CN110386978A

CN110386978A - 大肠杆菌周质空间表达的蛋白的提取方法

Info

Publication number: CN110386978A
Application number: CN201810355270.2A
Authority: CN
Inventors: 冯军; 吴勇; 张庆彬; 黄宗庆; 化浩举; 李乐乐
Original assignee: Shanghai Faith Biotechnology Co Ltd; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Faith Biotechnology Co Ltd; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2019-10-29

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法。所述的提取方法包括：将周质空间表达Fab蛋白的重组大肠杆菌菌体混悬于含有二价阳离盐的酸性缓冲液中，进行低压匀浆处理，之后除掉细胞碎片等杂质即得到含有目的蛋白的周质提取液；由此获得的周质提取液调pH值后进行高温加热处理，去除絮状沉淀后得到大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。本发明提取方法在尽量保证Fab提取收量的基础上有效地去除了Fab相关杂质，将目的蛋白中Fab纯度提高至90％以上，从而降低后续蛋白质层析纯化的难度以及成本。

Description

大肠杆菌周质空间表达的蛋白的提取方法

技术领域

本发明涉及大肠杆菌周质空间表达蛋白质的提取方法，特别涉及大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法。

背景技术

大肠杆菌作为原核细菌，其遗传背景研究比较透彻，易于培养且发酵培养周期短，是表达外源蛋白的首选细菌。目前大约有40％蛋白质药物是通过大肠杆菌表达系统生产的。外源蛋白在大肠杆菌中的表达方式分为胞质内表达以及分泌表达两种方式。Fab片段是由轻链和重链通过多对二硫键形成的异源二聚体活性蛋白，其在细菌胞内表达时，由于细菌胞内为还原型环境，Fab蛋白不能够进行正确折叠、形成二硫键，最终会形成无任何生物功能的包涵体。后期需要进行复杂的变性以及复性条件的探索，生产工艺比较复杂，目前这种表达方式主要局限于基础研究。为了克服以上问题，研究者们设计研究出大肠杆菌周质空间分泌表达Fab片段的策略。大肠杆菌周质空间为一个氧化型环境，有利于Fab蛋白二硫键的正确形成，且周质空间中蛋白酶含量比较低，能够避免Fab蛋白被蛋白酶降解，极大地提高了Fab蛋白的稳定性。同时，通过大肠杆菌发酵工艺优化，能够极大地提高Fab蛋白在周质空间的表达量。

在大肠杆菌周质空间发酵表达Fab抗体的过程中，Fab抗体重链Fd段以及轻链中的半胱氨酸在周质空间中氧化形成二硫键，最终保证Fab抗体重链Fd段以及轻链在二硫键作用下形成异二聚体，即Fab抗体。然而研究过程中发现，大肠杆菌周质空间表达Fab抗体的过程中，重链Fd段(VH-CH1)以及轻链(VL-CL)有一定几率进行二硫键错配反应，最终导致形成结构错配的Fab抗体以及Fab蛋白多聚体。除此之外，重链Fd段(VH-CH1)以及轻链(VL-CL)本身也可能进行二硫键配对反应，形成重链二聚体以及轻链二聚体。另外，重链Fd段(VH-CH1)以及轻链(VL-CL)自身内部进行二硫键配对，导致周质空间当中存在一定量的重链、轻链单体等成分。因此周质空间表达Fab蛋白的大肠杆菌周质蛋白提取液中不仅含有结构正确的Fab蛋白，也会存在着结构错配的Fab蛋白、多聚体、重链二聚体、轻链二聚体、重链以及轻链单体等Fab相关杂质。因此上述提取液通过亲和层析所制备得到的目的蛋白洗脱液当中仍旧存在Fab相关杂质，且此类Fab相关杂质，在后期分离纯化过程中较难去除，严重影响Fab抗体产品的最终纯度。Fab相关杂质的比例在周质空间不同种类的Fab蛋白表达过程中也有所不同，目前并没有通用的纯化方法能明显去除Fab相关杂质。

当外源蛋白，尤其是Fab抗体蛋白分泌至大肠杆菌周质空间后，需要采用定向释放的技术对周质蛋白进行提取。在周质蛋白提取过程中，内膜破损会导致胞浆内核酸、脂质以及杂蛋白等物质释放出来，严重干扰后期目的蛋白的分离纯化。因此周质蛋白提取方法的关键是只破坏大肠杆菌外膜，而不破坏内膜，最终使大肠杆菌中内膜和外膜之间的蛋白定向释放至提取液中。

文献[Popplewell A G,Sehdev M,Spitali M,et al.Methods Mol Biol,2005,308(308):17-30]提及了一种提取大肠杆菌周质空间Fab蛋白的方法。将菌体与Tris、EDTA溶液混匀后室温条件进行搅拌，上清即为周质空间Fab蛋白提取液。此方法操作过程简单，便于后期大规模放大，但是提取过程中搅拌时间较长(至少12h)，容易导致菌体破裂，得到的提取液过于粘稠，影响后期分离纯化。且此方法对周质蛋白的提取效率有待进一步研究。

文献US6967241B2描述了一种从大肠杆菌中提取异源蛋白的方法。通过将菌体混悬于含有溶解增强剂的酸性缓冲液中，进行细胞破碎处理，即得到富含目的蛋白的提取液，且提取液的黏度以及絮凝状态等性质得到了明显改善。但文献并没有对提取液中目的蛋白相关杂质进行详细描述。

因此针对大肠杆菌周质蛋白的定向释放技术，尤其是周质空间Fab抗体蛋白的释放，急需研究出一种提取效率更高、更加便捷且能够明显降低Fab相关杂质含量的周质提取方法，以满足工业生产上的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法。该方法能够破坏大肠杆菌的外膜，释放重组大肠杆菌周质空间的Fab抗体蛋白。

本发明的另一目的是提供一种粗纯化方法，在大肠杆菌周质空间Fab蛋白提取液的基础上，通过加热处理，除掉部分未正确配对的重链、轻链单体成分以及二硫键错配的Fab蛋白等杂质，尽可能地提高结构正确的Fab蛋白的纯度，从而降低后期目的蛋白分离纯化的难度以及成本。

本发明的第一方面，提供了一种大肠杆菌周质空间蛋白提取液的制备方法，包括步骤：

(i)混匀步骤，将周质空间分泌表达目的蛋白的重组大肠杆菌菌体混匀于酸性溶液中，获得菌体混悬液；

(ii)匀浆步骤，对步骤(i)中的菌体混悬液进行N次匀浆处理，获得匀浆液，其中N为≥1的正整数，优选N为1-15，更优选N为2-10，最优选N为3-5；

(iii)杂质去除步骤，对步骤(ii)中获得的匀浆液进行杂质去除处理，获得大肠杆菌周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述酸性溶液为在酸性条件下具有缓冲能力的酸性缓冲液。

在另一优选例中，所述酸性缓冲液pH值为3.5-4.5，优选4.0。

在另一优选例中，所述酸性缓冲液选自下组：甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、Tris–盐酸缓冲液、或其组合。

在另一优选例中，所述酸性缓冲液选自下组：甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等、或其组合。

在另一优选例中，所述酸性缓冲液为柠檬酸-氢氧化钠缓冲液。

在另一优选例中，所述柠檬酸浓度优选为30-80mmol/L，更优选为60mmol/L。

在另一优选例中，所述酸性缓冲液中含有二价阳离子盐。

在另一优选例中，所述二价阳离子盐选自下组：含Mg²⁺的盐、含Ca²⁺的盐、或其组合。

在另一优选例中，所述二价阳离子盐选自下组：MgSO₄、MgCl₂、CaSO₄、CaCl₂，或其组合。

在另一优选例中，所述二价阳离子盐浓度为30-80mmol/L，优选为50mmol/L。

在另一优选例中，所述酸性缓冲液选自下组：酸性缓冲液1、酸性缓冲液2、酸性缓冲液3、酸性缓冲液4、或其组合；

其中：

酸性缓冲液1为：30mmol/L柠檬酸，30mmol/L CaCl₂ pH3.5溶液；

酸性缓冲液2为：80mmol/L柠檬酸，80mmol/L CaSO₄ pH4.5溶液；

酸性缓冲液3为：30mmol/L柠檬酸，30mmol/L MgCl₂ pH4.0溶液；

酸性缓冲液4为：60mmol/L柠檬酸，50mmol/L MgSO₄ pH4.0溶液。

在另一优选例中，所述目的蛋白为大肠杆菌周质空间表达的蛋白。

在另一优选例中，所述目的蛋白为Fab蛋白。

在另一优选例中，所述目的蛋白为大肠杆菌周质空间表达的Fab蛋白。

在另一优选例中，所述匀浆步骤中，所述匀浆处理为低压匀浆处理。

在另一优选例中，所述匀浆步骤中，N＝3。

在另一优选例中，所述匀浆步骤中，匀浆压力为400-1000bar，较佳地为550bar-950bar。

在另一优选例中，所述杂质去除处理的方法选自下组：离心处理、中空纤维膜过滤、陶瓷膜过滤、平板膜过滤。

在另一优选例中，所述离心处理为高速离心处理。

在另一优选例中，所述离心处理在2-10℃下进行；较佳地在4℃下进行。

在另一优选例中，所述离心处理在5000-10000rpm条件下进行；较佳地在7000rpm条件下进行。

在另一优选例中，所述离心处理时间为10-50min，较佳地为20min。

在另一优选例中，所述混匀步骤中，酸性缓冲液为：60mmol/L柠檬酸，50mmol/LMgSO₄ pH4.0溶液。

在另一优选例中，所述混匀步骤中，所述重组大肠杆菌菌体与所述酸性缓冲液质量体积比(g/mL)为1:2.5-1:15，优选为1:5-1:10。

本发明的第二方面，提供了一种蛋白的提取方法，包括步骤：

(1)提供一蛋白提取液样品，其中含有待纯化的蛋白；

(2)调节(1)中蛋白提取液样品的pH为3.5-8.0，获得蛋白处理液1；

(3)对(2)中蛋白处理液1进行加热处理，所述热处理温度为30-80℃，获得蛋白处理液2；

(4)任选地，从蛋白处理液2中去除沉淀，获得蛋白粗纯化液。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(4)之后还包括步骤：

(5)调节蛋白粗纯化液的pH为中性。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(5)之后还包括步骤：

(6)亲和层析步骤，获得纯度≥90％的蛋白样品。

在另一优选例中，所述蛋白提取液为通过本发明的第一方面所述方法制得的周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述蛋白提取液为大肠杆菌周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述蛋白提取液为通过PEI提取法制得的周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述蛋白提取液为通过精氨酸提取法制得的周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述蛋白提取液为通过渗透压提取法制得的周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述蛋白提取液为通过Tris、EDTA搅拌提取法制得的周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述蛋白为大肠杆菌周质空间表达的蛋白。

在另一优选例中，所述蛋白为Fab蛋白。

在另一优选例中，所述蛋白为大肠杆菌周质空间表达的Fab蛋白。

在另一优选例中，所述蛋白粗纯化液为含有大肠杆菌周质空间表达的Fab蛋白的粗纯化液。

在另一优选例中，所述加热处理温度为30-80℃，较佳地为50-75℃，更佳地为60-75℃，最佳地为70℃。

在另一优选例中，所述pH为3.5-8.5，较佳地为5.0-8.5，更佳地为7.5-8.5，最佳地为8.0。

在另一优选例中，所述加热处理的时间为1-10h，较佳地为2-8h，更佳地为3-6h，最佳地为4h。

在另一优选例中，所述加热处理温度为65-70℃，pH为7.0-8.0，加热处理的时间为3-4h。

在另一优选例中，所述加热处理温度为70℃；pH为8.0；加热处理的时间为4h。

在另一优选例中，所述步骤(4)中去除沉淀为通过离心去除沉淀。

本发明的第三方面，提供了一种对微生物提取液进行粗纯化处理方法，包括步骤：

(a)提供一微生物提取液样品，其中含有待粗纯化的蛋白；

(b)调节(a)中微生物提取液样品的pH为3.5-8.0，获得第一处理液；

(c)对(b)中第一处理液进行加热处理，所述热处理温度为30-80℃，获得第二处理液；

(d)任选地，从第二处理液中去除沉淀，获得蛋白粗纯化液。

在另一优选例中，所述微生物为细菌。

在另一优选例中，所述微生物为大肠杆菌。

在另一优选例中，所述微生物提取液为周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述微生物提取液为大肠杆菌周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述微生物提取液为大肠杆菌周质空间表达的Fab蛋白提取液。

在另一优选例中，所述周质空间蛋白提取液为通过本发明的第一方面所述方法制得的大肠杆菌周质空间蛋白提取液。

在另一优选例中，所述加热处理温度为30-80℃，较佳地为50-75℃，更佳地为65-75℃，最佳地为70℃。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为合成基因元件示意图。

图2为不同压力匀浆后得到的周质提取液电泳图谱。

图3为不同温度加热后得到的粗纯化液电泳图谱。

图4为粗纯化液的亲和层析洗脱液电泳图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地首次设计了蛋白(例如大肠杆菌周质空间表达的Fab蛋白)的提取方法，该方法包括两部分，即提供蛋白提取液和对蛋白提取液进行粗纯化处理(包括调节蛋白提取液pH和加热处理)，从而获得蛋白粗纯化液。在提供蛋白提取液的步骤中，发明人优化了匀浆条件(例如匀浆压力等)，使得蛋白提取液中目的蛋白含量显著提高(例如周质蛋白提取液中目的蛋白含量达到了643μg/mL)；在提供粗纯化处理过程中，发明人优化了蛋白提取液的pH、加热处理温度T、加热时间t等参数，使得蛋白粗纯化液中目的蛋白纯度提高到90％以上，并且目的蛋白活性保持不变，显著降低目的蛋白后期分离纯化的成本。本发明粗纯化处理方法，通过加热处理，除掉部分未正确配对的重链、轻链单体成分以及二硫键错配的Fab蛋白等杂质，尽可能地提高结构正确的Fab蛋白的纯度，从而降低后期目的蛋白分离纯化的难度以及成本。此外，本发明中对蛋白提取液进行粗纯化处理的步骤中优化的参数条件具有一定的广谱性，也适用于通过其它方法获得的蛋白提取液，并且取得了良好效果。在此基础上完成了本发明。

术语

抗体Fab片段

抗体Fab片段是由轻链(VL-CL)和重链(VH-CH；Fd片段)通过多对链间以及链内二硫键形成的异源二聚体活性蛋白。相较于完整的免疫球蛋白分子，Fab片段具有如下优势：①分子量小但保留有全长抗体的抗原结合部位，具有良好的组织穿透性，能够渗透至全长抗体不能达到的靶组织；②不含Fc片段，无需进行糖基化修饰，尤其适合进行大肠杆菌发酵表达，表达周期短，发酵成本低。

周质蛋白提取液

本发明中，“周质提取液”、“周质蛋白提取液”、“周质空间蛋白提取液”、“周质空间表达的蛋白提取液”具有相同的含义，可以互换使用，均指通过周质蛋白提取方法获得的富含大肠杆菌周质空间表达的目的蛋白的溶液。

蛋白的提取方法

本发明提供一种蛋白的提取方法，包括下列步骤：

(1)提供一蛋白提取液样品，其中含有待纯化的蛋白；

(2)调节(1)中蛋白提取液样品的pH为3.5-8.0，获得蛋白处理液1；

(4)任选地，从蛋白处理液2中去除沉淀，获得蛋白粗纯化液。

典型地，所述方法中，步骤(4)之后还包括步骤：

(5)调节蛋白粗纯化液的pH为中性。

典型地，所述方法中，步骤(5)之后还包括步骤：

(6)亲和层析步骤，获得纯度≥90％的蛋白样品。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供的大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法包括如下步骤：

(a)将周质空间分泌表达Fab蛋白的重组大肠杆菌菌体混悬于酸性溶液中；

(b)上述菌体混悬液进行细胞破碎处理，之后除掉细胞碎片等杂质，得到大肠杆菌周质空间Fab蛋白提取液；

(c)上述提取液进行高温加热处理，之后分离除掉絮状蛋白沉淀，上清即为大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。

在另一具体实施方式中，一种优选的大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法包括如下步骤：

(a)将周质空间分泌表达Fab蛋白的重组大肠杆菌菌体混匀于如含柠檬酸、硫酸镁pH4.0的酸性缓冲液中；

(b)上述菌体混悬液进行低压匀浆处理，之后高速离心以去除细胞碎片等杂质，即可得到大肠杆菌周质空间Fab蛋白提取液；

(c)上述提取液调pH值后进行高温加热处理一定时间，之后进行高速离心除掉絮状蛋白沉淀，上清即为大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。

典型地，本发明提供的大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法，其中步骤(a)中，大肠杆菌发酵结束以后，离心收集菌体。之后将菌体混悬于酸性缓冲液当中。可以采用(并不局限)的缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、Tris–盐酸缓冲液等；其中优选在酸性条件下具有缓冲能力的缓冲液，包括(并不局限)甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等。更优选为柠檬酸-氢氧化钠缓冲液。柠檬酸浓度优选为30-80mmol/L，更优选为60mmol/L。酸性缓冲液pH值优选为3.5-4.5，更优选为pH4.0。

在另一具体实施方式中，步骤(a)中，重组大肠杆菌菌体完全混匀于酸性缓冲液过程中，可以在室温条件下进行充分搅拌，以确保菌体完全混匀于酸性缓冲液当中。在菌体混匀过程中，应确保没有菌体聚集颗粒的产生，以确保后期周质空间目的蛋白提取的效果。大肠杆菌菌体与所述酸性缓冲液进行混匀，优选质量体积比(g/mL)为1:2.5-1:15，更优选为1:5-1:10。

在另一具体实施方式中，步骤(a)中，大肠杆菌菌体完全混悬于酸性缓冲液中之后，需要在酸性缓冲液中加入一定浓度的二价阳离子盐，一方面是为了提高菌体完整形态的稳定性，降低菌体自溶程度，另一方面酸性缓冲液中一定量的盐浓度也起到了促进蛋白溶解的作用。可以采用(但并不局限)MgSO₄、MgCl₂、CaSO₄、CaCl₂等二价阳离子盐。优选二价阳离子盐浓度为30-80mmol/L，更优选为50mmol/L。

在另一具体实施方式中，本发明提供的大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法，其中步骤(b)中，菌体进行匀浆处理，匀浆压力优选为550bar-950bar。匀浆完成之后，可通过高速离心、中空纤维膜过滤、陶瓷膜过滤、平板膜过滤等方式除掉细胞碎片等物质，之后得到大肠杆菌周质空间Fab蛋白提取液。

在另一具体实施方式中，本发明提供的大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法，其中步骤(c)中，大肠杆菌周质空间Fab蛋白提取液进行高温加热处理，加热温度优选为65-70℃。在加热之前，提取液pH值调至5.0-8.0，优选为7.0-8.0。加热时间优选为1-6h，更优选为3-4h。高温加热完毕之后，离心去除蛋白絮状沉淀，上清即为大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。

在另一具体实施方式中，大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液调pH为中性后，再进行一步亲和层析即可获得纯度不低于90％的Fab蛋白样品。

粗纯化液中Fab蛋白纯度

本发明中所提及的周质提取液或粗纯化液中的目的蛋白包括构象正确的Fab蛋白以及Fab相关杂质。粗纯化液中Fab蛋白纯度是指构象正确Fab蛋白含量占目的蛋白总含量的比例。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明提供的大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法，操作过程简单可控；

(2)本发明方法能够降低对大肠杆菌内膜的破坏，从而减少胞内杂蛋白、核酸、脂类等物质的释放，极大地便利了后期分离纯化操作，不仅适合实验室小规模制备，同样也适用于后期工业化大规模生产；

(3)本发明方法可以在较短的时间内处理大量的样品，有利于后期工业化大规模放大生产；

(4)本发明方法相较于传统的大肠杆菌周质空间蛋白提取方法，本发明方法提取效率更高，最终也可以获得纯度更高的Fab蛋白样品，且能够保持蛋白原有的活性；

(5)本发明获得的周质蛋白粗纯化液黏度较低，方便了后期过滤等操作步骤；

(6)本发明方法可以减少后期Fab蛋白样品的纯化步骤，节约成本。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料和通用方法

材料和方法

本发明方法以制备基因工程菌(E.coli DE3购买于北京全式金生物技术有限公司，工程菌株构建方法参考专利WO2014178078A2)周质提取液为例，详述于后。该工程菌分泌表达赛妥珠单抗Fab蛋白于周质空间中。

实施例1：大肠杆菌周质空间分泌表达Fab蛋白的提取

赛妥珠单抗Fab重组表达的构建方法参考专利WO2014178078A2。将含有信号肽的Fab轻重链基因进行人工全合成(合成基因元件示意图见图1)，PCR扩增之后通过NdeI/EcoRI限制性酶切位点连接到pTack质粒，即pTack-STII-Fab。测序正确的质粒电转化至E.coli BL21(DE3)细胞，即为E.coli BL21(DE3)/pTack-STII-Fab。

组成该pTack-STII-Fab质粒的基因序列以及相对应氨基酸序列，见SEQ ID No.1-8。

赛妥珠单抗Fab重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pTack-STII-Fab的高密度发酵方法参考文献[Newton J M,Vlahopoulou J,Zhou Y.Investigating and modelling theeffects of cell lysis on the rheological properties of fermentation broths[J].Biochemical Engineering Journal,2017,121:38-48]。

发酵得到的重组大肠杆菌工程菌菌体按照如下设计的不同提取方法进行提取实验，将重组大肠杆菌工程菌菌体混匀于如下不同的提取液中，650bar压力下匀浆处理3次，匀浆液于4℃，7000rpm离心处理20min后取上清，上清即为低压匀浆周质提取液，用于如下实施例7的检测，各提取方法的具体设计提取条件如下表1所示。

表1.周质空间发酵表达Fab抗体蛋白的设计提取条件

注：

酸性缓冲液1组成为：30mmol/L柠檬酸，30mmol/L CaCl₂pH3.5溶液。

酸性缓冲液2组成为：80mmol/L柠檬酸，80mmol/L CaSO₄pH4.5溶液。

酸性缓冲液3组成为：30mmol/L柠檬酸，30mmol/L MgCl₂pH4.0溶液。

酸性缓冲液4组成为：60mmol/L柠檬酸，50mmol/L MgSO₄pH4.0溶液。

实验检测结果见下表2。

表2.各提取方法得到的提取液中目的蛋白含量的检测结果

实施例2：低压匀浆压力条件优化

取重组大肠杆菌工程菌菌体，在常温条件下按1:5的质量体积比(g/mL)混匀于终浓度60mmol/L柠檬酸，50mmol/L MgSO₄，pH4.0溶液中，于4℃在匀浆机上分别进行550bar、650bar、750bar、850bar、950bar压力匀浆处理3次。考察不同匀浆压力对周质蛋白提取效果的影响。上述匀浆液分别在4℃、7000rpm条件下离心处理20min，上清即为周质提取液。不同压力匀浆得到的提取液电泳图见图2中的1-5。上述提取液用于如下实施例7的检测。检测结果见表3。

表3.不同压力下匀浆结果

实验结果表明：匀浆压力在550-950bar范围内，周质提取液中目的蛋白含量变化不大，均能达到600μg/mL左右。

实施例3：周质提取液高温加热粗纯化处理

周质提取液的制备方法同实施例1方法4。将周质提取液调pH8.0后进行70℃高温水浴加热处理4h。高温处理后的周质提取液于室温条件下7000rpm离心处理20min，上清即为大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。粗纯化液电泳图见图3中的5。粗纯化液用于如下实施例7的检测。其中protein L亲和层析洗脱液电泳图见图4中1。

实验结果表明：周质提取液通过70℃加热处理之后，粗纯化液中目的蛋白浓度由614μg/mL降为228μg/mL，但是Fab蛋白纯度由43％提高至92％左右。通过高温加热粗纯化处理之后，大大提高了目的蛋白Fab纯度，能够降低后期Fab蛋白分离纯化成本。

实施例4：高温加热粗纯化处理过程中提取液pH值优化

周质提取液的制备方法同实施例1方法4。将周质提取液pH值分别调至pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0，将上述不同pH值的周质提取液进行60℃高温水浴加热处理5h，高温处理后的周质提取液于室温条件下7000rpm离心处理20min，上清即为大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。粗纯化液用于如下实施例7的检测。检测结果见表4。

表4.不同pH值的提取液高温加热处理后的粗纯化液检测结果

实验结果表明：当提取液pH选择为7.5-8.0时，通过加热能够明显提高Fab蛋白纯度。

实施例5：高温加热粗纯化处理过程中加热温度优化

周质提取液的制备方法同实施例1方法4。周质提取液pH值调至8.0后分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下水浴加热5h，高温处理后的周质提取液于室温条件下7000rpm离心处理20min，上清即为大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。粗纯化液电泳图见图3中的1-6。粗纯化液用于如下实施例7的检测。检测结果见表5。

表5.提取液经过不同温度加热处理后的粗纯化液检测结果

实验结果表明：提取液随着加热温度增高，粗纯化液中Fab蛋白纯度变高，仅通过加热一步粗纯化步骤就能明显提高粗纯化液中Fab蛋白纯度。

实施例6：高温加热粗纯化处理过程中加热时间优化

周质提取液的制备方法同实施例1方法4。周质提取液pH值调至8.0，之后分别于65℃、70℃条件下水浴加热处理，于加热时间1h、2h、3h、4h、5h、6h时取样，室温条件下7000rpm离心处理20min，上清即为大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。粗纯化液用于如下实施例7的检测。检测结果见表6。

表6.提取液经过不同时间加热处理后的粗纯化液检测结果

实验结果表明：当加热温度选择为65-70℃，加热3h，粗纯化液中Fab纯度能够到达90％以上。

实施例7：周质空间Fab蛋白提取液以及Fab蛋白粗纯化液中目的蛋白含量以及纯度检测

1)采用protein L亲和层析法检测周质提取液以及粗纯化液中目的蛋白的含量，步骤如下：

取周质空间Fab蛋白提取液或者Fab蛋白粗纯化液，调pH值至7.2，过0.22μm水膜后，进行protein L亲和层析纯化分析：

色谱柱：HiScreen^TM Capto^TM L；0.77×10cm，购自GE公司

柱体积(CV)：4.7mL

柱压：≤0.8MPa

检测波长：230nm

流动相A：20mM PBS溶液，pH7.2；流动相B：0.1M Gly-HCl溶液，pH2.7

上样量：3.8mL

分析洗脱条件：

时间(min)	流速(mL/min)	％A	％B
				0	1.60	100.0	0.0
4.00	1.60	100.0	0.0
				4.10	3.00	100.0	0.0
20.00	3.00	100.0	0.0
				20.05	3.00	0.0	100.0
28.00	3.00	0.0	100.0
				28.05	3.00	100.0	0.0
35.00	3.00	100.0	0.0

根据亲和层析洗脱峰面积计算目的蛋白浓度，并合并洗脱峰收集液。

注：周质提取液或粗纯化液中目的蛋白包括构象正确的Fab蛋白以及Fab相关杂质。

2)分析型HPLC检测粗纯化液Fab蛋白纯度

取上述亲和层析洗脱峰收集合并液，进行HPLC反向色谱分析

色谱柱：MabPacRP，4μm，3.0×100mm(P/N:088644)

检测波长：215nm

柱温：80℃

流动相A：0.1％TFA/水溶液流动相B：0.1％TFA/乙腈溶液

流速：0.70mL/min

分析方法：

注：粗纯化液Fab蛋白纯度是指构象正确Fab蛋白含量占目的蛋白总含量的比例。

对比实验

首先就本发明低压匀浆提取方法同目前运用较多的周质蛋白提取方法即PEI(聚乙烯亚胺)周质提取方法(EP-0851925-B1)、精氨酸提取方法(李振国,徐明波,牛罡,等.生物学杂志,2011,28(6):95-97)、渗透压周质提取方法(Ramanan R N,Tan J S,Mohamed MS,et al.Process Biochemistry,2010,45(2):196-202)、Tris，EDTA搅拌提取方法(Popplewell A G,Sehdev M,Spitali M,et al.Methods Mol Biol,2005,308(308):17-30)进行提取效果的比较(具体操作参照实施例1方法4、对照例1、对照例2、对照例3、对照例4)。周质提取液检测方法参照实施例7。

对照例1：PEI(聚乙烯亚胺)法制备重组大肠杆菌Fab蛋白提取液

操作方法参考专利EP-0851925-B1。

取表达赛妥珠单抗Fab蛋白的重组大肠杆菌工程菌菌体，按1:5的质量体积比(g/mL)混匀于含0.1％PEI，5mmol/L EDTA，25mmol/L Tris pH8.0溶液中，室温条件下搅拌120min。之后菌体混悬液于4℃，7000rpm离心处理20min，上清即为PEI周质提取液。

对照例2：精氨酸法制备重组大肠杆菌Fab蛋白提取液

操作方法参考文献“李振国,徐明波,牛罡,等.生物学杂志,2011,28(6):95-97.”。

取表达赛妥珠单抗Fab蛋白的重组大肠杆菌工程菌菌体，按1:5的质量体积比(g/mL)混匀于含0.4mol/L Arg，25mmol/L Tris pH8.0溶液中，4℃静置120min。之后菌体混悬液于4℃，7000rpm离心处理20min，上清即为精氨酸周质提取液。

对照例3：渗透压法制备重组大肠杆菌Fab蛋白提取液

操作方法参考文献“Ramanan R N,Tan J S,Mohamed M S,et al.ProcessBiochemistry,2010,45(2):196-202.”。

取表达赛妥珠单抗Fab蛋白的重组大肠杆菌工程菌菌体，按1:10的质量体积比(g/mL)混匀于含20％蔗糖，1mmol/L EDTA，25mmol/L Tris pH8.0溶液中，冰浴30min。之后菌体混悬液于4℃，7000rpm离心处理20min，菌体沉淀再次按1:5的质量体积比(g/mL)混匀于25mmol/L Tris pH8.0溶液中，冰浴30min。菌体混悬液于4℃，7000rpm离心处理20min，上清即为渗透压周质提取液。

对照例4：Tris，EDTA搅拌法制备重组大肠杆菌Fab蛋白提取液

操作方法参考文献“Popplewell A G,Sehdev M,Spitali M,et al.Methods MolBiol,2005,308(308):17-30.”。

取表达赛妥珠单抗Fab蛋白的重组大肠杆菌工程菌菌体，按1:5的质量体积比(g/mL)混匀于含100mmol/L Tris，10mmol/L EDTA pH7.4溶液中，室温条件下搅拌6h。之后菌体混悬液于4℃，7000rpm离心处理20min，上清即为Tris，EDTA搅拌周质提取液。

低压匀浆周质提取方法同对照例的结果对照见表7，本发明方法的周质提取液中目的蛋白含量明显高于对照例周质蛋白提取方法，电泳图中Fab蛋白条带清晰可见，且本发明方法周质提取液中杂蛋白种类数明显低于其它方法的周质提取液。

表7.本发明方法同对照例的周质提取液的比较

	周质液目的蛋白含量(μg/mL)
		本发明方法	643.22
PEI提取法	466.70
		精氨酸提取法	394.42
渗透压提取法	121.27
		Tris、EDTA搅拌提取法	428.05

表7结果显示，本发明方法中的周质提取液中目的蛋白含量达到了643μg/mL，周质提取液中目的蛋白含量相较于其它方法最高。

因此本发明方法中大肠杆菌周质空间Fab蛋白提取过程相较于其它提取方法，周质目的蛋白提取效率较高，工艺简单，操作方便，便于后期大规模放大。本发明方法将会进一步促进周质分泌表达工程菌的应用，为该类型基因工程菌的工业化应用打下坚实基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明序列信息

SEQ ID No.1:合成含有信号肽的Fab基因序列

CATATGAAAAAAAACATCGCGTTCCTGCTGGCAAGCATGTTCGTGTTCAGCATCGCAACCAACGCATACGCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCGTCTTCTCTGTCTGCTTCTGTTGGTGACCGTGTTACCATCACCTGCAAAGCTAGTCAGAACGTTGGTACTAACGTTGCTTGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCTCCGAAAGCTCTGATCTACTCTGCTTCTTTCCTGTACTCTGGTGTTCCGTACCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACTGACTTCACCCTGACCATCTCTTCTCTGCAACCGGAAGACTTCGCTACCTACTACTGCCAGCAGTACAACATCTACCCGCTGACCTTCGGTCAGGGTACTAAAGTTGAAATCAAACGTACCGTTGCTGCTCCGTCTGTTTTCATCTTCCCGCCGTCTGACGAACAGCTGAAATCTGGTACTGCTTCTGTTGTTTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCGCGTGAAGCTAAAGTTCAGTGGAAAGTTGACAACGCTCTGCAATCTGGTAACTCTCAGGAATCTGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACCTACTCTCTGTCTTCTACCCTGACCCTGTCTAAAGCTGACTACGAAAAACACAAAGTTTACGCTTGCGAAGTTACCCACCAGGGTCTGTCTTCTCCGGTTACCAAATCTTTCAACCGTGGTGAATGCTAAGGATCCAGGAGGAATATACCATGAAAAAAAACATCGCGTTCCTGCTGGCAAGCATGTTCGTGTTCAGCATCGCAACCAACGCATACGCAGAAGTTCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCTGCTTCTGGTTACGTTTTCACCGACTACGGTATGAACTGGGTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGGTCTGGAATGGATGGGTTGGATCAACACCTACATCGGTGAACCGATCTACGCTGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCTTCTCTCTGGACACCTCTAAATCTACCGCTTACCTGCAAATGAACTCTCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCGCTCGTGGTTACCGTTCTTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACTCTCGTTACCGTAAGCTCTGCTTCTACCAAAGGTCCGTCTGTTTTCCCGCTGGCTCCGTCTTCTAAATCTACCTCTGGTGGTACTGCTGCTCTGGGTTGCCTGGTTAAAGACTACTTCCCGGAACCGGTTACCGTTTCTTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCTGGTGTTCACACCTTCCCGGCTGTTCTGCAATCTTCTGGTCTGTACTCTCTGTCTTCTGTTGTTACCGTTCCGTCTTCTTCTCTGGGTACTCAGACCTACATCTGCAACGTTAACCACAAACCGTCTAACACCAAAGTTGACAAAAAAGTTGAACCGAAATCTTGCGACAAAACCCACACCTGCGCTGCTTAATAAGAATTC

SEQ ID No.2:连接肽基因序列

GGATCCAGGAGGAATATACCA

SEQ ID No.3:信号肽基因序列

ATGAAAAAAAACATCGCGTTCCTGCTGGCAAGCATGTTCGTGTTCAGCATCGCAACCAACGCATACGCA

SEQ ID No.4:信号肽氨基酸序列

MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA

SEQ ID No.5:轻链基因序列

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCGTCTTCTCTGTCTGCTTCTGTTGGTGACCGTGTTACCATCACCTGCAAAGCTAGTCAGAACGTTGGTACTAACGTTGCTTGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCTCCGAAAGCTCTGATCTACTCTGCTTCTTTCCTGTACTCTGGTGTTCCGTACCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACTGACTTCACCCTGACCATCTCTTCTCTGCAACCGGAAGACTTCGCTACCTACTACTGCCAGCAGTACAACATCTACCCGCTGACCTTCGGTCAGGGTACTAAAGTTGAAATCAAACGTACCGTTGCTGCTCCGTCTGTTTTCATCTTCCCGCCGTCTGACGAACAGCTGAAATCTGGTACTGCTTCTGTTGTTTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCGCGTGAAGCTAAAGTTCAGTGGAAAGTTGACAACGCTCTGCAATCTGGTAACTCTCAGGAATCTGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACCTACTCTCTGTCTTCTACCCTGACCCTGTCTAAAGCTGACTACGAAAAACACAAAGTTTACGCTTGCGAAGTTACCCACCAGGGTCTGTCTTCTCCGGTTACCAAATCTTTCAACCGTGGTGAATGCTAA

SEQ ID No.6:轻链氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASFLYSGVPYRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID No.7:重链基因序列

GAAGTTCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCTGCTTCTGGTTACGTTTTCACCGACTACGGTATGAACTGGGTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGGTCTGGAATGGATGGGTTGGATCAACACCTACATCGGTGAACCGATCTACGCTGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCTTCTCTCTGGACACCTCTAAATCTACCGCTTACCTGCAAATGAACTCTCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCGCTCGTGGTTACCGTTCTTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACTCTCGTTACCGTAAGCTCTGCTTCTACCAAAGGTCCGTCTGTTTTCCCGCTGGCTCCGTCTTCTAAATCTACCTCTGGTGGTACTGCTGCTCTGGGTTGCCTGGTTAAAGACTACTTCCCGGAACCGGTTACCGTTTCTTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCTGGTGTTCACACCTTCCCGGCTGTTCTGCAATCTTCTGGTCTGTACTCTCTGTCTTCTGTTGTTACCGTTCCGTCTTCTTCTCTGGGTACTCAGACCTACATCTGCAACGTTAACCACAAACCGTCTAACACCAAAGTTGACAAAAAAGTTGAACCGAAATCTTGCGACAAAACCCACACCTGCGCTGCT

SEQ ID No.8:重链氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYVFTDYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYIGEPIYADSVKGRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYRSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCAA

序列表

<110> 上海多米瑞生物技术有限公司

上海医药工业研究院

<120> 大肠杆菌周质空间表达的蛋白的提取方法

<130> P2018-0477

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1505

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

catatgaaaa aaaacatcgc gttcctgctg gcaagcatgt tcgtgttcag catcgcaacc 60

aacgcatacg cagacatcca gatgacccag tctccgtctt ctctgtctgc ttctgttggt 120

gaccgtgtta ccatcacctg caaagctagt cagaacgttg gtactaacgt tgcttggtat 180

cagcagaaac cgggtaaagc tccgaaagct ctgatctact ctgcttcttt cctgtactct 240

ggtgttccgt accgtttctc tggttctggt tctggtactg acttcaccct gaccatctct 300

tctctgcaac cggaagactt cgctacctac tactgccagc agtacaacat ctacccgctg 360

accttcggtc agggtactaa agttgaaatc aaacgtaccg ttgctgctcc gtctgttttc 420

atcttcccgc cgtctgacga acagctgaaa tctggtactg cttctgttgt ttgcctgctg 480

aacaacttct acccgcgtga agctaaagtt cagtggaaag ttgacaacgc tctgcaatct 540

ggtaactctc aggaatctgt taccgaacag gactctaaag actctaccta ctctctgtct 600

tctaccctga ccctgtctaa agctgactac gaaaaacaca aagtttacgc ttgcgaagtt 660

acccaccagg gtctgtcttc tccggttacc aaatctttca accgtggtga atgctaagga 720

tccaggagga atataccatg aaaaaaaaca tcgcgttcct gctggcaagc atgttcgtgt 780

tcagcatcgc aaccaacgca tacgcagaag ttcagctggt tgaatctggt ggtggtctgg 840

ttcagccggg tggttctctg cgtctgtctt gcgctgcttc tggttacgtt ttcaccgact 900

acggtatgaa ctgggttcgt caggctccgg gtaaaggtct ggaatggatg ggttggatca 960

acacctacat cggtgaaccg atctacgctg actctgttaa aggtcgtttc accttctctc 1020

tggacacctc taaatctacc gcttacctgc aaatgaactc tctgcgtgct gaagacaccg 1080

ctgtttacta ctgcgctcgt ggttaccgtt cttacgctat ggactactgg ggtcagggta 1140

ctctcgttac cgtaagctct gcttctacca aaggtccgtc tgttttcccg ctggctccgt 1200

cttctaaatc tacctctggt ggtactgctg ctctgggttg cctggttaaa gactacttcc 1260

cggaaccggt taccgtttct tggaactctg gtgctctgac ctctggtgtt cacaccttcc 1320

cggctgttct gcaatcttct ggtctgtact ctctgtcttc tgttgttacc gttccgtctt 1380

cttctctggg tactcagacc tacatctgca acgttaacca caaaccgtct aacaccaaag 1440

ttgacaaaaa agttgaaccg aaatcttgcg acaaaaccca cacctgcgct gcttaataag 1500

aattc 1505

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ggatccagga ggaatatacc a 21

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atgaaaaaaa acatcgcgtt cctgctggca agcatgttcg tgttcagcat cgcaaccaac 60

gcatacgca 69

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala

20

<210> 5

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gacatccaga tgacccagtc tccgtcttct ctgtctgctt ctgttggtga ccgtgttacc 60

atcacctgca aagctagtca gaacgttggt actaacgttg cttggtatca gcagaaaccg 120

ggtaaagctc cgaaagctct gatctactct gcttctttcc tgtactctgg tgttccgtac 180

cgtttctctg gttctggttc tggtactgac ttcaccctga ccatctcttc tctgcaaccg 240

gaagacttcg ctacctacta ctgccagcag tacaacatct acccgctgac cttcggtcag 300

ggtactaaag ttgaaatcaa acgtaccgtt gctgctccgt ctgttttcat cttcccgccg 360

tctgacgaac agctgaaatc tggtactgct tctgttgttt gcctgctgaa caacttctac 420

ccgcgtgaag ctaaagttca gtggaaagtt gacaacgctc tgcaatctgg taactctcag 480

gaatctgtta ccgaacagga ctctaaagac tctacctact ctctgtcttc taccctgacc 540

ctgtctaaag ctgactacga aaaacacaaa gtttacgctt gcgaagttac ccaccagggt 600

ctgtcttctc cggttaccaa atctttcaac cgtggtgaat gctaa 645

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 7

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gaagttcagc tggttgaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60

tcttgcgctg cttctggtta cgttttcacc gactacggta tgaactgggt tcgtcaggct 120

ccgggtaaag gtctggaatg gatgggttgg atcaacacct acatcggtga accgatctac 180

gctgactctg ttaaaggtcg tttcaccttc tctctggaca cctctaaatc taccgcttac 240

ctgcaaatga actctctgcg tgctgaagac accgctgttt actactgcgc tcgtggttac 300

cgttcttacg ctatggacta ctggggtcag ggtactctcg ttaccgtaag ctctgcttct 360

accaaaggtc cgtctgtttt cccgctggct ccgtcttcta aatctacctc tggtggtact 420

gctgctctgg gttgcctggt taaagactac ttcccggaac cggttaccgt ttcttggaac 480

tctggtgctc tgacctctgg tgttcacacc ttcccggctg ttctgcaatc ttctggtctg 540

tactctctgt cttctgttgt taccgttccg tcttcttctc tgggtactca gacctacatc 600

tgcaacgtta accacaaacc gtctaacacc aaagttgaca aaaaagttga accgaaatct 660

tgcgacaaaa cccacacctg cgctgct 687

<210> 8

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Ala Ala

225

Claims

1.一种大肠杆菌周质空间蛋白提取液的制备方法，其特征在于，包括步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混匀步骤中，酸性缓冲液为：60mmol/L柠檬酸，50mmol/L MgSO₄ pH4.0溶液。

3.一种蛋白的提取方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供一蛋白提取液样品，其中含有待纯化的蛋白；

(2)调节(1)中蛋白提取液样品的pH为3.5-8.0，获得蛋白处理液1；

(4)任选地，从蛋白处理液2中去除沉淀，获得蛋白粗纯化液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白为大肠杆菌周质空间表达的蛋白。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白为大肠杆菌周质空间表达的Fab蛋白。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加热处理温度为30-80℃，较佳地为50-75℃，更佳地为60-75℃，最佳地为70℃。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pH为3.5-8.5，较佳地为5.0-8.5，更佳地为7.5-8.5，最佳地为8.0。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加热处理的时间为1-10h，较佳地为2-8h，更佳地为3-6h，最佳地为4h。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加热处理温度为65-70℃，pH为7.0-8.0，加热处理的时间为3-4h。

10.一种对微生物提取液进行粗纯化处理方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一微生物提取液样品，其中含有待粗纯化的蛋白；

(d)任选地，从第二处理液中去除沉淀，获得蛋白粗纯化液。