KR20210148288A - 생체내 리폴딩된 항체 단편의 클로닝 및 발현 - Google Patents

생체내 리폴딩된 항체 단편의 클로닝 및 발현 Download PDF

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KR20210148288A
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라훌 샤라드 뱀부레
아티르 아사드 툰게카르
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카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치
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Abstract

본 발명은 미생물 발현 시스템의 세포질에서 용해성 형태로 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 생산 및 회수하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 미생물 발현 시스템의 세포질에서 용해성 형태로 생체내 리폴딩된 재조합 인간화된 바이오시밀러 라니비주맵 항체 단편을 생산 및 회수하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 재조합 라니비주맵의 수율은 높이고 천연적인 형태의 rHu 라니비주맵을 생산하는데 필요한 전체 생산 시간은 3일로 단축한다.

Description

생체내 리폴딩된 항체 단편의 클로닝 및 발현
본 발명은 미생물 발현 시스템의 세포질에서 용해성 형태로 생체내 리폴딩된 항체 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 미생물 발현 시스템의 세포질에서 용해성 형태로 생체내 리폴딩된 재조합 인간화된 바이오시밀러 라니비주맵 항체 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다.
시간 및 비용 효율적인 표적 치료학적 단백질의 제조는 바이오시밀러 산업의 성공에 중요한 관건이다. 최근 바이오의약품 연구 및 개발 추세는 항체 단편의 개발에 더욱 집중되어 있다. 항체 단편은 향상된 심층적인 종양 침투와 전장 크기의 mAb가 접근하지 못하는 특정 에피토프와의 결합 등의 전장 크기의 단일클론 항체와 비교해 일부 이점을 제공한다.
항체 단편은 비-당화된 작은 단백질이므로, 미생물 발현 시스템에서 생산하기 더 간단하고, 전장 크기의 단일클론 항체 및 기타 생물제제를 생산하기 위해 사용되는 통상적인 포유류 세포 배양 시스템보다 비교적 더 경제적으로 실행 가능하다. 야생형 E. coli 균주의 세포질은 환원 특성을 가지고 있어, 시스테인 아미노산에 존재하는 황 기들이 환원된 형태, 즉 -SH 형태로 존재한다. 이러한 세포질 내 지배적인 환원성 환경에서는 이황화 결합이 정상적으로 형성되지 않으며, 그 결과 여기에서 발현된 대부분의 항체는 미스폴딩되어 비활성 상태로 축적된다.
항체 단편과 같은 재조합 단백질을 봉입체 형태로 발현하는 것은 미생물 숙주를 이용한 생산 및 정제에 큰 부담이 된다. 봉입체는 생활성 단백질을 생산하기 위해 세포 분리, 용해화, 리폴딩 및 정제를 수반한 광범위한 처리를 요한다. 봉입체에서 단백질의 구조적인 상세한 내용을 파악하는데 있어 새로운 진전에도 불구하고, 용해화 및 리폴딩은 여전히 기능성 단백질의 회수율이 낮은 실험적인 방식으로 이루어지고 있다.
인도 특허 출원 번호 201711017654는 생체내 리폴딩된 재조합 인간화된 라니비주맵을 생산하기 위한 상류 공정을 개시하고 있으며, 또한 rHu 라니비주맵을 발현하기 위한 듀엣 벡터 (즉, 바이-시스트로닉 발현)를 개시하고 있다. 그러나, 단백질의 상류 공정 및 리폴딩에서 전체 공정이 9일 걸리며, 공정의 수율도 30.00 ± 5.00%이다.
인도 특허 출원 번호 201711010410은 rHu 라니비주맵을 수득하기 위해 생산 관련 불순물, 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 핵산을 제거하기 위한 연속적인 다중방식의 크로마토그래피 정제 단계와 후속적인 정용여과 및 한외여과를 포괄하는 하류 정제 기법을 개시하고 있다.
E. coli 세포질의 환원성 조건에서 이종의 단백질의 과다 발현은 봉입체로 지칭되는 비활성 및 불용성 단백질 응집물의 형성으로 이어진다. 이들 봉입체는 활성 단백질 형태를 수득하기 위해 용해화 및 리폴딩을 거쳐야 한다. rHu 라니비주맵에 대한 기존 제조 프로토콜에는 하나 이상의 생물 막을 통과해 활성 단백질 형태를 분비하기 위한 시험관내 리폴딩 단계와 클론 조작이 필수적이다. 시험관내 리폴딩 단계는 전체 제조 비용의 상당 부분을 차지하며, 약 ~120시간, 즉 약 5일이 걸리는 시간-소모적인 공정이다. 또한, 이황화 결합 형성을 위해 산화성 페리플라즘으로 발현된 단백질을 수송하는데에는 중대한 3가지 문제가 있다:
· 페리플라즘이 전체 세포 부피의 약 1/7th에 불과하고,
· 표적 단백질을 세포질에서 페리플라즘으로 분비하는 능력에 쉽게 과부하가 걸릴 수 있으며,
· 복수의 이황화 함유 단백질이 잘못 리폴딩되어, 응집 및 봉입체 형성으로 이어진다.
문헌에 따르면, 유전자 조작된 E. coli 균주를 이용해 E. coli의 세포질에서 재조합 단백질의 리폴딩된 생물학적 활성 형태를 발현할 가능성이 있다. OrigamiTM (DE3), Rosetta-gamiTM (DE3), SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3)는 활성형 단백질을 세포질에서 발현할 수 있는 이러한 레독스 돌연변이 균주의 예들이다. 이들 균주는 활성 형태의 단백질의 발현을 담당하는 돌연변이 타입들이 상이하다. 야생형 E. coli의 경우, 세포질의 환원 특성은 2가지 주요 효소, 즉 티오레독신 리덕타제 (trxB) 및 글루타레독신 리덕타제 (gor)의 작용으로 인한 것이다. E. coli OrigamiTM (DE3) 균주는 이황화 결합 이소머라제의 발현이 결핍된 trxB, gor 및 AhpC (퍼옥시다제) 돌연변이 균주인 반면, E. coli SHuffle 균주는 세포질 이황화 결합 이소머라제 (DsbC)를 구성적으로 과다발현하는 trxB, gor, AhpC 돌연변이 균주이다.
FA113 균주 (OrigamiTM (DE3))는 활성 단백질을 상당히 높은 발현 수준으로 생산하기 위해 마우스 항체 단편 2C5 및 5H4를 세포질에서 더 높은 수준으로 발현하는데 이용되고 있다. Anna Gaciarz et al (Microbial cell factories. 15 (22), 2016)은 용해성 생활성 항체 단편 (42 mg/L)을 CyDisCo 시스템을 이용해 세포질에서 생산하기 위한 대안적인 방식을 채택하였다. 이 시스템은, 세포질에서 환원 경로를 변형하지 않으면서, 통상적으로 이황화 결합을 형성하기 위한 촉매, 통상적으로 설프하이드릴 옥시다제, Erv1p와 이황화 결합 이성질화를 위한 촉매, 즉 DsbC 또는 PDI를 수반한다. Bo Kong and Grace L. G. (Soluble Expression of Disulfide Bond Containing Proteins FGF15 and FGF19 in the Cytoplasm of Escherichia coli. PLoS ONE. 9(1), e85890, 2014)에서는 둘다 이황화 결합을 2개 함유한 용해성 섬유모세포 성장인자 FGF19 및 FGF15의 세포질 발현에 레독스 돌연변이 Rosetta-gamiTM 2 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3) 균주를 이용하였다. 이는 용해성 단백질의 양을 높이기 위해 TRX 융합 태그를 사용하지만, FGF19와 약 50% 서열 상동성을 공유함에도 불구하고 FGF15을 리폴딩된 생활성 형태로 발현하는데 성공하지 못하였다. 상기한 연구들은 재조합 단백질의 용해성 생활성 형태를 합성하는데 적용된 조건이 다른 재조합 단백질을 합성하는데에는 적합하지 않음을 시사해준다.
Mehrnoosh F. et al ( Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 8(1), 16-22, 2016)에서는 Reteplase를 Rosetta-gamiTM B (DE3) 및 SHuffle® T7 (DE3)에서 용해성 형태로 생산하고자 시도하였지만, 표적 단백질이 봉입체로서 발현되고, 용해성 형태로 회수되지 않았다.
다양한 E. coli 발현 시스템들을 이용하여 활성 단백질을 세포질에서 발현하는 것에 대한 몇가지 기존 보고들이 있지만, 항체 단편과 같은 다중-도메인 재조합 단백질의 발현 시스템 및 생산을 선별하는 것은 어려운 일이며, 일반적으로 시도 및 오류 실험을 동반하는 실험적인 과제이다.
따라서, 산화성 세포질에서 rHu 라니비주맵 분자를 생체내 형성할 수 있는 레독스 돌연변이 미생물 숙주 세포를 이용함으로써 시험관내 리폴딩 단계를 우회하는 공정과, 이러한 미생물 숙주 세포로부터 라니비주맵을 효율적으로 회수하는 공정이 당해 기술 분야에서 요구되고 있다.
본 발명의 과제는 항체 단편 합성에서 시험관내 리폴딩 단계를 우회하고 항체 단편을 용해성 형태로 세포질에서 발현시키기 위해 미생물 숙주 세포를 채택하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 산화성 세포질에서 바이오시밀러 rHu 라니비주맵과 같은 리폴딩된 항체 단편을 생체내 형성할 수 있는 미생물 숙주 세포를 적어도 이용한 항체 단편의 합성 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 항체 단편을 고 수율로 생체내 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
채택된 시험관내 리폴딩 단계를 이용해 재조합 인간화된 라니비주맵 합성에 소모되는 비용과 과도한 시간을 단축한다는 관점에서, 본 발명은 미생물 발현 시스템의 세포질에서 생체내 리폴딩된 항체 단편을 용해성 형태로 생산하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 발현 및 회수하는 방법을 제공한다;
a. 세포질의 환원력을 위한 효소는 발현하지 않으면서, 다이설파이드 이소머라제 (disulfide isomerase)를 과다 발현하는 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 세포는 재조합 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 구조체를 포함하는, 단계;
b. 단계 (a)의 미생물 숙주 세포를 글리세롤을 포함하는 복합 영양 배지에서 30℃ 및 pH 7에서 광학 밀도 20.0 내지 25.0까지 배양하여 배양물을 수득하는 단계;
c. 발현을 유도하기 위해 배양물의 온도를 15℃ 내지 24℃ 범위로 낮추고 IPTG를 배양물에 첨가하여, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 포함하는 배양액 (culture broth)을 수득하는 단계;
d. 단계 (c)의 배양액을 원심분리하여 세포 덩어리 (cell mass)를 수득하는 단계;
e. 단계 (d)의 세포 덩어리를 파괴하여 세포 용해물 (cell lysate)을 수득하는 단계;
f. 단계 (e)의 세포 용해물을 원심분리하여 제1 상층물을 수득하는 단계;
g. 단계 (f)에서 수득한 제1 상층물을 pH 4.0에서 석출시킨 후 원심분리하여 제2 상층물을 수득하는 단계;
h. 단계 (g)의 제2 상층물을 한외여과하여, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 체류 분획 (retentate fraction)으로 수득하는 단계;
i. 단계 (h)의 체류 분획에 대해 다중방식의 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피를 수행하여, 정제된 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 수득하는 단계.
이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 미생물 발현 시스템의 세포질에서 재조합 항체 단편을 용해성 형태로 생산하는 방법을 제공한다;
(i) 재조합 항체 단편의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 듀엣 벡터를 구축하는 단계;
(ii) 단계 (i)의 듀엣 벡터를 E. coli SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포에 형질전환하는 단계;
(iii) 숙주 세포를 교반 플라스크에서 교반 플라스크 레벨 (shake flask level)에서 공정 파라미터 (process parameter) 하에 배양하는 단계;
(iv) 생체내 리폴딩된 용해성 재조합 항체 단편을 숙주 세포의 세포질에서 발현하기 위해, 발효기 규모 (fermenter scale)에서 숙주 세포의 세포 고 밀도 발효를 수행하는 단계.
보다 구체적으로, 본 발명은 바이오시밀러 재조합 인간화된 라니비주맵 항체 단편을 미생물 발현 시스템의 세포질에서 용해성 형태로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 서로 생체내에서, 즉 경쇄와 중쇄 내 쇄-내 이황화 결합으로 조합되는 rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄를 제공하며, 2개의 쇄-간의 이황화 결합이 숙주 세포의 세포질 안에서 형성된다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포질의 환원력을 담당하는 유전자 trxB 및 gor 발현 효소, 즉 각각 티오레독신 리덕타제 및 글루타레독신 리덕타제가 돌연변이되어, 산화성 세포질을 가진 미생물 발현 시스템을 제공해준다. 나아가, 본 발명은 이러한 미생물 발현 시스템의 세포질에서 다이설파이드 이소머라제 (DsbC)의 과다 발현을 제공해준다. DsbC는 형성된 비-천연성 이황화 결합을 파괴하여, 천연적인 이황화 결합을 형성하기 위한 샤페론으로 작동한다.
유익하게는, 본 발명은 증가된 수율로 rHu 라니비주맵을 제공해주며 rHu 라니비주맵을 천연 형태로 생산하는 전체 제조 시간을 3일로 단축한다.
도 1은 바이오시밀러 rHu 라니비주맵에 대한 새로운 클로닝, 발현 및 생체내 리폴딩 플랫폼을 도시한 것이다
도 2는 바이오시밀러 rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 듀엣 벡터 A를 도시한 것이다.
도 3은 생체내 리폴딩된 바이오시밀러 rHu 라니비주맵에 대한 다중방식의 크로마토그래피에 의한 부분 정제 결과를 도시한 것이다.
도 4(a)는 교반 플라스크 배양 시스템에서 rHu 라니비주맵이 함유된 부분 정제된 상층물의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다; 1번 레인: Innovator 라니비주맵 분자, 2번 레인: E. coli SHuffle® T7 (DE3) 상층물, 3번 레인: E. coli SHuffle® T7 Express (DE3) 상층물.
도 4(b)는 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 항체 단편을 비-환원 환경 하에 정제한 경우의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다; MW 레인: 표준 분자량 마커, 1번 레인: Innovator 라니비주맵 분자, 2번 레인: 정제된 표적 단백질, 3번 레인: 다중방식의 크로마토그래피 용출물 (10% 농도 구배), 4번 레인: -, 5번 레인: 다중방식의 크로마토그래피 용출물 (100% 농도 구배), 6번 레인: 완충제 교체 후 한외여과 체류물, 7번 레인: 친화성 크로마토그래피 통과액, 8번 레인: 세포 용해물.
도 4(c)는 비-환원 조건에서 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 항체 단편의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다; MW 레인: 표준 분자량 마커, 1번 레인: Innovator 라니비주맵 분자, 2번 레인: E. coli SHuffle T7 (DE3) 숙주 세포를 이용해 발현한 정제된 리폴딩된 단백질, 3번 레인: E. coli SHuffle T7 Express (DE3) 숙주 세포를 이용해 발현한 정제된 리폴딩 단백질.
도 5는 등전점에 기반한 석출 후 수득한 석출물에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다. 도 5(a): 1번 레인: 세포 용해물 조산물의 상층물, 2번 레인: pH 7.5; 3번 레인: pH 7.0; 4번 레인: pH 6.0; 5번 레인: pH 5.0; 6번 레인: pH 4.0. 도 5(b)는 등전점에 기반한 석출 후 수득한 상층물에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다. 1번 레인: 세포 용해물 조산물의 상층물; 2번 레인: pH 7.5; 3번 레인: pH 7.0; 4번 레인: pH 6.0; 5번 레인: pH 5.0; 6번 레인: pH 4.0.
도 6은 교반 플라스크 배양 시스템으로부터 수득한 부분 정제된 상층물에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 도시한 것이다. 도 6(a); 1번 레인: 단백질 마커, 2번 레인: Innovator 라니비주맵 분자, 3번 레인: - , 4번 레인: E. coli SHuffle® T7 (DE3) 상층물, 5번 레인: E. coli SHuffle® T7 Express (DE3) 상층물; 도 6(b)는 비-환원 조건에서 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 항체 단편에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 것이다; MW 레인: 표준 분자량 마커, 1번 레인: Innovator 라니비주맵 분자, 2번 레인: E. coli SHuffle T7 (DE3)을 이용해 발현된 정제된 리폴딩된 단백질, 3번 레인: E. coli SHuffleT7 Express (DE3)를 이용해 발현된 정제된 리폴딩된 단백질.
도 7은 교반 플라스크 배양 시스템에서 생체내 리폴딩된 바이오시밀러 rHu 라니비주맵 및 Innovator 라니비주맵 분자에 대한 RP-HPLC 분석 결과를 오버레이한 것이며 (도 7(a)), 생물조에서 수득한 생체내 리폴딩된 바이오시밀러 rHu 라니비주맵에 대한 RP-HPLC 분석을 오버레이 (도 7(b))한 것이다.
도 8은 교반 플라스크 배양 시스템에서 수득한 생체내 리폴딩된 바이오시밀러 rHu 라니비주맵에 대한 온전한 질량 분석 결과 (도 8(a))와, 생물반응조 규모에서 비-환원 조건 하의 Innovator 라니비주맵 분자와 정제된 생체내 리폴딩된 rHu 바이오시밀러 라니비주맵에 대한 MALDI-TOF MS 결과를 오버레이한 것이다.
도 9는 화학적으로 규정된 최소 배지에서 E. coli SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3)의 증식 특징을 나타낸 것이다.
도 10은 변형된 복합 배지에서 E. coli SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3)의 증식 특징을 나타낸 것이다.
도 11은 변형된 복합 배지에서 재조합 E. coli SHuffle T7 (DE3) 및 SHuffle T7 Express (DE3)의 배치 방식의 발현에서 600 nm 광학 밀도 및 DCW (g L- 1)를 시간 코스로 도시한 것이다.
도 12는 변형된 복합 배지에서 재조합 E. coli SHuffle T7 (DE3) 및 SHuffle T7 Express (DE3)의 배치 방식의 발현에서 교반기 속도 (rpm), 산소 유량 (%) 및 용해된 O2 농도 (%)를 시간-코스로 도시한 것이다.
도 13은 다중방식의 크로마토그래피를 이용하여 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 (단계 1)을 정제한 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 14는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 (단계 2)을 정제한 크로마토그램을 도시한 것이다.
서열 목록에 대한 간단한 설명
본 발명은 본 발명의 일부를 구성하는 서열 목록과 더불어 후술한 상세한 설명을 통해 심층적으로 이해될 수 있다.
본원에 첨부된 서열 설명과 서열 목록은 본 출원의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열에 적용되는 규칙을 따른다.
서열번호 1: 라니비주맵의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (721 bp)
서열번호 2: 라니비주맵 중쇄의 아미노산 서열 (231 aa)
서열번호 3: 라니비주맵의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (669 bp)
서열번호 4: 라니비주맵 경쇄의 아미노산 서열 (214 aa)
이제 본 발명은 일부 바람직한 선택적인 구현예들과 연계하여 상세히 설명될 것이며, 이에 대한 다양한 측면들을 더 충분히 이해 및 인지할 수 있을 것이다.
생물 재료의 소스: E. coli SHuffle® T7 (DE3) 및 E. coli SHuffle® T7 Express (DE3) 발현 시스템은 New England Biolabs Inc., USA (각각 Cat. No. C3026J 및 C3029J)에서 구입하였다.
rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 약물 은행으로부터 검색하고, 코돈 최적화를 수행하였다 (등재 번호: DB01270). 라니비주맵 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재한다. 라니비주맵 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 4에 기재한다.
이에, 본 발명은 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법에 관한 것으로, 수득되는 재조합 항체 단편이 고 수율로 수득된다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다:
a. 세포질의 환원력을 위한 효소는 발현하지 않으면서 다이설파이드 이소머라제를 과다 발현하는 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 세포는 재조합 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 구조체를 포함하는, 단계;
b. 단계 (a)의 미생물 숙주 세포를 글리세롤을 포함하는 복합 배지에서 30℃, pH 7에서 배양하여 배양물을 수득하는 단계;
c. 발현을 유도하기 위해 배양물의 온도는 낮추고 IPTG를 배양물에 첨가하여, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 포함하는 배양액을 수득하는 단계;
d. 단계 (c)의 배양액을 원심분리하여 세포 덩어리를 수득하는 단계;
e. 단계 (d)의 세포 덩어리를 파괴하여 세포 용해물을 수득하는 단계;
f. 단계 (e)의 세포 용해물을 원심분리하여 제1 상층물을 수득하는 단계;
g. 단계 (f)에서 수득한 제1 상층물을 pH 4.0에서 석출시킨 후 원심분리하여 제2 상층물을 수득하는 단계;
h. 단계 (g)의 제2 상층물을 한외여과하여, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 체류 분획으로 수득하는 단계;
i. 단계 (h)의 체류 분획에 대해 다중방식의 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피를 수행하여, 정제된 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 수득하는 단계.
본 발명은, 일 구현예에서, 재조합 항체 단편이 재조합 인간 라니비주맵의 단편인, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 다른 구현예에서, 미생물 숙주 세포가 E. coli 숙주 세포인, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 또 다른 구현예에서, E. coli 숙주 세포가 SHuffle T7 (DE3) 및 SHuffle T7 Express (DE3) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 일 구현예에서, 단계 (c)에서 유도 중에 배양물의 온도를 30℃에서 15℃ 내지 24℃ 범위의 온도로 낮추는, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 다른 구현예에서, IPTG를 0.55 mM 내지 1 mM 범위의 농도로 첨가하는, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 또 다른 구현예에서, 300 내지 1000 rpm의 교반 속도 및 0에서 90%까지의 O2 농화를 이용한 공기 포화도의 30% 농도에서의 용존 산소 (DO)에서 수행되는, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 또 다른 구현예에서, 중기-로그 단계의 배양 단계 (중기-로그 phase growth phase)에 ~20.0 내지 25.0 범위의 광학 밀도에서 숙주 세포를 유도하는, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 또 다른 구현예에서, 복합 영양 배지의 글리세롤 농도가 30g/L 내지 35g/L 범위인, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 일 구현예에서, 더 높은 pH에서 결합시키고 더 낮은 pH에 용출하는 결합 및 용출 방식으로 친화성 크로마토그래피를 수행하는, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은, 다른 구현예에서, 결합시키기 위한 더 높은 pH가 8.5 내지 10.5이고 용출시키기 위한 더 낮은 pH가 2.5 내지 4.5인, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 발현 및 회수 방법을 제공한다:
a) 세포질의 환원력을 위한 효소는 발현하지 않으면서, 다이설파이드 이소머라제를 과다 발현하는 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 세포는 재조합 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 구조체를 포함하는, 단계;
b) 단계 (a)의 미생물 숙주 세포를 글리세롤을 포함하는 복합 영양 배지에서 30℃ 및 pH 7에서 광학 밀도 20.0 내지 25.0까지 배양하여 배양물을 수득하는 단계;
c) 발현을 유도하기 위해 배양물의 온도를 15℃ 내지 24℃ 범위로 낮추고 IPTG를 배양물에 첨가하여, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 포함하는 배양액을 수득하는 단계;
d) 단계 (c)의 배양액을 원심분리하여 세포 덩어리를 수득하는 단계;
e) 단계 (d)의 세포 덩어리를 파괴하여 세포 용해물을 수득하는 단계;
f) 단계 (e)의 세포 용해물을 원심분리하여 제1 상층물을 수득하는 단계;
g) 단계 (f)에서 수득한 제1 상층물을 pH 4.0에서 석출시킨 후 원심분리하여 제2 상층물을 수득하는 단계;
h) 단계 (g)의 제2 상층물을 한외여과하여, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 체류 분획으로 수득하는 단계;
i) 단계 (h)의 체류 분획에 대해 다중방식의 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피를 수행하여, 정제된 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 수득하는 단계.
본 발명의 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 합성 및 회수 공정은 치료학적인 용도를 가진 항체, 다중 도메인을 가진 재조합 항체 및 재조합 단백질의 합성으로까지 확장된다.
일 구현예에서, 본 발명의 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편의 합성 및 회수 방법은 라니비주맵, 아비시시맵 (Abciximab) 및 세르톨리주맵 (Certolizumab)의 재조합 인간화 항체의 재조합 항체 단편을 합성하는데 적용된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 생체내 리폴딩된 재조합 라니비주맵의 발현 및 회수 방법을 제공한다;
a) 세포질의 환원력을 위한 효소는 발현하지 않으면서, 다이설파이드 이소머라제를 과다 발현하는 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 세포는 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 구조체를 포함하는, 단계;
b) 단계 (a)의 미생물 숙주 세포를 글리세롤을 포함하는 복합 영양 배지에서 30℃ 및 pH 7에서 광학 밀도 20.0 내지 25.0까지 배양하여 배양물을 수득하는 단계;
c) 발현을 유도하기 위해 배양물의 온도를 15℃ 내지 24℃ 범위로 낮추고 IPTG를 배양물에 첨가하여, 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵을 포함하는 배양액을 수득하는 단계;
d) 단계 (c)의 배양액을 원심분리하여 세포 덩어리를 수득하는 단계;
e) 단계 (d)의 세포 덩어리를 파괴하여 세포 용해물을 수득하는 단계;
f) 단계 (e)의 세포 용해물을 원심분리하여 제1 상층물을 수득하는 단계;
g) 단계 (f)에서 수득한 제1 상층물을 pH 4.0에서 석출시킨 후 원심분리하여 제2 상층물을 수득하는 단계;
h) 단계 (g)의 제2 상층물을 한외여과하여, 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵을 체류 분획으로 수득하는 단계;
i) 단계 (h)의 체류 분획에 대해 다중방식의 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피를 수행하여, 정제된 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵을 수득하는 단계.
본 방법의 단계 (a)에 따라, 본 발명은 서열번호 3에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 라니비주맵의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 클로닝함으로써 구축된 박테리아 발현 벡터를 제공한다. 경쇄와 중쇄를 코딩하는 유전자가 탑재된 이 바이시스트로닉 벡터는, 세포질의 환원력에 관여하는 효소는 발현하지 않으면서 다이설파이드 이소머라제를 과다 발현하는 박테리아 숙주 세포로 형질전환된다. 숙주 세포는 박테리아 또는 효모 숙주 세포로부터 선택된다. 본 발명은 SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3) 발현 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 E. coli의 컴피턴트 숙주 세포를 제공한다. 항생제 선별 마커를 이용해, 형질전환 양성 세포를 플레이트에서 분리하고, 대상 단백질, 즉 재조합 라니비주맵의 항체 단편의 발현을 확인한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 미생물 발현 시스템의 세포질에서 항체 단편을 용해성 형태로 생산하는 방법을 제공한다:
(i) 재조합 항체 단편의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 듀엣 벡터를 구축하는 단계;
(ii) 단계 (i)의 듀엣 벡터를 E. coli SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포에 형질전환하는 단계;
(iii) 숙주 세포를 교반 플라스크에서 교반 플라스크 레벨에서 공정 파라미터 하에 배양하는 단계; 및
(iv) 숙주 세포의 세포질에서 생체내 리폴딩된 용해성 재조합 항체 단편을 발현시키기 위해 발효기 규모에서 숙주 세포의 고 밀도 발효를 수행하는 단계.
이에, 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 pRSF 듀엣 벡터를 이용해, 컴피턴트 SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3) 발현 시스템을 형질전환하였다. 도 2는 rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄 유전자를 발현하기 위한 듀엣 벡터 A의 설계를 예시한다. 본 발명은 상기한 2가지 미생물 발현 시스템, 즉 E. coli SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3)를 이용함으로써 시험관내 리폴딩 단계를 생략한다. 이러한 미생물 발현 시스템은 세포질의 환원력을 담당하는 2가지 효소를 발현하는 유전자 trxB와 gor, 즉 티오레독신 리덕타제 및 글루타레독신 리덕타제가 각각 돌연변이된, 산화성 세포질을 포함한다. 도 9 및 10은 화학적으로 규정된 최소 배지 및 변형된 복합 배지에서 2가지 레독스 돌연변이 미생물 발현 시스템의 증식 특징들을 보여준다. 도 9 및 10의 비교를 통해, 영양적으로 풍부한 Tartoff Hobbs HiVeg Terrific 브로스와 글리세롤로 구성되는 변형된 복합 배지가, 세포 배양의 연장된 로그 단계에서 확인되는 바와 같이, 레독스 돌연변이 E. coli 미생물 발현 시스템을 효율적으로 증식시키기에 충분히 바람직한 배지임에 분명해 보인다. 변형된 복합 배지를 이용한 효율적인 증식 단계는 화학적으로 규정된 최소 배지와 비교해 변형된 복합 배지에서 관찰되는 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 발현 수준의 1.5 내지 2배 증가로 반영된다.
일 구현예에서, 본 발명은 이들 미생물 발현 시스템의 세포질에서 DsbC로서 공지된 단백질 다이설파이드 이소머라제의 과다발현을 제공한다. DsbC는 형성된 비-천연 이황화 결합을 파괴하고, 천연적인 이황화 결합을 형성하기 위한 샤페론으로 작동한다. rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄는 서로 생체내에서, 즉 경쇄와 중쇄 내 쇄-간 이황화 결합으로 조합되고, 2개의 쇄들 간의 쇄-내 이황화 결합이 숙주 세포 세포질 안에서 형성된다. 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 세포질 발현은, rHu 라니비주맵의 생물학적 활성 형태를 수득하기 위해 현재 요구되는 속도-제한적인 시험관내 리폴딩 단계를 쉽게 대체할 수 있어, 라니비주맵 제조에 대한 매력적인 고-성능 대안 방안이 된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 300 내지 1000 rpm의 교반 캐스캐이드와 0에서 90%까지 O2 농화를 이용하여 용존 산소 (DO)가 공기 포화도의 30%에서 유지되는, 생물반응조 규모의 공정을 제공한다. pH는 15% v/v 암모니아 수용액 및 30% v/v 오르토인산을 첨가함으로써 ~7.0으로 조절된다. 생물반응조에서 기포 발생은 20% v/v 소포제를 첨가하여 조절된다. 박테리아 배양물이 광학 밀도 약 ~20.0 내지 25.0, 즉, 중기-로그 단계에 도달하면, 온도를 SHuffle T7 (DE3)의 경우 22℃, SHuffle T7 Express (DE3)의 경우 16℃로 낮추고, 0.55 mM IPTG를 이용해 배양물을 유도한다.
생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 합성 및 회수하기 위한 바람직한 구현예들에 기술된 본 발명의 단계 (b) 및 (c)의 공정 파라미터는, 미생물 발현 시스템 및 발현할 재조합 항체에 대해, 본 발명자들이 고안한 것이다. 공정 파라미터는 재조합 항체가 용해성 형태로 발현되는데 상당한 영향을 미친다. 용해성 발현에 대한 다양한 공정 파라미터들의 영향을 연구하고 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 수율을 강화하기 위한 최적의 조건을 결정하기 위한 실험을 수행하였다.
교반 플라스크 규모에서, 바이오시밀러 rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 뉴클레오티드 구조체를 탑재한 E. coli 숙주 세포를 배양하여 BL 브로스에 투입한 다음 30℃ 및 225 rpm에서 배양하였다. 600 nm에서 광학 밀도 0.5 - 0.6에 도달하면, 1 mM IPTG로 E. coli 배양물을 유도하였다. 8시간 동안 배양한 후 세포를 회수하고, 배양액을 6000 rpm으로 10℃에서 30분간 원심분리하였다. 수득된 세포 덩어리는 100 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA를 포함하는 세포용해 완충제에 재현탁하고, 세포 상층물에 초음파를 3분 사이클로 처리하였다. 세포 용해 후, 샘플을 9000 rpm으로, 6℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층물 분획은 그 후 용해성 단백질 발현을 확인하기 위해 부분 정제 공정에 투입하였다. 교반 플라스크 레벨 Shuffle® T7 (DE3) 및 Shuffle® T7 Express (DE3) E. coli 발효시, 각각 600 nm에서 광학 밀도 3.96 ± 0.05 및 3.46 ± 0.07이 달성되었으며, 바이오매스는 각각 4.9 ± 0.25 g/l 및 4.7 ± 0.70 g/l이었다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 재조합 라니비주맵의 정제 및 회수 방법을 제공한다:
a) 생체내 리폴딩된 재조합 라니비주맵을 발현하는 숙주 세포를 배양한 후 회수한 배양액을 원심분리하여 세포 덩어리를 수득하는 단계;
b) 단계 (a)의 세포 덩어리를 파괴하여 세포 용해물을 수득하는 단계;
c) 단계 (b)의 세포 용해물을 원심분리하여 제1 상층물을 수득하는 단계;
d) 단계 (c)의 제1 상층물을 pH 4.0에서 석출한 다음 원심분리하여 제1 상층물을 수득하는 단계;
e) 단계 (d)의 제2 상층물을 한외여과하여 생체내 리폴딩된 재조합 라니비주맵을 체류 분획으로 수득하는 단계;
f) 단계 (e)의 체류 분획에 대해 다중방식의 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피를 수행하여 정제된 생체내 리폴딩된 재조합 라니비주맵을 수득하는 단계.
전술한 방법의 단계들에서, 세포 바이오매스는 배양액을 6000 rpm으로, 10℃에서 30분간 원심분리함으로써 수득한다. 정제하는 경우, 실험실 규모의 실험을 AKTA Purifier 크로마토그래피 시스템을 이용해 수행한다. 크로마토그래피 컬럼 (6.6 x 450 mm)을 사용해 15.0 ± 0.2 cm BAKERBOND™ XWP 500 Poly PEI-35 다중방식의 수지를 충진한다. 크로마토그래피 컬럼을 선택한 평형 완충제, 즉 20 mM Tris pH 9.0 (5-10 CV)을 사용해 평형화한다. 세포용해 후 수득한 무세포성 상층물에서 완충제를 전술한 평형 완충제로 교체한 다음 샘플 펌프를 사용해 크로마토그래피 컬럼으로 주입한다. 샘플 주입 후, 비-결합 단백질 샘플을 평형 완충제 세척 단계 (5CV)로 제거한다. 용출 단계는 10% 용출 완충제의 단계별 농도 구배 및 이후 용출 완충제 100%까지의 단계별 농도 구배를 수반하는 선택적인 염 기반의 용출 농도 구배로 구성된다. 크로마토그래피 컬럼의 산물을 pH, 전도도 및 280, 260 및 215 nm에서의 UV 검출을 이용해 모니터링한다. 도 3은 무세포 상층물을 부분 정제한 크로마토그램을 도시한다. 충분히 정제하기 위해, 세포 용해물에 대해 등전점 석출과 후속적인 상층물의 원심분리 및 한외여과를 수행하고, BAKERBOND™ XWP 500 Poly PEI-35 다중방식 수지에서 염 농도 구배 및 CH1-XL 친화성 매트릭스를 이용하여 더 높은 pH에서 결합시키고 더 낮은 pH에서는 용출시키는 방식으로 체류물을 정제하며, 이의 최종 순도는 99.44%이다. 이에, 결합시키기 위한 더 높은 pH는 8.5 내지 10.5이고, 용출시키기 위한 더 낮은 pH는 2.5 내지 4.5이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 화학적으로 규정된 최소 배지에서와 비교해 변형된 복합 배지에서 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 발현 수준을 교반 플라스크 규모 (표 3)에서 약 1.5배 내지 2.0배 증가시킨다.
친화성 크로마토그래피 단계는 2가지 주요한 이점을 제공한다; 먼저, 고정된 리간드는 경쇄 이소형 및 소스 물질과 독립적으로 인간 IgG 항체의 CH1 도메인을 인지하므로, 숙주 세포 단백질은 통과액으로서 통과되어, 도 8에서 MALDI-TOF MS 분석에서 확인된 바와 같이 경쇄들 간에 형성된 호모다이머 및 경쇄와 중쇄 간에 형성된 헤테로다이머를 분리할 수 있다. 이에, 리폴딩되고 정제된 항체 단편에 대한 비-환원 조건에서의 MALDI-TOF MS 분석 결과, 도 8(b)에서 Innovator 라니비주맵 분자의 분자량과 동일한 ~48 kDa의 온전한 분자량이 확인된다. 아울러, 도 4(b)는 세포 용해 조산물에서부터 최종 정제된 산물까지 표적 단백질의 분리 단계들에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다.
따라서, rHu 라니비주맵을 천연 형태로 생산하는데 필요한 총 생산 시간이 이러한 신규 개발된 기법을 채택함으로써 9일에서 3일까지 단축되었다. 이는, 기존의 시험관내 리폴링 공정과 비교해 적어도 4배까지 가능한 생산성 향상으로 이어진다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 재조합 라니비주맵의 수율이 교반 플라스크 규모에서 50 mg/L 내지 90 mg/L 범위인, 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 발현 및 회수 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 본 방법에 의해 수득되는 라니비주맵 단편의 항체 단편, viz, 경쇄 및 중쇄가 Innovator 라니비주맵 분자와 비슷함을 보여주는 바이오시밀래러 실험을 제시해준다. 이는 RP-HPLC 분석에서 생체내 리폴딩된 바이오시밀러 rHu 라니비주맵과 Innovator 라니비주맵 분자의 중첩을 보여주는 도 7에 잘 나타나 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 재조합 라니비주맵은 안전하며, Innovator 라니비주맵 분자에 비해 효율적이다.
본 발명의 이점:
· 본 발명은 바이오시밀러 rHu 라니비주맵을 용해성 형태로 발현시키기 위한 2가지 박테리아 발현 시스템을 제공해준다.
· 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 세포질 발현은, 현재 라니비주맵의 생물학적 활성 형태를 수득하기 위해 필요한 속도-제한적인 시험관내 리폴딩 단계를 쉽게 대체할 수 있으므로, 라니비주맵을 제조하기 위한 매력적인 고-성능의 대안법을 제시해준다.
· rHu 라니비주맵을 천연적인 형태로 생산하기 위해 필요한 총 제조 시간이 본 발명에 기술된 공정을 채택함으로써 9일에서 3일로 단축된다. 이는, 기준 시험관내 리폴딩 공정과 비교해 적어도 4배 내지 6배의 가능한 생산성 개선으로 이어진다.
· 본 발명의 공정의 제조 수율은 45 ± 5.00%이다.
· 본 발명의 공정을 이용함으로써 시험관내 리폴딩이 생략되어 30% 비용 절감된다.
실시예
하기 실시예들은 예시로서 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 클로닝
rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 발현하는 발현 벡터의 구축과 이후 숙주 세포의 형질전환을 후술한 바와 같이 수행하였다.
(i) 코돈 최적화에 의한 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 서열 구축
경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 약물 은행으로부터 입수하여, 코돈 최적화를 수행하였다.
(ii) rHu 라니비주맵의 경쇄 및 중쇄에 대한 pRSF 듀엣 벡터 구축
경쇄를 코딩하는 서열번호 3에 기재된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 서열을 다중 클로닝 부위 I (MCS I)의 T7 프로모터가 앞에 위치한 NcoI/HindIII 클로닝 부위에 5' 말단으로, 그리고 중쇄를 코딩하는 서열번호 1에 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 서열을 다중 클로닝 부위 II (MCS II)의 T7 프로모터가 앞에 위치한 NdeI/XhoI 클로닝 부위에 5' 말단으로 클로닝하여, 박테리아 발현 벡터 pRSF 듀엣 벡터를 구축하였다.
(iii) E. coli SHuffle T7 (DE3) 및 SHuffle T7 Express (DE3) 발현 시스템에서 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 pRSF 듀엣 벡터의 형질전환
(a) 재료: 뮐러 루리아 베타니 HiVeg 브로스 (LB 브로스), SOC 배양 배지, 루리아 베타니 HiVeg 아가, 타르토프 호브스 HiVeg 테리픽 브로스 (TB), 코발트 클로라이드, 망간 (II) 클로라이드, 구리 클로라이드, 소듐 몰리브덴산염 이수화물, 아연 아세테이트 이수화물, 패릭 사이트레이트 일수화물, 티아민 하이드로클로라이드, 트리즈만 베이스 및 카나마이신 용액은 인도 HiMedia Laboratory Private Limited에서 구입하였다. 발현 듀엣 벡터는 인도 Merck Life Science Private Limited에서 구입하였다. E. coli SHuffle® T7 (DE3) 및 Shuffle® T7 Express (DE3)는 미국 New England Biolabs Inc.에서 구입하였다. 페트리 디쉬 및 10 ㎕ 일회용 접종 루프는 인도 Tarsons Products Private Limited에서 구입하였다. 완충제 및 배양 배지는 모두 Milli-Q 워터에서 준비하였다. 빙초산, 아세토니트릴 (HPLC 등급), 메탄올 (HPLC 등급), 소듐 아세테이트 (무수), 소듐 클로라이드, 소듐 하이드록사이드, 붕산, 다이암모늄 하이드로겐 포스페이트, 구연산, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 과산화수소(30%), 다이소듐 하이드로겐 오르토포스페이트, 포타슘 클로라이드 및 니켈 암모늄 설페이트는 인도 Merck Life Science Private Limited에서 구입하였다. 글리세롤은 미국 Promega Corporation에서 구입하였다. 브로모페놀 블루, 트리플루오로아세트산 (TFA), 아크릴아미드, 암모늄 퍼설페이트, N,N' 메틸렌 비스아크릴아미드, 베타-머캅토에탄올, 글리신, 소듐 도데실 설페이트, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA)의 소듐 염 및　N,N,N', N'-테트라메틸에틸렌다이아민 (TEMED)은 인도 Sigma Aldrich Co.에서 구입하였다. BAKERBONDTM XWP 500 Poly PEI-35 수지는 인도 Avantor Performance Materials Private Limited에서 구입하였다. HRP 접합된 염소 항-토끼 IgG 2차 항체 (H+L)는 인도 Thermo Fisher Scientific Private Limited에서 구입하였다. 니트로셀룰로스 막, 필터지 및 섬유 패드는 인도 Bio-Rad Laboratories Private Limited에서 구입하였다. 웨스턴 블롯 분석에 사용되는 1차 항체는 Innovator 라니비주맵 분자, 즉 2가지 토끼 암컷에서의 Lucentis를 주입함으로써 rHu 라니비주맵에 대해 특이적으로 생성시켰으며, 면역화를 위해 2회 부스터 (Intox Private Limited, India) 접종한 후 혈청을 수집하였다. 수집한 혈청은 미국 GE Healthcare 사의 MabSelectTM SuReTM를 사용해 단백질 A 크로마토그래피를 수행하여, rHu 라니비주맵에 대한 다클론 IgG를 정제하였다.
(b) 장치: 박테리아 배양물을 인도 REMI Laboratory Instruments 사의 CIS-24 PLUS 교반기를 사용해 인큐베이션하였다. 미국 Sonics and Materials Inc. 사의 소니케이터 VibracellTM를 사용해 세포에 세포용해를 처리하였다. 독일 Eppendorf 5804R 저온 원심분리기를 사용해 박테리아 세포 분리를 수행하였다. 미국 Thermo Scientific 사의 NanodropTM 2000 및 일본 Shimadzu Analytical Private Limited 사의 UV-1800 Shimadzu UV 비저블 분광광도계를 사용해, 단백질 농도는 280 nm에서, 세포 밀도는 600 nm에서 흡광도 측정을 각각 수행하였다. 질량 분석을 위해 단백질 샘플 농축에 SPD1010 SpeedvacTM 농축기를 사용하였다. 발현된 단백질 농도에 대한 역상 고 성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 분석은 Agilent 1200 HPLC를 이용해 운영되는 미국 Phenomenex 사의 4.6 mm x 250 mm AerisTM 3.6 um WIDEPORE XB-C8 컬럼을 사용해 수행하였다. Agilent ChemStation 소프트웨어를 사용해 RP-HPLC 데이터를 기록 및 분석하였다. 질량 분광측정 분석은 미국 SCIEX 사의 AB SCIEX TOF/TOFTM 5800으로 수행하였다. 데이터는 Data Explorer® Software Version 4.11을 사용해 기록 및 분석하였다.
(c) 형질전환 프로토콜: 경쇄 코딩 유전자 및 중쇄 코딩 유전자를 포함하는 pRSF 듀엣 벡터를 컴피턴트 SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3) 발현 시스템으로 형질전환하였다. 형질전환 방법은 다음을 포함한다: 숙주 세포 50 ㎕를 벡터 5 ㎕와 30분간 얼음 위에서 인큐베이션한 다음 42℃에서 30초간 열 충격을 가한다. 열 충격 후, 세포는 다시 얼음 위에서 5분간 인큐베이션한다. SOC 배지 950 ㎕를 반응물 믹스에 첨가한 다음 60분간 30℃에서 300 rpm으로 드라이 배스에서 인큐베이션한다. E. coli 형질전환체 100 ㎕을 30 ㎍/ml 카나마이신 함유 LB 아가 플레이트에 첨가한다. 형질전환된 세포가 수용된 플레이트를 30℃에서 24-48시간 인큐베이션한다. 항생제 선별 마커를 이용해, 형질전환 양성 세포를 플레이트에서 분리하여, 대상 단백질 발현을 검증하기 위해 이용하였다.
실시예 2
교반 플라스크 레벨에서 rHu 라니비주맵 용해성 발현
E. coli SHuffle® T7 (DE3) 및 SHuffle® T7 Express (DE3)의 선택 형질전환체를 대상으로 리폴딩된 rHu 라니비주맵 발현에 대해 조사하였다. 선택 콜로니를 30 ㎍/ml 카나마이신이 첨가된 LB 브로스 50 ml에 접종하였다. 세포는 600 nm 광학 밀도가 1-1.2가 될 때까지 배양한 다음, 잘 배양된 콜로니 5 ml을 LB 배지 100 ml에 옮겨 (2차 배양), 30℃에서 225 rpm으로 인큐베이션하였다. 600 nm 광학 밀도 0.5 - 0.6에 도달한 후, E. coli 배양물에 1 mM IPTG를 첨가하여 유도하였다. 8시간 유도한 후 세포를 회수하고, 배양액을 6000 rpm으로 10℃에서 30분간 원심분리하였다. 그런 후 수득한 세포 바이오매스를 세포용해 완충제 (100 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA)에 재현탁하고, 세포 현탁물에 3분 주기 (10초 펄스 처리 후 20초 휴지)로 초음파 처리하였다. 세포용해 후, 샘플을 9000 rpm으로 6℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층 분획은 용해성 단백질 발현을 검증하기 위해 후속적인 부분 정제를 수행하였다. 교반 플라스크 레벨 Shuffle® T7 (DE3) 및 Shuffle® T7 Express (DE3) E. coli 발현시, 600 nm에서 광학 밀도 각각 3.96 ± 0.05 및 3.46 ± 0.07와, 4.9 ± 0.25 g/(바이오매스)l 및 4.7 ± 0.70 g/l이 각각 수득되었다.
실시예 3
생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 부분 정제
실험실 규모의 실험을 AKTA Purifier 크로마토그래피 시스템 (Amersham Bio-Sciences, Sweden)을 사용해 수행하였다. OmnifitTM (Diba industries, UK) 크로마토그래피 컬럼 (6.6 x 450 mm)에 15.0 ± 0.2 cm BAKERBOND™ XWP 500 Poly PEI-35 다중방식의 수지를 충진하였다. 크로마토그래피 컬럼을 선택한 평형 완충제, 즉 20 mM Tris pH 9.0 (5-10 CV)으로 평형화하였다. 세포용해 후 수득한 무세포성 상층물을 전술한 평형 완충제로 완충제 교환한 다음 샘플 펌프를 사용해 크로마토그래피 컬럼에 주입하였다. 샘플을 주입한 후, 비-결합 단백질 샘플을 평형 완충제 세척 단계 (5 CV)로 제거하였다. 용출 단계는 10% 용출 완충제의 단계별 농도 구배 및 후속적인 용출 완충제 100%까지의 단계별 농도 구배를 포함하는 선택적인 염 기반의 용출 농도 구배로 구성된다. 크로마토그래피 컬럼의 산출물은 pH, 전도도 및 280, 260 및 215 nm에서 UV 검출을 통해 모니터링하였다. 도 3은 무세포성 상층물을 부분 정제하기 위한 정제 단계의 크로마토그램을 도시한다.
실시예 4
교반 플라스크 규모에서 생산된 생체내 리폴딩된 바이오시밀러 rHu 라니비주맵의 특징을 규명하기 위한 분석법 개발
생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 특징을 규명하기 위해 다양한 오르소고날 분석법 (RP-HPLC, SDS PAGE, 웨스턴 블롯팅 및 MALDI-TOF-MS)을 개발 및 최적화하였다.
(i) 단백질 샘플의 흡광 측정
세포용해 후 총 단백질 및 크로마토그래피 산출물을 280 nm에서 UV 흡광 측정을 이용해 측정하였다. 수집한 모든 분획을 280 nm에서 NanodropTM 2000 및 UV-1800 Shimadzu UV 비저블 분광광도계를 사용해 판독하였다.
(ii) rHu 라니비주맵 샘플의 SDS PAGE 분석
2가지 박테리아 균주에서 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 발현을 동정하기 위한 SDS PAGE 분석을 12% (두께 1 mm) 해리 겔을 비-환원 조건 하에 (도 4(a)), 스택킹 겔에서는 정압 100 V로, 해리 겔에서는 정압 80 V로 수행하였다. 각 샘플을 겔에 로딩하기 전에 출발 완충제에서 10분간 끓였다. 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동 분리 후, 4:1:5 (물: 빙초산: 메탄올) 혼합물 중의 0.05% (w/v) 코마시 브릴리언트 블루 G-250을 사용해 단백질을 검출하였다. 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 항체 단편은 ~48 kDa의 예상되는 이동성으로 이동하였다.
(iii) rHu 라니비주맵의 웨스턴 블롯 분석
2종의 미생물 균주로부터 수득한 부분 정제된 세포 용해물 상층물에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하여, 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 항체 단편의 존재를 검증하였다. 샘플은 단백질 마커 및 표준 물질과 함께 12% SDS-PAGE 겔에서 전술한 바와 같이 전개한 다음 니트로셀룰로스 막으로 블롯팅하였다. 블롯팅한 후, 막은 PBST 완충제 중의 5% 탈지유 첨가된 차단 완충제에서 밤새 4℃에서 차단 처리하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 정제된 1차 항체는 차단 완충제에 1:1000으로 희석하여 사용하였으며, 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션을 유지하였다. 막을 PBST 완충제 (3번)로 헹구고, HRP 접합된 염소 항-토끼 IgG (H+L)와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 막을 PBST 완충제로 (3번) 헹구고, 0.5 mg/mL DAB (다이아미노벤젠), 50% 과산화수소 및 금속 인핸서가 함유된 염색 용액, 즉 PBS 완충제 중의 니켈 암모늄 설페이트 및 코발트 클로라이드를 처리하였다. 도 6(a)는 Shuffle T7 (DE3) 및 Shuffle T7 Express (DE3)에서 발현한 부분 정제된 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵과 Innovator 라니비주맵 분자에 대한 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
(iv) rHu 라니비주맵의 역상 HPLC 분석
생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵에 대한 정량적인 및 정성적인 분석을 역상 고 성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 분석을 이용해 수행하였다. RP-HPLC 분석은 Agilent 1200 HPLC으로 운영되는 4.6 mmx250 mm AerisTM 3.6 ㎛ WIDEPORE XB-C8 컬럼 (Phenomenex, USA)을 사용해 수행하였다. RP-HPLC 데이터는 Agilent ChemStation 소프트웨어를 사용해 기록 및 분석하였다. 이동상은 0.1% (v/v) TFA / 물 (용매 A)과 0.1% (v/v) TFA, 70% (v/v) 아세토니트릴 및 20% (v/v) 이소프로필 알코올 (용매 B)로 구성된다. 유속은 파장 280 nm에서 A에서 B까지 선형적인 농도 구배를 이용해 0.5 ml/min으로 유지하였다. 도 7(a)는 Innovator 라니비주맵 및 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 RP-HPLC 크로마토그램을 도시한다.
(v) 매트릭스를 이용한 레이저 탈착/이온화 ( MALDI - TOF )( 비행 시간 질량 분광기)에 의한 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 온전한 질량 분석
생체내 리폴딩된 정제된 rHu 라니비주맵을 시나피닉산 매트릭스와 1:1 비율로 혼합하여 MALDI-TOF 분석을 수행하였다 (도 8(a)). 매트릭스 시나피닉산 (20 mg/ml)은 고 순수한 물에 용해한 50% v/v 아세토니트릴, 0.1% v/v TFA 중에서 준비하였다. 균질화된 샘플 및 매트릭스 혼합물 1 ㎕를 투명한 384 웰 MALDI 플레이트에 증착시켰다. 플레이트를 AB SCIEX TOF/TOFTM 5800 장치에 장착하고, 그 장치는 선형적인 파지티브 이온 방식으로 이용하였다. 337 nm에서의 질소 레이저를 이온화 소스로서 유지하였다. 샘플 분석에 5000 내지 6000의 레이저 강도를 적용하였다. 결과 분석은 Data Explorer® Software Version 4.11을 사용해 수행하였다.
실시예 5
화학적으로 규정된 최소 배지 및 변형된 복합 배지에서 형질전환된 Shuffle ® T7 (DE3) 및 Shuffle ® T7 Express (DE3)의 증식 카이네틱스
2가지 돌연변이 균주의 증식 특징을 하기 조성의 화학적으로 규정된 최소 배지에서 조사하였다: 4 g/L (NH4)2HPO4, 13.3 g/L KH2PO4 ,1.7 g/L 구연산 및 31.5 g/L 글리세롤, pH 6.8. 일부 배지는 121℃에서 15분간 멸균 처리하였다. EDTA (8.4 mg/L), 티아민 하이드로클로라이드 (10 mg/L) 및 MgSO4 (1.2 g/L)로 구성되는 미량 성분 (2.5 ml/L)을 자동멸균한 물에 각각 용해하고, 0.22 μ 시린지 필터를 통해 여과한 다음 직접 플라스크에 투입하였다. L 당 미량 성분의 조성은 다음과 같다: CoCl2·6H2O (2.5 mg), MnCl2·4H2O (15.0 mg), CuCl2·2H2O (1.5 mg), H3BO3 (3.0 mg), Na2MoO4·2H2O (2.5 mg), Zn (CH3COO)2·2H2O (13.0 mg) 및 Fe (III) 사이트레이트 (100 mg). Shuffle® T7 (DE3) E. coli 증식의 경우, 영양 요구 균주이므로 루신 및 이소루신을 최종 농도 50 ㎍/ml로 화학적으로 규정된 배지로 플라스크 안에 투입하였다. 도 9 및 10은 화학적으로 규정된 최소 배지 및 변형된 복합 배지 각각에서 2가지 레독스 돌연변이 균주의 증식 특징을 보여준다.
실시예 6
DoE 방식에 기반한 공정 파라미터의 최적화
Box-Behnken 설계를 이용한 반응 표면 방법 (RSM)으로, 유도-전 광학 밀도, 유도-후 온도 및 유도제 농도와 같은 다양한 공정 파라미터가 생체내 리폴딩된 재조합 rHu 라니비주맵의 질과 양에 미치는 영향을 최적화 및 파악하였다. 발현은 JMP 소프트웨어를 이용해 공식화하였다. 모든 교반 플라스크 실험은 화학적으로 규정된 최소 배지를 사용해 2세트로 수행하였으며, 단백질 수율을 RP-HPLC 분석으로 계산하였다. 3가지 파라미터를 다음과 같이 선택하였다:
· 유도-전 O.D . (균주-의존적인): 초기-로그, 중기-로그 및 후기-로그 단계.
· 유도-후 온도: 10℃, 16℃ 및 22℃.
· 유도제 농도: 0.1 mM, 0.55 mM 및 1 mM IPTG.
인자 설계를 위한 실험 16종, 축 포인트 (axial point)를 위한 실험 8종 및 센트럴 포인트 (central point)를 위한 실험 6종을 비롯한 총 30건의 실험을 수행하였다.
표 1: SHuffle ® T7 (DE3)에서 생체내 리폴딩된 재조합 라니비주맵의 발현 수준에 영향을 미치는 다양한 공정 파라미터를 최적화하기 위한 Box- Behnken 설계
유도-후 온도 유도-전 광학 밀도 유도제 농도 ( mM ) 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 발현 (mg/ L)
16 중기-로그 0.55 40.34
16 초기-로그 0.1 21.21
16 후기-로그 0.1 25.65
16 초기-로그 1 13.31
16 후기-로그 1 26.60
22 중기-로그 0.1 50.82
22 초기-로그 0.55 17.18
22 후기-로그 0.55 43.06
22 중기-로그 1 45.26
10 중기-로그 1 38.31
10 중기-로그 0.1 31.41
10 초기-로그 0.55 18.21
10 후기-로그 0.55 53.55
표 2. SHuffle ® T7 Express (DE3)에서 생체내 리폴딩된 라니비주맵의 발현 수준에 영향을 미치는 다양한 공정 파라미터를 최적화하기 위한 Box- Behnken 설계
유도-후 온도 유도-전 광학 밀도 유도제 농도 ( mM ) 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 발현 (mg/ L)
16 중기-로그 0.55 26.87
16 후기-로그 0.1 13.63
16 초기-로그 0.1 15.63
16 후기-로그 1 14.15
16 초기-로그 1 14.90
22 중기-로그 0.1 11.95
22 중기-로그 0.1 12.55
22 초기-로그 0.55 7.00
22 후기-로그 0.55 8.88
10 중기-로그 0.1 18.20
10 후기-로그 0.55 16.80
10 중기-로그 1 15.13
10 초기-로그 0.55 9.41
실시예 7
생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 발현에 대한 배지 조성물의 영향
생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵을 높은 수준으로 발현하는 최적 조건은 JMP 소프트웨어를 이용한 통계학적 분석에 기반하여 동정하였다. 용해성 단백질 발현 수준에 대한 배지 조성물의 효과를 47.6 g/L Tartoff Hobbs HiVeg Terrific 브로스 및 31.5 g/L 글리세롤로 구성된 변형된 복합 배지를 이용해 조사하였다. 화학적으로 규정된 최소 배지와 비교해 변형된 복합 배지에서 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 발현 수준이 약 1.5 내지 2배 증가된 것으로 관찰되었다 (표 3).
표 3: 변형된 복합 배지 및 화학적으로 규정된 최소 배지에서 광학 공정 조건에서의 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 발현 수준
균주 배지 유도-후 온도 유도-전 O.D. 600 유도제 농도 (mM) 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 발현 (mg/L)
SHuffle® T7 (DE3) 규정 22 중기-로그 0.55 50.82 ± 2.92
복합 22 중기-로그 0.55 85.25 ± 5.71
SHuffle® T7 Express (DE3) 규정 16 중기-로그 0.55 23.71 ± 0.82
복합 16 중기-로그 0.55 56.28 ± 2.96
실시예 8
생물반응조 규모에서 생체내 리폴딩된 재조합 인간화된 라니비주맵의 생산
교반 플라스크 규모에서 파악된 최적 조건을, E. coli SHuffle T7 (DE3) 및 SHuffle T7 Express (DE3) 균주 둘다에서, 배치 방식으로, 변형된 복합 배지를 이용해, 생물반응조 규모에서 반복 실시하였다. 생물반응조 규모의 배양은 2 L 반응조에서 30℃에서 수행하였다 (작업 부피 1 L). 4시간 된 종균 배양물 100 ml (2차 배양)을 생물반응조에 배지 900 ml에 접종하였다. 생물반응조 어셈블리는 2개의 루시톤 임펠러 (Rushton impeller), 링 스파거 (ring sparger)(마크로 스파거)로 구성되며, 반응조 온도를 유지하기 위해 외부 냉각/가열 순환기를 외부에 장착하였다. 초기 배양 조건은 다음과 같다: 초기 배양 부피 1 L, 공기 유속 0.5 vvm, 교반 300 rpm, pH ~7.0. 용존 산소 (DO)는 300 - 1000 rpm 교반 캐스케이드 및 0에서 90%까지의 O2 농화를 이용하여 공기 포화도의 30%에서 유지시켰다. pH는 15% v/v 암모니아 수용액 및 30% v/v 오르토인산을 첨가하여 ~7.0에서 조절하였다. 생물반응조에서 거품 발생은 20% v/v 소포제를 첨가하여 조절하였다. 박테리아 배양물이 광학 밀도 약 ~20.0 내지 25.0, 즉 중기-로그 단계에 도달하면, 온도를 SHuffle T7 (DE3)의 경우 22℃로, SHuffle T7 Express (DE3)의 경우에는 16℃로 냉각시켰으며, 0.55 mM IPTG로 배양물을 유도하였다. 광학 밀도 (600 nm) 및 건조 세포 중량 (DCW) 측정을 위해 샘플을 일정한 주기로 생물반응조에서 무균적으로 취하였다. 그람 염색을 수행해, 개발한 프로토콜에서 오염이 없음을 확인하였다.
실시예 10
세포용해 및 회수- 후 공정
배양액을 6000 rpm으로 10℃에서 30분간 원심분리하여 세포 바이오매스를 수득하였다. 수득된 펠렛은 세포용해 완충제 (100mM Tris, 50 mM NaCl, 5mM EDTA) 50 ml에 용해하였다. 고압 호모게나이저를 적용해 15,000 psi에서 7분간 기계적 세포 파괴를 수행하였다. 세포용해 후, 수득한 세포 용해물을 6000 rpm으로, 10℃에서 30분간 원심분리하였다. 수득한 상층 분획을 수집하여, 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵을 정제하는데 이용하였다.
실시예 11
생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 정제
생물치료 단백질과 융합 파트너로 사용하고 최종 약물 제품으로부터 이의 제거는 식의약청에서의 잠재적인 우려의 대상이다. 이를 준수하기 위해, 융합 파트너/친화성 태그의 사용은 본 실험에서 피하였으며, 용해성 분획으로 발현된 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 정제는 석출과 크로마토그래피 단계를 조합 사용하여 수행하였다.
(a) 등전점을 이용한 석출
숙주 세포 단백질에 대한 등전점을 이용한 석출을 pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 및 7.5에서 수행하였다. 세포용해 후 수득한 무세포성 상층물에 대해 50% 빙초산을 첨가해 약 60분간 교반하여 등전점에 기반한 석출을 수행하였다. 석출 후, 수득되는 분획은 6500 rpm으로 10℃에서 20분간 원심분리하였다. E. coli 숙주 세포 단백질의 최대 석출은 pH 4.0에서, pH 5.0, 6.0, 7.0 및 7.5와 비교해 관찰되었다 (도 5a 및 5b). 이들 결과를 토대로, 모든 후속적인 하위 공정의 진행은 세포용해 후 수득된 상층물을 pH 4.0에서 석출시켜 수행하였다. 석출 및 원심분리 후 수득한 상층물을 한외여과하고, 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵은 RP-HPLC 분석에서 검증된 바와 같이 체류 분획에서 주로 수집되었으며 매우 소량이 세척 분획으로 소실되었다.
(b) 한외여과
등전점에 기반한 석출 후, 상층물은 UltrasetteTM lab 접선유도 여과 장치를 분자량 컷-오프 ~5 kDa에서 사용해 20 mM Tris pH 9.0 평형화 완충제로 한외여과하였다. 한외여과를 통해 추가로 수득한 체류물을 듀얼 전략, 즉 다중방식 및 친화성 크로마토그래피의 조합으로 정제하였다.
(c) 다중방식의 크로마토그래피
한외여과 후 수득한 무세포성 상층물을 28.0 ± 0.5 cm HiTrap Desalting Sephadex G-25 수지 (GE Healthcare, USA)가 충진된 XK-26TM (GE Healthcare, US) 크로마토그래피 컬럼 (26 x 1000 mm)을 사용해 전술한 평형화 완충제로 완충제 교체하였다. OmnifitTM (Diba industries, UK) 크로마토그래피 컬럼 (6.6x450 mm)에 15.0 ± 0.2 cm BAKER BOND™ XWP 500 Poly PEI-35 다중방식의 수지를 충진하였다. 크로마토그래피 컬럼을 선택한 평형화 완충제, 즉 20 mM Tris pH 9.0 (5-10 CV)으로 평형화하였다. 그런 후, 완충제 교체 산출물을 크로마토그래피 컬럼에 샘플 펌프를 사용해 주입하였다. 샘플 로딩 후, 비결합 단백질 샘플을 평형 완충제 세척 단계 (5 CV)를 이용해 제거하였다. 용출 단계는 10% 용출 완충제의 단계별 농도 구배 및 후속적인 용출 완충제 100%까지의 단계별 농도 구배를 포함하는 선택적인 염 기반의 용출 농도 구배로 구성된다. 크로마토그래피 컬럼의 산출물은 pH, 전도도 및 280, 260 및 215 nm에서 UV 검출을 통해 모니터링하였다. 도 13은 다중방식의 크로마토그래피 조작 (단계 1)에서의 크로마토그램을 도시한다. 10% 농도 구배 단계에서 수득한 용출물은 이후 친화성 컬럼에 주입하였다.
(d) 친화성 크로마토그래피
OmnifitTM 크로마토그래피 컬럼 (6.6 x 450 mm)에 13.3 ± 0.1 cm CH1-XLTM 친화성 수지 (항체 단편의 중쇄에 대한 친화성)를 충진하였다. 크로마토그래피 컬럼을 1X 포스페이트 완충제 염수 pH 7.2 (5-10 CV)로 평형화하였다. 다중방식의 크로마토그래피 단계에서 1차 단계별 농도 구배 (10%)로부터 수득된 산물은 샘플 펌프를 사용해 이 크로마토그래피 컬럼에 주입하였다. 샘플 주입 후, 비-결합 단백질 샘플은 평형 완충제 세척 단계 (5-7 CV)를 사용해 통과시켰다. 용출 단계는 용출 완충제의 100%까지의 선택적으로 pH 기반의 단계별 농도 구배, 즉 100 mM 글리신-HCl pH 2.5로 구성된다. 용출 후 수득된 산물을 10 mM 아세테이트 완충제 pH 5.5로 완충제 교체하였다. 도 14는 친화성 크로마토그래피 조작 (단계 2)의 크로마토그램을 도시한다. CH1-XL 친화성 매트릭스를 이용한 정제는 더 높은 pH에서 결합시키고 더 낮은 pH에서 용출시키는 결합 및 용출 방식으로 수행하였으며, 최종 순도는 99.44%이었다.
실시예 12
생체내 리폴딩된 바이오시밀러 rHu 라 니비주맵의 특징을 규명하기 위한 분석법 개발
생체내 리폴딩된 정제된 바이오시밀러 rHu 라니비주맵의 특징을 규명하기 위해 다양한 오르소고날 분석법 (RP-HPLC, SDS PAGE, 웨스턴 블롯팅 및 MALDI-TOF-MS)을 수행하였다.
(a) SDS-PAGE 분석
2가지 균주를 이용해 발현된 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵의 특징을 규명하기 위한 SDS-PAGE 분석을 12% (두께 1 mm) 해리 겔을 비환원 조건 하에, 스테킹 겔에서는 정압 100 V로, 해리 겔에서는 정압 80 V로 수행하였다. 각 샘플을 겔에 로딩하기 전에 출발 완충제에서 10분간 끓였다. 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동 분리 후, 4:1:5 (물: 빙초산: 메탄올) 혼합물 중의 0.05% (w/v) 코마시 브릴리언트 블루 G-250을 사용해 단백질을 검출하였다. 레독스 돌연변이 E. coli 균주를 이용해 발현된 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵을 다양한 오르소고날 분석법을 이용해 특징을 규명하였다. 정제된 생체내 리폴딩된 항체 단편을 비-환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였으며, 코마시 블루 염색으로 검출하였다. 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵은 Innovator 라니비주맵 분자와 동일한 예상된 ~48 kDa의 이동성으로 이동하였다 (도 4c).
(b) 웨스턴 블롯 분석
2가지 균주로부터 수득한 정제된 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하여, 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 항체 단편의 존재를 검증하였다. 샘플은 단백질 마커 및 표준 물질과 함께 12% SDS-PAGE 겔에서 전술한 바와 같이 전개한 다음 니트로셀룰로스 막으로 블롯팅하였다. 블롯팅한 후, 막은 PBST 완충제 중의 5% 탈지유 첨가된 차단 완충제에서 밤새 4℃에서 차단 처리하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 정제된 1차 항체는 차단 완충제에 1:1000으로 희석하여 사용하였으며, 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션 유지하였다. 막을 PBST 완충제 (3번)로 헹구고, 차단 완충제 중에서 HRP 접합된 염소 항-토끼 IgG (H+L)와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 막에 PBST 완충제로 (3번) 헹구고, 0.5 mg/mL DAB (다이아미노벤젠), 50% 과산화수소 및 금속 인핸서가 함유된 염색 용액, 즉 PBS 완충제 중의 니켈 암모늄 설페이트 및 코발트 클로라이드를 처리하였다.
웨스턴 블롯팅 분석을 이용해, 개발된 정제 프로토콜을 이용해 정제한 단백질이 대상 단백질, 즉 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵임을 검증하였다. 정제한 단백질은 Innovator 라니비주맵 분자의 동일한 ~48 kDa에서 검출되었다 (도 6b). 웨스턴 블롯팅 프로토콜에 사용된 1차 항체는 rHu 라니비주맵에 대해 특이적으로 생성되었으며, 따라서 임의의 위 양성을 검출할 가능성은 최소화된다.
(c) 역상 HPLC 분석
생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵에 대한 정량적인 및 정성적인 분석을 역상 고 성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 분석을 이용해 수행하였다. RP-HPLC 분석은 4.6 mm x 250 mm AerisTM 3.6 ㎛ WIDEPORE XB-C8 컬럼 (Phenomenex, USA)을 사용해 수행하였다. 이동상은 0.1% (v/v) TFA / 물 (용매 A)과 0.1% (v/v) TFA, 70% (v/v) 아세토니트릴 및 20% (v/v) 이소프로필 알코올 (용매 B)로 구성된다. 유속은 파장 280 nm에서 A에서 B까지 선형적인 농도 구배를 이용해 0.5 ml/min으로 유지하였다.
비-환원 조건 하에 정제한 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 항체 단편에 대한 RP-HPLC 분석에서, Innovator 라니비주맵 분자 Lucentis (Genentech Inc., USA)와의 동조성 (conformity)이 확인되었다 (도 7(b)).
(d) 매트릭스를 이용한 레이저 탈착/이온화 ( MALDI - TOF )( 비행 시간 질량 분광기)에 의한 온전한 질량 분석
표준 및 정제한 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵을 시나피닉산 매트릭스와 1:1 비율로 혼합하여 MALDI-TOF 분석을 수행하였다. 매트릭스 시나피닉산 (20 mg/ml)은 고 순수한 물에 용해한 50% v/v 아세토니트릴, 0.1% v/v TFA 중에서 준비하였다. 균질화된 샘플 및 매트릭스 혼합물 1 ㎕를 투명한 384 웰 MALDI 플레이트에 증착시켰다. 플레이트를 AB SCIEX TOF/TOFTM 5800 장치에 장착하고, 그 장치는 선형적인 파지티브 이온 방식으로 이용하였다. 337 nm에서의 질소 레이저를 이온화 소스로서 유지하였다. 샘플 분석에 5000 내지 6000의 레이저 강도를 적용하였다. 비-환원 조건 하 정제한 생체내 리폴딩된 rHu 라니비주맵 항체 단편에 대한 MALDI-TOF MS 분석에서 Innovator 라니비주맵 분자와 동일한 ~48 kDa의 온전한 중량이 검증되었다 (도 8(b)).
표 4: 인도 특허 출원번호 201711017654에 기술된 시험관내 리폴딩된 재조합 인간화된 라니비주맵 생산 공정과 본 출원에서의 생체내 리폴딩된 재조합 인간화된 라니 비주맵의 생산 공정 간의 비교 데이터
인도 특허 출원 번호 201711017654 본 발명
소요되는 공정 시간:
상류 및 리폴딩		 9일 3일
고정 수율 30.00 ± 5.00% 45 ± 5.00%
비용 절감 NA 시험관내 리폴딩으로 인해 30.0% 비용 절감
<110> CSIR <120> Cloning and expression of in-vivo refolded antibody fragment <150> IN201911013248 <151> 2019-04-02 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 721 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 1 gagctcatat ggaagttcag ctggttgaaa gcggtggtgg tctggttcag cctggtggta 60 gcctgcgtct gagctgtgca gcaagcggtt atgattttac ccattatggt atgaattggg 120 ttcgtcaggc accgggtaaa ggtctggaat gggttggttg gattaatacc tataccggtg 180 aaccgaccta tgcagcagat tttaaacgtc gttttacctt tagcctggat accagcaaaa 240 gcaccgcata tctgcagatg aatagcctgc gtgcagagga taccgcagtg tattattgtg 300 caaaatatcc gtattattac ggcaccagcc attggtattt cgatgtttgg ggtcagggca 360 ccctggttac cgttagcagc gcaagcacca aaggtccgag cgtttttccg ctggcaccga 420 gcagcaaaag taccagcggt ggcaccgcag cactgggttg tctggttaaa gattattttc 480 cggaaccggt taccgtgagc tggaatagcg gtgcactgac cagcggtgtt catacctttc 540 cggcagttct gcagagcagc ggtctgtata gcctgagcag cgttgttacc gttccgagca 600 gcagcctggg cacccagacc tatatttgta atgttaatca taaaccgagc aataccaaag 660 tggataaaaa agtggaaccg aaaagctgcg ataaaaccca tctgtaatag ctcgagccgc 720 g 721 <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of heavy chain of Ranibizumab <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 510 514 519 524 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 529 534 539 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 544 549 554 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 559 564 569 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 574 579 584 589 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 594 599 604 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 609 614 619 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 624 629 634 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 639 644 649 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 654 659 664 669 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 674 679 684 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 689 694 699 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 704 709 714 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 719 724 729 Ser Cys Asp Lys Thr His Leu 734 739 <210> 3 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 3 gagctccatg gatattcagc tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcaa gcgttggtga 60 tcgtgttacc attacctgta gcgcaagcca ggatattagc aattatctga attggtatca 120 gcagaaaccg ggtaaagcac cgaaagtgct gatctatttt accagcagcc tgcatagcgg 180 tgttccgagc cgttttagcg gtagcggtag tggcaccgat tttaccctga ccattagcag 240 cctgcagccg gaagattttg caacctatta ttgtcagcag tatagcaccg ttccgtggac 300 ctttggtcag ggcaccaaag ttgaaattaa acgtaccgtt gcagcaccga gcgtttttat 360 ctttccgcct agtgatgaac agctgaaaag cggcaccgca agcgttgttt gtctgctgaa 420 taacttttat ccgcgtgaag caaaagttca gtggaaagtt gataatgcac tgcagagcgg 480 taatagccaa gaaagcgtta ccgaacagga tagcaaagat agcacctata gcctgagcag 540 caccctgacc ctgagcaaag cagattatga aaaacacaaa gtgtatgcct gcgaagttac 600 ccatcagggt ctgagcagtc cggttaccaa aagttttaat cgtggtgaat gctaatagaa 660 gcttggtac 669 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of Light chain of Ranibizumab <400> 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 510 514 519 524 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 529 534 539 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 544 549 554 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 559 564 569 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 574 579 584 589 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 594 599 604 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 609 614 619 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 624 629 634 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 639 644 649 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 654 659 664 669 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 674 679 684 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 689 694 699 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 704 709 714 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 719

Claims (11)

  1. 하기 단계들을 포함하는, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 용해성 형태로 발현 및 회수하는 방법:
    a. 세포질의 환원력을 위한 효소는 발현하지 않으면서, 다이설파이드 이소머라제 (disulfide isomerase)를 과다 발현하는 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는 재조합 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 구조체를 포함하는, 단계;
    b. 단계 (a)의 미생물 숙주 세포를 글리세롤을 포함하는 복합 영양 배지에서 30℃ 및 pH 7에서 배양하여 배양물을 수득하는 단계;
    c. 발현을 유도하기 위해 상기 배양물의 온도를 낮추고 배양물에 IPTG를 첨가하여, 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 포함하는 배양액을 수득하는 단계;
    d. 단계 (c)의 배양액을 원심분리하여 세포 덩어리 (cell mass)를 수득하는 단계;
    e. 단계 (d)의 상기 세포 덩어리를 파괴하여 세포 용해물을 수득하는 단계;
    f. 단계 (e)의 상기 세포 용해물을 원심분리하여, 제1 상층물을 수득하는 단계;
    g. 단계 (f)에서 수득한 제1 상층물을 pH 4.0에서 석출시킨 후 원심분리하여 제2 상층물을 수득하는 단계;
    h. 단계 (g)의 상기 제2 상층물을 한외여과하여 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 체류 분획으로 수득하는 단계;
    i. 단계 (h)의 상기 체류 분획에 대해 다중방식의 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피를 수행하여, 정제된 생체내 리폴딩된 재조합 항체 단편을 용해성 형태로 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 항체 단편이 재조합 인간 라니비주맵 (Ranibizumab)의 단편인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미생물 숙주 세포가 E. coli 숙주 세포인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 E. coli 숙주 세포가 SHuffle T7 (DE3) 및 SHuffle T7 Express (DE3) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    단계 (c)에서, 상기 배양물의 온도는 유도하는 동안 30℃에서 15℃ 내지 24℃ 범위의 온도로 냉각되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 IPTG가 0.55 mM 내지 1 mM 범위의 농도로 첨가되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 300 내지 1000 rpm 범위의 교반 및 0에서 90%까지의 O2 농화를 이용하여 공기 포화도의 30% 농도의 용존 산소 (DO)에서 수행되는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 중기-로그 단계의 증식 단계에서 ~20.0 내지 25.0 범위의 광학 밀도에서 유도하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 복합 영양 배지에서 글리세롤의 농도가 30 g/L 내지 35 g/L 범위인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 친화성 크로마토그래피가 더 높은 pH에서 결합하고 더 낮은 pH에서 용출하는 결합 및 용출 방식으로 수행되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 결합을 위한 더 높은 pH가 8.5 내지 10.5이고, 상기 용출을 위한 더 낮은 pH가 2.5 내지 4.5인, 방법.
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