CN102757496A

CN102757496A - 一种抗vegf抗体片段的纯化制备方法

Info

Publication number: CN102757496A
Application number: CN2012101855737A
Authority: CN
Inventors: 刘宁; 宋磊; 赵文明
Original assignee: QUANGANG MEDICINE CO Ltd SHANDONG PROV
Current assignee: QUANGANG MEDICINE CO Ltd SHANDONG PROV
Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: CN102757496B

Abstract

本发明涉及在大肠杆菌周质表达重组VEGF抗体片段的纯化制备方法。关键技术是大肠杆菌周质表达VEGF抗体片段的纯化制备工艺和方法。纯化该重组抗体时，周质提取过程中加入可溶性增强试剂，利于抗体重链和轻链的正确折叠，对抗体片段纯化前进行热处理，使部分宿主菌蛋白失活、沉淀，而抗体分子更加稳定。在纯化过程中，仅使用阳离子交换—疏水层析两步法纯化获得纯度大于95%的抗体蛋白，是一种操作简单方便，低成本，高产出，适合产业化的抗体片段纯化制备方法。

Description

一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，提供一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法。

背景技术

单抗药物以其高特异性、有效性和安全性已经成为国际生物技术药物的支柱品种，占到了生物技术药物总额的36%，位居医药生物技术产品前列。2010年，单克隆抗体药物以480亿美元的销售额继续领跑全球药品市场，同比增长20%。2000-2010年十年间全球单克隆抗体药物市场复合增长率高达32%。整个抗体产品市场呈现爆炸式的增长方式，预计在未来十年内单克隆抗体药物将会成为全球生物医药领域发展的主导产品。单抗药物在肿瘤、自身免疫病、心血管及感染性等重大疾病的诊断治疗方面取得了突出的进展，目前FDA批准的治疗性抗体药物的主要靶点有：CD3、CD11、CD20、CD25、CD33、CD52、GpIIb/IIIa、呼吸道合胞体病毒F蛋白、人表皮生长因子受体-2（Her2）、肿瘤坏死因子alpha（TNF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）及表皮生长因子受体（EGFR）等。

1989年，Gospodarow从牛垂体滤泡细胞中分离纯化得到一种蛋白质，能特异作用于血管内皮细胞，引起血管内皮细胞增殖，并在体内诱导血管形成，命名为血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），已证实VEGF是最重要的血管生成因子之一，是特异的内皮细胞促有丝分裂剂。VEGF分子量为46KD，PI≈8.5，对热、酸稳定，人类VEGF 基因定位于6号染色体短臂（6p21.3）上，全长14 kb，由8个外显子和7个内含子组成。因VEGF mRNA剪接方式不同，可产生5种异构体，分别编码121，145，165，189和206个氨基酸，其中VEGF165是主要的效应分子。VEGF是一种具有内皮细胞特异性的有丝分裂原，体外促进内皮细胞生长，体内诱导血管发生，促进血管生长。VEGF可以强烈地增加毛细血管后静脉和小静脉的通透性。Brock等报道，VEGF是已知的最强的血管渗透剂，高于组胺50000倍。目前认为，VEGF增加血管通透性与血管内皮细胞的渗透细胞器VVO（vascular vacuolar organelle）有关。

VEGF的过表达与肿瘤、渗出型年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)性黄斑水肿、骨髓增生异常性等疾病的发生密切相关，对VEGF单抗药物、反义核苷酸抑制剂、VEGF受体的药物研发成为当前医药领域的研究热点。

美国Genetech公司研制的血管表皮生长因子（VEGF）抗体，贝伐单抗（Bevacizumab，商品名Avastin），其通过抑制VEGF，使肿瘤组织无法获得所需的血液、氧和其他养分，以达到抗癌功效。2004年2月FDA批准上市用于治疗转移性结直肠癌和非小细胞肺癌NSCLC一线治疗的VEGF抑制剂，分子量为148 KD。继而Genetech公司开发和生产雷珠单抗（Ranibizumab，商品名Lucentis），其是针对脉络膜新生血管（choroidal noevascularization ，CNV）的VEGF抑制剂，是第二代人源化的抗VEGF重组鼠单克隆抗体片段，由可降低免疫原性的非结合性人源化片段以及鼠高亲和力抗原决定簇两部分组成。Ranibizumab对人VEGF的所有亚型都具有特异性和亲和力，主要作用机制为结合VEGF165、VEGF121和VEGF110，阻止血管渗漏和新生血管的形成，从而抑制CNV的生成。2006年6月，FDA批准兰尼单抗用于治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD），2010年11月增加新的适应症—继发于视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)的黄斑水肿。Ranibizumab的分子量为48KD，动物实验表明，玻璃体内注射分子量较大的Bevacizumab不能穿透猴视网膜的内界膜，而注射Ranibizumab则可在1小时内完全渗透视网膜各层，并测得玻璃体内药物的半衰期为3.2天。

Fab片段由重链Fd和完整轻链组成，两者通过一个键间二硫键连接，形成异二聚体。在B细胞的粗面内质网中，可变区立体折叠，链内二硫键形成，从而轻链和重链可变区两个分子间相互作用，形成正确的立体构象。大肠杆菌周质腔有类似于内质网的环境，将重链和轻链5’端连接细菌蛋白的前导肽，在其引导作用下表达的蛋白可以分泌到周质腔，前导肽被前导肽酶特异切割，生成的N末端为天然蛋白的Fd段和轻链在周质腔内完成折叠、形成正确的链内和链间二硫键，成为有生物学活性的Fab片段。Fd基因片段和L链基因可以分别构建在2个载体上，然后共转染细胞，也可以构建在一个载体上转染细胞进行表达。以证明有效地细菌前导肽包括外膜蛋白A（outer membrane protein A,OmpA）、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , phoA)、果胶酸盐裂解酶(pectate lyase, pelB)等。使用包涵体方式表达抗体片段，需要在体外进行复性，这一过程对于抗体这样复杂的分子结构效率很低，对重组蛋白的活性有一定影响。

传统的抗体和抗体片段的纯化第一步采用亲和色谱（ProteinA、ProteinG、Kappa select），在捕获目标蛋白的同时，一步纯化获得纯度比较理想的目标蛋白。但是，在大规模生产的过程中，亲和色谱存在着某些缺陷：1、载量低2、配基容易脱落3、价格昂贵4、绝大多数亲和层析介质需要酸性条件下洗脱抗体蛋白，导致某些不耐酸的抗体蛋白聚集、沉淀、活性丧失。亲和配基通过化学键偶联到基质骨架上，在每批纯化过程中存在配基脱落的可能，故而产品需要检测配基残留量；配基脱落造成本身载量不高的介质的动态结合载量进一步降低，为了保证样品的处理量，需要定期补充和更换凝胶，成本递增；亲和介质的价格昂贵，提高产品的生产成本，所以在大规模生产抗体和抗体片段的工艺中，不使用亲和色谱能够快速获取药典纯度要求的重组蛋白，是一种低成本、高效的纯化制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术上的缺陷，提供一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法。纯化该重组抗体时，周质提取过程中加入可溶性增强试剂，利于抗体重链和轻链的正确折叠，对抗体片段纯化前进行热处理，使部分宿主菌蛋白失活、沉淀，而抗体分子更加稳定。

大肠杆菌周质表达抗VEGF抗体片段，经过周质提取后的蛋白悬液，纯化前使用热击处理，可使抗体的重链和轻链形成的Fab分子的稳定性提高，同时，去除50%以上宿主菌蛋白和蛋白聚合物，利于下面的纯化。在纯化过程中，使用阳离子交换—疏水层析两步法纯化，快速获得纯度大于95%的抗体蛋白，是一种操作简单方便，低成本、高产出的适合产业化的纯化制备方法。

大肠杆菌周质表达的抗VEGF抗体片段的纯化制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株构建和目标蛋白表达：构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库，使用VEGF-A为配基进行生物淘选，获得高特异性阳性克隆，测序后对序列进行比对和分析；构建适合抗体Fab片段表达的胞周质表达载体，载体元件包括：大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、两个信号肽序列、两个终止子，分别转录和引导抗体的重链和轻链，引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割信号肽，重链和轻链形成N末端是天然氨基酸序列的蛋白，两条链在周质腔的氧化环境中，通过二硫键的配对和形成，最终形成一个具有生物活性的蛋白分子；载体转化大肠杆菌株Rosetta-gami 2（DE3）（黙克公司），筛选阳性菌株，摇瓶法小试筛选高表达菌株，对高表达菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子Fab片段；

（2）周质提取：收集发酵菌液进行离心，将菌体细胞重悬于磷酸盐缓冲液，剪切机进行剪切至悬液均匀，筛网过滤后加入溶解性增强剂，匀浆在1000bar压力下匀质3-5次，8500rpm，15min离心，上清即为包含Fab单抗的蛋白质溶液；

（3）纯化预处理：将包含Fab单抗的蛋白质溶液进行热处理，此过程中出现大量宿主菌蛋白沉淀、絮凝，离心取上清即为初步纯化后的抗体片段。热击温度不同，对杂蛋白等的去除比例也不同（图1）；

（4）纯化：使用阳离子交换—疏水介质两步法对表达的抗体进行纯化，SDS－PAGE电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度，蛋白纯度大于95％；

（5）超滤：使用Milipore超滤系统，将纯化后的蛋白进行脱盐、更换至抗体稳

定的柠檬酸（10mM pH5.0）缓冲液系统。

上述步骤（2）中，磷酸盐缓冲液pH为5.0-8.0；使用的溶解性增强剂为一种二价阳离子试剂；此二价阳离子为氯化钙或硫酸镁；二价溶解性增强剂为硫酸镁；其中硫酸镁浓度为10-120mM。

上述步骤（3）中，热处理温度为30°C-70°C，时间为30min-100min；

优选热处理温度为50°C-60°C，优选时间为30min-50min。

上述步骤（4）中，阳离子交换介质为Capto MMC；疏水层析介质为Phenyl Sepharose High Performance。

构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库，使用VEGF-A为配基进行生物淘选，获得高特异性阳性克隆，测序后对序列进行比对和分析。构建适合抗体Fab片段表达的胞周质表达载体，转化、筛选阳性菌株并对高表达菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子Fab片段。发酵液离心后菌体进行周质提取，即将离心后的菌体细胞重悬于磷酸盐缓冲液，剪切机进行剪切至悬液均匀，晒网过滤后加入可溶性增强试剂，匀质3-5次，离心上清为包含Fab单抗的蛋白质溶液。将此蛋白质溶液进行热处理，可有效去除宿主菌杂蛋白HCP成分，同时保证抗体片段重链和轻链更稳定的结合。采用阳离子交换层析（Capto MMC）和疏水层析（Phenyl Sepharose High Performance）两步法进行纯化生产，获得纯度大于95%的抗体片段。周质提取后蛋白悬液的离子强度和电导较高（16-20ms/cm），普通离子交换层析时，需要利用超滤系统进行脱盐，目标蛋白才能结合在柱子上。本发明在第一步捕获层析过程中采用Capto MMC阳离子交换层析，周质提取蛋白溶液不需要任何处理直接上样，进行目标蛋白的分离和纯化。Capto MMC是一种高度交联多重作用弱阳离子吸附介质，其吸附过程具有耐受高盐的特性，目标蛋白在高电导下直接进样，结合在配基上；同时该介质结合在高强度的琼脂碱性配基上，放大时具有流率快、低反压的特点。使用此凝胶介质不需要超滤系统对样品进行脱盐预处理，可以避免超滤系统处理大量周质提取液的过程中因剪切力比较高可能造成目标蛋白活性减低。这样不但节约了生产设备成本，缩短纯化时间，而且提高了产品的质量。第二步精细层析采用疏水介质—Phenyl Sepharose High Performance，因为疏水层析具有高盐吸附，低盐洗脱的特性。Capto MMC阳离子交换层析需要高盐的条件下洗脱蛋白，从Capto MMC阳离子交换层析中收集的目标蛋白液加入适当盐后可直接上Phenyl Sepharose High Performance，这样操作简单，减少了样品的处理过程，降低了生产成本，提高了产率，Phenyl Sepharose High Performance凝胶介质颗粒为34μm，可有效去除Capto MMC不能去除的杂蛋白，使目标蛋白纯度到达95%以上。最后，对纯化产物使用超滤系统脱盐、浓缩。整个纯化组合合理，操作简单，工艺稳定，易于产业化放大。

本发明技术方案的有益效果为：

1．稳定性好、操作简单、耗时短、纯度高

周质提取液使用热处理，可有效去除宿主菌杂蛋白成分，同时保证抗体片段重链和轻链更稳定的结合，采用Capto MMC快速捕获和Phenyl Sepharose High Performance精细分离纯化两步进行纯化生产，即可得到纯度＞95%的抗体片段。Capto MMC和Phenyl Sepharose High Performance均属于耐受高盐的凝胶介质，样品在高电导下直接进样，不需要传统利用超滤等方式进行脱盐降低样品电导后上样等步骤，从而具有稳定性好、操作简单、耗时短、纯度高的优点。

2．降低生产成本

传统对抗体及抗体片段的纯化第一步多采用亲和介质进行纯化，Protein G、Protein A等亲和介质的价格约16-18万元/L，本发明使用符合配基的阳离子交换介质—Capto MMC，价格约4万元/L；同时对目标蛋白的动态结合载量，Capto MMC比常用亲和介质protein A sepharose CL-4B和Protein G sepharose 4 FF高出1倍以上，从而大幅度降低生产成本，增加产品竞争力。

3．不存在亲和配基脱落、残留和检测问题

使用亲和介质进行纯化的过程中，通过化学键偶联的配基会脱落至产品组分中，后期需要使用其他的方法进行去除，根据药典规定，纯化过程中使用亲和介质需要检测产品中亲和配基的残留量。本发明不需要使用亲和配基，不存在亲和配基脱落、残留和检测的问题。

附图说明

图1周质提取液热击 SDS-PAGE还原电泳

1周质提取上清 2周质提取上清30°C热击 3周质提取上清40°C热击

4周质提取上清50°C热击图 5周质提取上清60°C热击 6 低分子量蛋白标准

7周质提取沉淀30°C热击 8 周质提取沉淀40°C热击

9周质提取沉淀50°C热击图 10周质提取沉淀60°C热击

图2 阳离子层析（Capto MMC）色谱图

1 穿过峰 2 杂质峰 3目标蛋白峰 4 杂质峰

图3 疏水层析（Phenyl Sepharose High Performance）色谱图

1 穿过峰 2 杂质峰 3目标蛋白峰 4 杂质峰

图4 实施例1中纯化抗体各步SDS-PAGE电泳

1 周质提取液 2 热击后周质提取液 3 Capto MMC纯化 4 Phenyl HP纯化

5 低分子量标准蛋白

图5 MALDI-TOF质谱测定分子量

图6 重链与轻链N端氨基酸序列分析

图7 人脐静脉内皮细胞增殖抑制作用

●对照品Lucentis抑制曲线 ▽ 重组生产Fab片段抑制曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

1. 菌株构建和重组抗体表达：构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库，使用VEGF-A为配基进行生物淘选，获得高特异性阳性克隆，测序后对序列进行比对和分析；构建适合抗体Fab片段表达的胞周质表达载体，载体元件包括：大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、两个信号肽序列、两个终止子，分别转录和引导抗体的重链和轻链，引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割信号肽，重链和轻链形成N末端是天然氨基酸序列的蛋白，两条链在周质腔的氧化环境中，通过二硫键的配对和形成，最终形成一个具有生物活性的蛋白分子；载体转化大肠杆菌株Rosetta-gami 2（DE3）（黙克公司），筛选阳性菌株，摇瓶法小试筛选高表达菌株，对高表达菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子Fab片段；

2. 匀浆：1L发酵液进行离心，取菌体细胞重悬于10倍体积50mM pH 7.2磷酸盐缓冲液，剪切机进行剪切至悬液均匀，筛网过滤后加入溶解性增强剂80-100mM MgSO₄，匀浆在1000bar压力下匀质3-5次，8500rpm离心20min离心弃去沉淀，上清即为包含Fab单抗的蛋白质溶液；

3. 纯化预处理：将包含Fab单抗的蛋白质溶液，水浴56-60°C热击处理60min，热处理过程中匀速搅拌，此过程中溶液出现大量宿主菌蛋白絮凝，8500rpm离心15min，取上清即为初步纯化的抗体片段溶液；

4. 第一步阳离子交换层析

（1）色谱柱：XK26/20，层析介质：Capto MMC，均为美国GE公司；

（2）样品处理：用0.5M柠檬酸调节热击后上清液至pH4.5（电导18ms/cm），0.22μm微孔滤膜过滤；

（3）缓冲液配置：缓冲液A：25mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH=4.5), 缓冲液B：为

25mM MES（pH 5.2）+0.1M NaCl，缓冲液C：25mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH=6.5)＋0.3M NaCl；

（4）纯化过程：用缓冲液A预先平衡Capto MMC柱，样品直接上样Capto MMC

柱，上完样后以缓冲液A平衡柱子，将未结合到柱子的杂质冲洗干净，用缓冲液B洗脱杂蛋白，再用缓冲液A平衡柱子至酸性条件下，最后用缓冲液C洗脱目标蛋白；

（5）结果：收集目标蛋白峰(图2)，测蛋白浓度计算回收率，作SDS－PAGE

电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化，蛋白回收率为70%左右，蛋白纯度90％（图4）。

5. 第二步疏水层析

（1）色谱柱：XK26/20，层析填料为Phenyl Sepharose High Performance，均为美国GE公司；

（2）样品处理：阳离子交换后洗脱目标蛋白组分加入终浓度为0.8M Na₂SO₄，

1N NaOH调节pH6.8；

（3）缓冲液配置：缓冲液A为25mM pH 6.8 的磷酸盐缓冲液加0.8M Na₂SO₄, 缓冲液B为25mM pH6.8 的PB缓冲液加0.2M Na₂SO₄；

（4）纯化过程：用缓冲液A预先平衡Phenyl Sepharose High Performance柱，上样后以缓冲液A平衡柱子，将未结合到柱子的物质冲洗干净，再用100％的缓冲液B洗脱目标蛋白；

（5）结果：收集目标蛋白峰（图3），测蛋白浓度计算回收率，作SDS－PAGE电泳，分离胶浓度为12%，加样量不低于10μg，用考马斯亮蓝R250染色过夜，脱色后用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化，蛋白回收率为80 %左右，蛋白纯度可达98％以上（图4）。

6. 超滤浓缩：使用Millipore纵向流超滤系统，截留分子量为10KD的再生纤维素膜包对纯化后的蛋白质溶液进行脱盐和浓缩。首先进行蛋白质浓缩至OD₂₈₀2.0、然后使用8-10倍样品体积的10mM柠檬酸缓冲液pH5.0，更换缓冲系统，耗时2-2.2h，蛋白回收率97%，蛋白纯度同5不变。

7. 对实施例1的蛋白质液进行初步检测：分子量、N末端残基序列、生物学活性进行检定

（1）分子量测定：委托国家生物医学分析中心进行测定，使用MALDI-TOF-MS

测定VEGF Fab抗体的分子量为48249.6道尔顿（图5）。

（2）重链与轻链N端氨基酸序列测定分析：委托国家生物医学分析中心进行测定Fab重链和轻链N端15个氨基酸,结果重链的N端序列为：EVQLVESGGGLVQPG，轻链的N端序列为：DIQLTQSPSSLSASV，均与设计一致（图6）。

（3）生物活性测定：通过体外对人脐静脉内皮细胞增殖抑制作用测定重组抗体片段的生物学活性，选生长状态良好的人脐静脉内皮细胞（HuVEC），加入一定量的3% M199，制成2-4×10⁴个/ml细胞悬液，100μl/孔加入96孔板，于37℃，5%CO₂的培养箱中培养24h。用含0.2nM VEGF的分析培养基将纯化样品和阳性对照品（Lucentis）进行梯度稀释，每个浓度3个平行样，阴性对照不加药物，以测定培养基补齐。加入96孔板，100μl/孔于37℃，5%CO₂的培养箱中培养20-24h。每孔加入0.5 μCi [3H] 胸腺嘧啶脉冲细胞24小时后收集细胞，使用gamma计数仪计数，显示重组抗VEGF Fab抗体片段对人脐静脉内皮细胞增殖抑制作用与进口同类产品Lucentis的抑制作用基本一致（图7）。

实施例2

1. 菌株构建和目标蛋白表达：构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库，使用VEGF-A为配基进行生物淘选，获得高特异性阳性克隆，测序后对序列进行比对和分析。构建适合抗体Fab片段表达的胞周质表达载体，载体元件包括：大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、两个信号肽序列、两个终止子，分别转录和引导抗体的重链和轻链，引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割信号肽，重链和轻链形成N末端是天然氨基酸序列的蛋白，两条链在周质腔的氧化环境中，通过二硫键的配对和形成，最终形成一个具有生物活性的蛋白分子。载体转化大肠杆菌株Rosetta-gami 2（DE3）（黙克公司），筛选阳性菌株，摇瓶法小试筛选高表达菌株，对高表达菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子Fab片段。

2. 匀浆：发酵液进行离心，取菌体细胞重悬于10倍体积50mM pH 7.2磷酸盐缓冲液，剪切机进行剪切至悬液均匀，筛网过滤后加入溶解性增强剂50-70mM MgSO₄，匀浆在1000bar压力下匀质3-5次，8500rpm离心20min离心弃去沉淀，上清即为包含Fab单抗的蛋白质溶液。

3. 纯化预处理：将包含Fab单抗的蛋白质溶液，水浴50-55°C热击处理60min，热处理过程中匀速搅拌，此过程中溶液出现大量宿主菌蛋白絮凝，8500rpm离心15min，取上清即为初步纯化的抗体片段溶液，不同热击温度对纯度的影响（图1）。

4. 第一步阳离子交换层析

（1）色谱柱：XK26/20，层析介质：Capto MMC，均为美国GE公司；

25mM MES（pH 5.2）+0.12M NaCl，缓冲液C：25mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH=6.5)＋0.3M NaCl；

（5）结果：收集目标蛋白峰，测蛋白浓度计算回收率，作SDS－PAGE电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化，蛋白回收率为64%左右，蛋白纯度82％。

5. 第二步疏水层析

（2）样品处理：阳离子交换后洗脱目标蛋白组分加入终浓度为1.0 M(NH₄)₂SO₄，1N NaOH调节pH7.0；

（3）缓冲液配置：缓冲液A为25mM pH 7.0 的磷酸盐缓冲液加1.0 M (NH₄)₂SO₄, 缓冲液B为25mM pH7.0 的PB缓冲液加0.3M (NH₄)₂SO₄；

（5）结果：收集目标蛋白峰，测蛋白浓度计算回收率，作SDS－PAGE电泳，分离胶浓度为12%，加样量不低于10μg，用考马斯亮蓝R250染色过夜，脱色后用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化，蛋白回收率为82%左右，蛋白纯度为93%。

6. 超滤浓缩：使用Millipore纵向流超滤系统，截留分子量为10KD的再生纤维素膜包对纯化后的蛋白质溶液进行脱盐和浓缩。首先进行蛋白质浓缩、然后使用8-10倍样品体积的10mM柠檬酸缓冲液pH5.0，更换缓冲系统，耗时2-2.2h，蛋白回收率93%。

实施例3

1. 菌株构建和目标蛋白表达：构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库，使用VEGF-A为配基进行生物淘选，获得高特异性阳性克隆，测序后对序列进行比对和分析。构建适合抗体Fab片段表达的胞周质表达载体，载体元件包括：大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、两个信号肽序列、两个终止子，分别转录和引导抗体的重链和轻链，引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割信号肽，重链和轻链形成N末端是天然氨基酸序列的蛋白，两条链在周质腔的氧化环境中，通过二硫键的配对和形成，最终形成一个具有生物活性的蛋白分子。载体转化大肠杆菌株Rosetta-gami 2（DE3）（黙克公司），筛选阳性菌株，摇瓶法小试筛选高表达菌株，对高表达菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子Fab片段。

2. 匀浆：发酵液进行离心，取菌体细胞重悬于10倍体积50mM pH 7.2磷酸盐缓冲液，剪切机进行剪切至悬液均匀，筛网过滤后加入溶解性增强剂20-40mM MgSO₄，匀浆在1000bar压力下匀质3-5次，8500rpm离心20min离心弃去沉淀，上清即为包含Fab单抗的蛋白质溶液。

3. 纯化预处理：将包含Fab单抗的蛋白质溶液，水浴40-45°C热击处理100min，热处理过程中匀速搅拌，此过程中溶液出现大量宿主菌蛋白絮凝，8500rpm离心15min，取上清即为初步纯化的抗体片段溶液，不同热击温度对纯度的影响（图1）。

4. 第一步阳离子交换层析

（1）色谱柱：XK26/20，层析介质：Capto MMC，均为美国GE公司；

（2）样品处理：用0.5M柠檬酸调节热击后上清液至pH4.2（电导18ms/cm），0.22μm微孔滤膜过滤；

（3）缓冲液配置：缓冲液A：25mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH=4.2), 缓冲液B：为

25mM MOPS（pH 5.5）+0.10M NaCl，缓冲液C：25mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH=6.5)＋0.3M NaCl；

（5）结果：收集目标蛋白峰，测蛋白浓度计算回收率，作SDS－PAGE电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化，蛋白回收率为75%左右，蛋白纯度80％。

5. 第二步疏水层析

1N NaOH调节pH6.8；

（3）缓冲液配置：缓冲液A为25mM pH 6.8 的磷酸盐缓冲液加0.8M Na₂SO₄, 缓冲液B为25mM pH6.8 的PB缓冲液加0.3M Na₂SO₄；

（5）结果：收集目标蛋白峰，测蛋白浓度计算回收率，作SDS－PAGE电泳，分离胶浓度为12%，加样量不低于10μg，用考马斯亮蓝R250染色过夜，脱色后用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化，蛋白回收率为76%左右，蛋白纯度为90%。

6. 超滤浓缩：使用Millipore纵向流超滤系统，截留分子量为10KD的再生纤维素膜包对纯化后的蛋白质溶液进行脱盐和浓缩。首先进行蛋白质浓缩、然后使用8-10倍样品体积的10mM柠檬酸缓冲液pH5.0，更换缓冲系统，耗时2-2.2h，蛋白回收率90%。

Claims

1. 大肠杆菌周质表达的抗VEGF抗体片段的纯化制备方法，其特征在于，包括

以下步骤：

（2）周质提取：收集发酵菌液进行离心，将菌体细胞重悬于磷酸盐缓冲液，使用剪切机进行剪切至悬液均匀，筛网过滤后加入溶解性增强剂，匀浆在1000bar压力下匀质3-5次，8500rpm，15min离心，上清即为包含Fab单抗的蛋白质溶液；

（3）纯化预处理：将包含Fab单抗的蛋白质溶液进行热处理，此过程中出现大量宿主菌蛋白沉淀、絮凝，离心取上清即为初步纯化后的抗体片段；

（5）超滤：使用Milipore超滤系统，将纯化后的蛋白进行脱盐、更换至抗体稳定的柠檬酸（10mM pH5.0）缓冲液系统。

2.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，磷酸盐缓冲液pH为5.0-8.0。

3.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，溶解性增强试剂为二价阳离子试剂：氯化钙和硫酸镁。

4.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，溶解性增强试剂为硫酸镁。

5.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，硫酸镁浓度为10-120mM。

6.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，热处理温度为30°C-70°C，时间为30min-100min。

7.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，热处理温度为50°C-60°C，时间为30min-50min。

8.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，阳离子交换介质为Capto MMC。

9.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，疏水层析介质为Phenyl Sepharose High Performance。