JPH06113838A - ヒドロキシラーゼ、その製造方法、ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、ヒドロキシラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒドロキシラーゼ、その製造方法、ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、ヒドロキシラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体Info
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- JPH06113838A JPH06113838A JP4297654A JP29765492A JPH06113838A JP H06113838 A JPH06113838 A JP H06113838A JP 4297654 A JP4297654 A JP 4297654A JP 29765492 A JP29765492 A JP 29765492A JP H06113838 A JPH06113838 A JP H06113838A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃをＣＭＰ−ＮｅｕＧｃに
変換する酵素を単離する。また、当該酵素をコードする
遺伝子、当該酵素と特異的に反応するモノクローナル抗
体を得る。 【構成】 細胞破砕物を遠心分離して取得した細胞質画
分からタンパク質以外の夾雑物を除去した後、シトクロ
ームｂ５アフィニティーカラムを用いて分離することに
よって、細胞の可溶性分画から、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを
ＣＭＰ−ＮｅｕＧｃに変換する酵素（シチジン一リン酸
Ｎ−アセチルヒドロキシラーゼ）を単離した。該酵素の
アミノ酸配列をもとにＰＣＲプライマー又はＤＮＡプロ
ーブを合成し、該酵素をコードするＤＮＡを単離した。
また、精製した酵素を用いて、シチジン一リン酸Ｎ−ア
セチルヒドロキシラーゼに特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を製造した。
変換する酵素を単離する。また、当該酵素をコードする
遺伝子、当該酵素と特異的に反応するモノクローナル抗
体を得る。 【構成】 細胞破砕物を遠心分離して取得した細胞質画
分からタンパク質以外の夾雑物を除去した後、シトクロ
ームｂ５アフィニティーカラムを用いて分離することに
よって、細胞の可溶性分画から、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを
ＣＭＰ−ＮｅｕＧｃに変換する酵素（シチジン一リン酸
Ｎ−アセチルヒドロキシラーゼ）を単離した。該酵素の
アミノ酸配列をもとにＰＣＲプライマー又はＤＮＡプロ
ーブを合成し、該酵素をコードするＤＮＡを単離した。
また、精製した酵素を用いて、シチジン一リン酸Ｎ−ア
セチルヒドロキシラーゼに特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を製造した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はシチジン一リン酸Ｎ−ア
セチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ、その製造方法、
シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシ
ラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子の一部分を含有
し、かつ該ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮ
Ａ、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロ
キシラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体に関
する。
セチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ、その製造方法、
シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシ
ラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子の一部分を含有
し、かつ該ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮ
Ａ、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロ
キシラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体に関
する。
【０００２】
【従来の技術】マウスなどの動物細胞の糖鎖において
は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とＮ−グ
リコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）が共存している
が、通常健常人の細胞の糖鎖にはＮ−グリコリルノイラ
ミン酸（ＮｅｕＧｃ）は存在しない。ところが、ヒト細
胞であっても、ある種の癌細胞の糖鎖にはＮｅｕＧｃが
見出されることが知られている。
は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とＮ−グ
リコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）が共存している
が、通常健常人の細胞の糖鎖にはＮ−グリコリルノイラ
ミン酸（ＮｅｕＧｃ）は存在しない。ところが、ヒト細
胞であっても、ある種の癌細胞の糖鎖にはＮｅｕＧｃが
見出されることが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】図１に示すように、シ
チジン一リン酸Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＣＭＰ−
ＮｅｕＧｃ）は、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の５位のＮ−アセチル基
が水酸化されて生合成されるが、その生合成に関与する
酵素の存在は知られていなかった。
チジン一リン酸Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＣＭＰ−
ＮｅｕＧｃ）は、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の５位のＮ−アセチル基
が水酸化されて生合成されるが、その生合成に関与する
酵素の存在は知られていなかった。
【０００４】本発明の目的はＣＭＰ−ＮｅｕＧｃ生合成
に関与する酵素を精製することにある。また、本発明の
目的は該酵素をコードする遺伝子をクローニングするこ
とにある。更に、本発明の目的は、該酵素に特異的に結
合するモノクローナル抗体を製造することにある。
に関与する酵素を精製することにある。また、本発明の
目的は該酵素をコードする遺伝子をクローニングするこ
とにある。更に、本発明の目的は、該酵素に特異的に結
合するモノクローナル抗体を製造することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段及び作用】本願発明者は、
マウス細胞でＮｅｕＧｃが生成される場合には、当該Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＧｃの生成に先だってその５位のＮ−アセ
チル基を水酸化する酵素（シチジン一リン酸Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ、以下ＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃヒドロキシラーゼと記す）が発現し、この酵素によ
って１段階でヒドロキシル化が行われることを発見し
た。そして、細胞の可溶性分画からＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
ヒドロキシラーゼを精製した。
マウス細胞でＮｅｕＧｃが生成される場合には、当該Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＧｃの生成に先だってその５位のＮ−アセ
チル基を水酸化する酵素（シチジン一リン酸Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ、以下ＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃヒドロキシラーゼと記す）が発現し、この酵素によ
って１段階でヒドロキシル化が行われることを発見し
た。そして、細胞の可溶性分画からＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
ヒドロキシラーゼを精製した。
【０００６】本発明においては、この酵素の精製にあた
って、少なくともシトクロームｂ５アフィニティーカラ
ムを用いることを特徴とする。すなわち本発明において
は、細胞の可溶性分画から蛋白質以外の夾雑物を除去し
た後、シトクロームｂ５アフィニティーカラムでＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの活性を有する画分を分
画することによって、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラ
ーゼを精製することを特徴とする。
って、少なくともシトクロームｂ５アフィニティーカラ
ムを用いることを特徴とする。すなわち本発明において
は、細胞の可溶性分画から蛋白質以外の夾雑物を除去し
た後、シトクロームｂ５アフィニティーカラムでＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの活性を有する画分を分
画することによって、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラ
ーゼを精製することを特徴とする。
【０００７】また、本発明においては、精製されたＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼを切断してその断片の
アミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列を基にして合
成されたオリゴヌクレオチドをＤＮＡのプローブとして
用い、このＤＮＡプローブによりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒ
ドロキシラーゼをコードするＤＮＡをクローニングする
ことを特徴とする。更にこのＤＮＡが導入された形質転
換細胞によってＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの
大量生産が行われ、また、クローニングされたＤＮＡ
は、アンチセンス技術や遺伝子破壊技術による酵素発現
の抑制にも用いられる。
Ｐ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼを切断してその断片の
アミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列を基にして合
成されたオリゴヌクレオチドをＤＮＡのプローブとして
用い、このＤＮＡプローブによりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒ
ドロキシラーゼをコードするＤＮＡをクローニングする
ことを特徴とする。更にこのＤＮＡが導入された形質転
換細胞によってＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの
大量生産が行われ、また、クローニングされたＤＮＡ
は、アンチセンス技術や遺伝子破壊技術による酵素発現
の抑制にも用いられる。
【０００８】更に本発明においては、精製されたＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼを用いて当該ＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃヒドロキシラーゼと特異的に反応するモノクロ
ナール抗体が製造されることを特徴とする。そして、こ
のモノクロナール抗体によって、血清や摘出組織中に存
在するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの検出が行
われる。
−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼを用いて当該ＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃヒドロキシラーゼと特異的に反応するモノクロ
ナール抗体が製造されることを特徴とする。そして、こ
のモノクロナール抗体によって、血清や摘出組織中に存
在するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの検出が行
われる。
【０００９】因みに、このＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキ
シラーゼを用いることによって、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃか
ら廉価にＣＭＰ−ＮｅｕＧｃが得られる。
シラーゼを用いることによって、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃか
ら廉価にＣＭＰ−ＮｅｕＧｃが得られる。
【００１０】以下実施例として、マウス肝細胞からのＣ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの精製、ＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡのクロー
ニング、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼと特異的
に反応するモノクローナル抗体の製造を挙げるが、本願
発明の技術的範囲がこの実施例に限定されないことはい
うまでもない。
ＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの精製、ＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡのクロー
ニング、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼと特異的
に反応するモノクローナル抗体の製造を挙げるが、本願
発明の技術的範囲がこの実施例に限定されないことはい
うまでもない。
【００１１】
実施例１ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの精製 １−１ マウス肝２００ｇに４倍容の０．１ｍＭジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）を含む０．１ｍＭトリス塩酸バッファを
加え、氷冷下にホモジナイズした。ホモジネートから４
０〜６０％飽和硫安画分を取得し、濃縮・透析後、ホス
ホセルロースのオープンカラムを通し、夾雑物をカラム
に吸着させることによって除去した。各画分のタンパク
量は２８０ｎｍの吸光度で測定した。また、酵素活性は
図２に示す方法で測定した。
ール（ＤＴＴ）を含む０．１ｍＭトリス塩酸バッファを
加え、氷冷下にホモジナイズした。ホモジネートから４
０〜６０％飽和硫安画分を取得し、濃縮・透析後、ホス
ホセルロースのオープンカラムを通し、夾雑物をカラム
に吸着させることによって除去した。各画分のタンパク
量は２８０ｎｍの吸光度で測定した。また、酵素活性は
図２に示す方法で測定した。
【００１２】すなわち、細胞ホモジネートから得た酵素
分画０．５μｌを、シトクロームｂ５（５μＭ）、成分
Ｘ分画（５０μｇ／ｍｌ）、基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃ（４０μＭ）、補酵素としてＮＡＤＨ（０．７ｍ
Ｍ）、酸化防止剤としてＤＴＴ（１ｍＭ）を含む１０ｍ
Ｍトリス塩酸バッファ１０μｌに加え、３７゜Ｃで３０
分から１２０分間インキュベーションした後、氷冷エタ
ノールを加えて反応を停止させた。なお、シトクローム
ｂ５及び成分Ｘ画分は、本酵素活性を補助するために必
須な因子または画分である。これを遠心し、その上清を
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、以下
の条件で分析した。
分画０．５μｌを、シトクロームｂ５（５μＭ）、成分
Ｘ分画（５０μｇ／ｍｌ）、基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃ（４０μＭ）、補酵素としてＮＡＤＨ（０．７ｍ
Ｍ）、酸化防止剤としてＤＴＴ（１ｍＭ）を含む１０ｍ
Ｍトリス塩酸バッファ１０μｌに加え、３７゜Ｃで３０
分から１２０分間インキュベーションした後、氷冷エタ
ノールを加えて反応を停止させた。なお、シトクローム
ｂ５及び成分Ｘ画分は、本酵素活性を補助するために必
須な因子または画分である。これを遠心し、その上清を
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、以下
の条件で分析した。
【００１３】ＨＰＬＣ条件： カラム：ＯＤＳ−８０ＴＭ（直径４．６ｍｍ、長さ２５
０ｍｍ、東ソー） 溶離液：５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、 流速：０．５ｍｍ／ｍｉｎ 分析装置：ポンプ；ＳＰ８７００（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐ
ｈｉｓｉｃｓ社） 検出器；ＵＶＩＤＥＣ（日本分光） レコーダ；ＣＲ５Ａ（島津製作所） 検出波長；２７１ｎｍ 定量法：ピーク面積比法 このＨＰＬＣのクロマトグラムを図３に示した。２本の
ピークが検出され、それらの溶出位置はＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃ及びＣＭＰ−ＮｅｕＧｃの標準品の溶出位置と一致
した。基質であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＧｃへの変換率は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ及びＣＭＰ−
ＮｅｕＧｃのピーク面積の比より定量化した。変換率の
計算式を以下に示す。
０ｍｍ、東ソー） 溶離液：５０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、 流速：０．５ｍｍ／ｍｉｎ 分析装置：ポンプ；ＳＰ８７００（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐ
ｈｉｓｉｃｓ社） 検出器；ＵＶＩＤＥＣ（日本分光） レコーダ；ＣＲ５Ａ（島津製作所） 検出波長；２７１ｎｍ 定量法：ピーク面積比法 このＨＰＬＣのクロマトグラムを図３に示した。２本の
ピークが検出され、それらの溶出位置はＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃ及びＣＭＰ−ＮｅｕＧｃの標準品の溶出位置と一致
した。基質であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＧｃへの変換率は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ及びＣＭＰ−
ＮｅｕＧｃのピーク面積の比より定量化した。変換率の
計算式を以下に示す。
【００１４】変換率（％）＝（ＣＭＰ−ＮｅｕＧｃの面
積）×１００／（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの面積＋ＣＭＰ−
ＮｅｕＧｃの面積） また、１ユニットは１分間に１μモルのＣＭＰ−Ｎｅｕ
ＡｃをＣＭＰ−ＮｅｕＧｃに変換する酵素量として定義
した。分画ごとの測定値を図４に示した。ホスホセルロ
ースカラムの溶出条件は下記の通りである。
積）×１００／（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの面積＋ＣＭＰ−
ＮｅｕＧｃの面積） また、１ユニットは１分間に１μモルのＣＭＰ−Ｎｅｕ
ＡｃをＣＭＰ−ＮｅｕＧｃに変換する酵素量として定義
した。分画ごとの測定値を図４に示した。ホスホセルロ
ースカラムの溶出条件は下記の通りである。
【００１５】カラム；Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ Ｐ１１（ガラスカラム）（直径５０ｍｍ、長
さ２５０ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ） 溶離液； （１）スターティングバッファ（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂ
ｕｆｆｅｒ）組成 １２．５％ グリセロール ０．１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバ
ッファ ｐＨ＝７．０ （２）イリューションバッファ（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕ
ｆｆｅｒ）組成 前記スターティングバッファにさらに０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを加えたもの １画分の量；２００ｍｌ／ｆｒ． ホスホセルロースカラムを通したところ、吸光度、変換
活性共に溶出量２リットルまでの画分で高くなってい
た。
ｈａｔｅ Ｐ１１（ガラスカラム）（直径５０ｍｍ、長
さ２５０ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ） 溶離液； （１）スターティングバッファ（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂ
ｕｆｆｅｒ）組成 １２．５％ グリセロール ０．１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバ
ッファ ｐＨ＝７．０ （２）イリューションバッファ（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕ
ｆｆｅｒ）組成 前記スターティングバッファにさらに０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを加えたもの １画分の量；２００ｍｌ／ｆｒ． ホスホセルロースカラムを通したところ、吸光度、変換
活性共に溶出量２リットルまでの画分で高くなってい
た。
【００１６】１−２ ホスホセルロースカラムの溶出画分のうち活性を有する
溶出量２リットルまでの画分を、ＤＥＡＥ−セファロー
スカラムにかけ、リニア・グラジエント法で分画し、各
画分の吸光度を２８０ｎｍで測定した。各画分より０．
５μｌをとって変換活性を測定した。結果を図５に示し
た。ＤＥＡＥ−セファロースカラムの溶出条件は以下の
通りである。
溶出量２リットルまでの画分を、ＤＥＡＥ−セファロー
スカラムにかけ、リニア・グラジエント法で分画し、各
画分の吸光度を２８０ｎｍで測定した。各画分より０．
５μｌをとって変換活性を測定した。結果を図５に示し
た。ＤＥＡＥ−セファロースカラムの溶出条件は以下の
通りである。
【００１７】カラム；ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂ（直径５０ｍｍ、長さ１６０ｍｍ） 分析装置：ＦＰＬＣシステム（ファルマシア） 検出波長；２８０ｎｍ 溶離液； （１）スターティングバッファ組成 ５０ｍＭ ＮａＣｌ １２．５％ グリセロール ０．１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸バッファ
ｐＨ＝７．５ （２）図７中点ＡからＢの間に、ＮａＣｌ濃度を５０ｍ
Ｍから０．２Ｍへとリニアに変化させるリニア・グラジ
エントをかけ、活性画分を溶出させた。点Ｂにおいて、
塩濃度を１Ｍ ＮａＣｌまで急速に上げ、残存タンパク
を溶出した。
ＣＬ−６Ｂ（直径５０ｍｍ、長さ１６０ｍｍ） 分析装置：ＦＰＬＣシステム（ファルマシア） 検出波長；２８０ｎｍ 溶離液； （１）スターティングバッファ組成 ５０ｍＭ ＮａＣｌ １２．５％ グリセロール ０．１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸バッファ
ｐＨ＝７．５ （２）図７中点ＡからＢの間に、ＮａＣｌ濃度を５０ｍ
Ｍから０．２Ｍへとリニアに変化させるリニア・グラジ
エントをかけ、活性画分を溶出させた。点Ｂにおいて、
塩濃度を１Ｍ ＮａＣｌまで急速に上げ、残存タンパク
を溶出した。
【００１８】図５には、ＤＥＡＥセファロースカラムの
溶出プロファイルを、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＣＭＰ−
ＮｅｕＧｃへの変換率と、２８０ｎｍの吸光度で示し
た。前記変換率のプロファイルより、溶出量５リットル
から６．５リットルの間に前記変換活性が高いことが示
された。
溶出プロファイルを、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＣＭＰ−
ＮｅｕＧｃへの変換率と、２８０ｎｍの吸光度で示し
た。前記変換率のプロファイルより、溶出量５リットル
から６．５リットルの間に前記変換活性が高いことが示
された。
【００１９】１−３ ＤＥＡＥ−セファロースカラムから溶出された溶出量５
リットルから６．５リットル間の変換活性が高い画分を
回収して、レッド−セファロースカラムにかけた。ステ
ップ・グラジエント法で分画し、各画分のタンパク量を
定量し、各画分より０．５μｌをとって変換活性の測定
を行った。ＤＥＡＥ−セファロースカラムの溶出プロフ
ァイルを図６に示す。タンパク量は、ＢＣＡプロテイン
・アッセイ・キットで測定した。レッド−セファロース
カラムの溶出条件は以下の通りであった。
リットルから６．５リットル間の変換活性が高い画分を
回収して、レッド−セファロースカラムにかけた。ステ
ップ・グラジエント法で分画し、各画分のタンパク量を
定量し、各画分より０．５μｌをとって変換活性の測定
を行った。ＤＥＡＥ−セファロースカラムの溶出プロフ
ァイルを図６に示す。タンパク量は、ＢＣＡプロテイン
・アッセイ・キットで測定した。レッド−セファロース
カラムの溶出条件は以下の通りであった。
【００２０】カラム；レッド−セファロースカラム（直
径２５ｍｍ，長さ６０ｍｍ） ポンプ；ペリスタポンプ（アトー） 溶離液；図８中、点Ａ、Ｂでバッファを以下のように切
り換えた。
径２５ｍｍ，長さ６０ｍｍ） ポンプ；ペリスタポンプ（アトー） 溶離液；図８中、点Ａ、Ｂでバッファを以下のように切
り換えた。
【００２１】（１）スターティングバッファ組成 ７０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸バッファ
ｐＨ＝７．５ （２）点Ａで１９０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸バッファｐＨ＝７．５に切り換えた。
ｐＨ＝７．５ （２）点Ａで１９０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸バッファｐＨ＝７．５に切り換えた。
【００２２】（３）点Ｂで４０μＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡ
ｃ、１９０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸バ
ッファ ｐＨ＝７．５に切り換えた。
ｃ、１９０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸バ
ッファ ｐＨ＝７．５に切り換えた。
【００２３】流速；０．１１〜０．３３ｍｌ／ｍｉｎ １画分の量；１０ｍｌ／ｆｒ． インジェクション量；１００ｍｌ 図６に示した溶出プロファイルより、前記酵素の変換率
は、溶出量４００ｍｌから６００ｍｌの間で高くなって
いた。
は、溶出量４００ｍｌから６００ｍｌの間で高くなって
いた。
【００２４】１−４ レッド−セファロースカラムから溶出された溶出量４０
０ｍｌから６００ｍｌの間の変換活性が高い画分を回収
し、シトクロームｂ５アフィニティーカラムで分画を行
った。シトクロームｂ５アフィニティーカラムは、ウマ
血清より精製した（Ｙａｓｕｎｏｒｉ Ｋｏｚｕｔｓｕ
ｍｉ，ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，４２
９−４３５（１９９１））シトクロームｂ５を、臭化シ
アン活性化セファロース（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に固定化して、作製した。分
画ごとのタンパク量と前記変換活性を測定した。レッド
セファロースカラムの溶出プロファイルを図７（ａ）に
示す。タンパク量は、ＢＣＡプロテイン・アッセイ・キ
ットで測定した。シトクロームｂ５アフィニティーカラ
ムでの溶出条件は以下の通りであった。
０ｍｌから６００ｍｌの間の変換活性が高い画分を回収
し、シトクロームｂ５アフィニティーカラムで分画を行
った。シトクロームｂ５アフィニティーカラムは、ウマ
血清より精製した（Ｙａｓｕｎｏｒｉ Ｋｏｚｕｔｓｕ
ｍｉ，ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，４２
９−４３５（１９９１））シトクロームｂ５を、臭化シ
アン活性化セファロース（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に固定化して、作製した。分
画ごとのタンパク量と前記変換活性を測定した。レッド
セファロースカラムの溶出プロファイルを図７（ａ）に
示す。タンパク量は、ＢＣＡプロテイン・アッセイ・キ
ットで測定した。シトクロームｂ５アフィニティーカラ
ムでの溶出条件は以下の通りであった。
【００２５】カラム；シトクロームｂ５アフィニティー
カラム（直径９ｍｍ，長さ４４ｍｍ） 溶離液；０．１ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含む１０ｍ
Ｍトリス塩酸バッファｐＨ＝７．５ 分析装置：ＦＰＬＣシステム（ファルマシア） 流速；０．０５ｍｌ／ｍｉｎ １画分の量；０．８ｍｌ／ｆｒ． インジェクション量；０．２２ｍｌ 図７（ａ）に示した溶出プロファイルでは、活性部分は
溶出量４−１０ｍｌの部分に集中していることが認めら
れた。
カラム（直径９ｍｍ，長さ４４ｍｍ） 溶離液；０．１ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含む１０ｍ
Ｍトリス塩酸バッファｐＨ＝７．５ 分析装置：ＦＰＬＣシステム（ファルマシア） 流速；０．０５ｍｌ／ｍｉｎ １画分の量；０．８ｍｌ／ｆｒ． インジェクション量；０．２２ｍｌ 図７（ａ）に示した溶出プロファイルでは、活性部分は
溶出量４−１０ｍｌの部分に集中していることが認めら
れた。
【００２６】活性ピークを５．１５％グラジエントゲル
によるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）で分離したところ、図７（ｂ）に示されるような
６５Ｋダルトンの単一バンドを示し、前記酵素が単一の
タンパクとして精製されたことが示され、その精製標品
の比活性は６．８Ｕ／ｍｇであった。
によるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）で分離したところ、図７（ｂ）に示されるような
６５Ｋダルトンの単一バンドを示し、前記酵素が単一の
タンパクとして精製されたことが示され、その精製標品
の比活性は６．８Ｕ／ｍｇであった。
【００２７】１−５ 精製標品の等電点を以下の方法で測定した。条件は以下
の通りである。
の通りである。
【００２８】ゲル及びゲル濃度； ５％ アクリルアミド ２％ アンフォライト（ｐＩ４〜６．５） １２．５％ グリセロール ５０μＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ をＴＥＭＥＤと過硫酸アンモニウムで重合させて調製し
た。
た。
【００２９】泳動条件；２００Ｖ 細い帯状のレクタンゲルに試料をチャージして、等電点
電気泳動を行った後、各レーンを５ｍｍずつ切り出し、
断片を作成した。各断片それぞれに、１００μｌの溶出
液（０．１ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、１２．５％ グ
リセロールを含む０．２Ｍトリス塩酸バッファ、ｐＨ＝
７．５）を加え、一夜静置してゲル内のタンパクを溶出
させた。タンパク溶出後、それぞれの活性を測定した。
活性ピークの位置と、並行して泳動したｐＩマーカー
（バイオラッド）の泳動位置との比較より、図８に示す
ごとくｐＩは４．６５〜５．１の間であると結論され
た。
電気泳動を行った後、各レーンを５ｍｍずつ切り出し、
断片を作成した。各断片それぞれに、１００μｌの溶出
液（０．１ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、１２．５％ グ
リセロールを含む０．２Ｍトリス塩酸バッファ、ｐＨ＝
７．５）を加え、一夜静置してゲル内のタンパクを溶出
させた。タンパク溶出後、それぞれの活性を測定した。
活性ピークの位置と、並行して泳動したｐＩマーカー
（バイオラッド）の泳動位置との比較より、図８に示す
ごとくｐＩは４．６５〜５．１の間であると結論され
た。
【００３０】１−６ 前記酵素の熱安定性を以下の試験にて調べた。
【００３１】試料としては、ＤＥＡＥセファロースカラ
ムで分画した粗精製画分を用いた。基本バッファとし
て、１０ｍＭトリス塩酸バッファを使用し、ＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃ、ＣＭＰ、ＮｅｕＡｃ、グリセロールの酵素活
性の失活阻止作用を検討した。
ムで分画した粗精製画分を用いた。基本バッファとし
て、１０ｍＭトリス塩酸バッファを使用し、ＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃ、ＣＭＰ、ＮｅｕＡｃ、グリセロールの酵素活
性の失活阻止作用を検討した。
【００３２】試料約３０μＵを、基本バッファ、或いは
各試薬を図９に示した終濃度となるように加えた基本バ
ッファに溶かし、試料溶液量を４０μｌとした。これを
２０μｌずつ二つに分け、一方のみ加熱処理を行った。
熱処理の条件は、基本バッファのみを用いたときに、前
記酵素活性が５０％失活する条件として、５５゜Ｃ・１
０分と設定した。５５゜Ｃで１０分間処理を行った加熱
試料溶液を氷冷し、その１／１０量をとって、図２に従
ってアッセイを行った。加熱処理を行っていない試料溶
液も、同様にアッセイを行った。
各試薬を図９に示した終濃度となるように加えた基本バ
ッファに溶かし、試料溶液量を４０μｌとした。これを
２０μｌずつ二つに分け、一方のみ加熱処理を行った。
熱処理の条件は、基本バッファのみを用いたときに、前
記酵素活性が５０％失活する条件として、５５゜Ｃ・１
０分と設定した。５５゜Ｃで１０分間処理を行った加熱
試料溶液を氷冷し、その１／１０量をとって、図２に従
ってアッセイを行った。加熱処理を行っていない試料溶
液も、同様にアッセイを行った。
【００３３】加熱に対する前記酵素の安定性は以下の式
により表した。
により表した。
【００３４】熱安定性（％）＝熱処理後の試料溶液の酵
素活性×１００／未処理の試料溶液の酵素活性 図９に示したように、基本バッファでは５５゜Ｃ・１０
分の処理で試料溶液の酵素活性に約５０％の失活が見ら
れたが、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃまたはグリセロールを加え
た場合酵素活性の失活が阻止され、これらの化合物が酵
素の安定化作用を持つことが示されたが、ＣＭＰのみあ
るいはＮｅｕＡｃのみを加えても、酵素の失活は阻止さ
れなかった。失活阻止の程度はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの濃
度に依存した。
素活性×１００／未処理の試料溶液の酵素活性 図９に示したように、基本バッファでは５５゜Ｃ・１０
分の処理で試料溶液の酵素活性に約５０％の失活が見ら
れたが、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃまたはグリセロールを加え
た場合酵素活性の失活が阻止され、これらの化合物が酵
素の安定化作用を持つことが示されたが、ＣＭＰのみあ
るいはＮｅｕＡｃのみを加えても、酵素の失活は阻止さ
れなかった。失活阻止の程度はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの濃
度に依存した。
【００３５】その他、図示はしていないが各種の界面活
性剤、食塩、ＮＡＤＨ、フラビン、ＤＴＴ等についても
検討したが、いずれも酵素の失活阻止活性を示さなかっ
た。
性剤、食塩、ＮＡＤＨ、フラビン、ＤＴＴ等についても
検討したが、いずれも酵素の失活阻止活性を示さなかっ
た。
【００３６】１−７ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃに対するＫM 値は、精製酵素２１ｎ
ｇ／ｍｌを用いて以下のように求めた。ＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃの終濃度を図１０に示したように変化させて、図２
に示したアッセイを行った。ただし、シトクロームｂ５
を節約するため、シトクロームｂ５の添加量を通常の１
／５とし、反応時間を１０分ないし３０分とした。結果
を図１０に示した。
ｇ／ｍｌを用いて以下のように求めた。ＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃの終濃度を図１０に示したように変化させて、図２
に示したアッセイを行った。ただし、シトクロームｂ５
を節約するため、シトクロームｂ５の添加量を通常の１
／５とし、反応時間を１０分ないし３０分とした。結果
を図１０に示した。
【００３７】横軸にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ濃度を、縦軸に
反応の初速度をプロットしたところ、通常のミカエリス
ーメンテン型の飽和曲線を示した。イーディ・ホフステ
ィ・プロット（図１０中の囲みの中に示す）を行い、Ｋ
M 値を求めると５．０μＭであった。
反応の初速度をプロットしたところ、通常のミカエリス
ーメンテン型の飽和曲線を示した。イーディ・ホフステ
ィ・プロット（図１０中の囲みの中に示す）を行い、Ｋ
M 値を求めると５．０μＭであった。
【００３８】実施例２ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシ
ラーゼをコードするＤＮＡのクローニング ２−１ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの精製標品約６〜
１２μｇ（０．１〜０．２ｎｍｏｌ）を０．１％ラウリ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に対して透析して塩を除去
し、タンパクシークエンサ４７０Ａ（アプライド・バイ
オ・システムズ（ＡＢＩ）社）にかけて、Ｎ末の４０個
のアミノ酸の配列を決定した。決定されたアミノ酸の配
列を図１１に示す。
ラーゼをコードするＤＮＡのクローニング ２−１ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの精製標品約６〜
１２μｇ（０．１〜０．２ｎｍｏｌ）を０．１％ラウリ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に対して透析して塩を除去
し、タンパクシークエンサ４７０Ａ（アプライド・バイ
オ・システムズ（ＡＢＩ）社）にかけて、Ｎ末の４０個
のアミノ酸の配列を決定した。決定されたアミノ酸の配
列を図１１に示す。
【００３９】２−２ タンパク質のリシン残基部分を選択的に切断するため、
タンパク質をいくつかのペプチドに分解するリシルエン
ドペプチダーゼを使用した。まず、本酵素の精製標品約
４５μｇ（０．７ｎｍｏｌ）を８Ｍ尿素で処理し変性さ
せた後、０．１５Ｍトリス塩酸バッファｐＨ９．０で５
倍希釈し、０．４μｇのリシルエンドペプチダーゼ（ｌ
ｙｓｙｌ ｅｎｄｏ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を作用さ
せ、３７゜Ｃで一夜処理し（反応体積０．２ｍｌ）、本
酵素をいくつかのペプチドに分解した（図１２
（ａ））。図１２（ｂ）には、リシルエンドペプチダー
ゼ処理後のこれらのペプチドを逆相カラムで分画した結
果を示した。これらピークのうち、１４個について、Ａ
ＢＩ社のタンパクシークエンサにかけてアミノ酸配列を
決定した。決定されたアミノ酸配列の内２つを、図１３
及び図１４にそれぞれＭＺ２２とＭＺ２８として示し
た。
タンパク質をいくつかのペプチドに分解するリシルエン
ドペプチダーゼを使用した。まず、本酵素の精製標品約
４５μｇ（０．７ｎｍｏｌ）を８Ｍ尿素で処理し変性さ
せた後、０．１５Ｍトリス塩酸バッファｐＨ９．０で５
倍希釈し、０．４μｇのリシルエンドペプチダーゼ（ｌ
ｙｓｙｌ ｅｎｄｏ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を作用さ
せ、３７゜Ｃで一夜処理し（反応体積０．２ｍｌ）、本
酵素をいくつかのペプチドに分解した（図１２
（ａ））。図１２（ｂ）には、リシルエンドペプチダー
ゼ処理後のこれらのペプチドを逆相カラムで分画した結
果を示した。これらピークのうち、１４個について、Ａ
ＢＩ社のタンパクシークエンサにかけてアミノ酸配列を
決定した。決定されたアミノ酸配列の内２つを、図１３
及び図１４にそれぞれＭＺ２２とＭＺ２８として示し
た。
【００４０】２−３ 前記ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列から予想される塩
基配列を二つのペプチドの下に示した（図１３及び図１
４）。ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下
ＰＣＲと略す）を用いてＤＮＡの増幅を行うため、図１
３及び図１４中の比較的縮重度の低い部分についてプラ
イマーを合成した。ＨＺ２２の部分についてセンス・プ
ライマー（ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）であるプライマ
ー２（６４通りの混合プライマー）を、同様にＭＺ２８
の部分についてアンチ・センス・プライマー（ａｎｔｉ
−ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）であるプライマーＣ，プ
ライマーＤ（プライマーＣについては４８通り、プライ
マーＤについては９６通りの混合プライマー）を作成し
た（図１３及び図１４）。マウスの肝臓のｃＤＮＡを鋳
型として、ＰＣＲ法によってプライマー２とプライマー
Ｃ及びプライマー２とプライマーＤとの間のｃＤＮＡを
それぞれ増幅させ、その塩基配列を決定した。増幅に用
いた反応条件は図１５に示す。
基配列を二つのペプチドの下に示した（図１３及び図１
４）。ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下
ＰＣＲと略す）を用いてＤＮＡの増幅を行うため、図１
３及び図１４中の比較的縮重度の低い部分についてプラ
イマーを合成した。ＨＺ２２の部分についてセンス・プ
ライマー（ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）であるプライマ
ー２（６４通りの混合プライマー）を、同様にＭＺ２８
の部分についてアンチ・センス・プライマー（ａｎｔｉ
−ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）であるプライマーＣ，プ
ライマーＤ（プライマーＣについては４８通り、プライ
マーＤについては９６通りの混合プライマー）を作成し
た（図１３及び図１４）。マウスの肝臓のｃＤＮＡを鋳
型として、ＰＣＲ法によってプライマー２とプライマー
Ｃ及びプライマー２とプライマーＤとの間のｃＤＮＡを
それぞれ増幅させ、その塩基配列を決定した。増幅に用
いた反応条件は図１５に示す。
【００４１】図１７には、図１６に示されるプライマー
２とプライマーＣ、およびプライマー２とプライマーＤ
の組み合わせで増幅されたＤＮＡの２％アガロースゲル
電気泳動像を示した。サイズマーカーとしては、λ−Ｅ
ｃｏＴ１４Ｉ（Ｔａｋａｒａ）を用い、１２０Ｖ定電圧
で４５分間泳動を行い、エチジウムブロマイド（ｅｔｈ
ｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）によりＤＮＡを染色して
検出した。マウス脳のｃＤＮＡをネガティブコントロー
ルとした。なお、本願発明者は、マウス脳細胞ではＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼが発現しないことを見
いだしている。図１７に示したバンドのうち、矢印のつ
いていないバンドは脳でも現れているか、プライマーＤ
だけを用いた増幅でも現れているので、非特異的なバン
ドであり、その他の矢印の２本のバンドが、目的とする
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼをコードするＤＮ
Ａ断片である。
２とプライマーＣ、およびプライマー２とプライマーＤ
の組み合わせで増幅されたＤＮＡの２％アガロースゲル
電気泳動像を示した。サイズマーカーとしては、λ−Ｅ
ｃｏＴ１４Ｉ（Ｔａｋａｒａ）を用い、１２０Ｖ定電圧
で４５分間泳動を行い、エチジウムブロマイド（ｅｔｈ
ｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）によりＤＮＡを染色して
検出した。マウス脳のｃＤＮＡをネガティブコントロー
ルとした。なお、本願発明者は、マウス脳細胞ではＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼが発現しないことを見
いだしている。図１７に示したバンドのうち、矢印のつ
いていないバンドは脳でも現れているか、プライマーＤ
だけを用いた増幅でも現れているので、非特異的なバン
ドであり、その他の矢印の２本のバンドが、目的とする
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼをコードするＤＮ
Ａ断片である。
【００４２】これらのＤＮＡ断片のうちサイズの大きい
断片について塩基配列を決定した。塩基配列の決定は図
１８に示した方法により行った。
断片について塩基配列を決定した。塩基配列の決定は図
１８に示した方法により行った。
【００４３】決定されたＭＺ２２とＭＺ２８に挟まれる
領域のアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列（プライ
マー部分を除いて１２３ｂｐ、４１アミノ酸）を図１９
に示す。この１２３ｂｐの塩基配列をもとに合成した複
合プライマーと、ポリＡテイル（ｐｏｌｙ Ａ ｔａｉ
ｌ）にハイブリダイズするオリゴｄＴプライマーを用い
て、同様にしてＰＣＲ法によりＣ末側のｃＤＮＡを増幅
し、約７００ｂｐのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラー
ゼのＣ末側をコードするＤＮＡ断片を得た。
領域のアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列（プライ
マー部分を除いて１２３ｂｐ、４１アミノ酸）を図１９
に示す。この１２３ｂｐの塩基配列をもとに合成した複
合プライマーと、ポリＡテイル（ｐｏｌｙ Ａ ｔａｉ
ｌ）にハイブリダイズするオリゴｄＴプライマーを用い
て、同様にしてＰＣＲ法によりＣ末側のｃＤＮＡを増幅
し、約７００ｂｐのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラー
ゼのＣ末側をコードするＤＮＡ断片を得た。
【００４４】さらに、ここで得られた１２３ｂｐの塩基
配列をもとに合成した複合プライマーと、図１４に示し
たＮ末のアミノ酸配列から予想される塩基配列に基づい
て合成した複合プライマーを用いて、ＰＣＲ法でＮ末側
ｃＤＮＡを増幅し約１．５ＫｂｐのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
ヒドロキシラーゼのＮ末側をコードするＤＮＡ断片を得
た。
配列をもとに合成した複合プライマーと、図１４に示し
たＮ末のアミノ酸配列から予想される塩基配列に基づい
て合成した複合プライマーを用いて、ＰＣＲ法でＮ末側
ｃＤＮＡを増幅し約１．５ＫｂｐのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
ヒドロキシラーゼのＮ末側をコードするＤＮＡ断片を得
た。
【００４５】さらに、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラ
ーゼをコードするＤＮＡのスタートコドンと、図１１に
示したＮ末のアミノ酸配列から予想される塩基配列に基
づいて合成した複合プライマーとで挟まれる領域のＤＮ
Ａは、判明したＮ末のアミノ酸配列とオプティマルコド
ンをもとに合成した。
ーゼをコードするＤＮＡのスタートコドンと、図１１に
示したＮ末のアミノ酸配列から予想される塩基配列に基
づいて合成した複合プライマーとで挟まれる領域のＤＮ
Ａは、判明したＮ末のアミノ酸配列とオプティマルコド
ンをもとに合成した。
【００４６】これらの方法によりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒ
ドロキシラーゼのコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ ｒ
ｅｇｉｏｎ）全体約２．３ＫｂｐにわたってＤＮＡを単
離した。
ドロキシラーゼのコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ ｒ
ｅｇｉｏｎ）全体約２．３ＫｂｐにわたってＤＮＡを単
離した。
【００４７】２−４ マウス肝臓より常法に従い、ｍＲＮＡを単離した。これ
にウイルス由来の逆転写酵素を作用させて、ｃＤＮＡを
得た。さらに、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨ、及びＤＮＡ
ポリメラーゼを作用させ、二本鎖ＤＮＡを調整した。こ
のＤＮＡにＥｃｏＲＩアダプターを付加した後、λｇｔ
１０ベクターのＥｃｏＲＩ部位に組み込んだ。こうして
得られたリコンビナントベクターを用いてλファージを
再構成しｃＤＮＡライブラリーとした。
にウイルス由来の逆転写酵素を作用させて、ｃＤＮＡを
得た。さらに、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨ、及びＤＮＡ
ポリメラーゼを作用させ、二本鎖ＤＮＡを調整した。こ
のＤＮＡにＥｃｏＲＩアダプターを付加した後、λｇｔ
１０ベクターのＥｃｏＲＩ部位に組み込んだ。こうして
得られたリコンビナントベクターを用いてλファージを
再構成しｃＤＮＡライブラリーとした。
【００４８】上記のように作成したλｇｔ１０ライブラ
リーを１シャーレあたり約２×１０1 個になるようにま
き、プラークを形成させニトロセルロース膜に転写し
た。次に、ＰＣＲで得られた１２３ｂｐのｃＤＮＡ断片
をランダムプライマー法を用いて32Ｐで標識してプロー
ブとし、既に得たニトロセルロース膜に対して情報に従
ったプラークハイブリダイゼーション行った。全部で２
×１０6 個のファージをスクリーニングして３個の陽性
クローンを得、λｍＺ -１，λｍＺ -２，λｍＺ-３と
した。これらのクローンの内、最も長いインサートを有
するλｍＺ -２についてそのＤＮＡ配列を決定したとこ
ろ、予想されるＮｅｕＡｃのオープンリーディングフレ
ームのすべてを含有していた。
リーを１シャーレあたり約２×１０1 個になるようにま
き、プラークを形成させニトロセルロース膜に転写し
た。次に、ＰＣＲで得られた１２３ｂｐのｃＤＮＡ断片
をランダムプライマー法を用いて32Ｐで標識してプロー
ブとし、既に得たニトロセルロース膜に対して情報に従
ったプラークハイブリダイゼーション行った。全部で２
×１０6 個のファージをスクリーニングして３個の陽性
クローンを得、λｍＺ -１，λｍＺ -２，λｍＺ-３と
した。これらのクローンの内、最も長いインサートを有
するλｍＺ -２についてそのＤＮＡ配列を決定したとこ
ろ、予想されるＮｅｕＡｃのオープンリーディングフレ
ームのすべてを含有していた。
【００４９】実施例３ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシ
ラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体の製造 ３−１ モノクローナル抗体は梅田らの方法（実験医学第６巻１
０号（１９８８））に従い、以下のようにして作製し
た。
ラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体の製造 ３−１ モノクローナル抗体は梅田らの方法（実験医学第６巻１
０号（１９８８））に従い、以下のようにして作製し
た。
【００５０】精製酵素約１００μｌをニトロセルロース
膜に直接吸着させた。
膜に直接吸着させた。
【００５１】免疫動物としては、１０〜１２週齢のウィ
スターラットを用い、ネンブタール原液（５０ｍｇ／ｍ
ｌ）を１５０〜２００μｌを腹腔内に投与した。
スターラットを用い、ネンブタール原液（５０ｍｇ／ｍ
ｌ）を１５０〜２００μｌを腹腔内に投与した。
【００５２】抗原溶液は、上記のようにタンパクを吸着
させたニトロセルロースをはさみで細切後にホモジナイ
ズして懸濁液とし、この０．２ｍｌを脾内投与した。５
〜１０μｇ／ラットの抗原量で最初の免疫後２６日目、
３０日目に２度ブーストし、免疫グロブリン（ＩｇＧ）
を形成させた。
させたニトロセルロースをはさみで細切後にホモジナイ
ズして懸濁液とし、この０．２ｍｌを脾内投与した。５
〜１０μｇ／ラットの抗原量で最初の免疫後２６日目、
３０日目に２度ブーストし、免疫グロブリン（ＩｇＧ）
を形成させた。
【００５３】このＩｇＧを用いて、ハイブリドーマを作
製した。ミエローマ細胞としては、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３を使用した。脾細胞浮游液に予め洗浄してお
いたミエローマを脾細胞と１：１０の割合で加え、５０
％ポリエチレングリコールで細胞を集めた後に９６ウェ
ルプレートに２００μｌ／ウェルずつまき、５％ＣＯ2
インキュベータ中３７゜Ｃで培養した。１０〜１４日
後、コロニーが肉眼で観察されるようになった後、ＥＬ
ＩＳＡにより抗体のスクリーニングを行った。以上の操
作により、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼと特異
的に反応するモノクローナル抗体が得られた。
製した。ミエローマ細胞としては、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３を使用した。脾細胞浮游液に予め洗浄してお
いたミエローマを脾細胞と１：１０の割合で加え、５０
％ポリエチレングリコールで細胞を集めた後に９６ウェ
ルプレートに２００μｌ／ウェルずつまき、５％ＣＯ2
インキュベータ中３７゜Ｃで培養した。１０〜１４日
後、コロニーが肉眼で観察されるようになった後、ＥＬ
ＩＳＡにより抗体のスクリーニングを行った。以上の操
作により、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼと特異
的に反応するモノクローナル抗体が得られた。
【００５４】ニトロセルロース膜上では、上記の抗原は
変性した状態にあるため、通常より免疫原性が高く、ま
た、ウェスタン・ブロットを行った際にＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃヒドロキシラーゼと特異的に反応する選択性の高い
抗体が得られた。
変性した状態にあるため、通常より免疫原性が高く、ま
た、ウェスタン・ブロットを行った際にＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃヒドロキシラーゼと特異的に反応する選択性の高い
抗体が得られた。
【００５５】３−２ 本酵素のｃＤＮＡの全長及びその一部をベクターに組み
込んで大腸菌に導入し、本酵素タンパク及びその一部を
発現させた。これらを抗原として動物を免疫し、３−１
と同様の方法により、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラ
ーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体を得た。
込んで大腸菌に導入し、本酵素タンパク及びその一部を
発現させた。これらを抗原として動物を免疫し、３−１
と同様の方法により、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラ
ーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体を得た。
【００５６】なお、上記実施例１に記載の方法と同様な
方法によって、様々な生物種のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒド
ロキシラーゼを単離することが可能である。
方法によって、様々な生物種のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒド
ロキシラーゼを単離することが可能である。
【００５７】また、上記実施例２によって得られたＤＮ
Ａ断片をプローブとして様々な生物種のＤＮＡライブリ
ーをスクリーニングすることにより様々な生物種のＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼをコードするＣＭＰ−
ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼする遺伝子がクローニング
できる。また、本実施例で得られたＤＮＡをプローブと
して用いれば、ノーザンブロッティングによる分析で容
易に癌細胞の検出ができる可能性がある。癌細胞でＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼが発現していれば、対
応するメッセンジャーＲＮＡが製造されているのに対
し、通常の細胞はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼ
が発現しておらず、対応するメッセンジャーＲＮＡが製
造されていないからである。
Ａ断片をプローブとして様々な生物種のＤＮＡライブリ
ーをスクリーニングすることにより様々な生物種のＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼをコードするＣＭＰ−
ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼする遺伝子がクローニング
できる。また、本実施例で得られたＤＮＡをプローブと
して用いれば、ノーザンブロッティングによる分析で容
易に癌細胞の検出ができる可能性がある。癌細胞でＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼが発現していれば、対
応するメッセンジャーＲＮＡが製造されているのに対
し、通常の細胞はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼ
が発現しておらず、対応するメッセンジャーＲＮＡが製
造されていないからである。
【００５８】また、本発明によってＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
ヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡがクローニングさ
れたため、アンチセンス技術や細胞の遺伝子破壊技術に
用いるＤＮＡを容易に作成できる。そして、アンチセン
ス技術や細胞の遺伝子破壊技術を用いてＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃヒドロキシラーゼの発現を抑え、ＣＭＰ−ＮｅｕＡ
ｃヒドロキシラーゼを産生しない培養細胞を作成し、糖
鎖のデザインを行うことができる。
ヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡがクローニングさ
れたため、アンチセンス技術や細胞の遺伝子破壊技術に
用いるＤＮＡを容易に作成できる。そして、アンチセン
ス技術や細胞の遺伝子破壊技術を用いてＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃヒドロキシラーゼの発現を抑え、ＣＭＰ−ＮｅｕＡ
ｃヒドロキシラーゼを産生しない培養細胞を作成し、糖
鎖のデザインを行うことができる。
【００５９】更に、上記実施例３で得られる抗体や抗血
清を用いて、患者の血清や摘出組織中に存在するＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの検出を感度良く行うこ
とができる。
清を用いて、患者の血清や摘出組織中に存在するＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの検出を感度良く行うこ
とができる。
【００６０】
【発明の効果】以上のように本発明によって得られるＣ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼを用いて従来ＣＴＰ
とＮｅｕＧｃから合成されていたＣＭＰ−ＮｅｕＧｃ
を、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを原料として廉価に合成するこ
とができる。
ＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼを用いて従来ＣＴＰ
とＮｅｕＧｃから合成されていたＣＭＰ−ＮｅｕＧｃ
を、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを原料として廉価に合成するこ
とができる。
【００６１】さらに、本発明により得られる抗体や抗血
清を利用することにより、所定の癌の早期発見を行うこ
とも可能となる。
清を利用することにより、所定の癌の早期発見を行うこ
とも可能となる。
【００６２】また、本発明で得られるＤＮＡにより、容
易に遺伝子診断を行うことができると共に、アンチセン
ス技術または細胞の遺伝子破壊技術による発現の抑制
や、これに伴う糖鎖デザインを行うことも可能となる。
易に遺伝子診断を行うことができると共に、アンチセン
ス技術または細胞の遺伝子破壊技術による発現の抑制
や、これに伴う糖鎖デザインを行うことも可能となる。
【図１】基質であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが水酸化されて
ＣＭＰ−ＮｅｕＧｃが生産される反応を示す図である。
ＣＭＰ−ＮｅｕＧｃが生産される反応を示す図である。
【図２】前記酵素のアッセイ法を示す図である。
【図３】基質であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを水酸化してＣ
ＭＰ−ＮｅｕＧｃを産生させたときの、ＨＰＬＣ分析の
クロマトグラムである。
ＭＰ−ＮｅｕＧｃを産生させたときの、ＨＰＬＣ分析の
クロマトグラムである。
【図４】ホスホセルロースカラムＰ１１を用いたときの
クロマトグラムを示した図である。
クロマトグラムを示した図である。
【図５】ＤＥＡＥーセファロースカラムを用いたときの
クロマトグラムを示した図である。
クロマトグラムを示した図である。
【図６】レッドーセファロースカラムを用いたときのク
ロマトグラムを示した図である。
ロマトグラムを示した図である。
【図７】図７（ａ）は、シトクロームｂ５アフィニティ
ーカラムを用いたときのクロマトグラムを示した図であ
り、図７（ｂ）はシトクロームｂ５アフィニティーカラ
ムを用いたときのポリアクリルアミドゲル電気泳動結果
を示した写真である。
ーカラムを用いたときのクロマトグラムを示した図であ
り、図７（ｂ）はシトクロームｂ５アフィニティーカラ
ムを用いたときのポリアクリルアミドゲル電気泳動結果
を示した写真である。
【図８】ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの変換率
（％）と標準ｐＩマーカーの移動位置で決定したｐＩを
示した図である。
（％）と標準ｐＩマーカーの移動位置で決定したｐＩを
示した図である。
【図９】ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの熱安定
性を調べた結果を示した図である。
性を調べた結果を示した図である。
【図１０】ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの熱安
定性に対するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ濃度の影響を調べた結
果を示した図である。グラフの囲み中は、イーディ・ホ
フスティ・プロットである。
定性に対するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ濃度の影響を調べた結
果を示した図である。グラフの囲み中は、イーディ・ホ
フスティ・プロットである。
【図１１】ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼのＮ末
のアミノ酸配列及び対応する塩基配列を示した図であ
る。
のアミノ酸配列及び対応する塩基配列を示した図であ
る。
【図１２】リシルエンドペプチダーゼによるＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃヒドロキシラーゼ精製製品の限定加水分解の手
順（ａ）とその限定加水分解産物のＨＰＬＣ分析結果
（ｂ）とを示した図である。
ｅｕＡｃヒドロキシラーゼ精製製品の限定加水分解の手
順（ａ）とその限定加水分解産物のＨＰＬＣ分析結果
（ｂ）とを示した図である。
【図１３】ＭＺ２２のアミノ酸配列及び対応ＤＮＡ配列
を示した図である。
を示した図である。
【図１４】ＭＺ２８のアミノ酸配列及び対応ＤＮＡ配列
を示した図である。
を示した図である。
【図１５】ＰＣＲ法の反応条件を示した図である。
【図１６】ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼ全長に
対応するＰＣＲプライマーの位置を示した図である。
対応するＰＣＲプライマーの位置を示した図である。
【図１７】肝臓及び脳のプライマー２とプライマーＣ、
プライマー２とプライマーＤとを用い、ＰＣＲ法で増幅
させたときに発現された前記酵素のＤＮＡ断片の電気泳
動の結果を示す図である。
プライマー２とプライマーＤとを用い、ＰＣＲ法で増幅
させたときに発現された前記酵素のＤＮＡ断片の電気泳
動の結果を示す図である。
【図１８】シークエンシングの手順を示した図である。
【図１９】ＰＣＲ法で使用したプライマー部分とそれら
のプライマー部分の間で増幅されたＤＮＡの塩基配列を
示した図である。
のプライマー部分の間で増幅されたＤＮＡの塩基配列を
示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 川野 武弘 千葉県習志野市津田沼３−16−14−501 (72)発明者 小堤 保則 京都市右京区嵯峨朝日町11−１ ルミエー ル嵐山311
Claims (5)
- 【請求項１】 シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の５位のＮ−アセチル基を
水酸化し、Ｎ−グリコリル基に変換するシチジン一リン
酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ。 - 【請求項２】 下記の工程を含むことを特徴とするシチ
ジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラー
ゼの製造方法、 １）細胞破砕物を遠心分離し、細胞質画分を分離する工
程、 ２）細胞質画分から蛋白質以外の夾雑物を除去する工
程、 ３）少なくともシトクロームｂ５アフィニティーカラム
を用いて、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸
ヒドロキシラーゼの活性を有する画分を分画する工程。 - 【請求項３】 シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡ。 - 【請求項４】 シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の少なくとも
一部分を含有し、かつシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノ
イラミン酸ヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡと特異
的にハイブリダイズするＤＮＡ。 - 【請求項５】 シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸ヒドロキシラーゼと特異的に反応するモノクローナ
ル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4297654A JPH06113838A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | ヒドロキシラーゼ、その製造方法、ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、ヒドロキシラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4297654A JPH06113838A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | ヒドロキシラーゼ、その製造方法、ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、ヒドロキシラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113838A true JPH06113838A (ja) | 1994-04-26 |
Family
ID=17849395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4297654A Pending JPH06113838A (ja) | 1992-10-08 | 1992-10-08 | ヒドロキシラーゼ、その製造方法、ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、ヒドロキシラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06113838A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0752474A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| WO1997003200A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for cmp-n-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| US7368284B2 (en) | 2003-06-06 | 2008-05-06 | University Of Pittsburgh | Porcine CMP-N-Acetylneuraminic acid hydroxylase gene |
-
1992
- 1992-10-08 JP JP4297654A patent/JPH06113838A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0752474A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| WO1997003200A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for cmp-n-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| US7368284B2 (en) | 2003-06-06 | 2008-05-06 | University Of Pittsburgh | Porcine CMP-N-Acetylneuraminic acid hydroxylase gene |
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