CN110636859A - 用于产生重折叠的重组人源化兰尼单抗的方法 - Google Patents
用于产生重折叠的重组人源化兰尼单抗的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于制备抗体片段的新型克隆、表达和重折叠方法。更特别地,本发明涉及用于制备重组人源化(rHu)兰尼单抗的克隆、表达和重折叠平台。
Description
技术领域
本发明涉及用于制备抗体片段的新型克隆、表达和重折叠方法。
更具体地,本发明涉及用于制备重组人源化(rHu)兰尼单抗(Ranibizumab)的克隆、表达和重折叠平台。
背景技术
时间和成本上高效的目标治疗蛋白的制造是生物仿制药行业成功的关键因素。生物药物研究和开发的最新趋势更多地集中在抗体片段开发上。与全尺寸单克隆抗体治疗剂相比,抗体片段具有某些优势,例如,改善的和深的肿瘤渗透、特异性表位结合(其不是全尺寸单克隆抗体可达到的)等[1-2]。
与在哺乳动物细胞系统中的单克隆抗体产生相比,小的和未糖基化的抗体片段的细菌表达变得更加容易和更经济。兰尼单抗是一种重组人源化单克隆抗体片段,其用于湿型年龄相关性黄斑变性治疗[3]。它是抗血管生成的,并抑制人血管内皮生长因子A(VEGF A)的生物学活性。该人源化单克隆抗体片段通常通过重组DNA技术在大肠杆菌细胞中表达,并靶向人血管内皮生长因子A[3,4]。
rHu兰尼单抗包含214个残基的轻链,其在C末端通过二硫键与231个残基的N末端重链片段连接[5]。rHu兰尼单抗的分子量为48,380道尔顿,其中分别地重链分子量为24,953道尔顿和轻链分子量为23,430道尔顿。使用大肠杆菌细胞产生的rHu兰尼单抗形成不溶性蛋白聚集体形式的包涵体。
就表达为包涵体的rHu兰尼单抗而言,重折叠是整个生产过程中的关键限速步骤。这种Fab分子的现有商用重折叠过程是基于“3D”技术(稀释或渗滤或透析)之一以将聚集形式的蛋白质转化为具有生物活性的可溶形式[6-9]。目前,关于兰尼单抗制剂的体内和体外折叠途径的了解很少。由于关于rHu兰尼单抗体外重折叠的了解和可得文献有限,抗体片段通常以可溶形式在大肠杆菌周质中表达。然而,细菌周质仅占总细胞体积的8%-16%,从而限制了所表达的可溶性蛋白的量。在周质中较高水平的蛋白质表达还导致包涵体形成,这在产生的蛋白质数量和生产所需的时间两个方面严重地限制了生产率。
在大肠杆菌周质区室中表达是抗体片段最常用的生产技术。周质表达的关键缺点是产率较低,这使得这种方法在商业可行成为困难的任务。关于在大肠杆菌中抗体片段的周质表达已有一些报道。针对破伤风类毒素的抗体片段通过将单个序列与抗体片段的轻链和重链结合在周质空间中表达,导致16mg/l的产率。
在一些现有技术公开中值得注意的是,抗体片段的周质分泌以最小的产量进行蛋白质合成。Humphreys DP等人证明了通过使用双重启动子载体pDPH128在大肠杆菌中产生抗人IgG的抗体片段。该抗体片段的功能性可溶形式通过周质分泌以150mg/l的产率获得。牛抗体片段Fab通过在大肠杆菌HB2151中使用pComBov载体产生。在周质中表达这一抗体片段导致2mg/l的总体产率[13]。HuMAb4D5-8的抗体片段的周质表达在大肠杆菌中以1-2g/l的产率实现[14]。由于误折叠和聚集,治疗性蛋白的周质表达通常导致较低的表达水平[15]。
已经利用了与抗体片段的周质表达有关的专利文献和所使用的诸如标记的技术,但是没有任何尝试能够获得抗体片段制剂。
美国专利公开号2016289314公开了用于将rHu兰尼单抗的轻链和重链输出至大肠杆菌细胞的周质空间的信号序列。该专利公开描述了使用不同的表达载体但使用在周质中表达蛋白质的相同宿主细胞来表达rHu兰尼单抗的轻链和重链的技术。将等比例的轻链和重链组合用于通过稀释法进行体外重折叠。
PCT公开号WO9845331公开了具有治疗前景的特性的人源化和变体抗VEGF抗体的产生,包括:(a)对VEGF抗原的强结合亲和力;(b)抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖的能力,以及(c)体内抑制VEGF诱导的血管生成的能力。该专利申请公开了可变轻链和可变重链的核苷酸序列,并通过将含有VL和VH的载体转化到大肠杆菌细胞中来表达。
PCT公开号WO2013076657公开了作为融合标签的甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)蛋白以在BL21(DE3)大肠杆菌细胞中获得可溶性目标蛋白。rHu兰尼单抗轻链和重链基因序列用MAP蛋白标记,并且MAPLC和MAPHC融合蛋白以可溶性形式表达。
PH12015501593(A1)公开了一种用于合成抗VEGF抗体可溶性和稳定的抗VEGF免疫结合剂的杂交瘤技术,该抗VEGF免疫结合剂包含来自兔单克隆抗体的CDR。它还公开了轻链和重链可变区的核苷酸序列以及用于表达重组抗体片段的表达构建体。表达scFv或Fab多肽的质粒引入合适的宿主中,优选用于周质表达的大肠杆菌菌株JM83或用于在包涵体中的表达的BL21。多肽可以从周质中收获,或者形成包涵体,并使用标准技术如离子交换色谱、反相色谱、亲和色谱和/或凝胶过滤来纯化。
美国专利公开号2008125580公开了一种用于纯化在异源宿主细胞中产生的重折叠重组蛋白并将该蛋白在高pH缓冲液中重折叠的方法。如生长因子的重组蛋白(例如酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子)在宿主细胞中表达,并通过添加含还原剂和离液剂的缓冲液以及添加空气或氧而重折叠。
鉴于抗体片段的周质表达所存在的缺点,本领域需要开发一种以提高的纯度和产率来以等比例细胞质表达抗体片段的方法。
发明内容
发明目的
本发明的主要目的是提供用于制备抗体片段的克隆方法。
本发明的目的是提供携带编码抗体片段的重链和轻链的核苷酸序列的重组构建体及其在宿主细胞中的均等表达。
本发明的另一个目的是获得重组抗体片段的细胞质表达。
本发明的又一个目的是采用高细胞密度发酵来经济地生产重组抗体片段。
本发明的又一个目的是提供用于制备重组人源化(rHu)兰尼单抗的高通量重折叠方法。
发明概述
本发明的主要方面是提供用于制备重折叠的抗体片段的克隆方法。
在另一方面,本发明提供了用于制备重折叠的重组人源化抗体片段的克隆方法,所述方法包括:
a)将携带编码抗体片段的重链和轻链的核苷酸序列的载体转化到宿主细胞中;
b)使宿主细胞经历高密度细胞发酵;
c)通过在包含葡萄糖和IPTG的混合物的存在下诱导在宿主细胞的细胞质中以等比例共表达所述抗体片段的轻链和重链。
用于制备重折叠的重组人源化抗体片段的方法进一步包括:
(i)在增溶缓冲液的存在下使包含等比例的重组抗体片段的轻链和重链的包涵体溶解,以获得溶解的轻链和重链;和
(ii)通过稀释变性剂然后在氧化剂的存在下氧合以引发二硫键的氧化来重折叠溶解的抗体片段,从而获得生物活性形式的rHu兰尼单抗。
在又另一方面,本发明提供了重组人源化兰尼单抗的克隆和重折叠方法。
附图说明
图1描绘了rHu兰尼单抗的新型克隆、表达和重折叠平台;
图2描述了用于表达rHu兰尼单抗的轻链和重链基因的二重载体(Duet vector)A;
图3描述了用于表达rHu兰尼单抗的轻链和重链基因的二重载体B;
图4描绘了还原SDS-PAGE,其中泳道1:还原的标准原创rHu兰尼单抗;2:使用二重载体A的轻链和重链基因表达;3:使用二重载体B的轻链和重链基因表达;4:未诱导的大肠杆菌细胞;
图5描述了还原SDS-PAGE。1和2:还原的开发rHu兰尼单抗;3:还原的标准原创rHu兰尼单抗;
图6描绘了非还原SDS-PAGE。1:蛋白质分子量标记;2:标准原创rHu兰尼单抗;3:重折叠的rHu兰尼单抗;
图7描绘了用于rHu兰尼单抗生产的高细胞密度大肠杆菌发酵的生长曲线;
图8描绘了重折叠rHu兰尼单抗的反相HPLC色谱图。A:标准原创rHu兰尼单抗;B:重折叠的rHu兰尼单抗;
图9描绘了重折叠rHu兰尼单抗的体积排阻色谱图。A:标准原创rHu兰尼单抗;B:重折叠的rHu兰尼单抗;
图10描绘了通过MALDI-TOF对rHu兰尼单抗的完整质量分析。A:标准原创rHu兰尼单抗,B:重折叠的rHu兰尼单抗;
图11描绘了通过MALDI-TOF的还原和烷基化rHu兰尼单抗质量分析。A:标准原创rHu兰尼单抗轻链和重链,B:开发的rHu兰尼单抗轻链和重链;
图12显示了大肠杆菌的生长曲线,表明生物质产率相对于时间增加。
具体实施方式
现在将结合某些优选和可选的实施方案详细描述本发明,以便可以更充分地理解和领会其各个方面。
生物材料来源:从印度Merck Millipore life science private limited购买的大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
在优选的实施方案中,本发明提供了用于制备重折叠的重组人源化抗体片段的克隆方法,所述方法包括:
a)将携带编码抗体片段的重链和轻链的核苷酸序列的载体转化到宿主细胞中;
e)使宿主细胞经历高密度细胞发酵;
f)通过在包含葡萄糖和IPTG的混合物的存在下进行诱导在宿主细胞的细胞质中以等比例共表达所述抗体片段的轻链和重链。
在本发明中,“转化载体”的步骤是指在宿主细胞中转化至少一个携带编码抗体片段的重链和轻链的核苷酸序列的二重载体。
在特定的实施方案中,本发明提供了用于制备重折叠的重组人源化兰尼单抗的克隆方法,所述方法包括:
(i)将携带编码兰尼单抗的重链和轻链的Seq Id No.1和Seq Id No.3的载体转化到宿主细胞中;
(ii)使宿主细胞经历高密度细胞发酵;
(iii)通过在包含葡萄糖和IPTG的混合物的存在下进行诱导在宿主细胞的细胞质中以等比例共表达所述抗体片段的轻链和重链。
在一个实施方案中,本发明提供了编码Seq Id No.2的兰尼单抗重链的Seq IdNo.1的核苷酸序列。
在另一个实施方案中,本发明提供了编码SEQ ID No.4的兰尼单抗轻链的SEQ IDNo.3的核苷酸序列。
在一个实施方案中,本发明提供了一种载体构建体,其带有Seq Id No.1和Seq IdNo.3用于均等地表达抗体片段的重链和轻链。
因此,二重载体包含在多克隆位点I(MCS I)中T7启动子之后、在5'端插入NcoI/HindIII位点中的编码抗体片段轻链的核苷酸Seq Id No.3和在多克隆位点II(MCS II)中启动子T7之后、在5'端插入NdeI/XhoI位点中的编码重链的核苷酸Seq Id No.1。(图2)
在另一个实施方案中,本发明提供了二重载体,其包含在多克隆位点I(MCS I)中T7启动子之后、在5'端插入到NcoI/HindIII位点中的编码抗体片段轻链的核苷酸Seq IdNo.3,和在多克隆位点II(MCS II)中T7启动子之后、在5'端插入到NdeI/XhoI位点中的编码重链的核苷酸Seq Id No.1。(图3)
在另一个优选的实施方案中,至少一个携带轻链和重链基因构建体的二重载体在表达系统中转化。进行转化的最优选的表达系统是感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。测定选择的BL21(DE3)细胞的转化体的rHu抗体片段表达。
图4显示了使用二重载体A和二重载体B的轻链和重链的表达,其符合两条链的几乎相等的表达而在未诱导的大肠杆菌宿主细胞中没有任何泄漏表达(leaky expression)。更优选地,使用二重载体A观察到rHu兰尼单抗轻链和重链的一致且较高水平的均等表达,其使用12%还原SDS-PAGE显示在图5中。
在再一个实施方案中,本发明提供了约175g/l至约190g/l范围的生物质产率,包括约5g/l至约15g/l包涵体。图7示出了经受高细胞密度发酵以产生rHu兰尼单抗的转化大肠杆菌细胞的生长速率的增加。
图12显示了大肠杆菌的生长曲线,其表明生物质产率相对于时间增加。
在另一个优选的实施方案中,本发明提供了用于制备重折叠的重组人源化抗体片段的方法,其还包括:
(i)在氧化之前,在增溶缓冲液的存在下溶解包含等比例的重组抗体片段轻链和重链的包涵体以获得溶解的轻链和重链;和
(ii)通过稀释变性剂和然后在氧化剂的存在下氧合以引发二硫键的氧化来重折叠溶解的抗体片段,从而获得生物活性形式的rHu兰尼单抗。
在一个实施方案中,本发明提供了包含Tris缓冲剂、EDTA、变性剂和还原剂的增溶缓冲液。
优选的变性剂选自盐酸胍或尿素。
优选的还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)和/或β-巯基乙醇。
因此,Tris缓冲剂的优选浓度在0.1M至0.5M的范围内,和pH在7至10的范围内。EDTA的优选浓度在1mM至4mM的范围内,且盐酸胍的优选浓度在约3mM到约6mM的范围内。
最优选地,增溶缓冲液包含0.1M Tris pH 9.0、2mM EDTA和6M盐酸胍(作为变性剂),持续30分钟,并且还包含还原剂,即5mM DTT。
通过添加10mM的氧化型谷胱甘肽使可溶和还原的包涵体溶液进行氧化。随后在含有0.1M Tris pH 9.0、0.6M精氨酸、5%山梨糖醇、2mM EDTA的重折叠缓冲液中于10±2℃下使用75倍稀释进行重折叠。氧化性重折叠也通过以1SLPM(标准升每分钟)的流速使纯氧进入体外重折叠过程进行。
氧通过半胱氨酸氨基酸中巯基的氧化触发二硫键的形成和反应速率。还使用氧化还原穿梭(redox shuffle),且其与蛋白质的半胱氨酸氨基酸形成混合的二硫键,然后进行亲核攻击,这使得在蛋白质分子的半胱氨酸氨基酸之间形成正确的二硫键。
获得了生物活性的重折叠功能活性rHu兰尼单抗,其范围为100至110μg/ml。
此外,通过肽指纹分析确定了原创rHu兰尼单抗与开发的rHu兰尼单抗之间的良好一致性,理论序列覆盖率为85.4%。
实施例:通过举例说明的方式给出以下实施例,因此其不应解释为限制本发明的范围。
实施例1:用于轻链和重链基因序列构建的密码子优化
从药物库(drug bank)中获取rHu兰尼单抗轻链和重链的氨基酸序列,并进行了密码子优化(登录号:DB01270)。
实施例2:用于表达rHu兰尼单抗的轻链和重链的二重载体A的构建
通过在多克隆位点I(MCS I)中T7启动子之后、在5'端将轻链核苷酸Seq Id.No.3插入NcoI/HindIII位点中,和在多克隆位点II(MCS II)中T7启动子之后、在5'端将重链核苷酸Seq Id.No.1插入NdeI/XhoI位点中来构建二重载体A(图2)。
实施例3:用于表达rHu兰尼单抗的轻链和重链的二重载体B的构建
二重载体B(图3)通过在多克隆位点I(MCS I)中T7启动子之后、在5'端将轻链核苷酸序列SEQ ID No.3插入NcoI/HindIII位点中和在多克隆位点II(MCS II)中T7启动子之后、在5'端将重链核苷酸序列SEQ ID No.1插入NdeI/XhoI位点中来构建。
实施例4:BL21(DE3)宿主细胞中表达构建体的转化
具有轻重链基因构建体的二重载体A和B在感受态BL21(DE3)表达系统中转化。转化方法包括[22]:将100μl宿主细胞与0.5μg载体在冰上孵育30分钟,然后在42℃下热休克35秒。热休克后,将细胞再次在冰上孵育15分钟。然后将800μl Super Optimal broth withCatabolite repression(SOC)培养基添加到反应混合物中,接着以450rpm孵育1小时45分钟。将转化的细胞以2000rpm离心5分钟。将BL21(DE3)大肠杆菌转化体接种在含30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。将含有转化细胞的平板在37℃下孵育过夜。基于抗生素选择标记,从平板上分离阳性转化的细胞,并用于蛋白质表达。
实施例5:摇瓶水平的rHu兰尼单抗表达
测试选择的BL21(DE3)细胞转化体的rHu兰尼单抗表达。将选择的菌落接种到含30μg/ml卡那霉素的10ml LB肉汤中。细胞生长直至600nm下的光密度达到1至1.5之间的值。2ml的这些生长良好的菌落转换到100ml Terrific HiVegTM肉汤中,并在37℃下以250rpm孵育。在600nm下达到1-1.50的光密度后,大肠杆菌培养物用5mM IPTG诱导。5小时诱导后收获细胞,并以6000rpm离心20分钟。弃去上清液,并将细胞沉淀重悬于20mM Tris,0.1mM EDTApH 9.0裂解缓冲液中。将细胞在高压匀浆器中以15000巴压力裂解20分钟。将裂解的细胞以6000rpm离心25分钟。使用还原和非还原SDS-PAGE分析检查上清液和沉淀中表达的蛋白质的存在。图4显示了使用二重载体A和二重载体B的轻链和重链的表达,其符合两条链的近乎均等的表达而在未诱导的大肠杆菌宿主细胞中没有任何泄渗表达。利用12%还原SDS-PAGE,使用二重A载体观察到rHu兰尼单抗轻链和重链的较高水平均等表达(图5)。摇瓶水平大肠杆菌发酵导致600nm下3.78±0.05的光密度,具有9.3±0.12g/l的生物量,从而导致产生0.868±0.01g/l的包涵体产量。通过反相HPLC测量包涵体中rHu兰尼单抗轻链和重链的数量和纯度(图8)。
实施例6:生物反应器水平的rHu兰尼单抗表达
蛋白质表达在1L生物反应器中进行。评估选择性转化的BL21(DE3)细胞的rHu兰尼单抗表达。选择的菌落接种到含30μg/ml卡那霉素的10ml LB肉汤中。细胞生长直至600nm下的光密度达到1至1.5之间。2ml的这些生长良好的菌落转换到100ml的LB肉汤中,并在37℃下以250rpm孵育。100ml种子培养物转换到900ml Terrific HiVegTM肉汤中。高细胞密度发酵使用具有挡板组件(其具有直接驱动马达、两个Rushton叶轮和环形喷雾器)的2L热毯覆玻璃容器(Macrosparger),通过使用具有1SLPM气体流量范围的自动气体混合的115台式发酵罐进行。以30%的DO设定点,选择自动DO级联搅拌、GasFlo和O2混合。搅拌级联的下限保持在300rpm,且上限保持在1000rpm。GasFlo级联保持在1SLPM,且O2混合保持0-80%。大肠杆菌培养物在对数中期用5mM IPTG诱导。5小时诱导后收获细胞,并以6000rpm离心20分钟。弃去上清液,并将细胞沉淀重悬于20mM Tris,0.1mMEDTA pH 9.0裂解缓冲液中。将细胞在高压匀浆器中以15000巴的压力裂解20分钟。将裂解的细胞以6000rpm离心25分钟。使用SDS-PAGE分析测定上清液和沉淀中表达的rHu兰尼单抗的存在。高细胞密度大肠杆菌发酵导致600nm下75.0±1.2的光密度,具有182±2.9g/l的生物量,从而导致产生7.0±0.1g/l的包涵体产量(图7)。
实施例7:蛋白质的重折叠及rHu兰尼单抗的轻链和重链的包涵体的预处理
增溶方案:
首先将170mg湿重的包涵体溶解在10ml增溶缓冲液中30分钟,该缓冲液包含0.1MTris pH 9.0、2mM EDTA和6M盐酸胍(作为变性剂)。还原通过添加5mM DTT进行,并将其在25℃下保持1小时以进行还原。通过在25℃下添加10mM氧化型谷胱甘肽3小时,使这种可溶和还原的包涵体溶液保持氧化。
重折叠方案:
这种可溶和还原的及氧化的包涵体在含有0.1M Tris pH 9.0、0.6M精氨酸、5%山梨糖醇、2mM EDTA的重折叠缓冲液中于10±2℃下稀释75倍。通过以1SLPM(标准升/分钟)流速使纯氧进入体外重折叠过程进行氧化重折叠。氧通过半胱氨酸氨基酸中巯基的氧化触发二硫键的形成和反应速率。还使用氧化还原穿梭,其与蛋白质的半胱氨酸氨基酸形成混合的二硫键,然后进行亲核攻击,其允许在蛋白质分子的半胱氨酸氨基酸之间形成正确的二硫键。通过使用5KDa UltrasetteTM Lab切向流过滤装置对重折叠输出进行超滤,然后缓冲液交换到20mM Tris pH 9.0中。在非还原12%SDS-PAGE上48kDa处观察到重折叠的rHu兰尼单抗(图6)。通过反相和尺寸排阻HPLC测量重折叠的rHu兰尼单抗的数量和质量(图8)。
实施例8:重组rHu兰尼单抗的分析表征
A280下rHu兰尼单抗样品的吸光度测量
使用280nm的UV吸光度测量确定重折叠和色谱输出中的总蛋白质。使用NanodropTM2000和UV-1800Shimadzu UV可见分光光度计在280nm下读取收集的所有级分。
实施例9:用于rHu兰尼单抗的总蛋白质估算的Bradford’s分析
用于总蛋白质估算的正交技术是使用NanodropTM 2000在595nm下的Bradford分析。在将5μl样品加入250μl Bradford试剂中后,在振荡器上混合30秒。混合后,将样品在染料存在下孵育25分钟,并在595nm下测量吸光度[25]。
实施例10:rHu兰尼单抗样品的SDS PAGE分析
在还原条件下使用12%(厚度1mm)分离凝胶进行SDS PAGE分析以鉴定rHu兰尼单抗的轻链和重链的表达(图4),并且在非还原SDS-PAGE(图7)上以堆积凝胶恒定电压120V和分离凝胶恒定电压100V的条件观察到重折叠的rHu兰尼单抗。每个样品在加载到凝胶中之前在起始缓冲液中煮沸10分钟。在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后,使用4:1:5(水:冰醋酸:甲醇)中的0.05%(w/v)考马斯亮蓝G-250检测蛋白质[26]。
实施例11:rHu兰尼单抗的反相HPLC分析
rHu兰尼单抗的定量和定性分析采用反相色谱法(图8)使用4.6mm×50mmPoroshell 120EC-C18 2.7μm柱在Agilent 1260HPLC系统上进行。流动相由0.1%(v/v)的TFA水溶液(溶剂A)和0.1%(v/v)的TFA、100%(v/v)的乙腈(溶剂B)组成。流速保持在1ml/min,使用A至B的线性梯度,波长为214nm。图8显示了原创和重折叠的rHu兰尼单抗的RP-HPLC色谱图。
实施例12:用于rHu兰尼单抗体外生物活性定量的ELISA分析
使含有重折叠rHu兰尼单抗的样品与包被在平板上的VEGF抗原反应。通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG检测结合的rHu兰尼单抗。免疫反应导致固相VEGF结合抗体-兰尼单抗-酶标记抗体的夹心复合物的形成。洗涤微量滴定条以除去任何未结合的反应物。然后使底物四甲基联苯胺(TMB)反应。在微量滴定板读数器上于450nm下读取水解底物的量,并直接与所存在的rHu兰尼单抗的浓度成比例。使用体外生物测定法对生物活性的重折叠rHu兰尼单抗进行定量。获得了102μg/ml的功能活性rHu兰尼单抗[27]。
实施例13:rHu兰尼单抗的SE HPLC分析
通过使用YarraTM 3μm SEC-2000(300×7.8mm ID)柱进行的SEC-HPLC分析(图9)确定各种过程输出中的聚集物含量。流动相由20mM乙酸盐缓冲液和50mM氯化钠缓冲液,pH5.50组成。分析以等度模式在25℃下以0.5ml/min流速进行。蛋白质检测用光电二极管阵列检测器在280nm下进行。图9显示了纯度99.5%的纯化rHu兰尼单抗,与具有0.5%聚集物含量的原创rHu兰尼单抗相当。
实施例14:双链DNA估计
使用Quant-iTTM picogreen分析法评估重折叠输出中DNA的存在。使用双链λDNA制备标准曲线。将0.5ml的过程输出样品添加到0.5ml的稀释Quant-iTTM dsDNA BR试剂中,并将反应混合物孵育5分钟。五分钟后,使用荧光分光光度计测量荧光(激发波长为480nm,和发射波长为520nm)。
实施例15:重折叠rHu兰尼单抗通过基质辅助激光解析/电离(MALDI-TOF)(飞行时间质谱仪)的完整质量分析
将标准和重折叠的纯化rHu兰尼单抗与芥子酸基质按1:1比率混合以进行MALDI-TOF分析(图11)。类似地,将还原和烷基化的标准和重折叠的rHu兰尼单抗与芥子酸基质按1:1比率混合以进行MALDI-TOF分析(图12)。在高纯水中的50%v/v乙腈、0.1%v/v TFA中制备基质芥子酸(10mg/ml)。将样品和基质的1μl均质化混合物沉积在清洁的384孔MALDI板上。将板插入AB SCIEX TOF/TOFTM5800仪器中。仪器以正离子模式使用。337nm辐射的氮激光保持为电离源。4000至5000之间的激光强度用于样品分析。使用Data软件版本4.11进行结果分析。图10显示了重折叠rHu兰尼单抗与原创rHu兰尼单抗完整质量的比较。图11显示了纯化的rHu兰尼单抗的轻链和重链与还原和烷基化原创rHu兰尼单抗的质量相似性。
实施例16:通过LC-MS的肽指纹分析
通过牛血清白蛋白(BSA)、标准原创rHu兰尼单抗和重折叠rHu兰尼单抗的溶液消化来实现肽作图。通过在室温下使用6.0M盐酸胍进行蛋白质变性1小时。加入10mM的DTT用于变性蛋白的还原,并在室温下孵育1小时。通过使用15mM碘乙酰胺(IAA)进行烷基化,并在黑暗条件下孵育15分钟和再次添加5mM DTT以中和过量的IAA。将变性、还原和烷基化的蛋白质样品缓冲液交换到50mM碳酸氢铵中。胰蛋白酶以1:50(胰蛋白酶:蛋白质)的比率用于蛋白质样品的消化。消化混合物在37℃下孵育18小时,然后使用移液器头进行样品清理。使用SPD1010 SpeedvacTM浓缩器干燥清理的样品。消化的蛋白质样品在质谱级水中的3%乙腈和0.1%甲酸中重构。使用AB SCIEX TripleTOFTM 5600系统进行肽指纹分析,数据使用ProteinPilotTM软件记录和分析。结果表明,原创rHu兰尼单抗与开发的rHu兰尼单抗之间存在良好的一致性,其理论序列覆盖率为85.4%[29]。
本发明的优势
·通过使用本发明中公开的载体构建体获得轻链和重链的均等表达,排除了获得mAb片段轻链和重链的均等表达的人工操作的阶段;
·重组抗体片段的胞质表达而非周质表达导致高生物质产率,因此导致提高的重组蛋白的产率。
·本发明中使用的高细胞密度发酵提供了生物质产量的增加。
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Claims (8)
1.一种用于产生重折叠的重组人源化兰尼单抗的方法,所述方法包括:
a)将携带编码抗体片段的重链和轻链的核苷酸序列的载体转化到宿主细胞中,所述核苷酸序列具有SEQ ID No:1和SEQ ID No:3;
b)使宿主细胞经历高密度细胞发酵;
c)通过在包含葡萄糖和IPTG的混合物的存在下进行诱导在宿主细胞的细胞质中以相等的比例共表达所述抗体片段的轻链和重链以获得包涵体。
2.根据权利要求1所述的用于产生重折叠的重组人源化抗体片段的方法,所述方法还包括:
a)在增溶缓冲液的存在下使含有等比例的重组抗体片段的轻链和重链的包涵体溶解,从而获得溶解的抗体片段轻链和重链;和
b)通过稀释变性剂,然后在氧化剂的存在下氧合以触发二硫键的氧化来重折叠所述溶解的抗体片段轻链和重链,从而获得生物活性形式的rHu兰尼单抗;
c)通过使用5KDa切向流过滤装置对步骤(v)中获得的所述rHu兰尼单抗进行超滤,随后20mM Tris pH 9.0。
3.如权利要求2所述的方法,其中使用包含0.1M Tris缓冲液pH 9.0、2mM EDTA、变性剂和还原剂的增溶缓冲液进行增溶。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述变性剂选自盐酸胍或尿素。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。
6.根据权利要求2所述的方法,其中通过加入10mM氧化型谷胱甘肽,然后使纯氧以1SLPM(标准升每分钟)的流速进入体外重折叠过程而使所述溶解的抗体片段轻链和重链进行氧化。
7.根据权利要求2所述的方法,其中通过使用包含0.1M Tris pH9.0、0.6M精氨酸,5%山梨糖醇、2mM EDTA的重折叠缓冲液进行重折叠。
8.一种用于表达rHu兰尼单抗的轻链和重链基因的二重(双顺反子)载体表达系统,其中所述二重载体包含编码轻链的核苷酸序列SEQ ID No:3、编码重链的核苷酸序列SEQ IDNo:1、启动子序列和限制性位点。
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