JPH05501655A - 塩基性線維芽細胞増殖因子の酵素調製法 - Google Patents
塩基性線維芽細胞増殖因子の酵素調製法Info
- Publication number
- JPH05501655A JPH05501655A JP3513137A JP51313791A JPH05501655A JP H05501655 A JPH05501655 A JP H05501655A JP 3513137 A JP3513137 A JP 3513137A JP 51313791 A JP51313791 A JP 51313791A JP H05501655 A JPH05501655 A JP H05501655A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bfgf
- amino acid
- heparin
- column
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 title claims description 111
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 7
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 title description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 28
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000003908 Cathepsin D Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000258 Cathepsin D Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 229940066716 pepsin a Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 4
- 102100039652 Pepsin A-5 Human genes 0.000 claims abstract 3
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 108
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000003491 array Methods 0.000 claims 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 abstract description 20
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 abstract description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 abstract description 2
- NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N Ile-Thr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 31
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 2
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 2
- IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010004620 glycylsarcosine Proteins 0.000 description 2
- VYAMLSCELQQRAE-UHFFFAOYSA-N glycylsarcosine zwitterion Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=O)CN VYAMLSCELQQRAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 2
- ZICZZIRIRHGROF-UHFFFAOYSA-N 1-$l^{1}-oxidanyl-2,2,4,5,5-pentamethylimidazole Chemical compound CC1=NC(C)(C)N([O])C1(C)C ZICZZIRIRHGROF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 4-(3-phosphonopropyl)piperazine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CN(CCCP(O)(O)=O)CCN1 CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101001051969 Bos taurus Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- OELDIVRKHTYFNG-WDSKDSINSA-N Cys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS OELDIVRKHTYFNG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZXQPJYWZSFGWJB-AVGNSLFASA-N Glu-Cys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZXQPJYWZSFGWJB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N Gly-Ala-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- WKJKBELXHCTHIJ-WPRPVWTQSA-N Gly-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N WKJKBELXHCTHIJ-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N His-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N Lys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710089165 Protein white Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N Ser-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 1
- MSIYNSBKKVMGFO-BHNWBGBOSA-N Thr-Gly-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O MSIYNSBKKVMGFO-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N Tyr-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- FFCRCJZJARTYCG-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O FFCRCJZJARTYCG-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000002403 aortic endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 108010054847 carboxypeptidase P Proteins 0.000 description 1
- 241001233037 catfish Species 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
塩基性線維芽細胞増殖因子の酵素調製性本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子(
bFGF)の酵素調製に関するものである。
bFGFは、初め、脳及び下垂体から、146アミノ酸のポリペプチドとして単
離された(Etch他、PIIAS USA、 82巻、6507−6511.
1985年)。ウシbFGFの遺伝子がクローン化されている(^braham
他、5cience、233巻、545−548.1986年)。
そのヌクレオチド配列からは、155アミノ酸のbFGF翻訳産物が予測された
。更なる研究により、酵素阻害物質を添加した正常下垂体組織より、154アミ
ノ酸のbFGFが146アミノ酸のbFGFと共に抽出され得ること([1en
o他、Biochem。
Biophy+、 Res、Coma+、、138巻、580−588 、19
86年)、及び、脳及び肝癌細胞中の酸性プロテアーゼはbFGFを切断するこ
と(Klxg+brnn他、PNAS USA、84巻、1839−1843.
1987年)が示されている。
蛋白質工学技術は、レコンビナント増殖因子の治療用途での利用を可能なものと
した。しかしながら、これらの増殖因子は、ひとたび発現されると切断を受け、
様々な型の混合物になってしまう可能性があった。FGFもこの点に関しては例
外ではない(Barr他、1. [1io1. Chem、、 263巻、31
号、16471−16478.1988年)。
そこで我々は、N末端で切断されているbFGFの調製法を発案した。この方法
は、長い型より146アミノ酸型のbFGFを取得すること、及び、種々のbF
GFが混在する中から単一の型のbFGFを生産することに応用し得る。結果と
して得られる型は純粋であり、他型のbFGFの混入はない。
よって、本発明はbFGFの調製法を提供するものであり、その方法は、
(i) ヘパリン又はヘパラン硫酸と9−10 Lea−Pro結合を有するb
FGFとの結合体を形成し、
(11) ペプシンA又はカテプシンDにより結合体を処理して、前記結合を切
断し、
(i i i) かように取得されるbFGFを結合体から解離することを含む
。
各々、9−10 Leu−Pro結合を有し、第11位からC末端まで同一のア
ミノ酸配列を有し、しかも異なったN末端アミノ酸配列を有する2種類以上のb
FGFの混合物が、第(i)段階において使用可能である。これらのアミノ酸配
列は、異なったN末端を宵することのみが相違していてもよい。典型的には、b
FGFの配列間の唯一の相違とは、N末端アミノ酸残基の数が異なることである
。あるbFGFは他のbFGFより1つ以上余分なN末端アミノ酸残基を有して
いてもよい。あるいはまた、各bFGFの第9位以前のN末端アミノ酸配列が異
なるアミノ酸残基を含んでいてもよい。
そのため、本方法を、混合物中の各bFGFのアミノ酸配列が9以下の番号のN
末端アミノ酸残基で始まりしかも異なるN末端を有するbFGFのいかなる混合
物についても応用することが可能である。第(i)段階で用いる混合物は、すな
わち、NH2−(AA) X−Leu−Pro−Y−COOH[式中、AAはア
ミノ酸残基を、Xは0又は整数を、そしてYは(11−155) b F G
Fのアミノ酸配列を示す。]という一般式を有するbFGFより構成されていて
もよい。全長bFGFは155アミノ酸残基を有し、t55−bFGFあるいは
(1−155) bFGFと表示され得る。ヒトC1−155) bFGFのア
ミノ酸配列を配列番号1に示す。すなわち、この発明は、上述の式中のXがそれ
ぞれ8から1までの整数であり、(A A) が配列番号2から6に示される配
列の一つ、Ile■
Thr Thr 、 Thr Thr又はThrを示す、(1−155) bF
GFから(8−155)bFGFのうちの1種類のものあるいは2種類以上のも
のの混合物について応用可能である。とりわけこの発明は、154アミノ酸残基
のbFGF [(2−155)bFGF]と153アミノ酸残基のbFGF [
(3−155)bFGF)との混合物に応用可能である。
bFGFあるいはbFGFの混合物は、一般的にはレコンビナントDNA技術に
より取得される。翻訳産物のN末端におけるプロセシングが原因で、かような混
合物中においては異型のbFGFが取得される。その又は各々のbFGFは、ヒ
ト、マウス(marins)又は鰯歯動物(rodent)のbFGFであって
もよい。
ヘパリン及びヘパラン硫酸より選択されるbFGFの保護剤と、bFGF混合物
とで、適当な様式の結合体が形成され得る。
保護剤及びbFGFは、典型的には水溶液とされる。この溶液はバッファー化さ
れていてもよい。蛋白質の酸化を防止するための、ジチオスレイトールのような
酸化防止剤が存在していてもよい。bFGF対保護剤の比率は0.5:lから1
0:1(W/W)でよく、例としては1:1から5 : 1 (W/W)が挙げ
られる。結合体としてbFGFを保護することで、ペプシンA添加時の、更なる
不必要な加水分解を防止する。
ペプシンA(EC3゜4.23.1)又はカテプシンD(EC3,4,23,5
)を次にその結合体に接触させる。この結果、結合体中に保持されているbFG
F中の9−10 Leu−Pr。
結合の特異的な切断が起こる。この酵素は結合体の溶液中に供給され得る。この
酵素は、つまりは、bFGF及び保護剤の溶液に添加し得る。この酵素は、一般
的にはpHを4から6に調節した溶液として供給される。
この溶液を、例えばペプシンAの場合には30分から10時間、−例としては1
から8時間インキュベートする。カテプシンDについてのインキュベーションは
典型的には長目になり、90から130時間というのが例として挙げられるが、
約110時間というのが適当である。インキュベーション温度は5℃から室温ま
ででよく、例としては約10℃が挙げられる。
インキュベーシヨンは反応が完結するまで行う。
もう一つの方法としては、支持体に保護剤を固定して、親和性カラムを形成する
ことも可能である。アガロースゲルあるいは架橋したデキストランゲルビーズ(
例えばセファロース)のような適切なものであればどんな支持体でも使用し得る
。bFGFの溶液をカラムにかける。bFGFは保護剤に結合し、カラムに保持
される。次いで酵素溶液をカラムに通すことができる。最後に、切断された単一
の型のbFGFがカラムより溶出され得る。溶出は、塩化ナトリウム水溶液の直
線勾配を用いて行うことができる。
本発明の方法により、純粋型のbFGFが取得可能である。
特に(1G−155)bFGFと表示される146アミノ酸型のbFGFが取得
可能である。取得されるbFGFは、例えば創傷や火傷の治療に利用し得る。こ
のbFGFは、適切な製剤として外傷又は火傷に対して適用可能である。そのた
めかような製剤は、典型的には、更に生理学的に受容可能な担体又は賦形剤をも
含んでいる。
以下の実施例により、本発明を説明する。調製例及び比較例が示されている。
調製例:154/153型のbFGFの調製EP−A−363675に記載され
た方法に従い、bFGFの合成りNA配列及びかような配列を担持する発現プラ
スミドを構築した。発酵及び精製過程は以下のごとく行った。
(a)発酵過程
パスツール研究所コレクションからのバクテリア株E、coli17pe Bを
、bFGFをコードするヒトの遺伝子及びテトラサイクリン耐性の遺伝子の両方
を担持するプラスミドを用いて形質転換させた。この形質転換株をレコンビナン
ト・非グリコジル化型のh−bFGF (ヒトbFGF)の産生に使用した。こ
の株につき、Mxslu Ce1l Bsnk (vスター細胞バンク)(15
本の凍結乾燥バイアル)及びWorking Ce1l Bsnk (W、C,
B、。
作業用細胞バンク)(−190℃液化窒素中に保存の70バイアル)を準備した
。W、C,B、の1バイアル分の中味は、発酵相における接種材料として使用し
た。
発酵過程は10リツトルの発酵槽に4リツトルの培養液を入れて行った。株選択
の条件を維持する目的で、テトラサイクリン塩酸を培養液に添加した。37℃で
の20時間の増殖の後、最終生物量は乾燥重量で42±2g/lであり、比較ゲ
ル電気泳動法により測定したところ、bFGFの生産量は250G±500mg
/lであった。
大規模なバクテリア増殖を可能にするためには、発酵相中、純粋酵素を濃くする
ことが必要であった。
(b)初期精製
遠心により細胞(微生物)を全発酵培養液から分離した。結果として得られたペ
レットを、塩化ナリトウムを含有するリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁した
。効果的に細胞を破壊するには、高圧ホモジナイザーに少なくとも3回かける必
要があった。結果として得られる細胞溶解物を遠心により清澄化し、これからの
処理に付すため上清を回収した。
(c)精製
清澄化した上清をセファロース(商標)Sファーストフロー(カチオン交換体)
のカラムにのせ、リン酸バッファーの増加塩化ナトリウム濃度の勾配液を用いて
このカラムから生成物を溶出した。この生成物を、ヘパリンセファ0−ス6Bの
カラムで更に精製し、溶出はリン酸バッファーの増加塩化ナトリウム濃度の勾配
液を用いて行った。最終的に、バッファー交換をセファデックス(商標)G25
レジン上で行い、大量の生成物バッファー(リン酸ナトリウム−EDTA)中に
おける生成物を取得した。
セファ0−スSフアーストフロー及びセファデックスG25のカラムを水酸化ナ
トリウム溶液で洗浄し、殺菌した。ヘパリンセファロースは、3M塩化ナトリウ
ムを含むI)H=8.5、あるいは、pH=5.5の溶液のいずれかで洗浄した
。
この方法により 154/153型のbFGFが取得された。これは、
−Ab+ahxm他により報告され、又、配列番号=1に示される155アミノ
酸型のうち、N末端のMet残基を除くアミノ酸配列を有する 154アミノ酸
ヒトb F G F [(2−+551 b F G Fコ、及び、
一配列番号:1に示される155アミノ酸型のうちN末端のMet及びAla残
基を除く構成である153アミノ酸ヒトbFGF [(3−155)bFGF]
、の約50対50の混合物である。
調製例の154/153型bFGFは、以下に示すバッファー溶液中の濃度1.
8mg/mlとして準備した。
−10mMの第1リン酸ナトリウム、
−O,l mVのEDTAジナトリウム塩、−pH6,0゜
制御子加水分解中の、蛋白質酸化を回避するために、20mgのジチオスレイト
ールを1.8mgのbFGFに添加した。
溶液1:1mlのH20中20mgの保護剤(b)bFGFと保護剤の溶液の調
製
−100μmの蛋白質サンプル、
一9μmの溶液1、
一3μmの1Mクエン酸ナトリウム、I)H3,0l−70μmのH201
一18μg(18μl)のブタ腸管粘膜由来ペプシンA1−最終容量:200μ
m
保護剤はヘパラン硫酸であり、bFGF/保護剤の比は1:1 (W/W)であ
った。ペプシンA (EC:3.4.23.1)を、pH4,0においてbFG
Fと保護剤の溶液に添加し、10℃にて1時間インキュベートした。
3、酵素加水分解の動力学
上述の加水分解法の後、異なる時間で5DS−PAGE分析を行った。消化混合
液サンプルを、1,20.40及び60分後に5DS−PAGEにより分析した
。146−bFGF型からの154/153 b F G F型の分離は、Ph
ast SS71je (商標:ファルマシア社)を用いた5DS−PAGE分
析で行った。サンプルバッファーに関しては、t’has+ Gel )Iig
h Densit7のスタッキングゾーンでのサンプルの蛋白質沈降を回避する
目的で、サンプル調製条件を下記のごとく決定した。
−15μlの蛋白質溶液、
−10tt lの40mM Tri+/HC1,4mM EDTA、10%SD
S、20%メルカプトエタノール、9)18.0、
=3μlのDMSO(ジメチルスルホキシド)、及び−1tt Iのブロモフェ
ノールブルー(0,3%)。
サンプルの変性は、サンプルを100℃で5分間加熱して行った。サンプルの分
析により、1時間後に消化混合液から採取されたサンプルでは154/153−
b F G F断片は完全に消失していたことが示された。一つの主要断片が
取得されたが、それは対照物質として使用した146−bFGFのレコンビナン
ト断片にぴったり一致するものであった。
反応混合液を、あらかじめTr目バッファー10mM、 pH8,0゜0.51
1 NlClで平衡化しであるヘパリン−アガロースカラムに直接かけた。0.
5Mから3MのNlClの濃度勾配液を用いると、bFGFは1.5M NlC
lで溶出された。蛋白質濃度は、154/153bFGFを対照物質として用い
、B+zdlord法により決定した。
5.146型bFGFのエレクトロブロッティングこのエレクトロブロッティン
グ分析にて用いた方法は、Plough他(^nsl、Biochem、、18
1巻、33−39.1989年)による記載のものと同様のものである。使用し
た膜はImmobiloc PVDF (ミリボア社)である。
電気泳動後、ゲルを転写バッファー(lhM CAPS (3−[シクロへキシ
ルアミノ] −1−プロパンスルホン酸) 、pFlll、0. 20%メタノ
ール)で10分間平衡化した。Immobiloc PVDFは最初純粋メタノ
ールで湿潤させ、使用前に転写バッファー中で平衡化する。セミトライブロッテ
ィング用装置を使用した(KyhsC−^nderson、J、Biochem
、Bioph7s、 Mrlhods、10巻、 203−209゜1984年
)。電気転写は0 、 2 mA/ cm2で2時間行った。
PVDF膜を水ですすぎ、50%(V/V)メタノールに溶解している0、1%
(W/ V )クーマシーブリリアントブルーR−250液中で1分間染色した
。余分な染料を水で軽くすすぎ落とし、次に、10%(v/V)酢酸を含む40
%(V/V)メタノールで5から10分間脱染色した。次いで、配列決定前にP
VDF膜を注意深く中ですすいだ。
6.7ミノ末端配列決定
染色された蛋白質を含むPVDF膜の断片を、ポリブレン処理しであるフィルタ
ー上に一層になるように並べた。オンラインPTH−アミノ酸分析機モデル12
0Aを備えたAflllliedBios7slems社の配列決定機モデル4
70Aで配列決定をした。
これらの条件下で決定された蛋白質のNH2H2O量初の3つのアミノ酸は、P
ro−Ala−Leuであった。
これらのアミノ酸は、 146−pFGF型アミノアミノ末端のアミノ酸に相当
する。
7、レーザースキャンデンシトメトリー分析ヘブシンAによる154/153−
b F G Fの1時間の加水分解後に生成された146−bFGFのパーセ
ント率を決定する目的でこの分析を行った。1時間後、50μlの反応混合液を
50μlのSDS変性バッファーに混合した。同じ条件にて、種々の蛋白質濃度
のbFGFサンプルをSDS変性させた。これらのサンプルを、ゲルPAA 4
/30 (ファルマシア社)上での電気泳動により分離した。各ピークのデンシ
トメトリーをLKBBROM^2220記録積分器を用いて分析した。これらの
条件により得られた標準曲線を用いたところ、146−bFGFの濃度は+54
/153− b F G Fの開始濃度の91%に相当することが明らかになっ
た。
8、親和性精製後の146−bFGF収率酵素加水分解反応の収率を、ヘパリン
−アガロースカラムでの146−bFGF型の精製後にも測定した。上述の第2
項からの反応混合液1.64mgを、あらかじめTris 1G!IM、 pH
8,0,51NsClで平衡化したヘパリン−アガロースカラムにのせた。98
8においては、ペプシンAは完全に不活性であり、ヘパラン硫酸とbFGFとの
複合体は不安定化されており、そのため培養液中に過剰に存在するヘパリン−ア
ガロースへのbFGFの吸着が可能となる。bFGFを1.5M NlClで溶
出した。1.14mgの146−bFGF型が回収された。
保護剤としてヘパラン硫酸を用いた制御上加水分解及び親和性カラム精製後の1
46−bFGFアミノ酸型の取得の全収率は73%であった。
実施例2:保護剤としてヘパリン;ペプシンA保護剤をヘパリンとし、bFGF
/ヘパリン比を5対1 (w/W)にし、消化混合液の一部分を、2分及び4.
6. 8時間後に分析し、総インキュベージタン時間を8時間とした以外は、
実施例1の方法を繰り返した。bFGFとヘパリンの溶液は、−100μlの蛋
白質サンプル、
一18μlの溶液2、
一3μlの1Mクエン酸ナトリウム、pH3,0、−70μlのH2O、
一18μgのペプシンA1
一最終容量:200μ11
という組成であった。
溶液2は、100μmの溶液1及び900μmのH2Oから成る。
この様な条件下でも、8時間のインキュベーション後には、一種類のみの断片が
取得された。5DS−PAGE分析により測定したところ、この断片は見かけ上
の分子量16.200を有するものであった。
アミノ末端配列分析により、実施例1と同じ3つのN末端アミノ酸、Pro−A
la−Leuが得られた。
実施例3:保護剤としてヘパリン;ペプシンAヘパリンーアガロースカラムでの
146−bFGF断片の精製後、ヘパリンにより保護されたbFGFの制御下加
水分解の回収率も測定した。実施例2と同じ条件での7時間の加水分解後、1.
54mgのbFGFを含む反応液を、あらかじめ10mMリン酸ナトリウムバッ
ファー、pH8,0及び0.5M NlClで平衡化しであるヘパリン−アガロ
ースカラムにがけた。1.02mgの146−bFGFが、1.5M NaCl
で溶出された。
保護剤としてヘパリンを使用した親和性カラム精製の後、取得された146−b
FGFアミノ酸型の取得の全収率は69%であった。
実施例4:保護剤としてアガロース上に固定されたヘパリン:ヘパリン−アガロ
ース(7m1のゲルが5. 6mgのヘパリンを含有)のカラムを10dの第1
リン酸ナトリウム、0.1mM EDTA。
0、5M NaCl、pH4,0で10℃において平衡化した。154/153
−bFGFを親和性カラムにかけた。その後、同一のリン酸溶液で希釈した0、
111mgのペプシンAをカラムの上端にのせた。
0、 5ml/分の流速で6時間、この酵素をカラム全体に再循環させた。
6時間口に、10mMリン酸ナトリウムバッファーpH7,0,(1,1mM
EDTA、0.5M NaC1(3倍量)でカラムを洗浄し、次いで0.5Mか
ら3MのNaC]濃度勾配液で溶出した。bFGFは1,5MNaC1で溶出さ
れた。
2.7ミノ末端配列分析
電気泳動後、実施例1に記載のセミトライブロッティング用装置を使用し、Im
mobilon PVDF上でゲルをエレクトロプロットに付した。染色された
蛋白質を含有するPVDF膜の断片を、ポリブレン処理したフィルターの上に一
層になるように並べた。
この様な条件下で決定された蛋白質のNH2−末端部分の最初の3つのアミノ酸
は、Pro−Ala−Leuであった。これらのアミノ酸は146− b F
G F型のアミノ末端部分の3つのアミノ酸に相当する。
3.146−bFGFの回収率
ヘパリン−アガロースカラムから洗い出した14f+−bFGF断片の定量測定
後、加水分解反応の収率を測定した。1.211mgの146−bFGFが回収
された。ヘパリン−アガロースカラムでの制御上加水分解後の146−bFGF
アミノ酸型(分子量16、200)の取得の全収率は81%であった。
実施例5:保護剤としてヘパリン;カテプシンD1、bFGF酵素加水分解法
ペプシンAの代わりにウシ牌臓由来のカテプシンDを使用し、インキュベージタ
ン時間を110時間とした以外は、実施例2を繰り返した。
2、反応動力学
酵素加水分解中に得られる+46− b F G F断片の出現率はかなり低い
ものであるが、1時間後には5DS−PAGE分析により検出された。72時間
後において154/+53− b F G Fの加水分解は完結しておらず、反
応液中に36μgのカテプシンDを追加した。40時間後に反応は完結した。こ
れはカテプシンD(10単位/mg)の低活性に起因している。
3.7ミノ末端配列分析
電気泳動後、実施例1に記載のセミトライブロッティング用装置を使用し、Im
mobilon HDF上でゲルをエレクトロプロットに付した。染色された蛋
白質を含有するPVDF膜の切り取り断片を、ポリブレン処理したフィルター上
に一層になる様に並べた。オンラインPTH−アミノ酸分析機モデル12OAを
備えた1へpplied Biosyllem+社の配列分析機モデル470A
で配列決定を行った。これらの条件下で決定された蛋白質のNH2−末端部分の
最初の3つのアミノ酸は、Pro−Al a−Leuであった。
比較例1:保護剤なしでのペプシンA
保護剤無しであることを除いて、実施例1を繰り返した。
154/ 153型のbFGFは、数分のうちにペプシンAにより完全に消化さ
れた。
比較例2:保護剤なしでのカテプシンD保護剤無しであることを除いて、実施例
5を繰り返した。
154/i53 ?) b F G Fは、数分のうちにカテプシンDにより完
全に消化された。
比較例3:α−キモトリプシン
ペプシンAの代わりにα−キモトリプシンを使用し、又、保護剤無しであること
を除いて、実施例1を繰り返した。 154/153型のbFGFは、数分のう
ちにα〜キモトリプシンにより完全に消化された。そのため、他の陰イオン性物
質について、α−キモトリプシンからbFGFを保護する能力に関するテストを
行った。
−bFGF/保護剤の比=1
一温度=10℃
−pH=7.5
−インキュベーシコン時間=4時間
ヘパリン3.000を保護剤として使用し、5l)S−PAf;ε分析により測
定したところ、見かけ上の分子量14.0G(lである一つの断片が主として得
られ、又、より小さい分子量を有する他の幾つかの断片も取得された。
2、ヘパリン(シグマ社、H3125)−bFGF/保護剤比(W/W)=5
一温度=10°C
−pH=7.5
−インキュベーンラン時間=4時間
保護剤としてこの等級のヘパリンを用いると、保護が不充分であり、多数の断片
が取得された。
3、コンドロイチン硫酸
−bFGF/保護剤比(w/w)=1
一温度=10℃
−pH=7.5
一インキュベーション時間=2時間
保護が不充分であり、多数の断片が取得された。
4、デルマタン硫酸
−bFGF/保護剤比(w/w)=1
一温度=10℃
−pH=7.5
一インキュベーション時間=2時間
保護が不充分であり、多数の断片が取得された。
5、ポリアスパラギン酸
−bFGF/保護剤比(w/w)=1
一温度=10℃
−pH=7.5
−インキュベーション時間=2時間
ポリアスパラギン酸を保護剤として使用すると、保護が不充分であり、多数の断
片が取得された。
実施例6:保護剤としてヘパリン又はヘパラン硫酸:ペプシン1、実験手順
溶液中の可溶性複合体bFGF−ヘパリン及びbFGF−ヘパラン硫酸の蛋白質
加水分解処理
1.6mgの154/153−アミノ酸型のbFGFは、10mMクエン酸−リ
ン酸バッファーpH4,0,10℃中で1.5mgのヘパリンあるいはヘパラン
硫酸と複合させる。1時間のインキュベーション時間後、160μgのペプシン
A (Sigma社P−6887゜3200−4500単位/mg蛋白質)を溶
液に添加した。反応液のサンプルを、様々な時間において採取し、あらかじめ4
℃下で10mMリン酸バッファーp H8,0/ 0.5M NaClで平衡化
したヘパリン−セファロースカラムに直接かけた。次に、カラムを同バッファー
で長時間洗浄し、3M NaC1を含む10mMリン酸バッファーpH8,0で
bFGFを溶出した。−まとめにした各分画を、あらかじめlQmMリン酸バッ
ファーpH6,0で平衡化したセファデックスG25カラムで脱塩し、5OS−
PAGE分析に付した。保護剤としてヘパラン硫酸を使用すると、1時間後には
定量的な収率で146−bFGFが取得された。bFGF−ヘパリン複合体のペ
プシン処理では、ちょうど6,5時間のインキュベーション時間で同様の定量的
な収率に至った。
ヘパリン−セファロースカラムに結合したbFGFのペプシンA処理
5Gmgのb F G F (154/153)を、あらかじめ4℃下で0.5
M11aclを含む25mMクエン酸バッファーpH4,flで平衡化したヘパ
リン−セファロースカラム(Pha+macit社) (2,6X22.5cn
)に流速2.5ml/分でかけた。クエン酸−リン酸バッファーに溶かした68
0単位/mlのブタペプシンA (Sigmx社)溶液を、4℃下で3時間、2
. 5ml/分の流速で連続的にカラムを循環させた。その後、カラムを0.5
M NaC1を含む25mMリン酸バッファーpH8,0で長時間洗浄して酵素
を不活性化させ、除去した。bFGFは、31 NlClを含む25mMリン酸
バッファーpH8,0で段階的に溶出させた。bFGFを含有するフラクション
をひとまとめにし、^m1con PMIO膜上での限外濾過により濃縮し、あ
らかじめ10mMリン酸バッファーpH6,0で平衡化しであるセファデックス
G25カラム(Phumxcia 社)で脱塩した。
N末端配列分析
オンラインのモデル120AのPTH−分析機を備えたモデル477Aのパルス
法液相配列決定機(^pplied Biot7stems社、CA、USA)
で自動N末端配列分析に付した。多少変更を加えたNormiilプログラムを
使用した。配列決定用物質及び試薬は全てApplied Bios7slem
s社より購入した。
C末端配列分析
酵素対基質の比を約1 : 100 (w/w)として(Lu他、1、Cbro
matogr、、447巻、351−364. 1988年)、0.05%B+
1j−35を含む10mM酢酸ナトリウムバッファーpH3,a中、室温下にて
、bFGFのカルボキシペプチダーゼP消化の経時変化実験を行った。
0.5からlnmolの蛋白質の消化を、0.1から0.2μgのCp P (
Boehringet社)を用いて2時間行った。N−oイシンを内部標準物質
として添加した。様々な時間において、1G/100μm分液を採取し、モデル
420Aの誘導体化機(AppliedBios7slemi社)においてPI
TCにより自動的誘導体化を行ない、次にオンラインのモデル130Aの分析機
を備えたRP−HPLCに注入した後に、これをアミノ酸分析に付した。誘導体
化されたPTC−アミノ酸の分離は、PTC−C8カラム(P/N 0711−
0204. 220X2.Imm、5u、 Applied Bios7ste
IIIK社)で行った。
バイオアッセイ
ウシ大動脈由来の内皮細胞株(B A E C)を、bFGFによって誘導され
る増殖反応の実験に用いた。13%のウシ胎児血清(FBS)(ギブコ社、UK
)を補充したDolbeccoのModified EBle’ 1Mediu
m (DMEIJ)より成る完全培養液を使用して、96穴のマイクロタイター
プレートに、2500細胞/穴として細胞を撒いた。細胞付着後、完全培養液を
、0.5%ウシ胎児血清(F B S)、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA
) (Sigm!社USA)及び所望濃度のl) F (:、 )’ (Etb
zmonj社)を補充したDMEMから成る実験用培養液に入れ替えた。培養液
を3日間インキュベートし、38目にフォルマリンで固定し、0.5%のクリス
タルバイオレットで染色した。染色後各穴を十分に洗浄し、細胞に取り込まれな
かった染料を除去した。メタノール(95%、O,1ml/穴)を各穴に加え、
各穴ごとの細胞増殖の量におおまかに比例している染料を抽出した。プレートを
自動計測するため、540nmのフィルターを付けたマイクロプレート用の分光
光度計にかけた。
プラスミノーゲン活性化因子の合成のため、BAEC(0,21中、3×104
細胞/穴)を、96穴マイクロタイタープレー1の完全培養液に撒き、細胞付着
後、培養液を0.5%FBS。
0.1%BSA及び実験濃度のbFGFを補充したDMEMに入れ替えた。28
時間インキュベーションした後、培養液を洗浄し、細胞を0.5%Triton
X−100を含む溶液で溶解した。
分注した細胞溶解物を、アミトールアッセイ用の色素産生基質(Speclro
+y+ee PL)及びプラスミノーゲン(いずれの試薬も^me+1can
Diagno+1ica Inc、社)を用いるプラスミノーゲン活性化因子活
性に関するアッセイに付した。
2、結果
酵素によるbFGFの制御下切断
精製されたレコンビナント154/153の混合物を、2種類の異なるアスパラ
ギン酸加水分解酵素、ペプシンA及びカテプシンDと共にインキュベートした。
反応混合液の一部を様々な時間間隔をおいて採取し、5DS−PAGE分析に付
したところ、保護剤が何ら存在しないとbFGFは急速に小さなペプチドへと消
化されることが示された。一方、ヘパリンあるいはヘパラン硫酸(1・1w/w
)存在下でペプシンA (10: 1 w/w。
pH4,[l;10℃)を用いてb F G F (154/153 )を処理
したところ、結果として、154/153アミノ酸型の低分子量型への段階的か
つ完全な転換が起こり、得られる低分子量型は我々の146/145アミノ酸型
標準物質と同じ位置に移動した。
PDVF膜でのエレクトロブロッティング後、酵素消化の結果生じた低分子量バ
ンドを、パルス法液相配列決定機における自動N末端配列分析に付した。最初の
3サイクルで一種類の均一な配列、Pro−Ala−Leuが結果として得られ
、この配列は、既知の146アミノ酸型の未処理N最終末端に相当するものであ
った。他の配列は検出されなかったことより、bFGF分子上には3箇所のLe
u−Pro部位が存在するにもかかわらず、伸長型のbFGFがヘパリンあるい
はヘパラン硫酸と複合体を形成している時には、ペプシンAでの消化はLeu
−Pro1θペプチド結合のみを特異的に切断することが示された。
ペプシンAを使用して得られた、「ヘパリンに保護された」NH2−伸長型bF
GF分子の制御上蛋白質加水分解による切断は、カテプシンDを用いた消化に関
しても再現されたが、この蛋白質加水分解反応にはより長いインキュベーション
時間が必要であり、これは使用した調製酵素の低い比活性に起因する可能性が強
い。pHが7.5である以外は同様の条件にてキモトリプシンを添加した場合、
インキュベーション液のゲル電気泳動後に、約14000ダルトンの単一なポリ
ペプチドが検出され、146アミノ酸型の存在は認められなかった。
伸長型bFGFの154/153混合物をヘパリン−セファロースカラムに結合
させるラージスケール法でも、溶液及び小規模のバッチ反応において得られた結
果を立証した。このためには、50mgのb F G F (154/153)
をあらかじめpH4,0のクエン酸リン酸バッファーで平衡化したヘパリン−セ
ファロースカラムにかけた。ペプシンA溶液は、4℃下において3時間、連続的
にカラム中を循環させた。その後、カラムをアルカリ性pHのリン酸バッファー
で洗浄し、酵素を不活性化して除去した。結果として得られたポリペプチドは、
31 NaClを含むpH8,0のリン酸バッファーを用いてカラムより溶出さ
せた。bFGF含有分画を集め、セファデックスG25カラムで脱塩した。
5DS−PAGEにおいて分析された、集めた分画は、標準物jt 146/+
45 bFGF型の分子量に相当する分子量の単一バンドを示した。逆相HPL
C分析においても、やはり単一ピークが結果として得られた。N末端配列分析で
は、146−アミノ酸型の正確な未処理N末端に一致する単一の配列、つまり、
Pro−Ala−Leu−が取得された。C末端配列分析では、bFGF分子の
予測通りのカルボキシル最終末端、つまり、Ala−Lys−3erが示された
。従って、bFGFがヘパリン−セファロース樹脂に結合した場合にもやはり、
ペプシンAはL e u P r O10結合において特異的に分子を切断し、
均一な146−アミノ酸型を産生じ得た。
bFGF型のインビトロバイオアッセイ154/153−アミノ酸型の混合物の
生物学的活性を、記載した蛋白質加水分解法により取得された均一な146−ア
ミノ酸型のものと比較した。2種類の活性、つまり、増殖反応の誘導及びプラス
ミノーゲン活性化因子の合成を、ウシ大動脈の内皮細胞(BAEC)において検
討した。酵素法により取得される146アミノ酸型と比較すると、154/15
3型はインビトロにおいては生物学的に等価であることが、両アッセイにより証
明された。
配列表
(1)配列番号、1に関する情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:155アミノ酸
(B)型二アミノ酸
(C)鎖の数゛ニー重鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(11)配列の種類:蛋白質
(Xl)配列:配列番号=1:
Gly Sar Gly Ala phe Pro Pro Gly His
Fha Lys Asp Pro Dos Arg ’La■
Tyr Cys Lys Az GIY Gly PhePheLgu Arg
工1e His Pro Asp Gly ArgVal Asp Gly V
−Ll )Xq Glu Lys Sar Asp Pro KLs工IQ D
/、 Leu Gln l1uGin Ala Glu Glu Arg Gl
y Val Van Sar工1@Lys Gly Val Cym Ala
AsnArgT1yrIju Ala Mat IJ/S Glu ASP G
ly Arq Lal m Ala Sar $ CysVal ’Ihr A
sp Glu Cys Phe Flea ’Fha Glu 鯰ト民Glu
5ar Asn Asn Tyrloo 105 n。
A!gI計Tyr Arg Sar Arg ’Lyp Tyr Thr Sa
r Trp Tyr Van Ala Lau ’LpArg ’Ihr Gl
y Gin Tyr−1sa Gly Sar 聯Thr Gly Pro G
ly Gln Xyy。
130 D5 140
jua工1e TAPrMa’Law Pro Met Sarに、a 15a
r(2)配列番号・2に関する情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:8アミノ酸
(B)型二アミノ酸
(C)鎖の数ニー重鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(11)配列の種類:ペプチド
(11)配列:配列番号・2:
Met Ala Ala GI7 Ser Ile Thr Thr(3)配列
番号=3に関する情報:
(i)配列特性:
(A)長さニアアミノ酸
(B)型二アミノ酸
(C)鎖の数ニー重鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ロ)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号=3=
^18AI&G17 Ser lie Thr Thr(4)配列番号=4に関
する情報:
(i)配列特性。
(A)長さ・6アミノ酸
(B)型二アミノ酸
(C)鎖の数ニー重鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(11)配列の種類・ペプチド
(xi)配列:配列番号=4=
^1! G17 Set lle Thr Th+(5)配列番号=5に関する
情報:
(i)配列特性:
(A)長さ:5アミノ酸
(B)型二アミノ酸
(C)鎖の数ニー重鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(11)配列の種類:ペプチド
(工i)配列:配列番号:5:
G17 Set lie Thr Thr(6)配列番号=6に関する情報。
(i)配列特性:
(A)長さ=4アミノ酸
(B)型二アミノ酸
(C)鎖の数ニー重鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(11)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号:6:
Ser Ile Tht Thr
要 約
bFGFは、
(i)ヘパリン又はヘパラン硫酸と9−IG Leu−Pro結合をfるbFG
Fとの結合体を形成し、
(■)ペプシンA又はカテプシンDにより結合体を処理し−l前記結合を切断し
、
(i i i)かように取得されるbFGFを結合体から解離することにより調
製される。
この方法は、伸長型のbFGFから146アミノ酸型の1GFを調製することに
応用できる。又、この方法を、異なZ末端を有することのみが相違するアミノ酸
配列のb F G F &−合物から単一の型のbFGFを生産することにも利
用でき2国際調査報告
1m14m+maalAH+++−+e++Ne(lrインtoa+7n+a)
ρ国際調査報告
Claims (9)
- 1.(i)ヘパリン又はヘパラン硫酸と9−10Leu−Pro結合を有するb FGFとの結合体を形成し、(ii)ペプシンA又はカテプシンDにより結合体 を処理して、前記結合を切断し、 (iii)かように取得されるbFGFを結合体から解離することを含む、塩基 性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の調製方法。
- 2.異なるN末端を有することのみが相違するアミノ酸配列の前記bFGFの2 種類以上のものの混合物を第(i)段階において使用する請求項1に記載の方法 。
- 3.一般式 NH2−(AA)1−Leu−Pro−Y−COOH[式中、AAはアミノ酸残 基を、xは0又は整数を、そしてYは(11−155)bFGFのアミノ酸配列 を示す。]を有するbFGFより前記混合物が構成される請求項2に記載の方法 。
- 4.(AA) 1が、配列番号:2から6の配列の一つ、【配列があります】又はThrを示す 請求項3に記載の方法。
- 5.前記混合物が(2−155)bFGF及び(3−155)bFGFより構成 される請求項3に記載の方法。
- 6.その又は各々のbFGFが、ヒト、マウスあるいは認歯動物のbFGFであ る請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 7.第(i)段階において、ヘパリン又はヘパラン硫酸及びその又は各々のbF GFがバッファー水溶液として供給され、第(ii)段階において、その結果得 られる溶液にヘブシンA又はカテプシンDを添加する請求項1〜6のいずれか一 項に記載の方法。
- 8.第(i)段階において、ヘパリン又はヘパラン硫酸を支持体上に固定して親 和性カラムを形成し、前記bFGFの溶液をそのカラムにかけ、第(ii)段階 において、かようにサンプルをかけたカラムにペプシンA又はカテプシンDを通 し、第(iii)段階において、かように取得される切断された単一型のbFG Fをカラムより溶離する請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 9.請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法により調製されたbFGF及び生 理学的に受容可能な担体又は賦形剤を含む製剤。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB909017008A GB9017008D0 (en) | 1990-08-02 | 1990-08-02 | Process for the enzymatic preparation of basic fibroblast growth factor |
GB9017008.5 | 1990-08-02 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05501655A true JPH05501655A (ja) | 1993-04-02 |
Family
ID=10680087
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3513137A Pending JPH05501655A (ja) | 1990-08-02 | 1991-07-30 | 塩基性線維芽細胞増殖因子の酵素調製法 |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5348863A (ja) |
EP (1) | EP0495049B1 (ja) |
JP (1) | JPH05501655A (ja) |
KR (1) | KR100191697B1 (ja) |
CN (1) | CN1033810C (ja) |
AT (1) | ATE152122T1 (ja) |
AU (1) | AU643822B2 (ja) |
CA (1) | CA2066174A1 (ja) |
CZ (1) | CZ286237B6 (ja) |
DE (1) | DE69125810T2 (ja) |
DK (1) | DK0495049T3 (ja) |
ES (1) | ES2103822T3 (ja) |
FI (1) | FI921428A (ja) |
GB (1) | GB9017008D0 (ja) |
GR (1) | GR3024111T3 (ja) |
HU (1) | HU212671B (ja) |
IE (1) | IE912729A1 (ja) |
IL (1) | IL98988A (ja) |
MY (1) | MY107334A (ja) |
NO (1) | NO301480B1 (ja) |
NZ (1) | NZ239204A (ja) |
PH (1) | PH31240A (ja) |
PT (1) | PT98544B (ja) |
RU (1) | RU2093519C1 (ja) |
WO (1) | WO1992002539A1 (ja) |
YU (1) | YU48309B (ja) |
ZA (1) | ZA916026B (ja) |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0580874A4 (en) * | 1992-02-14 | 1997-02-26 | Kaken Pharma Co Ltd | Remedy for airway diseases |
AU703963B2 (en) * | 1994-04-21 | 1999-04-01 | Leukotech A/S | Heparin-binding protein for the treatment of sepsis and processes for its preparation |
US5939390A (en) * | 1995-03-09 | 1999-08-17 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition |
US6274712B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-08-14 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137 |
IL141647A0 (en) | 2001-02-26 | 2002-03-10 | Yeda Res & Dev | Synthetic human peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
CN102775472A (zh) | 2003-01-06 | 2012-11-14 | 安吉奥开米公司 | 作为穿过血脑屏障的载体的抑酶肽及类似物 |
CA2513331A1 (en) | 2003-01-14 | 2004-08-05 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd | Parenteral formulations of a peptide for the treatment of systemic lupus erythematosus |
US8618054B2 (en) | 2004-05-05 | 2013-12-31 | Valorisation-Rechereche Société en Commandite | Interleukin-1 receptor antagonists, compositions, and methods of treatment |
PL1751175T3 (pl) | 2004-05-05 | 2013-03-29 | Valorisation Recherche Soc En Commandite | Antagoniści receptora IL-1, kompozycje i sposoby leczenia |
EP2366786A3 (en) | 2005-05-05 | 2012-08-29 | VALORISATION HSJ, Société en Commandite | Cytokine receptor modulators and uses thereof |
EP2164866B1 (en) | 2007-05-29 | 2014-05-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
US9365634B2 (en) | 2007-05-29 | 2016-06-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
WO2009127072A1 (en) | 2008-04-18 | 2009-10-22 | Angiochem Inc. | Pharmaceutical compositions of paclitaxel, paclitaxel analogs or paclitaxel conjugates and related methods of preparation and use |
MX2011004019A (es) | 2008-10-15 | 2011-06-24 | Angiochem Inc | Conjugados de etoposido y doxorubicina para entrega de farmacos. |
EP2346906A4 (en) | 2008-10-15 | 2013-04-24 | Angiochem Inc | CONJUGATES FROM GLP-1 AGONISTS AND THEIR USE |
JP5759379B2 (ja) | 2008-12-05 | 2015-08-05 | アンジオケム インコーポレーテッド | ニューロテンシンまたはニューロテンシンアナログおよびその使用 |
BRPI0922611A2 (pt) | 2008-12-17 | 2018-11-06 | Angiochem Inc | inibidores de metaloproteína de matriz de membrana tipo 1 e usos dos mesmos |
CA2759129C (en) | 2009-04-20 | 2018-12-11 | Angiochem Inc. | Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog |
WO2011000095A1 (en) | 2009-07-02 | 2011-01-06 | Angiochem Inc. | Multimeric peptide conjugates and uses thereof |
WO2012000118A1 (en) | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Angiochem Inc. | Short and d-amino acid-containing polypeptides for therapeutic conjugates and uses thereof |
KR102081267B1 (ko) * | 2013-05-16 | 2020-02-25 | 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 | 헤파란 설페이트 |
WO2016080915A1 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Agency For Science, Technology And Research | Cosmetic use of heparan sulphate |
EP3220922B1 (en) | 2014-11-19 | 2020-10-14 | Agency For Science, Technology And Research | Heparan sulphates for use in repair and/or regeneration of skin |
DK3307326T3 (da) | 2015-06-15 | 2020-10-19 | Angiochem Inc | Fremgangsmåder til behandling af leptomeningeal karcinomatose |
CN105294851B (zh) * | 2015-12-07 | 2019-02-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用 |
CN114965839A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-08-30 | 朗肽生物制药股份有限公司 | 人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4956455A (en) * | 1984-03-05 | 1990-09-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Bovine fibroblast growth factor |
US4785079A (en) * | 1984-11-09 | 1988-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | Isolation of fibroblast growth factor |
US5026839A (en) * | 1985-12-17 | 1991-06-25 | Synergen, Inc | DNA encoding a basic fibroblast growth factor |
DE3811921A1 (de) * | 1988-04-09 | 1989-10-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen, die n-terminal mit prolin beginnen |
US5136025A (en) * | 1990-04-04 | 1992-08-04 | California Biotechnology Inc. | Method to purify basic fibroblast growth factor |
-
1990
- 1990-08-02 GB GB909017008A patent/GB9017008D0/en active Pending
-
1991
- 1991-07-29 CZ CS19912362A patent/CZ286237B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 YU YU131991A patent/YU48309B/sh unknown
- 1991-07-29 IL IL9898891A patent/IL98988A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 WO PCT/EP1991/001428 patent/WO1992002539A1/en active IP Right Grant
- 1991-07-30 US US07/842,177 patent/US5348863A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-30 JP JP3513137A patent/JPH05501655A/ja active Pending
- 1991-07-30 AU AU83044/91A patent/AU643822B2/en not_active Ceased
- 1991-07-30 PH PH42854A patent/PH31240A/en unknown
- 1991-07-30 RU SU915011557A patent/RU2093519C1/ru active
- 1991-07-30 AT AT91913996T patent/ATE152122T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 HU HU9201101A patent/HU212671B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 DK DK91913996.4T patent/DK0495049T3/da active
- 1991-07-30 KR KR1019920700725A patent/KR100191697B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 DE DE69125810T patent/DE69125810T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-30 ES ES91913996T patent/ES2103822T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-30 CA CA002066174A patent/CA2066174A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-30 EP EP91913996A patent/EP0495049B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-31 NZ NZ239204A patent/NZ239204A/xx unknown
- 1991-07-31 ZA ZA916026A patent/ZA916026B/xx unknown
- 1991-07-31 MY MYPI91001378A patent/MY107334A/en unknown
- 1991-08-01 PT PT98544A patent/PT98544B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-08-01 IE IE272991A patent/IE912729A1/en unknown
- 1991-08-02 CN CN91105269A patent/CN1033810C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-03-30 NO NO921236A patent/NO301480B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-04-01 FI FI921428A patent/FI921428A/fi unknown
-
1997
- 1997-07-16 GR GR970401761T patent/GR3024111T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH05501655A (ja) | 塩基性線維芽細胞増殖因子の酵素調製法 | |
US12043657B2 (en) | Human collagen 17-type polypeptide, production method therefor and use thereof | |
Dehm et al. | The Cleavage of Prolyl Peptides by Kidney Peptidases: Partial Purification of a “X‐Prolyl‐Aminopeptidase” from Swine Kidney Microsomes | |
JP3205578B2 (ja) | キメラ繊維芽細胞成長因子 | |
Beyreuther et al. | The Phosphoenolpyruvate‐Dependent Phosphotransferase System of Staphylococcus aureus: 1. Amino‐Acid Sequence of the Phosphocarrier Protein HPr | |
JPH09500267A (ja) | 増加した生物学的活性を有する短縮型ケラチノサイト増殖因子(kgf) | |
EP1976864A1 (en) | Novel peptide and use thereof | |
Fusi et al. | Ribonucleases from the extreme thermophilic archaebacterium S. solfataricus | |
Kanaya et al. | Comparison of the primary structures of ribonuclease U2 isoforms | |
EP1071718A1 (en) | Matrix binding factor | |
Leth-Larsen et al. | Structure of chymotrypsin variant B from Atlantic cod, Gadus morhua | |
Qian et al. | Separation and characterization of two polypeptide chains from the 7S cross-linking domain of basement-membrane (type IV) collagen | |
Butler et al. | Homologous regions of collagen α1 (I) and α1 (II) chains: Apparent clustering of variable and invariant amino acid residues | |
JPH04505554A (ja) | 可溶性トロンボモジュリン類似体 | |
JP2003137899A (ja) | 線維芽細胞増殖促進ペプチド | |
Mercanti et al. | A tryptic digestion fragment of nerve growth factor with nerve growth promoting activity | |
JPH07224093A (ja) | ペプチド | |
JPH07196527A (ja) | ペプチドまたはその誘導体と、細胞増殖賦活化剤 | |
GOTO et al. | STRUCTURAL STUDIES ON STEM BROMELAIN: Cyanogen Bromide Cleavage and Amino Acid Sequence of Carboxyl‐Terminal Half of the Molecule | |
van der Weyden et al. | Acanthoxin, a toxic phospholipase A2 from the venom of the common death adder (Acanthophis antarcticus) | |
US4784988A (en) | Peptides correlated to lysozyme | |
Nakamura et al. | Purification and characterization of a vimentin‐specific protease in mouse myeloid leukemia cells: Regulation during differentiation and identity with cathepsin G | |
Dumont et al. | Structure and action of heteronemertine polypeptide toxins: importance of amphipathic helix for activity of Cerebratulus lacteus toxin A-III | |
Sato et al. | Characterization of a fasciclin I-like protein with cell attachment activity from sea urchin (Strongylocentrotus intermedius) ovaries | |
Betbeder et al. | Production of homogeneous basic fibroblast growth factor by specific enzymatic hydrolysis of larger microheterogeneous molecular forms |