JPH03502880A - 多数のペプチドアナログの産生方法及び新規ペプチドアナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多数のペプチドアナログの産生方法 及び新規ペプチドアナログ 本発明は多数のペプチドアナログの同時産生方法及び新規ペプチドアナログに関 する。本発明は特にＬｅｕ１７−ＶＩＰ　　（パンアクティブ・インテステイナ ル・ポリペプチド（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｏｌｙｐ ｅｐｔｉｄｅ）　）の個々のＣ末端伸長アナログ群の同時産生方法、Ｌｅｕ’− ＶＩＰの新規Ｃ末端伸長アナログ及び上記新規Ｌｅｕ’−１／ＩＰアナログにつ いてコードするＤＮＡ配列を有した遺伝子を含むプラスミドに関する。

背景 医薬産業及び独立研究者らは、有用な公知化合物とはわずかに異なる新規化合物 に関して更に強く更に特異的である等の誘導体を発見する目的で常に研究してい る。

目的の公知化合物がペプチド又はポリペプチドである場合には、そのアミノ酸配 列の１つ又はいくつかのアミノ酸残基は他の天然又は非天然アミノ酸残基で置き 換えられる。

スクリーニング目的の場合には、時間及び費用双方を節約するため選択されたペ プチドの多数のアナログを同時に産生じうろことが望ましい。

本発明はすべてのアミノ酸残基がＬ配置であるＬｅｕ’−ＶＩＰの多数のＣ末端 伸長アナログを同時に産生ずる方法を提供する。

従来技術 パンアクティブ・インテステイナル・ポリペプチド（Ｖ　Ｉ　Ｐ）はＣ末端アミ ドがグルカゴン−セクレチン群に属する高塩基性２８アミノ酸長鎖ペプチドであ る。

ＶＩＰは最初１９７０年〔セイド、　　Ｓ、　　１．　　（Ｓａｉｄ、Ｓ、１． ）及ＣＦ？−ｚ　ト、　　Ｖ、　　（Ｍｕｔｔ、Ｖ、）　　（１９７０年）サイ エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、第１６９巻、第１２１７−１２１８頁〕Ｓ。

セイド及びＶ、マットによりブタ上部腸組織から単離されたが、但しその後神経 組織及び内分泌細胞双方中でも発見された〔セイド、Ｓ、Ｉ、　　（１９８２年 ）パンアクティブ・インテステイナル・ペプチド、レイブン・プレス（１？ａｖ ｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）　、　：、−ヨーク及びセイド、Ｓ、Ｉ。

（１９８２年）ペブタイデス（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、第５巻、第１４３−１５０ 頁〕。ＶＩＰの生物学的効果としては大脳血管拡張、プロラクチン放出促進、膵 臓外分泌促進、ペニス勃起〔セイド、Ｓ、１．　　（１９８２年）パンアクティ ブ・インテステイナル・ペプチド、レイブン・ブレス７ニユーヨーク、ロステン 、　Ｗ、　　Ｈ，（Ｒｏｓｔｅｎｅ、Ｖ、）１．）（１９８４年）プログレス・ イン・ニューロバイオロジー（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｌｏｌｏ ｇｙ）、第２２巻、第１０３−１２９頁及びマット、Ｖ、　　（１９８３年）プ レイン・ベプタイデス（Ｂｒａｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、　　クリーガー、Ｄ 、Ｔ。

（Ｋｒｉｅｇｅｒ、Ｄ、Ｔ、）ら編集〕、コリン作動性刺激唾液流の増強〔ラン ドバーブ、　Ｊ、　Ｍ、　（ＬｕｎｄｂｅｒｇＪ、Ｍ、）ら（１９８２年）アク タ・フィジオロジカ・スヵンジナビ力（Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｌｏｌｏｇｌｃａ　 ５ｃａｎｄｌｎａｖｉｃａ）、第１１４巻、第３２９−３３７頁〕及び肺内にお ける界面活性剤としての作用〔バーネス、　　Ｐ、　　Ｊ、　（Ｂａｒｎｅｓ、 Ｐ、Ｊ、）ら（１９８７年）ＴＩＰＳ、第８巻、第２４−２７頁〕がある。

最近ヒトＶＩＰについてコードする前駆遺伝子が単離されかつ配列決定された〔 ボドナー、　Ｍ、　（Ｂｏｄｎｅｒ、Ｍ、）ら（１９８５年）プロシーディング ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃｅ ｅｄｌｎｇ　ｏｆ’Ｎａｔ１ｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃ１ｅｎｃｅ 　ＵＳＡ）　、第８２巻、第３５４８−３５５１頁及びリンダ−、Ｓ、　（Ｌｊ ｎｄｅｒ、Ｓ、）ら（１９８７年）プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８４巻、第６０５−６０９頁〕。配列デー タによれば、ＶＩＰについてコードする遺伝子の３′　−末端にアミノ酸配列ｃ ＋ｙ−Ｌｙｓ−＾「ｇについてコードする更に３つのトリブレットが存在するこ とを示しているｃａｃ末端Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｌｙｓ−Ａ　ｒｇ又はＧｌｙ　ｊｌ独は 様々な組織中で検出されるペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ （ＰＡＭアーゼ）によるＣ末端アミド化の基質部位として作用することが示され た〔ブラッドベリー、Ａ−Ｆ、　　（Ｂｒａｄｂｕｒｔ、＾、Ｆ、）ら（１９８ ２年）ネーチ−？　−（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９８巻。

第６８６−６８８頁、エイバー、　Ｂ、　Ａ、　（ＥＩｐｐｅｒ、Ｂ、＾、）ら （１９８３年）ベブタイデス、第４＠、第９２１−９２８頁、グレムボトスキー 、　　Ｃ，Ｃ，（Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ、Ｃ。

Ｃ，）ら（１９８４年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＣｈｅＩＩｉｓｔｒｙ）　。

Ｗ＆２５９巻、第６３８５−６３９２頁、ゴメス、Ｓ。

（Ｇｏｉｅｚ、Ｓ、）ら（１９８４年）フエデレーション・オブ・ヨーロピアン ・バイオケミカル・ソサエティーズ・レターズ（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｃｈｅｉｊｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓＬｅｔｔｅｒ ｓ）、第１６７巻、第１６０−１６４頁、エイパー。

Ｂ、　Ａ、　　ら（１９８５年）エンドクリノロジー（ＥｎｄｏｃｒｌｎｏＩｏ ｇＹ＞　、第１１６巻、第２４９７−２５０４頁及びウアフィック、Ｈ８（Ｏｕ ａｆｉｋ、）１．）ら（１９８７年）プロシーディング・オブ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８４巻、第２６１−２６４頁〕。

広域生物活性のペプチドホルモンＶＩＰ及びそのアナログの遺伝子工学法による 大規模産生が望ましいことは明らかである。ＶＩＰに関するヒト前駆遺伝子は単 離かつ特徴付けられたが〔ボドナー１Ｍ、ら（１９８５年）プロシーディング・ オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８２巻、第３５４ ８−３５５１頁及びリンダ−２Ｓ、ら（１９８７年）プロシーディング・オブ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８４巻、第６０５−６０ ９頁〕、他の生物中でのその発現についてはまだ報告されていない。

本発明のＣ末端伸長Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログは大腸菌内で産生された。

発明の記載 本発明の一面において、Ｌｅｕ’−ＶＩＰ　（バソアクティブ・インテステイナ ル・ポリペプチド）の個々のＣ末端伸長アナログ群の同時産生方法が提供される が、上記群は下記アミノ酸配列を有する同鎖長ペプチド：Ｈｉ　５−５ｅｒ−Ａ ｓ　ｐ−Ａ　１　ａ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｘ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｙ−−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｌｙ ｓ−Ｔ’ｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−工１ｅ−Ｌｅｕ−〔上記式中ＸはＴｈ ｒ　、　Ｓｃｒ　、　Ｐｒｏ又はＡｌａを表す；ＹはＴｈｒ　、　Ｌｙｓ　、　 ｌｌｃ又はＡｌａを表す；ＺはＴｈｒ　ｓ　Ｌｙｓ　、　Ｉｌｅ又はＡｒｇを表 す；及びＷはｃｒｙ又はＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを表す〕及びＬｅｕ’−ＶＩＰ −Ｖ２”アナログであってかつ本方法を実施した場合に変異から生じる同鎖長ペ プチドからなる。上記方法は下記ステップを含む： 合成に際してＬｅｕ’−ＶＩＰの７及び１４位におけるアミノ酸残基についてコ ードするトリプレットが不確定に作られかつ３′末端にいくつかの同一塩基を有 する同鎖長オリゴヌクレオチドの第一混合物を同時に合成する；合成に際してＬ ｅｕ１７−ＶＩＰの２０位におけるアミノ酸残基についてコードするトリブレッ トが不確定に作られかつ３′末端にいくつかの同一塩基を有する同鎖長オリゴヌ クレオチドの第二混合物を同時に合成する（これらは第一混合物中におけるオリ ゴヌクレオチドの３′末端でいくつかの塩基と相補的である）； 上記第一混合物を上記第二混合物と混合し、それによって第一混合物のオリゴヌ クレオチドの３′末端におけるいくつかの塩基が第二混合物のオリゴヌクレオチ ドの３′末端におけるいくつかの塩基とアニーリングして部分的二重路間鎖長Ｄ ＮＡ配列の混合物を生じさせ、しかる後完全二重鎖ＤＮＡ配列に酵素変換する； ３′末端に第−酵素開裂部位及び５′末端に第二酵素開裂部位を有する二重鎖Ｄ ＮＡ配列の上記混合物を同時又は連続的に第−及び第二酵素による開裂に付して 、同様に開裂されたベクターの５′及び３′末端に結合可能な３′及び５′末端 のあるＤＮＡ配列を製造する；こうして開裂されたＤＮＡ配列をこうして開裂さ れたベクターに結合挿入してベクターの混合物を製造し、しかる後それ自体公知 の方法で宿主に組み込んで形質転換させる； 上記宿主を増殖させてコロニーを形成し、これを１つずつ分析して単一タンパク 質についてコードするＤＮＡ配列を確立し； 同定されたタンパク質コード配列（そのＣ末端部分は個々のＬｅｕ１７−ＶＩＰ −ｗ２”アナログに相当する）を有するベクターを含む宿主を発現条件下で別々 に増殖させ、しかる後別々に発現されたタンパク質が開裂されて上記個々の同鎖 長ペプチド群を形成するＣ末端Ｌｅｕ’−ＶＩＰ−Ｗ２９アナログを放出させる 。

ＷがＧｌｙを表す本発明のこの面の一態様において、本方法を実施した場合に変 異から生じるＬｅｕ１７−ＶＩＰ−１２９アナログは以下である： Ａｌａ−Ａｓｎ　　−Ａｒｇ　　−ＶＩＰ−Ｇｌｙ　　。

ＷがＧ　ｌ　ｙ−Ｌｙｓ−＾「ｇを表す本発明のこの面のもう１つの態様におい て、本方法を実施した場合に変異から生じるＬｅｕ’−ＶＩＰ−Ｖ２９アナログ は以下である：５ｅｒ７−Ｔｈｒ１４（１ｅ２０−Ｖａ　１２６−ＶＩＰ−Ｇｌ ｙ２９−Ｌｙｓ３０−Ａｒｇ３１゜上記方法で用いられる宿主の例は例えばバチ ルス（Ｂａｃｉ　ｌ　ｌυＳ）属の細菌又は大腸菌及び酵母、例えばサッカロミ セスーセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で ある。上記方法で用いられるベクターの例はバクテリオファージ及びプラスミド である。

本発明のこの面の好ましい態様において、ベクターはプラスミド、宿主は大腸菌 である。

本発明の方法の上記好ましい態様を実施した結果として多数のＣ末端伸長Ｌｅｕ ’−ＶＩＰアナログが産生されるが、これは本発明のもう一面を形成する。

このため本発明のもう一面では、下記アミノ酸配列を有するペプチドからなる群 より選択されるＬｅｕ’−ＶＩＰのＣ末端伸長アナログが提供される： Ｈｉ　５−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａ１　ａ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈｅ−Ｘ−Ａｓ　ｐ−Ａ ｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｙ−−Ｌｙｓ−Ｇ　１　ｎ−Ｌｅｕ− Ａ　ｌ　ａ　−Ｖａ　１−　Ｚ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｉ 　１　ａ−Ｌｅｕ−〔上記式中ＸはＴｈｒ　５Ｓｅｒ　ｓ　Ｐｒｏ又はＡｌａを 表す；ＹはＴｈｒ　、Ｌｙｓ　、　ｌｉｅ又はＡｌａを表す；２はＴｈｒ　ｓ　 Ｌｙｓ　、　ｌｉｅ又はＡｒｇを表す；及びＷはＧｌｙ又はＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ ｒｇを表す〕（本方法から得られかつ最初に産生されるよう計画された）並びに ＷがＧｌｙを表す同一アミノ酸配列を有したＬｅｕ１７−ＶＩＰのアナログ： 但しＸ−Ａｌａ　、　Ｙ−！ｌｅ及びＺ−Ｔｈｒである場合１位の旧ＳはＡｓｐ で置換されている、 但しＸ＝Ｐｒｏ　、　Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ−Ｌｙｓである場合１位の旧ＳはＴｙｒ で置換されている、 但しＸ−Ｔｈｒ　、　Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ−Ｔｈｒである場合２位のＳｅｒはＴｙ ｒで置換されかつ８位のＡｓｐはＴｙｒで置換されている、 但しＸ　−Ｔｈｒ　、Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ−Ａｒｇである場合３位のＡｓｐはＧｌ ｙで置換されている、 但しＸ＝Ｔｈｒ、Ｙ−Ａｒｇ及びＺ−Ｔｈｒである場合４位のＡｌａはＰｒｏで 置換されている、 但しＸ　−Ｔｈｒ　、　Ｙ−Ｔｈｒ及びＺｍＬｙｓである場合５位のＶａｔはＰ ｈｅで置換されている、 但しＸ−Ｔｈｒ、Ｙ−Ａｒｇ及びＺ−Ａｒｇである場合８位のＡｓｐはＡｓｎで 置換されている、 但しＸ−Ｐｒｏ　、　Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ−Ｌｙｓである場合８位のＡｓｐはｃｒ ｙで置換されている、 但しＸ＝Ｐｒｏ　、Ｙ−１１ｅ及びＺ−Ａｒｇである場合８位のＡｓｐはＧｉｎ で置換されかつ１９位のＶａｌはＰｈｅで置換されている、 但しＸ−５ｅｒ　、Ｙ−１１ｅ及び２−＾「ｇである場合８位のＡｓｐはＰｒｏ で置換されている、 但しＸ−Ａｌａ　、　Ｙ＝Ｌｙｓ及びＺｍＬｙｓである場合１１位のＴｈｒはＰ ｒｏで置換されている、但しＸ−Ｐｒｏ　、Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ＝Ｔｈｒである場 合１２位のＡｒｇはＰｒｏで置換されている、但しＸ＝Ｔｈｒ　、　Ｙ−Ｌｙｓ 及びＺ−１１ｅである場合１５位のＬｙｓはＡｓｎで置換されている、但しＸ− Ｐｒｏ　、Ｙ−１１ｅ及びＺ−Ｌｙｓである場合１５位のＬｙｓはＡｒｇで置換 されている、但しＸ−Ａｌａ　、　Ｙ−Ｌｙｓ及びＺ−Ａｒｇである場合１５位 のＬｙｓはＧｌｎで置換されている、但しＸ−＾１ａ、Ｙ−１１ｅ及びＺ−Ｌｙ ｓである場合１５位のＬｙｓはＴｈｒで置換されている、但しＸ−Ｔｈｒ　、Ｙ −Ｌｙｓ及びＺｗＬｙｓである場合１６位のＧｌｎは旧Ｓで置換されている、 但しＸ＝Ｐｒｏ　、Ｙ−１ｉｅ及びＺ−Ｔｈｒである場合１６位のＧｌｎは旧Ｓ で置換されている、 但しＸ＝Ｔｈｒ　、　Ｙ−１１ｅ及びＺ＝ｌｌｅである場合１９位のＶａｌはＰ ｈｅで置換されている、但しＸ−Ｐ　ｒｏ　５Ｙ−Ｔｈ　ｒ及びＺ−Ｔｈｒであ る場合２４位のＡｓｎはＬｙｓで置換されている、但しＸ＝Ｓｅｒ　、Ｙ−Ｌｙ ｓ及びＺ＝Ｔｈｒである場合２４位のＡｓｎはＩｌｅで置換されている、但しＸ −Ｔｈｒ　、Ｙ−Ａｒｇ及びＺ−Ｌｙｓである場合２８位のＡｓｎはＡｓｐで置 換されている、Ｙ　＝　Ｌｙｓ及びＺ−Ｌｙｓである場合Ｘ−Ｇｌｙ、及びＹ− Ａｓｎ及びＺ−Ａｒｇである場合Ｘ　−Ａｈａ〔これらのアナログはＶＩＰに関 して下記のように命名することができるニ ア　　　　１４　　　２０ Ａｌａ　−Ａｓｎ　　−Ａｒｇ　　−ＶＩＰ−Ｇｌｙ２９］（本発明の方法の好 ましい態様の１つのランを実施した場合に変異体として生じる）並びに ＷがＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを表す同一アミノ酸配列を資したＬｅｕ１７−ＶＩ Ｐのアナログ： 但しＸ−Ｐｒｏ　、Ｙ＝Ｔｈｒ及びＺ−＾「ｇである場合２位のＳｅｒはＰｈｅ で置換されている、 但しＸ　−Ｔｈｒ　、　Ｙ−Ｌｙｓ及びＺｍ！Ｉｅである場合３位のＡｓｐはＶ ａｔで置換されている、 但しＸ−Ｔｈｒ　、　Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ−Ｌｙ５である場合４位のＡｌａはＰｒ ｏで置換されている、 但しＸ−Ｐｒｏ　、Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ−１１ｃである場合５位のＶａｌはＰｈｃ で置換されている、 但しＸ−Ａｌａ　、　Ｙ＝Ｔｈｒ及びＺ−Ｔｈｒである場合６位のＰｈｅはＴｈ ｒで置換されている、 但しＸ　−Ｔｈｒ　、Ｙ＝Ｔｈｒ及びＺ−Ｔｈｒである場合８位のＡｓｐはＶａ ｔで置換されている、 但しＸ　＝　Ｐ　ｒｏ　％　Ｙ　＝　Ｔｈ　ｒ及びＺ−Ｌｙｓである場合１１位 のＴｈｒはＰｒｏで置換されている、但しＸ−Ｐｒｏ　５Ｙ−１１ｅ及びＺｍＡ ｒｇである場合１１位のＴｈｒはＰｒｏで置換されている、但しＸ−Ｔｈｒ　、 Ｙ−Ｌｙｓ及びＺｍＡｒｇである場合１３位のＬｅｕは＾「ｇで置換されている 、但しＸ−Ｐｒｏ　、　Ｙ−Ｌｙｓ及びＺ−Ｌｙｓである場合１３位のＬｅｕは Ｇｉｎで置換されている、但しＸ　＝　Ｐ　ｒｏ　％　Ｙ　−Ｔｈｒ及びＺ−Ｔ ｈｒである場合１３位のＬｅｕはＰｒｏで置換されている、但しＸ−Ｐｒｏ　、 　Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ−Ａｒｇである場合１３位のＬｃｕはＰｒｏで置換されてい る、但しＸ　−９ｅｒ　、　Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ＝Ｔｈｒである場合１３位のＬｅ ｕはＡｒｇで置換されかつ１５位のＬｙｓはＧｉｎで置換されている、 但しＸ−Ｐｒｏ　５Ｙ−Ｌｙｓ及びＺｍＡｒｇである場合１５位のＬｙｓはＧｌ ｎで置換されている、但しＸ−９ｅｒ　、　Ｙ−Ｌｙｓ及びＺ−＾「ｇである場 合１５位のＬｙｓはＡｓｎで置換されている、但しＸ＝Ｔｈｒ　、Ｙ−Ｌｙｓ及 びＺ−Ｌｙｓである場合１９位のＶａｔはＡｓｐで置換されている、但しＸ−Ｔ ｈｒ　、　Ｙ−Ｌｙｓ及びＺ−Ｔｈｒである場合１９位のＶａｌはＧｌｙで置換 されている、但しＸ−Ｔｈｒ　、Ｙ−Ｔｈｒ及びＺ−ＩＩｓである場合２４位の ＡｓｎはＡｓｐで置換されている、但しＸ　−Ａｌａ　、　Ｙ＝ＩＩｃ及びＺ− Ａｒｇである場合２４位のＡｓｎはＡｓｐで置換されている、但しＸ−５ｅｒ　 、　Ｙ−１１ｅ及びＺ−Ｔｈｒである場合２４位のＡｓｎはＬｙｓで置換されて いる、但しＸ−Ｐｒｏ　、Ｙ−ｌｉｅ及びＺ−Ｔｈｒである場合２５位のＳｅｔ はＴｙｒで置換されている、及び但しＸ−３Ｃｒ　、　Ｙ＝Ｔｈｒ及びＺ−１１ ｅである場合２６位のＩｌｃはＶａｌで置換されている 〔これらのアナログはＶＩＰに関して下記のように命名することができる： （本発明の方法の好ましい態様の第二〇ランを実施した場合に変異体として生じ る） 本発明のＣ末端伸長Ｌｅｕ１７−ＶＩＰアナログにおけるすべてのアミノ酸残基 はＬ配置である。

本発明のもう１面において、本発明のＣ末端伸長Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログにつ いてコードするＤＮＡ配列を存する遺伝子を含んだプラスミドが提供される。

本発明のすべてのＣ末端伸長Ｌｅυ１７−ＶＩＰアナログは天然ヒトＶＩＰと同 様の性質の他にも共通した一部の有用な性質を有し、即ちそれらはＶＩＰレセプ ターにおけるリガンドであって、それらは酸化に抵抗して（ロイシンによる天然 ＶＩＰ１７位メチオニンの置換に基づき）溶液中酸性ｐＨに保つことができ、し かもそれらがＣ末端伸長であるためそれらはインビトロ及びインビボ双方で長期 効果を示すが、これはＶＩＰの極端に短い生物学的半減期からみて有利であると 考えられる。

このため本発明のＣ末端伸長Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログは新規医薬及び（皮膚の 保湿用）化粧品中における有効活性成分として有用である。

新規医薬は １）一般に喘息及び上部気道の収縮の治療用、特に肺における血管拡張用； ２）特にペニス勃起用に局所適用される末梢血管拡張剤として； ３）ＶＩＰ産生腸腫瘍（水５〜１５ｇ／日の貞失によりヒトの死を起こすＶＩＰ 産生腸腫瘍）の治療用：４）血流、血圧、腸運動及び膀胱に関する疾患の治療用 ； ５）（例えば、抗精神病剤又は抗うつ剤の投与による）例えば阻止又は低下され た唾液分泌治療用の唾液分泌増強用；及び ６）膵液分泌の促進用； に投与される予定である。

活性成分を含有した医薬の組成は意図される投与経路及び治療される具体的疾患 に依存している。喘息が治療される場合には経鼻又は経口スプレーが適切である 。経口投与用の水性溶液又は錠剤は他の適応症に適している。

すべてのタイプの医薬において、活性成分は調剤分野で常用される薬学上許容し うる賦形剤及び／又は希釈剤と混合される。

大腸菌発現ベクターでクローニングされたＬｅｕ’−ＶＩＰアナログコードＤＮ Ａ配列を得るための遺伝子計画Ｃ末端伸長Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログについてコ ードする多数の人工遺伝子は、１回のみのクローニングステップを実施すること により大腸菌プラスミド発現ベクターの一部として直接得られるよう計画された 。合成計画では多数の人工大腸菌プロモーター誘導体を得るため最初に記載され た方法〔シモンクシッツ、　Ａ、　　（Ｓｉｍｏｎｃｓｉｔｓ、Ａ、）　。

カルマン、　Ｍ、　（ＫａｌＩＩａｎ、Ｍ、）　、　　クセルバン、Ｊ。

（Ｃｓｅｒｐａｎ、　Ｊ、）及びカリ、　　Ｃ，（Ｋａｒｌ、Ｃ，＞　　（１９ ８４年）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ・シンポ・セル（Ｎｕｃｌｅｌｃ　 Ａｃ１ｄｓ　ｔ？ｅｓ、ｓｙｍｐ、ｓｅｒ、）　、第１４巻、第３２１頁〕の原 理を利用した。簡単には、２種の一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが化学 的に合成され、それらの３′末端相補配列を介してアニーリングされた〔イタク ラ、に、、（１９８２年）ＴＩＢＳ、第７巻。

第４４２頁〕。こうして得られた部分的二本鎖は全Ｌｅｕ’−ＶＩＰコード領域 をカバーしており、クローニングに用いられる追加の末端配列を含んでいた。２ 種のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、４種すべての活性化ヌクレオチドモノ マーの混合物がアニーリング領域の外側におけるある既定位置で（即ち、Ｌｅｕ Ｉ７−ＶＩＰのアミノ酸残基７，１４及び２０についてコードするトリブレット で）用いられるようあいまいな化学合成によって得られた。アニーリングされた 部分的二本鎖はＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ断片）で行われる相互プライム化 合成によってすべての可能なホモ二本鎖を含む二本鎖ＤＮＡ混合物に変換された 。次いでこれらは２種の異なる制限エンドヌクレアーゼで開裂され（それらの開 裂部位はＬｃｕ’−ＶＩＰコード領域の上流及び下流に位置する）、開裂された 混合物は適切な開裂発現ベクターｐＰＥＸと結合された。結合された混合物はコ ンピテント大腸菌に組み込まれて形質転換され、Ｌｅｕ１７−ＶＩＰ関連コード 配列含有組換え体がコロニーハイブリッド形成により選択された。陽性組換え体 はクローン化Ｌｅｕ１７−ＶＩＰコード領域中で得られた具体的変異を確認する ためヌクレオチド配列決定で更に分析された。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドのデザインに際しては、それらはＬｅｕ’ −ＶＩＰコード領域に先立つメチオニン及びカルボキシ末端におけるＧｌｙ（Ｖ ＩＰａアナログ）又はＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　（Ｖ　Ｉ　Ｐ　ｂアナログ）伸 長部ニラいてコードするべきであると考えられた。メチオニンはＣＮＢ　ｒ開裂 により融合タンパク質からＬｅｕ’−ＶＩＰアナログを放出しうるように含まれ るが、一方力ルボキシ末端伸長部はペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシ ゲナーゼ（ＰＡＭアーゼ）により触媒されるアミド化の基質部位として役立つ〔 ブラッドベリー、　Ａ、　　Ｆ、　、フィニー、　Ｍ、　Ｄ、　　Ａ、　　（Ｆ ｉｎｎｉｅ、Ｍ、Ｄ、＾、）及びスミス、Ｄ。

Ｇ、　（Ｓｉｙｔｈ、Ｄ、Ｇ、）　（１９８２年）ネーチャー、第２９８巻、第 ６８６頁〕。ヌクレオチド配列内における混合化学カップリングの位置は、経路 １で示されたステップを実施した後最大数のアミノ酸バリエーションがＸ、Ｙ及 びＺに関して得られるよう既決ＸＳＹ及びＺコドンに位置するものが選択された 。混合位置として漂的コドンの第一（コドンＸに関する）又は第二（コドンＹ及 びＺに関する）塩基を選択することにより、４種のアミノ酸が３つの各コドンバ リエーションに関して得られるため、発現後に全部で６４の可能なＬｅｕ１７− ＶＩＰアナログを得ることができる。

経路１で部分的アニーリング二本鎖の土踏として示されたＶＩＰＩオリゴヌクレ オチドは２つの混合値ｆ＆　（Ｎ）を有するが、一方下鎖ＶＩＰ２オリゴヌクレ オチドは１つ有するだけである。ＶＩＰ’ｌ！オリゴヌクレオチドは上記のよう にＣ末端伸長部に関する情報を有した２つのバリエーションで製造された（経路 １中ＶＩＰ２ａ及びＶＩＰ２ｂオリゴヌクレオチド）。ＶＩＰａ及びＶＩＰｂ双 方のアナログを得るため、２つの別の実験がＶＩＰ１＋ＶＩＰ２ａ又はＶＩＰ１ ＋ＶＩＰ２ｂ、ｔｌＪゴヌクレオチドを各々用いて行われた。

クレノウボリメラーゼ反応で得られた二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　？ａ合物はホモ二本鎖 分子を含むが、これは発現ベクターに組み込んでクローニングすることにより分 離された。原則的に、すべての組換え体は具体的Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログにつ いてコードする１タイプのみの変異遺伝子を含有しているべきである。

ｐＰＥＸベクター ｐＰＥＸとは我々によりｐｐｉ：ｘと命名されたｒａｃ融合〔ボロス、　　Ｊ、 　　（Ｂｏｒｏｓ、Ｊ、）、ルカクソピッチ、Ｔ。

（Ｌｕｋａｃｓｏｖ！ｃｈ、Ｔ、）、バリコ、　　Ｇ、　　（Ｂａｌｌｋｏ、Ｇ 、）及びベネチアナー、　　Ｐ　、　（ＶｅｎｅＬｉａｎｅｒ、Ｐ、）　　（１ ９８６年）ジーン（Ｇｅｎｅ）、第４２巻、第９７頁〕プロモーターベクターＬ α　ｉｎｔ　　２３から組立てられた高度に効果的な大腸菌発現ベクターである 。ｒａｃプロモーターコントロール下で大腸菌β−ガラクトシダーゼの２８０ア ミノ酸及び細菌ＣＡＴ　（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ） の一部から構成される融合タンパク質を発現するＬα　ｉｎｔ　　２３ベクター は、その唯一のＢ　ａ　ｍ　Ｈ１部位を削除しかつｃｌａｌ及びＥｃｏＲ１部位 間に位置するそのＣＡＴコード領域を合成ポリクローニング領域に代えることに より修正された。こうして得られたｐＰＥＸベクターの関連領域は経路２で示さ れている。本ベクターはポリクローニング領域に唯一のＢａｍＨｒ、Ｋｐｎ　Ｌ 　Ｓａｃ　１、Ａｐａ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ部位を有し、β−ガラクトシダーゼ遺 伝子融合はＢａｍＨＩ及び他の唯一部位のいずれかを用いて行うことができる。

Ｌｅｕ’−ＶＩＰコード遺伝子がｐＰＥＸベクターのＢａｍＨｌ及びＥｃｏＲ１ 部位に組み込まれてクローニングされた場合、得られた融合遺伝子は各々３１４ 及び３１６アミノ酸鎖長のβ−ガラクトシダーゼ−ＶＩＰａ及びβ−ガラクトシ ダーゼ−ＶＩＰｂ融合タ融合タンパク−てコードしているが、それらのタンパク 質中２８４アミノ酸は融合パートナ−に由来する（経路１）。

例 Ｌｅｕ１７−ＶＩＰアナログについてコードするＤＮＡ領域の混制限酵素及びＴ ４ＤＮＡリガーゼはニューイングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から得た。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びクレノウボリメラーゼはベーリンガ−（Ｂｏ ｅｈｒｌｎｇｅｒ）製、（７−”２Ｐ）　ＡＴＰ（＞　５０００　ＣＩ／ｍｍｏ ｌ）及びＣａ−３２Ｐ）ｄＡＴＰ（＞　８００　Ｃ１／ｌｌｌ１ｏｌ）はアマ− ジャム（Ａｍｅｒｓｈａａ）製であり、ＢＳＡ−ＶＩＰ複合体に対するウサギ抗 血清はバー・アスケロフ博士（Ｄｒ、Ｐｅｒ　Ａｓｋｅｌｏｆ）　（Ｓ　Ｂ　Ｌ 　、　　ストックホルム、スウェーデン）から提供された。抗つサギＩｇＧ−ア ルカリホスファターゼ複合体及び発色試薬ＢＣＩ　Ｐ／ＮＢＴを含有したイムノ プロットアッセイキットはパイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から購入した。

ＴＩＲＮアーゼはカルビオケム（ＣａｌｂｉｏｃｈｅＩＩ）から購入した。

オリゴデオキシリボヌクレオチド ＣＣＧＧ　ＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＴＣＴＧＡ　ＣＧＣＴＧＴＴＴＴＣＮＣＴ Ｇ　ＡＣＡ　ＡＣＴＡ　ＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧＡＮ＾＾＾＾ＣＡＧＣＴＧＧＣＴ 　　（Ｖ　Ｉ　Ｐ　］オリゴヌクレオチド）ＡＡＧ＾＾ＴＴＣＡＧＣＣＧＴＴＣ ＡＧ　ＧＡＴＡＧ　Ａ　ＧＴＴＣＡ　ＧＧＴＡＣＴＴＴＮＴＡ　Ａ　ＣＡ　ＧＣ ＣＡ　ＧＣＴＧＴ（ＶＩＰ２ａオリゴヌクレオチド）ＡＡＧＡＡＴＴＣ＾＾ＣＧ ＴＴＴＧＣＣＧＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＡＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＴＴＮＴＡＡＣ ＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴ　（Ｖ　Ｉ　Ｐ　２　ｂ　オリゴヌクレオチド）及びＣＡ ＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣ（ｌ　ａ　ｃ　　Ｚ　　 ２７７−プライマー） オリゴヌクレオチドをホスホルアミダイト化学〔ファルマシア舎ジーン・アセン ブラ− （Ｐｈａｒｍａｅｊａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ））により自動ＤＮＡシ ンセサイザーで製造し、８Ｍ尿素含有ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に より精製した。オリゴヌクレオチドはそれらがハイブリッド形成プローブ又は配 列決定ブライマーのいずれかとして用いられる場合Ｔ４ポリヌクレオチドキナー ゼを用いることにより〔γ−”２Ｐ）ＡＴＰで５７−ホスホリル化させた〔マニ アティス、Ｔ。

（Ｍａｎｉａｔｅｓ、Ｔ、）　、　　フリッチュ、　　Ｅ　、　　Ｆ　、　　（ Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、）及びサンプルツク、　　Ｊ、　（Ｓａｏ＋ｂｒｏｏ ｋ、Ｊ、）　　（１９８２年）モレキュラー・クローニング：実験マニュアル、 コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 ）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、　コールド・スプリング・ハーバ −、ニューヨーク〕。

ＶＩＰＩオリゴヌクレオチド１００ｐａ＋ｏｌを水５０．ｃｌ中でＶＩＰ２ａ又 はＶＩＰ２ｂオリゴヌクレオチドのいずれか１００ｐＩＩｏｌと混合し、混合物 を９０℃で３分間保ち、約１時間かけて室温まで冷却させた。溶液をｐＨ８，２ の１０ａ＋ＭトリスーＨＣｌ、５　ｗＭｈｉｌ　ｇ　Ｃ１２、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ Ｐ及びＴＴＰ各５０μＭ、〔α−３２Ｐ〕ｄＡＴＰ　（約６２．　５ｐＩＩｏｌ ）　５　ｕｎ並びに５Ｕ／μＪｌ！クレノウボリメラ一ゼ１μｇを含有した１０ ０μｇに調製した。１５分間後１ａ＋ＭｄＮＴＰ混合物（全部で４種のデオキシ ヌクレオチド５′−三リン酸を含有）１０Ｐｇを加え、溶液を室温で１５分間イ ンキュベートした。ＤＮＡを１０ｐｇ／ｕｎ酵母キャリアｔＲＮＡ　（ｃ　ｔＲ ＮＡ）１μｇの補助でエタノール沈降により沈降させ、１０％アクリルアミド− ８Ｍ尿素ゲル電気泳動により４００Ｖで２時間精製した（ゲル厚０．４ｍｍ）。

ゲルをラジオオートグラフィーに付し、主放射能バンドを切出し、５０ｄＮａＣ １−０，１％ＳＤＳ溶液３００　ｕｌに３７℃で１２時間浸漬した。上澄をフェ ノール抽出し、沈降を液体窒素浴中１０ｕｇ／ｌｔＤ　ｃ　ｔＲＮＡｌ、ｃｌ、 ｐＨ５，２の３Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ３０ｕρ及びエタノール９００μＪを加えて行 った。遠心（１４，０００ｒｐｍ、３分間）により放射性ペレットを得、これを エタノールで洗浄し、乾燥し、無菌水に溶解した。

上記のようにして得た放射性Ｌｅｕ１７−ＶＩＰ−ＤＮＡ　２０　ｐｏ＋ｏｌを １００ａ＋ＭＮａＣ１、ｐＨ７，，５の５０＋ａＭトリスーＨＣ１−１０ｉＭＭ 　ｇ　ＣＩ　２．１　ｍＭＤ　Ｔ　Ｔの２００μｇ（高塩緩衝液）中３７℃で２ ０時間ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ各２００単位で処理した。反応混合物を６０℃ で１０分間加熱し、フェノール抽出しく２回）、ＤＮＡを上記エタノール沈降（ ２回）により水相から回収し、しかる後エタノールで洗浄し、乾燥し、無菌水に 再溶解した。１０％アクリルアミド−８Ｍ尿素電気泳動による混合物の分析では 二本鎖の約５０％のみが開裂され、双方の酵素で開裂されたＤＮＡの分画が約３ ０％のみであることを示した。それにもかかわらず混合物をそのままＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ開裂ｐＰＥＸベクターに組み込んでクローニングするため用いた。

ｐＰＥＸ１３　２μｇを高塩緩衝液２０μΩ中３７℃で４時間ＢａｍＨＩ及びＥ ｃｏＲＩ　１０−１０単位で処理した。反応混合物をアガロースゲル（０，５％ ）に供し、電気泳動をＴＡＥ緩衝液（４０ａ＋Ｍトリスー酢酸、ｐＨ７，５の２ ｄＥＤＴＡ）生臭化エチジウム存在下６０Ｖで１時間行った。直鎖ベクターバン ドを切出し、エレクトロエリュージョンに付しくｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ） 　、２回フェノール抽出し、エタノール沈降させ、エタノールで洗浄し、乾燥し た。ペレットを無菌水に溶解した。

上記のようにして得たＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ開裂ｐＰＥＸベクター０．２μｇ 及びＢａｍＨＩ−Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　Ｌｅｕ１７−ＶＩＰ−ＤＮＡ５　ｐｏｏｌ をｐＨ７，５の５０ｍＭトリス−ＨＣ１，１０ＩＩＩＭＭｇＣ１２，１０ｍＭＤ ＴＴ、１ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ８０単位を含有した反応混合物 ２０μｇ中１５℃で１２時間反応させた。反応混合物をＪＭＩＯＩ大腸菌細胞 〔遺伝子型（ｓｕｐＥ、ｔｈｉ。

Δ　（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）　　、　（Ｆ’　　ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、１ ａｃｌｑＺΔＭ１５））メッシング。

Ｊ　（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）、フレア、　Ｒ，（Ｃｒｃａ、Ｒ，）及びシーバ ーブ、　　Ｐ、　Ｈ，（Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ，）　（１９８１年）ヌクレイ ツク・アシッズ・リサーチ、第９巻、第３０９−３２１頁〕に凍結ストック〔ハ ナハン、　Ｄ、　　（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、）、　　ＤＮＡクローニング、第１ 巻、グローバー、　Ｄ、　Ｍ、　（Ｇｌｏｖｅｒ。

Ｄ、Ｍ、）　Ｗ菜、ＩＲＣブレス・リミテッド（ＩＲｃ　ＰｒｅｓｓＬｉｔｉＬ ｅｄ）　　（１９８５年）、第１０９−１３５頁、プロトコール３〕を用いて組 み込み形質転換させた。アンピシリン耐性コロニーを３２Ｐ標２Ｖ　Ｉ　Ｐ　１ オリゴヌクレオチドプローブでコロニーハイブリッド形成〔グランスタイン、　 Ｍ、　　（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、）及びホグネス、Ｄ、Ｓ。

（Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、Ｓ、）　（１９７５年）プロシーディング・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ。

第７２巻、第３９６１−３９６５頁〕に関して選択した。

コロニーの約８０〜９０９６はＶＩＰａ及びＶＩＰｂ変異体の双方に関してこの 試験で陽性であった。−双方の系の１２０コロニーをプラスミド製造及び配列決 定用に取出した。

プラスミド製造及び配列決定 単一コロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地３ｍｌに播種し、培 地を３７℃で１２〜１６時間振盪した。プラスミドＤＮＡを迅速なアルカリ抽出 操作で製造した〔バーンボイム、　Ｈ，Ｃ，（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，）及 びドリー、　　Ｊ、　（Ｄｏｌｙ、Ｊ、）　　（１９７９年）ヌクレイツク・ア シッズ・リサーチ、第７巻、第１５１３−１５２３頁〕。

プラスミドＤＮＡをｐＨ８，０の１０１トリス−ＭＣＩ。

１ｉＭＥＤＴＡ含有溶液１００μｇ中３７℃で３０分間ＴＩＲＮアーゼ５単位で 更に処理し、しかる後フェノール抽出及びエタノール沈降した。ペレットを無菌 水３０μｇに溶解した。

ジデオキシヌクレオチド配列決定は〔ホン、　Ｇ、　　Ｆ。

０１ｏｎｇ、Ｇ、Ｐ、）　　（１９８２年）バイオサイエンス・リボーツ（Ｂｉ ｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）、第２巻、第９０７頁で〕記載のようにｓ ′、−３２ｐ−ホスホリル化１ａｃ　　Ｚ　　２７？−配列決定ブライマー（０ ，２５ｐｃｏｌ）及び熱変性を用いてＨｉｎｄｌｎ直鎖化プラスミド鋳型（０， ２〜０゜４μｇ）上で行った。２４クローンに関する配列決定反応も同時に行っ た。

ｐＰＥＸ　！、ｅｕ’−ＶＩＰアナログプラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ ＩＯＩ細胞を０．　１ｇ＋ｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地１ｍｌ中２５　Ｏ ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた。細胞密度がＡ−６００ｎｏ＋で０． ５に達したとき、細胞をＩ　ＰＴＧの添加（最終濃度’２．　５ｔｓＨ＞及び３ ７℃、２５０ｒｐ１１で４時間の振盪によるか又はラクトースの添加（最終濃度 １％）及び２５　Ｏｒｐｍで２０時間の振盪のいずれかで誘導した。誘導後細胞 をエッペシドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｒ）遠心機中１２０００ｒｐＩｍで１分間 の遠心により回収し、溶解緩衝液（ｐＨ６，８の０．１２５Ｍトリス−ＭＣＩ、 ：３０％グリセロール、２％ＳＤＳ。

６Ｍ尿素及び１Ｍ２−メルカプトエタノール）３００μｇ中１００℃で３分間か けて溶解させ、非誘導抽出液３０μｇ及び誘導抽出液３０μｇをレムリ、　　Ｕ 、　　Ｋ。

（Ｌａｅａ＋ｍｌｉ、Ｕ、に、）　（１９７０年）ネーチャー、第２２７巻。

第６８０−６８５頁に従い５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル上でランさせ て、ゲルのクマシープリリャントブルー染色で示されるタンパク質発現の程度を モニターした。ゲルから評価されるように、発現融合タンパク質の量は全細胞タ ンパク質の６０％以上であった。

β−ガラクトシダーゼ−Ｌｅｕ’−ＶＴＰアナログの免疫学的認識／検出 非誘導サンプル６μｇ及び５０倍希釈誘導サンプル６μｇをパラレルに５ＤＳ− １０％ポリアクリルアミドゲル上でランさせ、ゲルの半分をクマシーブリリャン トブルーで染色し、ゲルの他の半分をニトロセルロース紙上でエレクトロプロッ トした（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｄ）。プロットされたニトロセルロース紙 をＢＳＡ−ＶＩＰに対する抗体を含有したポリクローナルウサギ血清と共にイン キュベートし、イムノプロットを製造者の指示に従いヤギ抗つサギＩｇＧ複合化 アルカリホスファターゼ及びＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色溶液（バイオ−ラッドイムノ アッセイキット）による処理で展開した。非常に強い免疫染色を融合タンパク質 含有Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログに関して得た。

発現されたβ−ガラクトシダーゼ−Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログ融合タンパク質の １ｇ規模精製 ｐ　Ｐ　Ｅ　Ｘ　Ｌｅｕ１７−ＶＩＰアナログプラスミドを有する大腸菌ＪＭＩ ＯＩ細胞を０，１■／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地１ｍｌ中３７℃で振盪した （２５Ｏｒｐｍ　）　ｏ　６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達したとき、細 胞をラクトース（最終濃度１％）で誘導し、３７℃、２５　Ｏｒｐｍで２０時間 振盪した。誘導後細胞を４℃、２０００Ｘｇで１０分間遠心により回収し、ｐＨ ７，６のＴＢＳ４０ｍｌで洗浄し、１０ＩＩＩＮＰＭＳＦ及び０．５ｇＭＥＤＴ Ａ含有ＴＢＳ３０ｍｌに再懸濁した。次いで細胞懸濁液を凍結解凍し、ブランラ ン（Ｂｒａｎｓｏｎ）超音波機で超音波処理しく５回の１分間破壊）、シかる後 ４℃、１７０００Ｘｇで３０分間遠心した。融合タンパク臂含有ベレットをゴデ ル、　　Ｄ、　　Ｖ、　　（Ｇｏｅｄｄｃｌ、Ｄ、Ｖ、）う（１９７９年）ＰＮ ＡＳ（ＵＳＡ）、第７６巻、第１０６−１１０頁に従い１％２−メルカプトエタ ノール含有６Ｍ塩化グアニジウム５０ｍ１中でホモゲナイズし、６００００Ｘｇ で６０分間遠心した。融合タンパク賞を含有した透明コハク色上澄を６Ｍ塩化グ アニジウム−１％２−メルカプトエタノールで１００ｍ１まで希釈し、ＴＢＳ１ ７２ｍｌを激しい攪拌下で滴下して融合タンパク質のほとんどを沈降させ、その 一方で宿主タンパク質のほとんどを溶液中に残留させた。スラリーを１０℃、１ １００００Ｘで３０分間の遠心前に室温で３０分間攪拌した。こうして得られた ベレットはβ−ガラクトシダーゼ−Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログ融合タンパク質の ほとんどを含有している。

融合タンパク質のＣＮＢｒ開裂 部分的に精製されたβ−ガラクトシダーゼ−Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログ融合タン パク質を７０％ギ酸２５ｍ１中にホモゲナイズで溶解させ、ＣＮＢｒ１．５ｇを 沈降物１ｇ当たりで加えた。溶液を室温で７０時間攪拌し、しかる後ロータベー パー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）を用い減圧下室温で蒸発させた。メタノール中５０ ｇＭＭ　Ｃ１２０ｍｌを残渣に融合タンパク質１ｇ当たりで加え、室温で一夜攪 拌した。次いでスラリーを４℃、２０００Ｘｇで１０分間遠心し、上澄を回収し た。

Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログ含有上澄を１）−凍結乾燥し、Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナ ログ含有残渣を１％ＴＦＡに溶解し、ＨＰＬＣ（ＣＩＢ−ボンダバック（Ｂｏｎ ｄａｐａｋ）、逆相）で精製するか又は２）ＨＰＬＣステップ前に下記のような 次の精製に付した；−Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナログ含有含有酸性メタノール面体Ｎ 　ａ　Ｃ１（０，２ｇ／ｍｌ）及び４倍容量の水冷ジエチルエーテルを加えた。

沈降物（Ｌｅｕ１７−ＶＩＰアナログ含有）を焼結ガラスロート（孔径Ｎα３） で回収し、ＩＭ酢酸５ｍｌによる洗浄で溶解させた。溶解されたＬｅｕ１７−Ｖ ＩＰアナログをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　２５カラム（７０長 、２ｃｍ径）で脱塩し、１％ＴＦＡで溶解前に凍結乾燥し、ＨＰＬＣ上１％ＴＦ Ａ中２０〜４０％アセトニトリル直線勾配で精製した。Ｌｅｕ’−ＶＩＰアナロ グを３３％アセトニトリルで溶出させた。次いで精製されたＬｅｕ’−ＶＩＰア ナログを生化学及び生物アッセイ系で試験した。

例：　Ｖ　Ｉ　Ｐ　ａ　（Ｘ−Ｔｈｒ、Ｙ−Ａｒｇ、Ｚ　−Ｌｙｓ、Ｗ−Ｇｌｙ 　）融合タンパク質β−ガラクトシダーゼ−ＶＩＰａを０．１■／　ｍｌアンピ シリン含有ＬＢ培地１ｇ中で発現させ、前記のように精製した。融合タンパク質 をＣＮＢ　ｒで開裂し、こうして得られたＶＩＰａを前記のように更に精製し、 下記アッセイ系で試験した：１）ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）２）ラジオ レセプターアッセイ ３）　３’　、　　５’　　一環式Ａ　Ｍ　Ｐ産生の促進４）インビボでネコに おける炭酸水素分泌１）ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）ベニンジュラ・ラボ ラトリーズ （ＰｅｎｎｌｎｓｕＩａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　　（Ｕ　Ｓ　Ａ　）か ら購入したＶＩＰ−ＲＩＡキットにおいて、組換えＶＩＰａは製造者の推薦に従 いファーレンクラッグ、　　Ｊ、　　（Ｐａｈｒｅｎｋｒｕｇ。

Ｊ、）及びシャツアリトッキ−・デ・ムカデル、０゜（Ｓｃｈａｆｆａｌｆｔｚ ｋｙ　Ｄｅ　Ｍｕｃｋａｄｅｌｌ、０．）　　（１９７７年）ジャーナル・オブ ・ラボラトリ−・アンド・クリニカル・メデイシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＬａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　ａｎｄ　ＣｌｉｎｉｃａｌＭＣｌｌｎｉｃａｌ　、第８９巻 、第１３７９−１３８８頁の方法に基づき測定した場合ＶＩＰとして認識される 。

２）ラジオレセプターアッセイ ラジオレセプターアッセイをラット大脳皮質由来膜上でクロラミン−Ｔヨウ素化 １２５１−　Ｖ　Ｉ　Ｐ　（ハルテン。

Ｇ、　（Ｈａｔ！ｄｅｎ、Ｇ、）ら（１９８６年）レジ・ペブ（Ｒｅｇ、Ｐｅｐ 、）、第１６巻、第１８３−１８８頁〕を濃度０．５ｎＭで用いて行い、アベン ス、　　Ｊ、　　（Ａｂｅｎｓ、Ｊ、）ら（１９８４年）ベブタイデス、第５巻 、第３７５−３７７頁で記載されるようにブタ腸由来精製ＶＩＰ及び大腸菌由来 組換えＶＩＰａによる標識ＶＩＰの置換について試験した。組換えＶＩＰａの親 和性はブタ腸から精製されたＶＩＰの場合と同一の実験誤差範囲内、即ち平衡状 態で１．５〜１．８ｎＭのＫｄ値であったが、但し組換えＶＩＰａはＶＩＰレセ プターにおける窩アフィニティリガンドであり、他の起源から得られたＶＩＰの 場合と識別しえない程度に結合した。

３）　３’　、　　５’　　一環式Ａ　Ｍ　Ｐ合成の促進ラット大脳皮質組織片 中における３’　、　　５’　　一環式Ａ　Ｍ　Ｐ　（ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ　）合成 のブタから精製されたＶＩＰ及び組換えＶＩ　Ｐａによる促進に関して試験し、 ２）の結果によるとＶＩＰレセプターのリガンドである組換えＶＩＰａが作動剤 又は拮抗剤として挙動するのか否かについて確立した。実験は下記のように行っ た：ラット大脳皮質片（０，４ｍｍＸ０．４ｍｍ）をクレブス・リンガース（Ｋ ｒｅｂｓ　Ｒｌｎｇｅｒｓ）炭酸水素緩衝液中で前インキュベートし、１０ｍＭ テオフィリン（ホスホジェステラーゼ阻害剤）存在下３６℃で６０分間０２／Ｃ ０２（９５％１５％）　（Ｖ／Ｖ）を吹き込んだ。次いで組織片をブタＶＩＰの 場合濃度１０．５０．１１００ｎ、１及び１０μＭで１０分間並びに（１）で評 価された）組換えＶＩＰａの場合濃度１０．５０．１００及び３００ｎＭで１０ 分間にわたり総容１１６００μρ中でインキュベートした。インキュベートをＥ ＧＴＡ　（１００ｍＭ）溶液１５０μｇの添加で終結させ、しかる後試験管を沸 騰水浴中に３分間おいた。ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ含有率をブラウン、Ｂ。

Ｌ、　（Ｂｒｏｖｎ、Ｂ、Ｌ、）ら（１９７２年）アドバ・サイクル・ヌクレ・ リサ（＾ｄｖ、ｃｙｃｌ　、Ｎｕｃｌ、Ｒｅｓ、）、第２巻、第２５−４０頁に 従い測定した。その結果は、１０分間のインキュベート時間で組換えＶＩＰａが ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐレベルを増加させ、このためＶＩＰの生理作用を媒介すると考え られるＶＩＰレセプター結合アデニル酸シクラーゼにおいて作動剤として作用す ることを示している〔ロステン、Ｗ。

Ｈ，（Ｒｏｓｔｅｎｅ、Ｗ、Ｈ，）　（１９８４年）ブログレ・ニューロバイオ ｏ　（Ｐｒｏｇｒ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　、）、第２２巻、第１０３−１２９頁 参照〕。

４）ＶＩＰａの生物活性 組換えＶＩ　Ｐａの生物活性をマットＶ、及びソーダーバーブ、　Ｕ、　（Ｓｏ ｄｅｒｂｅｒｇ、Ｕ、）　（１９５９年）アーキブ・ケム（Ａｒｋｌｖ　Ｋｅｔ ｘ）　、第１５巻、第６３−６８頁に従いネコ膵臓からの炭酸水素分泌促進に関 してもインビボアッセイで試験した。

組換えＶＩＰａ　（１６μｇ注入）はこのアッセイでブタＶＩＰと比較し約７０ ％有効であった。

組換えＶＩＰｂはこのアッセイにおいて同様の濃度で試験した場合少なくともブ タＶＩＰと同じくらい有効であった。

Φ　　　＝　　　　　　　＼ 国際調査報告 ｌａｍＩＩｍ＋＋＠＋ｕｕ＾ｅ−１−（ｓ１１＠ｌｌ５＝、ＰＣＴ／ＳＥａ８１ ００６９６

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｌｅｕ１７−ＶＩＰ（バソアクティブ・インチステイナル・ポリペプチド） の個々のＣ末端伸長アナログ群の同時産生方法であって、上記群が下記アミノ酸 配列を有する同鎖長ペプチド： 【配列があります】 〔上記式中ＸはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＡｌａを表す；ＹはＴｈｒ、Ｌｙｓ 、ｌｌｅ又はＡｌａを表す；ＺはＴｈｒ、Ｌｙｓ、ｌｌｅ又はＡｒｇを表す；及 びＷはＧｌｙ又はＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを表す〕及びＬｅｕ１７−ＶＩＰ−Ｗ ２９アナログであってかつ該方法を実施した場合に変異から生じる同鎖長ペプチ ドからなり、該方法が下記のステップで特徴付けられる方法：合成に際してＬｅ ｕ１７−ＶＩＰの７及び１４位におけるアミノ酸残基についてコードするトリプ レットが不確定に作られかつ３′末端にいくつかの同一塩基を有する同鎖長オリ ゴヌクレオチドの第一混合物を同時に合成する；合成に際してＬｅｕ１７−ＶＩ Ｐの２０位におけるアミノ酸残基についてコードするトリプレットが不確定に作 られかつ３′末端にいくつかの同一塩基を有する同鎖長オリゴヌクレオチドの第 二混合物を同時に合成する（これらは第一混合物中におけるオリゴヌクレオチド の３′末端でいくつかの塩基と相補的である）； 上記第一混合物を上記第二混合物と混合し、それによって第一混合物のオリゴヌ クレオチドの３′末端におけるいくつかの塩基が第二混合物のオリゴヌクレオチ ドの３′末端におけるいくつかの塩基とアニーリングして部分的二重鎖同鎖長Ｄ ＮＡ配列の混合物を生じさせ、しかる後完全二重鎖ＤＮＡ配列に酵素変換する； ３′末端に第一酵素開裂部位及び５′末端に第二酵素開裂部位を有する二重鎖Ｄ ＮＡ配列の上記混合物を同時又は連続的に第一及び第二酵素による開裂に付して 、同様に開裂されたベクターの５′及び３′末端に結合可能な３′及び５′末端 のあるＤＮＡ配列を製造する；こうして開裂されたＤＮＡ配列をこうして開裂さ れたベクターに結合押入してベクターの混合物を製造し、しかる後それ自体公知 の方法で宿主に組み込んで形質転換させる； 上記宿主を増殖させてコロニーを形成し、これを１つずつ分析して単一タンパク 質についてコードするＤＮＡ配列を確立し； 同定されたタンパク質コード配列（そのＣ末端部分は個々のＬｅｕ１７−ＶＩＰ −Ｗ２９アナログに相当する）を有するベクターを含む宿主を発現条件下で別々 に増殖させ、しかる後別々に発現されたタンパク質が開裂されて上記個々の同鎖 長ペプチド群を形成するＣ末端Ｌｅｕ１７−ＶＩＰ−Ｗ２９アナログを放出させ る。
2. ２．ＷがＧｌｙを表し、本方法を実施した場合に変異から生じるＬｅｕ１７−Ｖ ＩＰ−Ｗ２９アナログが：【配列があります】 である、請求項１に記載の方法。
3. ３．ＷがＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを表し、本方法を実施した場合に変異から生じ るＬｅｕ１７−ＶＩＰ−Ｗ２９アナログが：【配列があります】 である、請求項１に記載の方法。
4. ４．ベクターがプラスミド、宿主は大腸菌である、請求項１〜３のいずれか一項 に記載の方法。
5. ５．下記アミノ酸配列を有するペプチド：【配列があります】 〔上記式中ＸはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＡｌａを表す；ＹはＴｈｒ、Ｌｙｓ 、ｌｌｅ又はＡｌａを表す；ＺはＴｈｒ、Ｌｙｓ、ｌｌｅ又はＡｒｇを表す；及 びＷはＧｌｙ又はＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを表す〕並びに 【配列があります】 及び 【配列があります】【配列があります】及び【配列があります】 （上記においてすべてのアミノ酸残基はＬ配置である）からなる群より選択され ることを特徴とするＬｅｕ１７−ＶＩＰのＣ末端伸長アナログ。
6. ６．Ｌｅｕ１７−ＶＩＰのＣ末端伸長アナログについてコードする遺伝子を含む プラスミドであって、請求項５で記載されるＬｅｕ１７−ＶＩＰのＣ末端伸長ア ナログについてコードするＤＮＡ配列で特徴付けられるプラスミド。