JPH05501655A - 塩基性線維芽細胞増殖因子の酵素調製法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 塩基性線維芽細胞増殖因子の酵素調製性本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ ｂＦＧＦ）の酵素調製に関するものである。

ｂＦＧＦは、初め、脳及び下垂体から、１４６アミノ酸のポリペプチドとして単 離された（Ｅｔｃｈ他、ＰＩＩＡＳ　ＵＳＡ、　８２巻、６５０７−６５１１． １９８５年）。ウシｂＦＧＦの遺伝子がクローン化されている（＾ｂｒａｈａｍ 他、５ｃｉｅｎｃｅ、２３３巻、５４５−５４８．１９８６年）。

そのヌクレオチド配列からは、１５５アミノ酸のｂＦＧＦ翻訳産物が予測された 。更なる研究により、酵素阻害物質を添加した正常下垂体組織より、１５４アミ ノ酸のｂＦＧＦが１４６アミノ酸のｂＦＧＦと共に抽出され得ること（［１ｅｎ ｏ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙ＋、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍａ＋、、１３８巻、５８０−５８８　、１９ ８６年）、及び、脳及び肝癌細胞中の酸性プロテアーゼはｂＦＧＦを切断するこ と（Ｋｌｘｇ＋ｂｒｎｎ他、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、８４巻、１８３９−１８４３． １９８７年）が示されている。

蛋白質工学技術は、レコンビナント増殖因子の治療用途での利用を可能なものと した。しかしながら、これらの増殖因子は、ひとたび発現されると切断を受け、 様々な型の混合物になってしまう可能性があった。ＦＧＦもこの点に関しては例 外ではない（Ｂａｒｒ他、１．　［１ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　２６３巻、３１ 号、１６４７１−１６４７８．１９８８年）。

そこで我々は、Ｎ末端で切断されているｂＦＧＦの調製法を発案した。この方法 は、長い型より１４６アミノ酸型のｂＦＧＦを取得すること、及び、種々のｂＦ ＧＦが混在する中から単一の型のｂＦＧＦを生産することに応用し得る。結果と して得られる型は純粋であり、他型のｂＦＧＦの混入はない。

よって、本発明はｂＦＧＦの調製法を提供するものであり、その方法は、 （ｉ）　ヘパリン又はヘパラン硫酸と９−１０　Ｌｅａ−Ｐｒｏ結合を有するｂ ＦＧＦとの結合体を形成し、 （１１）　ペプシンＡ又はカテプシンＤにより結合体を処理して、前記結合を切 断し、 （ｉ　ｉ　ｉ）　かように取得されるｂＦＧＦを結合体から解離することを含む 。

各々、９−１０　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ結合を有し、第１１位からＣ末端まで同一のア ミノ酸配列を有し、しかも異なったＮ末端アミノ酸配列を有する２種類以上のｂ ＦＧＦの混合物が、第（ｉ）段階において使用可能である。これらのアミノ酸配 列は、異なったＮ末端を宵することのみが相違していてもよい。典型的には、ｂ ＦＧＦの配列間の唯一の相違とは、Ｎ末端アミノ酸残基の数が異なることである 。あるｂＦＧＦは他のｂＦＧＦより１つ以上余分なＮ末端アミノ酸残基を有して いてもよい。あるいはまた、各ｂＦＧＦの第９位以前のＮ末端アミノ酸配列が異 なるアミノ酸残基を含んでいてもよい。

そのため、本方法を、混合物中の各ｂＦＧＦのアミノ酸配列が９以下の番号のＮ 末端アミノ酸残基で始まりしかも異なるＮ末端を有するｂＦＧＦのいかなる混合 物についても応用することが可能である。第（ｉ）段階で用いる混合物は、すな わち、ＮＨ２−（ＡＡ）　Ｘ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｙ−ＣＯＯＨ［式中、ＡＡはア ミノ酸残基を、Ｘは０又は整数を、そしてＹは（１１−１５５）　ｂ　Ｆ　Ｇ　 Ｆのアミノ酸配列を示す。］という一般式を有するｂＦＧＦより構成されていて もよい。全長ｂＦＧＦは１５５アミノ酸残基を有し、ｔ５５−ｂＦＧＦあるいは （１−１５５）　ｂＦＧＦと表示され得る。ヒトＣ１−１５５）　ｂＦＧＦのア ミノ酸配列を配列番号１に示す。すなわち、この発明は、上述の式中のＸがそれ ぞれ８から１までの整数であり、（Ａ　Ａ）　が配列番号２から６に示される配 列の一つ、Ｉｌｅ■ Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　、　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ又はＴｈｒを示す、（１−１５５）　ｂＦ ＧＦから（８−１５５）ｂＦＧＦのうちの１種類のものあるいは２種類以上のも のの混合物について応用可能である。とりわけこの発明は、１５４アミノ酸残基 のｂＦＧＦ　［（２−１５５）ｂＦＧＦ］と１５３アミノ酸残基のｂＦＧＦ　［ （３−１５５）ｂＦＧＦ）との混合物に応用可能である。

ｂＦＧＦあるいはｂＦＧＦの混合物は、一般的にはレコンビナントＤＮＡ技術に より取得される。翻訳産物のＮ末端におけるプロセシングが原因で、かような混 合物中においては異型のｂＦＧＦが取得される。その又は各々のｂＦＧＦは、ヒ ト、マウス（ｍａｒｉｎｓ）又は鰯歯動物（ｒｏｄｅｎｔ）のｂＦＧＦであって もよい。

ヘパリン及びヘパラン硫酸より選択されるｂＦＧＦの保護剤と、ｂＦＧＦ混合物 とで、適当な様式の結合体が形成され得る。

保護剤及びｂＦＧＦは、典型的には水溶液とされる。この溶液はバッファー化さ れていてもよい。蛋白質の酸化を防止するための、ジチオスレイトールのような 酸化防止剤が存在していてもよい。ｂＦＧＦ対保護剤の比率は０．５：ｌから１ ０：１（Ｗ／Ｗ）でよく、例としては１：１から５　：　１　（Ｗ／Ｗ）が挙げ られる。結合体としてｂＦＧＦを保護することで、ペプシンＡ添加時の、更なる 不必要な加水分解を防止する。

ペプシンＡ（ＥＣ３゜４．２３．１）又はカテプシンＤ（ＥＣ３，４，２３，５ ）を次にその結合体に接触させる。この結果、結合体中に保持されているｂＦＧ Ｆ中の９−１０　Ｌｅｕ−Ｐｒ。

結合の特異的な切断が起こる。この酵素は結合体の溶液中に供給され得る。この 酵素は、つまりは、ｂＦＧＦ及び保護剤の溶液に添加し得る。この酵素は、一般 的にはｐＨを４から６に調節した溶液として供給される。

この溶液を、例えばペプシンＡの場合には３０分から１０時間、−例としては１ から８時間インキュベートする。カテプシンＤについてのインキュベーションは 典型的には長目になり、９０から１３０時間というのが例として挙げられるが、 約１１０時間というのが適当である。インキュベーション温度は５℃から室温ま ででよく、例としては約１０℃が挙げられる。

インキュベーシヨンは反応が完結するまで行う。

もう一つの方法としては、支持体に保護剤を固定して、親和性カラムを形成する ことも可能である。アガロースゲルあるいは架橋したデキストランゲルビーズ（ 例えばセファロース）のような適切なものであればどんな支持体でも使用し得る 。ｂＦＧＦの溶液をカラムにかける。ｂＦＧＦは保護剤に結合し、カラムに保持 される。次いで酵素溶液をカラムに通すことができる。最後に、切断された単一 の型のｂＦＧＦがカラムより溶出され得る。溶出は、塩化ナトリウム水溶液の直 線勾配を用いて行うことができる。

本発明の方法により、純粋型のｂＦＧＦが取得可能である。

特に（１Ｇ−１５５）ｂＦＧＦと表示される１４６アミノ酸型のｂＦＧＦが取得 可能である。取得されるｂＦＧＦは、例えば創傷や火傷の治療に利用し得る。こ のｂＦＧＦは、適切な製剤として外傷又は火傷に対して適用可能である。そのた めかような製剤は、典型的には、更に生理学的に受容可能な担体又は賦形剤をも 含んでいる。

以下の実施例により、本発明を説明する。調製例及び比較例が示されている。

調製例：１５４／１５３型のｂＦＧＦの調製ＥＰ−Ａ−３６３６７５に記載され た方法に従い、ｂＦＧＦの合成りＮＡ配列及びかような配列を担持する発現プラ スミドを構築した。発酵及び精製過程は以下のごとく行った。

（ａ）発酵過程 パスツール研究所コレクションからのバクテリア株Ｅ、ｃｏｌｉ１７ｐｅ　Ｂを 、ｂＦＧＦをコードするヒトの遺伝子及びテトラサイクリン耐性の遺伝子の両方 を担持するプラスミドを用いて形質転換させた。この形質転換株をレコンビナン ト・非グリコジル化型のｈ−ｂＦＧＦ　（ヒトｂＦＧＦ）の産生に使用した。こ の株につき、Ｍｘｓｌｕ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｓｎｋ　（ｖスター細胞バンク）（１５ 本の凍結乾燥バイアル）及びＷｏｒｋｉｎｇ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｓｎｋ　（Ｗ、Ｃ， Ｂ、。

作業用細胞バンク）（−１９０℃液化窒素中に保存の７０バイアル）を準備した 。Ｗ、Ｃ，Ｂ、の１バイアル分の中味は、発酵相における接種材料として使用し た。

発酵過程は１０リツトルの発酵槽に４リツトルの培養液を入れて行った。株選択 の条件を維持する目的で、テトラサイクリン塩酸を培養液に添加した。３７℃で の２０時間の増殖の後、最終生物量は乾燥重量で４２±２ｇ／ｌであり、比較ゲ ル電気泳動法により測定したところ、ｂＦＧＦの生産量は２５０Ｇ±５００ｍｇ ／ｌであった。

大規模なバクテリア増殖を可能にするためには、発酵相中、純粋酵素を濃くする ことが必要であった。

（ｂ）初期精製 遠心により細胞（微生物）を全発酵培養液から分離した。結果として得られたペ レットを、塩化ナリトウムを含有するリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁した 。効果的に細胞を破壊するには、高圧ホモジナイザーに少なくとも３回かける必 要があった。結果として得られる細胞溶解物を遠心により清澄化し、これからの 処理に付すため上清を回収した。

（ｃ）精製 清澄化した上清をセファロース（商標）Ｓファーストフロー（カチオン交換体） のカラムにのせ、リン酸バッファーの増加塩化ナトリウム濃度の勾配液を用いて このカラムから生成物を溶出した。この生成物を、ヘパリンセファ０−ス６Ｂの カラムで更に精製し、溶出はリン酸バッファーの増加塩化ナトリウム濃度の勾配 液を用いて行った。最終的に、バッファー交換をセファデックス（商標）Ｇ２５ レジン上で行い、大量の生成物バッファー（リン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ）中に おける生成物を取得した。

セファ０−スＳフアーストフロー及びセファデックスＧ２５のカラムを水酸化ナ トリウム溶液で洗浄し、殺菌した。ヘパリンセファロースは、３Ｍ塩化ナトリウ ムを含むＩ）Ｈ＝８．５、あるいは、ｐＨ＝５．５の溶液のいずれかで洗浄した 。

この方法により　１５４／１５３型のｂＦＧＦが取得された。これは、 −Ａｂ＋ａｈｘｍ他により報告され、又、配列番号＝１に示される１５５アミノ 酸型のうち、Ｎ末端のＭｅｔ残基を除くアミノ酸配列を有する　１５４アミノ酸 ヒトｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　［（２−＋５５１　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆコ、及び、 一配列番号：１に示される１５５アミノ酸型のうちＮ末端のＭｅｔ及びＡｌａ残 基を除く構成である１５３アミノ酸ヒトｂＦＧＦ　［（３−１５５）ｂＦＧＦ］ 　、の約５０対５０の混合物である。

調製例の１５４／１５３型ｂＦＧＦは、以下に示すバッファー溶液中の濃度１． 　８ｍｇ／ｍｌとして準備した。

−１０ｍＭの第１リン酸ナトリウム、 −Ｏ，ｌ　ｍＶのＥＤＴＡジナトリウム塩、−ｐＨ６，０゜ 制御子加水分解中の、蛋白質酸化を回避するために、２０ｍｇのジチオスレイト ールを１．８ｍｇのｂＦＧＦに添加した。

溶液１：１ｍｌのＨ２０中２０ｍｇの保護剤（ｂ）ｂＦＧＦと保護剤の溶液の調 製 −１００μｍの蛋白質サンプル、 一９μｍの溶液１、 一３μｍの１Ｍクエン酸ナトリウム、Ｉ）Ｈ３，０ｌ−７０μｍのＨ２０１ 一１８μｇ（１８μｌ）のブタ腸管粘膜由来ペプシンＡ１−最終容量：２００μ ｍ 保護剤はヘパラン硫酸であり、ｂＦＧＦ／保護剤の比は１：１　（Ｗ／Ｗ）であ った。ペプシンＡ　（ＥＣ：３．４．２３．１）を、ｐＨ４，０においてｂＦＧ Ｆと保護剤の溶液に添加し、１０℃にて１時間インキュベートした。

３、酵素加水分解の動力学 上述の加水分解法の後、異なる時間で５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。消化混合 液サンプルを、１，２０．４０及び６０分後に５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した 。１４６−ｂＦＧＦ型からの１５４／１５３　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ型の分離は、Ｐｈ ａｓｔ　ＳＳ７１ｊｅ　（商標：ファルマシア社）を用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥ分 析で行った。サンプルバッファーに関しては、ｔ’ｈａｓ＋　Ｇｅｌ　）Ｉｉｇ ｈ　Ｄｅｎｓｉｔ７のスタッキングゾーンでのサンプルの蛋白質沈降を回避する 目的で、サンプル調製条件を下記のごとく決定した。

−１５μｌの蛋白質溶液、 −１０ｔｔ　ｌの４０ｍＭ　Ｔｒｉ＋／ＨＣ１，４ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０％ＳＤ Ｓ、２０％メルカプトエタノール、９）１８．０、 ＝３μｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、及び−１ｔｔ　Ｉのブロモフェ ノールブルー（０，３％）。

サンプルの変性は、サンプルを１００℃で５分間加熱して行った。サンプルの分 析により、１時間後に消化混合液から採取されたサンプルでは１５４／１５３− 　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ断片は完全に消失していたことが示された。一つの主要断片が 取得されたが、それは対照物質として使用した１４６−ｂＦＧＦのレコンビナン ト断片にぴったり一致するものであった。

反応混合液を、あらかじめＴｒ目バッファー１０ｍＭ、　ｐＨ８，０゜０．５１ １　ＮｌＣｌで平衡化しであるヘパリン−アガロースカラムに直接かけた。０． ５Ｍから３ＭのＮｌＣｌの濃度勾配液を用いると、ｂＦＧＦは１．５Ｍ　ＮｌＣ ｌで溶出された。蛋白質濃度は、１５４／１５３ｂＦＧＦを対照物質として用い 、Ｂ＋ｚｄｌｏｒｄ法により決定した。

５．１４６型ｂＦＧＦのエレクトロブロッティングこのエレクトロブロッティン グ分析にて用いた方法は、Ｐｌｏｕｇｈ他（＾ｎｓｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１８ １巻、３３−３９．１９８９年）による記載のものと同様のものである。使用し た膜はＩｍｍｏｂｉｌｏｃ　ＰＶＤＦ　（ミリボア社）である。

電気泳動後、ゲルを転写バッファー（ｌｈＭ　ＣＡＰＳ　（３−［シクロへキシ ルアミノ］　−１−プロパンスルホン酸）　、ｐＦｌｌｌ、０．　２０％メタノ ール）で１０分間平衡化した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｃ　ＰＶＤＦは最初純粋メタノ ールで湿潤させ、使用前に転写バッファー中で平衡化する。セミトライブロッテ ィング用装置を使用した（ＫｙｈｓＣ−＾ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ｍｒｌｈｏｄｓ、１０巻、　２０３−２０９゜１９８４年 ）。電気転写は０　、　２　ｍＡ／　ｃｍ２で２時間行った。

ＰＶＤＦ膜を水ですすぎ、５０％（Ｖ／Ｖ）メタノールに溶解している０、１％ （Ｗ／　Ｖ　）クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０液中で１分間染色した 。余分な染料を水で軽くすすぎ落とし、次に、１０％（ｖ／Ｖ）酢酸を含む４０ ％（Ｖ／Ｖ）メタノールで５から１０分間脱染色した。次いで、配列決定前にＰ ＶＤＦ膜を注意深く中ですすいだ。

６．７ミノ末端配列決定 染色された蛋白質を含むＰＶＤＦ膜の断片を、ポリブレン処理しであるフィルタ ー上に一層になるように並べた。オンラインＰＴＨ−アミノ酸分析機モデル１２ ０Ａを備えたＡｆｌｌｌｌｉｅｄＢｉｏｓ７ｓｌｅｍｓ社の配列決定機モデル４ ７０Ａで配列決定をした。

これらの条件下で決定された蛋白質のＮＨ２Ｈ２Ｏ量初の３つのアミノ酸は、Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕであった。

これらのアミノ酸は、　１４６−ｐＦＧＦ型アミノアミノ末端のアミノ酸に相当 する。

７、レーザースキャンデンシトメトリー分析ヘブシンＡによる１５４／１５３− 　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの１時間の加水分解後に生成された１４６−ｂＦＧＦのパーセ ント率を決定する目的でこの分析を行った。１時間後、５０μｌの反応混合液を ５０μｌのＳＤＳ変性バッファーに混合した。同じ条件にて、種々の蛋白質濃度 のｂＦＧＦサンプルをＳＤＳ変性させた。これらのサンプルを、ゲルＰＡＡ　４ ／３０　（ファルマシア社）上での電気泳動により分離した。各ピークのデンシ トメトリーをＬＫＢＢＲＯＭ＾２２２０記録積分器を用いて分析した。これらの 条件により得られた標準曲線を用いたところ、１４６−ｂＦＧＦの濃度は＋５４ ／１５３−　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの開始濃度の９１％に相当することが明らかになっ た。

８、親和性精製後の１４６−ｂＦＧＦ収率酵素加水分解反応の収率を、ヘパリン −アガロースカラムでの１４６−ｂＦＧＦ型の精製後にも測定した。上述の第２ 項からの反応混合液１．６４ｍｇを、あらかじめＴｒｉｓ　１Ｇ！ＩＭ、　ｐＨ ８，０，５１ＮｓＣｌで平衡化したヘパリン−アガロースカラムにのせた。９８ ８においては、ペプシンＡは完全に不活性であり、ヘパラン硫酸とｂＦＧＦとの 複合体は不安定化されており、そのため培養液中に過剰に存在するヘパリン−ア ガロースへのｂＦＧＦの吸着が可能となる。ｂＦＧＦを１．５Ｍ　ＮｌＣｌで溶 出した。１．１４ｍｇの１４６−ｂＦＧＦ型が回収された。

保護剤としてヘパラン硫酸を用いた制御上加水分解及び親和性カラム精製後の１ ４６−ｂＦＧＦアミノ酸型の取得の全収率は７３％であった。

実施例２：保護剤としてヘパリン；ペプシンＡ保護剤をヘパリンとし、ｂＦＧＦ ／ヘパリン比を５対１　（ｗ／Ｗ）にし、消化混合液の一部分を、２分及び４． 　６．　８時間後に分析し、総インキュベージタン時間を８時間とした以外は、 実施例１の方法を繰り返した。ｂＦＧＦとヘパリンの溶液は、−１００μｌの蛋 白質サンプル、 一１８μｌの溶液２、 一３μｌの１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３，０、−７０μｌのＨ２Ｏ、 一１８μｇのペプシンＡ１ 一最終容量：２００μ１１ という組成であった。

溶液２は、１００μｍの溶液１及び９００μｍのＨ２Ｏから成る。

この様な条件下でも、８時間のインキュベーション後には、一種類のみの断片が 取得された。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定したところ、この断片は見かけ上 の分子量１６．２００を有するものであった。

アミノ末端配列分析により、実施例１と同じ３つのＮ末端アミノ酸、Ｐｒｏ−Ａ ｌａ−Ｌｅｕが得られた。

実施例３：保護剤としてヘパリン；ペプシンＡヘパリンーアガロースカラムでの １４６−ｂＦＧＦ断片の精製後、ヘパリンにより保護されたｂＦＧＦの制御下加 水分解の回収率も測定した。実施例２と同じ条件での７時間の加水分解後、１． ５４ｍｇのｂＦＧＦを含む反応液を、あらかじめ１０ｍＭリン酸ナトリウムバッ ファー、ｐＨ８，０及び０．５Ｍ　ＮｌＣｌで平衡化しであるヘパリン−アガロ ースカラムにがけた。１．０２ｍｇの１４６−ｂＦＧＦが、１．５Ｍ　ＮａＣｌ で溶出された。

保護剤としてヘパリンを使用した親和性カラム精製の後、取得された１４６−ｂ ＦＧＦアミノ酸型の取得の全収率は６９％であった。

実施例４：保護剤としてアガロース上に固定されたヘパリン：ヘパリン−アガロ ース（７ｍ１のゲルが５．　６ｍｇのヘパリンを含有）のカラムを１０ｄの第１ リン酸ナトリウム、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０、５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ４，０で１０℃において平衡化した。１５４／１５３ −ｂＦＧＦを親和性カラムにかけた。その後、同一のリン酸溶液で希釈した０、 １１１ｍｇのペプシンＡをカラムの上端にのせた。

０、　５ｍｌ／分の流速で６時間、この酵素をカラム全体に再循環させた。

６時間口に、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７，０，（１，１ｍＭ　 ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＣ１（３倍量）でカラムを洗浄し、次いで０．５Ｍか ら３ＭのＮａＣ］濃度勾配液で溶出した。ｂＦＧＦは１，５ＭＮａＣ１で溶出さ れた。

２．７ミノ末端配列分析 電気泳動後、実施例１に記載のセミトライブロッティング用装置を使用し、Ｉｍ ｍｏｂｉｌｏｎ　ＰＶＤＦ上でゲルをエレクトロプロットに付した。染色された 蛋白質を含有するＰＶＤＦ膜の断片を、ポリブレン処理したフィルターの上に一 層になるように並べた。

この様な条件下で決定された蛋白質のＮＨ２−末端部分の最初の３つのアミノ酸 は、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕであった。これらのアミノ酸は１４６−　ｂ　Ｆ　 Ｇ　Ｆ型のアミノ末端部分の３つのアミノ酸に相当する。

３．１４６−ｂＦＧＦの回収率 ヘパリン−アガロースカラムから洗い出した１４ｆ＋−ｂＦＧＦ断片の定量測定 後、加水分解反応の収率を測定した。１．２１１ｍｇの１４６−ｂＦＧＦが回収 された。ヘパリン−アガロースカラムでの制御上加水分解後の１４６−ｂＦＧＦ アミノ酸型（分子量１６、２００）の取得の全収率は８１％であった。

実施例５：保護剤としてヘパリン；カテプシンＤ１、ｂＦＧＦ酵素加水分解法 ペプシンＡの代わりにウシ牌臓由来のカテプシンＤを使用し、インキュベージタ ン時間を１１０時間とした以外は、実施例２を繰り返した。

２、反応動力学 酵素加水分解中に得られる＋４６−　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ断片の出現率はかなり低い ものであるが、１時間後には５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により検出された。７２時間 後において１５４／＋５３−　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの加水分解は完結しておらず、反 応液中に３６μｇのカテプシンＤを追加した。４０時間後に反応は完結した。こ れはカテプシンＤ（１０単位／ｍｇ）の低活性に起因している。

３．７ミノ末端配列分析 電気泳動後、実施例１に記載のセミトライブロッティング用装置を使用し、Ｉｍ ｍｏｂｉｌｏｎ　ＨＤＦ上でゲルをエレクトロプロットに付した。染色された蛋 白質を含有するＰＶＤＦ膜の切り取り断片を、ポリブレン処理したフィルター上 に一層になる様に並べた。オンラインＰＴＨ−アミノ酸分析機モデル１２ＯＡを 備えた１へｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｌｌｅｍ＋社の配列分析機モデル４７０Ａ で配列決定を行った。これらの条件下で決定された蛋白質のＮＨ２−末端部分の 最初の３つのアミノ酸は、Ｐｒｏ−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕであった。

比較例１：保護剤なしでのペプシンＡ 保護剤無しであることを除いて、実施例１を繰り返した。

１５４／　１５３型のｂＦＧＦは、数分のうちにペプシンＡにより完全に消化さ れた。

比較例２：保護剤なしでのカテプシンＤ保護剤無しであることを除いて、実施例 ５を繰り返した。

１５４／ｉ５３　？）　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆは、数分のうちにカテプシンＤにより完 全に消化された。

比較例３：α−キモトリプシン ペプシンＡの代わりにα−キモトリプシンを使用し、又、保護剤無しであること を除いて、実施例１を繰り返した。　１５４／１５３型のｂＦＧＦは、数分のう ちにα〜キモトリプシンにより完全に消化された。そのため、他の陰イオン性物 質について、α−キモトリプシンからｂＦＧＦを保護する能力に関するテストを 行った。

−ｂＦＧＦ／保護剤の比＝１ 一温度＝１０℃ −ｐＨ＝７．５ −インキュベーシコン時間＝４時間 ヘパリン３．０００を保護剤として使用し、５ｌ）Ｓ−ＰＡｆ；ε分析により測 定したところ、見かけ上の分子量１４．０Ｇ（ｌである一つの断片が主として得 られ、又、より小さい分子量を有する他の幾つかの断片も取得された。

２、ヘパリン（シグマ社、Ｈ３１２５）−ｂＦＧＦ／保護剤比（Ｗ／Ｗ）＝５ 一温度＝１０°Ｃ −ｐＨ＝７．５ −インキュベーンラン時間＝４時間 保護剤としてこの等級のヘパリンを用いると、保護が不充分であり、多数の断片 が取得された。

３、コンドロイチン硫酸 −ｂＦＧＦ／保護剤比（ｗ／ｗ）＝１ 一温度＝１０℃ −ｐＨ＝７．５ 一インキュベーション時間＝２時間 保護が不充分であり、多数の断片が取得された。

４、デルマタン硫酸 −ｂＦＧＦ／保護剤比（ｗ／ｗ）＝１ 一温度＝１０℃ −ｐＨ＝７．５ 一インキュベーション時間＝２時間 保護が不充分であり、多数の断片が取得された。

５、ポリアスパラギン酸 −ｂＦＧＦ／保護剤比（ｗ／ｗ）＝１ 一温度＝１０℃ −ｐＨ＝７．５ −インキュベーション時間＝２時間 ポリアスパラギン酸を保護剤として使用すると、保護が不充分であり、多数の断 片が取得された。

実施例６：保護剤としてヘパリン又はヘパラン硫酸：ペプシン１、実験手順 溶液中の可溶性複合体ｂＦＧＦ−ヘパリン及びｂＦＧＦ−ヘパラン硫酸の蛋白質 加水分解処理 １．６ｍｇの１５４／１５３−アミノ酸型のｂＦＧＦは、１０ｍＭクエン酸−リ ン酸バッファーｐＨ４，０，１０℃中で１．５ｍｇのヘパリンあるいはヘパラン 硫酸と複合させる。１時間のインキュベーション時間後、１６０μｇのペプシン Ａ　（Ｓｉｇｍａ社Ｐ−６８８７゜３２００−４５００単位／ｍｇ蛋白質）を溶 液に添加した。反応液のサンプルを、様々な時間において採取し、あらかじめ４ ℃下で１０ｍＭリン酸バッファーｐ　Ｈ８，０／　０．５Ｍ　ＮａＣｌで平衡化 したヘパリン−セファロースカラムに直接かけた。次に、カラムを同バッファー で長時間洗浄し、３Ｍ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ８，０で ｂＦＧＦを溶出した。−まとめにした各分画を、あらかじめｌＱｍＭリン酸バッ ファーｐＨ６，０で平衡化したセファデックスＧ２５カラムで脱塩し、５ＯＳ− ＰＡＧＥ分析に付した。保護剤としてヘパラン硫酸を使用すると、１時間後には 定量的な収率で１４６−ｂＦＧＦが取得された。ｂＦＧＦ−ヘパリン複合体のペ プシン処理では、ちょうど６，５時間のインキュベーション時間で同様の定量的 な収率に至った。

ヘパリン−セファロースカラムに結合したｂＦＧＦのペプシンＡ処理 ５Ｇｍｇのｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１５４／１５３）を、あらかじめ４℃下で０．５ Ｍ１１ａｃｌを含む２５ｍＭクエン酸バッファーｐＨ４，ｆｌで平衡化したヘパ リン−セファロースカラム（Ｐｈａ＋ｍａｃｉｔ社）　（２，６Ｘ２２．５ｃｎ ）に流速２．５ｍｌ／分でかけた。クエン酸−リン酸バッファーに溶かした６８ ０単位／ｍｌのブタペプシンＡ　（Ｓｉｇｍｘ社）溶液を、４℃下で３時間、２ ．　５ｍｌ／分の流速で連続的にカラムを循環させた。その後、カラムを０．５ Ｍ　ＮａＣ１を含む２５ｍＭリン酸バッファーｐＨ８，０で長時間洗浄して酵素 を不活性化させ、除去した。ｂＦＧＦは、３１　ＮｌＣｌを含む２５ｍＭリン酸 バッファーｐＨ８，０で段階的に溶出させた。ｂＦＧＦを含有するフラクション をひとまとめにし、＾ｍ１ｃｏｎ　ＰＭＩＯ膜上での限外濾過により濃縮し、あ らかじめ１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６，０で平衡化しであるセファデックス Ｇ２５カラム（Ｐｈｕｍｘｃｉａ　社）で脱塩した。

Ｎ末端配列分析 オンラインのモデル１２０ＡのＰＴＨ−分析機を備えたモデル４７７Ａのパルス 法液相配列決定機（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｔ７ｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ） で自動Ｎ末端配列分析に付した。多少変更を加えたＮｏｒｍｉｉｌプログラムを 使用した。配列決定用物質及び試薬は全てＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｌｅｍ ｓ社より購入した。

Ｃ末端配列分析 酵素対基質の比を約１　：　１００　（ｗ／ｗ）として（Ｌｕ他、１、Ｃｂｒｏ ｍａｔｏｇｒ、、４４７巻、３５１−３６４．　１９８８年）、０．０５％Ｂ＋ １ｊ−３５を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ３，ａ中、室温下にて 、ｂＦＧＦのカルボキシペプチダーゼＰ消化の経時変化実験を行った。

０．５からｌｎｍｏｌの蛋白質の消化を、０．１から０．２μｇのＣｐ　Ｐ　（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｔ社）を用いて２時間行った。Ｎ−ｏイシンを内部標準物質 として添加した。様々な時間において、１Ｇ／１００μｍ分液を採取し、モデル ４２０Ａの誘導体化機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ７ｓｌｅｍｉ社）においてＰＩ ＴＣにより自動的誘導体化を行ない、次にオンラインのモデル１３０Ａの分析機 を備えたＲＰ−ＨＰＬＣに注入した後に、これをアミノ酸分析に付した。誘導体 化されたＰＴＣ−アミノ酸の分離は、ＰＴＣ−Ｃ８カラム（Ｐ／Ｎ　０７１１− ０２０４．　２２０Ｘ２．Ｉｍｍ、５ｕ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｔｅ ＩＩＩＫ社）で行った。

バイオアッセイ ウシ大動脈由来の内皮細胞株（Ｂ　Ａ　Ｅ　Ｃ）を、ｂＦＧＦによって誘導され る増殖反応の実験に用いた。１３％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ギブコ社、ＵＫ ）を補充したＤｏｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ　ＥＢｌｅ’　１Ｍｅｄｉｕ ｍ　（ＤＭＥＩＪ）より成る完全培養液を使用して、９６穴のマイクロタイター プレートに、２５００細胞／穴として細胞を撒いた。細胞付着後、完全培養液を 、０．５％ウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）　（Ｓｉｇｍ！社ＵＳＡ）及び所望濃度のｌ）　Ｆ　（：、　）’　（Ｅｔｂ ｚｍｏｎｊ社）を補充したＤＭＥＭから成る実験用培養液に入れ替えた。培養液 を３日間インキュベートし、３８目にフォルマリンで固定し、０．５％のクリス タルバイオレットで染色した。染色後各穴を十分に洗浄し、細胞に取り込まれな かった染料を除去した。メタノール（９５％、Ｏ，１ｍｌ／穴）を各穴に加え、 各穴ごとの細胞増殖の量におおまかに比例している染料を抽出した。プレートを 自動計測するため、５４０ｎｍのフィルターを付けたマイクロプレート用の分光 光度計にかけた。

プラスミノーゲン活性化因子の合成のため、ＢＡＥＣ（０，２１中、３×１０４ 細胞／穴）を、９６穴マイクロタイタープレー１の完全培養液に撒き、細胞付着 後、培養液を０．５％ＦＢＳ。

０．１％ＢＳＡ及び実験濃度のｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭに入れ替えた。２８ 時間インキュベーションした後、培養液を洗浄し、細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ 　Ｘ−１００を含む溶液で溶解した。

分注した細胞溶解物を、アミトールアッセイ用の色素産生基質（Ｓｐｅｃｌｒｏ ＋ｙ＋ｅｅ　ＰＬ）及びプラスミノーゲン（いずれの試薬も＾ｍｅ＋１ｃａｎ　 Ｄｉａｇｎｏ＋１ｉｃａ　Ｉｎｃ、社）を用いるプラスミノーゲン活性化因子活 性に関するアッセイに付した。

２、結果 酵素によるｂＦＧＦの制御下切断 精製されたレコンビナント１５４／１５３の混合物を、２種類の異なるアスパラ ギン酸加水分解酵素、ペプシンＡ及びカテプシンＤと共にインキュベートした。

反応混合液の一部を様々な時間間隔をおいて採取し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付 したところ、保護剤が何ら存在しないとｂＦＧＦは急速に小さなペプチドへと消 化されることが示された。一方、ヘパリンあるいはヘパラン硫酸（１・１ｗ／ｗ ）存在下でペプシンＡ　（１０：　１　ｗ／ｗ。

ｐＨ４，［ｌ；１０℃）を用いてｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１５４／１５３　）を処理 したところ、結果として、１５４／１５３アミノ酸型の低分子量型への段階的か つ完全な転換が起こり、得られる低分子量型は我々の１４６／１４５アミノ酸型 標準物質と同じ位置に移動した。

ＰＤＶＦ膜でのエレクトロブロッティング後、酵素消化の結果生じた低分子量バ ンドを、パルス法液相配列決定機における自動Ｎ末端配列分析に付した。最初の ３サイクルで一種類の均一な配列、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕが結果として得られ 、この配列は、既知の１４６アミノ酸型の未処理Ｎ最終末端に相当するものであ った。他の配列は検出されなかったことより、ｂＦＧＦ分子上には３箇所のＬｅ ｕ−Ｐｒｏ部位が存在するにもかかわらず、伸長型のｂＦＧＦがヘパリンあるい はヘパラン硫酸と複合体を形成している時には、ペプシンＡでの消化はＬｅｕ　 −Ｐｒｏ１θペプチド結合のみを特異的に切断することが示された。

ペプシンＡを使用して得られた、「ヘパリンに保護された」ＮＨ２−伸長型ｂＦ ＧＦ分子の制御上蛋白質加水分解による切断は、カテプシンＤを用いた消化に関 しても再現されたが、この蛋白質加水分解反応にはより長いインキュベーション 時間が必要であり、これは使用した調製酵素の低い比活性に起因する可能性が強 い。ｐＨが７．５である以外は同様の条件にてキモトリプシンを添加した場合、 インキュベーション液のゲル電気泳動後に、約１４０００ダルトンの単一なポリ ペプチドが検出され、１４６アミノ酸型の存在は認められなかった。

伸長型ｂＦＧＦの１５４／１５３混合物をヘパリン−セファロースカラムに結合 させるラージスケール法でも、溶液及び小規模のバッチ反応において得られた結 果を立証した。このためには、５０ｍｇのｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１５４／１５３） をあらかじめｐＨ４，０のクエン酸リン酸バッファーで平衡化したヘパリン−セ ファロースカラムにかけた。ペプシンＡ溶液は、４℃下において３時間、連続的 にカラム中を循環させた。その後、カラムをアルカリ性ｐＨのリン酸バッファー で洗浄し、酵素を不活性化して除去した。結果として得られたポリペプチドは、 ３１　ＮａＣｌを含むｐＨ８，０のリン酸バッファーを用いてカラムより溶出さ せた。ｂＦＧＦ含有分画を集め、セファデックスＧ２５カラムで脱塩した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析された、集めた分画は、標準物ｊｔ　１４６／＋ ４５　ｂＦＧＦ型の分子量に相当する分子量の単一バンドを示した。逆相ＨＰＬ Ｃ分析においても、やはり単一ピークが結果として得られた。Ｎ末端配列分析で は、１４６−アミノ酸型の正確な未処理Ｎ末端に一致する単一の配列、つまり、 Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−が取得された。Ｃ末端配列分析では、ｂＦＧＦ分子の 予測通りのカルボキシル最終末端、つまり、Ａｌａ−Ｌｙｓ−３ｅｒが示された 。従って、ｂＦＧＦがヘパリン−セファロース樹脂に結合した場合にもやはり、 ペプシンＡはＬ　ｅ　ｕ　Ｐ　ｒ　Ｏ１０結合において特異的に分子を切断し、 均一な１４６−アミノ酸型を産生じ得た。

ｂＦＧＦ型のインビトロバイオアッセイ１５４／１５３−アミノ酸型の混合物の 生物学的活性を、記載した蛋白質加水分解法により取得された均一な１４６−ア ミノ酸型のものと比較した。２種類の活性、つまり、増殖反応の誘導及びプラス ミノーゲン活性化因子の合成を、ウシ大動脈の内皮細胞（ＢＡＥＣ）において検 討した。酵素法により取得される１４６アミノ酸型と比較すると、１５４／１５ ３型はインビトロにおいては生物学的に等価であることが、両アッセイにより証 明された。

配列表 （１）配列番号、１に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１５５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数゛ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：蛋白質 （Ｘｌ）配列：配列番号＝１： Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　 Ｆｈａ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｄｏｓ　Ａｒｇ　’Ｌａ■ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｚ　ＧＩＹ　Ｇｌｙ　ＰｈｅＰｈｅＬｇｕ　Ａｒｇ 工１ｅ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＶａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖ −Ｌｌ　）Ｘｑ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＫＬｓ工ＩＱ　Ｄ ／、　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　ｌ１ｕＧｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｙ　Ｖａｌ　Ｖａｎ　Ｓａｒ工１＠Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｙｍ　Ａｌａ　 ＡｓｎＡｒｇＴ１ｙｒＩｊｕ　Ａｌａ　Ｍａｔ　ＩＪ／Ｓ　Ｇｌｕ　ＡＳＰ　Ｇ ｌｙ　Ａｒｑ　Ｌａｌ　ｍ　Ａｌａ　Ｓａｒ　＄　ＣｙｓＶａｌ　’Ｉｈｒ　Ａ ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｆｌｅａ　’Ｆｈａ　Ｇｌｕ　鯰ト民Ｇｌｕ　 ５ａｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒｌｏｏ　１０５　ｎ。

Ａ！ｇＩ計Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　’Ｌｙｐ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓａ ｒ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ　’ＬｐＡｒｇ　’Ｉｈｒ　Ｇｌ ｙ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ−１ｓａ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　聯Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｎ　Ｘｙｙ。

１３０　Ｄ５　１４０ ｊｕａ工１ｅ　ＴＡＰｒＭａ’Ｌａｗ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｓａｒに、ａ　１５ａ ｒ（２）配列番号・２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ペプチド （１１）配列：配列番号・２： Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＧＩ７　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ（３）配列 番号＝３に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さニアアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ロ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号＝３＝ ＾１８ＡＩ＆Ｇ１７　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ（４）配列番号＝４に関 する情報： （ｉ）配列特性。

（Ａ）長さ・６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類・ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号＝４＝ ＾１！　Ｇ１７　Ｓｅｔ　ｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈ＋（５）配列番号＝５に関する 情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ペプチド （工ｉ）配列：配列番号：５： Ｇ１７　Ｓｅｔ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ（６）配列番号＝６に関する情報。

（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：６： Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｔ　Ｔｈｒ 要　約 ｂＦＧＦは、 （ｉ）ヘパリン又はヘパラン硫酸と９−ＩＧ　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ結合をｆるｂＦＧ Ｆとの結合体を形成し、 （■）ペプシンＡ又はカテプシンＤにより結合体を処理し−ｌ前記結合を切断し 、 （ｉ　ｉ　ｉ）かように取得されるｂＦＧＦを結合体から解離することにより調 製される。

この方法は、伸長型のｂＦＧＦから１４６アミノ酸型の１ＧＦを調製することに 応用できる。又、この方法を、異なＺ末端を有することのみが相違するアミノ酸 配列のｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　＆−合物から単一の型のｂＦＧＦを生産することにも利 用でき２国際調査報告 １ｍ１４ｍ＋ｍａａｌＡＨ＋＋＋−＋ｅ＋＋Ｎｅ（ｌｒインｔｏａ＋７ｎ＋ａ） ρ国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）ヘパリン又はヘパラン硫酸と９−１０Ｌｅｕ−Ｐｒｏ結合を有するｂ ＦＧＦとの結合体を形成し、（ｉｉ）ペプシンＡ又はカテプシンＤにより結合体 を処理して、前記結合を切断し、 （ｉｉｉ）かように取得されるｂＦＧＦを結合体から解離することを含む、塩基 性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の調製方法。
2. ２．異なるＮ末端を有することのみが相違するアミノ酸配列の前記ｂＦＧＦの２ 種類以上のものの混合物を第（ｉ）段階において使用する請求項１に記載の方法 。
3. ３．一般式 ＮＨ２−（ＡＡ）１−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｙ−ＣＯＯＨ［式中、ＡＡはアミノ酸残 基を、ｘは０又は整数を、そしてＹは（１１−１５５）ｂＦＧＦのアミノ酸配列 を示す。］を有するｂＦＧＦより前記混合物が構成される請求項２に記載の方法 。
4. ４．（ＡＡ） １が、配列番号：２から６の配列の一つ、【配列があります】又はＴｈｒを示す 請求項３に記載の方法。
5. ５．前記混合物が（２−１５５）ｂＦＧＦ及び（３−１５５）ｂＦＧＦより構成 される請求項３に記載の方法。
6. ６．その又は各々のｂＦＧＦが、ヒト、マウスあるいは認歯動物のｂＦＧＦであ る請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ７．第（ｉ）段階において、ヘパリン又はヘパラン硫酸及びその又は各々のｂＦ ＧＦがバッファー水溶液として供給され、第（ｉｉ）段階において、その結果得 られる溶液にヘブシンＡ又はカテプシンＤを添加する請求項１〜６のいずれか一 項に記載の方法。
8. ８．第（ｉ）段階において、ヘパリン又はヘパラン硫酸を支持体上に固定して親 和性カラムを形成し、前記ｂＦＧＦの溶液をそのカラムにかけ、第（ｉｉ）段階 において、かようにサンプルをかけたカラムにペプシンＡ又はカテプシンＤを通 し、第（ｉｉｉ）段階において、かように取得される切断された単一型のｂＦＧ Ｆをカラムより溶離する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. ９．請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により調製されたｂＦＧＦ及び生 理学的に受容可能な担体又は賦形剤を含む製剤。