。回収したｒＣＳＡ水溶液は、合計１５Ｌ以上の純水中で２４時間透析を行い、加圧式限外ろ過（分画分子量１０，０００）による濃縮、１０倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の添加によるＰＢＳ（ｐＨ７．４）への溶媒置換、およびＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）によるろ過を行い、４℃で保存した。

−アフィニティークロマトグラフィーによる遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）の精製（実施例２）−
調製５で分離、濃縮したｒＣＳＡ水溶液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液を加えることで、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液へと溶媒置換した。その後、アフィニティークロマトグラフィーを用いてｒＣＳＡを精製した。具体的には、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍカラム（東ソー社）にかけ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液で洗浄後、３Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液でｒＣＳＡを溶出した。回収したｒＣＳＡ水溶液は、合計１５Ｌ以上の純水中で２４時間透析を行い、加圧式限外ろ過（分画分子量１０，０００）による濃縮、１０倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４）の添加によるＰＢＳ（ｐＨ７．４）への溶媒置換、およびＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過し、４℃で保存した。

（参考例１）
イヌ血液に由来するイヌ血清アルブミン（ＣＳＡ）を以下に示した方法により得た。
イヌ血漿３０ｍＬに硫酸アンモニウムを５０％飽和になるまで加え、４℃で３０分間静置した。４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心分離することにより得られた上清を回収し、ＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過した後、合計１５Ｌ以上の純水中で２４時間透析を行った。透析後、ＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過し、１Ｍ リン酸（ｐＨ７．０）緩衝液を加えることで、１００ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）緩衝液へと溶媒置換した。得られた水溶液を、１００ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍカラム（東ソー社）にかけ、１００ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）緩衝液で洗浄後、３Ｍ ＮａＣｌ水溶液でＣＳＡを溶出した。回収したＣＳＡ水溶液は、合計１５Ｌ以上の純水中で２４時間透析を行い、加圧式限外ろ過（分画分子量１０，０００）による濃縮、１０倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４）の添加によるＰＢＳ（ｐＨ７．４）への溶媒置換、およびＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）によるろ過を行い、４℃で保存した。

＜遺伝子組換え動物血清アルブミンの評価＞
実施例１で得られた遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）及び参考例１で得られた血液由来イヌ血清アルブミン（ＣＳＡ）について、それぞれの物性及び構造を比較するために、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）、等電点電気泳動法、円偏光二色性スペクトル分析を実施した。

＜Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ＞
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（６５．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％（ｖ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．００３％（ｗ／ｖ）Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）に溶解したｒＣＳＡ ５００ｎｇを５−１０％グラジエントポリアクリルアミドゲルＨｉ−ＱＲＡＳ Ｇｅｌ Ｎ（関東化学社）にロードし、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ）を用いて３０ｍＡで約１時間電気泳動を行った。泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行うと、単一のバンドが観測された。そのバンドの移動度が、比較対象として同時に測定したＣＳＡの示すバンドの移動度と一致したことから、ｒＣＳＡとＣＳＡとは同一の分子量、表面電荷、形状を有することがわかった。

＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（６５．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％（ｖ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．００３％（ｗ／ｖ）Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）に溶解したｒＣＳＡ ５００ｎｇを１００℃で５分間加熱した。この溶液を５−２０％グラジエントポリアクリルアミドゲルＨｉ−ＱＲＡＳ Ｇｅｌ Ｎ（関東化学社）にロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を用いて３０ｍＡで約１時間電気泳動を行った。泳動後、ＣＢＢ染色を行うと、単一のバンドが観測され、その移動度から算出した分子量は６５．７ｋＤａであった。
そのバンドの移動度と算出した分子量が、比較対象として同時に測定したＣＳＡの示すバンドの移動度と分子量に一致したことから、ｒＣＳＡとＣＳＡとは同一の分子量を有することがわかった。
ｒＣＳＡとＣＳＡの分子量（６５．７ｋＤａ）は、アミノ酸配列より算出した分子量６５．７ｋＤａと一致した。

＜ＨＰＬＣ＞
ＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、口径０．２μｍ）でろ過したｒＣＳＡのＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（２０μＭ）２０μＬを高圧液体クロマトグラフィーシステム［ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、日立ハイテクノロジーズ社、カラム：ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ−８０３ＨＰＬＣ（Ｓｈｏｄｅｘ社）、溶出液：リン酸緩衝水（５０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．４））、検出波長２８０ｎｍ、流速０．５ｍＬ／分］を用いて測定した。ｒＣＳＡは単一な流出曲線ピークを示し、その保持時間は１８．０分であった。そのピーク形状と保持時間が、比較対象として同時に測定したＣＳＡの示すピーク形状と保持時間（１８．０分）に一致したことから、ｒＣＳＡとＣＳＡとは同一の分子量を有することがわかった。

＜質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）＞
ターゲットプレート上にＭａｔｒｉｘ溶液（０．０５％トリフルオロ酢酸、０．１％シナピン酸、５０％アセトニトリル水溶液）１μＬを滴下し、すぐにｒＣＳＡ水溶液（５０μＭ）１μＬを滴下し、空気乾燥させた。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、Ａｕｔｏｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いて質量分析を行った結果、ｒＣＳＡの分子量は６５．６ｋＤａであることがわかった。この値は、アミノ酸配列から見積もったシミュレーション値（６５．７ｋＤａ）とよく一致した。
また、その分子量が、比較対象として同時に測定したＣＳＡの分子量６５．６ｋＤａと同等であったことから、ｒＣＳＡとＣＳＡとは同一の分子量を有することがわかった。

＜等電点電気泳動法＞
ＮＯＶＥＸ ＩＥＦサンプルバッファー ｐＨ３−１０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に溶解したｒＣＳＡ ５００ｎｇをＮｏｖｅｘ ｐＨ３−１０ ＩＥＦ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にロードした。陰極側にＮｏｖｅｘ ＩＥＦ Ｃａｔｈｏｄｅバッファー ｐＨ３−１０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、陽極側にＮｏｖｅｘ ＩＥＦ Ａｎｏｄｅバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間、５００Ｖで３０分間泳動を行った。泳動後、ＣＢＢ染色を行うと、単一のバンドが観測され、その移動度から算出した等電点（ｐＩ値）は４．５であった。そのバンドの移動度と算出したｐＩ値が、比較対象として同時に測定したＣＳＡの示すバンドの移動度とｐＩ値に一致したことから、ｒＣＳＡとＣＳＡとは同一の等電点を有することがわかった。

＜円偏光二色性スペクトル分析＞
分光用石製セル（１ｃｍ）にｒＣＳＡのＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（０．２μＭ）２ｍＬを加え、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル（２００−２５０ｎｍ）を円偏光二色性分光光度計（Ｊ−８２０、日本分光社）を用いて測定した（２５℃）。ｒＣＳＡは２０８ｎｍと２２２ｎｍに極小値を持つαへリックス由来のスペクトルパターンを示した。２２２ｎｍにおける計測楕円率度（［θ］ｏｂｓ）から算出したモル楕円率（［θ］ｍｉｎ）は−２２，８１７ ｄｅｇｒｅｅｓ ｃｍ² ｄｍｏｌ^-1であり、その値から見積もったαへリックス含量は６８％であった。
そのスペクトルパターン、［θ］ｍｉｎ、αへリックス含量が、比較対照として同時に測定したＣＳＡの示すスペクトルパターン、［θ］ｍｉｎ（−２２，８７８ ｄｅｇｒｅｅｓ ｃｍ²ｄｍｏｌ^-1）、αへリックス含量（６８％）と実質的に同一であったことから、ｒＣＳＡとＣＳＡとは同一のαヘリックス量を有することがわかった。

（実施例３）
ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）に遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）が１、２、３、４つ結合したウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ］、及び、ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）に遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）が平均３つ結合したウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＭＣＣ］を下記の通り製造した。

＜調製６：メルカプト遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ−ＳＨ）の調製＞
遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）におけるシステイン−３４（Ｃｙｓ−３４）の残基をチオール基に還元しておくために、以下の操作を行った。
サンプル瓶（３０ｍＬ容量）にｒＣＳＡのＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（１ｍＭ）１０ｍＬを入れ、そこにジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）（和光純薬社）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（２０ｍＭ）０．２５ｍＬ（ジチオスレイトール／ｒＣＳＡ＝０．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加えてよく振盪し、室温、遮光下で６０分間攪拌して反応溶液を得た。
得られた反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過した後、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ、２．５ｃｍφ、溶出液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４））にかけ、未反応のジチオスレイトールを除去した。ｒＣＳＡを含む溶出液を遠心限外ろ過器（ＶＩＶＡ ＳＰＩＮ ２０、限外分子量５ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に入れ、遠心分離機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて、４，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で、１０ｍＬまで濃縮することで、メルカプト遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ−ＳＨ）を得た。
チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、ｒＣＳＡのメルカプト分率を定量した。４，４’−ジチオピリジン（４，４’−Ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（４，４’−ＤＴＰ）は遊離チオール（ＳＨ）基と反応し、４−チオピリジノン（４−Ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｏｎｅ）（４−ＴＰ）を生じるので、ｒＣＳＡに４，４’−ＤＴＰを加え、生成した４−ＴＰの量を測ることにより、システイン３４（Ｃｙｓ−３４）におけるチオール基の量を定量した。
まず、分光用石製セル（１ｃｍ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）１．４７ｍＬを加え、紫外可視吸収（ＵＶ−Ｖｉｓ．）スペクトル（１９０ｎｍ−７００ｎｍ）を紫外可視分光光度計（紫外可視分光光度計８４５４、Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて測定した（ブランク）。
次に、その石英セルにｒＣＳＡ−ＳＨのＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（１ｍＭ）３０μＬを加えてよく振盪し（ｒＣＳＡ濃度＝２０μＭ）、紫外可視吸収スペクトル測定を行った。
続いて、４，４’−ＤＴＰ水溶液（１０ｍＭ）３０μＬを添加し［４，４’−ＤＴＰ／ｒＣＳＡ＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）］、よく振盪した。
３０分間静置した後、紫外可視吸収スペクトル測定を行った。３２４ｎｍの吸光度と４−ＴＰのモル吸光係数（ε₃₂₄＝１．９８×１０⁴Ｍ^-1ｃｍ^-1）から、ピリジルジチオ基の濃度を算出した。ｒＣＳＡ濃度で割ることにより、ｒＣＳＡのメルカプト分率（還元型システイン３４の割合）を算出したところ、６０％〜８０％であった。

＜調製７：ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＨｂＢｖ−ＳＭＣＣ）の調製＞
ナス型フラスコ（１００ｍＬ容量）にＣＯ化ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（０．１ｍＭ）１０ｍＬを入れ、撹拌しながら、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、和光純薬社）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（２０ｍＭ）１ｍＬをゆっくり添加し［ＳＭＣＣ／ＨｂＢｖ＝２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）］、２５℃で３時間撹拌した。得られた反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過した後、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ、２．５ｃｍφ、溶出液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４））にかけ、未反応の架橋剤を除去した。得られたウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＨｂＢｖ−ＳＭＣＣ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を遠心限外ろ過器（ＶＩＶＡ ＳＰＩＮ２０、限外分子量：１０ｋＤａ）を用いて２０ｍＬまで濃縮し、０．１ｍＭとした。

＜調製８：ウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ_n）ＳＭＣＣの調製＞
調製６で得たメルカプト遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ−ＳＨ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（１．０ｍＭ）１０ｍＬをナス型フラスコ（５０ｍＬ容量）に入れ、撹拌子で撹拌（１００ｒｐｍ）しながら、ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＨｂＢｖ−ＳＭＣＣ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（０．１ｍＭ）１０ｍＬをゆっくりと滴下し［ｒＣＳＡ−ＳＨ／ＨｂＢｖ−ＳＭＣＣ＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）］、４℃、遮光下で１４時間反応させ、反応溶液を得た。
該反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、口径０．２μｍ）でろ過し、低圧クロマトグラフィーシステム［ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＨｉＬｏａｄ ２６／６０）、溶出液：５０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．４）］を用いて、４℃にて分離・精製した。溶出液はフラクションコレクターで捕集した。溶出曲線においては、ｒＣＳＡ（Ｍｗ：６５．７ｋＤａ）のピークより早い時間に複数のピークが出現し、高分子量体の生成が示唆された。主要な４つのピークを含む分画について、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ電気泳動測定（５−１０％グラジエントポリアクリルアミドゲルＨｉ−ＱＲＡＳ Ｇｅｌ Ｎ、関東化学社）を行ったところ、Ｍｗ：１３０ｋＤａ〜４５０ｋＤａに明確な４つのバンドが現れたため、それぞれの成分のみを含む分画を単離し、回収した。
単離した各高分子量体について、シアノメトヘモグロビン法（ネスコートヘモキットＮ、アルフレッサファーマ社）によりＨｂＢｖ濃度を、また６６０ｎｍ法（６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社）によりタンパク質濃度を定量した。分子量の低い成分から、ｒＣＳＡ／ＨｂＢｖ比が１．１、２．１、３．０、４．０となり、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合したウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ］であることがわかった。

＜調製９：ウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均_n）ＳＭＣＣの調製＞
調製６で得たメルカプト遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ−ＳＨ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（１．０ｍＭ）１０ｍＬをナス型フラスコ（５０ｍＬ容量）に入れ、撹拌子で撹拌（１００ｒｐｍ）しながら、ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＨｂＢｖ−ＳＭＣＣ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（０．１ｍＭ）１０ｍＬをゆっくりと滴下し［ｒＣＳＡ−ＳＨ／ＨｂＢｖ−ＳＭＣＣ＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）］、４℃、遮光下で１４時間反応させ、反応溶液を得た。
該反応溶液から、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＦＣ）を用いて、未反応のｒＣＳＡのみを除去することで、ウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体の混合物を得た。具体的には、得られた反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）及びレコーダーを連結したゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ、１Ｌ、溶出液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４））にかけ、ｒＣＳＡ以外の高分子量成分をサンプル瓶に集めた。必要に応じ、遠心限外ろ過器（ＶＩＶＡＳＰＩＮ、限外分子量：３０ｋＤａ）を用いて濃縮した。シアノメトヘモグロビン法（ネスコートヘモキットＮ、アルフレッサファーマ社）によりＨｂＢｖ濃度を、また６６０ｎｍ法（６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社）によりタンパク質濃度を定量した。ｒＣＳＡ／ＨｂＢｖ比は３．０となり、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが平均３つ結合したウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＭＣＣ］であることがわかった。

（実施例４）
実施例３において、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、和光純薬社）を用いた代わりに、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＳＭＣＣ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＳＭＣＣ］および（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＳＭＣＣを合成し、単離した。

（実施例５）
実施例３において、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、和光純薬社）を用いた代わりに、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＭＰＨ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭＰＨ］および（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＭＰＨを合成し、単離した。

（実施例６）
実施例３において、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、和光純薬社）を用いた代わりに、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（Ｎ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（ＥＭＣＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＥＭＣＳ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＥＭＣＳ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＥＭＣＳ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＥＭＣＳ］および（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＥＭＣＳを合成し、単離した。

（実施例７）
実施例３において、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、和光純薬社）を用いた代わりに、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（Ｎ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（ＳＥＭＣＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＢｖに遺伝子組換えｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＥＭＣＳ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＥＭＣＳ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＥＭＣＳ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＥＭＣＳ］および（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＥＭＣＳを合成し、単離した。

（実施例８）
実施例３において、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、和光純薬社）を用いた代わりに、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ジエチレングリコール］エステル（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）（ＳＭ（ＰＥＧ）₂、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭ（ＰＥＧ）₂、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭ（ＰＥＧ）₂、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭ（ＰＥＧ）₂、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭ（ＰＥＧ）₂］、および（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＭ（ＰＥＧ）₂を合成し、単離した。

（実施例９）
実施例３において、ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）を用いた代わりに、ブタヘモグロビン（ＨｂＳｗ）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＳｗにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ］および（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＭＣＣを合成し、単離した。

（実施例１０）
実施例３において、ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）を用いた代わりに、イヌヘモグロビン（ＨｂＣｎ）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＣｎにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ］および（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＭＣＣを合成し、単離した。

（実施例１１）
実施例３において、遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）を用いた代わりに、遺伝子組換えネコ血清アルブミン（ｒＦＳＡ）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＢｖにｒＦＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ₄）ＳＭＣＣ］および（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ平均₃）ＳＭＣＣを合成し、単離した。

（実施例１２）
＜調製１０：ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＨｂＢｖ−ＳＰＤＰＨ）の調製＞
ナス型フラスコ（２０ｍＬ容量）にＣＯ化ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（０．１ｍＭ）２ｍＬを入れ、撹拌しながら、スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＰＤＰＨ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のエタノール溶液（２０ｍＭ）０．２ｍＬをゆっくり添加し［ＳＰＤＰＨ／ＨｂＢｖ＝２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）］、２５℃で３０分間撹拌した。得られた反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過した後、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ、２．５ｃｍφ、溶出液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４））にかけ、未反応の架橋剤を除去した。得られたウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＨｂＢｖ−ＳＰＤＰＨ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を遠心限外ろ過器（ＶＩＶＡ ＳＰＩＮ２０、限外分子量：１０ｋＤａ）を用いて２ｍＬまで濃縮し、０．１ｍＭとした。

＜調製１１：ウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ_n）ＳＰＤＰＨの調製＞
実施例３における調製６で得たメルカプト遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ−ＳＨ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（１．０ｍＭ）２ｍＬをナス型フラスコ（２０ｍＬ容量）に入れ、撹拌子で撹拌（１００ｒｐｍ）しながら、ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＨｂＢｖ−ＳＰＤＰＨ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（０．１ｍＭ）２ｍＬをゆっくりと滴下し（ｒＣＳＡ−ＳＨ／ＨｂＢｖ−ＳＰＤＰＨ＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、２５℃、遮光下で２０時間反応させて、反応溶液を得た。
該反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、口径０．２μｍ）で濾過し、低圧クロマトグラフィーシステム［ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＨｉＬｏａｄ ２６／６０）、溶出液：５０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．４）］を用いて、４℃にて分離・精製した。溶出液はフラクションコレクターで捕集した。溶出曲線においては、ｒＣＳＡ（Ｍｗ：６５．７ｋＤａ）のピークより早い時間に複数のピークが出現し、高分子量体の生成が示唆された。主要な４つのピークを含む分画について、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ電気泳動測定（５−１０％グラジエントポリアクリルアミドゲルＨｉ−ＱＲＡＳ Ｇｅｌ Ｎ、関東化学社）を行ったところ、Ｍｗ：１３０ｋＤａ〜４５０ｋＤａに明確な４つのバンドが現れたので、それぞれの成分のみを含む分画を単離し、回収した。
単離した各高分子量体について、シアノメトヘモグロビン法（ネスコートヘモキットＮ、アルフレッサファーマ社）によりＨｂＢｖ濃度を、また６６０ｎｍ法（６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社）によりタンパク質濃度を定量した。分子量の低い成分から、ｒＣＳＡ／ＨｂＢｖ比が１．１、２．０、３．０、３．９となり、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合したウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＰＤＰＨ］であることがわかった。

＜調製１２：ウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均_n）ＳＰＤＰＨの調製＞
実施例３における調製６で得たメルカプト遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ−ＳＨ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（１．０ｍＭ）２ｍＬをナス型フラスコ（２０ｍＬ容量）に入れ、撹拌子で撹拌（１００ｒｐｍ）しながら、ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＨｂＢｖ−ＳＰＤＰＨ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（０．１ｍＭ）２ｍＬをゆっくりと滴下し（ｒＣＳＡ−ＳＨ／ＨｂＢｖ−ＳＰＤＰＨ＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、２５℃、遮光下で２０時間反応させて、反応溶液を得た。
該反応溶液から、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＦＣ）を用いて、未反応のｒＣＳＡのみを除去することで、ウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミンクラスターの混合物を得た。具体的には、得られた反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）及びレコーダーを連結したゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ、１Ｌ、溶出液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４））にかけ、ｒＣＳＡ以外の高分子量成分をサンプル瓶に集めた。必要に応じ、遠心限外ろ過器（ＶＩＶＡＳＰＩＮ、限外分子量：３０ｋＤａ）を用いて濃縮した。シアノメトヘモグロビン法（ネスコートヘモキットＮ、アルフレッサファーマ社）によりＨｂＢｖ濃度を、また６６０ｎｍ法（６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社）によりタンパク質濃度を定量した。ｒＣＳＡ／ＨｂＢｖ比は３．０となり、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが平均３つ結合したウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＰＤＰＨ］が得られた。

（実施例１３）
実施例１２において、スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＰＤＰＨ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた代わりに、スルホスクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＳＰＤＰＨ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた以外は、実施例１２と同様な方法に従って、ＨｂＢｖにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＳＰＤＰＨ］および（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＳＰＤＰＨ）を合成し、それぞれを単離した。

（実施例１４）
実施例１２において、ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）を用いた代わりに、ブタヘモグロビン（ＨｂＳｗ）を用いた以外は、実施例１２と同様な方法に従って、ＨｂＳｗにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ₁）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ₂）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ₃）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ₄）ＳＰＤＰＨ］および（ＨｂＳｗ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＰＤＰＨを合成し、単離した。

（実施例１５）
実施例１２において、ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）を用いた代わりに、イヌヘモグロビン（ＨｂＣｎ）を用いた以外は、実施例１２と同様な方法に従って、ＨｂＣｎにｒＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ₁）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ₂）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ₃）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ₄）ＳＰＤＰＨ］および（ＨｂＣｎ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＰＤＰＨを合成し、単離した。

（実施例１６）
実施例３における調製６で、遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）を用いた代わりに、遺伝子組換えネコ血清アルブミン（ｒＦＳＡ）を用いた以外は、実施例３における調製６と同様な方法に従って、メルカプト遺伝子組換えネコ血清アルブミン（ｒＦＳＡ−ＳＨ）を調製した。
実施例１２において、メルカプト遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ−ＳＨ）を用いた代わりに前記メルカプト遺伝子組換えネコ血清アルブミン（ｒＦＳＡ−ＳＨ）を用いた以外は、実施例１２と同様な方法に従って、ＨｂＢｖにｒＦＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ₁）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ₂）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ₃）ＳＰＤＰＨ、（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ₄）ＳＰＤＰＨ］および（ＨｂＢｖ−ｒＦＳＡ平均₃）ＳＰＤＰＨ）を合成し、単離した。

（参考例２）
実施例３において、遺伝子組換えイヌ血清アルブミン（ｒＣＳＡ）を用いた代わりに、血液由来のイヌ血清アルブミン（ＣＳＡ）を用いた以外は、実施例３と同様な方法に従って、ＨｂＢｖにＣＳＡが１、２、３、４つ結合した複合体［（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ］および（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ平均₃）ＳＭＣＣを合成し、単離した。

＜ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体の評価＞
実施例３で得られたウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＭＣＣ］、及び参考例２で得られたウシヘモグロビン−イヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ平均₃）ＳＭＣＣ］について、等電点電気泳動及び酸素親和性（Ｐ₅₀）測定を実施した。

＜等電点電気泳動測定＞
実施例３で得たウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ］の等電点電気泳動（ＮＯＶＥＸ ＩＥＦゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を測定したところ、各クラスターの等電点（ｐＩ値）は、４．８、４．７、４．６、４．６であり、ＨｂＢｖ（ｐＩ＝７．０）に比べ大幅に減少していることがわかった。ｒＣＳＡの結合数の増大に伴い、ｐＩ値が減少していることからも、ＨｂＢｖの分子表面にｒＣＳＡが結合している構造であることが示された。
また、参考例２で得られた、血液由来のイヌ血清アルブミン（ＣＳＡ）を用いて調製したウシヘモグロビン−イヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ］の各等電点（ｐＩ値）は、４．８、４．７、４．６、４．６であり、相当するウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体の値と一致した。

＜酸素親和性（Ｐ₅₀）測定＞
実施例３で得たウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣ］のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を窒素で十分に置換することにより、脱酸素化体（デオキシ体）を調製した。このＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液の紫外可視吸収スペクトルは、λ_max：４３０ｎｍ、５５６ｎｍを示し、ＨｂＢｖのデオキシ体のスペクトルパターンと一致したことから、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣのＨｂＢｖ部位が酸素を結合していないデオキシ体を形成していることが分かった。
そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素化体（オキシ体）のスペクトルが得られ（λ_max：４１３ｎｍ、５４０ｎｍ、５７７ｎｍ）、再度窒素を通気すると、デオキシ体のスペクトルパターンとなったことから、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣが酸素を可逆的に吸脱着していることが示された。
一方、一酸化炭素を通気すると、きわめて安定な一酸化炭素化体（λ_max：４２０ｎｍ、５３８ｎｍ、５６９ｎｍ）を形成した。酸素解離結合曲線記録装置（Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＳＣ社）を用いて酸素親和性（Ｐ₅₀）（酸素結合解離曲線において酸素結合率が５０％の時の酸素分圧）を算出したところ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₃）ＳＭＣＣのＰ₅₀は９Ｔｏｒｒ（３７℃）であった。
他のウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体［（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₁）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₂）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ₄）ＳＭＣＣ、（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ平均₃）ＳＭＣＣ］についても同様の実験を行ったところ、Ｐ₅₀（３７℃）は、いずれも９Ｔｏｒｒであった。
上記ウシヘモグロビン−遺伝子組換えイヌ血清アルブミン複合体（ＨｂＢｖ−ｒＣＳＡ_n）ＳＭＣＣの酸素結合解離に伴う紫外可視吸収スペクトル変化およびＰ₅₀の値は、血液由来のイヌ血清アルブミンを用いて合成したウシヘモグロビン−イヌ血清アルブミン複合体（ＨｂＢｖ−ＣＳＡ_n）ＳＭＣＣが示す酸素結合解離に伴う紫外可視吸収スペクトル変化およびＰ₅₀の値とよく一致した。

本発明の遺伝子組換え動物血清アルブミンは、ヒトを除く哺乳類動物においてアルブミンの喪失（熱傷、ネフローゼ症候群など）及びアルブミン合成低下（肝硬変症など）による低アルブミン血症、難治性の腹水、浮腫、肺水腫、出血性ショックの治療に用いることができる。本発明のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、本発明の人工酸素運搬体及び本発明の人工血漿増量剤は、ヒトを除く動物の生体内に投与する場合も安全度の高い血液代替物として利用でき、移植臓器又は組織の保存液、再生組織の培養液、腫瘍の抗癌治療増感剤、術前血液希釈液、人工心肺などの体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全、など）、慢性貧血治療剤、液体換気の灌流液としても利用できる。また、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としても利用できる。

１０ ヘモグロビン
２０ 遺伝子組換え動物血清アルブミン
１００ ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体

Claims (15)

1. ヒトを除く哺乳類動物の血清アルブミンであり、ピキア属酵母由来の細胞を宿主細胞として、遺伝子組換えにより産生されることを特徴とする、遺伝子組換え動物血清アルブミン。
2. （ａ）質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）により得られる分子量が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であり、
   （ｂ）等電点電気泳動法により得られる等電点が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一であり、
   （ｃ）円偏光二色性スペクトル分析により得られるαへリックス含量が、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと、血液由来の動物血清アルブミンとで同一である、
   請求項１に記載の遺伝子組換え動物血清アルブミン。
3. コアとしてのヘモグロビンと、
   前記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合されたシェルとしての、請求項１または２に記載の遺伝子組換え動物血清アルブミンと、
   を有することを特徴とする、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
4. 前記ヘモグロビンにおける前記架橋剤との結合部位がリシンである、請求項３に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
5. 前記遺伝子組換え動物血清アルブミンにおける前記架橋剤との結合部位がシステイン３４である、請求項３または４に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
6. 前記ヘモグロビンと前記架橋剤との結合がアミド結合であり、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンと前記架橋剤との結合がスルフィド結合及びジスルフィド結合のいずれかである、請求項３から５のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
7. 前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの数が１個〜７個である、請求項３から６のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
8. 前記ヘモグロビンが、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、イヌヘモグロビン、ネコヘモグロビン、ウサギヘモグロビン及びヒトヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３から７のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
9. 前記遺伝子組換え動物血清アルブミンが、遺伝子組換えイヌ血清アルブミン、遺伝子組換えネコ血清アルブミン、遺伝子組換えウサギ血清アルブミン、及び遺伝子組換えウシ血清アルブミンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項３から８のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
10. 前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの由来となる動物と、前記ヘモグロビンの由来となる動物とが異なる、前記遺伝子組換え動物血清アルブミンの由来となる動物用の、請求項３から９のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
11. 前記ヘモグロビンが、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビンまたはウマヘモグロビンであり、
    前記遺伝子組換え動物血清アルブミンが、遺伝子組換えイヌ血清アルブミン、遺伝子組換えネコ血清アルブミンまたは遺伝子組換えウマ血清アルブミンである、
    請求項１０に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
12. 前記架橋剤が、下記一般式（１）〜（３）及び化学式（１）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３から１１のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
    

    

    一般式（１）中、Ｒ₁は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。
    

    

    

    一般式（２）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。
    

    

    一般式（３）中、Ｒ₂は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。
13. 前記架橋剤が、下記一般式（４）で表される、請求項３から１１のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体。
    

    

    一般式（４）中、Ｒ₃は、水素原子及びＳＯ₃ ^-Ｎａ⁺のいずれかを表し、Ｒ₄は、下記一般式（５）〜（６）及び下記化学式（２）〜（４）のいずれかを表す。
    

    

    一般式（５）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。
    

    

    

    

    一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２を表す。
    

    
14. 請求項１又は２に記載の遺伝子組換え動物血清アルブミン及び／または請求項３〜１３のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を含むことを特徴とする、人工血漿増量剤。
15. 請求項３から１３のいずれか１項に記載のヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体を含むことを特徴とする、人工酸素運搬体。

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