KR20170090510A - 단백질 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 단백질 제조 방법을 제공하며, 특히 여기서 상기 단백질은 다른 분자와 커플링된다. 본 발명은 추가로, 예를 들어 치료 목적용 단백질을 얻기 위한 산업 규모 단백질 제조 방법을 제공한다.

Description

단백질 제조 방법
본 발명은 단백질 정제 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항체 및 항체 단편의 정제 방법에 관한 것이다.
치료 분야에서, 단백질 및 항체 및 항체 유래된 분자의 사용은 특히 존재감 및 중요성을 지속적으로 얻어 왔으며, 그 결과, 제어된 제조 공정에 대한 필요가 이와 함께 발생해왔다. 치료 단백질의 상품화는, 상기 단백질이 대량으로 제조되는 것을 필요로 한다. 상기 목적을 위해 단백질은 숙주 세포에서 자주 발현되고 후속적으로 투여 가능한 형태로의 이의 제조 전에 회수 및 정제된다.
발현시키고자 하는 단백질에 따라, 숙주 세포의 선택은 포유동물 숙주 세포, 주로 CHO(Chinese hamster ovary, 중국 햄스터 난소) 세포, 또는 박테리아 숙주 세포일 수 있다. 첫번째 경우에서, 단백질은 통상적으로 배양 상청액 내로 분비되고 이는 회수되며, 이후 용액은 단백질 정제를 위해 가공된다.
숙주 세포가 그람 음성 원핵 세포인 경우, 종종 바람직한 발현 시스템은 주변 세포질 공간 내에 축적되며 이로부터 단리되는 새롭게 합성된 단백질을 수반한다. 이 경우, 일단 단백질 발현의 소정 수준이 달성되면, 그 세포가 채취 및 가공된다. 이후 단백질은 채취된 세포를 단백질 추출 공정으로 처리함으로써 회수되며, 상기 공정은 주변 세포질로부터 용액 내로의 단백질의 방출과 세포 잔해 및 다른 불순물의 후속 제거를 수반한다. 이러한 세포 채취로부터 단백질 방출까지의 단계들은 통상적으로 1차 회수로 지칭되는 것에 포함된다. 이후 결과로 얻어진 단백질 함유 용액을 단백질 정제를 위해 가공한다. 주변 세포질 발현을 위해 사용되는 바람직한 그람 음성 원핵 세포는 일반적으로 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 균주 또는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 세포이다.
복합 혼합물로부터의 단백질 정제는 표적 단백질에 대해 맞춰진다. 항체 및 항체 유래 생성물의 경우에, 정제는 통상적으로, 제1 정제 및 생성물의 유의한 농축을 제공하는 크로마토그래피를 통한 제1 생성물 포획 단계를 수반한다. 상기 제1 단계는 보통 오염 물질, 예컨대 숙주 세포 불순물, 배지, 정제 공정 관련 불순물 및 생성물 관련 불순물을 감소시키도록 사용되는 1 이상의 추가 크로마토그래프 단계가 후속한다.
최근 몇 년 동안, 항체 및 항체 유래 단편을 비롯한 상이한 단백질이 구체적인 기능을 갖는 다른 분자에 커플링되는 것이 점점 더 통상적이 되었으며, 이는 진단 및 치료 용도 양쪽에 적용되며, 몇 가지 예시를 들자면 이는 특정 세트의 세포에 항체를 표적화하는 것일 수 있거나, 대안적으로 이것은 항체에 의해 이의 구체적인 작용 부위에 표적화된 약물일 수 있거나, 또는 분자는 동물에서 항체의 반감기를 증가시키게 되어있을 수 있다. 후자는 특히 동물의 순환계로부터 빠르게 제거되는 경향이 있는 항원 결합 항체 단편에 관한 경우이다.
상이한 분자는 단백질에서 천연 발생하거나 단백질 공학에 의해 인공적으로 도입되는 단백질 중의 반응성 기를 통해 단백질에 커플링될 수 있다. 주로, 제2 분자로의 단백질 결합에 대해 선호되는 반응성 기는 페어링되지 않은 시스테인 잔기에 존재하는 티올 기이다. 이러한 의미에서, 항체 힌지는 부위 특이적 반응에 통상적인 영역이며, 이는 상기 항체 힌지가 시스테인 잔기를 포함하고 항원 결합에 수반될 가능성이 높은 항체의 다른 영역으로부터 떨어져 있기 때문이다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 반응 또는 티올 기의 PEG화는 부위 특이적 PEG화에 대한 주지된 접근법이며, 여기서 다양한 티올 특이적 시약이 이용 가능하다.
그러나, 생 단백질에서, 시스테인 잔기는 보통 이황화 가교에 수반되거나 금속 또는 기타 단백질과의 상호작용의 원인이 된다. 그러므로, 부위 특이적 결합을 달성하기 위해, 이러한 반응성 기는 올바른 입체구조, 즉 이의 티올 기가 유리 상태여서, 이의 반응을 가능하게 하도록 해야 한다. 예를 들어, 단일 시스테인 잔기에서 G-CSF의 PEG화는 문헌[Veronese et al. Bioconjugate Chemistry 2007 Nov-Dec;18(6):1824-30]에 기재되어 있으며, 이로써 PEG화는 과도적 변성 조건 하에 수행된다. 이는 또한 선행 기술에서 단백질을 최적의 입체구조로 얻어 원하는 분자로의 이의 후속 반응을 가능하게 하도록 공정을 최적화하는 것이 시도되었다. 예를 들어, WO　2007/003898에서는 Fab'의 정제 후 포함되어 PEG와의 후속 반응에 대해 이를 예비하는 특이적 디아환원(diareduction) 단계가 기술되어 있다. 많은 경우, 예컨대 Fab'에 있어서, 1 이상의 표적 시스테인을 공액에 대해 선택적으로 영향을 주면서 단백질에 존재하는 다른 시스테인을 환원시키지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어 이 경우, Fab'는 중쇄와 경쇄 불변 영역 사이에 고유 쇄간 이황화 결합을 갖고, 따라서 힌지와 같은 항체의 다른 곳에 있는 표적 시스테인을 선택적으로 환원시키기 위해, 환원은 이황화 사슬이 온전히 유지되고 쇄간 시스테인과의 반응이 회피되도록 신중하게 수행될 필요가 있다. 통상적으로, 이는 온화한 환원 조건으로 여겨지는 조건을 이용하여 달성된다. 그러나, 환원이 통상적인 화학 반응임으로 고려하면, 온화한 환원 조건 하일지라도, 복합 혼합물 중 존재하는 상이한 화합물들은 환원 환경에서 반응이 가능하여 특성, 예를 들어 비제한적으로 결합 거동을 변화시키며, 이는 후속 단백질 정제에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 이유로 이내 선행 기술에 기재된 환원 단계는 일단 단백질이 정제되면 수행된다. 후속적으로, 원하는 단백질 공액은 반응하지 않은 단백질 또는 다른 원하지 않는 공액으로부터 정제되어야 한다.이 커플링 반응 공정의 효율은 제조 효율 및 관련된 제작 비용과도 관계가 있다.
상기를 고려하여, 특히 제조된 단백질이 제2 분자에 커플링되는, 단백질 제조를 위한 향상된 방법이 당해 분야에 추가로 요구된다.
본 발명은 상기 밝혀진 요구를, 특히 예를 들어 치료 목적용 단백질을 얻기 위한 산업용 단백질 제조에서, 신규한 단백질 제조 방법으로서 특히 여기서 상기 단백질은 다른 분자와 커플링되는 것인 제조 방법을 제공함으로써 해결한다.
도 1은 Fab'1 발현 세포로부터 얻은 E. 콜리 주변 세포질 추출물로부터 수행되는 두 평행 정제 공정으로부터 회수된 Fab'1의 PEG화 반응으로부터 얻은 샘플의 크기 배제 HPLC 분석을 나타낸다. 한 공정은 대조 조건 하, 즉 글루타티온 없이 수행되며, 반면 두번째 공정에서는 단백질은 1 mM 글루타티온의 존재 하에 단백질을 포획하기 위한 제1 크로마토그래피 단계로부터 최종 크로마토그래피 단계까지 유지되었다. HMWS는 고분자량 종(high molecular weight species) 또는 집합체(aggregates)의 양을 의미하고, 모노머는 PEG에 커플링된 Fab'1의 양을 의미하며, diFab'는 Fab'1 다이머의 양을 의미하고, Fab'는 결합하지 않은채 남은 Fab'1의 양을 의미한다.
도 2는, CDP870 Fab' 발현 세포로부터 얻어진 E. 콜리 주변 세포질 추출물로부터 회수된 CDP870 Fab'의 PEG화 반응으로부터 얻어지고, 1 mM 글루타티온의 존재 하에 단백질을 포획하기 위한 제1 크로마토그래피 단계로부터 최종 크로마토그래피 단계까지 단백질을 유지하면서 후속 정제된 샘플의 크기 배제 HPLC 분석을 나타낸다. HMWS는 고분자량 종 또는 집합체의 양을 의미하고, 모노머는 PEG에 커플링된 CDP870 Fab'의 양을 의미하며, diFab'는 CDP870 Fab'Fab'2 다이머의 양을 의미하고, Fab'는 결합하지 않은채 남은 양을 의미한다.
도 3은 E. 콜리 주변 세포질 추출물로부터 회수된 Fab'1의 PEG화 반응으로부터 얻어지고 선행 기술 방법에 따라 정제된 샘플의 크기 배제 HPLC 분석을 나타낸다. HMWS는 고분자량 종 또는 집합체의 양을 의미하고, 모노머는 PEG에 커플링된 Fab'1의 양을 의미하며, diFab'는 Fab'1 다이머의 양을 의미하고, Fab'는 결합하지 않은채 남은 Fab'1의 양을 의미한다.
본 발명은 상기 밝혀진 요구를, 특히 예를 들어 치료 목적용 단백질을 얻기 위한 산업용 단백질 제조에서, 신규한 단백질 제조 방법으로서 특히 여기서 상기 단백질은 다른 분자와 커플링되는 것인 제조 방법을 제공함으로써 해결한다.
제1 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단백질 제조 방법을 제공한다:
a) 숙주 세포에서의 단백질의 발현, 및
b) 상기 단백질을 숙주 세포 및 기타 오염 물질을 함유하는 혼합물로부터 정제하는 단계로서, 상기 정제는 1 이상의 크로마토그래피 단계를 포함하고, 환원제가 상기 혼합물에 첨가되며, 단백질은 제1 크로마토그래피 단계로부터 최종 크로마토그래피 단계까지 상기 환원제의 존재 하에 유지되는 것인 단계.
통상적으로, 제1 크로마토그래피 단계는 단백질 포획 단계로서 기능하며, 여기서 당업계의 숙련자가 이용 가능한 상이한 크로마토그래피 단계, 예를 들어 친화 크로마토그래피, 양이온 크로마토그래피, 음이온 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서의 사용을 위한 고상으로서의 적절한 기능을 갖는 멤브레인 또는 비드형 수지를 이용하는 크로마토그래피 등이 있다. 생성물 포획은 결합 및 용출 모드로 보통 수행되며, 여기서 원하는 단백질의 고상으로의 결합은 불순물, 예컨대 오염 단백질이 크로마토그래피 매질을 통해 흐르는 동시에 원하는 단백질이 고상에 결합한 채 남아있게 한다. 이후 결합한 원하는 단백질을, 원하는 단백질이 고상에 결합하는 메커니즘을 방해하는 용출 버퍼를 이용하여 상기 고상으로부터 회수한다. 가장 적절한 생성물 포획 단계는 정제되는 단백질의 성질에 기초하여 결정될 것이며, 예를 들어 전체 길이 항체를 제작하는 경우 통상적인 생성물 포획 단계는 단백질-A 기초 친화 크로마토그래피이다.
본 발명의 한 구체적인 실시양태에서, 상기 제1 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 단계이며, 여기서 원하는 단백질은 크로마토그래피 매질에 결합하고 후속하여 단백질을 함유하는 제1 용출액 내로 용출된다.
본 발명의 방법의 한 추가의 특정 실시양태에서, 환원제는 상기 양이온 교환 크로마토그래피 중에 사용되는 버퍼에 존재한다. 보다 구체적으로, 환원제는 로드 버퍼 내, 세척 버퍼 내 및 용출 버퍼 내 존재한다.
상기 부분에서 논의된 바와 같이, 제1 크로마토그래피 단계는 일반적으로 추가 불순물, 통상적으로 잔류 공정 및 생성물 관련 불순물의 제거를 돕도록 1 이상의 후속 크로마토그래피 단계가 후속한다. 일반적으로 이러한 단계는 겔 여과 크로마토그래피, 양이온 크로마토그래피, 음이온 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서 사용하기에 적절한 기능을 갖는 고상을 이용하여 비친화 크로마토그래피 단계를 사용할 것이다. 이는 결합 및 용출 모드로 또는 유수식 모드로 작동될 수 있다. 유수식 모드에서, 불순물은 결합하거나 고상에서 이동성이 감소되는 반면 표적 단백질은 용출액 또는 유수 분획으로 회수된다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 단계는 불순물을 포획하고 단백질 함유 유수를 생성하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 후속한다.
본 발명의 방법의 한 추가의 특정 실시양태에서, 환원제는 상기 음이온 교환 크로마토그래피 중에 사용되는 버퍼에 존재하여 불순물을 포획하고 단백질 함유 유수를 생성한다. 보다 구체적으로, 환원제는 로드 버퍼 내, 및 용출 버퍼 내 존재한다.
본 발명의 방법의 한 추가의 특정 실시양태에서, 혼합물로부터의 단백질 정제 단계는 단백질 함유 제1 용출액이 용출되는 양이온 교환 크로마토그래피인 제1 크로마토그래피 단계 및 단백질 함유 유수를 제조하는 음이온 교환 크로마토그래피인 제2 크로마토그래피 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 한 추가의 특정 실시양태에서, 환원제는 상기 양이온 교환 크로마토그래피 중에 및 상기 음이온 교환 크로마토그래피 중에 존재한다. 보다 구체적으로 상기 환원제는 상기 양이온 교환 크로마토그래피 및 상기 음이온 교환 크로마토그래피 중에 사용되는 버퍼 중에 존재한다. 추가 실시양태에서, 1 이상의 한외여과 또는 정용여과(UF/DF) 단계는 크로마토그래피 단계들 사이에서 수행된다. 산업 규모 단백질 제조에서, 이는 통상적으로 생성물 농축 및 버퍼 교환의 목적을 위해 수행되는 멤브레인 기초 접선 유동 여과 단계를 이용하여 작동된다. 이러한 멤브레인은 보통 단백질 결합이 낮고 생성물 손실을 방지하기 위한 구체적인 명목 분자량 컷오프를 가지며, 예를 들어 이것은 10kDa 명목 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인(Pall Life Sciences사제 T-시리즈 오메가 PES 멤브레인) 또는 10 kDa 명목 분자량 컷오프를 갖는 재생 셀룰로오스(Pall Life Sciences사제 델타 재생 셀룰로오스 멤브레인)을 포함한다.
정제 전략은 표적 단백질의 물리-화학적 특성이 적합하도록 다양한 조합으로 상기 단계 중 임의를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 살 수 있는 구체적인 정제 전략이 WO 2012/013682에 개시된 것과 같았으며, 이는 본원에 그 전체가 포함된다.
본 발명의 방법의 한 추가의 특정 실시양태에서, 혼합물로부터의 단백질 정제 단계는 단백질 함유 제1 용출액이 용출되는 양이온 교환 크로마토그래피인 제1 크로마토그래피 단계, 제1 용출액에 적용되는 제1 한외여과 또는 정용여과 단계, 단백질 함유 유수를 제조하는 음이온 교환 크로마토그래피인 제2 크로마토그래피 단계 및 유수에 적용되는 제2 한외여과 또는 정용여과 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 환원제는 단백질 함유 제1 용출액이 용출되는 상기 양이온 교환 크로마토그래피 중에, 제1 용출액에 적용되는 상기 제1 한외여과 또는 정용여과 단계 중에, 및 단백질 함유 유수를 제조하는 음이온 교환 크로마토그래피인 상기 제2 크로마토그래피 단계 중에 사용되는 모든 버퍼에 존재한다.
한 대안적인 실시양태에서, 혼합물로부터 단백질을 정제하는 단계는 단백질 함유 제1 용출액이 용출되는 제1 크로마토그래피 단계, 제1 용출액에 적용되는 제1 한외여과 또는 정용여과 단계, 단백질 함유 제2 용출액이 용출되는, 결합 및 용출 모드로 작동되는 제2 크로마토그래피 단계를 포함한다. 바람직하게는, 환원제는 단백질 함유 제1 용출액이 용출되는 상기 제1 크로마토그래피 단계 중에, 및 환원제의 존재 하에 단백질이 회수되는 제1 용출액에 적용되고 상기 제2 크로마토그래피 단계에 적용되는 상기 제1 한외여과 또는 정용여과 단계 중에 사용되는 모든 버퍼에 존재하고, 여기서 상기 제2 크로마토그래피 단계로부터의 용출액 중 회수된 단백질은 본질적으로 환원제를 포함하지 않는다.
당업자가 이용 가능한 환원제는 여러가지이다. 가장 적합한 환원제는 예를 들어 회수된 단백질 샘플 중 표적 티올의감소된 상태를 측정함으로써, 예를 들어문헌[Lyons et al. 1990, Protein Engineering 3, 703]에 기재된 자유 티올 검정을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 가장 적합한 환원제는 또한, 예를 들어 분석 크기 배제 또는 역상 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)에 의해, 회수된 단백질 샘플에서 원하지 않는 쇄내 및 쇄간 이황화 결합 절단의 양을 측정함으로써, 또는 대안적으로 원하는 회수된 반응된 단백질 분자의 양을 측정함으로써 선택될 수 있다. 크기 배제 HPLC는 분자 크기에 기초하여 입자를 분리하며 여기서 큰 분자는 작은 분자에 비해 빠르게 컬럼을 흘러 지나간다. 다른 한편으로, 역상 HPLC는 소수성 상호작용의 원리 상에 작동되며, 여기서 고정상으로의 분자의 결합은 고정상 상의 리간드와의 연합에 있어서 분자의 비극성 세그먼트 주변의 접촉 표면적에 비례하며, 보다 덜 극성인 분자에 대해 보유 시간이 더 길다. 두 경우 모두에서, 이황화 결합의 존재 또는 부존재는 상이한 용출 프로필을 갖는 종들을 유도한다.
본 발명의 방법의 제2 실시양태에서, 환원제는 글루타티온, β-머캅토에탄올, β-머캅토에틸아민, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 시스테인 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 제3 실시양태에서, 환원제는 0.1 mM 내지 100 mM의 글루타티온이다. 환원제의 양은 제조하고자 하는 단백질에 따라 조정될 수 있다. 본 발명의 추가의 특정 실시양태에서, 상기 환원제는 0.1 mM 내지 20 mM, 0.1 mM 내지 10 mM, 0.5 mM 내지 5 mM, 바람직하게는 0.5 mM 내지 2 mM의 글루타티온이다.
혼돈을 방지하기 위하여, 본원에서 지칭된 것과 같은 용어 글루타티온은 CAS Number 70-18-8에 의해 정의된 감소된 글루타티온 또는 모노머를 지칭한다.
본 발명의 방법의 제4 실시양태에서, 환원제는 회수된 단백질로부터 제거된다.
당업계의 숙련자에게 공지된, 용액으로부터 환원제를 제거하는 상이한 공정들이 존재하며, 정용여과, 겔 여과, 투석 또는 추가 크로마토그래피 단계를 비롯하여 이들 중 임의의 것이 현재 공정에 적합할 수 있다. 본 발명의 방법의 한 대안적인 실시양태에서, 환원제는 정용여과에 의해 단백질 샘플로부터 제거된다.
본 발명의 방법의 제5 실시양태에서, 단백질은 다른 분자에 커플링된다.
일반적으로 다른 분자에 단백질을 커플링시키는 공정은 용매, 예를 들어 수성 버퍼 용액 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 또는 아세테이트에서 수행된다. 통상적으로 이는 단백질이 정용여과되거나 겔 여과에 의해 이송된 버퍼이다. 반응은 일반적으로 임의 적합한 온도, 예를 들어 약 5℃ 내지 약 70℃, 예를 들어 실온, 즉 20℃, 21℃ 또는 22℃에서 수행될 수 있다. 버퍼는 임의로 킬레이트제, 예컨대 EDTA, EGTA, CDTA 또는 DTPA를 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로 버퍼는 킬레이트 버퍼, 예컨대 시트르산, 옥살산, 폴산, 비신, 트리신, 또는 트리스일 수 있다. 분자는 일반적으로 단백질의 농도에 대해 적어도 등몰 농도, 즉 1:1로 사용될 수 있다. 통상적으로 분자는 단백질의 농도에 대해 과량의 농도로 사용될 수 있다. 통상적으로 분자는1.1 내지 100 배 몰 과량, 바람직하게는 1.1, 1.5, 2, 3, 5, 10 또는 50 배 몰 과량으로 이용된다. 적합한 농도의 추가 예는 1.2, 1.25, 1.3 및 1.4 배 몰 과량을 포함한다. 대안적으로 2 이상의 단백질이 단일 분자에 커플링된 경우, 상기 분자는 과량이 아닐 수 있고, 예를 들어 단백질에 대한 분자의 비는 0.1 내지 1, 바람직하게는 0.5일 수 있다. 반응의 지속은 당업자에 의해 실험적으로 측정될 수 있으며 통상적으로 1 시간 내지 20 시간이다. 한 실시양태에서 반응은 17 시간 기간에 걸쳐 수행된다.
필요한 경우, 다른 분자에 커플링된 원하는 단백질은 종래 수단에 의해, 예를 들어 이온 교환, 크기 배제 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 기술에 의해 공정 중에 생성된 다른 생성물 또는 임의 출발물질로부터 분리될 수 있다. 따라서 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다른 분자에 커플링된 단백질이 회수되는 추가 단계를 추가로 포함한다.
상기 커플링은 1 이상의 시스테인을 통해 수행될 수 있다. 당업계의 숙련자는 예를 들어 단백질을 환원제로 처리한 후 생성된 유리 티올의 수를 측정함으로써 커플링에 이용 가능한 단백질 중의 시스테인의 수를 실험적으로 수립할 수 있다. 유리 티올의 수를 측정하는 방법은 당해 분야에 주지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Lyons et al., 1990, Protein Engineering, 3, 703]을 참고한다. 대안적으로, 당업계의 숙련자는 예를 들어 분석적 역상 또는 크기 배제 HPLC에 의해 상기 반응으로부터 얻어지는 종을 분석할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 커플링 부위로서의 이용을 위해 단백질 내로 시스테인을 도입하도록 다양한 유전자 공학 또는 단백질 공학 기술을 이용하여 개질될 수 있다. 따라서 커플링에 대해 사용되는 시스테인은 단백질 중에 자연 발생할 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 단백질 내로 엔지니어링될 수 있다. 그러므로, 커플링에 대해 이용 가능한 시스테인의 수 및 위치는 단백질의 의도된 용도 및 필요한 공액 분자의 수에 따라 구체적으로 제어될 수 있다.
본 발명의 방법의 제6 실시양태에서, 단백질은 단백질 상의 시스테인 잔기로의 공유 결합을 통해 다른 분자에 커플링된다.
본 발명의 방법의 한 대안적인 실시양태에서, 단백질은 시스테인 잔기를 통해 2 이상의 분자에 커플링될 수 있다.
제7 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다른 분자에 커플링된 단백질의 회수 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법의 제8 실시양태에서, 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 방법의 제9 실시양태에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab'이다.
추가 대안적인 실시양태에서, 상기 Fab'는 TNF 알파에 특이적으로 결합한다. 추가로 보다 구체적인 실시양태에서, TNF 알파에 측이적으로 결합하는 상기 Fab'는 WO　01/094585에 개시된 바와 같은 CDP870이며 이의 전체가 본원에 포함된다.
본 발명의 방법의 제10 실시양태에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편 중의 상기 시스테인은 항체 힌지 중에 존재한다.
당업자가 알고 있는 바와 같이, 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 원하는 효과에 따라 상이한 분자에 커플링시키는 것이 가능한다. 이러한 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 항신생물제, 약물, 독소 또는 생물학적 활성 펩티드에 커플링될 수 있다. 다른 한 편으로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 불활성 개체에 결합하여 순환계에서의 이의 반감기를 증가시킬 수 있으며, 이는 예를 들어 천연 존재 단백질 예컨대 알부민 또는 합성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등이다.
본 발명의 방법의 제11 실시양태에서, 상기 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다.
PEG 분자는 에틸렌 산화물의 중합으로부터 유래히며 300 Da 내지 10,000,000 Da의 넓은 범위의 분자량에 걸쳐 시판된다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따른 PEG 분자는, 선형 또는 분지형일 수 있고, 구입 가능하거나 공지된 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 상이한 분자량을 가진 PEG 분자가 상이한 응용분야에서의 용도를 구하며, 사슬 길이 효과로 인해 상이한 물리적 특성, 예컨대 점도를 갖지만, 이들의 화학적 특성은 유의하게 달라지지 않는다. 폴리머 크기는 특히 특정 조직, 예컨대 종양에 국재화하거나 순환 반감기를 연장시키는 능력과 같은 생성물의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다(검토를 위해 문헌[Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545]을 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 순환계를 떠나 조직 내로 침투하도록, 예를 들어 종양의 치료에서의 용도로 의도된 경우, 소분자량 폴리머, 예를 들어 약 5,000 Da의 분자량을 갖는 폴리머를 이용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환계에 머무르는 응용분야의 경우, 고분자량 폴리머, 예를 들어 25,000 Da 내지 40,000 Da 범위의 분자량을 갖는 폴리머를 이용하는 것이 유리할 수 있다.
PEG 분자는 시판되거나 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 이의 유도체로서, 커플링제 또는 모이어티의 커플링 또는 활성화를 이용한 유도를 이용하거나 이용하지 않고 합성될 수 있다(예를 들어 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지르딘, 옥시란, 또는 말레이미드 모이어티, 예를 들어 PEG-말레이미드 이용). 다른 적절한 폴리알킬렌 글리콜 화합물은 말레이미도 모노메톡시 PEG, 활성 PEG 폴리프로필렌 글리콜을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 또한 하기 유형, 즉 덱스트란, 콜로민산, 또는 다른 탄수화물계 폴리머의 하전된 또는 중성 폴리머, 아미노산의 폴리머 및 바이오틴 및 기타 친화성 시약 유도체를 포함한다. PEG 모이어티의 결합은 종종 PEG화로 지칭되며 단백질과 PEG 분자의 반응의 공정을 지칭하고 이러한 반응의 결과로서 상기 PEG 분자는 상기 단백질에 공유 결합한다.
일반적인 PEG 모이어티의 결합에 관하여, 문헌["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J.Milton Harris (ed), Plenum Press, New York]; 문헌["Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society , Washington DC] 및 문헌["Bioconjugation Protein 커플링 Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York]를 참고한다.
PEG화 및 PEG화 단백질을 고려할 경우 공정의 다양한 양태가 고려되어야 하며, 예를 들어 단백질의 부착 부위, PEG 시약의 활성 유형, 성질(영속적(permanent) 또는 절단 가능), 링커의 길이 및 형상, 및 또한 PEG 시약의 길이, 형상 및 구조가 그러하다. PEG화는 단백질 상의 아미노기가 표적화되는 무작위일 수 있고, 다양한 PEG화 종의 복합 혼합물을 유도한다. 대안적으로, PEG화는 통상적으로 N-말단 및 시스테인 특이적 반응을 통해, 부위 특이적일 수 있다. 시스테인 잔기가 생 단백질에 자연적으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 유전자 도입된 시스테인은 PEG 분자를 분자에서 정확하게 결정된 부위로 유도하도록 이용된다. 그러므로, PEG화에 이용 가능한 시스테인의 수 및 위치는 단백질의 의도된 용도 및 필요한 PEG 분자의 수에 따라 구체적으로 제어될 수 있다. 말레이미드, 피리딜 디설파이드, 비닐 설폰, 티올 시약, 등과 같은 다양한 티올 특이적 시약이 이용 가능하다. 형성된 연결의 안정성으로 인해, 말레이미드-PEG 시약은 종종 바람직한 선택이다.
본 발명의 방법의 한 추가 실시양태에서, PEG 분자는 단백질 상의 단일 시스테인에 말레이미드 기를 통해 공유 결합한다.
한 구체적인 실시양태에서, PEG 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 힌지 영역에 존재하는 단일 시스테인에 말레이미드 기를 통해 공유 결합한다.
본 발명의 방법의 제12 실시양태에서, 상기 PEG 분자는 40,000 PEG-말레이미드이다.
한 구체적인 실시양태에서, 상기 PEG 분자는 분지된 40,000 PEG-말레이미드이다. 보다 구체적으로, 상기 PEG 분자는 2개의 분지를 가진다.
제13 실시양태에서, 본 발명의 제11 또는 제12 실시양태에 따른 방법은 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 단백질은 시스테인을 통해 상기 PEG 분자에 커플링된다.
본 발명의 제12 실시양태에 따른 방법의 한 구체적인 실시양태에서, 상기 PEG 분자에 커플링된 단백질은 당업계에 공지된 수단, 예컨대 추가 크로마토그래피 단계 등에 의해 커플링되지 않은 단백질 및 PEG 분자로부터 회수 및 추가 정제된다.
추가의 특정 실시양태에서, 상기 PEG 분자에 커플링된 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 보다 구체적으로 상기 단백질은 Fab'이다.
본 발명의 방법의 한 구체적인 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1 초과의 PEG 분자에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 중 하나 또는 둘 모두 상에, 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두 상에, 중쇄 및 경쇄 둘 모두 상에 PEG화된다.
본 발명의 추가의 특정 실시양태에서, PEG 분자에 커플링된 항체 또는 이의 항원 결합 영역은 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두 상의 PEG 분자에 커플링된 Fab'이다. 한 바람직한 실시양태에서, 단백질은 항체 힌지 영역 상의 시스테인을 통해 PEG 분자에 커플링된 Fab'이다. 특정 실시양태에서, PEG화 항체는 적어도 24 kD의 수력학적 크기를 가진다. 다른 실시양태에서, PEG는 20 kD 내지 60 kD(포괄) 중 어떠한 크기로도 다양할 수 있다. 추가 실시양태에서, PEG-연결된 항체는 적어도 200 kD의 수력학적 크기를 가진다. 항체가 PEG 모이어티에 연결된 본 발명의 실시양태에서, PEG화 항체는 PEG 모이어티가 없는 항체에 비해 생체 내 반감기가 증가될 수 있다.
한 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 PEG 분자에 커플링된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.
a) 숙주 세포를, 숙주 세포가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계, 및
b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 숙주 세포 및 기타 오염 물질을 함유하는 혼합물로부터 정제하는 단계로서, 상기 정제는 1 이상의 크로마토그래피 단계를 포함하고, 환원제가 상기 혼합물에 첨가되며 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 크로마토그래피 단계로부터 최종 크로마토그래피 단계까지 상기 환원제의 존재 하에 유지되는 것인 단계,
c) 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 PEG를 첨가하는 단계, 및
d) PEG에 커플링된 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
대안적으로, 본 발명은 단백질을 정제하는 방법에 관한 것으로, 상기 단백질은 숙주 세포가 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포에서 발현되며, 상기 단백질을 숙주 세포 및 기타 오염 물질을 함유하는 혼합물로부터 정제하는 단계로서, 상기 정제는 1 이상의 크로마토그래피 단계를 포함하고, 환원제가 상기 혼합물에 첨가되며, 단백질은 제1 크로마토그래피 단계로부터 최종 크로마토그래피 단계까지 상기 환원제의 존재 하에 유지되는 것인 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 제작될 수 있는 항체 또는 항체 단편은 재조합 항체 단편을 코팅하는 1 이상의 발현 벡터로 형질주입된 진핵 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 진핵 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
포유동물 세포는 이의 생장 및 재조합 단백질의 발현을 지지할 임의 배지에서 배양될 수 있으며, 바람직하게는 배지는 동물 혈청 및 펩톤과 같은 동물 유래 생성물이 없는 화학적으로 정의된 배지이다. 세포 생장 및 단백질 제조를 가능하게 하도록 적절한 농도로 존재하는, 비타민, 아미노산, 호르몬, 생장 인자, 이온, 버퍼, 뉴클레오시드, 글루코스 또는 등가의 에너지원의 상이한 조합을 포함하는, 당업자가 이용 가능한 상이한 세포 배양 배지들이 존재한다. 추가 세포 배양 배지 성분은 당업자가 알 수 있는 세포 배양 사이클 중에 상이한 시점에 적절한 농도로 세포 배양 배지에 포함될 수 있다.
포유동물 세포 배양은 임의 적합한 컨테이너 예컨대 진탕 플라스크 또는 바이오리액터에서 수행될 수 있고, 이는 필요한 제조의 규모에 의존하는 유가식 모드로 가동되거나 가동되지 않을 수 있다. 이러한 바이오리액터는 교반 탱크 또는 에어 리프트 반응기일 수 있다. 다양한 대규모 바이오리액터는 1,000 L 초과 내지 50,000 L, 바람직하게는 5,000 L 내지 20,000 L, 또는 내지 10,000 L의 용량으로 이용 가능하다. 대안적으로, 소규모, 예컨대 2 L 내지 100 L의 바이오리액터가 또한 본 발명의 방법에 따른 항체 또는 항체 단편의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 통상적으로 포유동물 숙주 세포 배양물, 통상적으로 CHO 세포 배양물의 상청액에서 발견된다. 원하는 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상청액에 분비되는 CHO 배양 공정에 있어서, 상기 상청액은 당해 분야에 공지된 방법, 통상적으로 원심분리에 의해 수집된다.
그러므로 본 발명의 한 구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 단백질 정제 전에 원심분리 및 상청액 회수의 단계를 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서 상기 원심분리는 연속 원심분리이다. 혼란을 피하기 위해, 상청액은 세포 배양물의 원심분리로부터 유래하는 침강된 세포 위로 위치한 액체를 의미한다.
대안적으로, 숙주 세포는 바람직하게는 원핵 세포, 보다 바람직하게는 그람 음성 박테리아이다. 보다 바람직하게는, 숙주 세포는 E. 콜리 세포이다. 단백질 발현을 위한 원핵 숙주 세포는 당해 분야에 주지되어 있다(Terpe, K. (2006). Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222.). 숙주 세포는 원하는 단백질, 예컨대 항체 단편을 제조하도록 유전자 엔지니어링된 재조합 세포이다. 재조합 E. 콜리 숙주 세포는 MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue 및 JM109를 포함하여 임의 적합한 E. 콜리 균주로부터 유도될 수 있다. 한 예로는 재조합 단백질 발효에 대해 통상적으로 이용되는 숙주 균주인 E. 콜리 균주 W3110(ATCC 27,325)가 있다. 항체 단편은 또한 개질 E. 콜리 균주, 예를 들어 물질대사 돌연변이 또는 프로테아제 결핍 E. 콜리 균주를 배양하여 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 항체 단편은 통상적으로 단백질의 성질, 제조 규모 및 사용한 E. 콜리 균주에 따라 E. 콜리 숙주 세포의 주변 세포질 또는 숙주 세포 배양 상청액에서 찾을 수 있다. 단백질을 이러한 구획에 표적화하는 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(Makrides,S.C. (1996). Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev 60, 512-538.). E. 콜리 의 주변 세포질로 단백질을 유도하는 적합한 신호 서열의 예는 E. 콜리 PhoA, OmpA, OmpT, LamB 및 OmpF 신호 서열을 포함한다. 단백질은 자연 분비 경로에 의존하여 또는 단백질 분비를 유도하는 외막의 한정된 누설의 유도에 의해 상청액으로 표적화될 수 있으며 이의 예는 pelB 리더(leader)의 이용, 단백질 A 리더, 박테리오신 방출 단백질의 공발현, 글리신의 배양 배지로의 첨가와 함께 미토마이신-유도된 박테리오신 방출 단백질 및 멤브레인 침투성을 위한 유전자의 공발현이 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 재조합 단백질은 숙주 E. 콜리의 주변 세포질에서 발현된다.
E. 콜리 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현은 또한 유도성 시스템의 제어하일 수 있으며, 이로서 E. 콜리에서의 재조합 항체의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하이다. E. 콜리에서의 사용에 적합한 많은 유도성 프로모터는 당해 분야에 주지되어 있고 프로모터에 따라 재조합 단백질의 발현은 생장 배지의 구체적인 물질의 농도 또는 온도와 같은 다양한 요인에 의해 유도될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 락토오스 또는 he 비가수분해성 락토오스 유사체로 유도 가능한 E.콜리 lac, tac, 및 trc 프로모터, 이소프로필-b-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 및 각각 포스페이트, 트립토판 및 L-아라비노스를 유도하는 phoA, trp 및 araBAD 프로모터를 포함한다. 발현은 예를 들어 유도체의 첨가에 의해 또는 유도가 온도 의존적인 경우 온도 변화에 의해 유도될 수 있다. 재조합 단백질 발현의 유도가 배양물로의 유도체의 첨가에 의해 달성되는 경우, 유도체는 발효 시스템 및 유도체에 따라 임의 적합한 방법으로, 예를 들어, 단일 또는 다중 샷 첨가에 의해 또는 공급을 통한 유도체의 점진적 첨가에 의해 첨가될 수 있다. 유도체의 첨가와 단백질 발현의 실질적 유도 사이에 지연이 존재할 수 있음이 이해될 것이며, 예를 들어 유도체가 락토오스인 경우 임의 기존 탄소원이 락토오스 전에 이용되면서 단백질 발형의 유도 전에 지연이 발생할 수 있다.
E. 콜리 숙주 세포 배양(발효)는 이의 생장 및 재조합 단백질의 발현을 지지하는 임의 배지에서 배양될 수 있다. 배지는 예를 들어 문헌[Durany O,C.G.d.M.C.L.-S.J. (2004). Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli. Process Biochem 39, 1677-1684.]에 기재된 배지 등의 임의 화학적으로 정의된 배지일 수 있다.
E. 콜리 숙주 세포의 배양은 필요한 제조 규모에 따라 임의의 적합한 컨테이너, 예컨대 진탕 플라스크 또는 발효기 에서 수행될 수 있다. 1,000 리터 초과 내지 약 100,000 리터 이하의 용량을 갖는 다양한 대규모 발효기가 이용 가능하다. 바람직하게는, 1,000 리터 내지 50,000 리터, 보다 바람직하게는 1,000 리터 내지 25,000 리터, 20,000 리터, 15,000 리터, 12,000 리터 또는 10,000 리터의 발효기를 사용한다. 소규모의 발효기는 또한 0.5 리터 내지 1,000 리터의 용량으로 이용될 수 있다.
E. 콜리의 배양은 필요한 단백질 및 수율에 따라 임의 적합한 시스템, 예를 들어 연속식, 회분식 또는 유가식으로 수행될 수 있다. 회분식은 필요한 경우 영양소 또는 유도체의 샷 첨가와 함께 이용될 수 있다. 대안적으로, 유가식 배양이 사용될 수 있고 배양물은 발효기에 초기 존재한 영양소 및 발효가 완료되기까지 생장속도를 제어하기 위해 이용되는 1 이상의 영양소 공급 계획을 이용하여 유지될 수 있는 최대 비 생장 속도로 회분식 유도 전에 생장한다. 유가식이 또한 유도 전에 이용되어 E. 콜리 숙주 세포의 대사를 제어하고 보다 높은 세포 밀도가 달성되도록 한다.
원하는 경우, 숙주 세포는 발효 배지로부터 수집으로 처리될 수 있고, 예를 들어 숙주 세포는 원심분리, 여과 또는 농축에 의해 샘플로부터 수집될 수 있다.
한 실시양태에서 본 발명에 따른 공정은 단백질 추출 전에 원심분리 및 세포 회수 단계를 포함한다.
원하는 단백질, 예컨대 항체 단편이 숙주 세포의 주변 세포질 공간에서 발견되는 E. 콜리 발효 공정에 있어서, 숙주 세포로부터 단백질이 방출되는 것이 필요하다. 방출은 임의 적합한 방법, 예컨대 기계적 또는 압력 처리, 동결 융해 처리, 삼투 충격, 추출제 또는 열 처리에 의한 세포 용해에 의해 달성될 수 있다. 단백질 방출에 대한 이러한 추출 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 그러므로 한 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단백질 정제 전에 추가 단백질 추출 단계를 포함한다. 보다 구체적인 한 실시양태에서, 상기 단백질 추출 단계는 환원제 존재 하에 수행된다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 추가로 세포 배양 배지로부터 숙주 세포의 회수, 환원제 존재 하에 수행되는 단백질 추출 단계를 이용한 단백질의 채취, 단백질 추출 단계로부터 얻은 단백질 함유 혼합물의 회수 및 혼합물로부터 상기 단백질의 정제를 추가로 포함하며, 상기 정제는 1 이상의 크로마토그래피 단계를 포함하고 환원제가 상기 혼합물에 첨가되며 단백질은 제1 크로마토그래피 단계로부터 최종 크로마토그래피 단계까지 상기 환원제 존재 하에 유지된다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 상기 실시양태를 따른 상기 단백질 추출 단계 중에 존재하는 환원제는 본 발명의 방법의 단백질 정제 단계 중에 존재하는 환원제와 동일하거나 상이할 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 추출 버퍼가 샘플에 첨가되고 이후 샘플은 열 처리 단계로 처리된다. 열 처리 단계는 바람직하게는 US 5,655,866에 상세히 기재된 바와 같다. 열 처리 단계는 가용성의 샘플, 기타 항체 관련 물질의 제거를 가능하게 함으로써 올바르게 폴딩되고 및 조립된 항체 단편을 얻는 것이 가능하게 만든다.
열 처리 단계는 원하는 고온으로 샘플을 처리함으로써 수행된다. 가장 바람직하게는, 열 처리 단계는 30℃ 내지 70℃ 범위 내에서 수행된다. 온도는 원하는 대로 선택될 수 있으며 정제에 관하여 항체의 안정성에 따를 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 40℃ 내지 65℃ 범위 내, 또는 바람직하게는 40℃ 내지 60℃ 범위 내, 보다 바람직하게는 45℃ 내지 60℃ 범위 내, 보다 더욱 바람직하게는 50℃ 내지 60℃ 범위 내, 가장 바람직하게는 55℃ 내지 60℃, 58℃ 내지 60℃ 또는 59℃이다. 따라서, 최소 온도는 30℃, 35℃ 또는 40℃이고 최대 온도는 60℃, 65℃ 또는 70℃이다.
열 처리 단계는 바람직하게는 연장된 시간 동안 수행된다. 열 처리의 길이는 바람직하게는 1 시간 내지 24 시간, 보다 바람직하게는 4 시간 내지 18 시간, 보다 더욱 바람직하게는 6 시간 내지 16 시간, 가장 바람직하게는 10 시간 내지 14 시간, 또는 10 시간 내지 12 시간, 예를 들어 12 시간이다. 따라서, 열 처리의 최소 시간은 1 시간, 2 시간 또는 3 시간이고 최대 시간은 20 시간, 22 시간 또는 24 시간이다.
한 구체적인 실시양태에서, 열 처리는 10 시간 내지 16 시간 동안 50℃ 내지 60℃에서, 보다 바람직하게는 10 시간 내지 12 시간 동안 59℃에서 수행된다. 당업자는 온도 및 시간이 논의되는 샘플 및 제조되는 항체의 특성에 적합하도록 선택될 수 있음을 이해할 것이다.
추출 단계에 이어서, 항체 단편과 같은 원하는 단백질을 함유하는 혼합물은 원심분리 및/또는 여과의 단계로 처리될 수 있다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 추출 단계에 이어 및 상기 혼합물로부터의 단백질의 정제 전에 원하는 단백질을 함유하는 혼합물의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 제조 방법의 추가 실시양태에서, 환원제가 또한 상기 열 처리 단계 중에 존재한다. 한 구체적인 실시양태에서, 샘플에 첨가되는 추출 버퍼는 상기 환원제를 포함한다. 이러한 의미에서, 상기 열 처리 단계 중에 존재하는 환원제는 본 발명의 방법에 따른 단백질 정제 중에 존재하는 환원제와 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 방법의 한 추가의 특정 실시양태에서, 열 처리 단계 중에 존재하는 환원제는 글루타티온, β-머캅토에탄올, β-머캅토에틸아민, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 시스테인 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 한 추가의 특정 실시양태에서, 열 처리 단계 중에 존재하는 환원제는 0.1 mM 내지 100 mM의 글루타티온이다. 환원제의 양은 제조하고자 하는 단백질에 따라 조정될 수 있다. 본 발명의 추가의 특정 실시양태에서, 상기 글루타티온은 0.5 mM 내지 80 mM, 1 mM 내지 50 mM, 1 mM 내지 25 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 10 mM의 양으로 존재한다.
정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체(들)"는 모노클론 또는 폴리클론 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체(들)"는 당해 분야에 공지된 것과 같은 재조합 기술에 의해 생성되는 재조합 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "항체(들)"는 임의 종, 특히 포유동물 종의 항체; 예컨대 IgA1, IgA2, IgD, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE 및 IgM를 비롯한 임의 동종형(isotype)의 인간 항체 및 이의 개질된 변이체, 비인간 영장류 항체, 예를 들어 침팬지, 개코원숭이, 레서스(rhesus) 원숭이 또는 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 유래 항체; 설치류 항체, 예를 들어 마우스, 래트 또는 래빗 유래 항체; 염소 또는 말 항체; 및 낙타과 항체(예를 들어 낙타 또는 라마 유래, 예컨대 NanobodiesTM) 및 이의 유도체; 또는 닭 항체와 같은 조류의 항체 또는 상어 항체와 같은 어류 항체를 포함한다. 용어 "항체(들)"은 또한 1 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제1 부분이 제1 종으로부터 유래하고 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제2 부분이 제2 종으로부터 유래하는 "키메라" 항체를 지칭한다. 본원에서 논의되는 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어 구세계 원숭이(Old World Monkey), 예컨대 개코원숭이, 레서스 원숭이 또는 사이노몰구스 원숭이)로부터 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다. "인간화" 항체는 비인간 항체로부터 유도된 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 선택성, 친화성 및 활성을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 래빗, 닭 또는 비인간 영장류의 초가변 영역[또는 상보 결정 영역(CDR)]으로부터의 잔기로 치환되는 인간 항체(수용자 항체)이다. 대부분의 경우 CDR외부, 즉 프레임워크 영역(FR) 중의 인간(수용자) 항체의 잔기는, 상응하는 비인간 잔기로 추가 치환된다. 더 나아가, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 항체 성능을 추가로 개선하도록 실시된다. 인간화는 인간에서 비인간 항체의 면역원성을 감소시키고, 따라서 인간 질환의 치료에 대한 항체의 적용을 가능하게 한다. 인간화 항체 및 이를 제조하는 몇가지 상이한 기술은 당해 분야에 주지되어 있다. 용어 "항체(들)"은 또한 인간화에 대안으로서 제조될 수 있는 인간 항체를 지칭한다. 예를 들어, 면역화시 내생성 쥣과 항체의 제조 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리의 제조가 가능한 형질전환 동물(예: 마우스)를 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식 계열 돌연변이 마우스 중의 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형접합적 결실이내생성 항체 제조의 완전한 억제를 유도한다는 것이 기재되어 있다. 이러한 생식 계열 돌연변이 마우스에서의 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 어레이의 이송은 상기 항원을 갖는 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자를 보유하는 형질전환 동물의 면역화시 구체적인 항원에 대한 특이성을 갖는 인간 항체의 제조를 유도할 것이다. 이러한 형질전환 동물을 제조하기 위한 기술 및 이러한 형질전환 동물로부터 인간 항체를 단리 및 제조하기 위한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 형질전환 동물; 예를 들어 마우스에서, 마우스 항체의 가변 영역을 암호화하는 면역글로불린 유전자만이 상응하는 인간 가변 면역글로불린 유전자 서열로 치환된다. 항체 불변 영역을 암호화하는 마우스 생식세포계열 면역글로불린 유전자는 변화되지 않고 유지된다. 이렇게 하여, 형질전환 마우스의 면역 시스템에서의 항체 이펙터 기능 및 이에 따른 B 세포 발생은 본질적으로 변화하지 않으며, 이는 생체 내 항원 도전시 향상된 항체 반응을 유도할 수 있다. 원하는 구체적인 항체를 암호화하는 유전자가 이러한 형질전환 동물로부터 단리되면, 전체 인간 항체를 얻도록 불변 영역을 암호화하는 유전자가 인간 불변 영역 유전자로 치환될 수 있다. 시험관 내 인간 항체/항체 단편을 얻기 위한 다른 방법은 디스플레이 기술, 예컨대 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 기술에 기초하며, 여기서 적어도 일부 인공적으로 생성되거나 공여자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 유래한 재조합 DNA 라이브러리가 사용된다. 인간 항체를 생성하기 위한 파지 및 리보솜 디스플레이 기술은 당해 분야에 주지되어 있다. 인간 항체는 또한 생체 외에서 원하는 항원으로 면역화되고 이어서 융합되어 하이브리도마를 생성하는 단리된 인간 B 세포로부터 생성될 수 있으며, 이는 이후 최적 인간 항체에 대해 스크리닝될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체(들)"은 또한 비글리코실화 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 단편"은 당해 분야에 공지된 바와 같은 1 이상의 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 도메인을 포함하고 항원에 결합하는 항체 분자를 지칭한다. 본 발명에 따른 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 및 scFv 단편; 및 또한 디아바디; 트리아바디; 테트라바디; 미니바디; 도메인 항체; (dAbs), 예컨대 sdAbs, VHH 및 VNAR 단편, 단일 사슬 항체; 항체 단편 또는 항체로부터 형성된 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 또는 다중특이적 항체를 포함하고, Fab-Fv 또는 Fab-Fv-Fv 작제물를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 정의된 바와 같은 항체 단편은 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "크로마토그래피"는 혼합물의 개별 용질이 이동상의 영향 하에 고정 매질을 통해 이동하는 속도에서의 차이의 결과로서 혼합물 중 이의 용질로부터 분리되는 공정을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "음이온 교환 크로마토그래피"는 고상이 양전하로 하전된, 예를 들어 이에 부착된 1 이상의 양전하 하전된 리간드, 예컨대 4차 아민 기를 갖는 크로마토그래피를 의미한다. 시판 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로오스, QAE SEPHADEX.TM. 및 FAST Q SEPHAROSE.TM를 포함한다.(GE 헬스케어).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "양이온 교환 크로마토그래피"는 고상이 음전하로 하전된, 예를 들어 이에 부착된 1 이상의 음전하 하전된 리간드, 예컨대 카르복실레이트 또는 설포네이트 기 등을 갖는 크로마토그래피를 의미한다. 시판 양이온 교환 수지는 아가로스 상에 고정된 카르복시-메틸-셀룰로스,설포프로필(SP) 및아가로스 상에 고정된 술포닐을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세척 버퍼"는 원하는 폴리펩티지 분자를 용출하기 전에 이온 교환 수지에서 세척 또는 재평형화를 위해 사용되는 버퍼를 의미한다. 편리하게도, 세척 버퍼 및 로딩 버퍼는 동일할 수 있지만, 이는 필수적이지 않다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "로드 버퍼"는 고상이 아닌 원하는 단백질을 로딩하도록 사용되는 버퍼를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "용출 버퍼"는 고상으로부터 원하는 단백질을 용출시키도록 사용되는 버퍼를 의미한다. 이는 첨가제, 및/또는 용출 버퍼의 전도성 및/또는 pH 범위를 이용함으로써 달성될 수 있으며 원하는 폴리펩티드가 크로마토그래피의 고상으로부터 용출되도록 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "한외여과"는, 예를 들어 원하는 단백질을 함유하는 혼합물, 예컨대 용액이 농축 또는 정제 목적을 위해 멤브레인을 통과하는 압력 구동 공정을 의미한다. 한외여과 멤브레인은 통상적으로 1 nm 내지 50 nm의 평균 공극 크기를 가지며, 이는 역삼투 및 미세여과 멤브레인의 평균 공극 크기의 사이이다. 공극 크기는 보통 특정 분자량의 단백질을 보유하는 이의 능력으로 정량화되며 보통 kDa 단위의 명목 분자량 컷오프(nominal molecular weight cutoff, NMWC)의 용어로 인용된다. 한외여과는 힘을 구동하는 주어진 압력에 반응하여 멤브레인을 가로지르는 상이한 물질들의 여과 속도의 차이에 기초하여 용질을 분리하고, 그 속도는 용질의 크기에 의존한다. 따라서, 혼합물 또는 용액 중의 용질은 크기 차이에 기초하여 분리된다. 한외여과는 주로 단백질 농축, 버퍼 교환 및 탈염, 단백질 정제, 바이러스 제거, 및 정화를 위한 다운스트림 공정에서 사용된다. 용어 "한외여과"는 접선 유동 여과(TFF)를 포함하며 이로 인해 혼합물, 예컨대 용액은 한외여과 멤브레인을 따라 수평으로 통과한다. 용어 "한외여과"는 고성능 접선 유동 여과(HPTFF)를 포함하지 않으며 이로 인해 용질은 단지 크기에 의해서만 아니라 크기와 하전에 따라 분리된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "정용여과"는 단백질, 펩티드, 핵산, 및 이의 생체분자를 함유하는 용액으로부터 염 또는 용매의 농축을 본질적으로 대체하는 한외여과 멤브레인 기술의 한 유형을 의미한다. 상기 공정은 용액 및 현탁액의 성분을 이의 분자 크기에 기초하여 분리하기 위한 투과성 멤브레인 필터를 선택적으로 사용한다. 보다 작은 분자, 예컨대 염, 용매, 및 물은 한외여과 멤브레인을 자유롭게 통과하며, 보다 큰 분자들은 유지된다. 통상적으로 버퍼 중에 있는 단백질 샘플은, 멤브레인을 가로질러 정용여과되며 이는 단백질을 보유하고 버퍼 교환을 가능하게 한다. 시간이 경과함에 따라 원래의 단백질을 함유하는 버퍼는 신규한 버퍼로 교환된다.
대안적으로, 실험 규모에 따라, 원래의 버퍼를 신규한 버퍼로 교환하는 수단으로서 겔 여과(예컨대 중력류 하에 구동되는 Sephadex G-25 탈염 컬럼)를 이용하는 것일 수 있다. 이 경우 버퍼 교환은 수지 공극보다 큰 분자가 상기 수지 공극으로부터 배제되고, 수지 공극 내로 분산되고 따라서 유지되며 상을 통해 더 느리게 움직이는 보다 작은 분자보다 고상을 통해 더 빠르게 이동하는 경우 버퍼 교환이 일어난다. 보다 큰 분자, 예컨대 원하는 단백질은 수지 평형 버퍼에서 용출된 분획에서 수집된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "PEG화"는 PEG 분자에 공유 결합된 단백질을 지칭한다.
[ 실시예 ]
실시예 1
Fab'1(부위 특이적 PEG화를 위해 의도된 단일 힌지 티올 함유 Fab' 항체 단편)을 E. 콜리 W3110 숙주 세포에서 이종 단백질로서 발현시키고, 이종 단백질을 pH 7.4로 조정된 100 mM 트리스/10 mM-EDTA 버퍼의 첨가 및 57.5℃에서의 열 처리에 의해 숙주 세포의 주변 세포질 공간으로부터 방출시켰다. 세포 물질을 원심분리를 통해 제거하고 이종 단백질을 함유하는 세포 추출물을 아세트산의 첨가를 통해 pH 4.5로 조정하였다 이후 pH 조정된 세포 추출물을 원심분리 및 0.2 ㎛ 여과의 조합을 이용하여 정화된다. 이후 정화된 추출물(공급 스트림)을 약 6.0 mS/cm의 전도도를 목표로 물로 희석하였다.
이후 Fab'1 함유 공급 스트림을 Capto S™ 양이온 교환 컬럼 from GE 헬스케어 [덱스트란 링커를 통해 결합된 설포네이트 양이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.11 - 0.14 mml Na+/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼을 아세트산을 이용해 pH 4.5로 조정된 6 컬럼 부피의 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 로딩된 스트림을 공급하기 전에 평형화하였다.
로딩 후 컬럼을 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 비결합한 물질이 전부 세척되기까지 세척하였다. Fab'1 함유 분획은 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50 mM 아세트산 나트륨 및 190 mM NaCl로 용출되었다.
얻어진 Fab'1 함유 용출액을 10 kDa의 명목 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과 멤브레인(T-시리즈 멤브레인(Pall Corppration))을 이용하는 한외여과로 처리하여 부피의 약 1/5의 농축물을 유도하고 pH 8.2로 조정된 20 mM 트리스 버퍼 약 8 부피에 대해 정용여과하였다.
Fab'1 풀을 GE 헬스케어사제 Capto QTM 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합한 4차 아민 음이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.16 - 0.22 mmol Cl-/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 pH 8.2로 조정된 20 mM 트리스 버퍼를 갖는 단백질 로드 전에 평형화되었다.
컬럼을 로딩한 후, 컬럼을 pH 8.2로 조정된 20 mM 트리스 버퍼를 이용하여 세척하였다. Fab'1를 로딩 및 세척 단계로부터 얻어진 유수 분획으로부터 회수하였다.
Fab'1을 함유하는 얻어진 음이온 교환 크로마토그래피 용출액을, 로드 세척 및 용출 버퍼 이후, 사전 평형으로서 pH 4.5로 조정된 20 mM 아세트산 나트륨 버퍼를 이용하여 GE 헬스케어사제 PD-10 탈염 컬럼(85-260 um 범위 입자 크기 및 5000 Da의 배제 한계를 갖는 Sephadex™ G25 매트릭스를 이용한 겔 여과 크로마토그래피) 상에 로딩하였다.
Fab'1 용출액을 회수하고 2 분지의 20 kDa (3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-([3-(6-말레이미드-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시)프로판, 일본 도쿄 소재 NOF Corporation사제)을 갖는 40　kDa PEG-말레이미드를 1:2의 Fab'1-PEG 몰비로 첨가하고 18-22℃에서 17 시간 동안 반응하게 하였다.
크기 배제 HPLC를 이용하여 측정된 바와 같은 PEG화 효율은 43% Fab'1-PEG 모노머의 생성을 유도하였다(도 1).
실시예 2
E. 콜리 W3110 숙주 세포에서 이종 단백질로서 CDP870 Fab'를 발현시키고 pH 7.4로 조정된 100 mM 트리스/10 mM-EDTA 버퍼의 첨가 및 59℃에서의 열 처리에 의해 상기 이종 단백질을 숙주 세포의 주변 세포질 공간으로부터 방출시켰다. 세포 물질을 원심분리를 통해 제거하고 이종 단백질을 함유하는 세포 추출물을 아세트산의 첨가를 통해 pH 4.5로 조정하였다. 이후 pH 조정된 세포 추출물을 원심분리 및 0.2 ㎛ 여과의 조합을 이용하여 정화하였다.
정화된 추출물(공급 스트림)을 이후 약 4 mS/cm의 표적 전도도로 물로 희석하고 1 mM 글루타티온을 공급하였다.
이후 CDP870 Fab'를 함유하는 공급 스트림을 GE 헬스케어사제 Capto S™ 양이온 교환 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합된 설포네이트 양이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.11 - 0.14 mmol Na+/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 1mM 글루타티온을 함유하는 (아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된) 6 컬럼 부피의 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 로딩된 스트림을 공급하기 전에 평형화되었다.
로딩 후, 결합하지 않은 물질이 전부 세척되기까지, 1 mM 글루타티온 함유 아세트산을 이용해 pH 4.5로 조정된 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 컬럼을 세척하였다. CDP870 Fab' 분획을 1mM 글루타티온 함유 50 mM 아세트산 나트륨 및 250 mM NaCl(아세트산으로 pH 4.5로 조정됨)로 용출시켰다.
얻어진 CDP870 Fab' 함유 용출액을 10 kDa의 명목 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과 멤브레인(T-시리즈 멤브레인(Pall Corppration))을 이용하는 한외여과로 처리하여 부피의 약 1/2의 농축물을 유도하고 1 mM 글루타티온을 함유하는 pH 8.5 버퍼로 조정된 20 mM 트리스 버퍼 로 정용여과하였다. 7 부피의 버퍼를 정용 여과를 위해 사용하였다.
풀을 GE 헬스케어사제 Capto QTM 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합한 4차 아민 음이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.16 - 0.22 mmol Cl-/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 1 mM 글루타티온을 함유하는 pH 8.5로 조정된 20 mM 트리스 버퍼를 갖는 단백질 로드 전에 평형화되었다.
로딩 후, 컬럼을 1 mM 글루타티온을 함유하는 pH 8.5로 조정된 20 mM 트리스 버퍼를 이용하여 세척하였다. CDP870 Fab'를 로딩 및 세척 단계로부터 얻어진 유수식 분획으로 회수하였다. CDP870 Fab'를 함유하는 얻어진 음이온 교환 크로마토그래피 용출액을, 로드 세척 및 용출 버퍼 이후, 사전 평형으로서 아세트산으로 pH 4.5로 조정된 20 mM 아세트산 나트륨 버퍼를 이용하여 GE 헬스케어사제 PD-10 탈염 컬럼(85-260 um 범위 입자 크기 및 5000 Da의 배제 한계를 갖는 Sephadex™ G25 매트릭스를 이용한 겔 여과 크로마토그래피) 상에 로딩하였다.
CDP870 Fab' 함유 용출액을 회수하고 말레이미드 링커를 함유하는 2 분지의 20 kDa (비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜))의말레이미드프로피온아미드, 개질 라이신, 미국 캘리포니아 소재 Nektar Therapeutics Corppration)을 갖는 40　kDa PEG를 1:2.8의 PEG 과량 몰비로 첨가하고 18-22℃에서 반응하게 하였다.
크기 배제 HPLC를 이용하여 측정된 바와 같은 PEG화 효율은 78.1% CDP870 Fab'-PEG 모노머의 생성을 유도하였다(도 2).
실시예 3
E. 콜리 W3110 숙주 세포에서 이종 단백질로서 CDP870 Fab'를 발현시키고 1 mM 글루타티온을 함유하고 pH 7.4로 조정된 100 mM 트리스/10 mM-EDTA 버퍼의 첨가 및 59℃에서의 열 처리에 의해 상기 이종 단백질을 숙주 세포의 주변 세포질 공간으로부터 방출시켰다. 세포 물질을 원심분리를 통해 제거하고 이종 단백질을 함유하는 세포 추출물을 아세트산의 첨가를 통해 pH 4.5로 조정하였다. 이후 pH 조정된 세포 추출물을 원심분리 및 0.2 ㎛ 여과의 조합을 이용하여 정화하였다.
정화된 추출물(공급 스트림)을 이후 약 4 mS/cm의 표적 전도도로 물로 희석하고 1 mM 글루타티온을 공급하였다.
이후 CDP870 Fab'를 함유하는 공급 스트림을 GE 헬스케어사제 Capto S™ 양이온 교환 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합된 설포네이트 양이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.11 - 0.14 mmol Na+/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 1mM 글루타티온을 함유하는 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 6 컬럼 부피의 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 로딩된 스트림을 공급하기 전에 평형화되었다.
로딩 후, 결합하지 않은 물질이 전부 세척되기까지, 1 mM 글루타티온 함유 아세트산을 이용해 pH 4.5로 조정된 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 컬럼을 세척하였다. CDP870 Fab' 분획을 아세트산으로 pH 4.5로 조정된 1mM 글루타티온 함유 50 mM 아세트산 나트륨 및 250 mM NaCl로 용출시켰다. 얻어진 CDP870 Fab' 함유 용출액을 10 kDa의 명목 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과 멤브레인을 이용하는 한외여과로 처리하여 부피의 약 1/3의 농축물을 유도하고 1 mM 글루타티온을 함유하는 pH 8.5 버퍼로 조정된 9 부피의 20 mM 트리스 버퍼에 대해 정용여과하였다. CDP870 Fab' 풀을 GE 헬스케어사제 Capto QTM 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합한 4차 아민 음이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.16 - 0.22 mmol Cl-/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 1 mM 글루타티온을 함유하는 pH 8.5로 조정된 20 mM 트리스 버퍼를 갖는 단백질 로드 전에 평형화되었다. 로딩 후, 컬럼을 1 mM 글루타티온을 함유하는 pH 8.5로 조정된 20 mM 트리스 버퍼를 이용하여 세척하였다. CDP870 Fab'를 로딩 및 세척 단계로부터 얻어진 유수식 분획으로 회수하였다.
얻어진 CDP870 Fab' 함유 용출액을 10 kDa의 명목 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과 멤브레인을 이용하는 한외여과로 처리하고 PEG화를 위한 제조에서 20 mM 아세트산 나트륨 pH 4.5 내로 정용여과하였다.
2 분지의 20 kDa (말레이미도프로피온아미드 of 비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)), 개질 라이신, 미국 캘리포니아 소재 Nektar Therapeutics Corppration)을 갖는 40　kDa PEG-말레이미드를 1:1.4 및 1:2의 CDP870 Fab':PEG 몰비로 회수된 단백질에 첨가하고 18-22℃에서 17 시간 동안 반응하게 하였다.
역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같은 PEG화 효율은 각각 1:1.4 및 1:2 CDP870 Fab':PEG 비에 대해 74% 및 74.4% CDP870 Fab'-PEG 모노머의 생성을 나타내었다.
실시예 4
Fab'1(부위 특이적 PEG화를 위해 의도된 단일 힌지 티올을 포함하는 Fab' 항체 단편)을 E. 콜리 W3110 숙주 세포 중의 이종 단백질로서 발현시키고, 10 mM 글루타티온을 함유하는 pH 7.4로 조정된 100 mM 트리스/10 mM-EDTA 버퍼의 첨가 및 57.5℃에서의 열 처리에 의해 상기 이종 단백질을 숙주 세포의 주변 세포질 공간으로부터 방출시켰다. 세포 물질을 원심분리를 통해 제거하고 이종 단백질을 함유하는 세포 추출물을 아세트산의 첨가를 통해 pH 4.5로 조정하였다. 이후 pH 조정된 세포 추출물을 원심분리 및 0.2 ㎛ 여과의 조합을 이용하여 정화하였다.
정화된 추출물(공급 스트림)을 이후 6 mS/cm의 전도도 범위(약 4의 희석 인자)로 물로 희석하였다. 이후 Fab'1를 함유하는 공급 스트림을 GE 헬스케어사제 Capto S™ 양이온 교환 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합된 설포네이트 양이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.11 - 0.14 mmol Na+/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 아세트산을 이용하여 6 컬럼 부피의 pH 4.5로 조정된 1 mM 글루타티온 함유 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 로딩된 스트림을 공급하기 전에 평형화되었다.
로딩 후, 결합하지 않은 물질이 전부 세척되기까지, 아세트산을 이용해 pH 4.5로 조정된 1 mM 글루타티온 함유 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 컬럼을 세척하였다. Fab'1- 함유 분획을 아세트산을 이용해 pH 4.5로 조정된 1 mM 글루타티온 함유 50 mM 아세트산 나트륨 및 190 mM NaCl로 용출시켰다.
얻어진 Fab'1 함유 용출액을 10 kDa의 명목 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과 멤브레인을 이용하는 한외여과로 처리하여 부피의 약 1/5의 농축물을 유도하고 pH 8.2 버퍼로 조정된 8 부피의 1 mM 글루타티온 함유 20 mM 트리스 버퍼로 정용여과하였다.
Fab'1 풀을 GE 헬스케어사제 Capto QTM 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합한 4차 아민 음이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.16 - 0.22 mmol Cl-/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 pH 8.2로 조정된 1 mM 글루타티온 함유 20 mM 트리스 버퍼를 ㄱ갖는 단백질 로드 전에 평형화되었다.
컬럼을 로딩한 후, 컬럼을 pH 8.2로 조정된 1 mM 글루타티온을 함유하는 20 mM 트리스 버퍼를 이용하여 세척하였다. Fab'1을 로딩 및 세척 단계로부터 얻어진 유수식 분획으로 회수하였다.
Fab'1을 함유하는 얻어진 음이온 교환 크로마토그래피 용출액을, 로드 세척 및 용출 버퍼 이후, 사전 평형으로서 pH 4.5로 조정된 20 mM 아세트산 나트륨 버퍼를 이용하여 GE 헬스케어사제 PD-10 탈염 컬럼(85-260 um 범위 입자 크기 및 5000 Da의 배제 한계를 갖는 Sephadex™ G25 매트릭스를 이용한 겔 여과 크로마토그래피) 상에 로딩하였다.
Fab'1 용출액을 회수하고 2 분지의 20 kDa (3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-([3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시) 프로판, 일본 도쿄 소재 NOF Corporation사제)을 갖는 40　kDa PEG-말레이미드를 1:2의 Fab'1-PEG 몰비로 첨가하고 20℃에서 17 시간 동안 반응하게 하였다.
크기 배제 HPLC를 이용하여 측정된 바와 같은 PEG화 효율은 71.5% Fab' 1-PEG 모노머의 생성을 유도하였다(도 1).
실시예 5
Fab'1(부위 특이적 PEG화를 위해 의도된 단일 힌지 티올을 포함하는 Fab' 항체)을 E. 콜리 W3110 숙주 세포 중의 이종 단백질로서 발현시키고, pH 7.4로 조정된 100 mM 트리스/10 mM-EDTA 버퍼의 첨가 및 57.5℃에서의 열 처리에 의해 상기 이종 단백질을 숙주 세포의 주변 세포질 공간으로부터 방출시켰다. 세포 물질을 원심분리를 통해 제거하고 이종 단백질을 함유하는 세포 추출물을 아세트산의 첨가를 통해 pH 4.5로 조정하였다. 이후 pH 조정된 세포 추출물을 원심분리 및 0.2 ㎛ 여과의 조합을 이용하여 정화하였다.
정화된 추출물(공급 스트림)을 이후 6 mS/cm의 전도도로 물로 희석하였다. 이후 Fab'1를 함유하는 공급 스트림을 GE 헬스케어사제 Capto S™ 양이온 교환 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합된 설포네이트 양이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.11 - 0.14 mmol Na+/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 아세트산을 이용하여 pH 4.5로 조정된 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 로딩된 스트림을 공급하기 전에 평형화되었다.
로딩 후, 결합하지 않은 물질이 전부 세척되기까지, 아세트산을 이용해 pH 4.5로 조정된 50 mM 아세트산 나트륨 버퍼로 컬럼을 세척하였다. Fab'1- 함유 분획을 아세트산을 이용해 pH 4.5로 조정된 50 mM 아세트산 나트륨 및 190 mM NaCl로 용출시켰다.
얻어진 Fab'1 함유 용출액을 10 kDa의 명목 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과 멤브레인을 이용하는 한외여과로 처리하여 부피의 약 1/5의 농축물을 유도하고 pH 8.2로 조정된 20 mM 트리스 버퍼 8 부피로 정용여과하였다. Fab'1 풀을 GE 헬스케어사제 Capto QTM 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼[덱스트란 링커를 통해 결합한 4차 아민 음이온 교환 리간드를 갖는 고도 가교된 경질 아가로스 비드(평균 입자 크기 90 ㎛)(이온 용량 0.16 - 0.22 mmol Cl-/ml)] 상에 로딩하였다. 컬럼은 pH 8.2로 조정된 20 mM 트리스 버퍼를 갖는 단백질 로드 전에 평형화되었다.
컬럼을 로딩한 후, 컬럼을 pH 8.2로 조정된 20 mM 트리스 버퍼를 이용하여 세척하였다. Fab'1을 로딩 및 세척 단계로부터 얻어진 유수식 분획으로 회수하였다.
회수된 Fab'1 함유 음이온 교환 크로마토그래피 용출액을 이후 10 kDa의 명목 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르 술폰계 한외여과 멤브레인을 이용하는 한외여과로 처리하여 이를 20 mg/ml로 농축하고 2 mM EDTA 함유 0.1 M 포스페이트 버퍼 pH 6.8 내로 정용여과하였다.
이후 결과로 얻어진 Fab'1 함유 샘플을 6.5 시간에 걸쳐 pH 6.8로 조정된 1 mM 2-머캅토에틸아민 및 2 mM EDTA 함유 0.1 M 포스페이트 버퍼 및 동일한 멤브레인의 정용 여과로 감소시켰다.
추가로 pH가 4.5로 조정된 20 mM 아세트산 나트륨 버퍼 내로의 한외여과/정용여과는 PEG화에 대한 제조에서의 환원제를 제거하도록 동일한 멤브레인에서 수행되었다.
20 kDa의 2개의 분지를 갖는 40 kDa PEG-말레이미드(3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-([3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시) 프로판, 일본 도쿄 소재 NOF Corporation사제)를 회수된 Fab'1 단백질에, 1:1.25의 Fab':PEG 중량:중량 비로 첨가하고, 18-22℃에서 17시간 동안 반응하게 하였다.
크기 배제 HPLC를 이용하여 측정된 바의 PEG화 효율은 77.4% Fab'1-PEG 모노머를 유도하였다(도 3).

Claims (13)

  1. 단백질의 제조 방법으로서,
    a) 숙주 세포를, 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계, 및
    c) 상기 단백질을 숙주 세포 및 기타 오염 물질을 함유하는 혼합물로부터 정제하는 단계로서, 상기 정제는 1 이상의 크로마토그래피 단계를 포함하고, 환원제가 상기 혼합물에 첨가되며, 단백질은 제1 크로마토그래피 단계로부터 최종 크로마토그래피 단계까지 상기 환원제의 존재 하에 유지되는 것인 단계
    를 포함하는 단백질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 환원제는 글루타티온, β-머캅토에탄올, β-머캅토에틸아민, 디티오트레이톨, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀, 시스테인 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환원제는 0.1 mM 내지 100 mM 글루타티온인 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 환원제를 회수된 단백질로부터 제거하는 것인 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단백질은 다른 분자에 커플링된 것인 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단백질은 단백질의 시스테인 잔기로의 공유 결합을 통해 다른 분자에 커플링된 것인 제조 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 다른 분자에 커플링된 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab'인 제조 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편 내의 상기 시스테인은 항체 힌지에 있는 것인 제조 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자인 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 PEG 분자는 40,000 PEG-말레이미드인 제조 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단백질은 상기 시스테인을 통해 상기 PEG 분자에 결합되어 있는 것인 제조 방법.
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