CZ286237B6 - Způsob enzymové přípravy základního fibroplastového růstového faktoru - Google Patents
Způsob enzymové přípravy základního fibroplastového růstového faktoru Download PDFInfo
- Publication number
- CZ286237B6 CZ286237B6 CS19912362A CS236291A CZ286237B6 CZ 286237 B6 CZ286237 B6 CZ 286237B6 CS 19912362 A CS19912362 A CS 19912362A CS 236291 A CS236291 A CS 236291A CZ 286237 B6 CZ286237 B6 CZ 286237B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- bfgf
- heparin
- sequence
- pepsin
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 title claims description 125
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 title claims description 103
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 11
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102100039652 Pepsin A-5 Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 229940066716 pepsin a Drugs 0.000 claims abstract description 26
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 102000003908 Cathepsin D Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000258 Cathepsin D Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 5
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 4
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 19
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 6
- NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N Ile-Thr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 abstract description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 abstract description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 44
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 31
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 29
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 29
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 13
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 9
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 4
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ser-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- IXNRIBJPEOUGGB-DIKMWTQISA-N (2s)-6-amino-n-[(2r)-2-aminohexanoyl]-n-[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxycyclohexyl)propanoyl]-2-(4-nitroanilino)hexanamide Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N(C(=O)[C@H](N)CCCC)C(=O)[C@H](CCCCN)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1CCC(O)CC1 IXNRIBJPEOUGGB-DIKMWTQISA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQUFOZNPBIIJTN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;sodium Chemical compound [Na].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O OQUFOZNPBIIJTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 4-(3-phosphonopropyl)piperazine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CN(CCCP(O)(O)=O)CCN1 CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N Ala-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- TZDNWXDLYFIFPT-BJDJZHNGSA-N Ala-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O TZDNWXDLYFIFPT-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N Ala-Leu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N Arg-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZXQPJYWZSFGWJB-AVGNSLFASA-N Glu-Cys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZXQPJYWZSFGWJB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HPAIKDPJURGQLN-KBPBESRZSA-N Gly-His-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 HPAIKDPJURGQLN-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DKJWUIYLMLUBDX-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O DKJWUIYLMLUBDX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N Gly-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010027339 H-norleucyl-hexahydrotyrosyl-lysine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- QMUHTRISZMFKAY-MXAVVETBSA-N His-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N QMUHTRISZMFKAY-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N His-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N Leu-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YNNPKXBBRZVIRX-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YNNPKXBBRZVIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- WLJYLAQSUSIQNH-GUBZILKMSA-N Pro-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 WLJYLAQSUSIQNH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- JIPVNVNKXJLFJF-BJDJZHNGSA-N Ser-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N JIPVNVNKXJLFJF-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N Ser-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- QJKPECIAWNNKIT-KKUMJFAQSA-N Ser-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QJKPECIAWNNKIT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- KVEWWQRTAVMOFT-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KVEWWQRTAVMOFT-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- FFCRCJZJARTYCG-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O FFCRCJZJARTYCG-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N Val-Asp-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- ZXAGTABZUOMUDO-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZXAGTABZUOMUDO-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- DLRZGNXCXUGIDG-KKHAAJSZSA-N Val-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DLRZGNXCXUGIDG-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 108010054847 carboxypeptidase P Proteins 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- HPAIKDPJURGQLN-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-histidyl-L-phenylalanine Natural products C=1C=CC=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 HPAIKDPJURGQLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010012988 lysyl-glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Látka označovaná bFGF se připravuje (i) tvorbou adičního produktu z heparinu nebo síranu heparanu a bFGF, který obsahuje v polohách 9-10 vazbu Leu-Pro, (ii) na adiční produkt se působí pepsinem A nebo kathepsinem D, čímž se štěpí právě uvedená vazba, a (iii) z adičního produktu se uvolní takto vzniklý zkrácený bFGF. Tento postup se dá využít k přípravě formy 146 aminokyselin bFGF z delších forem bFGF. Také se dá využít k získání jediné formy bFGF ze směsi různých bFGF, pokud se liší pouze tím, že mají odlišné N-konce.ŕ
Description
Vynález se týká způsobu přípravy bazického fibroblastového růstového fakturu (Basic fibroblast growth factor, nadále bFGF).
Dosavadní stav techniky
Ten byl původně izolován z mozku a hypofyzy jako polypeptid, obsahující 146 aminokyselin (Esch. a spol., PNAS USA 82, 6507-6511, 1985). Gen pro bFGF skotu byl klonován (Abraham aspol., Science 233, 545-548 (1986)). Sekvence nukleotidu předpokládala obsah 155 aminokyselin bFGF translačního produktu. Z dalších prací vyplynulo, že bFGF o 154 aminokyselinách lze extrahovat spolu s bFGF o 146 aminokyselinách z normální hypoíyzámí tkáně za přidání enzymových inhibitorů (Ueno a spol., Biochem. Biophys. Res. Comm. 138, 580-588 (1986)) a že kyselé proteázy z mozku a hepatomových buněk štěpí bFGF (Kladsbrun a spol., PNAS USA 85. 1839-1843 (1989).
Proteinová inženýrská technologie umožnila dostupnost četných rekombinantních růstových faktorů pro terapeutické účely. Jakmile byly tyto růstové faktory konkretizovány, mohly se zpracovávat do směsí různých forem. V tomto směru nejsou faktory FGF výjimkou (Barr a spol., J. Biol. Chem. 263, 31, 16471-16478, 1988).
Podstata vynálezu
Nyní byl nalezen způsob přípravy bFGF se zkrácením na N-konci. Tento způsob se dá použít k získání sledu 146 aminokyselin bFGF z delších forem a získá se tím jediná forma bFGF ze směsi takových látek. Takto připravená forma je čistá a není znečištěna dalšími či jinými formami bFGF.
Ve shodě s tím je předmětem tohoto vynálezu postup pro přípravu bFGF, který zahrnuje (i) přípravu adičního produktu zheparinu nebo síranu heparanu a bFGF s vazbou 9-10 LeuPro, (ii) na získaný produkt se působí pepsinem A nebo kathepsinem D, čímž se štěpí právě uvedená vazba, (iii) z adičního produktu se uvolní takto připravený bFGF.
Ve stupni (i) se může použít směs dvou či více bFGF, pokud obsahují vazbu 9-10 Leu-Pro, které mají stejnou sekvenci aminokyselin od polohy 11 až kC-konci a které mají různé N-koncové aminokyseliny. Sekvence jejich aminokyselin se může lišit jen tím, že mají jinou N-koncovou aminokyselinu. Typicky je obvykle jediným rozdílem v sekvencích bFGF to, že počet Nkoncových zbytků aminokyselin se liší. Jeden z bFGF může mít navíc jednu či více Nkoncových aminokyselin než další bFGF. Nebo jinak, sekvence aminokyselin na N-konci před polohou 9 každého bFGF může obsahovat lišící se zbytky aminokyselin.
Je tedy možno použít postup podle tohoto vynálezu na jakoukoli směs bFGF, kde sekvence aminokyselin každého bFGF ve směsi začíná N-koncovým způsobem aminokyselin s číslem
- 1 CZ 286237 B6 nižším než 9 a zmíněné bFGF mají lišící se N-zakončení. Směs, použitá ve stupni (i), může být tedy složena z různých bFGF obecného vzorce
NH2-(AA)X-Leu-Pro-Y-COOH kde AA znamená zbytek jakékoli aminokyseliny, x znamená nulu nebo celé kladné číslo a Y znamená sekvenci aminokyselin (11-155) v bFGF. Celá délka bFGF odpovídá zbytkům 155 aminokyselin a může se označovat jako 155-bFGF nebo (l-155)bFGF. Sekvence aminokyselin lidského (l-155)bFGF je zachycena v sekvenčním sledu č. 1 na str. 19. Postup podle tohoto vynálezu je tedy možno použít najeden nebo směs dvou či více (l-155)bFGF až (8-155) bFGF a v takovém případě x ve výše uvedeném obecném vzorci znamená celé číslo od 8 do 1, a (AA)X znamená sekvence, jak jsou zachyceny v sekvenčním sledu 2 až 6 na str. 19-21, Ile-Thr-Thr, Thr-Thr nebo Thr. Zvláště pak se dá vynález použít na směs 154 zbytků aminokyselin bFGF [(2-155)bFGF] a 153 zbytků aminokyselin [bFGF (3-155)bFGFJ.
Faktor bFGF nebo směs takových bFGF se obvykle získá rekombinační DNA technikou. V takových směsích se získají lišící se formy bFGF, a to v důsledku postupů, probíhajících v přechodném produktu naN-koncích. Faktor bFGF může být lidského nebo jiného původu.
Adiční produkt činidla, která chrání bFGF a je vybráno z heparinu nebo sulfátu heparanu, a směsí bFGF se připravuje jakýmkoli vhodným způsobem. Obvykle se používají obě tyto složky, tedy chránící skupina a bFGF, případně více bFGF ve vodném roztoku, a tento roztok je možno pufrovat. K zabránění oxidace proteinu se může přidávat antioxidans, jako je dithiothreitol. Poměr bFGF ke chránícímu činidlu může kolísat od 0,5 : 1 až k 10 : 1 (hmotnostně), například 1:1 až 5:1. Ochrana bFGF ve formě adičního produktu chrání tento faktor před nežádoucí hydrolýzou, přidá-li se pepsin A.
Potom se s adičním produktem uvádí do styku pepsin A (EC 3.4.23.1) nebo kathepsin D (EC 3.4.23.5). V důsledku toho dojde ke specifickému štěpení vazby 9-10 Leu-Pro v bFGF, vázaném v adičním produktu. Enzym může být v roztoku adičního produktu a přidává se tedy k roztoku bFGF a chránícího činidla. Enzym se obvykle používá v roztoku, jehož pH bylo upraveno na hodnotu 4 až 6.
Roztok se potom inkubuje v případě použití pepsinu A například na 30 minut až 10 hodin, například na 1 až 8 hodin. V případě kathepsinu D je doba inkubace mnohem delší, například 90 až 130 hodin, nejvhodněji asi 110 hodin. Inkubační teplota může kolísat od 5 °C do teploty místnosti, například se může pohybovat kolem 10 °C. V inkubování se pokračuje, až reakce dokonale proběhne.
Jinak se může chránící činidlo znehybnit na podkladu, takže tvoří afmitní kolonu. Může se použít kterýkoli vhodný podklad, jako je agarosový gel nebo malé kuličky z gelu zesítěného dextranu (například sepharosy). Roztok bFGF, případně většího množství bFGF se potom nalije do kolony, tam se váže na chránící činidlo a zadrží se tím v koloně. Potom se kolonou prolije roztok enzymu a posléze se zkrácená jediná forma bFGF může eluovat z kolony. To se dá docílit lineárním gradientem vodného roztoku chloridu sodného.
Postupem podle tohoto vynálezu se dá získat čistá forma bFGF. Zvláště pak se dá získat forma 146 aminokyselin bFGF, označená (10-155)bFGF, a takto získaný bFGF se dá využít při léčbě zranění a popálenin. K takovému účelu se dá aplikovat v jakékoli vhodné úpravě či přípravku. Přípravky pochopitelně obsahují typicky fyziologický vhodný nosič či ředidlo.
Další příklady blíže dokládají význam tohoto vynálezu. Jsou připojeny příklady příprav a příklady srovnávání.
-2CZ 286237 B6
Příklad přípravy: příprava 154/153 formy bFGF
Konstrukce syntetické DNA sekvence bFGF a exprese plazmidu s takovou sekvencí byla provedena podle postupu, který je popsán v evropské pat. přihlášce 363 675. Fermentování a způsob čištění byla provedeny takto:
a) Fermentační postup
Mikrobiální kmen E. coli, typ B ze sbírky Pasteurova ústava, byl transformován plazmidem, obsahujícím jak lidský gen kódující bFGF, tak i geny pro tetracyklinovou rezistencí. Takto transformovaný kmen byl použit k produktu rekombinantního neglykosylovaného lidského bFGF (b-FGF, human bFGF). Z tohoto kmene byla připravena základní buněčná banka (15 lyofilizovaných ampulek) a pracovní buněčná banka (70 ampulek, uskladněných za teploty -190 °C v kapalném dusíku). Obsah jedné z ampulek pracovní buněčné banky byl použit jako očko fermentační fáze.
Fermentační postup se provádí v desetilitrových fermentačních nádobách, naplněných čtyřmi litry kultivačního prostředí. Do prostředí se přidává hydrochlorid tetracyklinu s úmyslem dodržet podmínky selekce kmene. Po 20 hodinách růstu za teploty 37 °C činí hmotnost konečné získané biomasy 42 ± 2 g sušiny na litr. Podle měření srovnávací gelovou elektroforézou to odpovídá produkci bFGF 2500 ± 500 mg na litr.
Během fermentačního postupu se musí zajistit obohacování čistým kyslíkem, aby se tím zajistil dostatečný mikrobiální růst.
b) Počáteční čištění
Buňky mikroorganismu se oddělí od kapalného podílu fermentační kapaliny odstředěním. Získaná pevná hmota se znovu suspenduje ve fosforečnanovém pufru (fosforečnan sodný), obsahujícím chlorid sodný. Nejméně 3 průchody vysokotlakovým homogenizátorem jsou nutné pro účinné a úplné rozrušení buněk. Takto získaný buněčný lyzát se vyčeří odstředěním a kapalina nad pevným podílem se oddělí pro další zpracování.
c) Čištění
Čištěným supematantem se naplní kolona se sepharosou S Fast Flow (obchodní značka, katex) a produkt se z této kolony eluuje použitím gradientu se zvyšující se koncentrací chloridu sodného ve fosfátovém pufru. Produkt se dále čistí na koloně Heparin Sepharose 6B s následujícím eluováním gradientem zvyšující se koncentrace chloridu sodného ve fosfátovém pufru. Posléze se výměna pufru provede na Sephadex-u G25 a získá se tím produkt v pufru z fosforečnanu sodného a kyseliny ethylendiamintetraoctové.
d) Uvedení kolony do stavu pro další použití
Kolony jak se Sepharose S Fast Flow, tak i Sephadex G 25, se promyjí roztokem hydroxidu sodného. Kolona s Heparin Sepharosou se promývá střídavě roztoky o hodnotě pH 8,5 a 5,5, obsahujícími vždy chlorid sodný v koncentraci 3 M.
Tímto způsobem se získá forma 154/153 bFGF a je to přibližně směs 50 na 50, sestávající z lidského bFGF o 154 aminokyselinách [(2-155)bFGF] ze sekvence 155 aminokyselin, jak ji uvádí Abraham a spol., a jak je to uvedeno v sekvenčním sledu č. 1. na str. 19, ale bez koncového Met zbytku, a
-3CZ 286237 B6 lidského bFGF o 153 aminokyselinách [(3-155)bFGF] ze sekvence 155 aminokyselin, jak je to uvedeno v sekvenčním sledu č. 1 na str. 19, ale bez N-koncových zbytků Met a Ala.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Síran heparanu jako chránící činidlo: pepsinu A
1. Příprava vzorku proteinu
Použije se forma 154/153 z příkladu přípravy na str. 4, a to v koncentraci 1,8 mg/ml v pufrovaném roztoku složek:
mM dihydrogenfosforečnanu sodného,
0,1 mM disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové, pH: 6,0
Aby nedošlo k jakékoli oxidaci v průběhu kontrolované hydrolýzy, přidá se na 1,8 mg bFGF 20 mg dithiothreitolu.
2. Provedení enzymové hydrolýzy gFGF
a) Standardní roztok chránícího činidla, tzv. roztok 1:
mg chránícího činidla na 1 ml vody.
b) Příprava roztoku bFGF a chránícího činidla:
100 μΐ vzorku proteinu μΐ roztoku 1 μΐ 1 M roztoku natriumcitrátu, pH 3,0 μΐvody pg (18 μΐ) pepsinu A z prasečí střevní sliznice, konečný objem: 200 μΐ.
Jako chránící činidlo se použije síran heparanu, a poměr bFGF/chránicí činidlo činí hmotnostně 1:1. Pepsin A (EC:3.4.23.1) se přidává k roztoku bFGF a chránícího činidla za pH 4,0 a vše se inkubuje hodinu za teploty 10 °C.
3. Kinetika enzymové hydrolýzy
Průběh hydrolýzy byl sledován v různých časových odstupech pomocí SDS-PAGE analýzy. Vzorky digesční směsi byly analyzovány za 1, 20, 40 a 60 minut tímto způsobem: oddělení formy 154/153 bFGF od formy 146 bFGF bylo zjištěno analýzou za použití Phast Systému (ochranná značka, Pharmacia). Se zřetelem na pufř vzorku byly podmínky přípravy vzorku definovány tak, aby nedošlo k jakémukoli vysrážení proteinu ze vzorku v pásmu vysoké gelové hustoty:
μΐ roztoku proteinu μΐ 40 mM pufru Tris/HCl, 4 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 10% SDS 20% metkaptoethanlu, pH 8,0
-4CZ 286237 B6 μΐ dimethylsulfoxidu, a μΐ bromenolové modři (0,3%).
Denaturace vzorku byla provedena jeho zahříváním na 100 °C po dobu 5 minut. Z analýz vzorku se ukázalo, že ve vzorku, který byl odebrán z digesční směsi za hodinu, zmizel fragment 154/153 bFGF dokonale. Byl zjištěn jeden větší fragment, a ten odpovídá přesně rekombinovanému 146— bFGF fragmentu, který byl použit jako referenční látka.
4. Čištění bFGF
Reakční směs byla přímo nalita na heparin-agarosovou kolonu, jež byla uvedena do rovnovážného stavu za použití lOmM Trispufru o pH 8,0 s obsahem 0,5M chloridu sodného. Eluování bFGF bylo provedeno použitím 1,5M roztoku chloridu sodného za použití gradientu 0,5 až 3M chloridu sodného. Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovou metodou za použití 154/153 bFGF jako referenční látky.
5. Elektroblotování formy 146 bFGF
Postup, použitý při tomto elektroblotování jako analýzy, se podobá tomu, který popsal Ploug a spol., Anal. Biochem. 181, 33-39 (1989). Použitá membrána: Immobilon PVDF (Millipore).
Po provedení elektroforézy byl gel uveden do rovnovážného stavu přechodným pufrem:
ml CAPS, tj. kyselina 3-(cyklohexylamino)-l-propansulfonová, pH 11,0, 20 % methanolu, a to po dobu 10 minut. Čistým methanolem byl zvlhčen Immobilon PVDF, uveden do styku s právě řečeným pufrem. Byla použita polosuchá blokovací soustava (Kyhse-Andersen, J. Biochem. Biophys. Methods 10, 203-209, 1984) a elektrotransfer probíhal 2 hodiny při 0,2 mA/cm2.
Membrána PVDF byla propláchnuta vodou a potom vybarvována minutu v 0,1% roztoku Coomassie brilantní modři R-250 v 50% methanolu. Nadbytek barviva byl odstraněn krátkým opláchnutím vodou s následujícím odbarvením v 40% methanolu, obsahujícím 10 % octové kyseliny, po dobu 5-10 minut. PVDF membrána pak byla opatrně propláchnuta vodou před dalším postupem.
6. Analýza sekvence koncových aminokyselin
Vyříznuté plošky PVDF membrány, obsahující vybarvený protein, se umístí jako jediná vrstva na filtrační papír, upravený Polybrenem. Následné sledování bylo proveden na Applied Biosystems Sequencer Model 470 A s přímým spojením na PTH-amino acid analyzer Model 120 A.
Prvé 3 aminokyseliny z NfL-koncové části proteinu, jež byly za těchto podmínek zjištěny, byly:
Pro-Ala-Leu.
Tyto aminokyseliny odpovídají třem aminokyselinám aminokoncové formy 146-bFGF.
7. Laserová denzitometrická analýza
Tato analýza byla provedena s úmyslem stanovit procento 146-bFGF, které vzniká za hodinu hydrolýzou 154/153-bFGF působením pepsinu A. Po hodině bylo 50 μΐ reakční směsi smícháno s 50 μΐ SDS-denaturačního pufru, a za přesně stejných podmínek byly denaturovány působením
-5CZ 286237 B6
SDS vzorky bFGF o různých koncentracích proteinu. Tyto vzorky byly pak elektroforeticky rozděleny na gelu PAA 4/30 (Pharmacia). Denzitometrie každého píku byla analyticky zjištěna za použití registračního integrátoru LKB BRO-Ma 2220. Za použití standardní křivky, získané za těchto podmínek, bylo zjištěno, že koncentrace formy 146-bFGF odpovídá 91 % koncentrace výchozího proteinu 154/153-bFGF.
8. Výtěžek 146-bFGF po afinitním čištění.
Výtěžek enzymové hydrolytické reakce byl také zjištěn po čištění formy 146-bFGF na koloně s heparin-agarosou. 1,64 mg reakční směsi ze stupně 2 zde nahoře se vlije na heparinagarosovou kolonu, uvedenou do rovnovážného stavu působením 10 mM pufru Tris o pH 8 za přítomnosti 0,5m roztoku chloridu sodného. Při pH 8 není pepsin A vůbec aktivní, komplex mezi sulfátem heparanu a bFGF se destabilizuje, což umožňuje adsorpci bFGF na heparinagorosu, jež je v prostředí skutečně v nadbytku. Potom se bFGF eluuje působením 1,5M roztoku chloridu sodného a získá se tím 1,14 mg formy 146-bFGF.
Celkový výtěžek aminokyselinové formy 146-bFGF po kontrolované hydrolýze za použití sulfátu zeparanu jako chránícího činidla a afinitní čisticí kolony činí 73 %.
Příklad 2: Heparin jako chránící skupina: pepsin A
Opakuje se postup dle příkladu 1 s tou změnou, že se jako chránící skupina použije heparin, přičemž poměr bFGF kheparinu činí hmotnostně 5:1. Alikvotní podíly digesční směsi se analyzují za 2 minuty, potom 4, 6 a 8 hodin s tím, že celková doba inkubace se rovná 8 hodin. Roztok bFGF a heparinu má toto složení:
100 μΐ proteinového vzorku μΐ roztoku 2 μΐ 1M roztoku sodné soli kyseliny citrónové, pH 3,0 μΐ vody pg pepsinu A, celkový objem na konci: 200 μΐ.
Roztok 2 se skládá ze 100 μΐ roztoku 1 a 900 μΐ vody. Za těchto podmínek byl také získán po době inkubace jen jeden fragent. Tento fragment má přibližnou molekulovou hmotnost 16 200 podle stanovení SDS-Page-analýzou.
Analýzou terminální sekvence aminokyselin byly vyhodnoceny tytéž 3 N-koncové aminokyseliny, jako v příkladu 1:
Pro-Ala-Leu.
Příklad 3: Heparin jako chránící činidlo: pepsin A
Výtěžek kontrované hydrolýzy BFGF s chránící heparinovou skupinou byl také zjištěn po čištění fragmentu 146-bFGF na heparin-agarosové koloně. Po sedmi hodinách hydrolýzy za týchž podmínek, jako v příkladu 2, obsahovalo reakční prostředí 1,54 mg bFGF. Po průchodu heparinagarosovou kolonou, uvedenou do rovnovážného stavu použití 10 mM natriumfosfátového pufru o pH 8,0 za přítomnosti 0,5M roztoku chloridu sodného, bylo uvedeno 1,5M roztokem chloridu sodného 1,02 mg 146-bFGF.
-6CZ 286237 B6
Celkový výtěžek získaného 146-bFGF po afinitním kolonovém čištění za použití heparinu jako chránícího činidla byl 69 %.
Příklad 4: Heparin, imobilizovaný na agarose, jako chránící činidlo: pepsin A
1. postup enzymové hydrolýzy bFGF
Heparin-agarosová kolona (7 ml gelu, obsahujícího 5,6 mg heparinu) se uvede do rovnovážného stavu působením 10 mM dihydrofosforečnanu sodného, 0,1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,5M chloridu sodného o pH 4,0 za teploty 10 °C. Na afinitní kolonu se vlije 154/153— bFGF, a potom 0,18 mg pepsinu A, zředěného týmž fosfátovým pufrem. Enzym se recirkuluje kolonou za rychlosti průtoku 0,5 ml/min po dobu 6 hodin.
Po právě této době se kolona promyje 10 mM natriumfosfátového pufru o pH 7,0, 0,1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,5M chloridu sodného (3 následné objemy), a potom gradientem chloridu sodného od 0,5M do 3M. Dále se bFGF eluuje 1,5M roztokem chloridu sodného.
2. Analýza sekvence koncových aminokyselin
Po elektroforéze byl gel elektroblotován na Immobilonu PVDF za použití polosuché blotovací soustavy, jak je to popisováno v příkladu 1. Vyříznuté plošky PVDF membrány, obsahující vybarvený protein, byl umístěn jako jednotná vrstva na filtračním papíru, upraveném Polybrenem. Prvé 3 aminokyseliny na NH2-koncové části proteinu, jak byly stanoveny za těchto podmínek, byla
Pro-Ala-Leu.
Tyto aminokyseliny odpovídají třem aminokyselinám aminokyselinové koncové části formy 146-bFGF.
3. Výtěžek získaného 146-bFGF
Výtěžek hydrolytické reakce byl zjištěn po kvantitativním stanovení fragmentu 146-bFGF, eluovaného z heparin-agarosové kolony. Bylo získáno 1,28 mg 146-bFGF. Celkový výtěžek při izolaci aminokyselinové formy 146-bFGF (molekulová hmotnost asi 16 200) po kontrolované hydrolýze na heparin-agarosové koloně byl 81 %.
Příklad 5: Heparin jako chránící činidlo: kathepsin D
1. Postup enzymové hydrolýzy bFGF
Opakuje se postup podle příkladu 2 s tou změnou, že se použije kathepsin D ze sleziny skotu místo pepsinu A a jako inkubační doba se volí 110 hodin.
2. Kinetika reakce
Fragment 146-bFGF se během enzymové hydrolýzy objevuje velmi málo a pomalu, ale byl zjištěn za hodinu analýzy SDS-PAGE. Po 72 hodinách nebyla hydrolýza 154/155-bFGF skončena a do reakčního prostředí bylo přidáno 36 pg kathepsinu D. Teprve za dalších 40 hodin byla reakce skončena. Je to dáno nízkou aktivitou kathepsinu D (10 jednotek/mg).
-7CZ 286237 B6
3. Analýza sekvence koncových aminokyselin
Po provedené elektroforéze byl gel elektroblotován na Immobilonu PVDF za použití polosuché blotovací soustavy, jak to bylo popsáno v příkladu 1. Vyříznuté plošky PVDF membrány, obsahující vybarvený protein, byly umístěny jako jediná vrstva na filmu upraveném Polybrenem. Sledování sekvence aminokyselin bylo prováděno na Applied Biosystems Sequencer Analysis Model 4704 se zařazeným PTH-analyzátorem aminokyselin, model 120 A. Prvé tři aminokyseliny z NH2-koncové části proteinu, jak byly stanoveny za těchto podmínek, byly
Pro-Ala-Leu.
Srovnávací příklad 1: Pepsin A bez chránícího činidla
Opakuje se postup dle příkladu 1 stou změnou, že se nepoužije chránící činidlo. Pepsin A rozložil dokonale formu 154/153 bFGF během několika málo minut.
Srovnávací příklad 2: Kathepsin D bez chránícího činidla
Opakuje se postup dle příkladu 5 s tou změnou, že se nepoužije chránící činidlo. Kathepsin D rozložil dokonale formu 154/153 bFGF během několika málo minut.
Srovnávací příklad 3: a-Chymotrypsin
Opakuje se postup dle příkladu 1 s tou změnou, že se místo pepsinu A použije a-chymotrypsin bez jakéhokoli chránícího činidla. α-Chymotrypsin rozložil během několika málo minut formu 154/153 bFGF. Byly testovány různé aniontové sloučeniny se zřetelem na jejich schopnost ochránit bFGF před a-chymotrypsinem:
1. Heparin 3000 (Sigma, H 7516)
Poměr bFGF ku chránícímu činidlu = 1 teplota 10 °C pH 7,5 inkubační doba: 4 hodiny.
Za použití heparinu 3000 jako chránícího činidla byl získán hlavně jeden fragment o přibližné molekulové hmotnosti 14 000, jakož i další štěpné produkty o nižších molekulových hmotnostech, jak to bylo stanoveno z výsledků SDS-PAGE-analýzy.
2. Heparin (Sigma, H 3125)
Poměr bFGF ku chránícímu činidlu hmotnostně = 5 teplota 10 °C pH 7,5 inkubační doba = 4 hodiny.
Za použití tohoto heparinu jako chránícího činidla nebylo chránění substrátu dostačující a došlo ke vzniku četných fragmentů.
3. Síran chondroitinu
Poměr bFGF ku chránícímu činidlu = 1 teplota 10 °C
-8CZ 286237 B6 pH = 7,0 doba inkubace = 2 hodiny.
Chránění bylo nedostačující a byly takto získány četné fragmenty.
4. Dermaten-sulfát poměr bFGF ku chránícímu činidlu = 1 (hmotnostně) teplota 10 °C pH = 7,5 doba inkubování = 2 hodiny.
Chránění bylo nedostačující a byly takto získány četné fragmenty.
5. Kyselina polyasparagová
Poměr bFGF ku chránícímu činidlu = 1 (hmotnostně) teplota = 10 °C pH = 7,5 doba inkubování = 2 hodiny.
Za použití kyseliny polyasparagové jako chránícího činidla bylo chránění nedostačující a byly získány četné fragmenty.
Příklad 6: Heparin nebo heparan-sulfát jako chránící činidlo: pepsin A nebo kathepsin D
1. Protokol pokusu
Proteolytické působení rozpustných komplexů bFGF heparinu a bFGF-heparan-sulfátu v roztoku
1,6 mg 154/153-aminokyselinové formy bFGF bylo komplexně vázáno na 1,6 mg heprinu nebo heparan-sulfátu v 10 mM citrátofosfátového pufhi, pH 4,0, 10 °C. Po hodině doby inkubování bylo přidáno do roztoku 160 pg pepsinu A (Sigma P-6887, 3200 až 4500 jednotek/mg proteinu). Vzorky reakčního prostředí byly odebrány v různých časech a přímo naneseny na heparinSepharosovou kolonu, předem ekvilibrovanou 10 mM fosfátového pufru, pH 8,0 + 0,5m chloridu sodného, 4 °C. Kolona byla důkladně promyta týmž pufrem a bFGF byl eluován 3M chloridem sodným v 10 mM fosfátového pufru, pH 8,0. Spojené frakce byly zbaveny soli a koloně Sephadex G25, předtím ekvilibrované 10 mM fosfátovým pufrem, pH 6,0 a provede se SDSPAGE analýza. Použije-li se jako chránící činidlo heparan-sulfát, pak se za hodinu získá v kvantitativním výtěžku 146-bFGF. Působení pepsinu na komplex bFGF s heparinem se projeví stejným kvantitativním výtěžkem, ale až za 6,5 hodin inkubování.
Působení pepsinu A na bFGF, vázaný na heparin-Sephadexové kolon.
Pomalou rychlostí se vpouští 50 mg 154/153-bFGF (2,5 ml za minutu) na heparin-Sepharosovou kolonu (Pharmacia), rozměrů 2,6 na 22,5 cm, jež byla předtím provedena do rovnovážného stavu za teploty 4 °C použitím 25 mM citrátového pufru o pH 4,0 a 0,5 mM chloridu sodného. Roztok 680 jednotek/ml prasečího pepsinu A (Sigma) v citráto-fosfátovém pufru se kontinuálně recykluje kolonou rychlostí 2,5 ml za minutu po 3 hodiny za teploty 4 °C. Kolona se pak důkladně promyje použitím 25 mM fosfátového pufru o pH 8,0 a 0,5 M roztoku chloridu sodného, čímž se dezaktivuje a vyřadí z činnosti enzym. Potom se postupně eluuje bFGF
-9CZ 286237 B6 použitím 3M chloridu sodného v 25 mM fosfátového pufru za pH 8,0. Frakce, obsahující bFGF, se spojí, zahustí ultrafiltrací na membráně Amicon PM 10 a zbaví se soli na koloně Sephadex G25 (Pharmacia), předtím uvedené do rovnovážného stavu 10 mM fosfátovým pufrem, pH 6,0.
Analýza N-koncové sekvence
Automatizovaná analýza N-koncové sekvence byla provedena na Pulsed Liquid Phase Sequencer, Model 477 A (Aplied Biosystems, CA, USA) s vřazeným 120A pTH-analyzátorem. Byl použit 1-normální program s nepatrnými modifikacemi. Všechny sekvenční materiály, jakož i reagencie pocházely od Aplied Biosystems.
Analýza C-koncové sekvence
Studie časového postupu diegesce bFGF karboxypeptidázou P byla provedena za teploty místnosti v 10 mM pufru octanu sodného o pH 3,8 + 0,05% Brij-35, a to za použití poměru enzymu k substrátu přibližně 1 : 100 (Lu a spol., J. Chromatogr. 447, 351-364 (1988).
Digesce 0,5 až 1 mmol proteinu byly prováděny po 2 hodiny za použití 0,1 až 0,2 pg CpP (Boehringer); jako vnitřní standard byl přidán N-leucin. V různých dobách byly odebírány alikvotní podíly 10/100 pl; analýza aminokyselin byla pak prováděna po automatizované derivatizaci použitím PITC na derivatizéru Model 420 A (Applie Biosystems) a pak injikováním do RP-HPLC s přiřazeným analyzátorem Model 130A. Dělení PCT-aminokyselin ve formě derivátů se provedlo na koloně PTC-08 (P/N 0711-0204, 220x2,0 mm, 5 pm, Applied Biosystem.
Biotesty
Jeden z endotheliálních buněčných kmenů z aorty skotu byl použit ke studiu proliferační odezvy, indukované bFGF. Buňky byly umístěny v množství 2500 buněk na řádku na mikrotitrační destičky o 96 řádkách v kompletním prostředí, obsahujícím Dulbecco's Modified Eagle's medium s dodatkem 13% hovězího séra. Později bylo kompletní prostředí nahrazeno experimentálním prostředím Dulbecco's Modified Eagle's Mediem s přidáním 0,5 % hovězího séra, 0,1% albuminu z hovězího séra (Sigma USA) a požadované koncentrace bFGF (Erbamont). Kultury byly inkubovány po 3 dny, potom byly fixovány formaldehydem a vybarveny 0,5% roztokem krystalové violeti. Po vybarvení byly řádky dokonale vymyty, aby se odstranilo zcela nadbytečné barvivo, methanolem (95%, 0,1 ml na řádku) se z každé řádky extrahovalo barvivo v rozsahu, který je úměrný množství buněk, které vzrostly v poměru na řádku. Destičky pak byly přeneseny k automatickému vyhodnocení na spektrofotometrickou čtečku mikrodestiček, vybavenou filtrem 540 nm.
Pro syntézu aktivátoru plazminogenu byly buňky z hovězí aorty (3x104 buněk v 0,2 ml na řádku) umístěny do 96 řadách mikrotitračních destiček v kompletním růstovém prostředí, jež bylo pak nahrazeno Dulbecco's Modified Eagle's Mediem s přidáním 0,5 % hovězího séra, 0,1 % albuminu z hovězího séra a testované koncentrace bFGF. Po inkubování po dobu 28 hodin byly kultury promyty a byla provedena lyže roztokem, obsahujícím 0,5 % tritonu X-100.
Alikvotní podíly buněčných lyzátů byly testovány na plazminogenový aktivátor a jeho aktivitu za použití chromogenního substrátu (Spectrozyme PL) a plazminogenu (obě reakční složky od Američan Diagnostic lne.) na amidolytický účinek.
-10CZ 286237 B6
2. Výsledky
Kontrolované enzymové zpracování bFGF
Čištěná směs 154/153 byla inkubována se dvěma různými proteázami kyseliny asparagové: pepsin A a kathepsin D. Alikvotní části reakční směsi byly odebírány v různých časových odstupech a analyzovány pomocí SDS-PAGE-analýzy. Ukázalo se, že za nepřítomnosti kteréhokoli chránícího činidla je bFGF rychle zhydrolyzován na drobné peptidy. Naopak, působí-li se na 154/153 bFGF pepsinem A (hmotnostně 10 : 1, pH 4,0, 10 °C) za přítomnosti heparinu nebo síranu heparanu (hmotnostně 1:1), pak dojde postupně k dokonalé konverzi aminokyselinové formy 154/153 na soustavu s nižší molekulovou hmotností, jež souhlasí ve všech směrech s naší standardní aminokyselinovou formou 146/145.
Po elektroblotování na PDVF membráně byl pás s nízkou molekulovou hmotností po enzymovém štěpení analyzován na N-koncovou sekvenci impulzovým sekvenčním zařízením v kapalné fázi. Výsledkem prvých tří cyklů byla jediná homogenní sekvence, a to Pro-Ala-Leu, a to odpovídá nedotčenému N-konci známé formy 146-aminokyselin. Nebyla zjištěna žádná jiná sekvence, což dokazuje, že navzdory přítomnosti tří seskupení Leu-Pro v molekule bFGF, uvede-li se dlouhá forma bFGF do komplexu s heparinem nebo síranem heparanu, štěpí se působením pepsinu A jedině specificky peptidová vazba Leu^-Proio;
Kontrolované proteolytické štěpení heparinem chráněné molekuly bFGF, substituované na NH2 skupině, se dosáhne pepsinem A, a právě tak digescí s kathepsinem D, i když v tomto případě je pro proteolytickou reakci nutná delší inkubační doba, pravděpodobně v důsledku nižší specifické aktivity použitého enzymového přípravku. Přidal—li se za podobných podmínek, ale za pH 7,5, chymotrypsin, byl zjištěn jediný polypeptid (asi 14 000 D) po gelové elektroforéze inkubační směsi, ale bez jakéhokoli důkazu přítomnosti aminokyselinové formy 146.
Enzymové zpracování bFGF na heparin-Sepharosové koloně ve velkém měřítku
Výsledky, získané v roztoku a při reakcích v malých dávkách, byly ověřeny provedením postupu ve velkém za použití 154/153 směsi prodlouženého bFGF, vázaného na heparin-Sepharosovou kolonu. Ve shodě stím bylo naneseno na takovou kolonu, dříve uvedenou do rovnovážného stavu v citrátovo-fosfátovém pufru při pH 4,0, 50 mg 154/153-bFGF. Kolonou byl recyklován kontinuálně roztok pepsinu A 3 hodiny za teploty 4 °C. Potom byla kolona promyta fosfátovým pufrem za alkalického pH se zřetelem inaktivovat enzym a vyřadit ho z funkce. Získaný polypeptid byl eluován z kolony 3 M chloridem sodným ve fosfátovém pufru za pH 8,0. Frakce, obsahující bFGF, byly soustředěny a odsoleny na koloně Sephadexu G 25.
Spojené frakce po analýze SDS-PAGE byly charakterizovány jediným pásem o molekulové hmotnosti, odpovídající standardní formě 146/145 bFGF. Reverzní fázová vysokotlaká kapalinová chromatografie: rovněž jediný pík. Analýza N-koncové sekvence vyústila v jedinou sekvenci, odpovídající správnému a nedotčenému N-konci aminokyselinové formy 146, tj. ProAlar-Leu. Analýza C-koncové sekvence končila zjištěním očekávaného karboxy-koncového seskupení molekuly bFGF, tj. -Ala-Lys-Ser. Takže byl-li bFGF vázán na heparin-Sepharosovou pryskyřici, byl schopen pepsin A štěpit specificky molekulu v místě vazby Leug-Proio za vzniku homogenní aminokyselinové formy 146.
Biotesty bFGF in vitro
Biologická účinnost směsi aminokyselinových forem 154/153 byla srovnána s homogenní formou aminokyselin 146, jak byla získána popsaným proteolytickým postupem. Byly studovány dvě aktivity, a to indukce proliferativní odezvy a syntéza plazminogenového aktivátoru, a to za použití endotheliálních buněk z aort skotu. V obou testech byla potvrzena in vitro biologická
-11CZ 286237 B6 rovnocennost 154/153 při srovnávání s aminokyselinovou formou 146, jak byla získána enzymovým postupem.
Záznamy sekvencí
1. Podklady pro sekvenční sled č. 1 (i) Charakteristiky sekvencí (A) délka: 155 aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (C) řetězec: jediný (D) : topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční sled č. 1
Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly
1015
Gly Ser Gly Ala Phe pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu
2530
Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg
4045
Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gin Leu
5560
Gin Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
70 7580
Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys
9095
Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr
100 105110
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys
115 120125
Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin Lys
130 135140
Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
145 150155
Podklady pro sekvenční sled č. 2 (A) délka: 8 aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (C) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) sekvenční sled č.
Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr 1 5
-12CZ 286237 B6
Podklady pro sekvenční sled 3 (i) Charakteristika sekvencí (A) délka: Ί aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (C) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) sekvenční sled č. 3
Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr
5
Podklady pro sekvenční sled 4 (i) Charakteristika sekvencí (A) délka: 6 aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (C) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) sekvenční sled č. 4
Ala Gly Ser Ile Thr Thr
5
Podklady pro sekvenční sled 5 (i) Charakteristika sekvence (A) délka: 5 aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (C) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) sekvenční sled č.
Gly Ser Ile Thr Thr
5
-13CZ 286237 B6
Podklady pro sekvenční sled 6 (i) Charakteristika sekvence (A) délka: 4 aminokyseliny (B) typ: aminokyseliny (C) řetězec: jediný (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) sekvenční sled č. 6
Ser Ile Thr Thr
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (4)
1. Způsob přípravy (10-155) bazického fibroblastového růstového faktoru ((10-155) bFGF), vyznačující se tím, že
i) se vytvoří adiční produkt heparinu nebo síranu heparanu s jednou sekvencí bFGF či se směsí dvou či více sekvencí bFGF, kde sekvence bFGF nebo každá ze sekvencí bFGF ve směsi je zvolena z (1-155) bFGF až (8-155) bFGF a obsahuje vazbu 9-10 Leu-Pro, ii) na adiční produkt se působí pepsinem A nebo kathepsinem D, čímž se štěpí vazba 9-10 Leu-Pro, a iii) ze získaného produktu se uvolní takto připravený (10-155) bFGF.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že bFGF nebo směs bFGF, použitá ve stupni (i), je původu lidského, myšího nebo hlodavčího.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se ve stupni (i) použije heparin nebo síran heparanu a bFGF nebo směs více bFGF v pufrovaném vodném roztoku, a ve stupni (ii) se přidává do tohoto roztoku pepsin A nebo kathepsin D.
4. Způsob podle nároků laž3, vyznačující se tím, že se heparin nebo síran heparanu imobilizuje na nosiči v afinitní koloně, na kolonu se nanese roztok bFGF nebo směsi bFGF ve stupni (i), takto zatíženou kolonou se vede ve stupni (ii) roztok pepsinu A nebo kathepsinu D a eluováním se ve stupni (iii) získá vzniklý (10-155) bFGF.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909017008A GB9017008D0 (en) | 1990-08-02 | 1990-08-02 | Process for the enzymatic preparation of basic fibroblast growth factor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS236291A3 CS236291A3 (en) | 1992-02-19 |
| CZ286237B6 true CZ286237B6 (cs) | 2000-02-16 |
Family
ID=10680087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS19912362A CZ286237B6 (cs) | 1990-08-02 | 1991-07-29 | Způsob enzymové přípravy základního fibroplastového růstového faktoru |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5348863A (cs) |
| EP (1) | EP0495049B1 (cs) |
| JP (1) | JPH05501655A (cs) |
| KR (1) | KR100191697B1 (cs) |
| CN (1) | CN1033810C (cs) |
| AT (1) | ATE152122T1 (cs) |
| AU (1) | AU643822B2 (cs) |
| CA (1) | CA2066174A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ286237B6 (cs) |
| DE (1) | DE69125810T2 (cs) |
| DK (1) | DK0495049T3 (cs) |
| ES (1) | ES2103822T3 (cs) |
| FI (1) | FI921428A (cs) |
| GB (1) | GB9017008D0 (cs) |
| GR (1) | GR3024111T3 (cs) |
| HU (1) | HU212671B (cs) |
| IE (1) | IE912729A1 (cs) |
| IL (1) | IL98988A (cs) |
| MY (1) | MY107334A (cs) |
| NO (1) | NO301480B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ239204A (cs) |
| PH (1) | PH31240A (cs) |
| PT (1) | PT98544B (cs) |
| RU (1) | RU2093519C1 (cs) |
| WO (1) | WO1992002539A1 (cs) |
| YU (1) | YU48309B (cs) |
| ZA (1) | ZA916026B (cs) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU659723B2 (en) * | 1992-02-14 | 1995-05-25 | Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. | Remedy for airway diseases |
| WO1995028949A1 (en) * | 1994-04-21 | 1995-11-02 | Novo Nordisk A/S | Heparin-binding protein for the treatment of sepsis and processes for its preparation |
| US5939390A (en) * | 1995-03-09 | 1999-08-17 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition |
| US6274712B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-08-14 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137 |
| IL141647A0 (en) | 2001-02-26 | 2002-03-10 | Yeda Res & Dev | Synthetic human peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| ATE512674T1 (de) | 2003-01-06 | 2011-07-15 | Angiochem Inc | Angiopep-1, verwandte verbindungen, und deren verwnedungen |
| CA2513331A1 (en) | 2003-01-14 | 2004-08-05 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd | Parenteral formulations of a peptide for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| CA2607113C (en) | 2004-05-05 | 2013-11-12 | Valorisation-Recherche, Societe En Commandite | Interleukin-1 receptor antagonists, compositions, and methods of treatment |
| US8618054B2 (en) | 2004-05-05 | 2013-12-31 | Valorisation-Rechereche Société en Commandite | Interleukin-1 receptor antagonists, compositions, and methods of treatment |
| JP2008542685A (ja) | 2005-05-05 | 2008-11-27 | ヴァロリザーシヨン・アッシュエスジ，ソシエテ・アン・コマンディット | サイトカイン受容体修飾因子及びその使用 |
| EP2164866B1 (en) | 2007-05-29 | 2014-05-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
| US9365634B2 (en) | 2007-05-29 | 2016-06-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
| ES2721148T3 (es) | 2008-04-18 | 2019-07-29 | Angiochem Inc | Composiciones farmacéuticas de paclitaxel, análogos de paclitaxel o conjugados de paclitaxel y métodos relacionados de preparación y uso |
| CN102245636A (zh) | 2008-10-15 | 2011-11-16 | 安吉奥开米公司 | 用于药物递送的依托泊苷和多柔比星结合物 |
| BRPI0920209A2 (pt) | 2008-10-15 | 2015-12-22 | Angiochem Inc | conjugados de agonistas de glp-1 e usos dos mesmos |
| AU2009322043A1 (en) | 2008-12-05 | 2011-07-07 | Angiochem Inc. | Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof |
| AU2009327267A1 (en) | 2008-12-17 | 2011-07-14 | Angiochem, Inc. | Membrane type-1 matrix metalloprotein inhibitors and uses thereof |
| EP2421562B1 (en) | 2009-04-20 | 2019-03-13 | Angiochem Inc. | Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog |
| CN102596993A (zh) | 2009-07-02 | 2012-07-18 | 安吉奥开米公司 | 多聚体肽结合物以及其应用 |
| BR112012033295A2 (pt) | 2010-07-02 | 2016-10-11 | Angiochem Inc | polipeptídeos curtos e contendo d-aminoácido para conjugados terapêuticos e seu uso |
| RU2700877C2 (ru) * | 2013-05-16 | 2019-09-23 | Эдженси Фо Сайенс, Текнолоджи Энд Ресёрч | Гепарансульфаты |
| CN107249599A (zh) | 2014-11-19 | 2017-10-13 | 新加坡科技研究局 | 硫酸乙酰肝素用于皮肤修复和/或再生 |
| US10493012B2 (en) | 2014-11-19 | 2019-12-03 | Agency For Science, Technology And Research | Cosmetic use of heparan sulphate |
| CA2989400A1 (en) | 2015-06-15 | 2016-12-22 | Angiochem Inc. | Ang1005 for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis |
| CN105294851B (zh) * | 2015-12-07 | 2019-02-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用 |
| CN114965839A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-08-30 | 朗肽生物制药股份有限公司 | 人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4956455A (en) * | 1984-03-05 | 1990-09-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Bovine fibroblast growth factor |
| US4785079A (en) * | 1984-11-09 | 1988-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | Isolation of fibroblast growth factor |
| US5026839A (en) * | 1985-12-17 | 1991-06-25 | Synergen, Inc | DNA encoding a basic fibroblast growth factor |
| DE3811921A1 (de) * | 1988-04-09 | 1989-10-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen, die n-terminal mit prolin beginnen |
| US5136025A (en) * | 1990-04-04 | 1992-08-04 | California Biotechnology Inc. | Method to purify basic fibroblast growth factor |
-
1990
- 1990-08-02 GB GB909017008A patent/GB9017008D0/en active Pending
-
1991
- 1991-07-29 YU YU131991A patent/YU48309B/sh unknown
- 1991-07-29 CZ CS19912362A patent/CZ286237B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 IL IL9898891A patent/IL98988A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 RU SU915011557A patent/RU2093519C1/ru active
- 1991-07-30 CA CA002066174A patent/CA2066174A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-30 HU HU9201101A patent/HU212671B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 DE DE69125810T patent/DE69125810T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-30 PH PH42854A patent/PH31240A/en unknown
- 1991-07-30 US US07/842,177 patent/US5348863A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-30 AU AU83044/91A patent/AU643822B2/en not_active Ceased
- 1991-07-30 DK DK91913996.4T patent/DK0495049T3/da active
- 1991-07-30 AT AT91913996T patent/ATE152122T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 KR KR1019920700725A patent/KR100191697B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 JP JP3513137A patent/JPH05501655A/ja active Pending
- 1991-07-30 EP EP91913996A patent/EP0495049B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-30 ES ES91913996T patent/ES2103822T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-30 WO PCT/EP1991/001428 patent/WO1992002539A1/en active IP Right Grant
- 1991-07-31 NZ NZ239204A patent/NZ239204A/xx unknown
- 1991-07-31 MY MYPI91001378A patent/MY107334A/en unknown
- 1991-07-31 ZA ZA916026A patent/ZA916026B/xx unknown
- 1991-08-01 PT PT98544A patent/PT98544B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-08-01 IE IE272991A patent/IE912729A1/en unknown
- 1991-08-02 CN CN91105269A patent/CN1033810C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-03-30 NO NO921236A patent/NO301480B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-04-01 FI FI921428A patent/FI921428A/fi unknown
-
1997
- 1997-07-16 GR GR970401761T patent/GR3024111T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ286237B6 (cs) | Způsob enzymové přípravy základního fibroplastového růstového faktoru | |
| JP2551551B2 (ja) | デスルファトヒルジン、その製造及びそれを含む製薬組成物 | |
| JPH02504468A (ja) | 繊維芽細胞成長因子のアナログ | |
| Chiesa et al. | Definition and comparison of the phosphorylation sites of the A and B chains of bovine α-crystallin | |
| Bond et al. | Isolation of bovine angiogenin using a placental ribonuclease inhibitor binding assay | |
| JPH0780904B2 (ja) | 新規ポリペプチド，ｄｎａおよびその用途 | |
| US5731412A (en) | Protein, DNA coding for same and method of producing the protein | |
| Bassuk et al. | Expression of biologically active human SPARC inEscherichia coli | |
| US6077694A (en) | Method for over-expression and rapid purification of biosynthetic proteins | |
| FI110669B (fi) | Menetelmiä luonnosta eristettävissä tai synteettisesti valmistettavissa olevien trombiini-inhibiittorien valmistamiseksi | |
| US6225081B1 (en) | Protein, DNA coding for same and method of producing the protein | |
| CA2002210C (en) | Expression and processing of authentic fgf's in yeast | |
| Ashton et al. | Preparation and characterization of anhydrothrombin | |
| EP1173572B1 (en) | Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase | |
| Vallee et al. | Chemical and biochemical properties of human angiogenin | |
| Manjula et al. | Subtilisin modification of monodeamidated ribonuclease-A | |
| Leushner et al. | The effect of ascorbate on the synthesis of minor (non-interstitial) collagens by cultured bovine aortic smooth muscle cells | |
| EP0322084A2 (en) | Tumor cell inhibition factor | |
| Van Kuilenburg et al. | Subunit IV of human cytochrome c oxidase, polymorphism and a putative isoform | |
| Betbeder et al. | Production of homogeneous basic fibroblast growth factor by specific enzymatic hydrolysis of larger microheterogeneous molecular forms | |
| KR930005917B1 (ko) | 에리트로포이에틴의 제조방법 | |
| KR100988706B1 (ko) | 재조합 에리트로포이에틴의 신규한 정제방법 | |
| JPH02195896A (ja) | 融合タンパク質の選択的切断方法 | |
| Fulvia ROLETTO et al. | Escherichia zyxwvutsrqponm | |
| WO1992006112A1 (en) | Activated ctap and analogs thereof and their use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 19910729 |