JP3205578B2 - キメラ繊維芽細胞成長因子 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Description
【０００１】
【本発明の背景】本発明は新規のキメラの塩基性繊維芽
細胞成長因子並びに該成長因子（ｂＦＧＦ）を増殖生産
する方法に関する。
細胞成長因子並びに該成長因子（ｂＦＧＦ）を増殖生産
する方法に関する。
【０００２】ポリペプチド成長因子は細胞の増殖および
分化を行うホルモンに似たモジュレータである。成長因
子は成長、再生および傷の修復を含む種々の生理学的な
過程を調節する作用をもっている。
分化を行うホルモンに似たモジュレータである。成長因
子は成長、再生および傷の修復を含む種々の生理学的な
過程を調節する作用をもっている。
【０００３】これらの成長因子の研究の過程において、
種々の組織、例えば脳、脳下垂体、視床下部からの抽出
物が培養された細胞の有糸分裂を刺激する能力に関し、
多数の成長因子が同定されてきた。これらの抽出物中の
活性因子には多数の簡略化された名前が付けられ、これ
らの中には上皮成長因子、血小板誘導成長因子、神経成
長因子、造血成長因子および繊維芽細胞成長因子が含ま
れる。
種々の組織、例えば脳、脳下垂体、視床下部からの抽出
物が培養された細胞の有糸分裂を刺激する能力に関し、
多数の成長因子が同定されてきた。これらの抽出物中の
活性因子には多数の簡略化された名前が付けられ、これ
らの中には上皮成長因子、血小板誘導成長因子、神経成
長因子、造血成長因子および繊維芽細胞成長因子が含ま
れる。
【０００４】繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は１９７４
年ゴスポダロヴィッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ）
により、繊維芽細胞および内皮細胞に対するマイトジェ
ンである牛の脳または脳下垂体の組織から誘導されるも
のとして初めて発表された［ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）誌２４９巻１２３〜１２７頁］。後に脳から得られ
る主なマイトジェンは脳下垂体から分離されたものとは
異なることが報告された。これらの２種の成長因子はそ
れぞれ酸性および塩基性のＦＧＦと名付けられた。何故
ならば両者は全く同じではないが同様な生物活性を有
し、等電点が異なっているからである。酸性および塩基
性の繊維芽細胞成長因子［最近ダヴリュー・エイチ・バ
ージェス（Ｗ．Ｈ．Ｂｕｒｇｅｓｓ）およびティー・マ
シアグ（Ｔ．Ｍａｃｉａｇ）によりアニュアル・レヴィ
ユー・オヴ・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）誌５８巻５７５〜６０６頁（１９８９
年）総説が書かれている］はヘパリン結合成長因子の１
種の通常の構成員であり、内皮細胞、平滑筋細胞、副腎
皮質細胞、前立腺細胞、網膜上皮細胞、オリゴデンドロ
サイト、アストロサイト、クリンドサイト、筋芽細胞、
骨芽細胞を含む大部分の中胚葉細胞および脳外胚葉から
誘導される細胞の一般的な増殖能力に影響を及ぼす［デ
ィー・ゴスポダロヴィッツ等、Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎ．４８巻１０９〜１３０頁（１９７８
年）、および上記バージェス並びにマシアグの論文５８
４頁］。人のメラノサイトは塩基性の繊維芽細胞成長因
子の突然変異を誘起するような影響に対し応答するが、
酸性のＦＧＦは応答しない。しかしながら、大部分の型
の鳥類および哺乳類の細胞は両方のポリペプチドに応答
する（上記バージェス等の論文）。
年ゴスポダロヴィッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ）
により、繊維芽細胞および内皮細胞に対するマイトジェ
ンである牛の脳または脳下垂体の組織から誘導されるも
のとして初めて発表された［ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）誌２４９巻１２３〜１２７頁］。後に脳から得られ
る主なマイトジェンは脳下垂体から分離されたものとは
異なることが報告された。これらの２種の成長因子はそ
れぞれ酸性および塩基性のＦＧＦと名付けられた。何故
ならば両者は全く同じではないが同様な生物活性を有
し、等電点が異なっているからである。酸性および塩基
性の繊維芽細胞成長因子［最近ダヴリュー・エイチ・バ
ージェス（Ｗ．Ｈ．Ｂｕｒｇｅｓｓ）およびティー・マ
シアグ（Ｔ．Ｍａｃｉａｇ）によりアニュアル・レヴィ
ユー・オヴ・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）誌５８巻５７５〜６０６頁（１９８９
年）総説が書かれている］はヘパリン結合成長因子の１
種の通常の構成員であり、内皮細胞、平滑筋細胞、副腎
皮質細胞、前立腺細胞、網膜上皮細胞、オリゴデンドロ
サイト、アストロサイト、クリンドサイト、筋芽細胞、
骨芽細胞を含む大部分の中胚葉細胞および脳外胚葉から
誘導される細胞の一般的な増殖能力に影響を及ぼす［デ
ィー・ゴスポダロヴィッツ等、Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎ．４８巻１０９〜１３０頁（１９７８
年）、および上記バージェス並びにマシアグの論文５８
４頁］。人のメラノサイトは塩基性の繊維芽細胞成長因
子の突然変異を誘起するような影響に対し応答するが、
酸性のＦＧＦは応答しない。しかしながら、大部分の型
の鳥類および哺乳類の細胞は両方のポリペプチドに応答
する（上記バージェス等の論文）。
【０００５】繊維芽細胞成長因子は細胞の成長を刺激す
るマイトジエン的な応答を誘起することの他に、多数の
細胞型を剌激しマイトジエン的でない応答をすることが
できる。これらの活性には傷を負った区域への細胞の移
動の促進（走化性）、新しい血管の生成（アンギオジェ
ネシス）、神経再生の調節（ニューロトロピズム）、お
よび特定の細胞蛋白質の表現、細胞外マトリックスの生
産および治癒過程において重要な細胞の生存に対する刺
激または抑制が含まれる（上記バージェス並びにマシア
グの論文５８４〜５８８頁）。
るマイトジエン的な応答を誘起することの他に、多数の
細胞型を剌激しマイトジエン的でない応答をすることが
できる。これらの活性には傷を負った区域への細胞の移
動の促進（走化性）、新しい血管の生成（アンギオジェ
ネシス）、神経再生の調節（ニューロトロピズム）、お
よび特定の細胞蛋白質の表現、細胞外マトリックスの生
産および治癒過程において重要な細胞の生存に対する刺
激または抑制が含まれる（上記バージェス並びにマシア
グの論文５８４〜５８８頁）。
【０００６】これらの性質は、細胞の成長促進作用と共
に、繊維芽細胞成長因子を治療の目的に使用して、傷の
治癒の促進、および血栓症、動脈硬化等の予防および治
療を行う基礎となる。従って繊維芽細胞成長因子は外傷
を受けた組織の治癒を促進し［ジェー・エム・ダヴィド
ソン等、ジャーナル・オヴ・セル・バイオロジー誌１０
０巻１２１９〜１２２７頁（１９８５年）］、心臓の病
気および手術の際の心筋の損傷を最小限度に抑制し（フ
ランコの米国特許第４，２９６，１００号および第４，
３７８，３４７号）、ニューロンの生存と軸索突起の延
長を増加させる［ピー・ウォリック等、米国プロシーデ
ィング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ・サイエ
ンス誌８３巻３０１２〜３０１６頁（１９８６年）］こ
とが示唆されて来た。
に、繊維芽細胞成長因子を治療の目的に使用して、傷の
治癒の促進、および血栓症、動脈硬化等の予防および治
療を行う基礎となる。従って繊維芽細胞成長因子は外傷
を受けた組織の治癒を促進し［ジェー・エム・ダヴィド
ソン等、ジャーナル・オヴ・セル・バイオロジー誌１０
０巻１２１９〜１２２７頁（１９８５年）］、心臓の病
気および手術の際の心筋の損傷を最小限度に抑制し（フ
ランコの米国特許第４，２９６，１００号および第４，
３７８，３４７号）、ニューロンの生存と軸索突起の延
長を増加させる［ピー・ウォリック等、米国プロシーデ
ィング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ・サイエ
ンス誌８３巻３０１２〜３０１６頁（１９８６年）］こ
とが示唆されて来た。
【０００７】従来からヒトの酸性の、並びにヒトおよび
ウシの塩基性の繊維芽細胞成長因子をコード化した相補
的なＤＮＡクローンが分離され、配列決定されており、
この相補的なＤＮＡから得られた推定されるアミノ酸配
列は蛋白質の配列分析法により決定された構造と一致し
ている（上記バージェスおよびマシアグの総説の５８０
〜５８１頁にまとめられている）。これらのデータから
酸性の繊維芽細胞成長因子（以後ａＦＧＦと略記する）
は１５５個のアミノ酸をもっていることが予測される
（上記文献参照）。塩基性の繊維芽細胞成長因子（以後
ｂＦＧＦと略記する）に対する遺伝子も１５５残基の蛋
白質をコードしている。ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両方
に対しＮ−末端の切断された形が存在し、これは全部の
生物活性を含んでおり、最初に分離され配列決定された
ｂＦＧＦの１４６個のアミノ酸を含むもの［エフ・エッ
シュ等、米国プロシーディング・オヴ・ナチュラル・ア
カデミー・オヴ・サイエンス誌８２巻６５０７〜６５１
１頁（１９８５年）および１３１個のアミノ酸を含むも
のとがある。構造を解析した結果ａＦＧＦとｂＦＧＦと
の間に５５％の一致が見られた（上記バージェスおよび
マシアグの総説の５８１頁）。
ウシの塩基性の繊維芽細胞成長因子をコード化した相補
的なＤＮＡクローンが分離され、配列決定されており、
この相補的なＤＮＡから得られた推定されるアミノ酸配
列は蛋白質の配列分析法により決定された構造と一致し
ている（上記バージェスおよびマシアグの総説の５８０
〜５８１頁にまとめられている）。これらのデータから
酸性の繊維芽細胞成長因子（以後ａＦＧＦと略記する）
は１５５個のアミノ酸をもっていることが予測される
（上記文献参照）。塩基性の繊維芽細胞成長因子（以後
ｂＦＧＦと略記する）に対する遺伝子も１５５残基の蛋
白質をコードしている。ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両方
に対しＮ−末端の切断された形が存在し、これは全部の
生物活性を含んでおり、最初に分離され配列決定された
ｂＦＧＦの１４６個のアミノ酸を含むもの［エフ・エッ
シュ等、米国プロシーディング・オヴ・ナチュラル・ア
カデミー・オヴ・サイエンス誌８２巻６５０７〜６５１
１頁（１９８５年）および１３１個のアミノ酸を含むも
のとがある。構造を解析した結果ａＦＧＦとｂＦＧＦと
の間に５５％の一致が見られた（上記バージェスおよび
マシアグの総説の５８１頁）。
【０００８】塩基性の繊維芽細胞成長因子は哺乳類の組
織から抽出することができるが、これにはヘパリン結合
アフィニティークロマトグラフを使用したとしても数段
階を必要とし（ゴスポダロヴィッツ等の米国特許第４,
７８５,０７９号および第４,９０２,７８２号）、プロ
テアーゼ阻害剤なしで抽出を行うと一般に１４６個のア
ミノ酸をもつ種が得られる（同特許第９欄２９〜３２
行）。ウシおよびヒトの塩基性繊維芽細胞成長因子ｃＤ
ＮＡは大腸菌［エム・イワネ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．誌１４６巻４７０〜
４７７頁（１９８７年）、およびシー・エイチ・スクァ
イヤーズ等、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミ
ストリー誌２６３巻１６２９７〜１６３０２頁（１９８
８年）］、およびエス・セルヴィシアエ（Ｓ．ｃｅｒｖ
ｉｃｉａｅ）［ピー・ジェー・バー等、ジャーナル・オ
ヴ・バイオロジカル・ケミストリー誌２６３巻１６４７
１〜１６４７８頁（１９８８年）］中で表現されてい
る。しかし生成物の報告された収率は低く（エッシュ等
のヨーロッパ特許明細書第２２８,４４９号１８頁参
照）、組換え体成長因子は蛋白質中で遊離のチオール基
により促進されるチオール−ジスルフィド交換を行う傾
向が強く、その結果ジスルフィドがスクランブルされた
種が生じる（上記イワネの論文参照）。
織から抽出することができるが、これにはヘパリン結合
アフィニティークロマトグラフを使用したとしても数段
階を必要とし（ゴスポダロヴィッツ等の米国特許第４,
７８５,０７９号および第４,９０２,７８２号）、プロ
テアーゼ阻害剤なしで抽出を行うと一般に１４６個のア
ミノ酸をもつ種が得られる（同特許第９欄２９〜３２
行）。ウシおよびヒトの塩基性繊維芽細胞成長因子ｃＤ
ＮＡは大腸菌［エム・イワネ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．誌１４６巻４７０〜
４７７頁（１９８７年）、およびシー・エイチ・スクァ
イヤーズ等、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミ
ストリー誌２６３巻１６２９７〜１６３０２頁（１９８
８年）］、およびエス・セルヴィシアエ（Ｓ．ｃｅｒｖ
ｉｃｉａｅ）［ピー・ジェー・バー等、ジャーナル・オ
ヴ・バイオロジカル・ケミストリー誌２６３巻１６４７
１〜１６４７８頁（１９８８年）］中で表現されてい
る。しかし生成物の報告された収率は低く（エッシュ等
のヨーロッパ特許明細書第２２８,４４９号１８頁参
照）、組換え体成長因子は蛋白質中で遊離のチオール基
により促進されるチオール−ジスルフィド交換を行う傾
向が強く、その結果ジスルフィドがスクランブルされた
種が生じる（上記イワネの論文参照）。
【０００９】多数の塩基性繊維芽細胞成長因子の同族体
が示唆されている。ｂＦＧＦの変種でアミノまたはカル
ボキシル末端アミノ基が除去されたもの、アミノ酸が付
加されたもの、システインがセリンのような中性のアミ
ノ酸で置き換えられたもの、またはアスパラギン酸、ア
ルギニン、グリシン、セリンまたはバリンが他の酸で置
き換えられたものは安定性が増加していることが示唆さ
れている（セノ等のヨーロッパ特許明細書第２８１，８
２２号４頁１〜３行、および６頁２９行〜７頁１９
行）。この変種は付加された部分、除去された部分およ
び置き換えられた部分を２または３個有し、システイン
がセリンに置き換えられたものが最も好適である（７頁
１８〜２３行）。アラカワおよびフォックス（ヨーロッ
パ特許明細書第３２０，１４８号）は天然のｂＦＧＦに
存在するシステインの少なくとも１個、好ましくは２個
を他のアミノ酸残基で置き換えると、安定性の高い同族
体が得られることを示唆している（１３頁２２〜２３
行）。実施例にはセリンが示されている（５頁２６行お
よび１３頁２５行）が、アラニン、アスパラギン酸およ
びアスパラギンも示唆されている（５頁２６行および１
３頁２２行）。同様に余分な結合を生じるシステインを
セリンで置き換え、酸化し易いシステイン、メチオニン
およびトリプトファンをアラニン、バリン、ロイシンま
たはイソロイシンで置き換えた組み換えａＦＧＦは、生
物活性が増加または改善された成長因子を与えることが
示唆されている（トーマス・ジュニアーおよびラインメ
イヤーのヨーロッパ特許明細書第３１９，０５２号１７
頁８〜２０行）。
が示唆されている。ｂＦＧＦの変種でアミノまたはカル
ボキシル末端アミノ基が除去されたもの、アミノ酸が付
加されたもの、システインがセリンのような中性のアミ
ノ酸で置き換えられたもの、またはアスパラギン酸、ア
ルギニン、グリシン、セリンまたはバリンが他の酸で置
き換えられたものは安定性が増加していることが示唆さ
れている（セノ等のヨーロッパ特許明細書第２８１，８
２２号４頁１〜３行、および６頁２９行〜７頁１９
行）。この変種は付加された部分、除去された部分およ
び置き換えられた部分を２または３個有し、システイン
がセリンに置き換えられたものが最も好適である（７頁
１８〜２３行）。アラカワおよびフォックス（ヨーロッ
パ特許明細書第３２０，１４８号）は天然のｂＦＧＦに
存在するシステインの少なくとも１個、好ましくは２個
を他のアミノ酸残基で置き換えると、安定性の高い同族
体が得られることを示唆している（１３頁２２〜２３
行）。実施例にはセリンが示されている（５頁２６行お
よび１３頁２５行）が、アラニン、アスパラギン酸およ
びアスパラギンも示唆されている（５頁２６行および１
３頁２２行）。同様に余分な結合を生じるシステインを
セリンで置き換え、酸化し易いシステイン、メチオニン
およびトリプトファンをアラニン、バリン、ロイシンま
たはイソロイシンで置き換えた組み換えａＦＧＦは、生
物活性が増加または改善された成長因子を与えることが
示唆されている（トーマス・ジュニアーおよびラインメ
イヤーのヨーロッパ特許明細書第３１９，０５２号１７
頁８〜２０行）。
【００１０】カルボキシル末端から７〜４６のアミノ酸
が除去され、随時アミノ酸が置き換えられているｂＦＧ
Ｆ変種は、安定性が改善されると同時に活性を保持して
いることがセノ等のヨーロッパ特許明細書第３２６，９
０７号に記載されている（２頁５０行〜３頁４行）。フ
ィッヅ等（ヨーロッパ特許明細書第２９８７２３号）は
１２８〜１３８の残基を含むヘパリン結合領域の塩基性
または正に帯電した残基を、中性または負に帯電したア
ミノ酸で置き換えると、ヘパリン結合能力が減少し効力
が強くなったＦＧＦが生じることを示唆している（５頁
４５行および５頁５４行〜６頁１６行）。バーゴンゾニ
等は２７〜３２の残基を欠いたＭ１−ｂＦＧＦ；５４〜
５８の残基を欠いたＭ２−ｂＦＧＦ；７０〜７５の残基
を欠いたＭ３−ｂＦＧＦ；７８〜８３の残基を欠いたＭ
４−ｂＦＧＦ；１１０〜１２０の残基を欠いたＭ５−ｂ
ＦＧＦ；１２８の位置のリジンおよび１２９の位置のア
ルギニンがグルタミン残基で置き換えられているＭ５ａ
−ｂＦＧＦ；および位置１１９および１２８のリジンお
よび位置１１８および１２９のアルギニンがグルタミン
残基で置き換えられているＭ６ｂ−ｂＦＧＦの６種の同
族体を示唆している（ヨーロッパ特許明細書第３６３，
６７５号、６欄４８行〜７欄１３行）。
が除去され、随時アミノ酸が置き換えられているｂＦＧ
Ｆ変種は、安定性が改善されると同時に活性を保持して
いることがセノ等のヨーロッパ特許明細書第３２６，９
０７号に記載されている（２頁５０行〜３頁４行）。フ
ィッヅ等（ヨーロッパ特許明細書第２９８７２３号）は
１２８〜１３８の残基を含むヘパリン結合領域の塩基性
または正に帯電した残基を、中性または負に帯電したア
ミノ酸で置き換えると、ヘパリン結合能力が減少し効力
が強くなったＦＧＦが生じることを示唆している（５頁
４５行および５頁５４行〜６頁１６行）。バーゴンゾニ
等は２７〜３２の残基を欠いたＭ１−ｂＦＧＦ；５４〜
５８の残基を欠いたＭ２−ｂＦＧＦ；７０〜７５の残基
を欠いたＭ３−ｂＦＧＦ；７８〜８３の残基を欠いたＭ
４−ｂＦＧＦ；１１０〜１２０の残基を欠いたＭ５−ｂ
ＦＧＦ；１２８の位置のリジンおよび１２９の位置のア
ルギニンがグルタミン残基で置き換えられているＭ５ａ
−ｂＦＧＦ；および位置１１９および１２８のリジンお
よび位置１１８および１２９のアルギニンがグルタミン
残基で置き換えられているＭ６ｂ−ｂＦＧＦの６種の同
族体を示唆している（ヨーロッパ特許明細書第３６３，
６７５号、６欄４８行〜７欄１３行）。
【００１１】しかし現在でも上記の治療に使用する目的
で新規の安定で活性をもった形の繊維芽細胞成長因子の
探索が尚続けられている。
で新規の安定で活性をもった形の繊維芽細胞成長因子の
探索が尚続けられている。
【００１２】
【本発明の概要】本発明は生のｂＦＧＦの３の位置のア
ラニン残基および５の位置のセリン残基がグルタミン酸
で置き換えられた新規の全長に亙る（１５５個のアミノ
酸に対しコード化を行う）ヒトの塩基性繊維芽細胞成長
因子の遺伝子および蛋白質に関する。本発明のＧｌ
ｕ３，５ｈｂＦＧＦはＮ−末端の８個のアミノ酸のとこ
ろでヒトの酸性ＦＧＦと配列が同じであり、従ってキメ
ラＦＧＦと考えることができる。更に詳細に述べれば、
これらの成長因子はヒトのＦＧＦであるが、本発明によ
って他の哺乳類のＦＧＦも得られる。
ラニン残基および５の位置のセリン残基がグルタミン酸
で置き換えられた新規の全長に亙る（１５５個のアミノ
酸に対しコード化を行う）ヒトの塩基性繊維芽細胞成長
因子の遺伝子および蛋白質に関する。本発明のＧｌ
ｕ３，５ｈｂＦＧＦはＮ−末端の８個のアミノ酸のとこ
ろでヒトの酸性ＦＧＦと配列が同じであり、従ってキメ
ラＦＧＦと考えることができる。更に詳細に述べれば、
これらの成長因子はヒトのＦＧＦであるが、本発明によ
って他の哺乳類のＦＧＦも得られる。
【００１３】ｇｌｕ３，５キメラ繊維芽細胞成長因子は
組織から誘導されたｂＦＧＦのマイトジエン活性誘起性
をもっているが、大腸菌中における表現は生の配列のも
のよりも著しく大きい。従って本発明によれば新規の生
物活性をもったＦＧＦおよびそれを高収率で製造する方
法が提供される。
組織から誘導されたｂＦＧＦのマイトジエン活性誘起性
をもっているが、大腸菌中における表現は生の配列のも
のよりも著しく大きい。従って本発明によれば新規の生
物活性をもったＦＧＦおよびそれを高収率で製造する方
法が提供される。
【００１４】ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの新規変種に関し
ても同じ発見がなされた。例えばシステイン７８および
システイン９６をチオールジスルフィドの変換を除去す
るアミノ酸、例えばセリンで置き換えると成長因子の安
定化された種類が得られる。従って本発明はｈｂＦＧＦ
（１〜１５５）を変性して大腸菌中に表現される成長因
子の収率を著しく増加させるばかりでなく、精製を容易
にし安定性を増加させることができる。
ても同じ発見がなされた。例えばシステイン７８および
システイン９６をチオールジスルフィドの変換を除去す
るアミノ酸、例えばセリンで置き換えると成長因子の安
定化された種類が得られる。従って本発明はｈｂＦＧＦ
（１〜１５５）を変性して大腸菌中に表現される成長因
子の収率を著しく増加させるばかりでなく、精製を容易
にし安定性を増加させることができる。
【００１５】従って本発明によれば新規の生物学的に活
性をもった繊維芽細胞成長因子並びにこれを工業的規模
で製造する方法が提供される。好適具体化例において
は、本発明のＤＮＡでコードされた新規ＦＧＦをプラス
ミドまたはベクターの中に挿入し、これを必要に応じ便
利に且つ効率的に保存、貯蔵または輸送することができ
る。次にプラスミドまたはベクターを用いて微生物、例
えば大腸菌に対し形質変換またはトランスフェクション
を行い、必要に応じこれを用いて本発明の新規ＦＧＦを
コード化するゲノム材料を保存、貯蔵および輸送するこ
とができる。これらの成長因子を発現する条件下におい
てこれらの微生物の培養すると、高収率でポリペプチド
が生産される。
性をもった繊維芽細胞成長因子並びにこれを工業的規模
で製造する方法が提供される。好適具体化例において
は、本発明のＤＮＡでコードされた新規ＦＧＦをプラス
ミドまたはベクターの中に挿入し、これを必要に応じ便
利に且つ効率的に保存、貯蔵または輸送することができ
る。次にプラスミドまたはベクターを用いて微生物、例
えば大腸菌に対し形質変換またはトランスフェクション
を行い、必要に応じこれを用いて本発明の新規ＦＧＦを
コード化するゲノム材料を保存、貯蔵および輸送するこ
とができる。これらの成長因子を発現する条件下におい
てこれらの微生物の培養すると、高収率でポリペプチド
が生産される。
【００１６】上記のように外傷を負った区域に放出され
た該成長因子は通常の治癒過程を促進するから、本発明
の新規繊維芽細胞成長因子は火傷、外科的な切除および
他の傷の治療、床ずれ等を含む皮膚の潰瘍の治療、心臓
血管系の異常、および心臓傷害後傷付いた組織の血管再
生を行うことにより血流を再び流す場合の処置、骨の修
復の促進、筋肉骨格傷害の治療、および神経萎縮症およ
び他の病気の治療などに使用する用途をもっている。
た該成長因子は通常の治癒過程を促進するから、本発明
の新規繊維芽細胞成長因子は火傷、外科的な切除および
他の傷の治療、床ずれ等を含む皮膚の潰瘍の治療、心臓
血管系の異常、および心臓傷害後傷付いた組織の血管再
生を行うことにより血流を再び流す場合の処置、骨の修
復の促進、筋肉骨格傷害の治療、および神経萎縮症およ
び他の病気の治療などに使用する用途をもっている。
【００１７】
【本発明の詳細な記述】本発明は約１５５個のアミノ酸
をもつ新規塩基性繊維芽細胞成長因子を高収率で製造す
る方法がおよび安定化する方法に関する。本明細書には
ヒトの成長因子についての組換え体の例が提供されてい
るが、本発明のＦＧＦは他の哺乳類にも適用することが
できる。本発明の新規組み換えＦＧＦは全長に亙るヒト
の塩基性繊維芽細胞成長因子のアラニン３およびセリン
５をグルタミン酸で置き換えることによりつくられる。
ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦはＮ−末端の８個のアミノ酸の
所で配列がヒトのａＦＧＦと同じであり、従ってｈａＦ
ＧＦおよびｈｂＦＧＦのキメラ同族体と考えることがで
きる。この変種は生の配列をもったｂＦＧＦに比べ大腸
菌中で表現される蛋白質の収率を著しく増加させる。
をもつ新規塩基性繊維芽細胞成長因子を高収率で製造す
る方法がおよび安定化する方法に関する。本明細書には
ヒトの成長因子についての組換え体の例が提供されてい
るが、本発明のＦＧＦは他の哺乳類にも適用することが
できる。本発明の新規組み換えＦＧＦは全長に亙るヒト
の塩基性繊維芽細胞成長因子のアラニン３およびセリン
５をグルタミン酸で置き換えることによりつくられる。
ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦはＮ−末端の８個のアミノ酸の
所で配列がヒトのａＦＧＦと同じであり、従ってｈａＦ
ＧＦおよびｈｂＦＧＦのキメラ同族体と考えることがで
きる。この変種は生の配列をもったｂＦＧＦに比べ大腸
菌中で表現される蛋白質の収率を著しく増加させる。
【００１８】組み換えられた生来のｂＦＧＦおよびｇｌ
ｕ3,5ｈｂＦＧＦは両方ともヘパリン−および逆相高速
液体クロマトグラフ上において微小不均一性を示す。ど
のような理論にも拘束されることを望まないが、この微
小不均一性はチオール−ジスルフィド交換（ジスルフィ
ドのスクランブル）によると思われる。何故ならば微小
不均一性はクロマトグラフにかける前に還元剤で成長因
子を処理すれば除去できるからである。成長因子の安定
化された種類の生成およびジスルフィドがスクランブル
された形の除去は部位特異的突然変異誘発によりシステ
イン７８およびシステイン９６をセリンで置き換えるこ
とにより達成される。
ｕ3,5ｈｂＦＧＦは両方ともヘパリン−および逆相高速
液体クロマトグラフ上において微小不均一性を示す。ど
のような理論にも拘束されることを望まないが、この微
小不均一性はチオール−ジスルフィド交換（ジスルフィ
ドのスクランブル）によると思われる。何故ならば微小
不均一性はクロマトグラフにかける前に還元剤で成長因
子を処理すれば除去できるからである。成長因子の安定
化された種類の生成およびジスルフィドがスクランブル
された形の除去は部位特異的突然変異誘発によりシステ
イン７８およびシステイン９６をセリンで置き換えるこ
とにより達成される。
【００１９】本明細書においては、蛋白質が試験管内お
よび生体内における試験でＦＧＦ活性を示し（上記のバ
ージェスおよびマシアグの総説の５８４〜５８６頁参
照）、ヘパリンと結合し、１．５〜１．７モルのＮａＣ
ｌ濃度でヘパリン・セファロースから流出し、ヒトまた
はウシの塩基性ＦＧＦまたはそれらの合成されたまたは
生来のペプチドを用いてつくられた抗体と免疫的に反応
するか、またはウシの血清アルブミンと共役なｂＦＧＦ
の配列をもつ合成同族体になるならば、塩基性ＦＧＦで
あると定義される。また蛋白質が試験管内および生体内
における試験でＦＧＦ活性を示し、ヘパリンと結合し、
１．０〜１．２モルのＮａＣｌ濃度でヘパリン・セファ
ロースから流出し、ヒトまたはウシのａＦＧＦまたはそ
れらの合成されたまたは生来のペプチドを用いてつくら
れた抗体と免疫的に反応するならば、酸性ＦＧＦである
と定義される。キメラの繊維芽細胞成長因子は両方の型
の配列を共有している。任意の哺乳類、特にヒトの繊維
芽細胞成長因子が本発明の範囲内に含まれる。
よび生体内における試験でＦＧＦ活性を示し（上記のバ
ージェスおよびマシアグの総説の５８４〜５８６頁参
照）、ヘパリンと結合し、１．５〜１．７モルのＮａＣ
ｌ濃度でヘパリン・セファロースから流出し、ヒトまた
はウシの塩基性ＦＧＦまたはそれらの合成されたまたは
生来のペプチドを用いてつくられた抗体と免疫的に反応
するか、またはウシの血清アルブミンと共役なｂＦＧＦ
の配列をもつ合成同族体になるならば、塩基性ＦＧＦで
あると定義される。また蛋白質が試験管内および生体内
における試験でＦＧＦ活性を示し、ヘパリンと結合し、
１．０〜１．２モルのＮａＣｌ濃度でヘパリン・セファ
ロースから流出し、ヒトまたはウシのａＦＧＦまたはそ
れらの合成されたまたは生来のペプチドを用いてつくら
れた抗体と免疫的に反応するならば、酸性ＦＧＦである
と定義される。キメラの繊維芽細胞成長因子は両方の型
の配列を共有している。任意の哺乳類、特にヒトの繊維
芽細胞成長因子が本発明の範囲内に含まれる。
【００２０】本発明のキメラの繊維芽細胞成長因子は約
１５５個のアミノ酸をもったｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦお
よびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦを含
み、また約１５４個のアミノ酸をもった切断型（例えば
Ｎ−末端メチオニンをもたないもの、実施例６（ｂ）参
照）を含んでいる。本発明はまた７８および９６の位置
のシステインを他のアミノ酸、例えばアラニン、グリシ
ン、アルギニン、トリプトファン、リジン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒス
チジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルア
ラニン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニンま
たはプロリンで置き換えたｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ同族
体を含んでいる。さらに本発明のＦＧＦ誘導体は特定な
種ではなく、例えばウシのＦＧＦの相補的複製およびｈ
ｂＦＧＦと配列相同性をもつ他の種類のものが含まれ
る。
１５５個のアミノ酸をもったｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦお
よびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦを含
み、また約１５４個のアミノ酸をもった切断型（例えば
Ｎ−末端メチオニンをもたないもの、実施例６（ｂ）参
照）を含んでいる。本発明はまた７８および９６の位置
のシステインを他のアミノ酸、例えばアラニン、グリシ
ン、アルギニン、トリプトファン、リジン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒス
チジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルア
ラニン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニンま
たはプロリンで置き換えたｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ同族
体を含んでいる。さらに本発明のＦＧＦ誘導体は特定な
種ではなく、例えばウシのＦＧＦの相補的複製およびｈ
ｂＦＧＦと配列相同性をもつ他の種類のものが含まれ
る。
【００２１】本発明の新規繊維芽細胞成長因子は構成ア
ミノ酸から、或いはアミノ酸またはペプチドとポリペプ
チドから、当業界の専門家に公知の化学的または生化学
的方法、例えば短い繊維芽細胞のＮ−末端に順次アミノ
酸を付加してゆく方法でポリペプチドを組み立てること
により製造することができる。別法として本発明の新規
繊維芽細胞成長因子はキメラＦＧＦをコード化するＤＮ
Ａをつくり、このＤＮＡをベクターに挿入し、宿主細胞
中でベクターを発現させ、このようにしてつくられた組
換え体ＦＧＦを分離する方法である。
ミノ酸から、或いはアミノ酸またはペプチドとポリペプ
チドから、当業界の専門家に公知の化学的または生化学
的方法、例えば短い繊維芽細胞のＮ−末端に順次アミノ
酸を付加してゆく方法でポリペプチドを組み立てること
により製造することができる。別法として本発明の新規
繊維芽細胞成長因子はキメラＦＧＦをコード化するＤＮ
Ａをつくり、このＤＮＡをベクターに挿入し、宿主細胞
中でベクターを発現させ、このようにしてつくられた組
換え体ＦＧＦを分離する方法である。
【００２２】本発明のＦＧＦをコード化するＤＮＡはヌ
クレオチドを除去するか、ヌクレオチドを付加するか、
或いは標準の方法を用いて点突然変異誘発を行うことに
よりヒトまたはウシの塩基性繊維芽細胞成長因子の遺伝
子を変化させてつくられる。その例は実施例１に示され
ている。遺伝子コードの縮重のために、本発明のＦＧＦ
をコードしているＤＮＡをつくるために種々のコドンの
変化の組み合わせを選ぶことができ、キメラＦＧＦをコ
ード化するＤＮＡを生じるどのようなヌクレオチドの除
去、付加または点突然変異も本発明の範囲に含まれる。
ある種の生物中でポリペプチドを発現するには或る種の
コドンがより効率的であるから、本発明のＦＧＦをコー
ドしているＤＮＡを得るために繊維芽細胞遺伝子をどの
ように変化させるかを選ぶには、組み換えベクターの宿
主として作用する種類の生物の中で最も効率の良い発現
を与えるものを選ぶことが好ましい。
クレオチドを除去するか、ヌクレオチドを付加するか、
或いは標準の方法を用いて点突然変異誘発を行うことに
よりヒトまたはウシの塩基性繊維芽細胞成長因子の遺伝
子を変化させてつくられる。その例は実施例１に示され
ている。遺伝子コードの縮重のために、本発明のＦＧＦ
をコードしているＤＮＡをつくるために種々のコドンの
変化の組み合わせを選ぶことができ、キメラＦＧＦをコ
ード化するＤＮＡを生じるどのようなヌクレオチドの除
去、付加または点突然変異も本発明の範囲に含まれる。
ある種の生物中でポリペプチドを発現するには或る種の
コドンがより効率的であるから、本発明のＦＧＦをコー
ドしているＤＮＡを得るために繊維芽細胞遺伝子をどの
ように変化させるかを選ぶには、組み換えベクターの宿
主として作用する種類の生物の中で最も効率の良い発現
を与えるものを選ぶことが好ましい。
【００２３】変化させてキメラＤＮＡをつくり得る繊維
芽細胞成長因子のＤＮＡ原料は天然のもの、組み換えた
もの、或いは合成したものであることができる。即ちＤ
ＮＡ原料は組織または組織培養物から分離するか、通常
の方法でオリゴヌクレオチドからつくるか、市販品を使
用するか、或いは繊維芽細胞からのｂＦＧＦに対してコ
ーディングを行うＲＮＡを分離し、このＲＮＡを用いて
単一鎖のｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として使用して
対応する二重鎖のＤＮＡをつくることができる。
芽細胞成長因子のＤＮＡ原料は天然のもの、組み換えた
もの、或いは合成したものであることができる。即ちＤ
ＮＡ原料は組織または組織培養物から分離するか、通常
の方法でオリゴヌクレオチドからつくるか、市販品を使
用するか、或いは繊維芽細胞からのｂＦＧＦに対してコ
ーディングを行うＲＮＡを分離し、このＲＮＡを用いて
単一鎖のｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として使用して
対応する二重鎖のＤＮＡをつくることができる。
【００２４】本発明の例には実施例２および３でつくら
れるようなキメラ繊維芽細胞ポリペプチド配列を定義す
るクローニングされた相補的なＤＮＡが含まれる。また
ＤＮＡ配列の同族体またはそれと密接に関連した相補的
なＤＮＡ、即ち、特にストリンジエントな条件下におい
てハイブリダイズすることによりキメラの繊維芽細胞ｃ
ＤＮＡになるＤＮＡ配列、およびそれに対応したＲＮＡ
が含まれる。本発明に含まれるＤＮＡは、キメラＦＧＦ
をコードしている配列の他に、ベクターを構成する配列
に依存して、遺伝子の発現を容易にする追加の配列を含
んでいる。
れるようなキメラ繊維芽細胞ポリペプチド配列を定義す
るクローニングされた相補的なＤＮＡが含まれる。また
ＤＮＡ配列の同族体またはそれと密接に関連した相補的
なＤＮＡ、即ち、特にストリンジエントな条件下におい
てハイブリダイズすることによりキメラの繊維芽細胞ｃ
ＤＮＡになるＤＮＡ配列、およびそれに対応したＲＮＡ
が含まれる。本発明に含まれるＤＮＡは、キメラＦＧＦ
をコードしている配列の他に、ベクターを構成する配列
に依存して、遺伝子の発現を容易にする追加の配列を含
んでいる。
【００２５】本発明のキメラ成長因子をコード化するＤ
ＮＡまたはそれに対応するＲＮＡを、次にベクター、例
えばｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＵＢ、またはｐＥＴ系列のプラ
スミドに挿入し、この組み換えられたベクターを用いて
宿主微生物の形質変換を行う。宿主生物はバクテリア
［例えば大腸菌またはビー・スブテリス（Ｂ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）］、イースト［例えばエス・セヴリシアエ
（Ｓ．Ｃｅｖｒｉｃｉａｅ）］または哺乳類（例えばマ
ウスの繊維芽細胞）であることができる。従ってまた本
発明によれば、標準的な方法でつくられたキメラ成長因
子を記述するＲＮＡおよびＤＮＡの配列を導入した新規
の生物学的に機能をもったウイルスの円形プラスミドが
提供される。外因性のベクターで運ばれるＤＮＡまたは
ＲＮＡの配列の大規模な発現を容易にする条件下におい
て、このようなベクターで安定に形質転換またはトラン
スフェクションされた微生物を培養し、その増殖培地、
細胞溶解物または細胞膜画分を分離すると所望の生成物
が得られる。大腸菌中にｈｂＦＧＦの突然変異体を発現
させた例を実施例４に示す。
ＮＡまたはそれに対応するＲＮＡを、次にベクター、例
えばｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＵＢ、またはｐＥＴ系列のプラ
スミドに挿入し、この組み換えられたベクターを用いて
宿主微生物の形質変換を行う。宿主生物はバクテリア
［例えば大腸菌またはビー・スブテリス（Ｂ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）］、イースト［例えばエス・セヴリシアエ
（Ｓ．Ｃｅｖｒｉｃｉａｅ）］または哺乳類（例えばマ
ウスの繊維芽細胞）であることができる。従ってまた本
発明によれば、標準的な方法でつくられたキメラ成長因
子を記述するＲＮＡおよびＤＮＡの配列を導入した新規
の生物学的に機能をもったウイルスの円形プラスミドが
提供される。外因性のベクターで運ばれるＤＮＡまたは
ＲＮＡの配列の大規模な発現を容易にする条件下におい
て、このようなベクターで安定に形質転換またはトラン
スフェクションされた微生物を培養し、その増殖培地、
細胞溶解物または細胞膜画分を分離すると所望の生成物
が得られる。大腸菌中にｈｂＦＧＦの突然変異体を発現
させた例を実施例４に示す。
【００２６】本発明によれば、ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆ、ｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦおよび
位置７８および９６におけるシステインのジスルフィド
変換を除去または排除する他のアミノ酸で置き換えられ
ている他のｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦに対してコード化を
行うＤＮＡであって、選ばれた非哺乳類の宿主による発
現に好適なコドンを含み、エンドヌクレアーゼ酵素を用
いて制限する開裂部位が備えられ、さらに容易に発現で
きるベクターを容易に構成できる開始、終止および中間
部分のＤＮＡ配列を備えた有利な特性をもっているＤＮ
Ａの全製造法および／または部分的製造法が提供され
る。従って本発明によれば、１種またはそれ以上のアミ
ノ酸残基に関し本明細書に詳細に記載された形とは異な
り（即ちｈｂＦＧＦに対して規定されたすべての残基の
中の幾つかが除去された同族体、および／または１種ま
たはそれ以上の残基が置き換えられた同族体、および／
またはポリペプチドの末端または中間部分に１種または
それ以上の残基が付加された同族体）、ｇｌｕ３，５ｈ
ｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦ
ＧＦと同じ生物学的性質をもったキメラ繊維芽細胞成長
因子を微生物で発現するためのコード化を行い得るＤＮ
Ａの製造法（およびｃＤＮＡおよび突然変異体のＤＮＡ
の部位特異性をもった突然変異による発現法）が提供さ
れる。
Ｆ、ｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦおよび
位置７８および９６におけるシステインのジスルフィド
変換を除去または排除する他のアミノ酸で置き換えられ
ている他のｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦに対してコード化を
行うＤＮＡであって、選ばれた非哺乳類の宿主による発
現に好適なコドンを含み、エンドヌクレアーゼ酵素を用
いて制限する開裂部位が備えられ、さらに容易に発現で
きるベクターを容易に構成できる開始、終止および中間
部分のＤＮＡ配列を備えた有利な特性をもっているＤＮ
Ａの全製造法および／または部分的製造法が提供され
る。従って本発明によれば、１種またはそれ以上のアミ
ノ酸残基に関し本明細書に詳細に記載された形とは異な
り（即ちｈｂＦＧＦに対して規定されたすべての残基の
中の幾つかが除去された同族体、および／または１種ま
たはそれ以上の残基が置き換えられた同族体、および／
またはポリペプチドの末端または中間部分に１種または
それ以上の残基が付加された同族体）、ｇｌｕ３，５ｈ
ｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦ
ＧＦと同じ生物学的性質をもったキメラ繊維芽細胞成長
因子を微生物で発現するためのコード化を行い得るＤＮ
Ａの製造法（およびｃＤＮＡおよび突然変異体のＤＮＡ
の部位特異性をもった突然変異による発現法）が提供さ
れる。
【００２７】本発明のＤＮＡ（およびＲＮＡ）配列は一
次構造配座の少なくとも一部を有し、キメラ繊維芽細胞
成長因子の生物学的特性を一つまたはそれ以上もったポ
リペプチド生成物を原核または真核宿主細胞で発現する
のに有用なすべての配列をコードする。これらの配列に
は（ａ）本明細書に記載されたｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
およびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦまた
はそれに相補的な鎖をコード化して得られるＤＮＡ配
列；（ｂ）本明細書記載のハイブリッド化条件またはも
っとストリンジエントなハイブリツド化条件下において
（ａ）に定義したＤＮＡ配列またはその断片にハイブリ
ダイズし得るＤＮＡ配列；および（ｃ）遺伝コードの縮
重がなければ上記（ａ）および（ｂ）に定義したＤＮＡ
配列にハイブリダイズしうるＤＮＡ配列が含まれる。特
にキメラ繊維芽細胞成長因子の対立変種をコード化する
ゲノムＤＮＡ配列、およびキメラ繊維芽細胞成長因子の
ＲＮＡ、その断片、および配列化されたＲＮＡまたはＤ
ＮＡが非脊椎動物の宿主のメッセンジャーの転写または
ＲＮＡ複製を容易にするコドンを導入できる同族体をコ
ードする配列が含まれる。
次構造配座の少なくとも一部を有し、キメラ繊維芽細胞
成長因子の生物学的特性を一つまたはそれ以上もったポ
リペプチド生成物を原核または真核宿主細胞で発現する
のに有用なすべての配列をコードする。これらの配列に
は（ａ）本明細書に記載されたｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
およびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦまた
はそれに相補的な鎖をコード化して得られるＤＮＡ配
列；（ｂ）本明細書記載のハイブリッド化条件またはも
っとストリンジエントなハイブリツド化条件下において
（ａ）に定義したＤＮＡ配列またはその断片にハイブリ
ダイズし得るＤＮＡ配列；および（ｃ）遺伝コードの縮
重がなければ上記（ａ）および（ｂ）に定義したＤＮＡ
配列にハイブリダイズしうるＤＮＡ配列が含まれる。特
にキメラ繊維芽細胞成長因子の対立変種をコード化する
ゲノムＤＮＡ配列、およびキメラ繊維芽細胞成長因子の
ＲＮＡ、その断片、および配列化されたＲＮＡまたはＤ
ＮＡが非脊椎動物の宿主のメッセンジャーの転写または
ＲＮＡ複製を容易にするコドンを導入できる同族体をコ
ードする配列が含まれる。
【００２８】本発明によって微生物的で発現されたポリ
ペプチドの分離および精製は通常の方法で行うことがで
き、これらの方法には例えば図２および３に示されたよ
うな分取クロマトグラフによる分離、および免疫的な分
離法、例えばモノクローナルおよび／またはポリクロー
ナル抗体を用いる方法、即ち実施例５に例示された精製
法が含まれる。
ペプチドの分離および精製は通常の方法で行うことがで
き、これらの方法には例えば図２および３に示されたよ
うな分取クロマトグラフによる分離、および免疫的な分
離法、例えばモノクローナルおよび／またはポリクロー
ナル抗体を用いる方法、即ち実施例５に例示された精製
法が含まれる。
【００２９】上記の説明および下記実施例に詳細に説明
されることを要約すれば、本発明のキメラ繊維芽細胞成
長因子は全長に亙る（１５５個のアミノ酸）ヒト塩基性
繊維芽細胞成長因子の組換え体であり、３の位置のアラ
ニンと５の位置のセリンがグルタミン酸で置き換えられ
ており、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現系を用いて大腸菌
で発現されたものである。［ここに用いられたｂＦＧＦ
についての番号はアブラハム等（１９８６年）によって
１５５個のアミノ酸の形に対して付けられたものであ
り、メチオニン・コドンを１の位置としている。］。生
来の組換え体ｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦは
両方ともヘパリン−およびＲＰ−ＨＰＬＣ上で広範な微
小不均一性を示し（図２）、これは成長因子をクロマト
グラフにかける前にジチオトレイトールのような還元剤
で処理すれば除去することができる（図３）。成長因子
の安定化された種をつくり、ジスルフィドに変換した形
のものを除去するには、システイン７８およびシステイ
ン９６を部位特異的突然変異誘発によってセリンで置き
換えることにより達成される。
されることを要約すれば、本発明のキメラ繊維芽細胞成
長因子は全長に亙る（１５５個のアミノ酸）ヒト塩基性
繊維芽細胞成長因子の組換え体であり、３の位置のアラ
ニンと５の位置のセリンがグルタミン酸で置き換えられ
ており、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現系を用いて大腸菌
で発現されたものである。［ここに用いられたｂＦＧＦ
についての番号はアブラハム等（１９８６年）によって
１５５個のアミノ酸の形に対して付けられたものであ
り、メチオニン・コドンを１の位置としている。］。生
来の組換え体ｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦは
両方ともヘパリン−およびＲＰ−ＨＰＬＣ上で広範な微
小不均一性を示し（図２）、これは成長因子をクロマト
グラフにかける前にジチオトレイトールのような還元剤
で処理すれば除去することができる（図３）。成長因子
の安定化された種をつくり、ジスルフィドに変換した形
のものを除去するには、システイン７８およびシステイ
ン９６を部位特異的突然変異誘発によってセリンで置き
換えることにより達成される。
【００３０】この発現系におけるｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆおよびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦの
収率は両方共、ａＦＧＦ ｃＤＮＡと同様に、親のｂＦ
ＧＦｃＤＮＡよりも１０倍高い（実施例５）。ｇｌ
ｕ３，５ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，
９６ｈｂＦＧＦの配列はＮ−末端の８個のアミノ酸のと
ころでｈａＦＧＦと同じである。従ってこれらの誘導体
はキメラである。
Ｆおよびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦの
収率は両方共、ａＦＧＦ ｃＤＮＡと同様に、親のｂＦ
ＧＦｃＤＮＡよりも１０倍高い（実施例５）。ｇｌ
ｕ３，５ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，
９６ｈｂＦＧＦの配列はＮ−末端の８個のアミノ酸のと
ころでｈａＦＧＦと同じである。従ってこれらの誘導体
はキメラである。
【００３１】本発明のポリペプチドは繊維芽細胞成長因
子と同様な生物学的活性を保持している。例えば組換え
体ｈｂＦＧＦのマイトジエン性を突然変異によって得ら
れる蛋白質をウシの脳から最初に分離されたｂＦＧＦ
（１０〜１５５）と比較すると（実施例７）、ヒトｂＦ
ＧＦの組換え体およびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦは内皮細
胞の成長の用量に依存する刺激を示し、これはウシの脳
のｂＦＧＦと同一である（図５）。システイン７８およ
び９６をセリンで置き換えてｇｌｕ３，５，ｓｅ
ｒ７８，９６ｈｂＦＧＦにしても、潜在的な突然変異誘
起性には影響がなく、組織から誘導されたウシのｂＦＧ
Ｆに対して決定されたものと区別できない用量−応答曲
線を与える（図６）。
子と同様な生物学的活性を保持している。例えば組換え
体ｈｂＦＧＦのマイトジエン性を突然変異によって得ら
れる蛋白質をウシの脳から最初に分離されたｂＦＧＦ
（１０〜１５５）と比較すると（実施例７）、ヒトｂＦ
ＧＦの組換え体およびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦは内皮細
胞の成長の用量に依存する刺激を示し、これはウシの脳
のｂＦＧＦと同一である（図５）。システイン７８およ
び９６をセリンで置き換えてｇｌｕ３，５，ｓｅ
ｒ７８，９６ｈｂＦＧＦにしても、潜在的な突然変異誘
起性には影響がなく、組織から誘導されたウシのｂＦＧ
Ｆに対して決定されたものと区別できない用量−応答曲
線を与える（図６）。
【００３２】本明細書記載のようにｈｂＦＧＦへの変性
を行うと、発現される成長因子の収率が著しく増加し、
その精製が容易になり、ジスルフィド変換による微小不
均一性が除去され、安定性が増大し、同時に生物活性は
すべて保持される。
を行うと、発現される成長因子の収率が著しく増加し、
その精製が容易になり、ジスルフィド変換による微小不
均一性が除去され、安定性が増大し、同時に生物活性は
すべて保持される。
【００３３】
【実施例】下記実施例により本発明並びに使用された特
性決定の方法を例示する。これらの実施例は本発明を限
定するものではない。特記しない限りすべての割合は重
量により、処理の特定の段階における重量に基づく値で
ある。
性決定の方法を例示する。これらの実施例は本発明を限
定するものではない。特記しない限りすべての割合は重
量により、処理の特定の段階における重量に基づく値で
ある。
【００３４】実施例 １発 現プラスミドの構成ヒト ｂＦＧＦの１５５個のアミノ酸の形をコードした合
成遺伝子［ジェー・エー・アブラハム（Ｊ．Ａ．Ａｂｒ
ａｈａｍ）等、イー・エム・ビー・オー・ジャーナル
（ＢＭＢＯ Ｊ．）５巻２５２３〜２５２８頁（１９８
６年）］をｐＵＣ１８にクローニングしたものを、英国
オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）のブリティッシ・バ
イオテクノロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）社から購入した。次のようにしてｂＦＧ
Ｆ ｃＤＮＡのＮ−末端メチオニン・コドンを含む−２
〜３の位置のＮｃｏｌ制限部位の切り離しと、独特なＮ
ｄｅｌ部位の導入を行った。変えるべきヌクレオチドの
配列（−１２〜３６）（下記のａ）をＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢｓｐＭＩＩでｐＵＣ １８から削除し、そしてｐ
ＵＣ １８中に内部Ｎｄｅｌ部位を含む合成フラグメン
ト（下記のｂ）をクローニングした。このクローニング
の結果、元の構成に比べ上流の非コードイング領域に４
個のヌクレオチドの欠失を含む構成物が得られる（下記
参照）。この欠失は下記に述べる発現系を用いた場合ｂ
ＦＧＦの相対的な蛋白質の収率に影響を及ぼさない。
成遺伝子［ジェー・エー・アブラハム（Ｊ．Ａ．Ａｂｒ
ａｈａｍ）等、イー・エム・ビー・オー・ジャーナル
（ＢＭＢＯ Ｊ．）５巻２５２３〜２５２８頁（１９８
６年）］をｐＵＣ１８にクローニングしたものを、英国
オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）のブリティッシ・バ
イオテクノロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）社から購入した。次のようにしてｂＦＧ
Ｆ ｃＤＮＡのＮ−末端メチオニン・コドンを含む−２
〜３の位置のＮｃｏｌ制限部位の切り離しと、独特なＮ
ｄｅｌ部位の導入を行った。変えるべきヌクレオチドの
配列（−１２〜３６）（下記のａ）をＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢｓｐＭＩＩでｐＵＣ １８から削除し、そしてｐ
ＵＣ １８中に内部Ｎｄｅｌ部位を含む合成フラグメン
ト（下記のｂ）をクローニングした。このクローニング
の結果、元の構成に比べ上流の非コードイング領域に４
個のヌクレオチドの欠失を含む構成物が得られる（下記
参照）。この欠失は下記に述べる発現系を用いた場合ｂ
ＦＧＦの相対的な蛋白質の収率に影響を及ぼさない。
【００３５】
【化１】
【００３６】元の（ａ）断片および変性された（ｂ）断
片に対しセンス鎖だけがそれぞれ示されている。下線を
引いた部分のコドンはメチオニン開始コドンの位置を示
している。
片に対しセンス鎖だけがそれぞれ示されている。下線を
引いた部分のコドンはメチオニン開始コドンの位置を示
している。
【００３７】ｂＦＧＦをコード化したこのｃＤＮＡを次
にＮｄｅｌおよびＢａｍＨ１を用いてｐＵＣから切り出
し、ＲＮＡポリメラーゼに対するＴ７プロモーターを含
むｐＥＴ−３ａの誘導体［バクテリオファージＴ７によ
る表現プラスミド、エー・ローゼンバーグ（Ａ．Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ）等によりジーン（ｇｅｎｅ）誌５６巻１
２５〜１３５頁（１９８７年）に定義］である発現ベク
ターｐＴ７ Ｋａｎ５のＮｄｅｌおよびＢａｍＨ１部位
にクローニングする。
にＮｄｅｌおよびＢａｍＨ１を用いてｐＵＣから切り出
し、ＲＮＡポリメラーゼに対するＴ７プロモーターを含
むｐＥＴ−３ａの誘導体［バクテリオファージＴ７によ
る表現プラスミド、エー・ローゼンバーグ（Ａ．Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ）等によりジーン（ｇｅｎｅ）誌５６巻１
２５〜１３５頁（１９８７年）に定義］である発現ベク
ターｐＴ７ Ｋａｎ５のＮｄｅｌおよびＢａｍＨ１部位
にクローニングする。
【００３８】実施例 ２ ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの構築 ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの構築手順はＮｄｅｌ制限部位
の導入に関して上記に述べた手順と同じであるが、塩基
性ＦＧＦ（ｃ）の最初の５−末端アミノ酸をコード化し
た領域は酸性ＦＧＦ（ｄ）のそれをコード化するように
変化させた。
の導入に関して上記に述べた手順と同じであるが、塩基
性ＦＧＦ（ｃ）の最初の５−末端アミノ酸をコード化し
た領域は酸性ＦＧＦ（ｄ）のそれをコード化するように
変化させた。
【００３９】
【化２】
【００４０】元の（ａ）断片および変性された（ｂ）断
片に対しセンス鎖だけがそれぞれ示されている。下線を
引いた部分のコドンは３および５の位置でグルタミン酸
をコード化するように変えられている。
片に対しセンス鎖だけがそれぞれ示されている。下線を
引いた部分のコドンは３および５の位置でグルタミン酸
をコード化するように変えられている。
【００４１】実施例 ３ ｇｌｕ３，５Ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦの構築 発 現プラスミドｐＴ７ ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦをオリ
ゴヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発の鋳型として
用いた。２種の突然変異誘発性のオリゴヌクレオチド・
プライマーを位置７８および９６のシステイン・コドン
をセリン・コドンに変えるように設計する。位置９６の
セリンに対するプライマーはセンス鎖（６０量体、２３
８〜２９７）に対するものであり、これに対し位置７８
のセリンに対するプライマーはアンチセンス鎖（３０量
体、２５１〜２２２）に対するものである。これらの突
然変異誘発性のプライマーの他に、Ｔ７プロモーター
（−１２〜＋１３のヌクレオチド）および末端領域（−
７５〜−５４のヌクレオチド）に対するプライマーを設
計した。
ゴヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発の鋳型として
用いた。２種の突然変異誘発性のオリゴヌクレオチド・
プライマーを位置７８および９６のシステイン・コドン
をセリン・コドンに変えるように設計する。位置９６の
セリンに対するプライマーはセンス鎖（６０量体、２３
８〜２９７）に対するものであり、これに対し位置７８
のセリンに対するプライマーはアンチセンス鎖（３０量
体、２５１〜２２２）に対するものである。これらの突
然変異誘発性のプライマーの他に、Ｔ７プロモーター
（−１２〜＋１３のヌクレオチド）および末端領域（−
７５〜−５４のヌクレオチド）に対するプライマーを設
計した。
【００４２】変性されたＦＧＦ遺伝子の突然変異はポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行う。図１に模式
的に示すようにＨｉｎｄＩＩＩ切断プラスミドＤＮＡを
含む２種の反応混合物をつくる。（ｉ）Ｔ７のセンス＋
セリン７８のアンチセンスプライマーにより期待された
３１９塩基対生成物が得られ、（ｉｉ）Ｔ７のアンチセ
ンス＋セリン９６のセンスプライマーにより期待された
２９４塩基対生成物が得られる。ＰＣＲ混合物はメーカ
ー［米国コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌ
ｋ）パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）社］の指示に従って製造した。
ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼを用い３０回の増幅サイク
ルの間それぞれ９２℃で１分間、５０℃で５秒間、７２
℃で１分間行い、生成物を寒天のゲル電気泳動法で分析
した。
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行う。図１に模式
的に示すようにＨｉｎｄＩＩＩ切断プラスミドＤＮＡを
含む２種の反応混合物をつくる。（ｉ）Ｔ７のセンス＋
セリン７８のアンチセンスプライマーにより期待された
３１９塩基対生成物が得られ、（ｉｉ）Ｔ７のアンチセ
ンス＋セリン９６のセンスプライマーにより期待された
２９４塩基対生成物が得られる。ＰＣＲ混合物はメーカ
ー［米国コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌ
ｋ）パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）社］の指示に従って製造した。
ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼを用い３０回の増幅サイク
ルの間それぞれ９２℃で１分間、５０℃で５秒間、７２
℃で１分間行い、生成物を寒天のゲル電気泳動法で分析
した。
【００４３】過剰のプライマーを増幅されたＤＮＡフラ
グメントから連続３回濃縮し、分子量３０，０００のミ
リポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ミクロ濃縮器を用いて透
析を行って分離した。保持液の部分を一緒にし、上記の
方法でＰＣＲを用いて増幅したが、この場合使用したプ
ライマーはＴ７プロモーター（センス）およびＴ７ター
ミネーター（アンチセンス）の領域に対応している。図
１参照。５９９塩基対ＰＣＲ生成物を次にＮｄｅｌおよ
びＢａｍＩＩＩで処理し、寒天のゲル電気透析法により
精製した。精製された断片をＴ７発現ベクター、即ちｐ
ＥＴ−３ａの誘導体であるｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）にク
ローニングした。
グメントから連続３回濃縮し、分子量３０，０００のミ
リポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ミクロ濃縮器を用いて透
析を行って分離した。保持液の部分を一緒にし、上記の
方法でＰＣＲを用いて増幅したが、この場合使用したプ
ライマーはＴ７プロモーター（センス）およびＴ７ター
ミネーター（アンチセンス）の領域に対応している。図
１参照。５９９塩基対ＰＣＲ生成物を次にＮｄｅｌおよ
びＢａｍＩＩＩで処理し、寒天のゲル電気透析法により
精製した。精製された断片をＴ７発現ベクター、即ちｐ
ＥＴ−３ａの誘導体であるｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）にク
ローニングした。
【００４４】実施例 ４ 天然の配列のｈｂＦＧＦおよびｈｂＦＧＦ突然変異体の
発現 配列の確認［エフ・サンジャー（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ）等
のプロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・
オヴ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）誌７４巻５４６３〜５４６７頁（１９７７年）］
を行った後、ｂＦＧＦ突然変異体をコード化した遺伝子
の形質転換を行いコンピテント細胞ＢＬ２１ ｐＬｙｓ
Ｓにする。プラスミドを宿した大腸菌は、３７℃におい
て硫酸カナマイシン（５０ｐｇ／ｍｌ）またはプラスミ
ドｇｌｕ３．５ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦに対するア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロランフェニ
コール（３４μｇ／ｍｌ）を含むルリア（Ｌｕｒｉａ）
のブイヨン中で６００ｎｍにおいて約０．６吸収単位に
なるまで成育した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（１ミルモル）を加えてｂＦＧＦ合成を開
始させる。２時間の誘導時間後４℃で遠心分離して細胞
を回収した。
発現 配列の確認［エフ・サンジャー（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ）等
のプロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・
オヴ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）誌７４巻５４６３〜５４６７頁（１９７７年）］
を行った後、ｂＦＧＦ突然変異体をコード化した遺伝子
の形質転換を行いコンピテント細胞ＢＬ２１ ｐＬｙｓ
Ｓにする。プラスミドを宿した大腸菌は、３７℃におい
て硫酸カナマイシン（５０ｐｇ／ｍｌ）またはプラスミ
ドｇｌｕ３．５ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦに対するア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロランフェニ
コール（３４μｇ／ｍｌ）を含むルリア（Ｌｕｒｉａ）
のブイヨン中で６００ｎｍにおいて約０．６吸収単位に
なるまで成育した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（１ミルモル）を加えてｂＦＧＦ合成を開
始させる。２時間の誘導時間後４℃で遠心分離して細胞
を回収した。
【００４５】実施例 ５ ｈｂＦＧＦ突然変異体の精製 １リットルの培養液から得た細胞ペレットを５０ミルモ
ルのトリス、０．１ミルモルのＥＤＴＡ緩衝剤を含むｐ
Ｈ７．６の液３０ｍｌ中に再懸濁させ、凍結／減圧サイ
クルを迅速に３回行って溶解させる。この溶解物を次い
で５ミルモルのＭｇＣｌ２の存在下においてＤＮａｓｅ
（２０μｇ／ｍｌ）で４℃において２０分間処理し、１
０，０００×ｇにおいて２０分間遠心分離にかけ、細胞
の残渣を除去する。ｂＦＧＦの活性はペレットおよび上
澄液の中に一様に分布していることが見出された。
ルのトリス、０．１ミルモルのＥＤＴＡ緩衝剤を含むｐ
Ｈ７．６の液３０ｍｌ中に再懸濁させ、凍結／減圧サイ
クルを迅速に３回行って溶解させる。この溶解物を次い
で５ミルモルのＭｇＣｌ２の存在下においてＤＮａｓｅ
（２０μｇ／ｍｌ）で４℃において２０分間処理し、１
０，０００×ｇにおいて２０分間遠心分離にかけ、細胞
の残渣を除去する。ｂＦＧＦの活性はペレットおよび上
澄液の中に一様に分布していることが見出された。
【００４６】米国のプロシーディング・オヴ・ナチュラ
ル・アカデミー・オヴ・サイエンス誌８１巻６９６３〜
６９６７頁（１９８４年）のディー・ゴスポラドヴィッ
ツの論文記載のヘパリン−セファロース・カラム・クロ
マトグラフにより、０．６〜３．０モルの直線勾配を付
けたＮａＣｌ濃度において流出させてｂＦＧＦの精製を
行う。成長因子を含む部分を一緒にし、ｐＨ７．６のト
リス緩衝液１０ミルモルで希釈して最終ＮａＣｌ濃度を
約０．６モルにした。
ル・アカデミー・オヴ・サイエンス誌８１巻６９６３〜
６９６７頁（１９８４年）のディー・ゴスポラドヴィッ
ツの論文記載のヘパリン−セファロース・カラム・クロ
マトグラフにより、０．６〜３．０モルの直線勾配を付
けたＮａＣｌ濃度において流出させてｂＦＧＦの精製を
行う。成長因子を含む部分を一緒にし、ｐＨ７．６のト
リス緩衝液１０ミルモルで希釈して最終ＮａＣｌ濃度を
約０．６モルにした。
【００４７】これを１０ミルモルのｐＨ７．６のトリ
ス、０．６モルのＮａＣｌと平衡に保った０．７５×
７．５ｃｍのヘパリン−５ＰＷのカラム［米国フィラデ
ルフィア州フィラデルフィアのトーソーハース（Ｔｏｓ
ｏＨａａｓ）社］に充填する。結合した物質の流出は２
８０ｎｍで監視し、塩の濃度に直線的な勾配を付け（６
０分で０．６〜３．０モルＮａＣｌ）流速を０．７ｍｌ
／分として流出させた。
ス、０．６モルのＮａＣｌと平衡に保った０．７５×
７．５ｃｍのヘパリン−５ＰＷのカラム［米国フィラデ
ルフィア州フィラデルフィアのトーソーハース（Ｔｏｓ
ｏＨａａｓ）社］に充填する。結合した物質の流出は２
８０ｎｍで監視し、塩の濃度に直線的な勾配を付け（６
０分で０．６〜３．０モルＮａＣｌ）流速を０．７ｍｌ
／分として流出させた。
【００４８】実施例４記載のＴ７発現系を用い、生来の
配列をもったｈｂＦＧＦ（２〜１５５）の収率はバクテ
リア培養液１リットル当たり約０．８ｍｇであった。生
来の配列をもったｈａＦＧＦを用いると６〜８ｍｇ／リ
ットルの収率が得られた。同じ系で発現されたｇｌ
ｕ３，５ｈｂＦＧＦでは精製された成長因子は８〜１０
ｍｇ／リットルであった。
配列をもったｈｂＦＧＦ（２〜１５５）の収率はバクテ
リア培養液１リットル当たり約０．８ｍｇであった。生
来の配列をもったｈａＦＧＦを用いると６〜８ｍｇ／リ
ットルの収率が得られた。同じ系で発現されたｇｌ
ｕ３，５ｈｂＦＧＦでは精製された成長因子は８〜１０
ｍｇ／リットルであった。
【００４９】プラスミドｐＴ７ ｇｌｕ３．５，ｓｅｒ
７８．９６を含む大腸菌を大規模培養（１０リットル）
した場合、細胞ペースト１ｇ当たり約１ｍｇの精製され
た成長因子が得られる。キメラｓｅｒ７８，９６変種の
蛋白質収率およびバクテリア抽出物の上澄液とペレット
部分とにおける蛋白質の分布はｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
と同様であった。
７８．９６を含む大腸菌を大規模培養（１０リットル）
した場合、細胞ペースト１ｇ当たり約１ｍｇの精製され
た成長因子が得られる。キメラｓｅｒ７８，９６変種の
蛋白質収率およびバクテリア抽出物の上澄液とペレット
部分とにおける蛋白質の分布はｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
と同様であった。
【００５０】実施例 ６ ｈｂＦＧＦおよびｈｂＦＧＦ突然変異体の特性決定 （ａ）クロマトグラフでの挙動 ヘパリン高速液体クロマトグラフで精製したｂＦＧＦ
を、０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル勾配
（０〜２８％ＣＨ３ＣＮで１５分間、２８〜６０％で９
９分間、６０〜３０％で１０分間）を用い流速を０．７
ｍｌ／分として逆相高速液体クロマトグラフＲＰ−ＨＰ
ＬＣ［Ｃ４、米国カリフォルニア州ヘスペリア（Ｈｅｓ
ｐｅｒｉａ）ヴァィダック（Ｖｙｄａｃ）ザ・セパレー
ション・グループ（ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇ
ｒｏｕｐ）］により分析する。結合した物質の流出は２
１０ｎｍで監視する。
を、０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル勾配
（０〜２８％ＣＨ３ＣＮで１５分間、２８〜６０％で９
９分間、６０〜３０％で１０分間）を用い流速を０．７
ｍｌ／分として逆相高速液体クロマトグラフＲＰ−ＨＰ
ＬＣ［Ｃ４、米国カリフォルニア州ヘスペリア（Ｈｅｓ
ｐｅｒｉａ）ヴァィダック（Ｖｙｄａｃ）ザ・セパレー
ション・グループ（ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇ
ｒｏｕｐ）］により分析する。結合した物質の流出は２
１０ｎｍで監視する。
【００５１】生来の配列をもったｈｂＦＧＦ（２〜１５
５）を含む粗製細胞均質化物のヘパリン・セファロース
・クロマトグラフの流出グラフでは２個の主要な蛋白質
のピークがあり、その両方ともマイトジエン活性をも
ち、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によればＭｒが１
７，０００の主要蛋白質種を含んでいた。ヘパリン・セ
ファロースの段階で得られたこの二つのピークの各々か
らの材料をＣ４逆相高速液体クロマトグラフ（ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ）にかけ、次いで分割された成分のＮ−末端分析
を行った結果、少なくとも３種の異なったｂＦＧＦの形
であると同定された。
５）を含む粗製細胞均質化物のヘパリン・セファロース
・クロマトグラフの流出グラフでは２個の主要な蛋白質
のピークがあり、その両方ともマイトジエン活性をも
ち、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によればＭｒが１
７，０００の主要蛋白質種を含んでいた。ヘパリン・セ
ファロースの段階で得られたこの二つのピークの各々か
らの材料をＣ４逆相高速液体クロマトグラフ（ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ）にかけ、次いで分割された成分のＮ−末端分析
を行った結果、少なくとも３種の異なったｂＦＧＦの形
であると同定された。
【００５２】この見掛け上の微小不均一性を解析する最
初の手段として、クロマトグラフ的に異なった種の発生
に際しチオール−ジスルフィド交換（ジスルフィドのス
クランブル）の寄与を還元剤で処理することにより評価
された。ヘパリン・セファロースで精製したｂＦＧＦの
蛋白質をジチオトレイトール（２ミリモル）で１０分間
３７℃でインキュベートした後ＲＰ−ＨＰＬＣで分析す
ると、前にｂＦＧＦ主として同定されたピークが示さ
れ、クロマトグラフは実質的に単一のピークから成って
いる。
初の手段として、クロマトグラフ的に異なった種の発生
に際しチオール−ジスルフィド交換（ジスルフィドのス
クランブル）の寄与を還元剤で処理することにより評価
された。ヘパリン・セファロースで精製したｂＦＧＦの
蛋白質をジチオトレイトール（２ミリモル）で１０分間
３７℃でインキュベートした後ＲＰ−ＨＰＬＣで分析す
ると、前にｂＦＧＦ主として同定されたピークが示さ
れ、クロマトグラフは実質的に単一のピークから成って
いる。
【００５３】ヘパリン・セファロースの段階からのＦＧ
Ｆを含む２個の蛋白質ピークを高分解能ＴＳＫヘパリン
高速液体クロマトグラフにかけると、１．６〜２．３モ
ルのＮａＣｌの範囲で流出する４個の主要な蛋白質成分
が現れる（図２）。このピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析すると、Ｐ−Ｉ、Ｐ−ＩＩＩおよびＰ−ＩＶは一つの
蛋白質バンドに含まれてＭｒが１７，０００で移動し、
これはｈｂＦＧＦ（２〜１５５）と一致するが、Ｐ−１
１はＭｒが約２０，０００となり、Ｎ−末端分析法によ
り不純物であることが判る。ヘパリン・セファロース・
クロマトグラフで一緒に貯蔵しておいた物質の部分をジ
チオトレイトール（５ミリモル）で１０分間室温におい
て処理した後ヘパリン高速液体クロマトグラフにかける
と、Ｐ−Ｉの量が増え、Ｐ−ＩＩＩの量が減少し、Ｐ−
ＩＶは消失する。この処理によりＭｒ２２，０００を含
むＰ−ＩＩの位置と強度は影響を受けない（図３）。
Ｆを含む２個の蛋白質ピークを高分解能ＴＳＫヘパリン
高速液体クロマトグラフにかけると、１．６〜２．３モ
ルのＮａＣｌの範囲で流出する４個の主要な蛋白質成分
が現れる（図２）。このピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析すると、Ｐ−Ｉ、Ｐ−ＩＩＩおよびＰ−ＩＶは一つの
蛋白質バンドに含まれてＭｒが１７，０００で移動し、
これはｈｂＦＧＦ（２〜１５５）と一致するが、Ｐ−１
１はＭｒが約２０，０００となり、Ｎ−末端分析法によ
り不純物であることが判る。ヘパリン・セファロース・
クロマトグラフで一緒に貯蔵しておいた物質の部分をジ
チオトレイトール（５ミリモル）で１０分間室温におい
て処理した後ヘパリン高速液体クロマトグラフにかける
と、Ｐ−Ｉの量が増え、Ｐ−ＩＩＩの量が減少し、Ｐ−
ＩＶは消失する。この処理によりＭｒ２２，０００を含
むＰ−ＩＩの位置と強度は影響を受けない（図３）。
【００５４】ジチオトレイトールを存在させまたは存在
させない場合のヘパリンおよびＲＰ−ＨＰＬＣ上でのｇ
ｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのクロマトグラフ的挙動は、生来
の配列をもったｈｂＦＧＦと同様である。システインを
セリンに変える突然変異によってこの同族体の精製が非
常に容易になる。何故ならばこの変異体はヘパリンおよ
びＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ上で単一の種として挙動し（図
４）、精製中にジチオトレイトールによる処理を省くこ
とができるからである。
させない場合のヘパリンおよびＲＰ−ＨＰＬＣ上でのｇ
ｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのクロマトグラフ的挙動は、生来
の配列をもったｈｂＦＧＦと同様である。システインを
セリンに変える突然変異によってこの同族体の精製が非
常に容易になる。何故ならばこの変異体はヘパリンおよ
びＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ上で単一の種として挙動し（図
４）、精製中にジチオトレイトールによる処理を省くこ
とができるからである。
【００５５】（ｂ）配列分析法 逆相で精製された蛋白質のＮ−末端配列分析は４７７Ａ
型パルス液相配列解析機［米国カルフォルニア州アプラ
イド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）社］にフェニルチオヒダントイン・アミノ
酸オンライン解析機（１２０Ａ型、同社製）を取り付け
て行う。ＨＣｌで気相で加水分解（５．７モルＨＣｌ／
０．１％フェノール；１１０℃で２４時間）した後、オ
ンラインの１３０Ａ型分離系（同社製）を取り付けた４
２０Ａ型フェニルチオヒダントイン・デリヴァタイザー
を用いてアミノ酸の組成を決定する。
型パルス液相配列解析機［米国カルフォルニア州アプラ
イド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）社］にフェニルチオヒダントイン・アミノ
酸オンライン解析機（１２０Ａ型、同社製）を取り付け
て行う。ＨＣｌで気相で加水分解（５．７モルＨＣｌ／
０．１％フェノール；１１０℃で２４時間）した後、オ
ンラインの１３０Ａ型分離系（同社製）を取り付けた４
２０Ａ型フェニルチオヒダントイン・デリヴァタイザー
を用いてアミノ酸の組成を決定する。
【００５６】ヘパリンＨＰＬＣで分離された物質のＮ−
末端配列分析によればｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（２〜１
５５）に一致した単一の配列が得られ、このことはＮ−
末端メチオニンが完全に除去されていることを示してい
る。
末端配列分析によればｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（２〜１
５５）に一致した単一の配列が得られ、このことはＮ−
末端メチオニンが完全に除去されていることを示してい
る。
【００５７】（ｃ）分子量 分子量の決定は１０〜１５％の勾配を付けた２０％の均
一なポリアクリルアミド・ゲル上においてドデシル硫酸
ナトリウムの存在下で（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）銀染色検出
系［ファストゲル・システム（Ｐｈａｓｔｇｅｌ Ｓｙ
ｓｔｅｍ）／ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）／Ｌ
ＫＢ］を用いて行う。
一なポリアクリルアミド・ゲル上においてドデシル硫酸
ナトリウムの存在下で（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）銀染色検出
系［ファストゲル・システム（Ｐｈａｓｔｇｅｌ Ｓｙ
ｓｔｅｍ）／ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）／Ｌ
ＫＢ］を用いて行う。
【００５８】ｈｂＦＧＦ（２〜１５５）はＭｒ１７，０
００で移動するが、これはｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦに対
する約１９，０００のＭｒ値に匹敵する。ｈｂＦＧＦお
よびそのキメラに対しアミノ酸配列のデータから計算さ
れた分子量はそれぞれ１７，１２４および１７，２２４
であった。見掛けの分子量の不一致を解決するために、
液体二次イオン質量分析計でｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの
試料を分析し、分子イオンの質量として１７，３６５を
得た。この値は実験誤差の範囲で配列のデータから予測
された値と一致する。どのような理論にも拘束されたく
ないが、変性条件下においてポリアクリルアミド・ゲル
上におけるｇｌｕ３，５の異常な移動は位置３および５
におけるグルタミル側鎖からの蛋白質−ＳＤＳ相互作用
の干渉によると考えることが最も確からしい。
００で移動するが、これはｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦに対
する約１９，０００のＭｒ値に匹敵する。ｈｂＦＧＦお
よびそのキメラに対しアミノ酸配列のデータから計算さ
れた分子量はそれぞれ１７，１２４および１７，２２４
であった。見掛けの分子量の不一致を解決するために、
液体二次イオン質量分析計でｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの
試料を分析し、分子イオンの質量として１７，３６５を
得た。この値は実験誤差の範囲で配列のデータから予測
された値と一致する。どのような理論にも拘束されたく
ないが、変性条件下においてポリアクリルアミド・ゲル
上におけるｇｌｕ３，５の異常な移動は位置３および５
におけるグルタミル側鎖からの蛋白質−ＳＤＳ相互作用
の干渉によると考えることが最も確からしい。
【００５９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上においてｇｌ
ｕ３，５．ｓｅｒ７８，９６もＭｒ１９，０００の蛋白
質として移動し、予想されたＭｒ１７，０００の種とし
て移動するのではない。この観測はｇｌｕ３，５ｈｂＦ
ＧＦに対する異常な移動と一致している。
ｕ３，５．ｓｅｒ７８，９６もＭｒ１９，０００の蛋白
質として移動し、予想されたＭｒ１７，０００の種とし
て移動するのではない。この観測はｇｌｕ３，５ｈｂＦ
ＧＦに対する異常な移動と一致している。
【００６０】実施例 ７ 生来のｈｂＦＧＦおよび突然変異体のｈｂＦＧＦ誘導体
の生物検定 生来の配列をもったｈｂＦＧＦおよびその突然変異体の
マイトジエン特性は、エッシュ（Ｅｓｃｈ）等の米国プ
ロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ
・サイエンス誌８２巻６５０７〜６５１１頁（１９８５
年）記載の方法により大動脈弓から誘導されたウシの内
皮細胞を用いて測定する。１０％のウシの血清［ハイク
ロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、Ｕ
Ｔ］を含み、これにペニシリン（１００単位／ｍｌ）、
ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびＬ−グ
ルタミン（２ミリモル）を加えたダルベッコ（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ）の方法で変性したイーグル（Ｅａｇｌｅ）の
媒質（ＤＭＥＭ）０．５ｍｌ中において２４個の穴をも
った培養板１枚当たり初期密度０．８×１０４個の細胞
を接種する。接種後２時間して０．５％のウシの血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＭＥＭ中にｂＦＧＦを適当
に希釈した（０．００１〜１００ｎｇ／ｍｌ）試料２０
μｌを加えた。培養器に入れて５日後二重の培養板をト
リプシン処理し、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）のカウ
ンターで細胞を数えて細胞の密度を決定した。
の生物検定 生来の配列をもったｈｂＦＧＦおよびその突然変異体の
マイトジエン特性は、エッシュ（Ｅｓｃｈ）等の米国プ
ロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ
・サイエンス誌８２巻６５０７〜６５１１頁（１９８５
年）記載の方法により大動脈弓から誘導されたウシの内
皮細胞を用いて測定する。１０％のウシの血清［ハイク
ロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、Ｕ
Ｔ］を含み、これにペニシリン（１００単位／ｍｌ）、
ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびＬ−グ
ルタミン（２ミリモル）を加えたダルベッコ（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ）の方法で変性したイーグル（Ｅａｇｌｅ）の
媒質（ＤＭＥＭ）０．５ｍｌ中において２４個の穴をも
った培養板１枚当たり初期密度０．８×１０４個の細胞
を接種する。接種後２時間して０．５％のウシの血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＭＥＭ中にｂＦＧＦを適当
に希釈した（０．００１〜１００ｎｇ／ｍｌ）試料２０
μｌを加えた。培養器に入れて５日後二重の培養板をト
リプシン処理し、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）のカウ
ンターで細胞を数えて細胞の密度を決定した。
【００６１】別法として、燐酸ｐ−ニトロフェニルを基
質として用い細胞を溶解した後に酸性フォスファターゼ
の濃度を測定することにより、ｂＦＧＦが存在する場合
およびしない場合での成長曲線をつくる［ディー・ティ
ー・コンノリー（Ｄ．Ｔ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）等、アナ
リティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）誌１５２巻１３６〜１４０頁（１９８６年）
１３７頁］。１０％のウシの血清、抗生物質およびＬ−
グルタミンを含む０．２５ｍｌのＤＭＥＭ中において穴
１個当たりの細胞の初期密度１０００〜１２００で細胞
を接種する（０．３２ｃｍ２、直径０．６４ｃｍの平ら
な底の９６個の穴を備えた板を使用）。接種後０．５％
のＢＳＡを含むＤＭＥＭ中に成長因子を適当に希釈した
（０．００１〜１００ｎｇ／ｍｌ）試料１０μｌを加え
る。
質として用い細胞を溶解した後に酸性フォスファターゼ
の濃度を測定することにより、ｂＦＧＦが存在する場合
およびしない場合での成長曲線をつくる［ディー・ティ
ー・コンノリー（Ｄ．Ｔ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）等、アナ
リティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）誌１５２巻１３６〜１４０頁（１９８６年）
１３７頁］。１０％のウシの血清、抗生物質およびＬ−
グルタミンを含む０．２５ｍｌのＤＭＥＭ中において穴
１個当たりの細胞の初期密度１０００〜１２００で細胞
を接種する（０．３２ｃｍ２、直径０．６４ｃｍの平ら
な底の９６個の穴を備えた板を使用）。接種後０．５％
のＢＳＡを含むＤＭＥＭ中に成長因子を適当に希釈した
（０．００１〜１００ｎｇ／ｍｌ）試料１０μｌを加え
る。
【００６２】４〜５日培養した後、各穴を洗滌し、各穴
に０．１モルの酢酸ナトリウム、０．１％のトリトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００および１０ミリモルの燐酸
ｐ−ニトロフェニル［シグマ（Ｓｉｇｍａ１０４フォス
フォターゼ基質）］を含むｐＨ５．５の緩衝液に加え
る。板を３７℃で２時間保温し、ＩＮの水酸化ナトリウ
ム１０μｌを加えて反応を停止させ、ＵＶマックス・カ
イネティック・マイクロプレート・リーダー（ＵＶ ｍ
ａｘ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａ
ｄｅｒ）［米国カリフォルニア州モレキュラー・デヴァ
イス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ）社］を用い
て、細胞を加えないで培養した対照の緩衝液と比較して
４０５ｎｍにおける発色度を決定する。両方の方法とも
区別できない用量−応答曲線を与える。
に０．１モルの酢酸ナトリウム、０．１％のトリトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００および１０ミリモルの燐酸
ｐ−ニトロフェニル［シグマ（Ｓｉｇｍａ１０４フォス
フォターゼ基質）］を含むｐＨ５．５の緩衝液に加え
る。板を３７℃で２時間保温し、ＩＮの水酸化ナトリウ
ム１０μｌを加えて反応を停止させ、ＵＶマックス・カ
イネティック・マイクロプレート・リーダー（ＵＶ ｍ
ａｘ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａ
ｄｅｒ）［米国カリフォルニア州モレキュラー・デヴァ
イス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ）社］を用い
て、細胞を加えないで培養した対照の緩衝液と比較して
４０５ｎｍにおける発色度を決定する。両方の方法とも
区別できない用量−応答曲線を与える。
【００６３】組換えｈｂＦＧＦおよび突然変異体のマイ
トジエン性をウシの脳から最初に分離されたｂＦＧＦ
（１０〜１５５）と比較すると、ヒトの組換え体ｂＦＧ
Ｆおよびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦは内皮細胞の成長に対
し用量に依存した剌激を示し、これはウシの脳のｂＦＧ
Ｆと同じであり（図５）、最高刺激の半分の値の用量
（平均有効用量ＥＤ５０）として０．３〜１．０ｎｇ／
ｍｌ）最高刺激に対し３〜１０ｎｇ／ｍｌである。シス
テイン７８および９６をセリンと入れ換えてｇｋｕ３，
５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦをつくても潜在的なマ
イトジエン活性には影響がなく、組織から誘導された牛
のｂＦＧＦに対して決定されたものと区別できない用量
−応答曲線を与える。
トジエン性をウシの脳から最初に分離されたｂＦＧＦ
（１０〜１５５）と比較すると、ヒトの組換え体ｂＦＧ
Ｆおよびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦは内皮細胞の成長に対
し用量に依存した剌激を示し、これはウシの脳のｂＦＧ
Ｆと同じであり（図５）、最高刺激の半分の値の用量
（平均有効用量ＥＤ５０）として０．３〜１．０ｎｇ／
ｍｌ）最高刺激に対し３〜１０ｎｇ／ｍｌである。シス
テイン７８および９６をセリンと入れ換えてｇｋｕ３，
５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦをつくても潜在的なマ
イトジエン活性には影響がなく、組織から誘導された牛
のｂＦＧＦに対して決定されたものと区別できない用量
−応答曲線を与える。
【００６４】上記の説明は当業界の専門家に本発明をい
かにして実施するかを説明する目的のものであり、当業
界の専門家がこれらの説明を読んで明らかになる明白な
変形または変更のすべての詳細を示そうとしたものでは
ないことを了解されたい。しかしこのようなすべての変
形および変更は添付特許請求の範囲に定義されているよ
うに本発明の範囲内に入るものである。
かにして実施するかを説明する目的のものであり、当業
界の専門家がこれらの説明を読んで明らかになる明白な
変形または変更のすべての詳細を示そうとしたものでは
ないことを了解されたい。しかしこのようなすべての変
形および変更は添付特許請求の範囲に定義されているよ
うに本発明の範囲内に入るものである。
【００６５】ＤＮＡ配列、プラスミドおよび／または本
発明に関連して保存された微生物は米国ニューヨーク州
パール・リヴァー（Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ）のアメリ
カン・サイヤナミド・コンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）の培養基保存室に
保存されており、適切な手続きにより誰でも入手するこ
とができる。さらに下記のものが下記の日付で下記のＡ
ＴＣＣ番号が付されて米国メリーランド州ロックヴィル
（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）２０９５２、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に保
存されている。
発明に関連して保存された微生物は米国ニューヨーク州
パール・リヴァー（Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ）のアメリ
カン・サイヤナミド・コンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）の培養基保存室に
保存されており、適切な手続きにより誰でも入手するこ
とができる。さらに下記のものが下記の日付で下記のＡ
ＴＣＣ番号が付されて米国メリーランド州ロックヴィル
（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）２０９５２、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に保
存されている。
【００６６】ＢＬ２１ ｌｙｓＳ／ｐＥＴ ｇｌｕ３，
５ｓｅｒ７８，９６、１９９０年１１月１３日、ＡＴＴ
Ｃ番号６８４７８ ＢＬ２１ ｌｙｓ−Ｓ／ｐＥＴ ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆ、１９９０年１１月１３日、ＡＴＴＣ番号６８４７７ 上記の二つは本明細書記載のｇｌｕ３，５ｓｅｒ７８，
９６ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦを含んで
いる。
５ｓｅｒ７８，９６、１９９０年１１月１３日、ＡＴＴ
Ｃ番号６８４７８ ＢＬ２１ ｌｙｓ−Ｓ／ｐＥＴ ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆ、１９９０年１１月１３日、ＡＴＴＣ番号６８４７７ 上記の二つは本明細書記載のｇｌｕ３，５ｓｅｒ７８，
９６ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦを含んで
いる。
【００６７】実施例 ８ ｍＥｏ−ｐｅｇ化合物による誘導体 ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（２〜１５５）を上記方法でつ
くる。ポリエチレングリコールヨードアセテート（ｍｅ
Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ２−ＣＣＨ２Ｉ；分子量＝２０００およ
び５０００）およびヨードアセトアミド（ＭｅＯ−ＰＥ
Ｇ−ＮＨＣＤＣＨ２１；分子量＝５０００）を下記方法
でつくる。
くる。ポリエチレングリコールヨードアセテート（ｍｅ
Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ２−ＣＣＨ２Ｉ；分子量＝２０００およ
び５０００）およびヨードアセトアミド（ＭｅＯ−ＰＥ
Ｇ−ＮＨＣＤＣＨ２１；分子量＝５０００）を下記方法
でつくる。
【００６８】２ミリモルのＥＤＴＡを含むｐＨ８．６、
トリス０．１モルの緩衝液中でｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
（５ｍｇ／ｍｌ）をジチオトレイトール（５ミリモル）
で還元し、アルゴン雰囲気下において室温で１時間保温
する。ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ２−ＣＣＨ２Ｉ分子量＝２０
００または５０００）ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯＣＨ２
Ｉ（分子量＝５０００）を加えて最終濃度を２５〜５０
ミリモルにし、次いで反応混合物を燐酸で緩衝した塩水
（ＰＢＳ）に対し４℃で１２時間透析する。
トリス０．１モルの緩衝液中でｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
（５ｍｇ／ｍｌ）をジチオトレイトール（５ミリモル）
で還元し、アルゴン雰囲気下において室温で１時間保温
する。ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ２−ＣＣＨ２Ｉ分子量＝２０
００または５０００）ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯＣＨ２
Ｉ（分子量＝５０００）を加えて最終濃度を２５〜５０
ミリモルにし、次いで反応混合物を燐酸で緩衝した塩水
（ＰＢＳ）に対し４℃で１２時間透析する。
【００６９】実施例 ９ 誘導体にしたＦＧＦ ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（５ｍｇ／ｍｌ）を１．５モル
のＮａＣｌを含むｐＨ７．４のトリス緩衝液１０ミリモ
ル中においてジチオトレイトール（５ミリモル）で還元
し、アルゴン雰囲気下において室温で０．５〜１時間保
温する。ヨード酢酸（ｐＨ８．５のトリス緩衝液１モル
中に０．４モル）を加えて最終濃度を５０ミリモルに
し、反応混合物を暗所において２時間室温で保温する。
次いでこの溶液を０．５モルのＮａＣｌを含む１０ミリ
モルのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析する。
のＮａＣｌを含むｐＨ７．４のトリス緩衝液１０ミリモ
ル中においてジチオトレイトール（５ミリモル）で還元
し、アルゴン雰囲気下において室温で０．５〜１時間保
温する。ヨード酢酸（ｐＨ８．５のトリス緩衝液１モル
中に０．４モル）を加えて最終濃度を５０ミリモルに
し、反応混合物を暗所において２時間室温で保温する。
次いでこの溶液を０．５モルのＮａＣｌを含む１０ミリ
モルのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析する。
【００７０】ｂＦＧＦのポリエチレングリコール誘導体
およびカルボキシメチル化されたｂＦＧＦを前記方法で
検定した。
およびカルボキシメチル化されたｂＦＧＦを前記方法で
検定した。
【００７１】実施例１０ カルボキシメチル化されたＦＧＦ カルボキシメチル化されたｂＦＧＦ： 非変性条件下に
おいてｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（２〜１５５）をヨード
酢酸で処理すると、ｂＦＧＦの４個のシステイン残基の
２個にカルボキシメチル化が起こる。変性されたシステ
インの位置は１４Ｃでラベルしたカルボキシメチル化さ
れたｂＦＧＦのエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ蒸解物
のペプチド・マッピングによりシステイン７８および９
６と同定される。システイン７８および９６を変性して
もヘパリンに対するｂＦＧＦの親和性には影響がない。
ｇｌｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦＧＦのマイト
ジエン活性およびレセプター結合特性はｇｌｕ３，５ｈ
ｂＦＧＦと同じである（図１）が、完全にカルボキシメ
チル化されたｂＦＧＦは活性をもっているようには見え
ない。変性されていないｂＦＧＦとは対照的にｇｌ
ｕ３，５ｈｂＦＧＦはｐ４における半減期が約５分であ
るのに対し、ｇｌｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦ
ＧＦでは６０分より長い（図２参照）。
おいてｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（２〜１５５）をヨード
酢酸で処理すると、ｂＦＧＦの４個のシステイン残基の
２個にカルボキシメチル化が起こる。変性されたシステ
インの位置は１４Ｃでラベルしたカルボキシメチル化さ
れたｂＦＧＦのエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ蒸解物
のペプチド・マッピングによりシステイン７８および９
６と同定される。システイン７８および９６を変性して
もヘパリンに対するｂＦＧＦの親和性には影響がない。
ｇｌｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦＧＦのマイト
ジエン活性およびレセプター結合特性はｇｌｕ３，５ｈ
ｂＦＧＦと同じである（図１）が、完全にカルボキシメ
チル化されたｂＦＧＦは活性をもっているようには見え
ない。変性されていないｂＦＧＦとは対照的にｇｌ
ｕ３，５ｈｂＦＧＦはｐ４における半減期が約５分であ
るのに対し、ｇｌｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦ
ＧＦでは６０分より長い（図２参照）。
【００７２】ｂＦＧＦのポリエチレングリコールエステ
ル： ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのＰＥＧ−２０００およ
び−５０００の誘導体はウシの内皮細胞のマイトジエン
試験では完全に活性があり（図３）、ヘパリンに結合す
る。ＰＥＧのエステル誘導体は加水分解してカルボキシ
メチル化されたｂＦＧＦ、即ち安定化された十分な活性
をもつ同族体になり、これはドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミド・ゲル上において１８Ｋｄ蛋白質
（ｇｌｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦＧＦ）の出
現によって監視することができる。
ル： ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのＰＥＧ−２０００およ
び−５０００の誘導体はウシの内皮細胞のマイトジエン
試験では完全に活性があり（図３）、ヘパリンに結合す
る。ＰＥＧのエステル誘導体は加水分解してカルボキシ
メチル化されたｂＦＧＦ、即ち安定化された十分な活性
をもつ同族体になり、これはドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミド・ゲル上において１８Ｋｄ蛋白質
（ｇｌｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦＧＦ）の出
現によって監視することができる。
【００７３】ｂＦＧＦのポリエチレングリコールアミ
ド： ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのＰＥＧ−５０００誘導
体はＰＥＧエステルとは対照的に安定である。これはＢ
ａｌｂＣ ３Ｔ３繊維芽細胞の分裂促進検定において完
全に活性であり、ＦＧＦレセプター結合検定試験におい
ては変性されていないｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦと同程度
に効果的に競合する。
ド： ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのＰＥＧ−５０００誘導
体はＰＥＧエステルとは対照的に安定である。これはＢ
ａｌｂＣ ３Ｔ３繊維芽細胞の分裂促進検定において完
全に活性であり、ＦＧＦレセプター結合検定試験におい
ては変性されていないｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦと同程度
に効果的に競合する。
【００７４】参考文献 １．アブラハム，ジェー・エー等、イー・エム・ビー・
オー・ジャーナル誌５巻２５２３〜２５２８頁（１９８
６年）． ２．アラカワ，ティー（Ａｒａｋａｗａ，Ｔ）およびフ
ォックス，ジー・エム（Ｆｏｘ，Ｇ．Ｍ．）、ヨーロッ
パ特許明細書第３２０，１４８号（１９８９年）． ３．バー，ピー・ジェー（Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ，）等、バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）
誌２６３巻１６４７１〜１６４７８頁（１９８８年）． ４．バーゴンゾニ，エル（Ｂｅｒｇｏｎｚｏｎｉ，Ｌ）
等、ヨーロッパ特許明細書第３６３，６７５号（１９８
９年）． ５．バージェス，ダヴリュー・エイチおよびマシアグ，
ティー、アニュアル・レヴィユー・オヴ・バイオケミス
トリー誌８巻５７５〜６０６頁（１９８９年） ６．コンノリ，ディー・ティー等、アナリティカル・バ
イオケミストリー誌１５２巻１３６〜１４０頁（１９８
６年）． ７．ダヴィドソン，ジェー・エム等、ジャーナル・オヴ
・セル・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．）１０
０巻１２１９〜１２２７頁（１９８５年）． ８．エッシュ，エフ等、プロシーディング・オヴ・ナチ
ュラル・アカデミー・オヴ・サイエンス（米国）誌８２
巻６５０７〜６５１１頁（１９８５年）． ９．エッシュ，エフ等、ヨーロッパ特許明細書第２２
８，４４９号（１９８６年）． １０．フィヅ，ジェー・シー（Ｆｉｄｄｅｓ，Ｊ．
Ｃ．）等、ヨーロッパ特許明細書２９８，７２３号（１
９８９年）． １１．フランコ，ダヴリュー・ピー（Ｆｒａｎｃｏ，
Ｗ．Ｐ．）、米国特許第４，２９６，１００号（１９８
１年）． １２．フランコ，ダヴリュー・ピー、米国特許第４，３
７８，３４７号（１９８３年）． １３．ゴスポダロヴィッツ，ディー、ネイチャー誌２４
９号１２３〜１２７頁（１９７４年）． １４．ゴスポダロヴィッツ，ディー、Ｎａｔ．Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔｉ．Ｍｏｎ．誌４８巻１０９〜１３０頁
（１９７８年）． １５．ゴスポダロヴィッツ，ディー、プロシーディング
・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ・サイエンス
（米国）誌８１巻６９６３〜６９６７頁（１９８４
年）． １６．ゴスポダロヴィッツ，ディー、米国特許第４，７
８５，０７９号（１９８８年）． １７．ゴスポダロヴィッツ，ディー、米国特許第４，９
０２，７８２号（１９９０年）． １８．イワネ，エム（Ｉｗａｎｅ，Ｍ）等、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．誌１４
６巻４７０〜４７７頁（１９７７年）． １９．ローゼンバーグ，エー等、ジーン誌５６巻１２５
〜１３５頁（１９８７年）． ２０．サンジャー，エフ（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）等、プ
ロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ
・サイエンス（米国）誌７４巻５４６３〜５４６７頁
（１９７７年）． ２１．セノ，エム（Ｓｅｎｏ，Ｍ）等、ヨーロッパ特許
明細書２８１，８２２号（１９８８年）． ２２．セノ，エム等、ヨーロッパ特許明細書３２６，９
０７号（１９８９年）． ２３．スクァイヤーズ，シー・エイチ（Ｓｑｕｉｒｅ
ｓ，Ｃ．Ｈ．）等、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル
・ケミストリー誌２６３巻１６２９７〜１６３０２頁
（１９８８年）． ２４．トーマス ジュニア，ケー・エー（Ｔｏｍａｓ
Ｊｎｒ，Ｋ．Ａ．）およびラインメイヤー，ディー・エ
ル（Ｌｉｎｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．）、ヨーロッパ特許明
細書第３１９，０５２号（１９８９年）． ２５．ウォリック，ピー（Ｗａｌｉｃｋｅ，Ｐ．）等、
プロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オ
ヴ・サイエンス（米国）誌８３巻３０１２〜３０１６頁
（１９８６年）． 配列のリスト （１）一般的事項 （ｉ）出願人： アンドリュー・ピー・セドン（Ａｎｄ
ｒｅｗ Ｐ．Ｓｅｄｄｏｎ）、ピーター・ボーレン（Ｐ
ｅｔｅｒ Ｂｏｈｌｅｎ）およびヤコヴ・グルツマン
（Ｙａｋｏｖ Ｇｌｕｚｍａｎ） （ｉｉ）発明の名称： キメラ繊維芽細胞成長因子 （ｉｉｉ）配列の数： ２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛先人： エステル・ジェー・チェヴドス（Ｅｓ
ｔｅｌｌｅ Ｊ．Ｔｓｅｖｄｏｓ）博士、アメリカン・
サイヤナミド・コンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａ
ｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ） （Ｂ）町名： ウエスト・メイン・ストリート（Ｗｅｓ
ｔ Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ）１９３７番地、Ｐ．Ｏ．
ボックス（Ｂｏｘ）６０ （Ｃ）市名： スタンフォード（Ｓｔａｎｆｏｒｄ） （Ｄ）州名： コネチカット （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ： ０６９０４−００６０ （ｖ）計算機可読形態： （Ａ）媒体の種類： フロッピー・ディスク （Ｂ）計算機： ＩＢＭ ＰＣ ＡＴ （Ｃ）オペレーティング・システム： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェアー： ＩＢＭのディスプレイライト
（Ｄｉｓｐｌａｙｗｒｉｔｅ）４から変換されたＡＳＣ
ＩＩ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日付： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）以前の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日付： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人の情報 （Ａ）氏名： チェヴドス，エステル・ジェー、博士 （Ｂ）登録番号： ３１，１４５ （Ｃ）参考文書／明細書番号： ３１，２１９−０１ （ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話番号： ２０３ ３２１ ２７５６ （Ｂ）ＦＡＸ番号： ２０３ ３２１ ２９７１ （Ｃ）テレックス番号： ７１０ ４７０ ４０５９ （２）配列に対する情報： 識別番号１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ： ４５６塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： ＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル： （ｉｖ）アンチセンス： （ｖ）フラグメント型： （ｖｉ）起源： （Ａ）生物： （Ｂ）株： （Ｃ）個体の単離物： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ： （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類： （Ｈ）セルライン： （Ｉ）オルガネラ： （ｖｉｉ）直接の起源 （Ａ）ライブラリー： （Ｂ）クローン： （ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置 （Ａ）染色体／セグメント （Ｂ）マップの位置 （Ｃ）単位 （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー （Ｂ）位置 （Ｃ）同定方法 （Ｄ）その他の情報 （ｘ）出版情報 （Ａ）著者 （Ｂ）標題 （Ｃ）雑誌 （Ｄ）巻 （Ｅ）号 （Ｆ）頁 （Ｇ）日付 （Ｈ）文書番号 （Ｉ）受理の日付 （Ｊ）出版の日付 （Ｋ）関連事項： （ｘｉ）配列の記述： 配列番号１
オー・ジャーナル誌５巻２５２３〜２５２８頁（１９８
６年）． ２．アラカワ，ティー（Ａｒａｋａｗａ，Ｔ）およびフ
ォックス，ジー・エム（Ｆｏｘ，Ｇ．Ｍ．）、ヨーロッ
パ特許明細書第３２０，１４８号（１９８９年）． ３．バー，ピー・ジェー（Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ，）等、バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）
誌２６３巻１６４７１〜１６４７８頁（１９８８年）． ４．バーゴンゾニ，エル（Ｂｅｒｇｏｎｚｏｎｉ，Ｌ）
等、ヨーロッパ特許明細書第３６３，６７５号（１９８
９年）． ５．バージェス，ダヴリュー・エイチおよびマシアグ，
ティー、アニュアル・レヴィユー・オヴ・バイオケミス
トリー誌８巻５７５〜６０６頁（１９８９年） ６．コンノリ，ディー・ティー等、アナリティカル・バ
イオケミストリー誌１５２巻１３６〜１４０頁（１９８
６年）． ７．ダヴィドソン，ジェー・エム等、ジャーナル・オヴ
・セル・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．）１０
０巻１２１９〜１２２７頁（１９８５年）． ８．エッシュ，エフ等、プロシーディング・オヴ・ナチ
ュラル・アカデミー・オヴ・サイエンス（米国）誌８２
巻６５０７〜６５１１頁（１９８５年）． ９．エッシュ，エフ等、ヨーロッパ特許明細書第２２
８，４４９号（１９８６年）． １０．フィヅ，ジェー・シー（Ｆｉｄｄｅｓ，Ｊ．
Ｃ．）等、ヨーロッパ特許明細書２９８，７２３号（１
９８９年）． １１．フランコ，ダヴリュー・ピー（Ｆｒａｎｃｏ，
Ｗ．Ｐ．）、米国特許第４，２９６，１００号（１９８
１年）． １２．フランコ，ダヴリュー・ピー、米国特許第４，３
７８，３４７号（１９８３年）． １３．ゴスポダロヴィッツ，ディー、ネイチャー誌２４
９号１２３〜１２７頁（１９７４年）． １４．ゴスポダロヴィッツ，ディー、Ｎａｔ．Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔｉ．Ｍｏｎ．誌４８巻１０９〜１３０頁
（１９７８年）． １５．ゴスポダロヴィッツ，ディー、プロシーディング
・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ・サイエンス
（米国）誌８１巻６９６３〜６９６７頁（１９８４
年）． １６．ゴスポダロヴィッツ，ディー、米国特許第４，７
８５，０７９号（１９８８年）． １７．ゴスポダロヴィッツ，ディー、米国特許第４，９
０２，７８２号（１９９０年）． １８．イワネ，エム（Ｉｗａｎｅ，Ｍ）等、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．誌１４
６巻４７０〜４７７頁（１９７７年）． １９．ローゼンバーグ，エー等、ジーン誌５６巻１２５
〜１３５頁（１９８７年）． ２０．サンジャー，エフ（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）等、プ
ロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ
・サイエンス（米国）誌７４巻５４６３〜５４６７頁
（１９７７年）． ２１．セノ，エム（Ｓｅｎｏ，Ｍ）等、ヨーロッパ特許
明細書２８１，８２２号（１９８８年）． ２２．セノ，エム等、ヨーロッパ特許明細書３２６，９
０７号（１９８９年）． ２３．スクァイヤーズ，シー・エイチ（Ｓｑｕｉｒｅ
ｓ，Ｃ．Ｈ．）等、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル
・ケミストリー誌２６３巻１６２９７〜１６３０２頁
（１９８８年）． ２４．トーマス ジュニア，ケー・エー（Ｔｏｍａｓ
Ｊｎｒ，Ｋ．Ａ．）およびラインメイヤー，ディー・エ
ル（Ｌｉｎｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．）、ヨーロッパ特許明
細書第３１９，０５２号（１９８９年）． ２５．ウォリック，ピー（Ｗａｌｉｃｋｅ，Ｐ．）等、
プロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オ
ヴ・サイエンス（米国）誌８３巻３０１２〜３０１６頁
（１９８６年）． 配列のリスト （１）一般的事項 （ｉ）出願人： アンドリュー・ピー・セドン（Ａｎｄ
ｒｅｗ Ｐ．Ｓｅｄｄｏｎ）、ピーター・ボーレン（Ｐ
ｅｔｅｒ Ｂｏｈｌｅｎ）およびヤコヴ・グルツマン
（Ｙａｋｏｖ Ｇｌｕｚｍａｎ） （ｉｉ）発明の名称： キメラ繊維芽細胞成長因子 （ｉｉｉ）配列の数： ２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛先人： エステル・ジェー・チェヴドス（Ｅｓ
ｔｅｌｌｅ Ｊ．Ｔｓｅｖｄｏｓ）博士、アメリカン・
サイヤナミド・コンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａ
ｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ） （Ｂ）町名： ウエスト・メイン・ストリート（Ｗｅｓ
ｔ Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ）１９３７番地、Ｐ．Ｏ．
ボックス（Ｂｏｘ）６０ （Ｃ）市名： スタンフォード（Ｓｔａｎｆｏｒｄ） （Ｄ）州名： コネチカット （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ： ０６９０４−００６０ （ｖ）計算機可読形態： （Ａ）媒体の種類： フロッピー・ディスク （Ｂ）計算機： ＩＢＭ ＰＣ ＡＴ （Ｃ）オペレーティング・システム： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェアー： ＩＢＭのディスプレイライト
（Ｄｉｓｐｌａｙｗｒｉｔｅ）４から変換されたＡＳＣ
ＩＩ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日付： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）以前の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日付： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人の情報 （Ａ）氏名： チェヴドス，エステル・ジェー、博士 （Ｂ）登録番号： ３１，１４５ （Ｃ）参考文書／明細書番号： ３１，２１９−０１ （ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話番号： ２０３ ３２１ ２７５６ （Ｂ）ＦＡＸ番号： ２０３ ３２１ ２９７１ （Ｃ）テレックス番号： ７１０ ４７０ ４０５９ （２）配列に対する情報： 識別番号１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ： ４５６塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： ＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル： （ｉｖ）アンチセンス： （ｖ）フラグメント型： （ｖｉ）起源： （Ａ）生物： （Ｂ）株： （Ｃ）個体の単離物： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ： （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類： （Ｈ）セルライン： （Ｉ）オルガネラ： （ｖｉｉ）直接の起源 （Ａ）ライブラリー： （Ｂ）クローン： （ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置 （Ａ）染色体／セグメント （Ｂ）マップの位置 （Ｃ）単位 （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー （Ｂ）位置 （Ｃ）同定方法 （Ｄ）その他の情報 （ｘ）出版情報 （Ａ）著者 （Ｂ）標題 （Ｃ）雑誌 （Ｄ）巻 （Ｅ）号 （Ｆ）頁 （Ｇ）日付 （Ｈ）文書番号 （Ｉ）受理の日付 （Ｊ）出版の日付 （Ｋ）関連事項： （ｘｉ）配列の記述： 配列番号１
【００７５】
【化３】
【００７６】
【化４】
【００７７】（２）配列に対する情報： 識別番号２ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ： ４５６塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： ＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル： （ｉｖ）アンチセンス： （ｖ）フラグメント型： （ｖｉ）起源： （Ａ）生物： （Ｂ）株： （Ｃ）個体・単離クローン： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ： （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類： （Ｈ）セルライン： （Ｉ）オルガネラ： （ｖｉｉ）直接の起源 （Ａ）ライブラリー： （Ｂ）クローン： （ｖｉｉｉ）ゲノムにおける位置 （Ａ）染色体／セグメント （Ｂ）マップの位置 （Ｃ）単位 （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー （Ｂ）位置 （Ｃ）同定方法 （Ｄ）その他の情報 （ｘ）出版情報 （Ａ）著者 （Ｂ）標題 （Ｃ）雑誌 （Ｄ）巻 （Ｅ）号 （Ｆ）頁 （Ｇ）日付 （Ｈ）文書番号 （Ｉ）受理の日付 （Ｊ）出版の日付 （Ｋ）関連事項： （ｘｉ）配列の記述： 配列番号２
【００７８】
【化５】
【００７９】
【化６】 本発明の主な特徴及び態様は次の通りである 。 １．（ａ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３のア
ラニンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換え
られている塩基性繊維芽細胞成長因子、 （ｂ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニ
ンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えら
れ、位置７８および９６のシステインがジスルフィドの
スクランブルを除去するアミノ酸で置き換えられている
塩基性繊維芽細胞成長因子、および （ｃ）（ａ）および（ｂ）のＮ−末端メチオニンをもた
ない切断された形から成る群から選ばれる塩基性繊維芽
細胞成長因子。 ２．該塩基性繊維芽細胞成長因子が組み換えられたもの
である上記第１項記載の塩基性繊維芽細胞成長因子。 ３．位置７８および９６のシステインがセリン、リジ
ン、アスパルチン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グ
ルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、ヴァ
リン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、スレ
オニン、プロリン、アラニン、グリシン、アルギニン、
またはトリプトファンで置き換えられている上記第２項
記載の組み換えられた塩基性繊維芽細胞成長因子。 ４．位置７８および９６のシステインがセリンで置き換
えられている上記第３項記載の組み換えられた塩基性繊
維芽細胞成長因子。 ５．ｇｌｕ 3 , 5 ｈｂＦＧＦから成る上記第２項記載の組
み換えられた塩基性繊維芽細胞成長因子。 ６．ｇｌｕ 3 , 5 ，ｓｅｒ 78 , 96 から成る上記第２項記載の
組み換えられた塩基性繊維芽細胞成長因子。 ７．上記第２項記載の成長因子をコード化したＤＮＡ配
列から成る生物学的な機能をもった環状プラスミドまた
はウィルスＤＮＡベクター。 ８．ｐＥＴ−３ａ誘導体から成る上記第７項記載のベク
ター。 ９．ＲＮＡポリメラーゼからのＴ７を含むｐＴ７ Ｋａ
ｎ ５およびｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）から成る群から選
ばれる上記第８項記載のベクター。 １０．宿主細胞が該成長因子を表現できる方法で上記第
７項記載のベクターで形質転換またはトランスフェクシ
ョンされた原核細胞または真核細胞。 １１．大腸菌から成る上記第１０項記載の細胞。 １２．（ａ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３の
アラニンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換
えられている組み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成長
因子をコードしているＤＮＡ配列、 （ｂ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニ
ンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えら
れ、位置７８および９６のシステインがジスルフィドの
スクランブルを除去するアミノ酸で置き換えられている
組み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成長因子をコード
しているＤＮＡ配列、および （ｃ）厳密な条件下でハイブリッド形成され（ａ）また
は（ｂ）記載のＤＮＡになるＤＮＡから成る群から選ば
れるＤＮＡ配列。 １３．上記第１２項記載のＤＮＡ配列から成る生物学的
な機能をもった円形プ ラスミドまたはウィルスＤＮＡベ
クター。 １４．該ベクターがＲＮＡポリメラーゼに対するＴ７プ
ロモーターを含むｐＴ７ Ｋａｎ ５およびｐＥＴ−３
ａ（ｍ１３）から成る群から選ばれるｐＥＴ−３ａであ
る上記第１３項記載のベクター。 １５．宿主細胞が該成長因子を表現できる方法で上記第
１２項記載のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェ
クションされた原核細胞または真核細胞。 １６．大腸菌の細胞が繊維芽細胞成長因子を表現できる
方法で上記第１３項記載のベクターの中にコード化され
たＤＮＡで形質転換された大腸菌。 １７．位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタ
ミン酸で置き換えられている１５４個（マイナス１個の
メチオニン）または１５５個のアミノ酸を有する組み換
えられた人の塩基性繊維芽細胞成長因子。 １８．位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタ
ミン酸で置き換えられ、位置７８および９６のシステイ
ンがセリン、リジン、アスパルチン酸、グルタミン酸、
アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシ
ン、ロイシン、ヴァリン、フェニルアラニン、チロシ
ン、メチオニン、スレオニン、プロリン、アラニン、グ
リシン、アルギニン、またはトリプトファンで置き換え
られている組み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成長因
子。 １９．位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタ
ミン酸で置き換えられ、位置７８および９６のシステイ
ンがセリンで置き換えられている１５４または１５５個
のアミノ酸をもった組み換えられた人の塩基性繊維芽細
胞成長因子。 ２０．上記第２項記載のＦＧＦをコードしている生成さ
れ分離されたＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェ
クションされた宿主細胞を該宿主細胞が成長因子を表現
するのに十分な時間の間培養媒質中で増殖させ、該培養
媒質、該宿主細胞の溶解物および該宿主細胞の膜残渣か
ら成る群から選ばれる材料から成長因子を回収する組み
換えられた人の繊維芽細胞成長因子を製造する方法。 ２１．該宿主細胞が大腸菌である上記第２０項記載の方
法。 ２２．該ＦＧＦはｇｌｕ 3 , 5 ｈｂＦＧＦおよびｇｌ
ｕ 3 , 5 ，ｓｅｒ 78 , 96 ｈｂＦＧＦから成る群から選ばれる
上記第２１項記載の方法。 ２３．宿主細胞がＤＮＡでコード化されたポリペプチド
を表現できる方法で上 記第２項記載のＦＧＦに対しコー
ド化を行うＤＮＡ配列で原核細胞または真核細胞の形質
転換またはトランスフェクションを行う組み換えられた
人の塩基性繊維芽細胞成長因子を表現し得る原核細胞ま
たは真核細胞を製造する方法。 ２４．該細胞が大腸菌である上記第２３項記載の方法。 ２５．該ＦＧＦはｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ
3 , 5 ，ｓｅｒ 78 , 96 ｈｂＦＧＦから成る群から選ばれる上
記第２４項記載の方法。 ２６．４個のシステインの少なくとも２個は（ＣＨ 2 Ｃ
ＯＯＨ）；［ＣＨ（ＣＯ 2 Ｈ）（ＣＨ 2 ） x ＣＯ 2 Ｈ］、
（ＣＨ 2 ＣＯＮＲ 3 Ｒ 4 ）、（Ｒ 5 ）、［（ＣＨ 2 ） n Ｓ
Ｏ 3 ］、（ＣＨＣＨ 2 ＣＯＮＲ 3 ＣＯ［（ＣＨ 2 ） m ＮＲ 3 Ｒ
4 ］、（ＣＨ 2 ＯＣＯＣＨ 2 Ｒ 5 ）または（ＳＲ 6 ）、但し
式中Ｒ 3 およびＲ 4 はそれぞれＨ、［（ＣＨ 2 ） x ＣＯ
2 Ｈ］、［（ＣＨ（ＣＯ 2 Ｈ）（ＣＨ 2 ） x ＣＯ 2 Ｈ］、随
時ヒドロキシル置換基を０〜２個有するＣ 1 〜Ｃ 6 のアル
キルまたはポリエチレングリコールであり；Ｒ 5 はＣ１
〜Ｃ 6 のアルキル、Ｃ 1 〜Ｃ 4 のアルコキシメチルであ
り、Ｒ 6 はＣ 1 〜Ｃ 6 のアルキル、ポリエチレングリコー
ルまたは随時１または２個のカルボン酸または硫酸基を
置換したフェニル基であり；ｎはお〜４の整数、ｍは２
〜４の整数であり、ｘは１〜３の整数である、から成る
群から選ばれる置換基で修飾されている上記第２項記載
の塩基性繊維芽細胞成長因子。 ２７．該塩基性繊維芽細胞成長因子はカルボメトキシ化
された繊維芽細胞成長因子である上記第２６項記載の塩
基性繊維芽細胞成長因子。 ２８．該繊維芽細胞成長因子はｇｌｕ 3 , 5 ｈｂＦＧＦで
ある上記第２７項記載の塩基性繊維芽細胞成長因子。
ラニンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換え
られている塩基性繊維芽細胞成長因子、 （ｂ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニ
ンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えら
れ、位置７８および９６のシステインがジスルフィドの
スクランブルを除去するアミノ酸で置き換えられている
塩基性繊維芽細胞成長因子、および （ｃ）（ａ）および（ｂ）のＮ−末端メチオニンをもた
ない切断された形から成る群から選ばれる塩基性繊維芽
細胞成長因子。 ２．該塩基性繊維芽細胞成長因子が組み換えられたもの
である上記第１項記載の塩基性繊維芽細胞成長因子。 ３．位置７８および９６のシステインがセリン、リジ
ン、アスパルチン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グ
ルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、ヴァ
リン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、スレ
オニン、プロリン、アラニン、グリシン、アルギニン、
またはトリプトファンで置き換えられている上記第２項
記載の組み換えられた塩基性繊維芽細胞成長因子。 ４．位置７８および９６のシステインがセリンで置き換
えられている上記第３項記載の組み換えられた塩基性繊
維芽細胞成長因子。 ５．ｇｌｕ 3 , 5 ｈｂＦＧＦから成る上記第２項記載の組
み換えられた塩基性繊維芽細胞成長因子。 ６．ｇｌｕ 3 , 5 ，ｓｅｒ 78 , 96 から成る上記第２項記載の
組み換えられた塩基性繊維芽細胞成長因子。 ７．上記第２項記載の成長因子をコード化したＤＮＡ配
列から成る生物学的な機能をもった環状プラスミドまた
はウィルスＤＮＡベクター。 ８．ｐＥＴ−３ａ誘導体から成る上記第７項記載のベク
ター。 ９．ＲＮＡポリメラーゼからのＴ７を含むｐＴ７ Ｋａ
ｎ ５およびｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）から成る群から選
ばれる上記第８項記載のベクター。 １０．宿主細胞が該成長因子を表現できる方法で上記第
７項記載のベクターで形質転換またはトランスフェクシ
ョンされた原核細胞または真核細胞。 １１．大腸菌から成る上記第１０項記載の細胞。 １２．（ａ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３の
アラニンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換
えられている組み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成長
因子をコードしているＤＮＡ配列、 （ｂ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニ
ンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えら
れ、位置７８および９６のシステインがジスルフィドの
スクランブルを除去するアミノ酸で置き換えられている
組み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成長因子をコード
しているＤＮＡ配列、および （ｃ）厳密な条件下でハイブリッド形成され（ａ）また
は（ｂ）記載のＤＮＡになるＤＮＡから成る群から選ば
れるＤＮＡ配列。 １３．上記第１２項記載のＤＮＡ配列から成る生物学的
な機能をもった円形プ ラスミドまたはウィルスＤＮＡベ
クター。 １４．該ベクターがＲＮＡポリメラーゼに対するＴ７プ
ロモーターを含むｐＴ７ Ｋａｎ ５およびｐＥＴ−３
ａ（ｍ１３）から成る群から選ばれるｐＥＴ−３ａであ
る上記第１３項記載のベクター。 １５．宿主細胞が該成長因子を表現できる方法で上記第
１２項記載のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェ
クションされた原核細胞または真核細胞。 １６．大腸菌の細胞が繊維芽細胞成長因子を表現できる
方法で上記第１３項記載のベクターの中にコード化され
たＤＮＡで形質転換された大腸菌。 １７．位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタ
ミン酸で置き換えられている１５４個（マイナス１個の
メチオニン）または１５５個のアミノ酸を有する組み換
えられた人の塩基性繊維芽細胞成長因子。 １８．位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタ
ミン酸で置き換えられ、位置７８および９６のシステイ
ンがセリン、リジン、アスパルチン酸、グルタミン酸、
アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシ
ン、ロイシン、ヴァリン、フェニルアラニン、チロシ
ン、メチオニン、スレオニン、プロリン、アラニン、グ
リシン、アルギニン、またはトリプトファンで置き換え
られている組み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成長因
子。 １９．位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタ
ミン酸で置き換えられ、位置７８および９６のシステイ
ンがセリンで置き換えられている１５４または１５５個
のアミノ酸をもった組み換えられた人の塩基性繊維芽細
胞成長因子。 ２０．上記第２項記載のＦＧＦをコードしている生成さ
れ分離されたＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェ
クションされた宿主細胞を該宿主細胞が成長因子を表現
するのに十分な時間の間培養媒質中で増殖させ、該培養
媒質、該宿主細胞の溶解物および該宿主細胞の膜残渣か
ら成る群から選ばれる材料から成長因子を回収する組み
換えられた人の繊維芽細胞成長因子を製造する方法。 ２１．該宿主細胞が大腸菌である上記第２０項記載の方
法。 ２２．該ＦＧＦはｇｌｕ 3 , 5 ｈｂＦＧＦおよびｇｌ
ｕ 3 , 5 ，ｓｅｒ 78 , 96 ｈｂＦＧＦから成る群から選ばれる
上記第２１項記載の方法。 ２３．宿主細胞がＤＮＡでコード化されたポリペプチド
を表現できる方法で上 記第２項記載のＦＧＦに対しコー
ド化を行うＤＮＡ配列で原核細胞または真核細胞の形質
転換またはトランスフェクションを行う組み換えられた
人の塩基性繊維芽細胞成長因子を表現し得る原核細胞ま
たは真核細胞を製造する方法。 ２４．該細胞が大腸菌である上記第２３項記載の方法。 ２５．該ＦＧＦはｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ
3 , 5 ，ｓｅｒ 78 , 96 ｈｂＦＧＦから成る群から選ばれる上
記第２４項記載の方法。 ２６．４個のシステインの少なくとも２個は（ＣＨ 2 Ｃ
ＯＯＨ）；［ＣＨ（ＣＯ 2 Ｈ）（ＣＨ 2 ） x ＣＯ 2 Ｈ］、
（ＣＨ 2 ＣＯＮＲ 3 Ｒ 4 ）、（Ｒ 5 ）、［（ＣＨ 2 ） n Ｓ
Ｏ 3 ］、（ＣＨＣＨ 2 ＣＯＮＲ 3 ＣＯ［（ＣＨ 2 ） m ＮＲ 3 Ｒ
4 ］、（ＣＨ 2 ＯＣＯＣＨ 2 Ｒ 5 ）または（ＳＲ 6 ）、但し
式中Ｒ 3 およびＲ 4 はそれぞれＨ、［（ＣＨ 2 ） x ＣＯ
2 Ｈ］、［（ＣＨ（ＣＯ 2 Ｈ）（ＣＨ 2 ） x ＣＯ 2 Ｈ］、随
時ヒドロキシル置換基を０〜２個有するＣ 1 〜Ｃ 6 のアル
キルまたはポリエチレングリコールであり；Ｒ 5 はＣ１
〜Ｃ 6 のアルキル、Ｃ 1 〜Ｃ 4 のアルコキシメチルであ
り、Ｒ 6 はＣ 1 〜Ｃ 6 のアルキル、ポリエチレングリコー
ルまたは随時１または２個のカルボン酸または硫酸基を
置換したフェニル基であり；ｎはお〜４の整数、ｍは２
〜４の整数であり、ｘは１〜３の整数である、から成る
群から選ばれる置換基で修飾されている上記第２項記載
の塩基性繊維芽細胞成長因子。 ２７．該塩基性繊維芽細胞成長因子はカルボメトキシ化
された繊維芽細胞成長因子である上記第２６項記載の塩
基性繊維芽細胞成長因子。 ２８．該繊維芽細胞成長因子はｇｌｕ 3 , 5 ｈｂＦＧＦで
ある上記第２７項記載の塩基性繊維芽細胞成長因子。
【図１】図１はｇｌｕ３，５，Ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦ
ＧＦ ｃＤＮＡの構成を示す。実施例２で作成された発
現プラスミドｐＴ７ ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦを鋳型と
し使用し、下記のポリメラーゼ連鎖反応混合物を用いｃ
ｙｓ７８をｓｅｒ７８に、ｃｙｓ９６をｓｅｒ９６に変
異させた。（１）Ｔ７のセンスプライマー＋ｓｅｒ７８
アンチセンスプライマー；および（２）Ｔ７アンチセン
スプライマー＋ｓｅｒ９６ センスプライマー。次に実施
例３記載のＴ７センスプライマー＋Ｔ７アンチセンスプ
ライマーを用いて（１）および（２）からポリメラーゼ
連鎖反応を行う。
ＧＦ ｃＤＮＡの構成を示す。実施例２で作成された発
現プラスミドｐＴ７ ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦを鋳型と
し使用し、下記のポリメラーゼ連鎖反応混合物を用いｃ
ｙｓ７８をｓｅｒ７８に、ｃｙｓ９６をｓｅｒ９６に変
異させた。（１）Ｔ７のセンスプライマー＋ｓｅｒ７８
アンチセンスプライマー；および（２）Ｔ７アンチセン
スプライマー＋ｓｅｒ９６ センスプライマー。次に実施
例３記載のＴ７センスプライマー＋Ｔ７アンチセンスプ
ライマーを用いて（１）および（２）からポリメラーゼ
連鎖反応を行う。
【図２】図２は天然のｈｂＦＧＦのヘパリンＨＰＬＣを
示す。結合したｈｂＦＧＦ（１５４個のアミノ酸を含
む）を、実施例５記載の方法で０．６〜３．０モルのＮ
ａＣｌ濃度の直線状の勾配を付け、流速を０．７ｍｌ／
分とし、２８０ｎｍで監視してヘパリン・セファロース
・カラムから流出させた。
示す。結合したｈｂＦＧＦ（１５４個のアミノ酸を含
む）を、実施例５記載の方法で０．６〜３．０モルのＮ
ａＣｌ濃度の直線状の勾配を付け、流速を０．７ｍｌ／
分とし、２８０ｎｍで監視してヘパリン・セファロース
・カラムから流出させた。
【図３】図３は還元された組換え体ｈｂＦＧＦのヘパリ
ンＨＰＬＣを示す。実施例６に記載したようにヘパリン
・セファロースからの物質を一緒に集めたものをジチオ
テイトールで還元し、これをヘパリン・セファロース・
カラムから流出させた。
ンＨＰＬＣを示す。実施例６に記載したようにヘパリン
・セファロースからの物質を一緒に集めたものをジチオ
テイトールで還元し、これをヘパリン・セファロース・
カラムから流出させた。
【図４】図４はｇｌｕ３，５，Ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦ
ＧＦの逆相ＨＰＬＣを示す。ヘパリンＨＰＬＣからの試
料（８μｇ）を０．４５×２５ｃｍのヴァイダックＣ４
カラムに入れ、実施例６記載のように０．１％トリフル
オロ酢酸／アセトニトリル溶媒系（０〜２８％のアセト
ニトリルで１５分間、２８〜６０％で９９分間、６０〜
８０％で１０分間）を用い０．７ｍｌ／分で流出させ
た。
ＧＦの逆相ＨＰＬＣを示す。ヘパリンＨＰＬＣからの試
料（８μｇ）を０．４５×２５ｃｍのヴァイダックＣ４
カラムに入れ、実施例６記載のように０．１％トリフル
オロ酢酸／アセトニトリル溶媒系（０〜２８％のアセト
ニトリルで１５分間、２８〜６０％で９９分間、６０〜
８０％で１０分間）を用い０．７ｍｌ／分で流出させ
た。
【図５】図５は天然のｂＦＧＦと組換え体ｂＦＧＦとの
生物検定の結果の比較である。実施例７記載のようにウ
シの脳から分離されたｂＦＧＦのマイトジエン活性を、
ウシの大動脈急の血管の内皮細胞の増殖作用に関し、ヒ
トの組換え体ｂＦＧＦと比較した。ウシの脳のｂＦＧＦ
（１０〜１５５）（−▲−）、天然の配列をもった組換
え体ｈｂＦＧＦ（−●−）およびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆ（−○−）を種々の量で存在させ（アミノ酸分析で決
定）細胞を成長させた。４日後に、検査した細胞密度領
域に関する細胞の数と等価な酸性フォスフォターゼ活性
を４０５ｎｍにおいて決定した。
生物検定の結果の比較である。実施例７記載のようにウ
シの脳から分離されたｂＦＧＦのマイトジエン活性を、
ウシの大動脈急の血管の内皮細胞の増殖作用に関し、ヒ
トの組換え体ｂＦＧＦと比較した。ウシの脳のｂＦＧＦ
（１０〜１５５）（−▲−）、天然の配列をもった組換
え体ｈｂＦＧＦ（−●−）およびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆ（−○−）を種々の量で存在させ（アミノ酸分析で決
定）細胞を成長させた。４日後に、検査した細胞密度領
域に関する細胞の数と等価な酸性フォスフォターゼ活性
を４０５ｎｍにおいて決定した。
【図６】図６は生来のｂＦＧＦとキメラのｂＦＧＦとの
生物検定の結果の比較である。成長因子を種々の量で存
在させ（アミノ酸分析で決定）５日間保持した細胞を用
いウシの脳のｂＦＧＦ（１０〜１５５）（−○−）とｇ
ｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦ（−●−）と
のマイトジエン活性を比較し、細胞の数を実施例７記載
の方法で決定した。
生物検定の結果の比較である。成長因子を種々の量で存
在させ（アミノ酸分析で決定）５日間保持した細胞を用
いウシの脳のｂＦＧＦ（１０〜１５５）（−○−）とｇ
ｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦ（−●−）と
のマイトジエン活性を比較し、細胞の数を実施例７記載
の方法で決定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヤコブ・グルツマン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 07458アツパーサドルリバー・ピーチト ウリープレイス24 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/50 C12N 15/00 - 15/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (9)
- 【請求項１】 （ａ）１５５個のアミノ酸から成り、位
置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で
置き換えられている塩基性繊維芽細胞成長因子、 （ｂ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、
位置７８および９６のシステインがチオール−ジスルフ
ィド交換を除去するアミノ酸で置き換えられている塩基
性繊維芽細胞成長因子、および （ｃ） （ａ）および（ｂ）に記載の塩基性繊維芽細胞
成長因子であって、Ｎ−末端メチオニンをもたない成長
因子、 から成る群から選ばれることを特徴とする塩基性繊維芽
細胞成長因子。 - 【請求項２】 （ａ）１５５個のアミノ酸から成り、位
置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で
置き換えられている組換え塩基性繊維芽細胞成長因子、 （ｂ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、
位置７８および９６のシステインがチオール−ジスルフ
ィド交換を除去するアミノ酸で置き換えられている組換
え塩基性繊維芽細胞成長因子、および （ｃ） （ａ）および（ｂ）に記載の組換え塩基性繊維
芽細胞成長因子であって、Ｎ−末端メチオニンをもたな
い成長因子、 から成る群から選ばれることを特徴とする組換え塩基性
繊維芽細胞成長因子。 - 【請求項３】 （ａ）１５５個のアミノ酸から成り、位
置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で
置き換えられている組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因
子をコードするＤＮＡ、および （ｂ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、
位置７８および９６のシステインがチオール−ジスルフ
ィド交換を除去するアミノ酸で置き換えられている組換
えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子をコードしているＤＮ
Ａ、 から成る群から選ばれることを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項２または請求項３に記載の組換え
塩基性繊維芽細胞成長因子をコード化したＤＮＡ配列を
含んで成ることを特徴とする生物学的な機能をもった環
状プラスミドまたはウィルスＤＮＡベクター。 - 【請求項５】 宿主細胞が該成長因子を発現できる状態
で請求項４記載のベクターで形質転換またはトランスフ
ェクションされていることを特徴とする原核細胞または
真核細胞の宿主細胞。 - 【請求項６】 宿主細胞が該成長因子を発現できる状態
で請求項３記載のＤＮＡ配列で形質転換またはトランス
フェクションされていることを特徴とする原核細胞また
は真核細胞の宿主細胞。 - 【請求項７】 請求項２記載の塩基性繊維芽細胞成長因
子をコードしている精製され分離されたＤＮＡ配列で形
質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を該
宿主細胞が該成長因子を発現するのに十分な時間および
十分な条件下、培地中で増殖させ、該培地、該宿主細胞
の溶解物および該宿主細胞の膜画分から成る群から選ば
れる物質から成長因子を回収することを特徴とする （ａ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられて
いる組換え塩基性繊維芽細胞成長因子、 （ｂ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、
位置７８および９６のシステインがチオール−ジスルフ
ィド交換を除去するアミノ酸で置き換えられている組換
え塩基性繊維芽細胞成長因子、および （ｃ） （ａ）および（ｂ）に記載の組換え塩基性繊維
芽細胞成長因子であって、Ｎ−末端メチオニンをもたな
い成長因子、 から成る群から選ばれることを特徴とする組換え塩基性
繊維芽細胞成長因子を製造する方法。 - 【請求項８】 宿主細胞が請求項２記載の塩基性繊維芽
成長因子をコードするＤＮＡにコードされたポリペプチ
ドを発現できる状態で、請求項２記載の塩基性繊維芽成
長因子をコードするＤＮＡ配列で、原核細胞または真核
細胞の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクション
することを特徴とする （ａ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられて
いる組換え塩基性繊維芽細胞成長因子、 （ｂ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、
位置７８および９６のシステインがチオール−ジスルフ
ィド交換を除去するアミノ酸で置き換えられている組換
え塩基性繊維芽細胞成長因子、および （ｃ）（ａ）および（ｂ）に記載の組換え塩基性繊維芽
細胞成長因子であって、Ｎ−末端メチオニンをもたない
成長因子、 から成る群から選ばれることを特徴とする組換えヒト塩
基性繊維芽細胞成長因子を発現し得る原核細胞または真
核細胞の作成方法。 - 【請求項９】 ４個のシステイン残基の少なくとも２個
は、（ＣＨ2ＣＯＯＨ）；［ＣＨ(ＣＯ2Ｈ)(ＣＨ2)xＣＯ
2Ｈ］、（ＣＨ2ＣＯＮＲ3Ｒ4）、（Ｒ5）、［（ＣＨ2）n
ＳＯ3］、（ＣＨＣＨ2ＣＯＮＲ3ＣＯ［（ＣＨ2）mＮＲ3
Ｒ4］）、（ＣＨ2ＯＣＯＣＨ2Ｒ5）または（ＳＲ6）
［但し上記式中Ｒ3およびＲ4はそれぞれＨ、［（Ｃ
Ｈ2）xＣＯ2Ｈ］、［ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）（ＣＨ2）xＣＯ2
Ｈ］、随時ヒドロキシル置換基を０〜２個有するＣ1〜
Ｃ6のアルキルまたはポリエチレングリコールであり；
Ｒ5はＣ1〜Ｃ6のアルキル、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシメチ
ルであり、Ｒ6はＣ1〜Ｃ6のアルキル、ポリエチレング
リコールまたは随時１または２個のカルボン酸または硫
酸基で置換されたフェニル基であり；ｎは０〜４の整
数、ｍは２〜４の整数であり、そしてｘは１〜３の整数
である］から成る群から選ばれる置換基で修飾されてい
ることを特徴とする （ａ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられて
いる組換え塩基性繊維芽細胞成長因子、 （ｂ）１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、
位置７８および９６のシステインがチオール−ジスルフ
ィド交換を除去するアミノ酸で置き換えられている組換
え塩基性繊維芽細胞成長因子、および （ｃ）（ａ）および（ｂ）に記載の組換え塩基性繊維芽
細胞成長因子であって、Ｎ−末端メチオニンをもたない
成長因子、 から成る群から選ばれることを特徴とする組換え塩基性
繊維芽細胞成長因子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61520290A | 1990-11-23 | 1990-11-23 | |
| US615202 | 1990-11-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04330097A JPH04330097A (ja) | 1992-11-18 |
| JP3205578B2 true JP3205578B2 (ja) | 2001-09-04 |
Family
ID=24464425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33156891A Expired - Fee Related JP3205578B2 (ja) | 1990-11-23 | 1991-11-21 | キメラ繊維芽細胞成長因子 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5310883A (ja) |
| EP (1) | EP0486862B1 (ja) |
| JP (1) | JP3205578B2 (ja) |
| KR (1) | KR100205078B1 (ja) |
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