JPH02186984A - 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野ｊ 本発明は、癌患者に由来する新規なガラクトース転移酵
素に間する。本発明のガラクトース転移酵素は癌患者に
多（検出されるので腫瘍マーカーとして使用することが
できる。従って、本発明のガラクトース転移酵素に対す
るモノクローナル抗体は癌診断薬として用いることがで
き、本発明のガラクトース転移酵素はこのモノクローナ
ル抗体を製造する際の試薬としての用途を有する。

〔従来の技術］ ガラクトース転移酵素（ガラクトシルトランスフェラー
ゼ（以下、ＧＴと言うことがある））は、ウリジンジホ
スホガラクトース（ｔＪＤＰ−ガラクトース）から種々
の糖蛋白質のオリゴ糖や単糖類の非還元残基へのガラク
トース転移を触媒する酵素であり、はとんど全ての組繊
に存在する。

このＧＴの異字な活性が種々の悪性ｌ！Ｉ瘍で認められ
、腫瘍マーカーとしてのＧＴの研究が行なわれた。その
結果、ＧＴのアイソザイムであるＧＴ−１１の血清中の
量が癌の存在と密接な関係にあることが発見された。こ
のＧ　Ｔ　−ＩＩは、Ｂｉｎｃｈｅ信Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍ＋ｍｏｎ、６５　ｆ２１．５４
５−５５１．１９７５に記載されている通り、Ｎａｔｉ
ｖｅ−ＰＡＧＥにおいて正゛諧人に主として存在するＧ
Ｔ−Ｉに比較し移動度の小さい、ＧＴ酵素活性を有する
バンドを定義したものである。また、該Ｇ　Ｔ　−ＩＩ
に対するモノクローナル抗体としてＭＡｂ３８７２が報
告されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４８
．５３２５−５３３４．１９８８１が、Ｇ　Ｔ　−ＩＩ
の本質についてはいまだ明らかになっていない。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、腫瘍マーカーとして感度良く測定する
ことができる新規なガラクトース転移酵素を提供するこ
とである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、Ｇ　Ｔ　−ＩＩの本質について更に究明
した結果、癌に特異性を持つＧＴが存在し、Ｇ　Ｔ　−
１１として、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに認められるバン
ドはその一現象にすぎず、ＧＴ−１のバンド、原点にも
一部この癌特異性を持つＧＴが混在していることを見出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明の新規ＧＴは
、これまで言及されてきたＧＴ　−ＩＩとしての性質を
一部包含すると共に、下記に限定されているようなその
本質となる物性を有する。

すなわち、本発明者らは、鋭意研究の結果、癌患者腹水
から検出され、正常人からはほとんど検出されない、正
常人に主として存在するガラクトース転移酵素とは異な
る癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素を見出し本発明
を完成した。

すなわち、本発明は、癌患者腹水よりα−ラクトアルブ
ミンアガロースアフイニテイクロマトグラフィーにより
精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件下電気泳動で約５
万の分子量を示し、ネイティブの状態でＭＡｂ４８８０
と反応性があり、一部自己会合しており、還元処理によ
りＭＡｂ４８８０との反応性が増大すると共に自己会合
が亢進してゲルろ過クロマトグラフィーで分子量２０万
以上の分画に検出される癌関連ヒト由来ガラクト−ス転
移酵素を提供する。

［発明の詳細な説明］ 本発明のガラクトース転移酵素は、下記実施例に詳細に
記載するように、癌患者の腹水、例えば卵巣癌患者の腹
水からＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８巻、５３
２５頁、１９８８年に記載の方法に従い、α−ラクトア
ルブミンアフィニティークロマトクラフィーにより正常
人のＧＴと同様にして精製することができる。もっとも
、本発明のガラクトース転移酵素は、卵巣癌患者に限ら
ず、子宮癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、肝臓癌等
の癌患者にも伴在し、また、腹水に限らず、血清その他
の体液中にも存在する。

本発明のガラクトース転移酵素は、下記実施例に具体的
に記載するように、２−メルカプトエタノール処理後の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件下電気泳動で約５万の分子量
を示す、この分子量は正常人由来のガラクトース転移酵
素と同じである。

本発明のガラクトース転移酵素は、ネイティブの状態で
卵巣癌腹水から精製されたＧＴを抗原とするモノクロー
ナル抗体であるＭＡｂ４８８０Ｆ文献：Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４８巻、５３２５頁、１９８８１　
と反応性を有する。　ＭＡｂ４８８０を産生するハイブ
リドーマは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
、その受託番号はＢＰ−１７５８である。　ＭＡｂ４８
１１１０との反応性は、下記実施例に詳細に示すように
標識したＭＡｂ４８８０を用いたウェスタンプロット法
により確認することができる。

また、本発明のガラクトース転移酵素はネイティブの状
態で一部自己会合している。すなわち、同一タンパク質
の分子間の相互作用によって結合している状態であり、
分子量としては整数倍として検出される。その結合はい
わゆる共有結合ではな（特定の条件下では解離すること
がある。

このことは、上記したウェスタンプロット法により確認
することができる。

本発明のガラクトース転移酵素はまた、還元処理、例え
ば１０ｍＭ２−メルカプトエタノール処理により、ＭＡ
ｂ４８８０との反応性が増大する。これは、下記実施例
に詳細に記載するように、還元処理後のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ及びＭＡｂ４８８０を抗原として用いたウェスタンプ
ロット法により確認することができる。

また、本発明のガラクトース転移酵素は、上記還元処理
により自己会合が亢進してゲルろ過クロマトグラフィー
で分子量２０万以上の分画に検出されるようになる。

本発明のガラクトース転移酵素は、正常人由来の正常ガ
ラクトース転移酵素と基質及び作用が同じである。すな
わち、 ｔＪＤＰガラクトース＋受容体−ｍ− ガラクトースー受容体＋ＵＤＰ （ただし、受容体は、Ｎ−アセチルグルコサミン又は非
還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有するオリゴ糖
、糖タンパク、糖脂質）の反応を触媒する。また、その
至適ｐＨ又は安定ｐＨ範囲も正常ヒトガラクトース転移
酵素と同じ＜ｐＨ６，０〜８．０である。

本発明のガラクトース転移酵素は、癌患者に多く存在す
るので、腫瘍マーカーとして用いることができる。従っ
て、本発明のガラクトース転移酵素に対するモノクロー
ナル抗体は癌診断薬として用いることができ、本発明の
ガラクトース転移酵素はこのモノクローナル抗体を製造
する際の試薬としての用途を有する。

［発明の効果］ 本発明により、腫瘍マーカーとして用いることができる
新規なヒトガラクトース転移酵素が提供された１本発明
のガラクトース転移酵素を抗原として用いてモノクロー
ナル抗体を作製することにより、新規な癌診断薬を提供
することができる。

［実施例１ 本発明を下記実施例に基づいてより具体的に説明する。

もっとも１本発明は下記実施例に制限されるものではな
い。

実ＪＬ例」２ 卵巣患者腹水ｌ！！、及び正常人プール血清２Ｉ２をそ
れぞれＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８巻、５３
２５頁、　１９８８年に記載の方法に従い、α−ラクト
アルブミンアフィニティークロマトグラフィーにより精
製し、ガラクトース転移酵素１．１．ｍｌ及び０．８Ｌ
Ｉｌｌをそれぞれ得た。すなわち、腹水又は血清を精製
水で４℃−晩透析後、不市物を遠心して取り除きトリス
バッファー（ｐＨ７，２＋　、マンガンクロライド（Ｍ
口Ｃ１□１．Ｎ−アセチルグルコサミンをそれぞれ２０
ｍＭ、　１０＋ｎＭ、５ｍＭ、になるように加えα−ラ
クＦ・アルブミンアフィニティカラム（２，５ｃｍｘ　
５０ｃｍ１　に流した。上記バッファーＩＩ２でカラム
を洗浄した後、Ｎ−アセチルグルコサミンを含まないバ
ッファーで溶出を行ないＧＴ画分を得た。得られたＧＴ
画分は更にα−ラクトアルブミンアフィニティーカラム
で同様に操作を行ないさらに精製した。こうして得られ
たＧＴ画分は免疫グロブリンを除去する為に抗−ヒトＩ
ｇＧアガロースカラム（０，５ｘ　３ｃｍ）を通した後
ａ縮した。得られた癌患者由来ＧＴ及び正常人由来ＧＴ
のタンパク質濃度はそれぞれ０．８Ｂ／ｍ１．０．５ｍ
ｇ／Ｉ！ｌｌであった。得られた癌患者由来ガラクトー
ス及び正常人由来ガラクトースそれぞれ１０μｍは、ド
デシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと言う）及び２−メ
ルカプトエタノールで処理後、ＩＯｃ＋＋Ｘ　１０ｃｍ
のスラブゲル（（株）第一化学薬品社製）を用いて４〜
２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥを下記の条件で行ない銀染色し
た。

泳動用バッファー＋２５＋＋Ｍ）リス、１９２ｍＭクリ
シン０．１％　ＳＯ３ｆｐＨ８，４） 泳動ミリアンペア°６０ｍＡ定電流 泳動時間：１時間 その結果、癌患者由来ガラクトース及び正常人由来ガラ
クトースは共に分子量４８．０００〜５５．０００に分
布するバンドを有し、その他の不純物のバンドは見られ
なかった。

一方、５ＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色を行なう代わりにＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ
Ａ　７６、４３５０＋１９７９）に記載されたウェスタ
ンプロットを行なった。このウェスタンプロットにおい
て、検出するための抗体としてＭＡｂ４８８０のホース
ラデイツシュパーオキシダーゼ（［（ＲＰ）標識体を用
いた。その結果、上記銀染色に相当するバンドのみが検
出されたが、癌患者由来ガラクトース転移酵素は正常人
由来ガラクトース転移酵素より非常に強（発色した。

以上の結果、本発明のガラクトース転移酵素は正常人の
それと同様α−ラクトアルブミンアフィニティクロマト
マトグラフィーにより精製され、５ＤＳ−ＰＡＧＥ還元
条件下で約５万の分子量を有することが分かった。

及ｉ五ユ 実施例１で精製された癌患者由来及び正常人由来のガラ
クトース転移酵素それぞれ１０μｌを１０ｃｍＸ　ｌＯ
ｃｗ＋スラブゲル（（株）第一化学薬品社製）を用いて
４〜１５％Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを下記の条件で行な
い銀染色した。

泳動用バッファー：２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシ
ン（ｐＨ８，４１ 泳動ミリアンペア＋　３０ｍＡ定電流 泳動時間・２時間 その結果、癌患者由来ガラクトース転移酵素はＲｆ値０
３〜口、５のブロードなバンドと原点からＲｆ　値約０
．３のテーリングしたバンドが認められた。また、正常
人由来ガラクトース転移酵素はＲｆ値約０．３〜０．５
に相当するバンドは認められたが原点からＲｆ値約０．
３に及ぶバンドはトレース量であった。

一方、上記電気泳動において、銀染色する代わりにゲル
（個々の試料レーン）を０．２５ｃｎ＋の幅にカットし
、それぞれ１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶
液（以下ＰＢＳと言う）　１００　ｕ　１に４℃、１晩
浸漬した。この浸漬液５０ｕｌをＭＡｂ４８８０をコー
ティングしたポリスチレンビーズ及びＰＢＳ　２００μ
ｌと３７℃、２時間インキュベートした後、ビーズをＰ
ＢＳで３回洗浄しＨＲＰで標識したＭＡｂ４８８０　　
（以下ＭＡｂ４８８０−ＨＲＰと言う）を加えて室温で
２時間反応させた。反応後、ビーズをＰＢＳで４回洗浄
し、基質として０−フェニレンジアミンを加えて発色さ
せ波長４９２ｎｎにおける吸光度を測定した（　ＭＡｂ
４８８０サンドイッチアッセイ）、結果を図１に示す。

以上の結果１本発明のガラクトース転移酵素は、Ｎａｔ
ｉｖｅ−ＰＡＧＥ下ではその一部が自己会合し高分子化
した状態にあることが分かった。

支五且ユ 実施例１で精製された癌患者由来及び正常人由来のガラ
クトース転移酵素はそれぞれ１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノールで８０℃、３分間処理した後、実施例２と同様
にして４〜１５％Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行ない銀染
色した。癌患者由来ガラクトース転移酵素は実施例２で
見られたような原点からＲｆ１＋Ｉｉ０．３に及ぶテー
リング域はほとんど消失し、代わって原点付近にバンド
が認められた。　Ｒｆ値約０．３〜０．５のブロードな
バンドはやや銀染色濃度は低下したがほぼ実施例２と同
様に認められた。

正常人由来のガラクトース転移酵素は、原点付近にトレ
ース量のバンドを認めたが実施例２と比べてほとんど変
化はなかった。

実施例２及び上記２−メルカプトエタノール処理後のゲ
ルを、実施例１と同様にウェスタンプロットし、ＭＡｂ
４８８０−１１ＲＰにより染色した。実施例２でのＮａ
ｔｉｖｅ−ＰＡＧＥからのプロットは、癌由来ガラクト
ース転移酵素、正常人由来ガラクトース転移酵素共に、
銀染色と同様のパターンを示した。

２−メルカプトエタノール処理したサンプルでのＮａｔ
ｉｖｅ−ＰＡＧＥからのブローットでは、癌由来ガラク
トース転移酵素は原点からテーリングしたバンドのみ染
色された。正常人由来ガラクトース転移酵素は原点がわ
ずかに染色されただけであった。

以上の結果から、本発明で得た癌患者由来ガラクトース
転移酵素は２−メルカプトエタノール処理により自己会
合がより進み高分子化すること、またＭＡｂ４８８０と
の結合反応性が著しく高（なり、一方正常人に主に存在
するガラクトースとＭＡｂ４８８０との反応性は低下す
ることが分かった。

１嵐立」 実施例１で精製された癌患者由来及び正常人由来のガラ
クトース転移酵素はそれぞれ１０ｍ１Ｊ２−メルカプト
エタノールで８０℃で３分間処理後、又は未処理のまま
、１０倍ないし約７０００倍に１％ＢＳＡ・ＰＢＳで希
釈し、ＭＡｂ４８８０を用いて実施例２と同様にしてザ
ンドイッチアッセイを行なった。

結果を図２に示す。図２中、曲線ｌは癌患者由来ガラク
トース転移酵素、曲線２は２−メルカプトエタノール加
熱処理した癌患者由来ガラクトース転移酵素１曲線３は
正常人由来ガラクトス転移酵素、曲線４は２−メルカプ
トエタノール加熱処理した正常人由来ガラクトース転移
酵素についての結果を示す。

以上の結果、２−メルカプトエタノール処理により本発
明のガラクトース転移酵素のＭＡｂ４８８０サンドイッ
チアッセイの検出感度は飛躍的に向上し、正常人血清中
にも僅か１こ存在するが、癌患者四水中には多量に存在
することが分かった。

及五り玉 実施例４で得られたサンドイッチアッセイ用のサンプル
各１００ｕｌをＦＰＬ（：　５ｕｐｅｒ　ｒｏｓｅ−１
２（ファルマシア社製）でゲルろ過を行なった（溶媒：
　ＰＢＳ　、流５１　：　０．５ｍｌ／ｌ１ｉｎ）、　
２−メルカプトエタノール処理した癌患者由来ＧＴの溶
出曲線を図３に示す、１０〜３０分までのフラクション
２０本について、各２μｌをニトロセルロース膜に直接
プロットしＭＡｂ４８８０−ＨＲＰと反応させ発色させ
た。その結果を下記表１に示した１反応の程度は下記の
記号を用いて表わした。

強発色 ＋：弱発色 ±：徴徴発 −二無発色 下記表１からも明らかなように本発明の癌患者由来ガラ
クトース転移酵素は、２−メルカプトエタノール処理に
より自己会合が進み高分子化が起こりゲルろ過による分
離では分子量２０万以上の分画で検出されることが分か
った。

１１Ｃ硼互 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８巻、　　５３２
５．１９８８に記載のＧ　Ｔ　−Ｉ＋に特異的なモノク
ローナル抗体ＭＡｂ３８７２（ＡＴＣＣＨＢ　８９４５
１　を臭化シアンにより活性化されたアガロースゲルに
固定し、ＭＡｂ３８７２アフィニティクロマト力ラムｆ
２．５ｃｍＸ　１．Ｏｃ＋ｎｊ　を作製した。

該カラムに卵巣癌患者腹水約１ｇ、を５０＋ａｌ／ｈｒ
の流速で通過させた後、５００ｍ１の０．５Ｍ　ＮａＣ
１を含むリン酸バッファー（ｐＨ７，３）で洗浄した。

次に、０．５ＭＮａＣｌを含むクリシンバッファー（ｐ
Ｈ２，８＋により溶出を行ないＭＡｂ３８７２と反応性
のある画分をプールし、約１ｍｌにまで濃縮した。

上記ＭＡｂ３８７２アフィニティク口マトグラフィーに
より精製されたサンプル及び実施例１でアフィニティク
ロマトグラフィーにより精製されたサンプルについて以
下のアッセイを行なった。

ＭＡｂ４８８０固定化ビーズ、ＭＡｂ４８８０−１（Ｒ
Ｐ標識体は実施例１に記載のもの、さらにＭＡｂ３８７
２固定化ビーズ、Ｍ　Ａ　ｂ　３８７２−　ＨＲＰ標識
体はＭＡｂ４８８０に準じて作製した。α−ラクトアル
ブミン精製品を５００倍に、及びＭＡｂ３８７２精製品
を１００倍にそれぞれ１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したも
のについて、以下の固定化ビーズ、標識体の組合わせに
よるサントイ・ンチアッセイを実施例２に従って行なっ
た。吸光度の値の結果を下記表２に示す。

下記表２から明らかなように、本発明の癌関連ＧＴはＭ
Ａｂ３８７２と反応性を示すＧ　Ｔ　−ＩＩとは一部共
有する部分はあるが異なった物質であることが分かる。

精製品Ａ　；　α−ラクトアルブミン７フイニテイク０
マドララフイーにより精製したＧＴ精製品Ｂ　　：　　
ｈｌＡｂ３８７２アフィニティク０マドクラフィーによ
り精製したＧＴ

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明のガラクトース転位酵素及び正常人由来
ガラクトース転位酵素についてのＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧ
Ｅ後のゲル断片浸漬液のＭＡｂ４８８０サンドイッチア
ッセイの結果を示す図、 図２は、未処理又は２−メルカプトエタノール加熱処理
後の本発明のガラクトース転位酵素又は正常人由来ガラ
クトース転位酵素のＭＡｂ４８８０サンドイッチアッセ
イの結果を示す図、 図３は、２−メルカプトエタノール加熱処理後の本発明
のガラクトース転位酵素のゲルろ過における溶出曲線を
示す図である。 （４４２Ｍ−ス −，４艙峰

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 癌患者腹水よりα−ラクトアルブミンアガ ロースアフィニティクロマトグラフィーにより精製され
   、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件下電気泳動で約５万の分子
   量を示し、ネイティブの状態でＭＡｂ４８８０と反応性
   があり、一部自己会合しており、還元処理によりＭＡｂ
   ４８８０との反応性が増大すると共に自己会合が亢進し
   てゲルろ過クロマトグラフィーで分子量２０万以上の分
   画に検出される癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素。