JP2813982B2 - 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素 - Google Patents
癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素Info
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- JP2813982B2 JP2813982B2 JP1004476A JP447689A JP2813982B2 JP 2813982 B2 JP2813982 B2 JP 2813982B2 JP 1004476 A JP1004476 A JP 1004476A JP 447689 A JP447689 A JP 447689A JP 2813982 B2 JP2813982 B2 JP 2813982B2
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- Japan
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- cancer
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- galactosyltransferase
- mab4880
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、癌患者に由来する新規なガラクトース転移
酵素に関する。本発明のガラストース転移酵素は癌患者
に多く検出されるので腫瘍マーカーとして使用すること
ができる。従って、本発明のガラクトース転移酵素に対
するモノクローナル抗体は癌診断薬として用いることが
でき、本発明のガラクトース転移酵素はこのモノクロー
ナル抗体を製造する際の試薬としての用途を有する。
酵素に関する。本発明のガラストース転移酵素は癌患者
に多く検出されるので腫瘍マーカーとして使用すること
ができる。従って、本発明のガラクトース転移酵素に対
するモノクローナル抗体は癌診断薬として用いることが
でき、本発明のガラクトース転移酵素はこのモノクロー
ナル抗体を製造する際の試薬としての用途を有する。
［従来の技術］ ガラクトース転移酵素（ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ（以下、GTと言うことがある））は、ウリジンジホ
スホガラクトース（UDP−ガラクトース）から種々の糖
蛋白質のオリゴ糖や単糖類の非還元残基へのガラクトー
ス転移を触媒する酵素であり、ほとんど全ての組織に存
在する。このGTの異常な活性が種々の悪性腫瘍で認めら
れ、腫瘍マーカーとしてのGTの研究が行なわれた。その
結果、GTのアイソザイムであるGT−IIの血清中の量が癌
の存在と密接な関係にあることが発見された。このGT−
IIは、Biochem.Biophys.Res.Common、65（２）、545−5
51、1975に記載されている通り、Native−PAGEにおいて
正常人に主として存在するGT−Ｉに比較して移動度の小
さい、GT酵素活性を有するバンドを定義したものであ
る。また、該GT−IIに対するモノクローナル抗体として
MAb3872が報告されている（Cancer Research、48、5325
−5334、1988）が、GT−IIの本質についてはいまだ明ら
かになっていない。
ーゼ（以下、GTと言うことがある））は、ウリジンジホ
スホガラクトース（UDP−ガラクトース）から種々の糖
蛋白質のオリゴ糖や単糖類の非還元残基へのガラクトー
ス転移を触媒する酵素であり、ほとんど全ての組織に存
在する。このGTの異常な活性が種々の悪性腫瘍で認めら
れ、腫瘍マーカーとしてのGTの研究が行なわれた。その
結果、GTのアイソザイムであるGT−IIの血清中の量が癌
の存在と密接な関係にあることが発見された。このGT−
IIは、Biochem.Biophys.Res.Common、65（２）、545−5
51、1975に記載されている通り、Native−PAGEにおいて
正常人に主として存在するGT−Ｉに比較して移動度の小
さい、GT酵素活性を有するバンドを定義したものであ
る。また、該GT−IIに対するモノクローナル抗体として
MAb3872が報告されている（Cancer Research、48、5325
−5334、1988）が、GT−IIの本質についてはいまだ明ら
かになっていない。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、腫瘍マーカーとして感度良く測定す
ることができる新規なガラストース転移酵素を提供する
ことである。
ることができる新規なガラストース転移酵素を提供する
ことである。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、GT−IIの本質について更に究明した結
果、癌に特異性を持つGTが存在し、GT−IIとして、Nati
ve−PAGEに認められるバンドはその一現像にすぎず、GT
−Ｉのバンド、原点にも一部この癌特異性を持つGTが混
在していることを見出し、本発明を完成した。すなわ
ち、本発明の新規GTは、これまで言及されてきたGT−II
としての性質を一部包含すると共に、下記に限定されて
いるようなその本質となる物性を有する。
果、癌に特異性を持つGTが存在し、GT−IIとして、Nati
ve−PAGEに認められるバンドはその一現像にすぎず、GT
−Ｉのバンド、原点にも一部この癌特異性を持つGTが混
在していることを見出し、本発明を完成した。すなわ
ち、本発明の新規GTは、これまで言及されてきたGT−II
としての性質を一部包含すると共に、下記に限定されて
いるようなその本質となる物性を有する。
すなわち、本発明者らは、鋭意研究の結果、癌患者腹
水から検出され、正常人からはほとんど検出されない、
正常人に主として存在するガラクトース転移酵素とは異
なる癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素を見出し本発
明を完成した。
水から検出され、正常人からはほとんど検出されない、
正常人に主として存在するガラクトース転移酵素とは異
なる癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素を見出し本発
明を完成した。
すなわち、本発明は、癌患者腹水よりα−ラクトアル
ブミンアガロースアフィニティクロマトグラフィーによ
り精製され、SDS−PAGE還元条件下電気泳動で約５万の
分子量を示し、ネイティブの状態でMAb4880と反応性が
あり、一部自己会合しており、加熱還元処理によりMAb4
880との反応性が増大すると共に自己会合が亢進してゲ
ルろ過クロマトグラフィーで分子量20万以上の分画に検
出される癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素を提供す
る。
ブミンアガロースアフィニティクロマトグラフィーによ
り精製され、SDS−PAGE還元条件下電気泳動で約５万の
分子量を示し、ネイティブの状態でMAb4880と反応性が
あり、一部自己会合しており、加熱還元処理によりMAb4
880との反応性が増大すると共に自己会合が亢進してゲ
ルろ過クロマトグラフィーで分子量20万以上の分画に検
出される癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素を提供す
る。
［発明の具体的説明］ 本発明のガラクトース転移酵素は、下記実施例に詳細
に記載するように、癌患者の腹水、例えば卵巣癌患者の
腹水からCancer Research 48巻、5325頁、1988年に記載
の方法に従い、α−ラクトアルブミンアフィニティーク
ロマトグラフィーにより正常人のGTと同様にして精製す
ることができる。もっとも、本発明のガラクトース転移
酵素は、卵巣癌患者に限らず、子宮癌、大腸癌、肺癌、
膵臓癌、食道癌、肝臓癌等の癌患者にも存在し、また、
腹水に限らず、血清その他の体液中にも存在する。
に記載するように、癌患者の腹水、例えば卵巣癌患者の
腹水からCancer Research 48巻、5325頁、1988年に記載
の方法に従い、α−ラクトアルブミンアフィニティーク
ロマトグラフィーにより正常人のGTと同様にして精製す
ることができる。もっとも、本発明のガラクトース転移
酵素は、卵巣癌患者に限らず、子宮癌、大腸癌、肺癌、
膵臓癌、食道癌、肝臓癌等の癌患者にも存在し、また、
腹水に限らず、血清その他の体液中にも存在する。
本発明のガラクトース転移酵素は、下記実施例に具体
的に記載するように、２−メルカプトエタノール処理後
のSDS−PAGE還元条件下電気泳動で約５万の分子量を示
す。この分子量は正常人由来のガラクトース転移酵素と
同じである。
的に記載するように、２−メルカプトエタノール処理後
のSDS−PAGE還元条件下電気泳動で約５万の分子量を示
す。この分子量は正常人由来のガラクトース転移酵素と
同じである。
本発明のガラクトース転移酵素は、ネイティブの状態
で卵巣癌腹水から精製されたGTを抗原とするモノクロー
ナル抗体であるMAb4880（文献:Cancer Research、48
巻、5325頁、1988）と反応性を有する。MAb4800を産生
するハイブリドーマは工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託され、その受託番号はBP−1758である。MAb4880
との反応性は、下記実施例に詳細に示すように標識した
MAb4880を用いたウェスタンブロット法により確認する
ことができる。
で卵巣癌腹水から精製されたGTを抗原とするモノクロー
ナル抗体であるMAb4880（文献:Cancer Research、48
巻、5325頁、1988）と反応性を有する。MAb4800を産生
するハイブリドーマは工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託され、その受託番号はBP−1758である。MAb4880
との反応性は、下記実施例に詳細に示すように標識した
MAb4880を用いたウェスタンブロット法により確認する
ことができる。
また、本発明のガラクトース転移酵素はネイティブの
状態で一部自己会合している。すなわち、同一タンパク
質の分子間の相互作用によって結合している状態であ
り、分子量としては整数倍として検出される。その結合
はいわゆる共有結合ではなく特定の条件下では解離する
ことがある。このことは、上記したウェスタンブロット
法により確認することができる。
状態で一部自己会合している。すなわち、同一タンパク
質の分子間の相互作用によって結合している状態であ
り、分子量としては整数倍として検出される。その結合
はいわゆる共有結合ではなく特定の条件下では解離する
ことがある。このことは、上記したウェスタンブロット
法により確認することができる。
本発明のガラクトース転移酵素はまた、加熱還元処
理、例えば10mM 2−メルカプトエタノール処理により、
MAb4880との反応性が増大する。これは、下記実施例に
詳細に記載するように、還元処理後のSDS−PAGE及びMAb
4880を抗原として用いたウェスタンブロット法により確
認することができる。
理、例えば10mM 2−メルカプトエタノール処理により、
MAb4880との反応性が増大する。これは、下記実施例に
詳細に記載するように、還元処理後のSDS−PAGE及びMAb
4880を抗原として用いたウェスタンブロット法により確
認することができる。
また、本発明のガラクトース転移酵素は、上記加熱還
元処理により自己会合が亢進してゲルろ過クロマトグラ
フィーで分子量20万以上の分画に検出されるようにな
る。
元処理により自己会合が亢進してゲルろ過クロマトグラ
フィーで分子量20万以上の分画に検出されるようにな
る。
本発明のガラクトース転移酵素は、正常人由来の正常
ガラクトース転移酵素と基質及び作用が同じである。す
なわち、 UDPガラクトース＋受容体−−→ ガラクトース−受容体＋UDP （ただし、受容体は、Ｎ−アセチルグルコサミン又は非
還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有するオリゴ
糖、糖タンパク、糖脂質）の反応を触媒する。また、そ
の至適pH又は安定pH範囲も正常ヒトガラクトース転移酵
素と同じくpH6.0〜8.0である。
ガラクトース転移酵素と基質及び作用が同じである。す
なわち、 UDPガラクトース＋受容体−−→ ガラクトース−受容体＋UDP （ただし、受容体は、Ｎ−アセチルグルコサミン又は非
還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有するオリゴ
糖、糖タンパク、糖脂質）の反応を触媒する。また、そ
の至適pH又は安定pH範囲も正常ヒトガラクトース転移酵
素と同じくpH6.0〜8.0である。
本発明のガラクトース転移酵素は、癌患者に多く存在
するので、腫瘍マーカーとして用いることができる。従
って、本発明のガラクトース転移酵素に対するモノクロ
ーナル抗体は癌診断薬として用いることができ、本発明
のガラクトース転移酵素はこのモノクローナル抗体を製
造する際の試薬としての用途を有する。
するので、腫瘍マーカーとして用いることができる。従
って、本発明のガラクトース転移酵素に対するモノクロ
ーナル抗体は癌診断薬として用いることができ、本発明
のガラクトース転移酵素はこのモノクローナル抗体を製
造する際の試薬としての用途を有する。
［発明の効果］ 本発明により、腫瘍マーカーとして用いることができ
る新規なヒトガラストース転移酵素が提供された。本発
明のガラクトース転移酵素を抗原として用いてモノクロ
ーナル抗体を作製することにより、新規な癌診断薬を提
供することができる。
る新規なヒトガラストース転移酵素が提供された。本発
明のガラクトース転移酵素を抗原として用いてモノクロ
ーナル抗体を作製することにより、新規な癌診断薬を提
供することができる。
［実施例］ 本発明を下記実施例に基づいてより具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に制限されるもので
はない。
る。もっとも、本発明は下記実施例に制限されるもので
はない。
実施例１ 卵巣患者腹水１及び正常人プール血清２をそれぞ
れCancer Research 48巻、5325頁、1988年に記載の方法
に従い、α−ラクトアルブミンアフィニティークロマト
グラフィーにより精製し、ガラクトース転移酵素1.1ml
及び0.8mlをそれぞれ得た。すなわち、腹水又は血清を
精製水で４℃一晩透析後、不溶物を遠心して取り除きト
リスバッファー（pH7.2）、マンガンクロライド（MnC
l2）、Ｎ−アセチルグルコサミンをそれぞれ20mM、10m
M、5mMになるように加えα−ラクトアルブミンアフィニ
ティカラム（2.5cm×50cm）に流した。上記バッファ−
１でカラムを洗浄した後、Ｎ−アセチルグルコサミン
を含まないバッファで溶出を行ないGT画分を得た。得ら
れたGT画分は更にα−ラクトアルブミンアフィニティー
カラムで同様に操作を行ないさらに精製した。こうして
得られたGT画分は免疫グロブリンを除去する為に抗−ヒ
トIgGアガロースカラム（0.5×3cm）を通した後濃縮し
た。得られた癌患者由来GT及び正常人由来GTのタンパク
質濃度はそれぞれ0.8mg/ml、0.5mg/mlであった。得られ
た癌患者由来ガラクトース及び正常人由来ガラクトース
それぞれ10μｌは、ドデシル硫酸ナトリウム（以下SDS
と言う）及び２−メルカプトエタノールで処理後、10cm
×10cmのスラブゲル（（株）第一化学薬品社製）を用い
て４〜20％SDS−PAGEを下記の条件で行ない銀染色し
た。
れCancer Research 48巻、5325頁、1988年に記載の方法
に従い、α−ラクトアルブミンアフィニティークロマト
グラフィーにより精製し、ガラクトース転移酵素1.1ml
及び0.8mlをそれぞれ得た。すなわち、腹水又は血清を
精製水で４℃一晩透析後、不溶物を遠心して取り除きト
リスバッファー（pH7.2）、マンガンクロライド（MnC
l2）、Ｎ−アセチルグルコサミンをそれぞれ20mM、10m
M、5mMになるように加えα−ラクトアルブミンアフィニ
ティカラム（2.5cm×50cm）に流した。上記バッファ−
１でカラムを洗浄した後、Ｎ−アセチルグルコサミン
を含まないバッファで溶出を行ないGT画分を得た。得ら
れたGT画分は更にα−ラクトアルブミンアフィニティー
カラムで同様に操作を行ないさらに精製した。こうして
得られたGT画分は免疫グロブリンを除去する為に抗−ヒ
トIgGアガロースカラム（0.5×3cm）を通した後濃縮し
た。得られた癌患者由来GT及び正常人由来GTのタンパク
質濃度はそれぞれ0.8mg/ml、0.5mg/mlであった。得られ
た癌患者由来ガラクトース及び正常人由来ガラクトース
それぞれ10μｌは、ドデシル硫酸ナトリウム（以下SDS
と言う）及び２−メルカプトエタノールで処理後、10cm
×10cmのスラブゲル（（株）第一化学薬品社製）を用い
て４〜20％SDS−PAGEを下記の条件で行ない銀染色し
た。
泳動用バッファー:25mMトリス、192mMグリシン0.1％SDS
（pH8.4） 泳動ミリアンペア:60mA定電流 泳動時間:1時間 その結果、癌患者由来ガラクトース及び正常人由来ガ
ラクトースは共に分子量48,000〜55,000に分布するバン
ドを有し、その他の不純物のバンドは見られなかった。
（pH8.4） 泳動ミリアンペア:60mA定電流 泳動時間:1時間 その結果、癌患者由来ガラクトース及び正常人由来ガ
ラクトースは共に分子量48,000〜55,000に分布するバン
ドを有し、その他の不純物のバンドは見られなかった。
一方、SDS−PAGE後、銀染色を行なう代わりにProc.Na
tl.Acad.Sci.USA 76,4350（1979）に記載されたウェス
タンブロットを行なった。このウェスタンブロットにお
いて、検出するための抗体としてMAb4880のホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼ（HRP）標識体を用いた。そ
の結果、上記銀染色に相当するバンドのみが検出された
が、癌患者由来ガラクトース転移酵素は正常人由来ガラ
クトース転移酵素より非常に強く発色した。
tl.Acad.Sci.USA 76,4350（1979）に記載されたウェス
タンブロットを行なった。このウェスタンブロットにお
いて、検出するための抗体としてMAb4880のホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼ（HRP）標識体を用いた。そ
の結果、上記銀染色に相当するバンドのみが検出された
が、癌患者由来ガラクトース転移酵素は正常人由来ガラ
クトース転移酵素より非常に強く発色した。
以上の結果、本発明のガラクトース転移酵素は正常人
のそれと同様α−ラクトアルブミンアフィニティクロマ
トマトグラフィーにより精製され、SDS−PAGE還元条件
下で約５万の分子量を有することが分かった。
のそれと同様α−ラクトアルブミンアフィニティクロマ
トマトグラフィーにより精製され、SDS−PAGE還元条件
下で約５万の分子量を有することが分かった。
実施例２ 実施例１で精製された癌患者由来及び正常人由来のガ
ラクトース転移酵素それぞれ10μｌを10cm×10cmスラブ
ゲル（（株）第一化学薬品社製）を用いて４〜15％Nati
ve−PAGEを下記の条件で行ない銀染色した。
ラクトース転移酵素それぞれ10μｌを10cm×10cmスラブ
ゲル（（株）第一化学薬品社製）を用いて４〜15％Nati
ve−PAGEを下記の条件で行ない銀染色した。
泳動用バッファー:25mMトリス、192mMグリシン（pH8.
4） 泳動ミリアンペア:30mA定電流 泳動時間:2時間 その結果、癌患者由来ガラクトース転移酵素はRf値0.
3〜0.5のブロードなバンドと原点からRf値約0.3のテー
リングしたバンドが認められた。また、正常人由来ガラ
クトース転移酵素はRf値約0.3〜0.5に相当するバンドは
認められたが原点からRf値約0.3に及ぶバンドはトレー
ス量であった。
4） 泳動ミリアンペア:30mA定電流 泳動時間:2時間 その結果、癌患者由来ガラクトース転移酵素はRf値0.
3〜0.5のブロードなバンドと原点からRf値約0.3のテー
リングしたバンドが認められた。また、正常人由来ガラ
クトース転移酵素はRf値約0.3〜0.5に相当するバンドは
認められたが原点からRf値約0.3に及ぶバンドはトレー
ス量であった。
一方、上記電気泳動において、銀染色する代わりにゲ
ル（個々の試料レーン）を0.25cmの幅にカットし、それ
ぞれ１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液（以
下PBSと言う）100μｌに４℃、１晩浸漬した。この浸漬
液50μｌをMAb4880をコーティングしたポリスチレンビ
ーズ及びPBS200μｌと37℃、２時間インキュベートした
後、ビーズをPBSで３回洗浄しHRPで標識してMAb4880
（以下MAb4880−HRPと言う）を加えて室温で２時間反応
させた。反応後、ビーズをPBSで４回洗浄し、基質とし
てｏ−フェニレンジアミンを加えて発色させ波長492nm
における吸光度を測定した（MAb4880サンドイッチアッ
セイ）。結果を図１に示す。
ル（個々の試料レーン）を0.25cmの幅にカットし、それ
ぞれ１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液（以
下PBSと言う）100μｌに４℃、１晩浸漬した。この浸漬
液50μｌをMAb4880をコーティングしたポリスチレンビ
ーズ及びPBS200μｌと37℃、２時間インキュベートした
後、ビーズをPBSで３回洗浄しHRPで標識してMAb4880
（以下MAb4880−HRPと言う）を加えて室温で２時間反応
させた。反応後、ビーズをPBSで４回洗浄し、基質とし
てｏ−フェニレンジアミンを加えて発色させ波長492nm
における吸光度を測定した（MAb4880サンドイッチアッ
セイ）。結果を図１に示す。
以上の結果、本発明の８ガラクトース転移酵素は、Na
tive−PAGE下ではその一部が自己会合して高分子化した
状態にあることが分かった。
tive−PAGE下ではその一部が自己会合して高分子化した
状態にあることが分かった。
実施例３ 実施例１で精製された癌患者由来及び正常人由来のガ
ラクトース転移酵素はそれぞれ10mM2−メルカプトエタ
ノールで80℃、３分間処理した後、実施例２と同様にし
て４〜15％Native−PAGEを行ない銀染色した。癌患者由
来ガラクトース転移酵素は実施例２で見られたような原
点からRf値0.3に及ぶテーリング域はほとんど消失し、
代わって原点付近にバンドが認められた。Rf値約0.3〜
0.5のブロードなバンドはやや銀染色濃度は低下したが
ほぼ実施例２と同様に認められた。正常人由来のガラク
トース転移酵素は、原点付近にトレース量のバンドを認
めたが実施例２と比べてほとんど変化はなかった。
ラクトース転移酵素はそれぞれ10mM2−メルカプトエタ
ノールで80℃、３分間処理した後、実施例２と同様にし
て４〜15％Native−PAGEを行ない銀染色した。癌患者由
来ガラクトース転移酵素は実施例２で見られたような原
点からRf値0.3に及ぶテーリング域はほとんど消失し、
代わって原点付近にバンドが認められた。Rf値約0.3〜
0.5のブロードなバンドはやや銀染色濃度は低下したが
ほぼ実施例２と同様に認められた。正常人由来のガラク
トース転移酵素は、原点付近にトレース量のバンドを認
めたが実施例２と比べてほとんど変化はなかった。
実施例２及び上記２−メルカプトエタノール処理後の
ゲルを、実施例１と同様にウェスタンブロットし、MAb4
880−HRPにより染色した。実施例２でのNative−PAGEか
らのブロットは、癌由来ガラクトース転移酵素、正常人
由来ガラクトース転移酵素共に銀染色と同様のパターン
を示した。２−メルカプトエタノール処理したサンプル
でのNative−PAGEからのブロットでは、癌由来ガラクト
ース転移酵素は原点からテーリングしたバンドのみ染色
された。正常人由来ガラクトース転移酵素は原点がわず
かに染色されただけであった。
ゲルを、実施例１と同様にウェスタンブロットし、MAb4
880−HRPにより染色した。実施例２でのNative−PAGEか
らのブロットは、癌由来ガラクトース転移酵素、正常人
由来ガラクトース転移酵素共に銀染色と同様のパターン
を示した。２−メルカプトエタノール処理したサンプル
でのNative−PAGEからのブロットでは、癌由来ガラクト
ース転移酵素は原点からテーリングしたバンドのみ染色
された。正常人由来ガラクトース転移酵素は原点がわず
かに染色されただけであった。
以上の結果から、本発明で得た癌患者由来ガラクトー
ス転移酵素は２−メルカプトエタノール処理により自己
会合により進み高分子化すること、またMAb4880との結
合反応性が著しく高くなり、一方正常人に主に存在する
ガラクトースとMAb4880との反応性は低下することが分
かった。
ス転移酵素は２−メルカプトエタノール処理により自己
会合により進み高分子化すること、またMAb4880との結
合反応性が著しく高くなり、一方正常人に主に存在する
ガラクトースとMAb4880との反応性は低下することが分
かった。
実施例４ 実施例１で精製された癌患者由来及び正常人由来のガ
ラクトース転移酵素はそれぞれ10mM2−メルカプトエタ
ノールで80℃で３分間処理後、又は未処理のまま、10倍
ないし約7000倍に１％BSA・PBSで希釈し、MAb4880を用
いて実施例２と同様にしてサンドイッチアッセイを行な
った。
ラクトース転移酵素はそれぞれ10mM2−メルカプトエタ
ノールで80℃で３分間処理後、又は未処理のまま、10倍
ないし約7000倍に１％BSA・PBSで希釈し、MAb4880を用
いて実施例２と同様にしてサンドイッチアッセイを行な
った。
結果を図２に示す。図２中、曲線１は癌患者由来ガラ
クトース転移酵素、曲線２は２−メルカプトエタノール
加熱処理した癌患者由来ガラクトース転移酵素、曲線３
は正常人由来ガラクトース転移酵素、曲線４は２−メル
カプトエタノール加熱処理した正常人由来ガラクトース
転移酵素についての結果を示す。
クトース転移酵素、曲線２は２−メルカプトエタノール
加熱処理した癌患者由来ガラクトース転移酵素、曲線３
は正常人由来ガラクトース転移酵素、曲線４は２−メル
カプトエタノール加熱処理した正常人由来ガラクトース
転移酵素についての結果を示す。
以上の結果、２−メルカプトエタノール処理により本
発明のガラクトース転移酵素のMAb4880サンドイッチア
ッセイの検出感度は飛躍的に向上し、正常人血清中にも
僅かに存在するが、癌患者腹水中には多量に存在するこ
とが分かった。
発明のガラクトース転移酵素のMAb4880サンドイッチア
ッセイの検出感度は飛躍的に向上し、正常人血清中にも
僅かに存在するが、癌患者腹水中には多量に存在するこ
とが分かった。
実施例５ 実施例４で得られたサンドイッチアッセイ用のサンプ
ル各100μｌをFPLC super rose−12（ファルマシア社
製）でゲルろ過を行なった（溶媒:PBS、流量:0.5ml/mi
n）。２−メルカプトエタノール処理した癌患者由来GT
の溶出曲線を図３に示う。10〜30分までのフラクション
20本について、約２μｌをニトロセルロース膜に直接プ
ロットしMAb4880−HRPと反応させ発色させた。その結果
を下記表１に示した。反応の程度は下記の記号を用いて
表わした。
ル各100μｌをFPLC super rose−12（ファルマシア社
製）でゲルろ過を行なった（溶媒:PBS、流量:0.5ml/mi
n）。２−メルカプトエタノール処理した癌患者由来GT
の溶出曲線を図３に示う。10〜30分までのフラクション
20本について、約２μｌをニトロセルロース膜に直接プ
ロットしMAb4880−HRPと反応させ発色させた。その結果
を下記表１に示した。反応の程度は下記の記号を用いて
表わした。
：強発色 ＋：弱発色 ±：微発色 −：無発色 下記表１からも明らかなように本発明の癌患者由来ガ
ラクトース転移酵素は、２−メルカプトエタノール処理
により自己会合が進み高分子化が起こりゲルろ過による
分離では分子量20万以上の分画で検出されることが分か
った。
ラクトース転移酵素は、２−メルカプトエタノール処理
により自己会合が進み高分子化が起こりゲルろ過による
分離では分子量20万以上の分画で検出されることが分か
った。
実施例６ Cancer Research 48巻、5352、1988に記載のGT−IIに
特異的なモノクローナル抗体MAb3872（ATCC HB 8945）
を臭化シアンにより活性化されたアガロースゲルに固定
し、MAb3872アフィニティクロマトカラム（2.5cm×10c
m）を作製した。該カラムに卵巣癌患者腹水約１を50m
l/hrの流速で通過させた後、500mlの0.5M NaClを含むリ
ン酸バッファー（pH7.3）で洗浄した、次に、0.5M NaCl
を含むグリシンバッファー（pH2.8）により溶出を行な
いMAb3872と反応性の画分をプールし、約1mlにまで濃縮
した。
特異的なモノクローナル抗体MAb3872（ATCC HB 8945）
を臭化シアンにより活性化されたアガロースゲルに固定
し、MAb3872アフィニティクロマトカラム（2.5cm×10c
m）を作製した。該カラムに卵巣癌患者腹水約１を50m
l/hrの流速で通過させた後、500mlの0.5M NaClを含むリ
ン酸バッファー（pH7.3）で洗浄した、次に、0.5M NaCl
を含むグリシンバッファー（pH2.8）により溶出を行な
いMAb3872と反応性の画分をプールし、約1mlにまで濃縮
した。
上記MAb3872アファニティクロマトグラフィーにより
精製されたサンプル及び実施例１でアフィニティクロマ
トグラフィーにより精製されたサンプルについて以下の
アッセイを行なった。MAb4880固定化ビーズ、MAb4880−
HRP標識体は実施例１に記載のもの、さらにMAb3872固体
化ビーズ、MAb3872−HRP標識体はMAb4880に準じて作製
した。α−ラクトアルブミン精製品を500倍に、及びMAb
3872精製品を100倍にそれぞれ１％BSA・PBSで希釈した
ものについて、以下の固定化ビーズ、標識体の組合わせ
によるサンドイッチアッセイを実施例２に従って行なっ
た。吸光度の値の結果を下記表２に示す。
精製されたサンプル及び実施例１でアフィニティクロマ
トグラフィーにより精製されたサンプルについて以下の
アッセイを行なった。MAb4880固定化ビーズ、MAb4880−
HRP標識体は実施例１に記載のもの、さらにMAb3872固体
化ビーズ、MAb3872−HRP標識体はMAb4880に準じて作製
した。α−ラクトアルブミン精製品を500倍に、及びMAb
3872精製品を100倍にそれぞれ１％BSA・PBSで希釈した
ものについて、以下の固定化ビーズ、標識体の組合わせ
によるサンドイッチアッセイを実施例２に従って行なっ
た。吸光度の値の結果を下記表２に示す。
下記表２から明らかなように、本発明の癌関連GTはMA
b3872と反応性を示すGT−IIとは一部共有する部分はあ
るが異なった物質であることが分かる。
b3872と反応性を示すGT−IIとは一部共有する部分はあ
るが異なった物質であることが分かる。
図１は、本発明のガラクトース転位酵素及び正常人由来
ガラクトース転位酵素についてのNative−PAGE後のゲル
断片浸漬液のMAb4880サンドイッチアッセイの結果を示
す図、 図２は、未処理又は２−メルカプトエタノール加熱処理
後の本発明のガラクトース転位酵素又は正常人由来ガラ
クトース転移酵素のMAb4880サンドイッチアッセイの結
果を示す図、 図３は、２−メルカプトエタノール加熱処理後の本発明
のガラクトース転位酵素のゲルろ過における溶出曲線を
示す図である。
ガラクトース転位酵素についてのNative−PAGE後のゲル
断片浸漬液のMAb4880サンドイッチアッセイの結果を示
す図、 図２は、未処理又は２−メルカプトエタノール加熱処理
後の本発明のガラクトース転位酵素又は正常人由来ガラ
クトース転移酵素のMAb4880サンドイッチアッセイの結
果を示す図、 図３は、２−メルカプトエタノール加熱処理後の本発明
のガラクトース転位酵素のゲルろ過における溶出曲線を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓ ｔ 75（２）ｐ．237−248（1985) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】癌患者腹水よりα−ラクトアルブミンアガ
ロースアフィニティクロマトグラフィーにより生成さ
れ、SDS−PAGE還元条件下電気泳動で約５万の分子量を
示し、ネイティブの状態でMAb4880と反応性があり、一
部自己会合しており、加熱還元処理によりMAb4880との
反応性を増大すると共に自己会合が亢進してゲルろ過ク
ロマトグラフィーで分子量30万以上の分画に検出される
癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1004476A JP2813982B2 (ja) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素 |
| EP19900100421 EP0378188B1 (en) | 1989-01-11 | 1990-01-10 | Cancer-related human galactosyltransferase, its use and diagnostics |
| US07/911,273 US5308769A (en) | 1989-01-11 | 1992-07-09 | Cancer-related human galactosyltransferase GT-II |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1004476A JP2813982B2 (ja) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02186984A JPH02186984A (ja) | 1990-07-23 |
| JP2813982B2 true JP2813982B2 (ja) | 1998-10-22 |
Family
ID=11585169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1004476A Expired - Fee Related JP2813982B2 (ja) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0378188B1 (ja) |
| JP (1) | JP2813982B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2888587B2 (ja) * | 1990-03-06 | 1999-05-10 | コニカ株式会社 | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いた検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素の測定方法 |
| US5308769A (en) * | 1989-01-11 | 1994-05-03 | Konica Corporation | Cancer-related human galactosyltransferase GT-II |
| FR2751346A1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-01-23 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede |
| EP1137783A2 (en) * | 1998-12-10 | 2001-10-04 | ZymoGenetics, Inc. | Beta-1,3-galactosyltransferase homologs |
| WO2002018556A2 (en) * | 2000-08-31 | 2002-03-07 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 8797, a human galactosyltransferase and uses thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4205129A (en) * | 1979-03-05 | 1980-05-27 | The Massachusetts General Hospital | Method for purifying galactosyltransferase isoenzymes and product |
| US4797356A (en) * | 1985-12-02 | 1989-01-10 | Konishiroku Photo Industries, Co., Ltd | Monoclonal antibodies specific to glactosyltransferase isoenzyme II and their use in cancer immunoassays |
-
1989
- 1989-01-11 JP JP1004476A patent/JP2813982B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-01-10 EP EP19900100421 patent/EP0378188B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ７５（２）ｐ．２３７−２４８（１９８５） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0378188B1 (en) | 1996-07-31 |
| EP0378188A1 (en) | 1990-07-18 |
| JPH02186984A (ja) | 1990-07-23 |
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