JPS60501989A - インシュリン様成長因子の微生物発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 “インシュリン様成長因子の微生物発現背景 これは１９８３年８月１０日に出願した同時係属出願である米国特許ＮＯ，５２ Ｌ９６６の一部継続出願である。

この発明は一般に、遺伝子材料の操作に関するものであり。

より詳細には、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩと、このポリペプチド類似 体の微生物発現を得んがための組み換衣操作法において有用な特定のＤＮＡ配列 の製造に関するものである。

インシュリン様成長因子［０ＧＦ−１）およびインシュリン様成長因子ＴＩ　（ ［ＧＦＩＩ）は構造的に関連のある。天然に存在し。

ヒト血清中でみられるポリペプチドである。（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ。

Ｅ、ｅＬ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　（１１，ｓ、八、）　、Ｖｏｌ、７３＋　Ｔｌ ａｇｅＳ　２３６５−２３６９　（＋９７６）〕。ＩＧＦ−１は、３つのジスル フィド橋で交差結合し、推定分子量７６４９の７０個のアミノ酸残基からなる華 鎖ポ”リペプチドである。ＩＧＦ−１１は、３つのジスルフィド橋で交差結合し 、推定分子量７４７１の６７個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。

が構造的に同族であり２両者ｔまヒトプロインシュリンＧこ構造的に類イ以して いる。（Ｈｉｎｔｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏ↓ｏｇｙ−ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ−ｏ１ｉｓｍ＋　ｓｏ、　ｐａｇｅｓ　４０５ 〜４０７．　（１９８０）　）。

ＩＣＦ−］　とＩＧＦ−ＩＩは、それらの生物活性と成長ホルモン依存性にもと づいて“ソマトメジン類”に分類されて０る。この゛ツマＩ・メジン類は小ペプ チド類の１族で、ソマトメジンＡ、゛ツマトメジンＣ，インシュリン様成長因子 ■および＋１．および増加刺激活性因子を含んでいる６ＩＧＦ−ＴはツマＩ−メ ジンＣと同一であると指摘している報告が相当数ある（Ｖａｎ　Ｗｙｋ、　Ｊ、 　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｃ１１ｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、＋５０＋　ｐａｇｅｓ　 ２０６〜２０８　（１９８０）　；Ｈｉｎｔｚ、　Ｒ，Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ、　Ｃ１１ｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、　５０＋　ｐａｇｅｓ　 ４０５〜４０７　（１９８０）　）。ソマトメジン類は３つの王たる特徴を共有 している。すなわち、これらは比較的分子の大きい担体タンパク質と結合して循 環しているようで５かつ、その由来は、何らかの腺というよりは、少なくとも一 部は肝にある。限定された研究から、腎のような他の組織もまた。ソマトメジン を分泌することを指摘している。

ソマトメジン類は成長に必須の数多い生物機能を有している。

ソマトメジン類は、抗インシュリン抗体により抑制できない。

脂肪および筋に対する同化インシュリン様作用を有している。

ソマトメジン活性とインシュリン作用との間の高い相関性はフィンシュリンがソ マトメジン類を介して成長に貢献している点を示唆している。これらの成長促進 効果には、細゛胞増加冗進ならびに軟骨増殖の刺激、アミノ酸移送の刺激、　Ｒ ＮＡ、、　ＤＮＡおよびタンパク質の合成、および硫酸基のプロテオグリカンへ の移入ならびにプロリンのコラーゲンへの移入があげられる。はとんどの哺乳類 の出生後の成長は、ソマトメジン類による軟骨成長の刺激によるものであり、子 宮内での成長もやはり、ソマトメジンに依存することがある。（Ｐｈｉｌｌｉｐ ｓ、　Ｌ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＋Ｖｏ１．３０２＋　ｐａｇｅｓ　４３８−４４６　（ Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１９８０））。

ソマトメジン類はまた。アミノ酸と糖の移送およびグルコースの筋グリコーゲン への移入を刺激する作用をもも、このとき。

ソマトメジン類はインシュリンと一般に同等の働きを有している。脂肪組織では 、ソマトメジン類は、糖移送、グルコースの二酸化炭素への酸化、および脂質へ の移入および基礎およびエピネフリン刺激性脂質分解の阻止を刺激するものであ る。

姥・′＋：所見から、成長、Ｆルモ、・・作用の標的生成物としてのソマトメジ ン類；よ成長ホルモ／分泌に対と７で陰性フィー　トハノク効果を有するという 仮説が導かれている。ソマトメジン類の低濃度は、クツ／オルコル、　Ｌａｒｏ ｎ型小人症１肝疾患、および新生児、こおいて、成長ホルモンの高濃度と共存し ている。ソマトメジン類は成長ホルモン欠乏症では非常に低濃度であり、濃度は 特発性成長ホルモン欠乏症では変動する。部分的成長ホルモン欠乏症の小児は完 全欠乏症と比へて濃度が高い、ソマトメジン類の４度上昇の原因は、アグロメガ リー、脳下垂体巨人症、青年朋、ツマトメノン耐性症候群、および肥満症があけ られる。

このため、ソマトメジン定量は成長にともなう疾患の診断および成長ホルモン関 連灰色の治療効果をモニターするうえて有用な場合がある。

循環中のソマトメジン類は、簡易性、精密度および信頼性の異なる各種の化学お よび免疫学的分析法で定量することができる。特に１分析手法は、均一のソマト メジンおよび／または抗ツマトメノン抗体の標準物質がないところから、特異性 と感度も変動する。

明らかに、　ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１１（ならびにそのポリペプチド類似体 以体）のような大量のソマトメジン類があれば、ヒトおよび動物にみられる成長 制御の生化学機構の解明を目的とした研究を容易にすること多大である。さらに 、　ＩＧＦ−１およびＩＩを大量に合成により生成することにより、創傷の治癒 のような治療過程の研究と同様に、脳下垂体性小人症のような成長欠乏状態の長 訓込］釘−ｏ研究および治療を可能にするであろう。

ソマトメジン類は、大量の血漿や血清から非常に少量しか単離されていない。単 離過程における主な問題は、最初に酸性エタノールで抽出後、これらペプチドの 収量を増加する点にある。

ｊＰｈｉｌｌｉｐｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｙ　Ｅｐｇ±リ−←Ｊ、、−Ｍｅｄ、 、３ｑ’；ｑ、ｐａｇｅｓ　３７１〜３８０　（１９８０）　）　６最近、　＋ ＧＦ−１に対するモノクローナル抗体がハイフリドーマ法で生成された。（Ｌａ ｕｂｌｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　−Ｆ↓」１Ｓ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　４９．　ｐ ｐ、　１０９−１１２　（１９８０）　）　。七ツクローナル抗体を用いて血清 からＩＧＦ−１を単離しようとする試みがなされたが、　ｊＧＦ−Ｉ　とＩＧＦ −１１との分離には至っていない。これは、おそらく、最初のＩＧＦイミュノジ ェンの不純物、あるいはＩＧＦ−１とＩＧＦ−ＩＩの両方に共通の抗原決定因子 に対するモノクローナル抗体の特異性によるものであろう。　Ｌａｕｈｌｉ＋　 ｅＬ　ａｌ、＋　仰起１ｒこより詳述され１こ親和性精製法でも同様に、非タン パク質由来の大量の不純物が生成した。最後に、　＋ＧＦ−１の全ての化学合成 を実施しようとした試みは、純粋化合物が数置が低いという結果に終わった。［ Ｌｉ、　ｅｔ　ａｌ、、叩於弛」）、靭、　、ｐａｇｅｓ　２２１６〜２２２０ 　（１９８３）を参照のこと〕。

製造のための遺伝子組換え法（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅ）。

ＩＧＦ４およびＩＧＦ−ＩＩに対する構造上の遺伝子のクローニングおよび発現 を利用法が、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　ｙ　Ｎｅ１１ｓ、　Ｖｏｌ、　３＋　 Ｎｏ、　ｉｏ＋ｐａｇｅｓ　］　−３（Ｍａｙ　１５．１９８３）に掲載され、 王として多数の外部タンパク質の酵母分泌を取り扱った文献で示唆されている。

明らかに、各種の構造の遺伝子が製造され、あるいはｃＤＮＡ法で得られ、クロ ーンされ、さらに酵母アルファ因子前駆遺伝子の冒頭配列に結合された。遺伝子 合成法や、この分泌生成物の純度、収量あるいは生物活性の分析に関して何ら詳 細は明らかでなかった。同様に、当該ＩＧＦ　−１およびＩＩのポリペプチドＭ （Ｕ体についても詳述されていない。

このため、純粋な、生物活性のあるＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１１およびそのポ リペプチド類似体の大規模製造に用いる十分に操業可能な方法および材料Ｑこつ いての技術の必要性が継続的に叫ばれている。

この発明により供与されているものは１選別された宿主微生物におけるヒトイン シュリン様成長因子Ｉおよびインシュリン様成長因子ＩＩの合成を指示できる生 成遺伝子である。生成遺伝子の望ましい形態においては、塩基配列には、特定の 宿主微生物、すなわち、Ｅ、　ｃｏｌｉ　のコドンに対して特徴的な優先的発現 にもとづいた同アミノ酸を特定する代替的コドンから選別された１つ以上のコド ンがふくまれている。製造遺伝子の他の望ましい形態にはＥ、　ｃｏｌｉ菌（た とえば、最初のＭｅｔ残基）にみられる直接発現を容易にするエラコード化され たポリペプチド内の追加のアミノ酸残基を特定する塩基コドンが供与されている ものが含まれる。さらに製造遺伝子の他の望ましい形態においては、所望のポリ ペプチドを特定する塩基コドンの配列は１発現ベクトルの形成あるいはポリペプ チド類似体の新規の構造遺伝子、すなわち、この構造遺伝子の１つまたは両方の 上の、あるいはその中の中間の位置の選別された！Ｉｌ限エンドヌクレアーゼ開 裂に供与される塩基の配列、についての生成を容易にする塩基の１つ以上の配列 を含むものである。

この発明により、同様に供与されているものには：　（１）　１つ以上のアミノ 酸残基（たとえば、ＣＴｈｒ５９）　ＩＧＦ−１および〔Ａｒｇ”　Ａｒｇ５５ ）　ＩＧＦ−ＩＩ）の定性および／あるいは部位に関してインシュリン様成長因 子と異なったインシュリン様成長因子ポリペプチド類似体の微生物発現を指示で きる製造遺伝子、および（２）インシュリン様成長因子ポリペプチドあるいはイ ンシュリン様成長因子類偵体を含む融合ポリペプチドの微生物発現を可能にする 方法で第２のポリペプチドの合成を指示できる第２遺伝子に融合している。この 発明にしたがった製造遺伝子から成る融合遺伝子を指す。

ポリペプチド生成物を生成するためのこの発明の実施にあたり、製造ＤＮＡ配列 は、ハイブリ、ドベクトルを形成するためにウィルス性あるいは円形プラスミｙ トＤＮへベクトルにインサートされ、このハイブリソトベクトルは、細菌（たと えば　ム」ｏｌｉ　）あるいは酵母細胞のような宿主微生物を転換するために利 用される。この後、転換微生物は適当な栄養状態で培養され。

この発明のポリペプチド生成物を発現するものである。

この発明の他の観点および特徴は、この発明に関する次の詳細な説明を考慮する ことにより明らかになる。

詳細な説貝 ここで用いられているように、“製造”とはｌ）ＮΔ配列または遺伝子について のもので、ヌクレオチド塩基の組合せにより完全に化学合成されたか、あるいは 、このように化学合成された生成物の生物学的複製から派生した生成物のいずれ かを指す。

これ自体、この用語は、ｃＤＮＡ法あるいは最初から生物由来の出発材料を用い たゲノムクローニング法により“合成された”生成物を包括するものである。

次の略語は本明細書でアミノ酸を指すものとして用いる。すなわち、アラニン、 　Ａｌａ　；　アルギニン、　Ａｒｇ　；　アスパラギン、　Ａｓｎ　；　アス パラギン酸、Ａｓｐ；ンステイン、　Ｃｙｓ　；グルタミン、　Ｇｉｎ　；　グ ルタミン酸、　Ｇｌｕ　；　クリシン、　Ｇｒｙ；　ヒスチジン、　Ｈｉｓ　； 　イソロイノン、　Ｉｌｃ　；　ロイツン。

ｌｅｕ　；　リジン＋　Ｌｙｓ　；　メチオチン、　Ｍｅｔ　；　フェニルアラ ニン、　Ｐｈｅ　；　プロリン、　Ｐｒｏ　；　セリン＋　Ｓｅｒ　；　スレオ ニン、Ｔｈｒ；ｌ−リプトファン、　Ｔｒｐ　；　チロシン＋　Ｔ　！／　ｒ　 ；　バリン、　Ｖａｌ、次の略語はヌクレオチット塩基に用いられる：ずなわち 、Ａはアデニン；　Ｇはクアニン；　Ｔはサイミン；Ｕはウラシル；およびＣは サイトシン。

この発明の理解を助けるために５次の表１は、　ＤＮＡの６４個の交互の３重の ヌクレオチット塩基コドンと２０個のアミノ酸およびそれらによる記述終止じ停 止”）機能の間にある表のうえでの相関関係を示すものである。

紅 第１部位　第２部位　第３部位 ＣＡＧ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｃ Ｔ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏｐ　５ｔｏｐ　ＡＬｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏｐ　Ｔｒ ｐ　ＧＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｔ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｃ ＣＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　ＡＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　’Ｇ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃ Ａ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＡＭｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇａｙ　Ｔ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃ Ｇ　Ｖａｌ　八ｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＡＶａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ この発明による構造遺伝子の製造は望ましくは、“構造遺伝子の製造および発現 ”と称したＹｉｔｚｈａｋ　５ｔａｂｉｎｓｋｙによる。さらに、これは当該操 作法の段階を詳述する目的で引用文献として採用されているが、　１９８２年５ 月６日に出願された。共同所有権を有し、同時係属出願の米国特許申請Ｎｏ、　 ３７５，４９３で開示された方法により実施されるものである。

次の実施例は、　ＩＧＰ−Ｉ、’ＩＧＦ４１およびそのポリペブチＦ類偵体の微 生物発現にコード化したＤＮＡ配列の製造における。この発明の実施を例示した ものである。同時に例示したものは、所望のポリペプチドの直接発現および所望 のポリペプチドを含む下記実施例は、この発明にしたがった構造遺伝子を製造す るために用いるオリゴヌクレオチド断片の合成に用いられる一般的操作法に関す るものである。

実施例１ オリゴヌクレオチド断片は、３段階操作法および数回の中間洗浄を用いて合成し た。焼結ガラスロート内のポリマー結合ジメトキシトリチル保護ヌクレオチドは 最初にジクロロメタン内に１１重２分間１通した３％トリクロロ酢酸を用いて２ その５゛−保護基（ジメトキシトリチル）を除去した。次にこのポリマーをジク ロロメタン、メタノールおよびアセトニトリルで洗浄した。この洗浄ポリマーを さらに乾燥アセトニトリルでリンスし、アルゴン下に静置し、さらに次の縮合操 作により処理した。

１０■テトラゾールのアセトニトリル溶液の０．５ｍｌをポリマーを含有してい る反応容器に加えた。次に３０■保護ヌクレオチドフオスクオルアミジトのアセ トニトリル溶液の０．５ｍｌを加えた。

この反応を２分間、進めた２反応物を吸引除去し、さらにポリマーをアセトニト リルでリンスした。これを酸化操作に付した。

すなわち、０．１モルＩ２の２−６−ルチジン／水／ＴＨＦ、　１　：　２　： 　２溶液を含有する溶液１ｍｌをポリマー結合オリゴヌクレオチド鎖と２．５分 間９及応させた。メタノール、　ＴＨＦ、およびジクロロメタン洗浄に続き、こ のサイクルを、トリクロロ酢酸のＣＨｚＣｌ　Ｔ８液とともに再度、くり返した 。このサイクルを、所望のオリゴヌクレオチド配列が得られるまで、（り返した 。

最終のオリゴヌクレオチド鎖を室温で、チオフェノール　ジオキサン、トリエチ ルアミン　１：２：２で４５分間、処理した。

次に、メタノールおよびジエチルエーテルでリンスした後、このオリゴヌクレオ チドを室温で、濃縮アンモニアにより、同ポリマーから開裂した。同ポリマーか ら溶液をデカントした後７濃縮子ンモニア溶液を密封試験管内で６０°ＣにてＴ ６侍間、加熱した。

それぞれのオリゴヌクレオチド溶液を次に、１−ブタノールにより４回、抽出し た。この溶液を２０％ポリアクリルアミド　７モル尿素電気泳動ゲルに充てんし 、泳動後、適切な生成物ハンドが単離された。

次の実施例はＩＧＦ−［にコード化した構造遺伝子の製造を示したもので、同時 に、そのポリペプチド類僚体の構造遺伝子が調整されるであろう方法を例示して いる。

実施例２ １８個の特定のデオキシオリゴヌクレオチド（１〜１８）を実施例１にしたがっ て合成した。このオリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で 精製し、さらに、１ナノモルのＤＮＡ、　２倍量のＡＴＰ、および１．１位の５ ０ｍＭヒドロキシエチルピペラジン　エタン　スルボン酸、　１０ｍＭ　ＭｇＣ １ｚ、　１０ｍＭジチオスレイトールから成るｐＨ１，６ハノフアーの２０μｌ に・溶解したものを用いた標準反応系において、　ＡＴＰおよびＴ４ボリヌクレ オチドギナーゼにより、５゛端の部位で、リン酸化した。反応後、このキナーゼ を５分間、沸とうすることにより破壊した。バッファー内のこれらリン酸化オリ ゴヌクレオチドは次に直接、リゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）に用いた。

２０μｐ標準バツフアー中のこのオリゴヌクレオチドを結合し。

短いデユープレックスを形成した。それぞれのデユープレックスは、当モル量に おいて２つの補体配列を結合し、同混合物を沸とうし、さらに１ｚ２時間をかけ て、ゆっくりと室温まで冷却することにより形成した。

これら９個のデユープレックスは配列順に結合し、最後の構造遺伝子がリゲーシ ョン用単−試験管内に入るま゛で３７°ｃ、５分間、デユープレックスの各セッ トをアニールした。このオリゴヌクレオチド混合物は次にＡＴＰで全量を１５０ μモルとし、さらに８４単位のＴ４．ＤＮＡ　リガーゼで４℃にて１６時間、処 理した。十分にリゲートした構造遺伝子は次にポリアクリルアミドゲル電気泳動 法で精製した。

次の表２は、　ＩＧＦ−Ｉの直接微生物発現にコード化した最終組立て構造遺伝 子を示している。

表ｌｌ −１１２３４５６７８９ ＢａｍＨＩ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌ ｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ３’　ＧＧＡ　ＴＡＣＣＣＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＴＧＴ　ＧＡ ＣＡＣＧ　ＣＣＧ　ＣＧＡ　ＣＴＴ−−−２，ｗ １０　１１　１２　１３　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０　２］、 ２２　２３Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ 　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇａｙ　ＰｈｅＧＡＣＣＡＡ　ＣＴＧ　Ｃ ＧＡ　ＧＡＣＧＴＣＡＡＡ　ＣＡＴ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ 　ＡＡＧ４□□□−□□６− ２４　’２５　２６　２７　２８　２９　３０　３１　３２　３３　３４・３５ 　３６　３７Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙ ｒ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡＴＡ　ＡＡＡ　ＴＴＧ 　ＴＴＣＧＧＣＴＧＡ　ＣＣＧ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　Ｇ ＣＧ　ＣＣＡ３　ｍ− ３８３９４０４１４２４３４４４５４６４７４８４９５０５］Ａｌａ　Ｐｒｏ　 Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇａｙ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　 Ｐｈｅ　Ａｒｇ　５ｅｒＣＧＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＣＡ Ａ　ＣＴＡ　ＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＧＡ−−１０１２１ ４− ５２５３５４５５５６５７５８５９６０６１６２６３６４６５Ｃｙｓ　Ａｓｐ　 Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　八ｌａ　 Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＡＣＧ　ＣＴＡ　ＧＡＣＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＡＣＣＴＴ 　ＴＡＣＡＴＡ　ＡＣＡ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＴＴＴ６ ６６　６７　６８　６９　７０ ＧＧＧ　ＣＧＴ　ＴＴＣＡＧＧ　ＣＧＡ　ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴ−５’□１日 このテーブルに含まれているものに、　ＤＮＡ配列が微生物発現ベクトル内の正 しい読みとり枠中に適切にインサートされたときの、特定アミノ酸残基の数列化 した配列がある。このため。

ポリペプチド配列は、最初のメチオニン残基（第１位）とともに天然のｒｃｐ− ｒの７０個のアミノ酸残基の連続を構成しているのが判る。

このテーブルでは、各アミノ酸を特定しているコドンは特定の残基の名称の下に 整列している。ＤＮＡ配列内のカッコでかこんだ部分は最初に形成した１８個の 個々のオリゴヌクレオチドを示し、さらに中間デユープレックス（たとえば、１ と２．３と４、等）を指している。製造遺伝子の構成法が一貫しておれば。

ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　８＋　ｐａｇｅｓ　１９８３〜 １９１２　（１９８０）　；およびＧｒａｎｔｈａｍ＋　ａｔ　ａｌ、、Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　９＋　ｐａｇｅｓ　ｒ４３〜ｒ７４ 　（１９８１）で提示されたデータにしたがった予想発現宿王（たとえば、　Ｅ 、　ｃｏｌｉ　）の“優先順位′にしたがって５選択される。また、　Ｂｅｎｎ ｅｔｚｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｒｉｏｔ　Ｃｈｅｍ、＋　２５７．　ｐ ｐ、　３０２６〜３０３１　（１９８２１）　；　およびＧｒｏｓｊｅａｎ、　 ｅｔ　ａｌ、、　ｆｌｉｅｎｅ、　１８＋ｐｐ、　１９９〜２０９　（１９８２ ）を参照されたい。

表ＩＩの■ＧＦ−Ｉ構造遺伝子を生成するときに用いるコドンは目下、望ましい とされるものに存するが、　ＩＧＦ−１類似体にコート化された構造遺伝子を生 成するときに介在する発現を容易にし。

かつ／または、操作法を容易にすることのある数多（の変化が発生することを理 解できょう。前者の１例として、アミノ酸の第２位の代替的プロリン特定コドン を用いることで２例示された配列からの判読されたｍＲＮＡのりボゾームの結合 を改良することがある。この表に示した一ＣＣＧ−の適切な代替物は−ＣＣＡ− であり、この代替物は、オリゴヌクレオチ）”Ｎｏ、　］および２のそれぞれを 構成する際に華１の塩基を変化することにより容易に得られる。後者の１例とし て、独自の制限酸素認識部位が７コード化されたアミノ酸配列を変えることなく 、ＤＮＡ配列に導入できる。たとえば、　−ＧＡＧ　ＣＴＣ−のオリゴヌクレオ チドＮｏ、　３と４における第９位と第１０位にあるグルタミン酸とロイシンを それぞれ特定している１対のコドンを変えることは釦部位を導入する役割を果た す；−ＧＧＴ−のオリゴヌクレオチｌ”　Ｎ　ｏ　、　５と６のＧ１ｙ１９のコ ドンを変えることは、ハ」部位の塩基配列を完了する；および−ＣＴＣＧＡＧ− のオリゴヌクレオチドＮｏ、　１５と１６ノ１．ｅｕ”および隣接のＧｌｕ”を 変えることにより独自のハ虹位を生成する。

コドン変化はまた。製造された構造遺伝子内に存在する潜在的に望ましくない第 ２構造を最少にするために用いられる。１例として１表ＩＩの配列は、　ＤＮＡ 自体、およびＤＮＡから判読されたＲＮＡ配列中の望ましくない第２構造の予想 部分を決定するために、あるコンピュータープログラムｌ：Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅ ｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、、ＳＥＯ二ＤＮ八−へｅ、ｑｕｅｎｃｅ−八ｎａｌｙ ｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｍａｎｕａｌ＋ＴＯＩ’５２０版 ３．０．　ｐ、　４３　（１９８２＞　’Ｊの助けを借りて解析した。

この解析の結果にもとづいて３次に例示するコドン変化が起こることがある。ヴ アリンにコード化されたアミノ酸第１１位のコドン−ＧＴＴ−は表ＩＩのオリゴ ヌクレオチドＮｏ、　３と４の中にある１個の塩基を変えることにより変化でき る。同様に、ウアリンにコード化された。アミノ酸第１２位のコドンも、オリゴ ヌクレオ’ｆ−トＮｏ、　３　（ＧＡＣからＧＡＴ　）中の１個の塩基とオリゴ ヌクレオチドＮｏ、　４　（ＧＴＣからＡＴＣ）中の対応する塩基を変えること により変化できる。これら２個のコドン変化はＩＧＦ−１１にコード化さ粘た製 造遺伝子の予想される第２構造を最少にする。

ポリペプチドのアミノ酸末端残基（上部ストランドの“５”で指示されているも の）を特定する遺伝子の末端に１選別された制限エンドヌクレアーゼ酵素認識部 位（ここでは、１個のＢａｍＨＩのステイソキ一端として示されている）のステ イソキー（粘着性のある）端が与えられている。ポリペプチドのカルボキシ末端 塩基（Ａｌａ”　）を特定する遺伝子の末端に、翻訳停止コドン（たとえば、　 ＴＡＧ、　ＴＡＧ）および同様に選別された制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ ここでは、１個の５ａｌｌステイソキ一端として示されている）が与えられてい る。１個あるいはそれ以上の全体の、デユープレックス、総合認識部位がベクト ル内でのインサートの過程で酵素処理される各末端にあることがあることは理解 できよう。

天然の配列と異なったポリペプチド配列にコード化された新規なＩＧＦ−Ｔ　類 ４９体遺伝子が同時に調整された。これは１選別オリゴヌクレオチドの塩基配列 を変え、この新規な遺伝子を得るリゲーション操作を繰り返すことにより、実施 された。オリゴヌクレオチドＮｏ、　１５と１６を変化すると、残基５９のメチ オニンがスレオニンに変化した。オリゴヌクレオチドＮｏ、　１５内のコドン修 飾はＡＴＧからＡＣＣのものであった。オリゴヌクレオチドＮｏ。

１５内のコドン修飾はＣＡＴからＧＧＴのものであった。１個のＭｅｔ＝１残基 を除去するためにシアノゲンブロマイドを用いたとき。

この変化は残基５９のポリペプチドの開裂を防止し、新規な生物的特徴を有する ペプチドを生成することがある。たとえば、　Ｍｅ１５９のＴｈｒ５９による置 換はコンピューター解析により、その部分のポリペプチドの水作用を変化してい るように思える。

同様に、コンピューター解析によると、オリゴヌクレオチドＮｏ、　１５と１６ を変化し、残基５９のメチオニンをウアリンがロイシンに変化することにより、 この水作用は変化していないようである。オリゴヌクレオチドＮｏ、　１５内の コドン修飾は、それぞれ。

ＡＴＧからＧＴＧあるいはＴＴＧＯものである。オリゴヌクレオチドＮｏ、　１ ６内では、補体コドン変化は、　ＣＡＴがらＣＡＣあるいばＣＡＡのものである 。

オリゴヌクレオチドＮｏ、　９および１ｏを変化することにより。

残基３８のアラニンはヴアリンに変化することがある。オリゴヌクレオチドＮｏ 、　９内の修飾はＧＣＴがらＧＴＴのもので；オリゴヌクレオチドＮｏ、　１０ はＡＧＣからＡＭＣのものである。ＩＧＦ−１配列のこの修飾により、天然の塩 基不安定配列のＡｒｇ”Ａｒｇ３７Ａｌａ３８は。

この物はｐＨは高いと不安定であるものであるが、除去し、微生物宿主からＩＧ Ｆ−１を単離するときの困難さの原因になることがある。

次の実施例はＩＧＲ−ＩＩにコード化された構造遺伝子の製造に関するもので、 さらに、ポリペプチド類似体の構造遺伝子の調整法を例示するものである。

渫ＪＩ引１ １８個のデオキオリゴヌクレオチドが合成され、結合して、実施例］と２の一般 法にしたがって配列順にアニールされたデユープレックスが形成され２次の表■ に提示された構造遺伝子を−１］　２　３　４　５　６　７　８　９　１０Ｂ１ ０Ｂａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　 Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ３’−ＧＡ　ＴＡＣＣＧＴ　ＡＴＡ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　 ＡＧＡ　ＣＴＴ　ＴＧＴ　ＧＡＣＡＣＧ　ＣＣＧ２　４− １１　１２　１３　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０　２１　２２　 ２３　２４Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ 　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＡｒｇＣＣＡ　ＣＴＴ　ＧＡ（： 　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＴＧＡ　ＧＡＣＧＴＣＡＡＡ　ＣＡＴ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　Ｃ ＴＧ　ＧＣＡ−一」□６ ２５　２６　２７　２８　２９　３０　３１　３２　３３　３４　３５　３６　 ３７　３８Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ 　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＡｒｇＣＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　 ＡＡＡ　ＴＣＧ　ＧＣＡ　ＧＧＣＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＣＧ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　Ｇ ＣＡ　ＧＣＧ−□　８−’□１０□□−」 ３９　４０　４１　４２　４３　４４　４５　４６　４７　４８　４９　５０　 ５１　５２Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ 　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　ＡｓｐＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　 ＴＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＣＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　Ａ ＣＧ　ＣＴＡ１２　１４　□ ５３　５４　５５　５６　５７　５８　５９　６０　６１　６２　６３　６４　 ６５６６Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　５ｅｒＧＡＣＣＧＡ　ＧＡＣＧＡＣ ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＣＧＴ　ＴＴＣＡ ＧＧ１６　− ７ ＣＴＴ　ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴ−５’ １８ この表に含まれているものは、　ＤＮＡ配列は微生物発現ベクトル内の正しい読 取り枠内に適切にインサートされたときの特定のアミノ酸残基の番号付配列であ る。これにより、ポリペプチド配列は、最初のメチオニン残基（第１位）を伴っ た天然のＩＧＦ−ＩＩの連続した６７個のアミノ酸から成っている。

この配列は、先に実施例２１表ＩＩの配列について詳述した同じ様式で解釈され る。同様に、コドンの使用は、予想宿主微生物の“優位性”にもとづくことがあ り、さらに、ＩＧＦ４１類似体にコード化された遺伝子を生成する際に介在する 発現および／または操作法を容易にするため、すなわち、内部制限酵素認識部位 をＤＮＡ配列にインサートするうえで配列内に用いられたコドン内に変化が起こ ることがある。

配列の５゛端には選別された制限エンドヌクレアーゼ酵素認識部位（ここでは、 　ＢａｍＨＩ　）の“ステイソキ一端”を形成する塩基がある。判読停止コドン （たとえば、　ＴＡＧ、　ＴＡＧ）および同様に選別された制限エンドヌクレア ーゼ認識部位（たとえば、ここでは、５ａｉｌ）がポリペプチド（Ｇｌｕ６７） のカルボキシ末端残基の後に与えられている。

新規のｒＧＦ４ｒ［似体構造遺伝子は、オリゴヌクレオチド−Ｎ　ｏ。

１４と１５を変化することによりＩＧＦＪ内の同等の部位に存在しているような アルギニン残基へ第５４位と第５５位のアラニンとロイシンを変化させることに より調整されることがある。この配列によりコード化された類イ以体、　〔八ｒ ｇ５４．Ａｒｇ５５）　、　ＩＧＦ−１１，は。

これ故、　ＩＧＦ−Ｉの残基４６から５８を包括する部位を正確に複製している 残基４５から５７を包括する部位の残基をとり入れているであろう。オリゴヌク レオチドＮｏ、　１５内のコドン修飾は−ＧＣＴ−ＣＴＧ−から−ＣＧＴ−ＣＧ Ｇ−のものである；　これに対応するオリゴヌクレオチド内の修飾は　−Ｃ：Ａ Ｇ−ＡＧＣ−から−ＣＣＧ−ＡＣＧ−のものである。

もう１つの模範的ｔｃｐ−ｕｌ似体はＩＧＦ−１遺伝子ＤＮＡ配列の“Ｃ−ペプ チド”部分をＩＧＦ−ＩＩＤＮＡ配列に導入するために組み立てられることがあ る。ＩＧＦ−１１アミノ酸残基３３から４０．すなわち、　ｃ−ペプチド部分、 の置換は、オリゴヌクレオチドＮｏ、　９．１０．１１および１２内を変化する ことにより実施される。ＩＧＦ−ＩＩ配列にインサートされた新規なオリゴヌク レオチドは、　ＩＧＦ４のＣ−ペプチド部分、すなわち、アミノ酸残基３０から ４１を特定している。

同’１１７（１ｕ体は９次の新規なオリゴヌクレオチド９’、　１０’、　１１ ’および１２゛　を用いて即座に製造され１表ＩＩＩで例示された構造中の最初 のオリゴヌクレオチド９．１０．１１および１２をそれぞれ、置換する。

Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒ。

Ａ　ＧＧＣＣＧＡ　ＣＣＧ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＡＧＧＧＣＧ　 ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＧＧＡｌｏ” Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ＧｌｕＧＴＣＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＡ Ｇ　ＣＡＡ　ＣＴＣＣＴＴ　Ａ□１２ 注目すべきは、　ＩＧＦ−１１−Ｃ−１で称される。このＩＧＦ−１１類似体に は天然の該ポリペプチドよりも多数のアミノ酸残゛基が含まれている。

次の実施例は、この発明のＩＧＦ−１ポリペプチド生成物の発現を得るために５ 微生物宿主細胞の変換に用いる発現ベクトルの組み立て法に関するものである。

遺伝子に伴うクローンはポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解明してＩＧＦ− １構造遺伝子の推定分子量を確認した。

さらにクローン化製造ＤＮＡオリゴヌクレオチドを解明するた■部位のハタテリ オファーシＭ１３ｍｐ８およびＭ１３ｍｐ９複製形ＤＮＡにインサートした。一 定の方向内のインサートされたＤＮΔに伴うクローンをポリアクリルアミドゲル 電気泳動法で単離し、解明した。一方向の単一ストランドＤＮＡを草離し、　Ｉ ＧＦ４構造遺伝子（７）ＤＮＡ配列を　Ｓａｎｇｅｒ　Ｄｉｄｅｏｘｙ配列化技 法により確認した。

ＩＧＦ−１の製造遺伝子を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ［および顕部を用い た処理により旧３Ｉｌｐ８複製形から切断した。

続いて、この遺伝子を合成ハイブリッド　プロモーター／オいる。

３’　ＡＧＴＡＴ　ＴＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＡＡＴＴＡＣＧＡＴＴＴＴＡ ＡＧＡ　ＡＣＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＧＴＴ＾八ＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴ　Ｔ へＴＴＡＡＡＴＡＧ　ＡＴＴＣＣＴＣ（：ＴＡＧ−５’この８６−塩基対プロモ ーター／オペレーター配列にはＴ５Ａ複製、物（ｒｅｐｌｉｃａ　）　＋　すな わち、　Ｔ５初期プロモーター、　Ｐ２５．　Ｐ２６゜Ｐ２８およびＰ２Ｏ７（ Ｂｕｊａｒｄ、旦ＢＳ、　５　：　２７４−２７８　（１９８０）　；Ｂｕｊａ ｒｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｐａｇｅｓ　１２１−１４０．　Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ 　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　（Ｒ，Ｒｏｄｒｉｇｎ ｅｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ　）　、　Ｐｒａｉｇｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ　（１９Ｂ２）に掲載されているものを参照されたい）の既知配列にもとづい て指示された第５０塩基対合成Ｔ５初期プロモーター配列、および第２１−塩基 対１ａｃ−オペレーター制御配列が含まれている。これにより、同プロモーター 配列の判読作業はＬ些□リプレッサー酵素によって約２００倍、最小に調整され る。この圏９−オペレーター配列は天然のラクトース　オペロンでみられるよう に予測されたｍＲＮＡ出発部位に位置している［Ｄｉｃｋｓｏｎ、　ｅｔａｌ、 、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１Ｂ２　：　２７〜３５　（１９７５）を参照のこと〕 。

プラスミ）”ｐＴ５−４は５制限エンドヌクレアーゼ酵素、…ｎｄｌｌｌ−およ びシ」且しエ　すなわち、肛屁見およびはυ叩□ステイソキ一端を有するＴ５Ａ −１ａｃプロモ一ター／オペレーターＤＮＡ配列で消化されたＥ、　ｃｏｌｉ　 クローニングベクトルｐＢＲ３２５の巨大断片にインサ：トすることにより組み 立てられる。“Ｔ５−４”で称されるプロモーター／オペレーター配列を伴った クローンはＰＡＧＥ上の制限断片の分子量比較とジデオキシヌクレオチドＤＮＡ 配列化により解明された。

プラスミドｐＴ５−４は制限エンドヌクレアーゼであるＢａｍＨＩおよび５ａｌ ｌ　および細菌由来のアルカリ性フォスファターゼにより処理され、これにより 、プラスミド３“をプロモーター／オペレーターに開裂した。この切断された製 造ＩＧＦ−１遺伝子は次に。

ＢａｍＨＩおよび皿の制限部位の間にインサートし、さらにリケードされ、プラ スミドｐＴ５−４−ＩＧＦ−１を生成した。ＴＧＦ−１の第２２６塩基対オリゴ ヌクレオチドを正しい方向にインサートされたことは制限酵素分析ならびにポリ アクリルアミドゲル電気流動法による分子比較によって実証されている。

Ｂ、プラスミドｐＡＤＰ２２３の組み丈工製造ＩＧＦ−Ｉ構造遺伝子をプラスミ ドｐＴ５−４−　ＩＧＦ−１内で適当なプロモーター／オペレーターと組み合わ せた際、所望タンパク質の高濃度なＥ、　ｃｏｌｉ発現をもたらすであろう発現 ベクトルを生成する試みで、さらに別の操作法を実施した。これらの操作法には 、共同所有で同時係属出願された米国特許申請Ｎｏ、５２１゜９５４、　Ｍｏｒ ｒｉｓによる“ＤＮＡベクトル”の主題であるプラスミドの使用法を含んだもの であった。該申請書の開示内容は、この明細書の引用文献に具体的に示されてい る。゛簡華に云えば、咀み立てに使用されるプラスミドｐｃＦＭ４１４　（Ａ、 ’　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，４００７６）には複製（コピー）制御部分に温度感受性のあ る突然変異が含まれている。このベクトルを変換したとき、３４℃で培養した宿 主細胞培養物では同プラスミドのコピーが少なかった。このプラスミドのコピー 数は、培養温度を３４℃から高くしたとき、５０倍に増加する（すなわち、“逃 亡する。゛）３７°Ｃでの培養は通常、同細胞に致死的である。

Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，４００７６を用いたベクトルの組み立てにかかる特別な操 作法は次のようであった。プラスミドｐＴ５−！１−＋’ＧＦ−１は１Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよび５ａｊｌで消化して、　ＩＧＦ−１構造遺伝子と関連のＴ−５１８ Ｃプロモーター／オペレーターを含む第３０３塩基対断片を生成した。プラスミ ドｐｃＦＭ４１４は、現員４月−および５ａｌＩで消化し、巨大断片を単離した 。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有する。このＨｉｎｄ　ｍおよび５ａｊｌ断片を次にｐ ｃＦＭ４１４の巨大国叫７Ｓ→」」、断片でリゲートしてプラスミドρＡＤＩ’ ２２３を生成したうこの構造物は、完全な形の旧ｎｄＨ＋認識部位を保有してい たが、と旦およびＸｈｏ　ｌの補完的ステイアキ一端のりゲーションでは、いず れの認識部位をも復旧しなかった。同様に注目すべきは、この構造物は結果的に 。

ＩＧＦ−Ｔ　、構造遺伝子５゛を判読停止配列に、　Ｔｏｏｐ在３゛をｐｃＦＭ ４１４のハ旦部位に定位した。

次の実施例は、融合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ（Ｔｈｒ５９）　ＩＧＦ −１の断片としての（Ｔｈｒ５９）　ＩＧＦ−Ｔの発現を得るがための微生物宿 主細胞の変換に用いる発現ベクトルの組み立てを例示している。

１！に□シ）０５□１）（すｊ 第２２６塩基対［Ｔｈｒ５９）　ＩＧＦ−１類伯体遺伝子（以下“ＩＧＦ−ｊＴ ”と称す）でその製法は実施例２で詳述しているものをβａｍｌｆ（ｉ　８よひ 顕部制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてＦ、、　ｃｏ３’＋−クローニングベ クトル　ｐＢＲ３２２にインサートした。遺伝子ととも生成したクローンはポリ アクリルアミドケル電気泳動法により解明され、　ＩＧＦ−ＩＴの構造遺伝子の 推定分子量を確認した。

クローン化合成りＮＡオリゴヌクレオチドをさらに解明するために、第２２６塩 基対断片をｐＢＲ３２２から切断し、　Ｂａｍ［１１および５ａｊｌ部位のハタ テリアファージＭ１３ｍｐ８および旧３’ｍ　ｐ　９複製形ＤＮＡにインサート した。特定の方向にインサートされたＤＮＡに伴うクローンをポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法で単離して、解明した。一方向への華−ストランドＤＮＡを単 離し、さらにＩＧＦ−１構造遺伝子のＤＮＡ配列をＳａｎｇｅｒ　Ｄｉｄｅｏｘ ｙ配列化技法により確認した。　゛ ＩＧＦ−ＩＴ遺伝子をＭ１３バクテリオファージ複製形ＤＮＡから切断し、増幅 のため適当なプラスミド（たとえは、βｐ１±７４Σ１１消化プラスミドρＴＰ 　）にインサートした。プラスミドｐＴＰには。

そのＢａｍＨＴ制限エンドヌクレオチド認識部位に対し５゛に位置した１個のＥ ｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位と１個のＸｂａ　１制限工ンドヌクレ アーゼ制限部位があり、この位置にＴＧＦ４Ｔコート化配列がインサートされた 。次に示したｐＴＰ中のＥｃｏＩｉ１部位からＢａｍＨＩまでのＤＮＡ配列は次 のとおりである：ＥｃｏＲＩ　にｂａｒ ５’−ＡＡ　ＴＴＣＴＣＴ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＴＧ− ３’３’−Ｇ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＡＣＴＴＣＴＴＴ　ＡＴＡ　ＡＣＣＴＡＧ− ５’ａｍＨＴ このため、生成した増幅プラスミド、　ｐＴＰ−ＩＧＦ−ＩＴ中に、アゾ人シン 含量が高い１一連の塩基が、配列を定めているＩＧＦ−ＩＴポリペプチドに先行 して、存在している。アデノシン含量の高い配列とともに、　ＩＧＦ−ＩＴ遺伝 子コード化配列は次にｂ■しと５ａｌｌにより増幅プラスミドから切断し、　Ｅ ｃｏＲＩ　／５ａｉｌ消化プラスミドｐＢ　ｔｒａで田且制限部位に対して３” のり１を存するものにインサートした。生成したベクトルはｐＡＤＰ６と称した 。

ρＡＤＰ６は次に、制限ヌクレオチドで消化してＩＧＦ−ＩＴをＥｃｏｌ？Ｉ／ ＫｐｎＩとして得た。この断片は、Ｌ個のＥｃｏＲＩ　／Ｋｐｎｌエンドヌβガ ラクトシダーゼ酵素遺伝子のコドン１００４に１個のＥｃｏ［制限部位が含まれ ている。この生成したプラスミドベクトル、　ｐＡＤＰ２０１．、にはβ−ガラ クトシダーゼの天然のプロ干−クー／オペレーター、β−ガラクトシダーゼの最 初の１００４′：！）−ン、これにツツイてｐＴＰ４ＧＦ−ＩＴのＥｃｏＲＩ一 部位からＡＴＧコドンまでのコドン。

これにつづいて、メチオニン指定コドンとＩＧＦ−ＩＴ遺伝子の７０個のコドン が含まれている。

宿主微生物中に発現ベクトルとして用いられたとき、プラスミドｐＡＤＰ２０＋ 　は１次の配列のアミノ酸を含む第１０８４アミノ酸β−ガラクトシダーゼー− ＩＧＦ−ＩＦ融合ペプチドの発現を特定する二当該アミノ酸とは、Ｎ１１□−〔 β−ガラクトシダーゼ（最初の１００４個のアミノ酸）　）−５ｅｒ−”−Ａｒ ｇ−９Ｍｅｔ−８−Ｌｙｓ−’Ｌｙｓ−６Ｔｙｒ−’−Ｔｒｐ−−’ｌｌｅ−− ３Ｐｒｏ−２Ｍｅｔ−’−（ＩＧＦ−ＩＴ　（７０個のアミノＭ）〕−ＣＯＯＨ 。

次の実施例は、そのアミノ基末端に短い“リーダー”あるいは“プロ”残基配列 をともなう（Ｔｈｒ”　）　ＩＧＦ−Ｉの直接発現のベクトルに関するものであ る。

実施例６ ＩＧＦ−ＩＴポリペプチドは、第８アミノ酸リーダーを有するペプチドとして直 接に発現することも可能である。実施例５で述べたプラスミドｐ、ＴＰ−ＩＧＦ −ＩＴはエンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉおよび３　ａｊ　、Ｅで開裂され、　Ｉ ＧＦ−ＩＴポリペプチド−指定配列に先行したアデノシン含量の高い、一連の塩 基を含有する復＝土／□す」」、断片を生成する。この構造物は次に、　ｔｒｐ プロモーター／レギュレーター配列の次の製造Ｘｂａ　Ｉ部位のＸｂａｌ／５ａ ｉｌ処理ｐＢＲ由来プラスミド（ｐＩＮＴ−ｒ−ＴＸｂ４　）にインサートされ る６ｐＡｌｌＰ＋　と称される生成したベクトルはＥ、　ｃｏｌｉ宿主内の発現 ベクトルとして用いられ。

次の８個のアミノ酸の“プロ”配列を含むポリペプチド生成物。

ＩＧＦ−ＩＴＶを生成する。すなわち、同アミノ酸とは。

ＮＯ３−Ｍｅｔ−’−Ｌｙｓ−７−Ｌｙｓ−６−Ｔｙｒ−５−Ｔｒｐ−’−１１ ｅ−’−Ｐｒｏ−２−ｎｅｔ−’−（ＩＧＦ−ＩＴ）−Ｃｏｏｌをいう。

プラスミドｐＡＤＰＬは影速幻□および独で消化され、ｔｒｐプロモーター／レ ギュレーター配列とそれに続（ＩＧＦｉＴ７にコード化された配列を含有する断 片を切断した。この断片は次に、実施例４で述べた温度感受性の高いコピ一番号 プラスミド′であるＥｃｏＲＩ　／Ｘｈｏｌ処理されたｐｃ：ＦＭ４１４にクロ ーンされた。同プラスミドのＸｈｏｌ結合性端末を遺伝子断片の５ａｊｌ結合性 端末とリゲートした。これにより、生成したプラスミドベクトル面ひＰ２１５内 の両方の制限部位を除去した。

次の実施例は、この発明の所望のポリペプチドの微生物発現に関するものである 。

ブラスミＦｐＴ５−４４ＧＦ４　（実施例４）はＥ、　ｃｏｌｉ　（７）ＪＭＩ ０３株に変換し、　Ｍ９培地、すなわち９分光光度計の吸光度が波長６００ｎｍ のとき０．２　（Ａｂｏｏ”　０．２　）　０：）とき０．４　％グリセｏ−ル 、　５００μｇ／ｎ＋１アンピシリンを含むもの、で培養した。’］ｍＭにイソ プロピルチオガラクトシドを加え、　ＩＧＦ４ポリペプチドの産生を誘発した。

培養物は、＾６゜。−１，３のとき集菌し、菌細胞をソニケー）　（ｓｏｎｉｃ ａｔｅ）　Ｌ＋　遠沈した。生成したベレットを次に。

６、助ヴアニジン塩酸１０．刊ジチオスレイトール（ＭＣＩ　／ＤＴＴ　）で可 溶化してタンパク質を変性した。この溶液はさ、らに、　０．０１％ＨＣＩ内の ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５を通過させてヴアニジンと［ｌＴＴを除去し、　５ｍ Ｍ酸化ＤＴＴで再変性した。Ｎ１ｃｈｏｌａｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｅｓ社から入手したラジオイムノアッセイ法を実施してＩＧＦ−１ポ リペプチドの発現を定量した。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の結果は、全体 の菌細胞においては波長６００ｎｍにて分光光度計の読取値が１に相当する濃度 で培養物１リツターあたり２マイクログラム（２μｇ　１００１　）　、ならび に再変性細抑ペレット中では０．１８μｇ　１００１以下を示した。

プラスミドｐＡＤＰ２２３　（実施例４）はＦ、、　ｃｏｌｔ　ＪＭ１０３株に 変換され、２８℃から３７℃に上昇し、Ａｂｏａ＝０．１　（７）とき５００　 ｐｇ　／ｍｌアンピシリンを含有するしブロスで培養した。培養物はＡ６゜。＝ ：２．０で集菌した。菌細胞をソニヶートし、遠沈し、ペレ・２トをヴアニジン ＨＣＩ　／ＤＴＴで可溶化した。この溶液をさらに５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５コ ラムに通過させ、酸性口ＴＴで変性した。ＲＩＡ結果から。

全細胞中では５μｇ　１００１．再変性細胞ベレットでは０．２６μｇ１００１ 以下であることが判った。

Ｂ、β−ガークトシノ〉１〔ユ遅セ」」１金ｒじ少Ｆｌ’プラスミドｐＡＤＰ２ ０１　（実施例６）をＥ、　ｃｏｌｔ　ＪＭ１０３株に変換し、変換宿主細胞を ０．４％グリセロールと２５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＭ９培地で 培養した。Ａ６ｏｏ＝０．２のとき、　ＩＰＴＧを１１−に加えて、β−ガラク トシダーゼ−ＩＧＦ−ＩＴの産生を誘発した。培養物はＡｈＯｏ−０，８のとき 集菌した。同細胞はソニケートでかく乱し、さらに遠沈した。β−ガラクトシダ ーゼ−ＩＧＦ−ＩＴは全て、ペレツト内にあった。細胞ベレットはヴアニジンＨ ＣＩ　／ＤＴＴでけん濁し、タンパク質を変性し、さらにシアノゲン　ブロマイ ド（ＣＮＢｒ）で処理してメチオニンの位置でタンパク質を開裂した。ＣＮＢｒ を除くため回転蒸発後、タンパク質をヴアニジンＨＣＩ　１０ＴＴで再処理し、 ５ｅｐｈａｄｅｘ脱塩コラムに通過させてヴアニジンとＤＴＴを除去し、さらに 酸化ＤＴＴで再変性した。

ＲＩＡの結果から２５０μｇ１００１の収量が示された。

Ｃ−匹Ｆ−ＩＴ７□□□光貝 プラスミドｐＡＤＰＩ　（実施例５）をＢ、　ｃｏｌｉ−の）ＩＢＩＯＩ株に変 換し、菌細胞を５００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する最小培地で培養した。

菌細胞を　＾、。、＝０．５でインドールアクリル酸を添加してＩＧＦ−ＩＴ７ の産生を誘発した。菌細胞はＡ６０６＝１．０で集菌した。その後、菌細胞はり ゾチームの存在下で凍結と融解により、かく乱した。これに続いて、デオキシリ ボヌクレアーゼで処理し、遠沈した。ＲＩＡの結果から、上澄液には１８ｇ　１ ０ＤＩのＩＧＦ４Ｔ７が含有されていることが判明している。

プラスミドｐＡＤＰ２１５　（実施例６）を影ユ望上ｉＪ門１０３株に変換し、 　Ａ６ｏｏ＝０．１で２８℃から３７℃へ上昇したとき５００　μｇ　／ｍｌア ンピシリンを含有したしブロスで培養した。培養物はＡ６゜。−２゜０のとき集 菌し、菌細胞はソニケートし、遠沈し、ベレットをヴアニジン）ＩｃＩ　／ＤＴ Ｔで可溶化した。この材料を次に５ｅｐｈａｄｅｘＧ２５コラムに通過させ２酸 化ＤＴＴで再変性した。ＲＩＡの結果がら、全細胞中では、　ｒＧＦ−ＩＴＶが ２０μｇ１００１で、再変性細胞ベレット材料ではＩＧＦ４Ｔ７が２５０μｇ　 １０ｏ１であることが明らかである。

発現系に関するデータを次の表■に示している。

■ 発現系　皇豊凶　上遣撮　ペレ・７ト ｐＡＤＰ２０１　０．１　２５０ ｐＡＤＰ１　１ ｐＡＤＰ２１５　２０　２５０ ｐＴ５−４−ＩＧＦ−１２＜０．１８ ｐＡＤＰ２２３　５　＜０．２６ 第８アミノ酸リーダーの活性に及ぼす予想される影響を評価するために、上述の 方法で製造された凍結乾燥、　ＨＰＬに精製ＩＧＦ−ＩＴ−７（１００μｇ）を １４ｍｇシアノゲン　ブロマイドを含有する７０％のギ酸０．５ｍｌに溶解した 。２３℃で６４時間後５反座混合物を建ＨＣＩで平衡状態にした１０ｍ１の５ｅ ｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５コラムに通過させた。

溶出液をＩ（ＰＩ、Ｃで精製した後、タンパク質をＰＡＤＥ上で天然のヒト血漿 由来ＩＧＦ−Ｉ　と同し電気泳動移動度を有するかどうかを観察し、さらに、つ ぎの分析においてＩＧＦ−ＩＴ７とヒト血漿由来ＴＧＦ−１でＶａｎ　Ｗｙｋ、 　ａｔ　ａｌ、、　ＰＮＡ針（ＩＳＡ　）　、　８１　：　７４０−７４２　（ １９８４）による方法で調整したものを比較した。

Ａ、ラジオイムノアッセイをＣｏｐａｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、　Ｍｅｔ、、　５０　：　６９０〜６９７　（１９ ８０）の非平衡法により実施した。ラジオイムノアッセイから、　ＩＧＦ−ＩＴ ７はヒト血漿ＩＧＦ−１の力価の５０％を有する；および、上述したように、リ ーターがなければ、　ＩＧＦ−ＩＴはヒト由来ＩＧＦ−Ｉの力価の８０％を有す ることが明らかになった。

Ｂ、ヒト胎盤細胞膜を用いたラジオレセプターアソセイヲＤ゛Ｅｒｃｏｌｅ、　 ｅｔ　ａｌ、、　ｐａｇｅｓ　１９０−２０１．Ｇｒｏｕｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｓ 　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（Ｐｅｃｉｌｅ、ｅｔ　ａｌ、 、ｅｄｓ、）　１Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１ ９７６）による方法で実施した。ＩＧＦ−ＩＴ７はヒト血漿ＩＧＦ−１の力価の ４０％、　ＩＧＦ−ＩＴはヒト標準品の力価の８０％を有することが観察された 。

Ｃ，５ｔｉｌｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、 　９９　ノ３９５〜４０６（１９７９）の方法により、有糸分裂作用を測る細胞 成長アッセイにて、　ＴＧＦ４Ｔ−７とＩＧＦ４Ｔの両方が、　ＢＡＬＢＩＣ３ Ｔ３細胞の成長をさらに刺激した。アミノ酸補充後の栄養素欠乏培地では、　Ｉ ＧＦ−ＩＴはヒ）ＩＧＦ−１と同程度に成長を刺激した。

前述の倒起的な実施例は、影」遼拝−宿主細胞にみられる直接発現および融合生 成物発現に用いるに適したＩＧＦ−１，ＩＧＦ−１１および類似のポリペプチド の製造された構造遺伝子の組み立てに主として関連したものである。製造された 遺伝子は、酵母優先コドンの使用により酵母細胞でみられる直接発現に特に良く 適した方法で即座に２組み立てられるであろう。さらに共同所有され、同時係属 出願の米国特許申請書Ｎｏ、　４８７．７５３．　Ｂｉｔｔｅｒにより“酵母由 来の外因性ポリペプチドの分泌”と称する１９８３年４月２２日に出願されたも のの方法が、ポリペプチド生成物の成育培地−・の分泌を伴った酵母発現を得る ために用いることができるであろう。このような場合、メチオニン指定のへＴＧ コドンをＩＧＦ指定コドンに翻訳することは不必要となろう。

この発明の生成物および／またはそれらの抗体は適切に“タッグ（添付）”され 、たとえば、ラジオイムノ標識（たとえばｐｚ５）、酵素結合（抱合）、または 螢光標識し１分析および／または臨床検査キットに有用な試薬材料、液体サンプ ル中のこのような生成物および／または該抗体の存在を定性、定量する試薬材料 を供与するものである。かかる抗体は１つまたはそれ以上の動物由来の接種から （たとえば、マウス、ラヒ、１１．羊。

ヒト、　ｅｔｃ　）またはモノクローナル抗体から得られるであろう。

これらの試薬材料のいずれもが単独に、もしくは適当な基質と併用して、たとえ ば、ガラス、プラスチック球またはビーズ上にコードンて用いることができる。

この発明の実施における数多くの修飾および変更が、前述の倒起的実施例を考え るときに、当業者に発生ずることが予想される。したがって、この発明は２添付 の請求の範囲のみに限定すべきではない。

手続補正書（自発） 昭和６０年５月２８日 ／事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ８４１０１２１８２　発明の名称　インシュリン様 成長因子の微生物発現３゛補正をする者 事件との関係　特許出願人 居所　アメリカ合衆国　９１３２０　カリフォルニアサウザンド　オークス　オ ーク　テラス神戸市中央区東町１２５番地の１貿易ビル９階国際調査報告 Ｉｎ＋＊ｆｎａｌｌｏｎ＋１ＡＩｌｏｌ：ｃａｔｉｏｎＮｏ、ｐｃＴ／ＩＪｓｓ ノ４１０１２１３Ｉｎ＋ｗ＋ｎａｌｌａｎａｌ　ＡｐｐＨｅｉｌｌｏｎ）ｌａ、 ＰＣＴ／ＵＳ８１１１０ｉ２１８第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号　庁内整理番号優先権主張　［相］１９８着４月２ ６日［相］米国（Ｕ　Ｓ）［株］６３３４５１＠発　明　者　スニトマン　デイ ヴイッド　エ　アメル　イブ リカ合衆国　８０３０３　コロラド　ボールダー　イサーケ　ドラ４７５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、インシュリン様成長因子ポリペプチドの選別された宿主微生物にお（する合 成を指示できる製造された遺伝子。 ２、インシュリン様成長因子ポリペプチドの選別された宿主微生物における合成 を指示できる製造された遺伝子。 ３、インシュリン様成長因子Ｉ＋ポリペプチドの選別された宿主微生物におりる 合成を指示できる製造された遺伝子。 ４、請求の範囲１にしたがった製造された遺伝子で１　この中で塩基配列が、予 想される宿主微生物にみられるコドンの優先的発現特徴にもとづいて、同しアミ ノ酸を指定する代替的コドンから選ばれた１つまたはそれ以上のコドンを含むも の。 ５、請求の範囲１にしたがった製造された遺伝子で、この中で塩基配列が、　Ｅ 、　ｃｏｊｉ−にみられるコドンの優先的発現特徴にもとついて、同しアミノ酸 を指定する代替的コドンから選ばれた］つまたはそれ以上のコドンを含むもの。 ６、請求の範囲２にしたがったインシュリン様成長因子■を指示する製造された 遺伝子で、この中で塩基配列が次のものから成るもの： ５’　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＴＧＣＧＧＣＧＣＴ　Ｇへへ 　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＧＡに　ＧＣＴ３’−ＣＣＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＴＧＴ　ＧＡ ＣＡＣＧ　ＣＣＧ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＣＡＡ　ＣＴＧ　ＣＧＡＣＴＧ　Ｃ ＡＧ　ＴＴＴ　ＧＴＡ　ＴＧＣＧＧＣＧＡＣ（’：ＧＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣＴＡＴ 　ＴＴＴ　ＡＡＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡ　ＣＡＴ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ 　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＣＣＣＧ　ＡＣＴ　 ＧＧＣＴＡＣＧＧＴ　ＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＣＣＧＣＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　Ｃ ＡＧ　ＡＣＴＧＧＣＴＧＡ　ＣＣＧ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＡＧＧ 　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＴＧ＾ＧＧＴ　ＡＴＣＧＴＴ　ＧＡ Ｔ　ＧＡＡ　ＴＧＣＴＧＴ　ＴＴＴ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＣＧＡＴ　ＣＴＧ　 ＣＧＣＣＣＡ　ＴＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　Ｇ ＣＡ　ＡＧＡ　ＡＣＧ　ＣＴＡ　ＧＡＣＧＣＧＣＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＴＧ 　ＴＡＴ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＣＣＧＣＡ　ＡＡＧ　 ＴＣＣＧＣＡ　ＧＡＣＣＴＴ　ＴＡＣＡＴＡ　ＡＣＡ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣ ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＣＧＴ　ＴＴＣＡＧＧＧＣＴ　ＴＡＧ　ＴＡＧ−３’ ＣＧＡ　ＡＴＣＡＴＣ−５’。 ７、請求の範囲３にしたがったインシュリン様成長因子■を指、示する製造され た遺伝子で、その中で塩基配列は次のものから成るもの： ５’−ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　Ｔ ＧＣＧＧＣＧＧＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧＧＴＴ　ＧＡＣＡＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　Ｔ ＴＴ　ＧＴＡ　ＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣＴＡＴＣＡＡ　ＣＴ Ｇ　ＴＧＡ　ＧＡＣＧＴＣＡＡＡ　ＣＡＴ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　 ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＡＴＴＴ　ＡＧＣＣＧＴ　ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧ ＣＧＴＡ　ＴＣＣＣＧＴ　ＣＧＣＴＣＴ　ＣＧＴ　ＧＧＴＡＡＡ　ＴＣＧ　Ｇ（ ：Ａ　ＧＧＣＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＣＧ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＡＧ Ａ　ＧＣＡ　ＣＣＡＡＴＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＴＧＣＴＧＴ　ＴＴＴ　Ｃ ＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＣＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧＴＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＣ ＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＡＣＧ　ＣＴＡ　ＧＡＣＣ ＧＡ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣＴＡＴ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＣＣＣ ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＴＣＣＧＡＡ　ＴＡＧ　ＴＡ（，３’ＧＡＣＣＴＴ　ＴＧＧ　 ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＣＧＴ　ＴＴＣＡＧＧ　ＣＴＴ　Ａ ＴＣＡＴＣ−５’８、請求の範囲１にしたがった製造された遺伝子で、その中で インシュリン様成長因子を指定する塩基コドンは、それぞれ１合成されたポリペ プチド内の追加の最初および／または末端のアミノ酸を指定する最初および／ま たは末端のコドンを含むもの。 ９、請求の範囲８にしたがった製造された遺伝子で、その中で追加の最初のアミ ノ酸を指定している最初のコドンは最初のメチオニン残基を指定するコドンであ るもの。 １０、請求の範囲８にしたがった製造された遺伝子で、その中で。 追加の最初のアミノ酸を指定している最初のコドンがアデニン含量の高い、最初 のコドンであるもの。 １１、請求の範囲１ｏにしたがった製造された遺伝子で、その中で。 該アデニン含量の高い、最初のコドンが次の塩基配列から成るもの： ５’ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＴＧＧ　ＡＴＣＣＣＡ−３’。 １２、請求の範囲１にしたがった製造された遺伝子で、その中で。 インシュリン様成長因子を指定している塩基コドンが、制限エンドヌクレアーゼ 酵素開裂の認識位置になりうる塩基配列の一部を構成する塩基配列に先行され、 および／または、後続され、および／または含むものである。 １３、インシュリン様成長因子ポリペプチドの類偵体の選別された宿主微生物に おける合成を指示できる製造された遺伝子で、１つまたはそれ以上のアミノ酸の 実体および／または位置に関して異なっているもの。 １４、請求の範囲１３にしたがって製造された遺伝子で、その中で。 塩基配列が、予想される宿主微生物にみられるコドンの優先的発現特徴にもとづ いて、同しアミノ酸を指定する代替的コドンから選ばれた１つまたはそれ以上の コドンを含むもの。 １５、請求の範囲１４にしたがって製造された遺伝子で、その中で。 塩基配列が、　Ｅ、　ｃｏｌｉにみられるコドンの優先的発現特徴にもとづいて 、同しアミノ酸を指定する代替的コドンがら選ばれた１つまたはそれ以上のコド ンを含むもの。 １６、請求の範囲１３にしたがって製造された遺伝子で、その中で。 塩基配列が９次から成るもの： ５’−ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＴＧＣＧＧＣＧＣＴ　ＧＡＡ 　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＧＡＣＧＣ；Ｔ３’−ＣＣＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＴＧＴ　ＧＡ ＣＡＣＧ　ＣＣＧ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＣＡＡ　ＣＴＧ　ＣＧＡＣＴＧ　Ｃ ＡＧ　ＴＴＴ　ＧＴＡ　ＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣＴＡＴ　Ｔ ＴＴ　ＡＡＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡ　ＣＡＴ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　Ｇ ＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＣＣＣＧ　ＡＣＴ　ＧＧ ＣＴＡＣＧＧＴ　ＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＣＣＧＣＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＧ 　ＡＣＴＧＧＣＴＧＡ　ＣＣＧ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　Ｇ ＣＧ　ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＴＧＡＧＧＴ　ＡＴ（：　ＧＴＴ　ＧＡ Ｔ　ＧＡＡ　ＴＧＣＴＧＴ　ＴＴＴ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＣＧＡＴ　ＣＴＧ　 ＣＧＣＣＣＡ　ＴＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ’ＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　Ｇ ＣＡ　ＡＧＡ　ＡＣＧ　ＣＴＡ　ＧＡＣＧＣＧＣＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣ ＴＡＴ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＣＣＧＣＡ　ＡＡＧ　Ｔ ＣＣＧＣＡ　ＧＡＣＣＴＴ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　Ａｆｌ：Ａ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　Ｇ ＡＣＴＴＴ　ＧＧＧ　ＣＧＴ　ＴＴＣＡＧＧＧＣＴ　ＴＡＧ　ＴＡＧ−３″ ＣＧＡ　ＡＴＣＡＴＣ−５’。 １７、請求の範囲１３にしたがって製造された遺伝子で（Ｍｅｔ−−’） ＩＧＦ−Ｔ　；　ＣＭｅｔ　−’）　ＩＧＦ４１　；　ＣＴｈｒ５９）　＋ＧＦ −１；　ｌ：Ｖａ１５９１１ＧＦ−１；　（Ｌｅｕ”　）　ＩＧＦ−Ｉ　；　Ｃ Δｒｇ”Ａｒｇ”５〕ＩＧＦ−４Ｉ　；およびＩＧＦ−ＩＩ−Ｃ−１゜ からなるグループから選ばれた１個のインシュリン様成長因子ポリペプチド類似 体を指定するもの。 １８、請求の範囲１３にしたがった製造された遺伝子で、その中で。 インシュリン様成長因子を指定している塩基コドンが、それぞれ１合成されたポ リペプチドにおける。追加の最初および／または末端アミノ酸を指定している最 初および／または末端コドンを含むもの。 １９、請求の範囲１日にしたがった製造された遺伝子で、その中で。 追加のアミノ酸を指定している該最初のコドンがアデニン含量の高い、最初のコ ドンであるもの。 ２０、請求の範囲１９にしたがった製造された遺伝子で、その中で。 該アデニン含量の高い、最初のコドンが次の塩基配列から成るもの： ５’　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＴＧＧ　ＡＴＣＣＣＡ−３’。 ２１、請求の範囲１３にしたがった製造された遺伝子で、その中で。 インシュリン様成長因子を指定している塩基コドンが、　ＤＮＡ配列の制限エン ドヌクレアーゼの認識位置となりうる塩基配列の一部から成っている塩基配列に 先行され、および／または、後続され、および／または、これを含むもの。 ２２、請求の範囲１または１３にしたがった製造遺伝子がら成る融合遺伝子で、 請求の範囲１または１０の製造された遺伝子によりコード化されたポリペプチド 生成物を含む融合ポリペプチドの合成を可能にする方法での第２のポリペプチド の合成を指示できる第２遺伝子に融合しているもの。 ２３、請求の範囲２２にしたがった融合遺伝子で、その中で、該第２遺伝子が、 β＝ガラクトシダーゼ酵素の合成を指示する遺伝子であるもの。 ２４、請求の範囲１または３にしたがった製造された遺伝子を含む生物的機能の 高いＤＮＡ微生物変換ベクトル。 ２５、請求の範囲２２にしたがった融合遺伝子を含む生物的機能の高いＤＮＡ微 生物変換ベクトル。 ２６、請求の範囲２４または２５のいずれかにしたがったベクトルで。 円形ＤＮＡプラスミド。 ２７、請求の範囲２４または２５のいずれかにしたがったベクトルで変換した微 生物。 ２８、インシュリン様成長因子ポリペプチドの産件の製造は次のものから成る： 適当な栄養状態で成育する微生物で、請求の範囲１にしたがって製造された遺伝 子を含む生物機能性の高いＤＮＡにより変換され、それによって該微生物が該遺 伝子を発現し。 インシュリン様成長因子ポリペプチドを産生ずる。 ２９、次のものからなるインシュリン様成長因子ポリペプチドの産生のための製 法： 適当な栄養状態で成育する微生物で、請求の範囲１にしたがって製造された遺伝 子を含む生物機能性の高い１）ＮＡにより変換され、それによゲでインツユリン 様成長因子ポリペプチドを産生ずる。 ３０、次のものから成るインシュリン様成長因子ポリペブチ［の産生のための製 法： 適当な栄養状態で成育する微生物で、請求の範囲３にしたがった製造された遺伝 子を含む生物機能性の旨いＤＮＡにより変換され、それによってインシュリン様 成長因子ポリペプチドを産生ずる。 ３１、請求の範囲２８または２９にしたがった製法で、その中で、成育された微 生物は、　Ｅ、　ｃｏｌｉ−である。 ３２、次のものから成るインツユリン様成長因子ポリペプチドの産生のための製 法二 適当な栄養状態で成育する微生物で、請求の範囲１３にしたがって製造された遺 伝子を含む生物機能性の高いＤＮＡにより変換され、それによってインシュリン 様成長囚子ポリペプチドを産生ずる。 ３３、請求の範囲３２にしたがった製法で、その中で、生育された微生物ばもヨ 改月−である。 ３４、請求の範囲１にしたがって製造された遺伝子を微生物内で発現するポリペ プチド生成物。 ３５、請求の範囲２にしたがって製造された遺伝子を微生物内で発現するポリペ プチド生成物。 ３６、請求の範囲３にしたがって製造された遺伝子を微生物内で発現するポリペ プチド生成物。 ３７、請求の範囲１３にしたがって製造された遺伝子を微生物内で発現するポリ ペプチド生成物。 ３８、次のものから成るグループから選ばれたクレーム３７にしたがった生成物 ： （Ｍｅｔ−’）　ＩＧＰ−１；　ＣＭｅｔ−’）　ＩＧＦ−１１；　ＣＴｈｒ５ ９）　ＩＧＦ−１；　（Ｖａｌ”　）　ＩＧＦ−１；　（Ｌｅｕ５９）　ＩＧＦ −１；　（＾ｒｇＳａｇｒｇ５５〕ＩＧＦ−１１ｉ　およびＩＧＦ−１１−Ｃ− １゜３９、請求の範囲１または１３にしたがったラジオアイソトープ標識された 製造遺伝子から成る試薬材料。 ４０、　請求の範囲３４．３５．３６または３７のラジオアイソトープ標識生成 物から成る試薬材料。 ４１、請求の範囲３９または４０にしたがった試薬材料で、その中で。 該ラジオアイソトープとはｌ１２５であるもの。 ４２、請求の範囲３４．３５．３６または３７にしたがった。プラスチックビー ズの表面上にコートされたポリペプチドに対するタソグド抗体から成る試薬材料 。