JP3372464B2 - ヒト内皮細胞成長因子のコード配列からなるｃＤＮＡクローン - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明はヒト内皮細胞成長因
子の完全なコード配列からなるｃＤＮＡクローンに関す
るものである。 【０００２】さらに詳しくは、本発明はヒト内皮細胞成
長因子のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローン、
開裂可能なシグナルペプチドをコードする配列をさらに
含むｃＤＮＡクローン及び該ヒト内皮細胞成長因子をコ
ードする配列及び開裂可能なシグルペプチドをコードす
る配列を含むプラスミドに関するものである。本発明は
さらに内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）をコードするＤＮ
Ａ配列を組み込む複製可能な発現ベクター並びにそれに
より形質転換又はトランスフェクションされる自己複製
宿主細胞システムに関するものである。 【０００３】 【従来の技術】本明細書では「ＥＣＧＦ」と呼ばれる内
皮細胞成長因子は、生体外の内皮細胞に関するミトゲン
である。内皮細胞の成長は、アンジオゲネシスの方法中
の必要な工程である〔マシアグ（Ｍａｃｉａｇ）「プロ
グ・ヘモスタシス・アンド・トロンボ（Ｐｒｏｇ．Ｈｅ
ｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂ．）」７：１
６７〜１８２（１９８４）；マシアグ，Ｔ．，フーバー
（Ｈｏｏｖｅｒ），Ｇ．Ａ．及びワインシュタイン（Ｗ
ｅｉｎｓｔｅｉｎ），Ｒ．，「Ｊ．バイオロ．ケム．
（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」２５７：５３３３〜５３３
６（１９８２）〕。ウシＥＣＧＦはマシアグらにより単
離された〔「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」２２５：
９２３〜９３５（１９８４）〕。それはストレプトマイ
シン硫酸塩沈でん、ゲル排除クロマトグラフィ、硫安ア
ンモニウム沈でん及びヘパリン・セファロース・アフィ
ニティクロマトグラフィを用いた。このやり方で精製さ
れたウシＥＣＧＦは、アニオン性等電点及び２０，００
０の見掛け上の分子量を有する１本鎖ポリペプチドを生
ずる〔マシアグ同上；シュライバー（Ｓｃｈｒｅｉｂｅ
ｒ）ら「Ｊ．セル・バイオロ．（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．）〕１０１：１６２３〜１６２６（１９８５）；及
びシュリバーら「プロシ．ナツル．アカデ．サイ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）」８２：６１３
８〜６１４２（１９８５）〕。さらに最近では、ヘパリ
ン−セファロースカラムからのウシＥＣＧＦの塩化ナト
リウム勾配溶離により、又は逆相高速液体クロマトグラ
フィ（ＨＰＬＣ）により、複数の形のウシＥＣＧＦがバ
ージス（Ｂｕｒｇｅｓｓ）ら〔「Ｊ．バイオロ．ケム」
２６０：１１３８９〜１１３９２（１９８５）〕により
単離された。アルファ−ＥＣＧＦ及びベータ−ＥＣＧＦ
と呼ばれる２種の単離されたポリペプチドは、それぞれ
１７，０００及び２０，０００の見掛け上の分子量を有
する。このやり方を用いて、８，５００ｍｌのウシ脳抽
出物（６．２５×１０⁷ 全単位）に含まれるウシＥＣＧ
Ｆは、合計６ｍｌのアルファ−ＥＣＧＦ（３．０×１０
⁶ 単位）及び３ｍｌのベータ−ＥＣＧＦ（５．２×１０
⁵ 単位）に濃縮される。これは、アルファ−ＥＣＧＦの
９，３００倍の精製及びベータ−ＥＣＧＦの１６，３０
０倍の精製である（バージス、同上）。最近、ウシＥＣ
ＧＦに対するネズミモノクローナル抗体が生成され（マ
シアグら、同上）、それは米国特許第４，３６１，５０
９号明細書にチンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）及び
フルヒアー（Ｆｕｌｃｈｅｒ）により記載されたファク
ターVIIIＣのモノクローナル抗体精製に似た方法で、ウ
シＥＣＧＦを精製するのに有用であろう。 【０００４】一般に、組換えＤＮＡ技術は周知である。
「メソッズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（アカデミック・プレ
ス、ニュー・ヨーク）、１５及び６８巻（１９７９）；
１００及び１０１巻（１９８３）及びそれらに引用され
た参考文献参照（これらのすべては本明細書において参
考文献として引用される）。最も普通に用いられる組換
えＤＮＡの方法論を具体化する広範囲の技術的な論説
は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら「モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（１９８２）に見い出されうる。種々のポリペプチドに
ついてコーディングする遺伝子は、組換えＤＮＡ媒体例
えば細菌性又はウイルス性のベクターにポリペプチドに
ついてコードするＤＮＡフラグメントを組み入れ、そし
て適当な宿主を形質転換することによりクローンされう
る。この宿主は代表的にはエツシエリキア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌で
あるが所望の生成物に応じて真核宿主が用いられうる。
組換えベクターを組み込むクローンは単離されそして成
長されさらに多量に所望のポリペプチドを生成するのに
用いられうる。 【０００５】三、四のグループの科学者は、真核細胞か
らメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の混合物を単離し
そして一連の酵素的反応を用いてこのｍＲＮＡに対して
相補的な二本鎖ＤＮＡコピーを合成した。第一の反応に
おいて、ｍＲＮＡはＲＮＡに向うＤＮＡポリメラーゼ
（又逆転写酵素と呼ばれる）により一本鎖相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）へ転写される。逆転写酵素は５’−３’方
向にＤＮＡを合成し、プレカーサーとしてデオキシリボ
ヌクレオチド５’−トリホスフェートを用い、そして鋳
型及びプライマー鎖を必要とし、その後者は遊離の３’
−ヒドロキシル末端を有しなければならない。ｍＲＮＡ
の鋳型の部分的なコピー又は完全なコピーの何れにせ
よ、逆転写酵素生成物は、しばしばそれらの３’末端に
おいて短い部分的に二本鎖のヘアピン（「ループ」）を
有する。第二の反応において、これらの「ヘアピン・ル
ープ」は、ＤＮＡポリメラーゼに対するプライマーとし
て働く。予め形成されたＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼ
の作用において鋳型としてさらにプライマーとして要求
される。ＤＮＡポリメラーゼは、遊離の３’−ヒドロキ
シル基（それに新しいヌクレオチドが加えられて５’−
３’方向に鎖を伸長する）を有するＤＮＡ鎖の存在を必
要とする。このような連続逆転写酵素及びＤＮＡポリメ
ラーゼ反応の生成物は、なお一端でループを有する。そ
のようにして生成された二本鎖ＤＮＡのループ又は「折
り重ね点」の頂点は、実質的に一本鎖セグメントであ
る。第三の反応において、この一本鎖セグメントは、一
本鎖特異的ヌクレアーゼＳ１により開裂されて「ブラン
トエンド」二本鎖ＤＮＡセグメントを発生させる。この
一般的な方法は、すべてのｍＲＮＡ混合物に適用可能で
あり、そしてブエル（Ｂｕｅｌｌ）ら「Ｊ．バイオロ．
ケム．」２５３：２４８３（１９７８）に記載されてい
る。 【０００６】得られた二本鎖ｃＤＮＡ混合物（ｄｓ−ｃ
ＤＮＡ）は、少なくとも一部は用いられる特別な媒体に
応じて、多くの周知の技術の任意の一つによりクローン
する媒体にそう入される。種々のそう入法は、「メソッ
ズ・イン・エンチモロジー」６８：１６〜１８（１９８
０）及びその引用文献にかなり詳しく述べられている。
一度ＤＮＡセグメントがそう入されると、クローンする
媒体が用いられて適当な宿主を形質転換する。これらの
クローンする媒体は、通常、宿主に抗生物質抵抗性の特
徴を与える。このような宿主は、一般に原核細胞であ
る。この点において、形質転換又はトランスフェクショ
ンされた宿主の二、三のみが所望のｃＤＮＡを含むに過
ぎない。すべての形質転換又はトランスフェクションさ
れた宿主のすべてが、遺伝子「ライブラリー」を形成す
る。この方法により生成された全部のｄｓ−ｃＤＮＡラ
イブラリーが、原料として用いられるｍＲＮＡ混合物に
存在するコーディング情報の代表的なサンプルを提供す
る。 【０００７】もし適当なオリゴヌクレオチド配列が利用
しうるならば、それは用いられて下記のやり方で問題の
クローンを同定する。個々の形質転換又はトランスフェ
クションされた細胞は、ニトロセルロース濾紙上でコロ
ニーとして成長する。これらのコロニーを溶解し；放出
されたＤＮＡを加熱により濾紙に固く結合する。濾紙
を、次に問題の構造遺伝子に相補的なラベルされたオリ
ゴヌクレオチドのプローブとともにインキュベートす
る。プローブは、それが相補的なｃＤＮＡと交雑し、そ
してオートラジオグラフィにより同定される。所望の蛋
白に関する構造上の情報のすべてを含むクローンの一つ
又は組合せを同定するために、相当するクローンの特徴
を求める。問題の蛋白についてコーディングする核酸配
列を単離し、そして発現ベクターに再そう入する。発現
ベクターは、ｄｓ−ｃＤＮＡの有効な発現（転写及び翻
訳）を行わさせる特定の原核又は真核のコントロール要
素の統制コントロールの下に、クローンされた遺伝子を
おく。従って、この一般的な技術は、少なくとも一部の
それらのアミノ酸又はＤＮＡ配列がオリゴヌクレオチド
のプローブが利用可能であることについて知られている
これらの蛋白に対してのみ利用可能である。一般にマニ
アチスら、同上参照。さらに最近では、問題のエンコー
ドされた蛋白に対して特異的な抗体により細菌性コロニ
ー又はファージ・プラークをプロービングすることによ
り、特定のクローンを同定する方法が開発された。蛋白
生成物の合成が必要なので、この方法は「発現ベクタ
ー」クローニング媒体についてのみ用いられる。構造遺
伝子は、蛋白の発現をコントロールする調節遺伝子配列
に隣接したベクターにそう入される。細胞は、化学的方
法又は宿主細胞或いはベクターにより供給される機能の
何れかにより、溶解され、そして蛋白は特定の抗体及び
検出システム例えば酵素イムノアッセイにより検出され
る。この一つの例は、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）及びデービ
ス（Ｄａｖｉｓ）「プロシ・ナツル・アカデ．サイ．Ｕ
ＳＡ」８０：１１９４〜１１９８（１９８３）並びにヤ
ング及びデービス「サイエンス」２２２：７７８（１９
８３）により記載されたラムダｇｔ₁₁システムである。 【０００８】 【発明の実施の形態】本発明は、容易に利用しうる大量
のＥＣＧＦ又はＥＣＧＦフラグメントを提供可能にし
た。これは、そのデザインがウシＥＣＧＦのアミノ酸配
列の知識に基づきそしてＥＣＧＦ ｃＤＮＡと特異的に
反応するオリゴヌクレオチドにより達成される。ＥＣＧ
Ｆの生成は、ＥＣＧＦ蛋白をコードするクローニング媒
体の生成に対する組換えＤＮＡ技術の適用並びにヒト起
源の他の蛋白が実質的にないＥＣＧＦ蛋白を回収する方
法により達成される。 【０００９】従って、本発明はヒト由来の他の蛋白を含
まないＥＣＧＦ又はそのフラグメントを提供する。ＥＣ
ＧＦは宿主細胞において組換えＤＮＡ技術により生成さ
れ、そして本質的に純粋な形で提供される。本発明は特
にＥＣＧＦをコードするＤＮＡ配列を組み込む複製可能
な発現ベクター並びにそれにより形質転換又はトランス
フェクションされる自己複製宿主細胞システムを提供す
る。宿主細胞システムは通常原核細胞例えばＥ．コリ又
はＢ．スブチリス、又は真核細胞のものである。 【００１０】ＥＣＧＦは、（ａ）適当な宿主細胞システ
ム中にＥＣＧＦをコードするＤＮＡ配列を発現しうる複
製可能な発現ベクターを生成させ；（ｂ）該宿主システ
ムを形質転換して組換え宿主システムが得られ；（ｃ）
該ＥＣＧＦコードＤＮＡ配列の発現を生じさせる条件下
で該組換え宿主システムを維持してＥＣＧＦ蛋白を生成
させ；そして（ｄ）該ＥＣＧＦ蛋白を回収することより
なる方法により生成される。好ましくはＥＣＧＦコード
複製可能発現ベクターは、ＥＣＧＦ ｍＲＮＡを代表す
るｄｓ−ｃＤＮＡ生成物を調製しそしてｄｓ−ｃＤＮＡ
を複製可能な発現ベクターに組み込むことにより製造さ
れる。ＥＣＧＦを回収する好ましい態様は、組換え宿主
システムにより発現された蛋白と、ＥＣＧＦに関して特
異的な少なくとも一つの結合工程を含む試薬組成物とを
反応させることを含む。ＥＣＧＦは、損傷の治療又は血
管及び他の内皮細胞系構造の再生において治療剤として
用いられうる。 【００１１】第１図は、ｃＤＮＡクローンを生成する酵
素反応の一般的な方法を示す。 【００１２】第２図は、ラムダｇｔ₁₁にそう入されるＤ
ＮＡフラグメントを含むライブラリーの生成を示す。 【００１３】第３図は、ウシのアルファ及びベータＥＣ
ＧＦの部分的アミノ酸配列を示す。 ラインａ：ウシのアルファＥＣＧＦのアミノ末端アミノ
酸配列。 ラインｂ：ウシのベータＥＣＧＦのアミノ末端アミノ酸
配列。かっこ内の部分は、その配列が決定されなかった
ＮＨ₂ 末端セグメントに相当し；その代りアミノ酸組成
が示される。Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ・・・・で始まる
配列は、トリプシン開裂ウシベータＥＣＧＦから決定さ
れた。 ラインｃ：臭化シアノゲン開裂ウシアルファＥＣＧＦの
アミノ酸配列。 ラインｄ：臭化シアノゲン開裂ウシベータＥＣＧＦのア
ミノ酸配列。 【００１４】第４図は、水素結合された塩基対を示す。 【００１５】第５図は、ヒト内皮細胞成長因子のための
オリゴヌクレオチドのプローブのデザインを示す。 【００１６】第６図は、ヒトＥＣＧＦ ｃＤＮＡクロー
ン１及び２９の概略図を示す。開いたリーディング・ボ
ックスは、ヒトベータ−ＥＣＧＦをコードする開いたリ
ーディング・フレームを示す。ＥｃｏＲＩ部位は、ｃＤ
ＮＡライブラリーの構成に用いられる合成オリゴヌクレ
オチドリンカーに相当する。クローン１の３’末端のポ
リ（Ａ）テールは、Ａ₁₇により示される。 【００１７】第７図は、ヒトＥＣＧＦ ｃＤＮＡ配列と
オリゴヌクレオチドプローブとの間の同一性を示す。 ラインａ：ウシのトリプシン−又は臭化シアノゲン開裂
ベータＥＣＧＦアミノ酸配列。 ラインｂ：ユニークなオリゴヌクレオチドプローブ。 ラインｃ：ヒトＥＣＧＦ ｃＤＮＡ配列（ラムダＥＣＧ
Ｆクローン１及び２９から決定）。 ラインｄ：ｃＤＮＡ配列分析から導かれたヒトＥＣＧＦ
アミノ酸配列。 【００１８】第８図は、ヒトＥＣＧＦの完全なｃＤＮＡ
配列を示す。ＥＣＧＦクローン１及び２９からのｃＤＮ
ＡインサートはＭ１３ｍｐ１８にサブクローンされ、そ
してＥＣＧＦコード開放リーディング・フレーム及びそ
の側面領域は、鎖成長停止法により配列された。ＥＣＧ
Ｆコード開放リーディングフレームの５’及び３’末端
の停止コドンは、フレームにおいて、アンダーラインさ
れた配列及びｔｒｍによりそれぞれ示されている。アミ
ノ酸に関する一つの文字の表示が用いられる：Ａ，ａｌ
ａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｎ；Ｆ，Ｐｈ
ｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙ
ｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒ
ｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈ
ｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；Ｙ，Ｔｙｒ。 【００１９】第９図は、ＥＣＧＦ ｍＲＮＡのノーザン
・ブロット分析を示す。ＲＮＡは２．２Ｍホルムアルデ
ヒド及び５０％ホルムアミド中で変性させられそして
２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１．２５％アガロース
ゲル中の電気泳動により分画された。これを１０Ｘ Ｓ
ＳＰＥによってブロットすることによりジーンスクリー
ン・プラス（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ）（ニ
ュー・イングランド・ニュークリア）に移した。ブロッ
トを、２Ｘ ＳＳＰＥ、２０Ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ）の溶液、イースト・トランスファＲＮＡ（２０
０μｇ／ｍｌ）、０．２％ ＳＤＳを含む混合物中で１
６時間６５℃でＥＣＧＦクローン１の³²ｐをラベルした
ニック翻訳プローブへ交雑された。膜を６５℃で２Ｘ
ＳＳＰＥ及び０．２％ ＳＤＳにより２回、０．２Ｘ
ＳＳＰＥ及び０．２％ ＳＤＳにより２回次々に洗い、
風乾しそして増感スクリーンとともにコダックＸＡＲフ
ィルムに１晩露出した。２８Ｓ及び１８Ｓ ＲＮＡの転
位が示される。 【００２０】レーン１：１０μｇヒト脳ポリ（Ａ）含有
ＲＮＡ。 レーン２：１０μｇヒト成人肝ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ。 【００２１】本明細書で用いられるとき、「ＥＣＧＦ」
は、ヒトのアンジオゲニックなプロセスに固有なＥＣＧ
Ｆが有するように、生体外で細胞の成長、分化及び転位
に影響する能力を有する生活性的な形で、細胞又は無細
胞培養システムにより生成される内皮細胞成長因子又は
そのフラグメントを示す。 【００２２】ＥＣＧＦの異なるアレルは、自然に存在し
うる。これらの変異は、同一の生物学的機能の蛋白に対
してコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における
相違により特徴付けられよう。単一又は複数のアミノ酸
の置換、欠損、付加又は転換を有するアナローグを生成
することは可能である。自然のＥＣＧＦの生物学上活性
な性質を保つＥＣＧＦの誘導体をもたらすアナローグ並
びにすべてのこのようなアルレの変異、修飾は、本発明
の範囲内に含まれる。 【００２３】「発現ベクター」は、そのような配列がそ
れらの発現に影響しうる他の調節配列に結合するとき、
そこに含まれたＤＮＡ配列を転写及び翻訳しうるベクタ
ーを指す。これらの発現ベクターは、エピソーム、バク
テリオファージとして又は染色体ＤＮＡの拡大部分とし
ての何れかで、宿主生物又はシステム中で複製可能でな
ければならない。本発明で特に用いられるのに適した発
現ベクターの一つの形は、細菌中で通常生存し複製する
バクテリオファージ、ウイルスである。この目的に特に
望ましいファージは、ヤング及びデービス、同上により
記述されたラムダｇｔ₁₀及びｇｔ₁₁ファージである。ラ
ムダｇｔ₁₁は、そう入されたＤＮＡにより特定されるポ
リペプチドを生成しうる一般的な組換えＤＮＡ発現ベク
ターである。 【００２４】劣化を最低にするために、ラクトースの合
成アナローグ（ＩＰＴＧ）による誘導のときに、異物蛋
白又はその部分は原核蛋白Ｂ−ガラクトシダーゼに合成
融合される。蛋白劣化径路に欠けた宿主細胞の使用は、
又誘導されたラムダｇｔ₁₁クローンから生成された新規
な蛋白の寿命を増大させる。ラムダｇｔ₁₁クローンにお
ける異物ＤＮＡの適当な発現は、Ｂ−ガラクトシダーゼ
プロモーター及び翻訳開始コドンに関するそう入された
ＤＮＡの適切な配向及びリーディング・フレームに依存
するだろう。 【００２５】組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターの
他の形は、プラスミド即ち円形の組込まれていない（染
色体外）の二本鎖ＤＮＡループである。同等な機能を果
たす発現ベクターの任意の他の形は、本発明の方法に用
いられるのに適している。 【００２６】本明細書において開示された組換えベクタ
ー及び方法は、広範囲の原核及び真核の生物を含む宿主
細胞に用いられるのに適している。原核細胞が、ＤＮＡ
配列のクローン化及びベクターの構成に好ましい。例え
ば、Ｅ．コリＫ１２株ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９
４）が特に有用である。もち論、他の微生物の株も用い
られうる。宿主細胞又はシステムと両立しうる種から誘
導された複製及びコントロール配列を含むベクターは、
これらの宿主とともに用いられる。ベクターは、形質転
換された細胞に表現型選択をもたらしうる特徴ととも
に、元来複製の元を有している。例えば、Ｅ．コリは、
ベクターｐＢＲ３２２を用いて形質転換され、それはア
ンピシリン及びテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含む
〔ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら「ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）」２：９５（１９７７）〕。 【００２７】これらの抗生物質抵抗性遺伝子は、形質転
換された細胞を同定する手段を提供する。発現ベクター
は、又目的の遺伝子の発現のために用いられうるコント
ロール要素を含む。Ｅ．コリ中の異物ＤＮＡ配列の発現
のために用いられる普通の原核コントロール要素は、ベ
クテリオファージラムダのｐＲ及びｐＬプロモーターと
ともに、Ｅ．コリのＢ−ガラクトシダーゼ及びトリプト
ファン（ｔｒｐ）オペロンから誘導されたプロモーター
及び調節配列を含む。これらの要素の組合わせは、又用
いられる（例えば、ｔｒｐプロモーターとラクトースオ
ペレーターとの融合物であるＴＡＣ）。他のプロモータ
ーも又発見されそして利用され、そしてそれらのヌクレ
オチド配列に関する詳細は、発表されて当業者がそれら
を機能的に組合わせそして利用することができる。 【００２８】原核生物に加えて、真核微生物例えばイー
スト培養も又用いられうる。サッカロミセス・セルビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａ
ｅ）又は普通のベーカーズ・イーストは、真核微生物の
中で最も普通に用いられるが、多数の他の菌株も普通に
利用される。イースト中の異物ＤＮＡ配列の発現に適し
たイーストプロモーターは、３−ホスホグリセラートキ
ナーゼ又は他のグルコース分解酵素のためのプロモータ
ーを含む。好適な発現ベクターは、クローンされた遺伝
子のｍＲＮＡ転写のポリアデニル化及び停止をもたらす
停止シグナルを含む。イーストと両立しうるプロモータ
ー、複製の起源、適切な停止配列を含む任意のベクター
は、ＥＣＧＦの発現のために適している。 【００２９】多細胞生物から誘導された細胞系も又宿主
として用いられうる。原則として、脊椎動物又は無脊椎
動物の源からの何れでも、任意のこれら細胞培養は利用
可能である。しかし、関心は脊椎動物の細胞において最
大であり、そして培養（組織培養）中の脊椎動物の細胞
の増殖は、最近普通に行われている。このような有用な
宿主の例は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、マウスＣ １２７、
チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＷＩ ３
８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７及びＭＤＣＫ細胞系である。こ
のような細胞の発現ベクターは、元来、複製の起源、発
現されるべき遺伝子の前にあるプロモーター、ＲＮＡ切
り継ぎ部位（もし必要ならば）そして転写停止配列を含
む。 【００３０】ほ乳動物の細胞に用いられるため、発現ベ
クターのコントロール機能（プロモーター及びエンハン
サー）は、しばしばウイルス性物質により提供される。
例えば、普通に用いられるプロモーターは、ポリオー
マ、アデノウイルス２そして最もしばしばシミアン（Ｓ
ｉｍｉａｎ）ウイルス４０（ＳＶ ４０）から誘導され
る。真核プロモーター例えばネズミメタロチオネイン遺
伝子のプロモーター〔パウラキス（Ｐａｕｌａｋｉｓ）
及びハマー（Ｈａｍｅｒ）「プロシ・ナツル・アカデ・
サイ．」８０：３９７〜４０１（１９８３）〕も又用い
られうる。その上、このようなコントロール配列が宿主
システムと両立しうるならば、所望の遺伝子配列と元々
結合しているプロモーター又はコントロール配列を利用
することが可能でありそしてしばしば望ましい。転写の
速度を高めるために、真核エンハンサー配列も構築に加
えられうる。これらの配列は、種々の動物細胞又は発が
ん性のレトロウイルス例えばマウス肉腫ウイルスから得
られうる。 【００３１】複製の起源は、外因性の起源例えばＳＶ
４０又は他のウイルス性の起源により提供されるものを
含むベクターの構築によりもたらされるか、又は宿主細
胞の染色体複製メカニズムによりもたらされるかの何れ
かである。もしベクターが宿主細胞の染色体に組み入れ
られるならば、後者がしばしば充分である。 【００３２】宿主細胞は、種々の化学的組成を有するＥ
ＣＧＦを生成しうる。蛋白はその第一のアミノ酸として
メチオニンを有するものが生成される。このメチオニン
は、構造遺伝子の起源で元々存在するＡＴＧ開始コドン
により、又は構造遺伝子のセグメントの前に操作される
ことにより存在する。蛋白は、又細胞内又は細胞外で開
裂されて、蛋白のアミノ末端で元々見い出されるアミノ
酸を生ずる。蛋白は、それ自体又は異種シグナルペプチ
ドの何れかとともに生成され、シグナルポリペプチドは
細胞内又は細胞外の環境で特異的に開裂可能である。最
後に、ＥＣＧＦは、任意の外来のポリペプチドを開裂し
去る必要なしに成熟した形で直接発現により生成されう
る。 【００３３】組換え宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用
いて構築されたベクターにより形質転換された細胞に関
する。本明細書で規定された如く、ＥＣＧＦはこの形質
転換の結果として生成される。このような細胞により生
成されたＥＣＧＦ又はフラグメントは、「組換えＥＣＧ
Ｆ」とされる。 【００３４】下記の方法は、本発明の方法で有用な特定
の試剤を生成する多数の充分に確立された方法の或るも
のに過ぎない。ｍＲＮＡ混合物を得るための一般的な方
法は、組織サンプルを得るか又は所望の蛋白を生成する
細胞を培養するかそしてチャーグウイン（Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎ）ら「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）」１８：５２９４（１９７９）により開示された
方法の如き方法によりＲＮＡを抽出することである。ｍ
ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロース又はポリ（Ｖ）セ
ファロースのクロマトグラフィ次いでポリ（Ａ）含有ｍ
ＲＮＡ画分の溶離により、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ含有物質
により増加される。 【００３５】上述のポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ増加画分を
用いて逆転写酵素を用いて一本鎖相補ｃＤＮＡ（ｓｓ−
ｃＤＮＡ）を合成する。ＤＮＡ合成の結果として、ヘア
ピン・ループは第二の鎖ＤＮＡ合成を開始するＤＮＡの
３’末端で形成される。適切な条件下、このヘアピン・
ループを用いてＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌ
クレオチドトリホスフェートの存在下ｄｓ−ｃＤＮＡの
合成を行う。 【００３６】得られたｄｓ−ｃＤＮＡは、多くの周知の
技術の任意の一つにより発現ベクターに挿入される。一
般に、方法はマニアチスら、同上並びに「メソッゾ・イ
ン・エンチモロジィ」６５及び６８巻（１９８０）及び
１００及び１０１巻（１９８３）に見い出される。一般
に、ベクターは少なくとも１種の制限エンドヌクレアー
ゼにより線状化され、それは少なくとも２個のブラント
又は結合端を生成するだろう。ｄｓ−ｃＤＮＡは、ベク
ター挿入部位とリゲート又は結合される。 【００３７】もし実質的な細胞壁物質を含む原核細胞又
は他の細胞が用いられるならば、発現ベクターによる形
質転換の最も普通の方法は、コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、
Ｒ．Ｎ．ら「プロシ．ナツル．アカデ．サイ．ＵＳＡ」
６９：２１１０（１９７２）により記載された塩化カル
シウム予備処理である。もし細胞壁バリヤーなしの細胞
が宿主細胞として用いられるならば、トランスフェクシ
ョンはグラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びファン・デル・エ
ブ（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）「ウイロロジー（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ）」５２：４５６（１９７３）により記載され
たりん酸カルシウム沈澱法により行われる。細胞にＤＮ
Ａを導入する他の方法例えば核注入、ウイルス感染又は
プロトプラスト融合が成功して用いられうる。細胞は次
に選択的媒体上に培養され、そして発現ベクターがエン
コードする蛋白が生成される。 【００３８】ＥＣＧＦに関する一部又は全部のｃＤＮＡ
を含むクローンは、ＥＣＧＦの部分的アミノ酸配列決定
から導かれた特定のオリゴヌクレオチドプローブにより
同定される。この同定法は、非同義性オリゴヌクレオチ
ドプローブがデザインされてそれが特異的にＥＣＧＦ
ｄｓ−ｃＤＮＡに交雑することを必要とする。ＥＣＧＦ
ｃＤＮＡ配列を含むクローンは、³²ｐ−ＡＴＰにより
オリゴヌクレオチドプローブを放射性ラベルし、ＥＣＧ
Ｆ−ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーの個々のクロ
ーンのＤＮＡへ放射性オリゴヌクレオチドプローブを交
雑し、そしてオートラジオグラフィーにより交雑するク
ローンの検出及び単離により単離される。このようなク
ローニングシステムは、ヤング及びデービス、同上によ
り記載されたラムダｇｔ₁₁システムに適用可能である。 【００３９】ＥＣＧＦの全配列を含むクローンは、ＥＣ
ＧＦ特異的オリゴヌクレオチドによる組換えラムダｇｔ
₁₁ ｃＤＮＡライブラリーの最初のスクリーニング中単
離されたＥＣＧＦ組換え体のｃＤＮＡインサートをプロ
ーブとして用いて同定される。ヌクレオチド配列技術を
用いてｃＤＮＡフラグメントによりエンコードされたア
ミノ酸の配列を決定する。この情報を用いてウシＥＣＧ
Ｆ及びＥＣＧＦの臭化シアノゲン開裂により誘導される
ペプチドのアミノ末端の周知のアミノ酸配列に対する比
較により、推定のＥＣＧＦ ｃＤＮＡクローンの同定性
を決定する。 【００４０】 【実施例】 Ａ．全ＲＮＡの生成 全ＲＮＡ（メッセンジャー、リボゾーム及びトランスフ
ァー）を、本質的にチャーグウイン、同上（１９７９）
に記載されたように新鮮な２日経過したヒトの脳幹から
抽出した。細胞ペレットを５倍容の溶液〔４Ｍグアニジ
ンチオシナート及び２５ｍＭアンチ フォーム（Ａｎｔ
ｉｆｏｒｍ）Ａ（シグマ・ケミカル・カンパニー、セン
ト・ルイス、ミズリー）を含む〕中でホモゲナイズし
た。ホモジネートを１０℃で１５分間ソルバル（Ｓｏｒ
ｖａｌｌ）ＧＳＡローター中で６，０００ｒｐｍで遠心
分離した。上澄み液を酢酸の添加によりｐＨ５．０に調
節し、そしてＲＮＡが２時間−２０℃で０．７５倍容の
エタノールにより沈澱した。ＲＮＡを遠心分離により集
め、そして２ｍＭくえん酸ナトリウム及び５ｍＭジチオ
スレイトールを含む７．５Ｍグアニジン塩酸塩中に溶解
した。０．５倍容のエタノールを用いて２回の追加の沈
澱後、残存するグアニジン塩酸塩を無水エタノールによ
り沈澱から抽出した。ＲＮＡを滅菌水に溶解し、不溶物
質を遠心分離により除きそしてペレットを水により再抽
出した。ＲＮＡを０．２Ｍ酢酸カリウムに調節しそして
１晩−２０℃で２．５倍容のエタノールの添加により沈
澱させた。 【００４１】Ｂ．ポリ（Ａ）含有ＲＮＡの生成 前述の如く生成された全ＲＮＡ沈澱を１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ及び１％ＳＤＳを含む２０ｍＭヘペスパッファー（ｐ
Ｈ７．２）に溶解し、１０分間６５℃で加熱し次に２５
℃に急速に冷却した。ＲＮＡ溶液を次に等容量の水によ
り希釈し、ＮａＣｌを加えて最終の濃度を３００ｍＭ
ＮａＣｌとした。２４０Ａ₂₆₀ 単位以内のＲＮＡを含む
サンプルを標準の方法を用いてポリ（Ｕ）セファロース
のクロマトグラフィにかけた。ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを
１ｍＭヘペスバッファー（ｐＨ７．２）及び２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む７０％ホルムアミドにより溶離した。溶離
液を０．２４Ｍ ＮａＣｌに調節しそしてＲＮＡを−２
０℃で２．５倍容のエタノールにより沈澱させた。 【００４２】Ｃ．ラムダｇｔ₁₁中のｃＤＮＡクローンの
構築 酵素反応について行われた方法は、第１図に示される。
ｍＲＮＡ（２０μｇ）をブエル（Ｂｕｅｌｌ）ら、同上
及びウイルケンセン（Ｗｉｌｋｅｎｓｅｎ）ら「Ｊ．バ
イオロ．ケム．」２５３：２４８３（１９７８）に記載
された通りに、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼＩに
よりｄｓ−ｃＤＮＡへコピーされた。ｄｓ−ｃＤＮＡを
セファデックスＧ−５０で脱塩し、そして放出された容
量の画分をさらにメーカーの処方に従ってエルチップ
（Ｅｌｕｔｉｐ）Ｄカラム〔シュライヒアー・アンド・
シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌ
ｌ）、キーン、ＮＨ〕で精製した。ｄｓ−ｃＤＮＡをＳ
１ヌクレアーゼとのインキュベーションによりブラント
末端にした〔リカ（Ｒｉｃｃａ）ら、「Ｊ．オバロ．ケ
ム．」２５６：１０３６２（１９８１）〕。反応混合物
は、０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、０．４Ｍ
塩化ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸亜鉛及び０．１単位の
Ｓ１ヌクレアーゼ（ｄｓ−ｃＤＮＡ／ｎｇ当り）よりな
り、１００μｌの最終反応容量とした。ｄｓ−ｃＤＮＡ
を１時間３７℃でインキュベートし、フェノール：クロ
ロホルムにより抽出し次に前述の如くセファデックスＧ
−５０で脱塩した。 【００４３】ｄｓ−ｃＤＮＡを次にマニアチスら「モレ
キュラー・クローニング」同上に記載された反応条件を
用いてＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）フラグメント及びＥｃｏＲＩメチラーゼにより処理
した。ｃＤＮＡを再び前述の如くセファデックスＧ−５
０で脱塩し次にＴ₄ ＤＮＡリガーゼ（マニアチスら、同
上）を用いて０．５μｇのホスフォリル化ＥｃｏＲＩリ
ンカーにリゲートした。混合物をＥｃｏＲＩにより開裂
しそしてトリス・ボレートバッファ中の８％アクリルア
ミドゲルで分画した（マニアチスら、同上）。１キロベ
ースより大きい大きさのＤＮＡをゲルから溶離しそして
エルチップＤカラムに結合することにより回収し、１Ｍ
ＮａＣｌにより溶離しそしてエタノール沈澱により集
めた。 【００４４】第２図に示されるように、ＤＮＡフラグメ
ントは次にＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて開裂されたＥｃ
ｏＲＩ及びホスファターゼにより処理されたラムダｇｔ
₁₁に挿入された。５．７×１０⁶ ファージのライブラリ
ーが生成し、その中の約６５％が組換えファージであっ
た。ライブラリーは、Ｅ．コリＹ１０８８〔ｓｕｐＥｓ
ｕｐＦ ｍｅｔＢ ｔｒｐＲ ｈｓｄＲ^- ｈｓｄＭ⁺ ｔ
ｏｎＡ２１ ｓｔｒＡ ｌａｃＵ１６９（ｐｒｏＣ：；
Ｔｎ５）（ｐＭＣ９）〕に４２℃でプレートストックを
生成することにより増巾された。増巾方法はマニアチス
ら、同上に記載されている。ヤング及びデービス、同上
により記載されたこの菌株の重要な特徴は、(1) ｓｕｐ
Ｆ（Ｓ遺伝子におけるファージアンバー突然変異の要求
された抑圧）、(2) ｈｓｄＲ^- ｈｓｄＭ^- （宿主修飾前
異物ＤＮＡの制限を防止するのに必要）そして(3) ｌａ
ｃＵ１６９（ｐｒｏＣ：；Ｔｎ５）さらに(4) （ｐＭＣ
９）（ファージ及び／又は細胞の成長を阻害しうる異物
遺伝子の発現をインデューサの不存在下抑制するｌａｃ
Ｉ含有ｐＢＲ３２２誘導体）を含む。 【００４５】Ｄ．ＥＣＧＦ配列を含むクローンの同定 ＥＣＧＦ ｃＤＮＡを含む組換えファージに関するライ
ブラリーをスクリーンするために、１．５×１０⁶ ファ
ージをＥ．コリＹ１０９０〔△ｌａｃＵ１６９ｐｒＡ△
ｌｏｎ ａｒａＤ１３９ ｓｔｒＡ ｓｕｐＦ（（ｔｒ
ｐＣ２２：；Ｔｎ１０）（ｐＭＣ９）〕の菌叢にプレー
トし、そして６時間４２℃でインキュベートした。プレ
ートを１晩冷凍した後、ニトロセルロースフィルターを
プレートの上に置いた。フィルターの位置を針によりマ
ークした。フィルターを１分後除きそして室温で放置し
て乾燥した。各プレートから、重複したフィルターを前
述した通りに作成したが、ただしフィルターを５分間プ
レートと接触させたままにした。すべてのフィルターを
次にマニアチスら、同上に記載された如く交雑のために
生成した。これは０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ中のＤＮＡの変性、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５、１．５Ｍ ＮａＣｌ中の中和及び真空下８０℃２時
間にわたるフィルターの加熱を含んだ。 【００４６】ヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーをＥＣＧＦ
インサートを含むクローンについてスクリーンするため
に、特定のオリゴヌクレオチドをデザインした。このオ
リゴヌクレオチドは、ＥＣＧＦのアミノ末端の部分的ア
ミノ酸配列分析に基づいた。第３図のラインａ及びｂで
示されるように、ウシＥＣＧＦはアルファ及びベータＥ
ＣＧＦと呼ばれる２種として単離され、それはそれぞれ
のアミノ末端で見い出されるアミノ酸だけが異なる。第
３図のラインｂに示されるように、ベータＥＣＧＦはア
ルファＥＣＧＦより僅かに大きなものである。ベータＥ
ＣＧＦのアミノ末端における正確なアミノ酸配列は未決
定であるが、配列は高速原子衝撃質量分析により誘導さ
れそしてウシベータＥＣＧＦのアミノ末端トリプティッ
クペプチドのアミノ酸組成が示される。アミノ末端ブロ
ッキング基はアセチルと思われる。もし未処理のベータ
ＥＣＧＦがトリプシンにより開裂されるならば、Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ・・・により始まるアルファではないベ
ータＥＣＧＦに見い出される第二のアミノ酸配列が決定
される。この配列は、又酸性線維芽細胞成長因子のアミ
ノ末端で見い出される〔トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、
Ｋ．Ａ．ら「プロシ．ナツル．アカデ．サイ．〕８２；
６４０９〜６４１３（１９８５）〕。アルファＥＣＧＦ
のアミノ末端はＡｓｎ Ｔｙｒ Ｌｙｓ・・・であり
（第３図、ラインａ）、そしてアミノ末端を欠いたベー
タＥＣＧＦと同じである。第３図において、ラインｃ及
びｄは、それぞれ臭化シアノゲン開裂ウシアルファ及び
ベータＥＣＧＦのアミノ酸配列の比較のために示す。 【００４７】オリゴヌクレオチドのデザインのため、ア
ルファＥＣＧＦアミノ酸１９〜２９に相当するアミノ酸
配列Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ が選ばれ
た。可能なコーディング配列のすべてを含むオリゴヌク
レオチドの混合物をデザインするのよりも（遺伝コード
の同義性のために）、長いユニークなオリゴヌクレオチ
ドがデザインされた。このようなオリゴヌクレオチドプ
ローブは、複合ｃＤＮＡ〔ジェイエ（Ｊａｙｅ）ら「ヌ
クレイック．アシズ．リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」１１：２３２５〜２３３
５（１９８３）〕及びゲノム〔ギチャー（Ｇｉｔｓｃｈ
ｉｅｒ）ら「ネイチュア」３１２：３２６〜３３０（１
９８４）〕ライブラリーをスクリーニングするのに成功
したプローブであることが既に示されている。３種の基
準がＥＣＧＦプローブをデザインするのに用いられた。
(1) ジヌクレオチドＣＧを避けた。この戦略は真核ＤＮ
ＡにおけるＣＧジヌクレオチドの観察された表示不足に
基く〔ジョセ（Ｊｏｓｓｅ）ら「Ｊ．バイオロ．ケ
ム．」２３６：８６４〜８７５（１９６１）〕。(2) 好
ましいコドン利用データを可能な限り用いた。ヒトコド
ン利用の最近且包括的な分析はラテ（Ｌａｔｈｅ）
「Ｊ．モル．バイオロ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）」１８
３：１〜１２（１９８５）〕に見い出された。(3) ＣＧ
ジヌクレオチドの戦略及び好ましいコドン利用が情報価
値がないときは、異常な塩基対を認めた。この戦略はｔ
ＲＮＡアンチコドンとｍＲＮＡコドンとの間の相互作用
中に生ずるＧ：Ｔ、Ｉ：Ｔ、Ｉ：Ａ及びＩ：Ｃ塩基対の
天然の発生に基く〔クリック（Ｇｒｉｃｋ）、「Ｊ．モ
ル．バイオロ．」１９：５４８〜５５５（１９６
６）〕。普通のそして異常な塩基対の図を第４図に示
す。交雑プローブにおけるＩ（イノシン）の使用は、オ
ーツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）ら「Ｊ．バイオロ．ケム．」
２６０；２６０５〜２６０８（１９８５）によりモデル
実験において先ず立証された。ＥＣＧＦに関するヒト脳
幹ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするのに用いられ
るオリゴヌクレオチドのデザインで行われた全体の戦略
及び選択を第５図に示す。さらに、同じ戦略によりデザ
インされた２種の他のオリゴヌクレオチドも構築され
た。 【００４８】第５図に示された約３０ｐモルのオリゴヌ
クレオチドをマニアチスら、同上により本質的に記載さ
れた³²ｐガンマＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼとのインキュベーションにより放射性ラベルをした。
前述の如く作成したニトロセルロースフィルターを４２
℃で６Ｘ ＳＳＰＥ（１Ｘ ＳＳＰＥ＝０．１８ＭＮａ
Ｃｌ、０．０１Ｍ ＮａＨＰＯ₄ ｐＨ７．２、０．０
０１Ｍ ＥＤＴＡ）、２Ｘデンハートの溶液（１×デン
ハート−０．０２％各フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）、ポリ
ビニルピロリドン、ウシ血清アルブミン）、５％硫酸デ
キストラン、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で
予備交雑した。³²Ｐをラベルしたオリゴヌクレオチドを
４時間の予備交雑に加え、そして交雑を４２℃で１晩続
けた。未交雑のプローブを３７℃で２Ｘ ＳＳＰＥ、
０．１％ＳＤＳの逐次の洗浄により除いた。スクリーン
された１．５×１０⁶ プラークから、２個のプラーク
が、１晩の露出後正のオートラジオグラフィーシグナル
を示した。これらのクローンを、交雑プローブとして上
記のオリゴヌクレオチドを用いる精製サイクルの繰返し
により精製して均一なものとした。 【００４９】単離された２個のクローン（ＥＣＧＦクロ
ーン１及び２９）をさらに詳しく分析した。ＥｃｏＲＩ
による分解により、クローン１および２９は、それぞれ
２．２及び０．３ｋｂのｃＤＮＡインサートを示した。
クローンされたｃＤＮＡのニック翻訳及びサザーンブロ
ット分析（マニアチスら、同上）における放射性ラベル
されたプローブとしてのその次の使用は、クローン１及
び２９は関連のある重複したクローンであることを示し
た。これらの２個のクローンの重複性は、第６図に示さ
れる。 【００５０】クローン１及び２９は、さらに詳しく以下
の如く分析された。追加の２個のオリゴヌクレオチド
が、ウシＥＣＧＦのアミノ酸配列に基づいてデザインさ
れた。これらのオリゴヌクレオチドは、クローン１及び
２９を単離するのに用いられるオリゴヌクレオチドのデ
ザインに用いられたのと同じ考え方に基づいてデザイン
された。これらのオリゴヌクレオチド（ＥＣＧＦオリゴ
ヌクレオチドII及びIII）は、第７図に示される。これ
らの２個のオリゴヌクレオチド及びオリゴ（ｄＴ）
₁₈は、前述の如きキネーション反応において放射性ラベ
ルをされ、そしてサザーンブロッティング実験において
交雑プローブとして用いた。これらの実験の結果は、ク
ローン２９の０．３ｋｂ ｃＤＮＡインサートはＥＣＧ
ＦオリゴヌクレオチドＩ及びIIには交雑するがＥＣＧＦ
オリゴヌクレオチドIII 又はオリゴ（ｄＴ）₁₈には交雑
せず；クローン１の２．２ｋｂ ｃＤＮＡインサートは
オリゴヌクレオチドＩ、II、III そしてオリゴ（ｄＴ）
₁₈に交雑することを示した。これらのデータ並びにクロ
ーン１及び２９の次のヌクレオチド配列決定は、クロー
ン１の３’未満がポリ（Ａ）テールで終わることを示し
た。ウシＥＣＧＦの臭化シアノゲン開裂生成物に基づく
ＥＣＧＦオリゴヌクレオチドIII に対するそしてオリゴ
（ｄＴ）₁₈に対するクローン１の交雑は、このクローン
が、大きな（１ｋｂより大）３’側面配列と同じくアル
ファ及びベータの両方のＥＣＧＦに関するコーディング
配列の残りを含むことを強く示唆していた。 【００５１】クローン１及び２９からのｃＤＮＡインサ
ートは単離され、Ｍ１３ｍｐ１８にサブクローンされそ
してＥＣＧＦをエンコードする開放リーディングフレー
ム及び側面領域は、鎖成長停止法〔サンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ）ら「プロシ．ナツル．アカデ．サイ．ＵＳＡ」７
４：５４６３〜５４６７（１９７７）〕により配列が示
された。これらのクローンのヌクレオチド配列及び核酸
配列から導かれたアミノ酸配列を第８図に示す。ヌクレ
オチド配列を調べるとヒトＥＣＧＦをエンコードする４
６５個のヌクレオチドの開放リーディングフレームを明
らかにする。ヒトＥＣＧＦの１５５個のアミノ酸が、翻
訳停止コドンの側面に位置することが分かった。ｃＤＮ
Ａから導かれたヒトベータＥＣＧＦのＮＨ₂ 末端アミノ
酸はメチオニンであり、それは翻訳開始残基として働く
ものと思われる。初めの１５〜２０個のアミノ末端基の
比較的非疎水性とともに、これらのデータは、ヒトベー
タＥＣＧＦがＮＨ₂ 末端シグナルペプチドなしに合成さ
れることを強く示唆している。 【００５２】第３及び８図の比較は、トリプシン開裂ウ
シベータＥＣＧＦのアミノ末端アミノ酸配列並びにウシ
アルファＥＣＧＦのそれは、ラムダＥＣＧＦクローン１
及び２９のヌクレオチド配列から予想されるアミノ酸配
列と殆ど同じであることを示す。９５％以上の２種の間
の全体の同一性が観察される。 【００５３】ノーザンブロット分析（マニアチスら、同
上）は、ＥＣＧＦ ｍＲＮＡが２８Ｓ γＲＮＡととも
に泳動する単一の分子であることを明らかにしている
（第９図）。２８Ｓ γＲＮＡの評価された大きさの変
化を考えて、ＥＣＧＦ ｍＲＮＡの大体の大きさは４．
８±１．４ｋｂである。アルファ及びベータの両方のＥ
ＣＧＦの成熟した形をエンコードする配列のすべては、
ＥＣＧＦクローン１及び２９（それはともに約２．３ｋ
ｂを含む）内にエンコードされる。従って、これらのデ
ータは、領域５’及び側面に位置するＥＣＧＦエンコー
ディング配列が極めて大きい（約２．５±１．４ｋｂ）
を立証する。 【００５４】クローン１及びクローン２９からのｃＤＮ
Ａインサートは、ＥｃｏＲＩによる分解により切除さ
れ、そしてＥｃｏＲＩ部位でｐＵＣ８でサブクローンさ
れた。クローン１から形成されたプラスミドは、ｐＤＨ
１５と呼ばれ、そしてクローン２９から形成されたプラ
スミドｐＤＨ１４と呼ばれた。プラスミドは、アメリカ
ン・タイプ・カルチュア・コレクション、１２３０１パ
ークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ２０８５２に
寄託された。クローン１からのプラスミドのｐＤＨ１５
はＡＴＣＣ５３３３６とされ、クローン２９からのプラ
スミドのｐＤＨ１４はＡＴＣＣ ５３３３５とされた。 【００５５】従って、本実施例は、ヒト起源の他の蛋白
を本質的に含まないヒト内皮細胞成長因子を提供する実
験的な方法を記載している。 【００５６】ＥＣＧＦは、培養中の内皮細胞の成長及び
増殖に有用性がある。最近、細胞培養の用途のＥＣＧＦ
は、マシアグら〔「プロシ．ナツル．アカデ．サイ．」
７６：１１、５６７４〜５６７８（１９７８）〕プロト
コールによりウシの脳から抽出されている。この粗製ウ
シＥＣＧＦは、ヒトの臍静脈内皮細胞に対してミトゲニ
ックであり〔マシアグら「Ｊ．バイオロ．ケム．」２５
７；５３３３〜５３３６（１９８２）〕そして他のもの
からの内皮細胞についてもそうである。ＥＣＧＦ及びフ
イブロネクチンマトリックスによるヘパリンの利用は、
安定な内皮細胞クローンの成立を行わせる。生体外のミ
トゲンとしての使用に関するこの粗製ウシＥＣＧＦの推
薦される濃度は、成長培地１ｍｌ当り１５０ミクロｇで
ある。 【００５７】組換えＤＮＡ誘導ヒトＥＣＧＦは、それ
故、研究の目的でヒト内皮細胞及び他の間葉細胞の生体
外の培養において、粗製のウシＥＣＧＦの改良された置
換物としての用途を有する。コトＥＣＧＦは、両方の蛋
白のアミノ酸配列における高度の同一性のために、内皮
細胞の成長の相乗作用にウシＥＣＧＦと同じか又はそれ
よりも良いことが予想される。生体外の細胞の分化及び
成長を増強する予想される有効な投与量の範囲は、培養
培地１ｍｌ当り５〜１０ｎｇの精製されたＥＣＧＦであ
る。本明細書に示された如き組換えＤＮＡ技術を経るＥ
ＣＧＦの生成及びバージスら〔「Ｊ．バイオロ．ケ
ム．」２６０：１１３８９〜１１３９２（１９８５）〕
により記載された如き次の精製は、ヒトのホメスタチス
及びアンジオゲネシスのモデルを発展させるヒト起源の
多量の精製生成物（従来任意の量又は純度で入手不可
能）を提供するだろう。 【００５８】組換えＤＮＡから導かれたヒトＥＣＧＦ
は、又組織培養フラスコ又は瓶よりも人工器管上の細胞
の成長の増大に有用性がある。この器管は、装置への内
皮細胞の付着を助ける他の分子によりコーティングされ
ていてもいなくてもよい。これらの促進分子は、細胞外
マトリックス蛋白（例えばフイブロネクチン、ラミニン
又はコラーゲンの一種）、ヒト血清アルブミン、ヘパリ
ン又は他のグリコサミノグリカン又は不活性有機分子を
含みうる。内皮細胞は、培地中で有効量のＥＣＧＦを用
いてこれらの表面に培養され、最終的に内皮細胞の単層
により器管をカバーする。この器管は、次に人工器管上
に非トロンボゲン表面をもたらし、従って人工器管の植
え込みにともなう潜在的に生命をおびやかすトロンボゲ
ンの発生の危険を低下させる。 【００５９】ＥＣＧＦは、診断の応用に有用性を有す
る。シュライバー（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）ら〔「プロ
シ．ナツル．アカデ．サイ．」８２：６１３８（１９８
５）〕は、ウシＥＣＧＦについて二重抗体イムノアッセ
イを開発した。このアッセイにおいて、９５穴のポリ塩
化ビニルプレートをウサギ抗ＥＣＧＦによりコートし、
残りの結合部位を次に１０％正常ウサギ血清によりブロ
ックした。ＥＣＧＦのサンプルを次に穴に加えそしてイ
ンキュベートした。洗浄後ネズミモノクローナル抗ＥＣ
ＧＦを加えた。インキュベーション及び三、四回の洗浄
後、パーオキシダーゼとカップルされたウサギ抗マウス
Ｉｇ Ｇを加えた。反応生成物を、過酸化水素の存在下
Ｏ−フェニレンジアミンの転換後分光測光的に定量し
た。同様に考えられたイミノアッセイは、内皮細胞の成
長に影響する疾患状態のヒトＥＣＧＦレベルをモニター
するのに有用であろう。精製された組換えＤＮＡ誘導Ｅ
ＣＧＦは、未知のＥＣＧＦサンプルを定量する標準の試
薬として有用であろう。 【００６０】ＥＣＧＦは、又血管及び他の内皮細胞系構
造の再生又は損傷の治療に可能性がある。 【００６１】本発明は例示的な態様により限定されるも
のと考えられないことは理解されるべきである。本明細
書に開示された発明の概念から離れることなく、他の態
様を作成することは可能である。このような態様は、当
業者の能力の中にある。

【図面の簡単な説明】 【図１】図１はｃＤＮＡクローンを生成する酵素反応の
一般的な方法を示す。 【図２】図２はラムダｇｔ₁₁に挿入されるＤＮＡフラグ
メントを含むライブラリーの生成を示す。 【図３】図３はウシのアルファ及びベータＥＣＧＦの部
分的アミノ酸配列を示す。 【図４】図４は水素結合された塩基対の組み合わせを示
す。 【図５】図５はヒト内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）のた
めのオリゴヌクレオチドのプローブのデザインを示す。 【図６】図６はヒトＥＣＧＦ ｃＤＮＡクローン１及び
２９の概略図を示す。 【図７】図７はヒトＥＣＧＦ ｃＤＮＡクローン配列と
オリゴヌクレオチドプローブとの間の同一性を示す。 【図８】図８はヒトＥＣＧＦの完全なｃＤＮＡ配列を示
す。 【図９】図９はＥＣＧＦ ｍＲＮＡのノーザン・プロッ
ト分布を示す。

フロントページの続き (72)発明者 マイケル ジエイ アメリカ合衆国バージニア州 22204 アーリントン サウス セコンド スト リート 3017 (72)発明者 ウィルソン バーガス アメリカ合衆国メリーランド州 20879 ゲイザース バーグ シダー アベニ ュー 13 (72)発明者 トーマス マーシア アメリカ合衆国メリーランド州 20852 ロックビル バレリアン レーン 6050 (72)発明者 ウィリアム ドロハン アメリカ合衆国バージニア州 22151 スプリングフィールド パース コート 5232 (56)参考文献 特表 昭63−502725（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏ Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．101, （1985），Ｐ．1623〜1626 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．82，Ｎｏ．19, （1985），Ｐ．6409〜6413 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．260，（1985），Ｐ．11389〜11392 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 C12P 21/00 - 21/08 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト内皮細胞成長因子の完全なコード配列からなる
   ｃＤＮＡクローンであり、該内皮細胞成長因子が下記の
   （ｉ）及び（ｉｉ）からなる群から選ばれるアミノ酸配
   列からなる、ｃＤＮＡクローン。 （ｉ）ＮＹＫＫＰＫＬＬＹＣＳＮＧＧＨＦＬＲＩＬＰＤＧＴＶＤＧＴＲＤＲＳ ＤＱＨＩＱＬＱＬＳＡＥＳＶＧＥＶＹＩＫＳＴＥＴＧＱＹＬＡＭＤＴＤ ＧＬＬＹＧＳＱＴＰＮＥＥＣＬＦＬＥＲＬＥＥＮＨＹＮＴＹＩＳＫＫＨ ＡＥＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰＲＴＨＹＧＱＫＡＩＬＦＬＰ ＬＰＶＳＳＤ（α−ＥＣＧＦ）、 及び （ｉｉ）ＮＨ₂ −末端メチオニン残基を付加的に含む
   （ｉ）の配列。 ２．ヒト内皮細胞成長因子ｍＲＮＡによって定義される
   ヒト内皮細胞成長因子のコード配列に対して５’及び
   ３’に位置する非翻訳核酸を含有するｃＤＮＡであり、
   該内皮細胞成長因子が下記の（ｉ）及び（ｉｉ）からな
   る群から選ばれるアミノ酸配列からなる、ｃＤＮＡクロ
   ーン。 （ｉ）ＮＹＫＫＰＫＬＬＹＣＳＮＧＧＨＦＬＲＩＬＰＤＧＴＶＤＧＴＲＤＲＳ ＤＱＨＩＱＬＱＬＳＡＥＳＶＧＥＶＹＩＫＳＴＥＴＧＱＹＬＡＭＤＴＤ ＧＬＬＹＧＳＱＴＰＮＥＥＣＬＦＬＥＲＬＥＥＮＨＹＮＴＹＩＳＫＫＨ ＡＥＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰＲＴＨＹＧＱＫＡＩＬＦＬＰ ＬＰＶＳＳＤ（α−ＥＣＧＦ）、 及び （ｉｉ）ＮＨ₂ −末端メチオニン残基を付加的に含む
   （ｉ）の配列。 ３．ヒト内皮細胞成長因子をコードする配列を含むプラ
   スミドであり、該プラスミドはＡＴＣＣ ５３３３６と
   してアメリカン タイプ カルチャー コレクションに
   国際寄託されたプラスミドｐＤＨ１５であり、そして該
   内皮細胞成長因子が下記のアミノ酸配列からなる、プラ
   スミド。 ＮＹＫＫＰＫＬＬＹＣＳＮＧＧＨＦＬＲＩＬＰＤＧＴＶＤＧＴＲＤＲＳ ＤＱＨＩＱＬＱＬＳＡＥＳＶＧＥＶＹＩＫＳＴＥＴＧＱＹＬＡＭＤＴＤ ＧＬＬＹＧＳＱＴＰＮＥＥＣＬＦＬＥＲＬＥＥＮＨＹＮＴＹＩＳＫＫＨ ＡＥＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰＲＴＨＹＧＱＫＡＩＬＦＬＰ ＬＰＶＳＳＤ（α−ＥＣＧＦ）