NO301480B1 - Fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av basisk fibroblastfaktor - Google Patents
Fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av basisk fibroblastfaktor Download PDFInfo
- Publication number
- NO301480B1 NO301480B1 NO921236A NO921236A NO301480B1 NO 301480 B1 NO301480 B1 NO 301480B1 NO 921236 A NO921236 A NO 921236A NO 921236 A NO921236 A NO 921236A NO 301480 B1 NO301480 B1 NO 301480B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- bfgf
- heparin
- column
- thr
- pepsin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 title 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 30
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 102100039652 Pepsin A-5 Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 229940066716 pepsin a Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 102000003908 Cathepsin D Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000258 Cathepsin D Proteins 0.000 claims abstract description 13
- NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N Ile-Thr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N 0.000 claims abstract description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims abstract description 4
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 120
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 110
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims 10
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 abstract description 22
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 42
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 23
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 10
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 2
- IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- IXNRIBJPEOUGGB-DIKMWTQISA-N (2s)-6-amino-n-[(2r)-2-aminohexanoyl]-n-[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxycyclohexyl)propanoyl]-2-(4-nitroanilino)hexanamide Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N(C(=O)[C@H](N)CCCC)C(=O)[C@H](CCCCN)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1CCC(O)CC1 IXNRIBJPEOUGGB-DIKMWTQISA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 4-(3-phosphonopropyl)piperazine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CN(CCCP(O)(O)=O)CCN1 CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101001051969 Bos taurus Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101000898643 Candida albicans Vacuolar aspartic protease Proteins 0.000 description 1
- 101000898783 Candida tropicalis Candidapepsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004176 Cathepsin F Human genes 0.000 description 1
- 108090000610 Cathepsin F Proteins 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101000898784 Cryphonectria parasitica Endothiapepsin Proteins 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- 108010027339 H-norleucyl-hexahydrotyrosyl-lysine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000933133 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910082 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000910079 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000910086 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000910088 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101000898773 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Saccharopepsin Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000002403 aortic endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 108010054847 carboxypeptidase P Proteins 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000010512 small scale reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av basisk fibroblastvektfaktor (10-155) hvor bFGF betegner sekvensen vist i SEQ 10 Nr.l. Fremgangsmåten er særpreget ved de trekk som er angitt i krav l's krarak-teriserende del.
Basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) ble opprinnelig iso-lert fra hjerne og hypofyse som et polypeptid på 146 aminosyrer (Esch et al, PNAS USA 82, 6507 - 6511, 1985). Genet for bovin bFGF har blitt klonet (Abraham et al, Science 233, 545 - 548, 1986). Nukleotidsekvensen forutsa 155 aminosyre bFGF translasjonsprodukt. Videre arbeid har vist at 155 aminosyre bFGF kan ekstraheres sammen med 146 aminosyrers bFGF fra normalt hypofysevev med tilsetning av enzyminhibitorer (Ueno et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 138, 580 - 588, 1986) og at sure proteaser i hjerne og hepatomceller spalter bFGF (Klagsbrun et al, PNAS USA 84, 1839 - 1843, 1987).
Proteinmanipuleringsteknikker har gjort rekombinante vekstfaktorer tilgjengelige for terapeutisk bruk. Når de endelig har blitt uttrykt, kan disse vekstfaktorer bli be-handlet til en blanding av forskjellige former. FGFs er ingen unntagelse i denne sammenheng (Barr et al, J. Biol. Chem. 263, 31, 16471-16478, 1988).
Søker har nå utarbeidet en fremgangsmåte for fremstilling av et bFGF som er forkortet ved sin N-terminal. Denne fremgangsmåte kan anvendes for å erholde en 146-aminosyreform av bFGF fra lengre former og å danne en enkel form av bFGF fra en blanding av bFGF. Den resulterende form er ren og er ikke forurenset av andre former av bFGF.
Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et bFGF, hvilken fremgangsmåte omfatter: i) å danne et addukt mellom heparin eller heparansulfat og et bFGF av den generelle formel NH2-(AA) x-Lev-Pro-Y-COOH hvor (AA)x betegner en sekvenes vist i SEQ 10 Nr. 2 til 6, Ile-Thr-Thr, Thr-Thr eller Thr, og Y betegner aminosyresekvensen av (11-155)6FGF;
ii) å behandle adduktet med pepsin A eller cathepsin D, for derved å spalte denne binding, og
iii) frigjøre fra adduktet det således fremstilte (11-155)6FGF.
Det er følgelig mulig å anvende foreliggende fremgangsmåte på en blanding av bFGF, hvor aminosyresekvensen til hver bFGF i blandingen starter ved et N-terminalt aminosyreresi-dium med nummer lavere enn 9, og hvor bFGF har de forskjellige N-terminaler som er vist i SEQ ID Nr. 2 til 6, Ile-Thr-Thr, Thr-Thr eller Thr. Blandingen anvendt i punkt i) består av bFGF av den generelle formel:
hvor (AA)x er som definert ovenfor og Y betegner aminosyresekvensen av (11 - 55)bFGF. bFGF av full lengde har 155 aminosyreresiduer og kan bli betegnet 155-bFGF eller (1-155)bFGF. Aminosyresekvensen av human (l-155)bFGF er vist i SEQ ID NO: 1. Spesielt kan oppfinnelsen bli anvendt på en blanding av 154 aminosyreresiduers bFGF [2-155)bFGF] og153 aminosyreresiduers bFGF [3-155)bFGF].
bFGF eller blandingen av bFGF blir generelt erholdt ved rekombinante DNA-teknikker. Forskjellige former for bFGF
blir erholdt i slike blandinger grunnet etterbehandling av translasjonsproduktet ved dets N-terrainal. Det eller hver av bFGF kan være et humant murint eller gnager bFGF.
Et addukt blir dannet mellom et beskyttende middel for bFGF valgt fra heparin og heparansulfat, og blandingen av bFGF på enhver passende måte. Det beskyttende middel og bFGF ble typisk fremstilt i en vanndig oppløsning. Denne opp-løsning kan være bufret. Et antioxidant så som ditiotre-itol kan være tilstede ved å forhindre proteinoksidasjon. Forholdet mellom bFGF:beskyttende middel kan være fra 0,5:1 til 10:1 (w/w), f.eks. fra 1:1 til 5:1 (w/w). Beskyttelsen av bFGF som addukter forhindrer ytterligere uønsket hydrolyse når pepsin A blir tilsatt.
Pepsin A (EC 3.4.23.1) eller cathepsin D (EC 3.4.23.5) blir dernest satt i kontakt med adduktet. Dette resulterer i
spesifikk spaltning av 9-10 Leu-Pro-bindingnen i bFGF holdt i adduktet. Enzymet kan bli fremskaffet i en oppløsning av adduktet. Enzymet kan følgelig bli tilsatt til en oppløs-ning av bFGF og det beskyttende middel. Enzymet blir generelt i en oppløsning justert til pH 4 til 6.
Oppløsningen inkuberes i f.eks. i tilfelle med pepsin A fra 30 minutter til 10 timer, f.eks. fra 1 til 8 timer. Inkubering er typisk lenger for catepsid D, f.eks. fra 90 til 130 timer, passende omkring 10 timer. Inkuberingstempe-raturen kan være fra 5°C til romtemperatur, f.eks. 10°C. Inkubering blir utført inntil reaksjonen er fullstendig.
Alternativt kan det beskyttende middel være immobilisert på et støttemateriale for å danne en affinitetskolonne. Ethvert passende støttemateriale kan bli brukt såsom en agarosegel eller fomettede dekstrangelkuler (f.eks. "Sepharose"). En oppløsning av bFGF blir satt på kolonnen. bFGF binder til det beskyttende middel og blir holdt på kolonnen. En oppløsning av enzym kan så bli passert gjen nom kolonnen. Endelig kan den avkortede enkle form for bFGF bli eluert fra kolonnen. Dette kan bli oppnådd med en lineær gradient av vanndig natriumkloridoppløsning.
En ren form av bFGF kan bli erholdt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. Spesielt kan 146 aminosyreformen av bFGF betegnet (10-155) bFGF bli erholdt. Det erholdte bFGF kan bli brukt for å behandle f.eks. sår og brannskader. bFGF kan bli tilført et sår eller brannskade i enhver passende formulering. Slike formuleringer omfatter følge-lig typisk ytterligere et fysiologisk akseptabelt bære-middel eller fortynningsmiddel.
De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Et frem-stillingseksempel og sammenligningseksempel er fremskaffet.
Fremstillincrseksempel: Fremstilling av 154/ 153 for av bFGF
Konstruksjonen av den syntetiske DNA-sekvens for b-FGF og for ekspresjonplasmidet som bærer en slik sekvens, ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet i EP-A-36375. Fermenteringen og opprenskningsprosedyren ble utført som følger:
a) Fe rmen t e r incrspro s e s s
En bakteriestamme, E. coli type B fra Institutt Pasteur-samlingen, ble transformert med et plasmid som bærer både det humane gen som koder for bFGF og genet for tetracyklin-resistens. Denne transformerte stamme ble brukt for fremstilling av rekombinant ikke-alykosylert h-bFGF (human bFGF) . En "Master Cell Bank" (15 frysetørkede rør) og en "Working Cell Bank" (W.C.B) (70 rør lagret i flytende nitrogen ved -190°C) av denne stamme ble fremstilt. Inn-holdet av et rør av W.C.B, ble brukt som inoculum for fermenteringsfasen.
Fermenteringsprosessen ble utført i 10 1 fermentorer fylt med 4 1 kulturmedium. Tertracyklinhydroklorid ble tilsatt mediet for å opprettholde betingelsene for stammeutvel-gelse. Etter 20 timers vekst ved 37°C var den endelige biomasse
42±2 g/l tørrvekt, og produksjonen av bFGF var 2500 ± 500 mg/l som målt ved komparativ gelelektroforese.
Anrikning i rent oksygen var nødvendig i løpet av fermenteringsfasen for å tillate en stor bakteriell vekst.
b) Initiell opprenskning
Cellene (mikroorganismene) ble adskilt fra det totale
fermenteringsmedium ved sentrifugering. Den resulterende pellet ble resuspendert i natriumfosfatbuffer inneholdende natriumklorid. Et minimum av 3 passeringer gjennom en høytrykkshomogenisator var nødvendig for effektiv celle-brytning. Det resulterende cellelysat ble klargjort ved sentrifugering, og supernatanten ble samlet opp for videre-behandling.
c) Opprenskning
Den klargjorte supernatant ble satt på en kolonne av "Sepharose" (varemerke) S Fast Flow (kationbytter), og produktet ble eluert for denne kolonne ved å bruke en gradient av økende natriumkloridkonsentrasjoner i fosfatbuffer. Produktet ble videre renset på en kolonne av "Heparin Sepharose" 6 B ved å eluere med en gradient med økende natriumkloridkonsentras jon i en f osf atbuf fer. Endelig ble et bufferbytte foretatt på et "Sephadex" (varemerke) G25 resin for å erholde produktet i bulkproduktbufferen (nat-riumfosfat -EDTA).
d) Kolonnesanitisering
"Sepharose" S "Fast Flow" og "Sephadex" G25-kolonner ble
sanitisert ved å vaske med natriumhydroksidoppløsninger. "Heparin Sepharose" ble vasket alternativt med oppløsninger ved pH = 8,5 og pH = 5,5 inneholdende 3M natriumklorid.
På denne måte ble en 154/153 form av bFGF erholdt. Dette er en omtrentlig 50:50 blanding av;
154 aminosyre humant bFGF [(2-155)bFGF] med aminosyresekvensen av 155 aminosyreformen som er rapportert av Abraham et al, og vist i SEQ ID NO: 1, men uten det N-terminale "Met<n->residium, og - et 153 aminosyrers humant bFGF [(3-155)bFGF] bestående av en 155 aminosyreform av bFGF vist i SEQ ID NO: 1, men uten de N-terminale "Met" og "Ala"-residuer.
EKSEMPEL 1: Heparansulfat som beskyttende middel: pepsin A
1. Fremstilling av proteinprøven:
154/153 formen av bFGF fra fremstillingseksemplet ble fremskaffet ved en konsentrasjon på 1,8 mg/ml i en bufret oppløsning:
10 mK mononatriumfosfat,
0,1nM EDTA dinatriumsalt
- pH 6,0.
For å unngå enhver proteinoksidasjon i løpet av den kontrollerte hydrolyse, ble 20 mg dithiotreitol tilsatt til 1# 8 mgg bFGF.
2. bFGF enzymatisk hydrolvseprosedyre:
a) Standard oppløsning av beskyttelsesmiddel Oppløsning 1: 20 mg av beskyttelsesmiddel i 1 ml H20 b) Fremstillin<g>av oppløsning av bFGF og beskyttende middel
100 fil av proteinprøven,
9 fil av oppløsning 1,
3 n 1 M natriumsitrat, pH 3,0,
70 fil H20,
18 ug (18fil) av pepsin AA fra gristarmslimhinne Sluttvolum: 200 fil
Det beskyttende middel var heparansulf at og bFGF/beskyttende middelforholdet var 1:1 (w/w). Pepsin A (EC: 3.4.-23.1) ble tilsatt til oppløsningen av bFGF, og beskyttelsesmiddel ved pH 4,0 og inkubert ved 10°C i 1 time. 3. Kinetiske betingelser for den enzymatiske hydrolyse: Hydrolyseprosedyren ovenfor ble fulgt ved forskjellige tider av SDS-PAGE-analyse. Prøver av fordøyningsblandingen ble analysert etter 1, 20, 40 og 60 minutter med SDS-"PA-GE" . Separasjon av 154/153 bFGF-formen fra 146-bFGF-formen ble oppnådd i SDS-PAGE-analysen ved å bruke "Phast"-systemet
(varemerket; Pharmacia). Med hensyn til prøvebufferen ble prøvefremstillingsbetingelser definert som følger for å unngå noen proteinutfelling av prøven i oppsamlingssonen til "Phast Gel High Density":
15 ( il av proteinblandingen,
- 10 fil av 40 mM Tris/HCl, 4 mM Tris/HCl, 4 mM EDTA, 10% SDS, 20% merkaptoetanol, Ph 8,0,
3 |il av DMSO (dimetylsulfoksid) , og
1 fil av bromfenol blått (0,3%).
Prøvedenaturering ble oppnådd ved å varme prøven til 100°C i 5 minutter. Analaysen av prøvene viste at i prøven tatt fra fordøyningsblåndingen etter en time, hadde 154/153-bFGF-fragmentet forsvunnet. Et hovedfragment ble erholdt som tilsvarte nøyaktig 146-bFGF rekombinantfragmentet brukt som referanse.
4. Opprensknin<g>av bFGF
Reaksjonsblandingen ble direkte satt på en Heparinagarose-kolonne preekvilibrert med Tris-buffer 10 mM, pH 8,0, 0,5M NaCl. BFGF ble eluert ved l,5M NaCl ved å bruke en gradient på 0,5M til 3M NaCl. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-metoden ved å bruke 154/153 bFGF som referanse.
5. Elektroblotting av 146- formen av bFGF
Fremgangsmåten brukt i denne elektroblottinganalysen var lik den beskrevet av Ploug et al, (Anal.Biochem. 181, 33-39, 1989). Membranen som ble brukt, var "Immobilon PVDF" (Millipore).
Etter elektroforese ble gelen ekvilibrert i en overførings-buffer (10 mM CAPS (3-[klykoheksylamino]-1-propansulfon-syre) , pH 11,9, 20% metanol) i 10 minutter. "Immobilonen PVDF" ble opprinnelig fuktet med ren metanol og så ekvilibrert i overføringsbufferen for bruk. En semitørr blottingsammensetning ble brukt (Kyhse-Andersen, J. Biochem. Biophys. Methods 10, 203-209, 1984). Elektrooverføringen ble utført i 2 timer ved 0,2 mA/cm<2>.
PVDF-membranen ble renset i vann og så farget i 0,1% (w/v) Coomassie brilliant blue R-250 i 50% (v/v) metanol i1minutt. Overskytende fargestoff ble fjernet med en kort vask med vann fulgt av avfarging i 40% (v/v) metanol innbe- fattende 10% (v/v) eddiksyre i 5 til 10 minutter. PVDF-membranen ble så forsiktig renset i vann før sekvensering.
6. Aminoterminal sekvensanalyse
Utskårne områder av PVDF-membranen inneholdende det fargede protein ble plassert som et enkelt lag på toppen av Poly-bren-kondisjonert filter. Sekvensering ble utført på en "Applied Biosystems" sekvensator modell 470 A utstyrt med en "on-line" PTH-aminosyreanalysator modell 120 A.
De første tre aminosyrer av den NH2-terminale del av proteinet bestemt under disse betingelser var
Disse aminosyrer tilsvarer de tre aminosyrer av den amino-terminale 146-bFGF-form.
7. Laserscan densiometrianalvse
Denne analyse ble utført for å bestemme prosentdelen av 146-bFGF dannet etter en time av hydrolyse av 154/153-bFGF med pepsin A. Etter 1 time ble 50 fil av reaksjonsblandingen blandet til 50pil av SDS-denatureringsbuffer. I de samme betingelser ble bFGF-prøver av forskjellige pro-teinkonsentrasjoner SDS-denaturert. Disse prøver ble adskilt ved elektroforese på en gel "PAA 4/30" (Pharmacia). Densiometrien til hver topp ble analysert ved å bruke "LKB BROMA 2220" nedtegningsintegratorer. Ved å bruke standard-kurven erholdt ved disse betingelser ble det funnet at konsentrasjonen til 140-bFGF-formen tilsvarte 91% av 154/- 15 3-bFGF-utgangskonsentrasj onen.
8. 146- bFGF- utbytte etter affinitetsrensing
Utbytte av den enzymatiske hydrolysereaksjon ble også bestemt etter rensing av 146-bFGF-formen på en heparin-agarosekolonne. 1,64 mg av reaksjonsblandingen fra punkt 2 ovenfor ble satt på en heparin-agarosekolonne preekvilibrert med Tris 10 mM, pH 8, 0,5 m NaCl. Ved pH 8 er pepsin A slett ikke aktiv, og komplekset mellom heparansulfat og bFGF blir destabilisert på grunn av absorbsjon av bFGF på heparin-agarose som er tilstede i overskuddet i mediet. bFGF ble eluert ved 1,5 M NaCl. 1,14 mg av 146-bFGF-formen ble gjenvunnet.
Det totale utbytte av det som ble erholdt av 146-bFGF aminosyreformen etter kontrollert hydrolyse ved å bruke heparansulfat som beskyttelsesmiddel og affinitetskolonne-opprenskning, var 73%.
EKSEMPEL 2: Heparin som beskyttelsesmiddel; pepsin A
Fremgangsmåten fra eksempel 1 ble gjentatt, bortsett fra at beskyttelsesmidlet var heparin, bFGF-heparinforholdet var
5:1 (w/w), alikvoter av fordøyningsblandingen ble analysert etter 2 minutter og 4, 6 og 8 timer, og den totale inkuberingstid var 8 timer. Oppløsningen av bFGF og heparin besto av:
100 fil proteinprøve,
18 fil oppløsning 2,
3/il 1 M natriumcitrat, pH 3,0,
18 fig pepsin A,
sluttvolum: 200 fil
Oppløsning 2 besto av 100 fil av oppløsning 1 og 900 fil av H20. Under disse betingelser ble også kun et fragment erholdt etter 8 timers inkubering. Dette fragment hadde en observert molekylvekt på 16,200 som bestemt ved SDS-"PAGE"-analyse.
Ved aminio-terminal sekvensanalyse ble de samme tre N-terminale aminosyrer som i eksempel 1 erholdt:
EKSEMPEL 3: Heparin som beskyttelsesmiddel; pepsin A
Utbyttet av den kontrollerte hydrolyse av bFGF beskyttet med heparin ble også bestemt etter opprenskning av 146-bFGF-fragmentet på en heparin-agarosekolonne. Etter 7 timer hydrolyse i samme betingelser som i eksempel 2 ble reaksjonsmediet inneholdende 1,54 mg bFGF satt på en heparin- agarosekolonne preekvilibrert med 10 mM natriumfosfat-buf f er, pH 8,0 og 0,5 M BaCl. 1,02 mg av 146-bFGF ble eluert ved 1,5 M NaCl.
Det totale utbytte av mengden av 146-bFGF aminosyreformen
etter af f initetsopprenskning ved å bruke heparin som beskyttelsesmiddel var 69%.
EKSEMPEL 4: Heparin immobilisert på Agarose som beskyttelsesmiddel ; pepsin A
1. bFGF enzymatisk hydrolvseprosedvre
En kolonne av heparin-agaraose (7ml gel inneholdende 5,6 mg heparin) ble ekvilibrert med natriummonofosfat 10 mM, 0,1 mM EDTA, NaCl 0,5 M, pH 4,0 ved 10°C. 154/153-bFGF ble satt på affinitetskolonnen. Derpå ble 0,18 mg pepsin A fortynnet i samme fosfatoppløsning satt på toppen av kolonnen. Enzymet resirkuleres gjennom kolonnen ved en 0,5 ml/minutt strømningshastighet i 6 timer.
Ved t=6timer ble kolonnen vasket med 10 mM natriumfosfat-buf f er pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, (3 volumdeler) , derpå med en 0,5 M til 3 M NaCl-gradient. bFGF ble eluert ved 1,5 M NaCl.
2. Aminoterminal sekvensanalvse
Etter elektroforese ble gelen elektroblottet på Immobilon PVDF ved å bruke en semitørr blottingsammensetning som beskrevet i eksempel 1. Utskjæringsområder av PVDF-membranen inneholdende det fargede protein ble plassert som et enkelt lag på toppen av et Polybrenkondisjonert filter. De første tre aminosyrer av den NH2-terminale del av proteinet bestemt under disse betingelser var:
Disse aminosyrer tilsvarer de tre aminosyrer til den amino-terminale del av 146-bFGF-formen.
3. 146- bFGF qjenvinninqsutbytte
Utbyttet av hydrolysereaksjonen ble bestemt etter kvan-titativ bestemmelse av 146-bFGF-fragmentet hentet ut fra heparin-agarosekolonnen. 1,28 mg av 146-bFGF ble gjenvunnet. Det totale utbytte av det erholdte materiale av 146-bFGF aminosyreformen (Mw=16,200) etter kontrollert hydrolyse på en heparin-agarosekolonne var 81%.
EKSEMPEL 5: Heparin som beskyttelsesmiddel; cathepsin D
1. bFGF enzymatisk hydrolvseprosedyre
Eksempel 2 ble gjentatt, bortsett fra at cathepsin F fra bovinmilt ble brukt istedetfor pepsin A, og inkuberings-tiden var 110 timer.
2. Kinetiske betingelser for reaksjonen
Opptreden av 146-bFGF-fra<g>mentet erholdt i løpet av den enzymatiske hydrolyse er meget liten, men ble påvist ved SDS-"PAGE"-analyse etter 1 time. Etter 72 timer var 154/- 153-bFGF-hydrolyse ikke fullstendig, og 36 ug av cathepsin D ble tilsatt i reaksjonsmediet. 40 timer senere var reaksjonen fullstendig. Dette er grunnet lav aktivitet til cathepsin D (10 enheter/mg).
3. Aminoterminal sekvensanalvse
Etter elektroforese ble gelen elektroblottet på "Immobilon PVDF" ved å bruke en semitørr blottingsammensetning som beskrevet i eksempel 1. Utskårne områder av PVDF-membranen inneholdende det fargede protein ble plassert som et enkelt lag på toppen av et Polybrenkondisjonert filter. Sekven-siering ble utført på en "Applied Biosystems sekvensator-analyse modell 470A" utstyrt med en "on-line" PTH-aminosyreanalysator modell 12OA. De første tre aminosyrer av den NH2-terminale del av proteinet bestemt under disse betingelser var:
Sammenli<g>nin<g>seksempel 1: pepsin A uten besk<y>ttelsesmiddel
Eksempel 1 ble gjentatt med det unntak at intet beskyttelsesmiddel var tilstede. 154/153-formen av bFGF ble fullstendig fordøyet med pepsin A i løpet av et par minutter.
Sammenli<g>ni<g>nin<g>seksempel 2: Cathepsin D uten besk<y>ttel-sesmiddel
Eksempel 5 ble gjentatt med det unntak at intet beskyttelsesmiddel var tilstede. 154/153 av bFGF ble fullstendig fordøyet av cathepsin D i løpet av et par minutter.
Sammenligningseksempel 3: g- Chymotrypsin
Eksempel 1 ble gjentatt bortsett fra at a-chymotrypsin ble anvendt istedetfor pepsin A, og intet beskyttelsesmiddel var tilstede. 154/153-formen av bFGF ble fullstendig fordøyet av a-chymotrypsinet i løpet av et par minutter. Forskjellige anioniske forbindelser ble følgelig undersøkt for sin mulighet til å beskytte bFGF fra a-chymotrypsinet: 1. Heparin 3000 ( Sigma, H 7516)
bFGF/beskyttelsesmiddelområde = 1
temperatur = 10°C
- pH = 7,5
inkubasjonstid = 4 timer
Ved å bruke heparin 3000 som beskyttelsesmiddel ble et fragment med observert molekylvekt på 14,000 i hovedsak erholdt og enkelte andre fragmenter med lavere molekylvekt som bestemt ved SDS-"PAGE"-analyse.
2. Heparin ( Sigma, H 3125)
bFGF/beskyttelsesmiddelområde (w/w) = 5
temperatur = 10°C
- pH = 7,5
inkubasjonstid = 4 timer
Ved å bruke heparinmateriale som beskyttelsesmiddel, var beskyttelsen ikke tilstrekkelig, og mange fragmenter ble erholdt.
3. Chondroi tinsulfat
- bFGF/beskyttelsesmiddelområde (w/w) = 1
temperatur 10°C
- pH = 7,5
inkubasjonstid = 2 timer
Beskyttelsen var ikke tilstrekkelig, og mange fragmenter ble erholdt.
4. Dermatansulfat
- bFGF/beskyttelsesmiddelområde (w/w) = 1
temperatur = 10°C
- pH = 7,5
inkubasjonstid = 2 timer
Beskyttelsen var ikke tilstrekkelig, og mange fragmenter ble erholdt.
5. Polyasparqinsyre
bFGF (beskyttelsesmiddelområde (w/w) = 1
temperatur = 10°C
- pH = 7,5
inkubasjonstid = 2 timer
Ved å bruke polyasparginsyre som beskyttelsesmiddel var beskyttelsen ikke tilstrekkelig, og mange fragmenter ble erholdt.
EKSEMPEL 6: Heparin eller heparansulfat som besk<y>ttelses-middel; pepsin A eller cathepsin D
1. Eksperimentell fremgangsmåte
Proteolytisk behandling av oppløselige komplekser av bFGF- heparin og bFGF- heparansulfat i oppløsning
1,6 mg av 154/153 aminosyreformen bFGF ble kompleksbundet til 1,6 mg heparin eller heparansulfat i 10 mM citratfosfatbuffer pH 4,0, 10°C. Etter 1 time inkuberingstid ble
160/zg pepsin A (Sigma P-6887, 3200-4500 enheter pr. mg protein) satt til oppløsningen. Prøver av reaksjonsmediet ble fjernet ved forskjellige tidspunker og satt direkte på en heparin-Sepharosekolonne, pre-ekviklibrert ved 10 mM fosfatbuffer pH 8,0/0,5 M NaCl ved 4°C. Kolonnen ble så vasket i utstrakt grad ved samme buffer, og bFGF ble eluert med 3 M NaCl i 10 mM fosfatbuffer pH 8,0. De sammenslåtte fraksjoner ble avsaltet og en Sephadex G25-kolonne på forhånd ekvilibrert i 10 mM fosfatbuffer pH 6,0 og underkastet SDS-"PAGE"-analyse. Ved å bruke heparansulfat som beskyttelsesmiddel ble 146-bFGF erholdt i kvantitativt utbytte etter 1 time. Pepsinbehandling av bFGF-heparinkom-pleks førte til samme kvantitative utbytte i bare 6,5 time inkuberingstid.
Pepsin A- behandling av bFGF bundet til en heparin- Sepharosekolonne 50 mg bFGF (154/153) ble satt på ved en strømningshastighet på 2,5 ml pr. minutt på en heparin-Sepharosekolonne (Pharmacia) (2,6 x 22,5 cm) på forhånd ekvilibrert i 25 mM citratbuffer pH 4,0/0,5 M NaCl ved 4°C. En oppløsning på 680 enheter pr. ml grise-pepsin A (Sigma) i citrat-fosfatbuffer ble kontinuerlig gjeninnført gjennom kolonnen ved 2,5 ml pr. minutt i 3 timer ved 4°C. Kolonnen ble så vasket i utstrakt grad med en 25 mM fosfatbuffer pH 8,0/0,5 M NaCl for å inaktivere og å eliminere enzymet. bFGF ble støteluert med 3M NaCl i 25 mM fosfatbuffer Ph 8,0. De bFGF-inneholdende fraksjoner slått sammen, konsentrert ved ultrafiltrering på Amicon PM 10 membran og avsaltet på en Sephadex G25-kolonne (Pharmacia) på forhånd ekvilibrert i 10 mM fosfatbuffer pH 6,0.
N- terminal sekvensanalyse
Automatisk N-terminal sekvensanalyse ble utført på en modell 477A Pulsed Liquid Phase Sekvensiator (Applied Biosystems, CA, US) med "on-line"-modell 120A PTH-analysator. Normal-1-program med små modifikasjoner ble brukt. Alle sekvensieringsmaterialer og reagenter ble kjøpt fra Applied Biosystems.
C- terminal sekvensanalyse
Tidsforløpstudium av karboxypeptidase P-fordøyning av bFGF ble utført ved romtemperatur i 10 mM natriumacetatbuffer pH 3,8/0,05% Brij-35, ved å bruke et enzym til substratforhold på omkring 1:100 (w/w) (Lu et al, J. Chromatogr. 447, 351-364, 1988) .
Fordøyninger av 0,5-1 nmol protein ble utført i to timer med 0,1-0,2/zg CpP (Bøhringer) ; N-Leucine ble tilsatt som en innvendig standard. Ved forskjellige tider ble 10/100/zl porsjoner fjernet og underkastet aminosyreanalyse etter automatisk derivatisering med PITC på en modell 420A Deri-vatisator (Applied Biosystems) og deretter injisert i en RP-HPLC med "on-line"-modell 130A analysator. Separasjon av de derivatiserte PTC-aminosyrer ble oppnådd på en PTC-C8-kolonne (P/N 9711-0204, 220 x 2,1 mm, S\ i, Applied Biosystems) .
Bioassavs
En endothelial cellestamme avledet fra bovin aorta (BAEC) ble brukt for å studere den proliferative respons indusert av bFGF. Celler ble utsådd ved 2500 celler pr. brønn i 96 brønners mikrotitplater i fullstendig medium bestående av Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMEM supplementert med 13% føtalt bovinserum (FBS) (Gibco UK). Etter festing ble det fullstendige medium erstattet med eksperimentelle media bestående av (DMEM), supplementert med 0,5% fetalt kalve-serum (FBS), 0,1% bovinserumalbumin (BSA) (Sigma USA), og den ønskede konsentrasjon av bFGF (Erbamont). Kulturene ble innkubert i 3 dager ved hvilken tid de ble fiksert med formalin og farget med 0,5% krystallviolett. Etter farging ble brønnene grundig vasket for å fjerne ikke-inkorporert fargestoff. Metanol (95%; 0,1 ml pr. brønn) ble satt til hver brønn for å ekstrahere fargemidlet i en grad som var proporsjonal med mengden av celler dyrket pr. brønn. Plater ble overført for automatisk avlesning til en spek-tro- fotometrisk mikroplateavleser utstyrt med et 540 mn filter.
For syntesen av plasminogen aktivator ble BAEC (3 x 10<*>celler i 0,2 ml pr. brønn) utsådd i 96 brønners mikrotiter-plater i fullstendig vekstmedium som ble erstattet etter festing med DMEM supplementert med 0,5 FBS, 0,1% BSA og forsøkskonsentrasjonene av bFGF. Etter inkubering i 28 timer ble kulturene vasket, og celler ble lysert med en oppløsning inneholdende 0,5% Triton X-100.
Deler av cellelysatene ble undersøkt for plasminogenak-tivatoraktivitet ved å bruke kromogent substrat (Spectro-zyme PL) og plasminogen (begge reagenser fra American Diagnostica Inc.) for de amidolytiske prøver.
2. Resultater
Kontrollert enzymatisk behandling av bFGF
Den rensede rekombinante 154/153-blanding ble inkubert med to forskjellige aspartatproteaser: pepsin A og cathepsin D. Deler av reaksjonsblandingen ble tatt ved forskjellige tidsintervaller og underkastet SDS-"PAGE"-analyse som viste at ved fravær av ethvert beskyttelsesmiddel ble bFGF raskt fordøyet til små peptider. I motsetning til dette resul- terte behandlingen av bFGF (154/153) med pepsin A (10:1 w/w; pH 4,0; 10°C) i nærvær av heparin eller heparansulfat (1:1 w/W) i progressiv og fullstendig omdanning av 154/153 aminosyreformer til en lavere molekylvektsform som migrerte sammen med søkers 146/145 aminosyreformstandard.
Etter elektroblotting på en PDVF-membran ble lavmolekyl-vektbåndet som stammet fra den enzymatiske fordøyning, underkastet automatisk N-terminal sekvensanalyse på en pulsert væskefasesekvensator. De første tre cykler resul-terte i en enkel homogen sekvens; Pro-Ala-Leu som tilsvarer den intakte N-terminale ende av den kjente 146-aminosyreform. Ingen annen sekvens ble påvist, noe som viser at til tross for tilstedeværelsen av tre Leu-Pro-seter på bFGF-molekylet, når de forlengede former av bFGF ble kompleksbundet til heparin eller til heparinsulfat, spaltet for-døyningen med pepsin A spesifikt og kun Leu9-Pro10peptid-bindingen.
En kontrollert proteolytisk spaltning av "heparinbeskyt-tede" NH2-forlengede bFGF-molekyler som erholdt med pepsin A, ble oppnådd etter fordøyning med cathepsin D, selv om en lengre inkuberingstid var nødvendig for denne proteolytiske reaksjon, muligens grunnet den lavere spesifikke aktivitet av det anvendte enzympreparat. Når chymotrypsin ble tilsatt under lignende betingelser, men ved pH 7,5, ble et enkelt polypeptid omkring 14000 dalton påvist etter gelelektroforese av inkuberingsblandingen uten noe tegn på tilstede- værelse av en 146 aminosyreform.
Enzymatisk behandling i stor skala av bFGF på heparin-Sepharosekolonne
Resultatene erholdt i oppløsning og i småskalareaksjoner ble bekreftet, og en prosess i større skala med 154/153-blandingen av forlenget bFGF bundet til en herparin-Sepo-harosekolonne ble utført. Følgelig ble 50 mg bFGF (154/-153) satt på en heparin-Sepharosekolonne på forhånd ekvilibrert i citratfosfatbuffer pH 4,0. En oppløsning av pepsin A ble gjeninnført kontinuerlig gjennom kolonnen i 3 timer ved 4°C. Deretter ble kolonnen vasket med en fosfatbuffer ved alkalisk pH både for å inaktivere og for å fjerne enzymet. Det resulterende polypeptid ble eluert fra kolonnen ved 3 M NaCl i fosfatbuffer ved pH 8,0. De bFGF-inneholdende fraksjoner ble samlet opp og avsatet på en Sephadex G25-kolonne.
De sammenslåtte fraksjoner analysert på SDS-"PAGE" viste et enkelt bånd med en molekylvekt som tilsvarer den til standard 146/145 bFGF-formen. Revers fase-HPLC-analyse resul-terte også i en enkel topp. N-terminal sekvensanalyse ga en enkel sekvens som tilsvarer den korrekte intakte N-terminale ende av 146-aminosyreformen, det vil si Pro-Ala-Leu. C-terminal sekvensanalyse viste den ventede karboksy-terminale ende av bFGF-molekylet, det vil si -Ala-Lys-Ser. Således, også når bFGF var bundet til heparin-Sepharosere-sinet, var pepsin A i stand til å spalte spesielt molekylet ved Leu9-Pro10-bindingen for å danne en homogen 146-aminosyreform.
In vitro bioassays av bFGF- formene
Den biologiske aktivitet av blandingen av 154/153-amino-syref ormen ble sammenlignet med den til den homogene 146-aminosyreform erholdt ved den beskrevne proteolytiske prosess. To aktiviteter, induksjonen av en proliferativ respons og syntesen av plasminogen aktivator ble studert i bovine endotheliale aortaceller (BAEC). Begge prøvinger bekrefter den i in vitro biologiske ekvivalens av 154/153-sammenlignet med 146-amonosyreformen erholdt ved den enzymatiske prosess.
Claims (4)
1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en basisk fibroblast vekstfaktor (10-155)bFGF, hvor bFGF betegner sekvensen vist i SEQ ID Nr. 1,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (i) å danne et addukt mellom heparin- eller heparansulf at og et bFGF av den generelle formel:
hvor (AA)Xbetegner en sekvens vist i en av SEQ ID Nr. 2 til 6, Ile-Thr-Thr, Thr-Thr eller Thr, og Y betegner aminosyresekvensen av (11-155)bFGF; (ii) behandle adduktet med pepsin A eller cathepsin D for derved å spalte nevnte binding, og (iii) frigjøre fra adduktet det således fremstilte (10-155)bFGF.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat blandingen i trinn (i) utgjøres av (2-155)bFGF og (3-155)bFGF.
3 . Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat heparin- eller heparansulfatet og bFGF-materialet foreligger i en bufret vandig oppløsning i trinn (i) og pepsin A eller cathepsin D tilsettes til den resulterende oppløsning i trinn (ii).
4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 3,karakterisert vedat heparin- eller heparansulfatet er immobilisert på et støttemateriale for å danne en affinitetskolonne, en oppløsning av nevnte bFGF settes på kolonnen i trinn (i), en oppløsning av pepsin A eller cathepsin D passeres gjennom den således preparerte kolonne i trinn (ii) og den avkortede enkle form av (10-155)bFGF således fremstilt elueres fra kolonnen i trinn (iii).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909017008A GB9017008D0 (en) | 1990-08-02 | 1990-08-02 | Process for the enzymatic preparation of basic fibroblast growth factor |
| PCT/EP1991/001428 WO1992002539A1 (en) | 1990-08-02 | 1991-07-30 | Process for the enzymatic preparation of basic fibroblast growth factor |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO921236L NO921236L (no) | 1992-03-30 |
| NO921236D0 NO921236D0 (no) | 1992-03-30 |
| NO301480B1 true NO301480B1 (no) | 1997-11-03 |
Family
ID=10680087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO921236A NO301480B1 (no) | 1990-08-02 | 1992-03-30 | Fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av basisk fibroblastfaktor |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5348863A (no) |
| EP (1) | EP0495049B1 (no) |
| JP (1) | JPH05501655A (no) |
| KR (1) | KR100191697B1 (no) |
| CN (1) | CN1033810C (no) |
| AT (1) | ATE152122T1 (no) |
| AU (1) | AU643822B2 (no) |
| CA (1) | CA2066174A1 (no) |
| CZ (1) | CZ286237B6 (no) |
| DE (1) | DE69125810T2 (no) |
| DK (1) | DK0495049T3 (no) |
| ES (1) | ES2103822T3 (no) |
| FI (1) | FI921428A (no) |
| GB (1) | GB9017008D0 (no) |
| GR (1) | GR3024111T3 (no) |
| HU (1) | HU212671B (no) |
| IE (1) | IE912729A1 (no) |
| IL (1) | IL98988A (no) |
| MY (1) | MY107334A (no) |
| NO (1) | NO301480B1 (no) |
| NZ (1) | NZ239204A (no) |
| PH (1) | PH31240A (no) |
| PT (1) | PT98544B (no) |
| RU (1) | RU2093519C1 (no) |
| WO (1) | WO1992002539A1 (no) |
| YU (1) | YU48309B (no) |
| ZA (1) | ZA916026B (no) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993015753A1 (fr) * | 1992-02-14 | 1993-08-19 | Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. | Medicament contre les maladies des voies aeriennes |
| WO1995028949A1 (en) * | 1994-04-21 | 1995-11-02 | Novo Nordisk A/S | Heparin-binding protein for the treatment of sepsis and processes for its preparation |
| US5939390A (en) * | 1995-03-09 | 1999-08-17 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition |
| US6274712B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-08-14 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137 |
| IL141647A0 (en) | 2001-02-26 | 2002-03-10 | Yeda Res & Dev | Synthetic human peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| WO2004060403A2 (en) | 2003-01-06 | 2004-07-22 | Angiochem Inc. | Aprotinin and anglos as carriers across the blood-brain barrier |
| MXPA05007552A (es) | 2003-01-14 | 2006-05-19 | Teva Pharma | Formulaciones parenterales de un peptido para el tratamiento de lupus sistemico eritematoso. |
| US8618054B2 (en) | 2004-05-05 | 2013-12-31 | Valorisation-Rechereche Société en Commandite | Interleukin-1 receptor antagonists, compositions, and methods of treatment |
| PL1751175T3 (pl) | 2004-05-05 | 2013-03-29 | Valorisation Recherche Soc En Commandite | Antagoniści receptora IL-1, kompozycje i sposoby leczenia |
| EP2366786A3 (en) | 2005-05-05 | 2012-08-29 | VALORISATION HSJ, Société en Commandite | Cytokine receptor modulators and uses thereof |
| US9365634B2 (en) | 2007-05-29 | 2016-06-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
| EP2164866B1 (en) | 2007-05-29 | 2014-05-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
| CN102026667B (zh) | 2008-04-18 | 2014-06-25 | 安吉奥开米公司 | 紫杉醇、紫杉醇类似物或紫杉醇结合物的药物组合物及相关制备方法和用途 |
| JP2012505637A (ja) | 2008-10-15 | 2012-03-08 | アンジオケム，インコーポレーテッド | Ｇｌｐ−１アゴニストのコンジュゲート及びその使用 |
| MX2011004019A (es) | 2008-10-15 | 2011-06-24 | Angiochem Inc | Conjugados de etoposido y doxorubicina para entrega de farmacos. |
| CA2745524C (en) | 2008-12-05 | 2020-06-09 | Angiochem Inc. | Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof |
| BRPI0922611A2 (pt) | 2008-12-17 | 2018-11-06 | Angiochem Inc | inibidores de metaloproteína de matriz de membrana tipo 1 e usos dos mesmos |
| CA2759129C (en) | 2009-04-20 | 2018-12-11 | Angiochem Inc. | Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog |
| MX2012000016A (es) | 2009-07-02 | 2012-03-26 | Angiochem Inc | Conjugados de peptidos multimericos y sus usos. |
| CA2803646A1 (en) | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Angiochem Inc. | Short and d-amino acid-containing polypeptides for therapeutic conjugates and uses thereof |
| SG11201509430WA (en) * | 2013-05-16 | 2015-12-30 | Agency Science Tech & Res | Heparan sulphates |
| US10493012B2 (en) | 2014-11-19 | 2019-12-03 | Agency For Science, Technology And Research | Cosmetic use of heparan sulphate |
| JP6709217B2 (ja) | 2014-11-19 | 2020-06-10 | エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ | 皮膚の修復および／または再生において使用するためのヘパラン硫酸 |
| ES2826827T3 (es) | 2015-06-15 | 2021-05-19 | Angiochem Inc | Métodos para el tratamiento de carcinomatosis leptomeníngea |
| CN105294851B (zh) * | 2015-12-07 | 2019-02-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用 |
| CN114965839A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-08-30 | 朗肽生物制药股份有限公司 | 人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4956455A (en) * | 1984-03-05 | 1990-09-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Bovine fibroblast growth factor |
| US4785079A (en) * | 1984-11-09 | 1988-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | Isolation of fibroblast growth factor |
| US5026839A (en) * | 1985-12-17 | 1991-06-25 | Synergen, Inc | DNA encoding a basic fibroblast growth factor |
| DE3811921A1 (de) * | 1988-04-09 | 1989-10-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen, die n-terminal mit prolin beginnen |
| US5136025A (en) * | 1990-04-04 | 1992-08-04 | California Biotechnology Inc. | Method to purify basic fibroblast growth factor |
-
1990
- 1990-08-02 GB GB909017008A patent/GB9017008D0/en active Pending
-
1991
- 1991-07-29 CZ CS19912362A patent/CZ286237B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 YU YU131991A patent/YU48309B/sh unknown
- 1991-07-29 IL IL9898891A patent/IL98988A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 CA CA002066174A patent/CA2066174A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-30 US US07/842,177 patent/US5348863A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-30 ES ES91913996T patent/ES2103822T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-30 DK DK91913996.4T patent/DK0495049T3/da active
- 1991-07-30 WO PCT/EP1991/001428 patent/WO1992002539A1/en active IP Right Grant
- 1991-07-30 HU HU9201101A patent/HU212671B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 AU AU83044/91A patent/AU643822B2/en not_active Ceased
- 1991-07-30 AT AT91913996T patent/ATE152122T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 EP EP91913996A patent/EP0495049B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-30 KR KR1019920700725A patent/KR100191697B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 JP JP3513137A patent/JPH05501655A/ja active Pending
- 1991-07-30 DE DE69125810T patent/DE69125810T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-30 PH PH42854A patent/PH31240A/en unknown
- 1991-07-30 RU SU915011557A patent/RU2093519C1/ru active
- 1991-07-31 ZA ZA916026A patent/ZA916026B/xx unknown
- 1991-07-31 MY MYPI91001378A patent/MY107334A/en unknown
- 1991-07-31 NZ NZ239204A patent/NZ239204A/xx unknown
- 1991-08-01 PT PT98544A patent/PT98544B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-08-01 IE IE272991A patent/IE912729A1/en unknown
- 1991-08-02 CN CN91105269A patent/CN1033810C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-03-30 NO NO921236A patent/NO301480B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-04-01 FI FI921428A patent/FI921428A/fi unknown
-
1997
- 1997-07-16 GR GR970401761T patent/GR3024111T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO301480B1 (no) | Fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av basisk fibroblastfaktor | |
| JP3205578B2 (ja) | キメラ繊維芽細胞成長因子 | |
| CN110845603A (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| IE81151B1 (en) | Purified ciliary neurotrophic factor | |
| Abad et al. | Properties of a chloroplast enzyme that cleaves the chlorophyll a/b binding protein precursor: optimization of an organelle-free reaction | |
| Kim et al. | Construction of chimeric human epidermal growth factor containing short collagen-binding domain moieties for use as a wound tissue healing agent | |
| EP0587541B1 (en) | Process to purify the big-endothelin protein | |
| DE69324547T2 (de) | Protease, die menschlichen Hepatozytwachtumsfaktor umsetzt, und dafür kodierendes Gen | |
| US6077694A (en) | Method for over-expression and rapid purification of biosynthetic proteins | |
| Gonnelli et al. | Purification and characterization of two leaf polypeptide inhibitors of leaf protease from alfalfa (Medicago sativa) | |
| EP0527778A1 (en) | IMPROVED PROCESS FOR PURIFYING RECOMBINANT PROTEINS AND METHODS USEFUL THEREIN. | |
| CA2369973C (en) | Preparation of pancreatic procarboxypeptidase b, isoforms and muteins thereof and their use | |
| JP2561149B2 (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| JPH06327489A (ja) | 遺伝子操作による生物活性β−ＮＧＦの生産方法 | |
| JP2877253B2 (ja) | 融合タンパク質の選択的切断方法 | |
| JP2845558B2 (ja) | メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列 | |
| KR20210148288A (ko) | 생체내 리폴딩된 항체 단편의 클로닝 및 발현 | |
| Betbeder et al. | Production of homogeneous basic fibroblast growth factor by specific enzymatic hydrolysis of larger microheterogeneous molecular forms | |
| JPS61192288A (ja) | ヒトエラスタ−ゼ２の生物工学的製造 | |
| JP2780160B2 (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| MXPA01009979A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use | |
| Banaś-Gruszka et al. | Amino acid composition ana N-terminal residues of goose, duck and hen prothrombin | |
| Fiol | Cloning, production and site-directed mutagenesis of bovine pancreatic ribonuclease A in Escherichia coli | |
| Chen | Biochemical and molecular biological studies on the mammalian multiubiquitinating enzyme E2 (25K) | |
| JPH02222690A (ja) | ヒト５―リポキシゲナーゼの酵母による製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN JANUARY 2001 |