JPS59205997A - ヒト−インシユリン様成長因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） １、発明の分野 成長ホルモンの生体内適用に続いて生ずる内体的成長が
、有光分裂性インシーリン様成長因子の群によシ介在さ
れ、このペプチドの血清白濃度か成長ホルモンに依存す
ることか予想される。とれらのペプチドには、ソマトメ
ジン−Ｃ１ソマトメジン−Ａ１並びにインシーリン様成
長因子Ｉ及びＩ［（ＩＧＦ　Ｉ及びＩＧＦ　ＩＩ　）が
含まれる。ＩＧＦ　Ｉ及び■はヒトー血消から分離する
ことができ、そしてインシュリンのアミノ酸配列に広範
囲に相同なアミノ酸配列を有する。現在、これらの成長
因子の限定された量のみがヒト−血清からの分離によシ
得られる。従って、組換ＤＮ人技法によって比較的大量
の成長因子が製造できることは、科学的、及び臨床的に
非常に有利である。

２従来技術の記載 ヒト−インシュリン様成長因子■及びＩｔ　（ＩＧＦｌ
及び■）のアミン酸配列ば沓ず、それぞれ、Ｒｉｎｄｓ
　ｒｋｎｅ　ｃｈｔ及びＨｕｍｂｅｌ　（１９７８）　
Ｊ。

Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ。２５３：２７６９−２７７６：及
びＲｉｎａｅ　ｒｋｎｅｃｈｔ及びＨｕｍｂｅｌ　（１
，９７８）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　８９　：　２８
３−２８６　、によシ決定された。ＩＧＦ受容体の性質
がＭａｓｓａｇｕｅ及びＣｚｅｃｈ　（１９８２）　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｒｎ。２５７：５０３８−５０４
５において検削されている。

Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　、　Ｃｅ１ｌ
　（１９８２）３０：９３３−９３４は、成熟α−ファ
クターの４個のクンデムコピーを含有する推定上のα−
ファクター前駆体を記載すると共に、その配列を記録し
そしてプロセシング機構を仮定している。

Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｔｔｚは、１９８１年
のＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　Ｍ？ｅｔ
ｉｎｇ　ｏｎ　ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｉａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔの俊約省第２４２頁において、
ｒ　Ａ　Ｐｕｔａｔｉｖｅ　Ａｌｐｈａ　−Ｆａｃｔｏ
ｒ　　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　
　ＦｏｕｒＴａｎｄｅｍ　Ｒｅｐｅａｔｓ　　ｏｆ　Ｍ
ａｔｕｒｅ　　Ａｌｐｈａ　　−Ｆｏｃｔ□ｒ　ｌと題
して、α−ファクターについてコードする配列及びこれ
らの２他；の配列間のスペーサーについて記載している
。

（発明の要約） 成熟ヒト−インシーリン様成長因子（ＩＧＦ　）を効率
的に製造するだめの方法及び構成物が提供される。特に
、酵母宿主中での［ｆしＪ　−ＩＧＦ　Ｉ及び「プレＪ
　−ＩＧＦ　ｎの発現が培地へのＪ？ポリペプチド分泌
を促進する。異る分離源に由来するＤＮＡ配列を連結す
ることによりＤＮＡ構成物を生じさせる。この分離源に
は天然源及び合成源の両者が含まれる。得られたＤＮＡ
構成物は酵母中で安定に複製し、そしてプロセシングさ
れた「プレ」−ポリペプチドの効率的で高レベルの生産
をもたらし、このポリペプチドは培地から高収量で分離
することができる。

（具体的な態様の記載） ヒト−インシュリン様成長因子（ＩＧＦ　ｌ及び■）を
発現するととができるＤＮＡ配列が提供される。

これらのＤＮＡ配列はベクターに導入することができ、
そして得られたプラスミドを使用して感受性宿王を形質
転換する。組換プラスミドを用いる感受性宿主の形質転
換によ）、インシーリン様成長因子の発現及びポリペプ
チド生成物の製造がもたらされる。

特に、前駆体ポリペプチドをプロセシングしそして成熟
ポリペプチドを培地中に生産することができる酵母宿主
中で前駆体ポリペプチド（「プレ」−’　ＩＧＦ　１　
、汲び「プレＪ　−ＩＧＦ　Ｕ　）を産べ三せ図るだめ
の飴規なりＮＡ構成物・が提供される。このＤＮＡ　ｓ
放物は、酵母宿主中で安定に維持され得る抄製系、効果
的なプロモーター、前記構造遺伝子とリーディングフレ
ームが一致するり−〆一及びプロセシングシグナルを含
む構造遺伝子、及びとの構造遺伝子から下流にある転写
彰結配列を含有する。場合によっては、転写飢御、遺伝
子の増幅、転写の外部的制御、及びこれらに類すること
のための他の配列を備えることができる。「プレ」−Ｉ
ＧＦ　Ｉ及び「プレ、Ｊ　−ＩＧＦ　Ｉｔは、成熟ポリ
ペプチドについてコードするＤＮＡ配列が＞１’；？　
ｉ刀によシ効果的に認識されるプロセシングシグナルを
含むリーダー配列と連結されてお多、そしてリーディン
グフレームが一致していることを意味する。そして、「
プレ」は酵母宿主と１達する分泌及びプロセシングシグ
ナルを示し、そして目的のポリペプチドをコードする遺
伝子と関連するプロセシングシグナルを示すものではな
い。

ＤＮＡ構成物の調製においては、複製系、プロモーター
、リーダー及びプロセシングシグナルを包む構造遺伝子
、並びにターミネータ−を体現する個々の配列を、得ら
れたプラスミド中でこれらが適切に機能することができ
ることを保証するように所定の順序に一緒にすることが
必要である。後記のごとく、配列の適切な方向と順序を
保証するためにアメシタ−を使用することができる。

使用するＩＧＦＩ及びＩＧＦＩＩ遺伝子は染色体ＤＮＡ
。

ｃ　ＤＮＡ　％　合成りＮＡ、又はこれらの組合わせで
あってよい。リーダー及びプロセシングシグナルは通常
、ポリペプチドの分泌をもたらす酵母中の天然ＤＮＡ配
列から誘導される。ｕＬｆＥｔによシ自然に分泌される
これらのポリペプチドにはα−ファクター、ａ−ファク
ター、敵性ホスファターゼ、及びこれらに類するものが
含まれる。抄製系、プロモーター、及びターミネータ−
１τむイト、放物を構成する他の配列はよく知られてお
シ、そして文献に記載されている。

この炎明のＤＮＡ倹成物酸物成、するために連結される
計速のＤＮＡ配列は程々の分離源からｄ導されるであろ
うから、これらの配５列をコネクター分子又はアダプタ
ー分子によ多連結するのが好−ましい。

特に、リーダー及びプロセシングシグナル配列のコード
銀の３味侑をＩＧＦコード鎖の５′床峙にこれらのそれ
ぞれの相１ｉｉｉ的ＤＮＡ　ＩＥ＋と共に連結するため
に、アダプターを有利に使用することができＺ０リーダ
ー及びプロセシングシグナル配列は、コード領域の所定
の数の塩２Ｓ効が欠失するように、３′末端の近くで内
部的に制限されてもよい。そして、リーダー及びプロセ
シング配列がＩＧＦコード鎖と連結された際に欠失した
塩甚対が与えられそしてＩＧＦコード鎖がリーダー配り
１］に対して適切なリーディングフレーム内にあるよう
に、アダプターを構成することかできる。ポリペプチド
のＣ末端が天然のＣ末端と同一であることを保証するた
め、合成ＩＧＦコード領域及び／又はアダプターはその
３′末端に翻訳終結コドンをセするであろう。

アダプターはコード配列中に約５〜４０塩基、さらに一
般には約８〜３５烙、基を有し、そして接着末端又は平
滑末端のいずれかを有することかでき、そして接滋末端
が好ましい。アダプターが遍轟な相補的接着末端を有す
る２種類の異るＤＮＡ配列と選択的に連結するように、
アダプターの各末端は異る制限酵素にＮ違する接光末☆
ｉｈ：を有することが好ましい。

この発明を、酵母α−ファククーのリーダー及びプロセ
シングシグナルに連結された、ＩＧＦＩ及びＩＧＦ　Ｉ
ｆについてコードする合成断片に関して説明する。酵母
α−ファクターをＨｉｎｄｌｌｌ及びＳａ／−ｉによシ
制限する。ＨｉｎｄＴｆｆはα−ファクター前駆体のプ
ロセシングシグナル中ｇｔｕコドンのコード鎖中の第２
塩基の３′を１裂せしめ、他方、ＪｉｉｎｄＩＩ！認跪
配列はｇＡｕコドンを終え、ａＬａについてコードし、
そして成熟α−ファクターのアミノ末端ｔｒｐコドンの
第１の５′塩基を与える。５ａＡ１部位は、α−ファク
ター遺伝子の転写の方向に関して転写クーミネーターの
上流に位置する。

、■ＧＦについてコードする合ｈ＆　Ｍ嵌子は、ＩＧＦ
Ｉ及ヒＩＧＦ　ｆｌポリ被グチドの公知のアミノ酸配列
に基礎をｔｉ：ｉ−＜ヌクレオチド配列を有するであろ
う。

好ましくは、この合成配列は、例えば耐匂、の解樵系ｒ
：￥素についてコードする遺伝子において見出されるコ
ドンの頻度に裁いて、酵母宿主により優先的に使用され
るコドンを用いるであろう。便利には、合成配列は、ク
ローニングベクター中の制限部位に挿入するために平滑
末端ではなくむしろ接着末端を含有するであろう。さら
に、ＩＧＦＩ／ＩＧＦ　Ｉｔ雑種ペプチド分子を産生せ
しめることができる配列にアニールされる断片を生成せ
しめるだめに、サイレント変異を用いて合成配列中に昏
１］限部位を予定することができよう。

例においては、合成断片にｐｃｏ　ＲＩ用の接オ′１−
末端を設け、そしてｐＢＲ３２８中のＥｃｏ　ＲＩ部位
に挿入する。通常、合成配列はポリペプチドコート８領
域の各端の内側に追加の制限部位を有するであろう。こ
れらの内部制限部位は、クローニングベクターからコー
ド領域を正確に切り出しそしてアダプターと連結し、こ
れによってリーダー及びプロセシングシグナル並びにコ
ード領域を含有する最終ＤＮＡ構成物が転写ターミネー
タ−に対して適切ガリーディングフレームを有しそして
適切に並置されるように選択される。好ましくは、制限
部位は開裂部位から離れて認識部位を有し、シ１４裂は
コード領域の内側に向けられ、そして認識部位が失われ
る。これによシ、ヌクレオチド配列にかかわシなくコー
ド領域の各端における正確な開裂が可能となる。例にお
いてはＨｇａｌを用いる。

合成遺伝子の調製においては、オー・ぐ−ラップする単
鎖ＤＮＡ　（ｓｓ　ＤＮＡ　）断片を常法に従って調音
する。このｓ　ｓ　ＤＮＡ断片は通常約１０〜４０塩基
の長さを有する。さらに相当長い断片を使用することも
できるが、この場合に（ｒ：ｉ合成状Ｋｒ、が低下し、
そして適切な配列が不注意に分解されておらず又は変化
してい疫いことを保証するのが困μＪｌとなる。ｓ　ｓ
　ＤＮＡ断片を合成した後、これらをアニーリング条件
下で、適切な１１箇序を確保しなから相柿的塩基刻と連
結（Ｊｏｉｎｉｈｇ　）する。次に断片の端を結合（ｌ
ｉｇａｔｅ　）せしめ、そして得られた合成りＮＡ、　
！断片を、通−常は細菌宿主、％４えばＥ。コリ（Ｅ、
ｅｏｉｌ　）中でクローニングし、そして増［１毘せし
める。前記のごとく、合成構造遺伝子には、目的のクロ
ーニングベクター中の適当な制限部位に相補的な接滝末
端、及びコード領域の正確な切シ出しを可能にする内部
認識部位を設ける。合成自己夕）１をクローニングしそ
して坤、′１・］４せしめた後、通常の量のこの配列を
、通常はＩＧＦコード領域のいずれかの末端の内部制」
限部位において切シ出す。

便利には、使用するプロモーターは、リーダー及ヒプロ
セシング配列に関連するプロモーターでおる。このよう
にして、効率的な転写のために適切々空間的関係におい
てプロモーター及びリーダー配列をも有する５′−ボー
タブ１項素が有られる。

さらに転写ターミネーターを含有せしめることによシ「
プロモーター／リーダー−制限部位−ターミネーター」
から成る「カセット」が得られ、ＩＧＦコード＠域がア
ダーブタ−各月いて挿入される。通常、このようなカセ
ットは、イｄ主によシ分泌され２ポリペプチドを発現す
るｉＵ’ｉ−〜イ酋主由来の無傷の遺伝子及びこの遺伝
子の上流及び下３ｔｉ；の転写制御配列を含むＤＮＡ断
片を分離することによｐ得られる。

前記の方法に代えて、天然の１ｌｉ４州プロモーターの
代シに転写制御を可能にする他のゾロモークー全使用す
ることができる。この方法においては、異るプロモータ
ーを挿入するために、ソータ８−配列から上流の配列決
定及び／又は制限地図の作成が必要であろう。ある場合
に（ｒ−ｔ、天然の酵母プロモーターを保持し、そして
この天然の酵母）０ロモ−クーから上流又は下流にクン
デムに第２のプロモークーを設けるのが打首しいであろ
う。

広範囲の′ｆ）類・のプロモーターを入手することかで
き、又は酵母遺伝子から得ることができる。酷に有利な
プロモーターに（θ−１好１砧系における醇素に関する
プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロダナーゼ
、ピルベートキナーゼ、トリホースホスフェートインメ
シーゼ、ホスポダルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキ
ナーゼ咎に関するプロモーターが含壕れる。これらのプ
ロモーターを１１１：厖りｊ配列、例え’Ｄニエンハン
サー、オペレーターク４１と共に使用することによシ、
そして無傷の制侶１系を有する宿主ケ使用することによ
シ、プロセシングされた「プレＪ　−ＩＧＦの発現を制
御することができる。すなわち、椋々の小有桜分仔、例
えはグルコースを用いて目的ポリペプチドの産生の制御
を行うことができる。

さらに、温度の変化による転写の調節を可能にする温度
感受性制御変異株を使用することもてきる。すなわち、
非許容（ｎｏｎ　−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ　）温度で細
胞を増殖せしめることによりＭｉｌ！胞を高濃度に増殖
ぜしめることができ、ぞのｐｉＧＦＩ及びＩＧＦ　ＩＩ
の「プレ」−ポリペプチドの発現をも友らすために辺１
度をムえることかできる。

初成物中に他の能力を妬１入するとともできる。

例えは、宿主へのストレスに際しそのストレスに応答す
る込嵌子のみならずフランク・領域も」ゾ゛すλ゛７３
される場合には、増幅のために幾つかの魁嵌子を用いる
ことができる。このような遺１沢子を、プロモークー、
コード領域、及び「プレ」−ポリペプチドの転写制御を
もたらす他の制御シグナル〃゛・ら」二流に配化′シ、
そして酵母存生をストレスすることによシ、「プレ」−
ポリペプチド遺伝子をその制御配列と共に含有する多数
の反復配列を有するグラスミドか得られるであろう。代
表的′ｆｒ、遺伝子にはメタロチオネイン及びジヒドロ
フォレー）　Ｌ／ダクターゼ遺伝子が含まれる。

構成物は、リーダー配列断片に加えて、宿主ダノムと相
同の他のＤＮＡを含有することができる。

ＩＧＦ遺伝子を染色体へ組み込むことが好ましい場合に
は、ＩＧＦ遺伝子構成の周縁に宿主の染色体ＤＮＡと相
同の配列を設けることにより組込みを促進することかで
きる。

使用する複製系はＣ４母宿主によシ認識されるであろう
。従って、複製系は酵母・宿主にとって本来的（ｎａｔ
ｉｖｅ　）であることが好ましい。多数の酵母ベクター
がＢｏｔｓｔｅｉｎ等、Ｇｅｒ、ｅ（１９７９）８：１
７−２４によシ報告されている。唱−に有利なものは２
μｎ；シラスミド複奴糸を含有するＹＥｐシラスミドで
ある。これらのプラスミドは、多コピー数において安定
に８．持される。これに代えて又はこれに加えて、安定
な維持を得るためにＡＲ８１とＣＥＮ４との組合わせを
用いることかできる。

各操作の後、ふされしい場合には、構成物をクローニン
グし、純粋にそしてさらに操作するのに十分な訛、にお
いて所争の構成物を得る。クローニングを原核性生物、
特にルヨ甲で行うことができるように、シャトルベクタ
ー（すなわち、酵母及び細菌の複製開始点の両者を含有
するベクター）を使用することが好ましい。

プラスミドは、酵母宿主細胞又はスフェロプラストを用
い、そして形質転換のだめのカルシウム沈澱ＤＮＡもし
くはりポゾーム、又は他の常用技法を用いながら、任意
の便オし１な手段により酵母イ占主に導入することがで
きる。変性された宿主は、発現グラスミドを構成するた
めに使用されるベクター中に通常設けられている遺伝的
マーカーに従って選択することができる。プラスミドが
、宿主を補完（ｃ’ｏｒｎｐｌｅｍｅｎｔ　）　Ｌそし
てこれに原栄養性を付与する遺伝子を有する場合、栄養
袈求性イ自主を用いることができ、る。他の方法として
、飯当な殺生物剤、例えは抗生物質、重金！）、青紫、
又はとれらに類するものをマーカーとしてシラスミドに
導入することができる。次に、親糺胞をストレスするこ
とによってプラスミド含有細胞を選択することができる
栄養培地を用いることによシ選折を行うことができる。

次に、プラスミド含有細Ｈ（りを追白な栄養培地に増殖
せしめ、そして目的とする分泌されたポリペプチドを常
法に従って分離する。

ポリペプチドはクロマトグラフィー、濾過、抽出等によ
、！１１１ｉ￥′ｔ！ｊすることができる。ポリペプチ
ドは培地中に成熟形として存在するであろうから、目的
のポリペプチドを取シ出し表から培地を連続的に循舐す
るととができる。

次に例によシこの発明をさらに具体的に説明する。但し
これによシこの発明の卸、囲を限定するものではない。

（実馳） ４Ｔ寸しい酵母コドンを有するヒト−インシーリン様成
長因子■及びＩＩ　（ＩＧＦ　Ｉ及びＩＧＦ　ＩＩ　）
のヌクレオチド配列を、それぞれ、Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅ
ｃｈｔ及びＨｕｍｂｅｌ　（１９７８）　Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５３：２７６９−２７７６　；及びＲｉｎｄｅｒｋｎ
ｅｃｈｔ及びＨｕｍｂｅｌ　（１９７８）　ＦＥＢＳ　
Ｌｅｔｔｅｒｓ　８９　：２８３−２８６において報告
されたアミノ酸配列に基いて察出した。配列（コード鎖
を５７−３７で示す）を次に示す。

以下余白 この配列は両端にＥｃｏＲＩ接着末端を有する。

［ＧＦＩ（７）コードはコード鎖の１６塩基から始捷り
２２５塩基で終わる。Ｈｇａ（制限部位がＩＧＦＩコー
ド領域の両端に位置する。Ｈｇａ）認識部位（５′−Ｇ
ＡＣＧＣ−３’　）はＩＧＦ　ｉコード領域の外側、す
なわち合成配列の末端とＨｇａｌ開裂部位の同に存在す
る。

１６塩基から始まシ２１９塩基で終わるコード鎖を有す
るＩＧＦ■合成配列も合同様に構成される。

ＩＧＦ　■についてすぐ前に記載した配列を有するＩＧ
Ｆ　Ｉのだめの合成りＮＡ断片を、燐アミディト（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ法）　（１９’８３年１月
１２日に出願された係属中の出願Ａ４５７．４１２を参
照のこと）を用いて２０種類のオーバーラップ５ｓＤＮ
Ａ断片を合成することによシ調製した。

ａｓＤＮＡを次に示す。

ｙ。下企白 標示　　　　　　　　　　配　　　列 Ａ　　　　　　ＡＡＴＴＣＧＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＢ−
Ｉ−Ｉ　　　ＧＴＣＣＡＧＡＡＡＣＣＴＴＧＴＧＴＧＧ
ＴＣ−１−２ｂ　　　ＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＣ−１
−２ａ　　　ＧＡＴＧＣＴＴＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴＤ　
　　　　　ＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴ
ＡＣＴＴＣｌ−３ＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＴＡ
ＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＥ−［４ＴＡＧＡＡＧＡＧＣ
ＴＣＣＡＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＴＣＧＴＴＦ−［５ＧＡ
ＣＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣ
ＴＴＧＧ−［６ＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＣ
ＴＧＴＧＣＴＩ−７ＣＣＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＴＡ
ＡＧＴＣＴＨ−［８ＧＣＴＴＧＡＡＴＧＣＧＴＣＧＪ−
Ｉ−９ＧＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＡＡＧＣＧＴＣＧ
Ｋ−１−１０ＡＡＡＧＣＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧ
ＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＧＬ　　　　　　ＣＴＣＴＧＴＣ
ＡＣＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＴＴＧＣＭ−Ｉ−１１ＡＡＣ
ＣＧＧＴＴＧＧＣＴＴＧＴ’Ｉ’ＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡ
Ｃ１−１２、ＴＧＧＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡ
ＧＡＡＣＣＧＴＩ−１３ＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴ
ＣＡＡＣＧＡＴＡＣＣＧＧＴＴＴＧＮ−ｉ−１４ＣＣＡ
ＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＣＴＩ−１
５ＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧＴＡＣＡＴＴ
Ｔｌ−１６ＡＡＴＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＣυ１ＧｃＡＧ
ＡｃＴＴＡＧｃＴｓｓＤＮＡを次のようにして連結する
。Ａ及びｌ−１６以外の各セグメント５０ｐモルずつを
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′−燐酸化し
た。

５０ｐモルずつのすべての断片を、１８μｌのプールと
して１段階で、１．５時間にわたって９５℃から２５℃
に冷却することによりアニーリングした。

１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ　、　１００　ｍＭ
のトリス−Ｉ（ＣＡ　、　ｐＨ７，８，１０ｍＭのＭｇ
Ｃ４２，１μＩ／７ｒＬｌのスペルミジン及びＴ４１Ｊ
ガーゼを含有する３０μｌの反応容積中で連結（ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ　）を行った。次の方式１に示す断片の順序
及び対形成（ｐａｉｒｉｎｇ　）から得られる適切な２
重鎖断片を、７チネイテイブポリアクリルアミド軍気泳
動グル上で精製した。

以下余白 ＩＧＦＩのＤＮＡ配列を同様にして合成した。次の追加
のｓ　ｓ　ＤＮＡ断片を調製した。

Ｂ−ｎ−Ｉ　　ＣＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＣＧＡＡＡ
ＣＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＣ−ｎ−２ＧＧＴＧＡＡＴＴＧ
ＧＴＣＧＡＣＡＣＣＴＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴｎ−３、Ｔ
ＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＴＴＣ’ＣＡＧＡＧＴＴＴＣＴＥ
−ＩＩ−４ＡＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴ
ＴＦ−１１−５ＧＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡ
ＴＣＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧ−１１−６ＧＣＴＴＴＧＴ
ＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣ’ｌ”Ｈ−ＩＩ−７
ＡＣＣＣＣＡＧＣＴＡＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＴＧＣ
ＧＴＣＧＪ−１１−８ＧＴＴＴＣＧＧＡＴＧＧＴＣＴＧ
ＴＡＡＧＣＣＡＴＡＡＧＣＧＴＣＧＫ　−ＩＩ　−９Ａ
ＡＧＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡ
ＣＡＡＧＭ−Ｉ［−１０ＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＧＡＧ
ＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣｎ−１１ＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴ
ＡＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＩＩ−１２ＧＡＡＡＣＡＡＣＡ
ＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＣＴＮ−ｎ−１３ＴＴＣ
ＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＣＴｎ
−１４ＡＧＡＣＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＴＡＧＣＡＣＡＧ
ＴＡＧＧＴＩＩ−１５ＡＡＴＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＣＡ
ＴＴＣ以下余白 これらのｓ　ｓ　ＤＮＡ断片の２００ｐモル及び断片Ａ
１Ｄ及びＬを上記の方法と同様にして連結した。この場
合、Ａ及び１−１５＆燐酸化せず、次のようなセグメン
トの順序及び対を生成せしめた。

以下余白 合成りＮＡ配列をｐＢＲ３２８のＥｃｏＲ１部位に挿入
してプラスミドｐ３２８　ＩＧＦ　Ｉ及びｐ３２８ＩＧ
Ｆ　ＩＩを潤Δし／ζ。クローニングした後、ＩＧＦコ
ード釦を、、Ｈｇａｌを用いて切シ出した・次に合成オ
リゴヌクレオチドアダン６ターを、ＨｇａＩ制限断片に
連ｉｆｍＪｉ　Ｌ／た。工ＧＦＩのだめのアダゲタ−は
次の配列を有する。

（ａ）　　５’　−ＡＧＣＴＧＡＡＧＣ’ｒ−３’３’
　−ＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＧ−５’（ｂ）　　５’　−
ＣＴＧＣＴ’ｒＧＡＴＡＡＧ−３’３’　−ＡＣ’ｆ’
ＡＴＴＣＡＧＣＴ−５’コード鎖の方向に１）１．ｉシ
て、第１アダフ０ター（ａ）の３′末＼’ｉ＆はＩＧＦ
　１合成配列」二の”ｇ’　Ｉ　１５ｉ４裂部位と相補
的であシ、他方第１アダフ０ターの５′末端はＨｉｎｄ
　Ｉ’ｌｌ　ｊχ方し９９品を！Ｊ（する。第２アダプ
ター（ｂ）はその５′末端において、ＩＧＦＴ配列の３
′末端のＨｇａｉ開裂部位に相Ｊｉ的であり、他方アダ
プターの３′末端は影すＩ接着末端を供する。

ＩＧＦ　Ｉ［について、アダプターは次の配列を有する
。

（ｃ）　　　　５’　−ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴ−３’３
’　　ＣＴＴＣＧＡＣＧＡＡＴ−５’（ｄ）　　　　５
’　−ＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＡＧ−３’３’　−ＡＣＴ
ＡＴＴＣＡＧＣＴ−５’第１アダプターに関して上記し
た方向に関して、（ｃ）はその３′末端においてＩＧＦ
ＩＩ合成配列中の５′−馬上Ｉ開裂部位に相補的であり
、他方５′末端ば」罰ｄ　ＩＩＩ接着末端を供する。第
２アダプター（ｄ）はその５′末端においてＩＧＦＩ［
合成配列中の第２馬臼Ｉ開裂部位に相補的であり、そし
てその３末端においてシ四Ｉ接着末端を供する。

合成断片及びそれに連結したアダプターを１旧１１８用
ダル電気泳動によシ精製し、そしてエンドヌクレアーゼ
Ｈｉｎｄｌｌ［及びＳａｌ　Ｉにより前もって完全消化
しておいた１　００　ＪのｐＡＢ　１１３に連結した。

ｐＡＢ　１１３はｐＡＢ　１１２から、３個の６３　ｂ
ｐ顯ユｄｌｌｌ断片を除去することにより誘導した。ｐ
ＡＢ１１２は、且担ｄＩＩＩ及びジ１１部位が除去され
ているｐＢＲ３２２のＥＩＣＯＲ１部位中でクローニン
グされた酵母α−ファクター遺伝子を有する１、８ｋｂ
二部Ｒ１断片を含有するプラスミドである。プラスミド
１１２は、プラスミドＹＥｐ２４のＢａｍＨＩ部位中で
部位−ニングされた部分５ａｕ３Ａ断片として酵母α−
ファクター遺伝子を含有するプラスミドｐＡＢ　１０１
から誘導した。ｐＡＢ　１０１は、公表されているα−
ファクターコード領域（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏ
ｗｉｔｚ＋　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　１９８１　　Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ
　ｔｈ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｙ
ｅａｓｔｓ　、　２４２頁）と相同の酵素的にＰ　放射
性ラベルした合成オリゴヌクレオチドを用いてＹＥｐ　
２４中でクローニングされた酵母ゲノムライブラリをス
クリーニングすることによシ得だ。

イむられた混合物を用いて且、ｒ９ＨＢ　１０１の細胞
を形質転換し、そしてＩＧＦＩ及びＩＧＦｎについてそ
れぞれシラスミドｐＡＢ１１３−　ＩＧＦ−１及びｐＡ
ＢＩ　Ｌ　３−　ＩＧＦ−１を得た。

それぞれＩＧＦｉ及びＩＧＦＩＩ構造遺伝子を有するプ
ラスミドｐＡＢ１１３−　ＩＧＦ−１及びｐＡＢ　１１
３−ＩＧＦ−Ｉｆ（各５μｇずつ）を旦輩−Ｒ１によシ
完全消化し、そして得られた断片を過剰のＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩアダゲタ−に連結し、そしてＢａｍＨＩで消
化した。得られた１、８ｋｂシュＨｉ断片を調製用ゲル
電気泳動により分離し、そして約１００　ｎｇの各断片
を、あらかじめＢａｍＨＩで完全消化しそしてアルカリ
ホスファターゼで処理した１００ｎ、ＨのｐＣ１／１に
連結した。

プラスミドｐｃｔ／１はｐＪＤＢ２１９　、　Ｂｅｇｇ
ｓ　。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）２７５：１０５．の誘導体
であ見この場合ｐＪＤＢ２１９における細菌プラスミド
ｐＭＢ　９に対応する領域はｐｃ１／１においてはｐＢ
Ｒ３２２によシ置き換えられている。各連結混合物を用
いてＬ三丈ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換した。形質転換体
をアンピシリン耐性により選択し、そしてそのプラスミ
ドを制限エンドヌクレアーゼ消化によシ分析した。各構
造遺伝子ＩＧＦ（又はＩＧＦ　ｉＩについて選択したそ
れぞれのクローンからのＤＮＡ　、　（ｐＹＩＧＦ−Ｉ
−１０／１）又は（ｐＹＩＧＦ−Ｉ［−１０／１）を調
製し、そしてこれを用いて酵母ＡＢ１０３細胞を形質転
換した。形質転換体をそのＬｅｕ＋衣現型によＩ）選択
しだ。

シラスミド（ｐＹＩＧＦ　−ｌ−１０／１　）により形
質転換されだ醇母株ＡＢ１０３（μ２エリムニ王。

シ肥２−ｉ１．２．±３−５２　、虫辷工Ｕ）の培養物
（５１及び９１）をロイシン不含培地中で３０℃にて飽
イ［］（光学濃度６５０　ｎｍにおいて５）まで増殖せ
しめ、そしてさらに１２時間３０℃にて振とうを継続し
た。細胞上澄液を遠心分！’７ｆ＋：により各ｊ召養物
から集め、そしてＩＧＦ　ｌをイオン交換）ｌ！′８１
脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｊＪ
＝　＋リッチモンド、カリホルニア製１３ｉｏｒｅｘ−
７０）への吸着によりＮ６−眉ｊした。８０％エタノー
ル中１０１購ＨＣＡにより浴出し７ζ後、ＩＧＦ分画（
それぞれＱ、　４．　ｍｌ及び３　ｍｌ　）を全蛋白質
濃度及びＩＧＦＩＤ度について全１ｊ％Ｌ　Ｌだ。蛋白
質は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社。

す、テモンド、カリホルニア製、クーマシーブル−（Ｃ
ｏｏ＋ｎａｓｓｉｅＢｌｕｅ　）により測定した。ＩＧ
ＦＩ６１１］定（は、放射性ラベルしだＩＧＦ　Ｉを用
いる常用のＦ　１１“う・ノオイムノアッセイにより行
った。この結果を次に示す。

試行番号　容βＪ　濃節後の体積　全蛋白質　　ＩＧＦ
−１１５１０，４ｍｌ　　　’５．０ｍ：）／ｍｌ　　
３．７５ｍｑ／ｗｅ２　　　９１　　　３．０ゴ　　２
，９Ｉ＋汐ｙｍ／、　　３．Ｏｏｒｑり／匈プロラクチ
ンに対するハト−そのうの反応を促進するペゾチドの作
動性効果に基＜ＩＧＦＩのバ・イオアソセイＣＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ等（１９８３）　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎｓ／
　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　−Ｌｉｉ＜ｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ
ｃｔｏｒｓ、５ｐｅｎｃｅｒＥ、　Ｍ、　％　＋パルタ
ー、デグルクー、ベルリン〕により、これらの標品のＩ
ＧＦＩはヒトの血精かも分、−Ｉ［１された真正なＩＧ
ＦＩと同等の活性を有することが示された。

ＡＢ１０３（ｐＹＩＧＦ−ｉｌ−１０／１）を上記と同
様に増殖ぜしめ、そしてＩＧＦＩＩについてのヒト七拾
盤１１ａラジオリセゾター測定（５ｐｅｎｃｅｒ％、７
＋　（１９７９）Ａｃｔ、　　ＥｎｄｏｃｒｉｎａＬ　
９１　：　３６−４８　）により、３９ユニット／ｍｌ
が示された。正′＋’ｉＳなヒトー而鯖は１ユニツト／
　ｔ＋７１を有する。

この発明に従えば、ヒト−インシュリン様成長因子Ｉを
発現し、プロセシングしそして分泌するためにベクター
に挿入される新規な購酸物が提供される。こうして、天
然のヒトーインシーリン様成長囚子Ｉと同じ配列を有す
るη５　ＩＪ波プチドが得られる。分泌により、細胞数
に対して非常に増強された収量が得らｆＬｌそしてその
後の調製揉作及び精製が単え°を化される。

以上説明及び・レロによシこの発明を幾分詳細に記載し
たが、この発明の範囲内において幾つかの変化及び変法
が実施できることは言うまでもない。

なお、酵母菌株ニセレピシエ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　）ＡＢ’１０３（ｐＹＩＧＦ−Ｉ−１０／１）
及びＡＢ１０３（ｐＹＩＧＦ’−ＩＩ　−１０７１）は
１９８３年４月２３日にアメリカン・タイプ・カルチュ
ア・コレクション（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ）に寄託され、
それぞれ番号通２０６７３及び扁２０６７４が与えられ
た。

ｖ６下余白 第１頁の続き ０発　明　者　ジエイムズ・ピー・メリイウェザー アメリカ合衆国カリフォルニア ・バークレイ・ウオルナット・ ストリート１４２７ ■発明者　　ギイー・ミュレンバッハ アメリカ合衆国カリフォルニア ・バークレイ・グローブ・スト リー１−１３２４ ０発　　明　者　ミツキー・ニス・アルディーアメリカ
合衆国カリフォルニア ・サンフランシスコ・アービン グ・ストリート２０９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、適切な宿主中でのヒト−インシーリン様成長因子（
   ＩＧＦ）の効率的製造方法であって、該宿主と適合性の
   ベクター中転写開始領域から下流であってその転写制御
   のもとにある楊造遺伝子を構成するように、適切なリー
   ディングフレーム内に前記宿主に認識される分泌リーダ
   ー配列及びグロセシンダシグナル配列と連結されたヒト
   ーインシーリン様成長因子コード造伝子を有する機能的
   ＤＮＡ構成を含有する宿主細胞を増処ぜしめ、そして分
   泌されたヒト−インシュリン様成長因子を分離すること
   から成る方法。 ２、　ヒトーインシーリン様成督因子遺伝子が宿主によ
   υ優先的に使用されるコドンを有する合成、ｉＪ、−ｊ
   嵌子でちる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　ヒトーインシーリン様成長因子造伝子が次のヌク
   レオチド配列： を有する合成ヒト−インシーリン様成長因子■遺伝子で
   ある牲−許ｄｈ求の範囲第１項記載の方法。 ４、　ヒト−インシーリン様成長因子遺伝子が次のヌク
   レオチド配列： 以下余白 を有する合成ヒト−インシュリン様成長因子■遺伝子で
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、宿主が酵母である特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ６、宿主が酵母であシ、そしてベクターが２μｍプラス
   ミドの誘導体である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、酵母中でヒト−インシーリン様成長因子を発現せし
   め、酵母分泌及びプロセシングシグナルにより促進され
   る前記ヒト−インシーリン様成長因子の分泌をもたらす
   方法であって、ヒト−インシュリン様成長因子について
   コードする第１　ＤＮＡ配列を含有し、そしてコード録
   の５′−末端を前記ＤＮＡ配列の＠′！、’ｌ塩基に又
   はそれよシ下流に冶する第１　ＤＮＡ断片を調製し；酵
   母に認識され得る分泌及びプロセシングシグナルについ
   てコードする第２　ＤＮＡ配列を含有し、そしてコード
   録の３′−末端を前記プロセシングシグナルの末端塩基
   に又はそれよシ上流に有する第２　ＤＮＡ断片を訓製し
   、ここで、前記第１断片及び第２断片の少なくとも一方
   がその末端をコード配列の内部に有することによシ塩基
   対を欠失しており；前記ｉ　１　ＤＮＡ断片及び第２　
   ＤＮＡ断片を、該第１　ＤＮＡ　１４９１片及び第２　
   ＤＮＡ断片の欠失環基対についてコードするアダプター
   によシ、該第１　ＤＮＡ断片及び第２　ＤＮＡ　断片か
   同一リーディングフレーム内にあるように連結し；第１
   断片の下流にそれに隣接して終結コドンを設けることに
   よ、！７「ル」−ヒト−インシーリン様成長因子遺伝子
   を調製し；そしてこの「７″し」−ヒトーインシュリン
   様成長囚子遺伝子を酵旬中の発現ベクター中でクローニ
   ングし、この「プレ」−ヒト−インシュリン様成長因子
   の分泌及びプロセシングを行うことから成る方法。 ８、　前記ヒト−インシーリン様成長因子がヒト−イン
   ターリ４城成長因子Ｉである特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 ９、　前記ヒト−インシュリン様成長因子がヒト−イン
   シーリン様成長因子■でちる％８”Ｉ’　ｊｆ７４　ｇ
   りの範。 凹第７項記載の方法。 １０、　　前記発現ベクターが細菌によｊ’　餡ａｋさ
   れる検板系を含有する特許腎；τ氷の範「第７項記載の
   方法。 １１、　　顔、記鉢母イ゛：；製系が２μ？７Ｚプラス
   ミド又はその音１５分を含んで成るｔｒ￥ｉチ計２求の
   ぐ一匠第７項記彰・の方法０ １２　　ン４−刊（てオー几される乞り征、、シグナル
   の転写制御のもとにヒト−インシーリン様成長因子につ
   いてコードするコード自己り１．を含んで成るＤＮｆｉ
   、　＄へ区物。 １３Ｆ・」記ヒトーインシーリン杼既長園子コートρ己
   多′：゛がヒト−インシーリン様６．長目−子Ｉについ
   てコードづ−る住う許さΣくの九−弛、第１２項町田、
   ｉ〜のＤＮＡ構成物。 １４ｎ・５記ヒト−インシュリン様成長因子コード配列
   がヒトーインシーリン様成長困子■についてコードする
   判−ε干詐求の、、：２Ｉｉ、′第１２項ｇ上載のＤＮ
   Ａ栴成物放 物５　１罫母によシ証記・ぢれるｔ−製系を含有する牲
   許請求の釘四第１２項記載のＤＮＡ構成物。 １６　　前記コード配列の少なくとも一部分が、酵母に
   より優先的に利用されそしてヒトのコドンとは異るコド
   ンを有する％’　ＦＦ　Ｍ？ｒ求の範囲第１２項９【・
   載のＤＮＡ構成物０ １７、　　前記構成物７５壕［貼によジオ；−、用さ才
   １．る袂多、糸を含有する特許請求の１１２囲第１２項
   記式、ニのＤＮＡ　ｊｊＱ取物０ １８　　前記酵母複製系が２μｍプラスミド又はその部
   分を含んで成る特許請求の齢四第１５項記製のＤＮＡ構
   成物。 １９、次の配列： 以下余白 ＆　じ　期　　：２　ミ　二　　−￥　二を含有する特
   許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ構成物０ ２０　　次の配列： Ｊｙ、下余白 を含有する輪、許賄求の範囲第１２．ＩＮ記載のＤＮＡ
   　４’：＋）酸物。 ２１、培禿中の細胞性宿主の発現のだめの、１力及び翻
   訳制御配列に連結された、ヒト−インシーリン様成長因
   子についてコードする配列を含んで成るＤＮＡ構成物。