JPS6398397A - 酵母におけるヒトｐｓｔｉの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトＰＳＴＩの製造方法に関する。

更に詳しくは、ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を有す
るベクターにより酵母を形質転換し、酵母にヒトＰＳＴ
Ｉを産生させヒトＰＳＴＩを得る、ヒ１−ＰＳＴＩの製
造方法に関する。

従来の技術 膵臓に由来するトリプシン・インヒビターには、膵分泌
性トリプシン・インヒビター（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　
５ｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｔｒｙｐｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ、以下ＰＳＴＩと略記）と塩基性群トリプシン・イ
ンヒビター（ｂａｓｉｃ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｔｒ
ｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　）の２種類がある。前
者は哺乳動物に存在し、膵臓の他、腎臓、肺臓、肺臓、
肝臓、脳なとの臓器にも分布する。後者は反飼動物の膵
臓の他、各種臓器に分布するがヒトをはじめとする他の
哺乳動物には存在しない。ＰｕｂｏｌｓらＵ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４９．２２３５．１９７４
）およびＦｂｉｎｓｔａｉｎら（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　４３．５６９．１９７４＞はそれぞれヒ
ト膵液中からヒトＰＳＴ　Ｉを分離精製し、Ｇｒｅｅｎ
ｅら（Ｍａｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　４５．８１３．
１９７６）によりその構造が明らかにされた。ヒトＰＳ
Ｔ　Ｉは第１図に示すとおり５６個のアミノ酸からなる
ペプチドで、分子量は６２４２である。また（ｙｓの団
基はアミノ酸配列９と３８番目、１６と３５番目、２４
と５６番目で、それぞれＳ−８結合をしており、遊離Ｓ
Ｈ基は存在しない。但し、Ｇｒａｉｎｅらによるアミノ
酸配列が、２１番自Ａｓｎ、２９番目Ａｓｐであるのに
対して、本発明者らが決定した配列は２１番目Ａｓｐ、
２９番目Ａｓｎである点で異なっている。Ｅｄｄｅｌａ
ｎｄら（Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　ｐｈｙ
ｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　３５９．６７１．１９７８）
および北原ら（Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｊ、　３．１１１９．
１９７９）はそれぞれ膵液中から得たヒトＰＳＴＩを抗
原としたラジオイムノアッセイ系を確立し、血中ＰＳＴ
Ｉの測定を可能にした。出来ら（Ｂｉｏｃｈａｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、　Ｒａｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　１３２．６０５．１９８５）はヒトＰ
ＳＴＩ（７）ＤＮＡ配列を明らかにした（第２図参照）
。

急性膵炎の自己消化は蛋白分解酵素によって惹起される
。何らかの原因で活性化した少量のトリプシンがトリプ
シノーゲンをはじめ他のＺｙｌｌｌｏｇＱｎの連鎖反応
的活性化を行なうためと言われている。膵腺房細胞に存
在するＰＳＴＩは、膵酵素とともに膵液中に分泌されて
、膵管内で起こったトリプシンの活性化を阻止する。更
に、ＰＳＴＩの一部は逸脱インヒビターとして血中に移
行してｆｒｅｅな状態で存在する（胆と膵、２．２３１
．１９８１）、血中ＰＳＴＩは膵疾患、特に急性膵疾患
で大きな変動を示し、高値維持期間もアミラーゼに比し
長期間である。またプロテアーゼインヒビターとは無関
係に、血中ＰＳＴＩの変動は膵侵襲を鋭敏に反映する（
胆と膵、塁、　３８３．１９８２）。従って、血中ＰＳ
ＴＩを測定することにより、膵疾患の診断と経過観察が
可能になる。

近年の遺伝子工学の発展により、目的のベブチドをコー
ドする遺伝子をベクターに組込み、大腸菌などの細菌に
導入して該ペプチドを大量に得ることは容易な技術とな
りつつある。しかし一般に発現したペプチドは細胞内に
蓄積されるため、生成された蛋白質が細胞の成育増殖を
阻害したり、過剰に生成きれると負のフィードバックに
よって生産性が抑制されることがある。また、短鎖のペ
プチドを細菌内に産生させると、細菌中のペプチダーゼ
によって分解されることがある。目的の蛋白質を採集す
るためには、まず細胞を採集破壊し、該細胞破壊物から
目的の蛋白質を精製しなければならない。この細胞破壊
物中には多くの不純物が含まれ、その一部は人体に有害
であり、そこから純粋な目的の蛋白質を得ることは必ず
しも容易なことではない。

細胞膜を構成する蛋白質や分泌蛋白質などは、その一端
に細胞内外の膜を通過するために必要なアミノ酸配列シ
グナルペプチドを持つ前駆体ポリペプチドとして合成さ
れ、膜通過の際に膜に存在するペプチダーゼによりシグ
ナルペプチド部分は切断され、本来の蛋白質分子となり
その活性および機能を発揮する。上記のような遺伝子組
換技術における欠点を克服するために、この分泌機構を
利用して、菌体外へ目的のペプチドを分泌させる試みが
なされている。特に分泌生産においては、宿主として酵
母が好適であり、酵母を宿主として様々なペプチドが分
泌生産されている（例えば、特開昭５８−１７４３９６
、特開昭６０−７００７９、特開昭５９−１９６０９３
、特開昭５９−２０５９９７、特開昭５９−１９８９８
０、特開昭６０−４１４８７など）。

発明が解決しようとする問題点 現在、膵疾患の診断および経過観察の為に、ＲＩＡによ
るＰＳＴＩの測定が広く採用されている。この測定に際
しては、標準試薬等としてヒトＰＳＴＩが必須であるが
、これはヒトｐ液中から分離精製されているため、量が
限られ、大量に得ることは不可能であった。

また、ヒトＰＳＴＩが遺伝子工学を利用して産生された
例は全く無かった。

問題点を解決する為の手段 本発明は、ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を有するベ
クターにより酵母を形質転換し、該酵母にヒトＰＳＴＩ
を産生させ、ヒトＰＳＴＩを得ることを特徴とするヒト
ＰＳＴＩの製造方法を提供する。

ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子は、出来ら（前述）に
よりヒト組繊細胞ｍＲＮＡからクローニングされ、その
配列も明らかになっている。

従って、ヒトＰＳＴＩをフードする遺伝子は出来らの方
法に従ってヒト組繊細胞から調製することも、合成する
ことも可能である。該遺伝子は第１図に示すＤＮＡ配列
のみならず、第１図に示すアミノ酸配列をコードするも
のであればよい。なお、本明細書中でヒトＰＳＴＩ遺伝
子とは、ヒトＰＳＴＩをコードする構造遺伝子のみなら
ず、プロモーター領域、シグナルペプチドをコードする
領域、転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナル
など発現に関与する領域を含んで意味する場合がある。

ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を運搬するベクターと
しては、一般に酵母の形質転換に用いられるベクターを
使用することができる。例えば、ＹＩｐ５、ＹＩｐ３２
などのＹＩｐ、ｐＪＤＢ２１９、ＹＥｐ　１３などのＹ
Ｅｐ、ＹＥｐ７、ＹＥｐ１６などのＹＲｐ、ｙｃｐ　１
９などのｙｃｐ。

ｐＹｃｌ、ｐＹｃ２などのコスミド、２μｍＤＮＡなど
から構築されるベクターなどが挙げるれる。また、公知
の発現ベクター、ｐＡＭ８２、ｐＡＴ７７、ＹＥｐ５２
、ＡＨ５、ＡＨ９、ＡＨＩＯ１ＡＨ２１、ｐＧＰＤ−２
なども利用可能である。しかし、これらに限定されるも
のではなく、ヒトＰＳＴＩ遺伝子を運搬し酵母に導入し
、発現させることが可能なものであれば良い。

ヒトＰＳＴ　Ｉをコードする遺伝子をベクターに導入す
る際には、適当なプロモーターの下流に該ヒトＰＳＴＩ
をコードする構造遺伝子を配し、きらに必要があればそ
の下流に転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナ
ルを配すればよい。該プロモーター、および転写終結シ
グナルおよびボ７一 リアデニル化シグナルとしては、エノラーゼ、グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ
、アルコールデヒドロゲナーゼ１１酸性ホスフアターゼ
、ガラクトース利用に関する酵素、イソ・チトクローム
Ｃなどの発現に関与するものが、単独でまたは組み合わ
せて用いる事ができる。もちろん上記の配列以外でも、
ヒトＰＳＴＩを発現できる配列であれば、ｌ／）かなる
ものでもよい。さらに、ヒトＰＳＴＩを分泌生産するた
めには、適当なシグナルペプチドをコードする遺伝子の
直後に該ヒトＰＳＴＩ構造遺伝子を接続すればよい。該
シグナルペプチドをコードする遺伝子としては、α−フ
ァクター、ａ−ファクター、酸性ホスファターゼ、イン
ベルターゼなどの遺伝子を使用できる。これらに限らず
、通常分泌きれる蛋白質のシグナルペプチドをコードす
る遺伝子であれば使用可能であろう。ヒト組繊細胞から
ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を調製した場合には、
ヒトＰＳＴＩ構造遺伝子と共に、シ＝８− グナルペブチドをコードする遺伝子、および転写終結シ
グナルおよびポリアデニル化シグナルがクローニングさ
れるため（第２図参照）、適当なプロモーターの下流に
接続して使用することが有利である。ただし、ポリアデ
ニル化シグナルは必須ではない。もちろん、ヒトＰＳＴ
Ｉ遺伝子は公知であり比較的短鎖であるため、化学合成
してもよい。

宿主としては、ヒトＰＳＴＩを分泌させるためには、酵
母を用いるのが好ましい。使用可能な酵母として、サツ
カロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈｇｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）の菌株、ＫＭ−４６（Ａ
ＴＣＣ２６９２３）、Ｈ−４２（ＡＴＣＣ２６９２２）
、ＢＨ−６４−ＩＡ（ＡＴＣＣ２８３３９）などが挙げ
るれるが、これらに限らず一般的に宿主として用いられ
る酵Ｎは、すべて本発明に適用できる。もちろん、酵母
に限らず、常法に従って、枯草菌や大腸菌のベクターに
ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を挿入し、枯草菌や大
腸菌を形質転換してヒトＰＳＴＩを得ることも可能であ
る。

発現されたヒトＰＳＴＩは、常法通り、クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離操
作などを適当に組み合わせて精製できる。特に、分泌生
産された場合には、培養培地から、クロマトグラフィー
などにより容易に精製できる。

衷蓋碧 ヒトＰＳＴＩｃＤＮＡのクローニング 外科手術により除去されたヒト膵臓、唾液腺、胃、肝臓
を直ちに液体窒素中で凍結し、−７０°Ｃで保存する。

全細胞ＲＮＡはグアニジン・フェノール／りｏｏホルム
法（Ｇｅｎｅ　２８．２６３−２７０．１９８４）によ
って分離した。オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマ
トグラフィーを繰り返して、全ＲＮＡからポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡを精製し、５ｃｈｉｂｌｅｒらの方法（Ｃｅ１１１
ｓ、１４９５−１５０９　（１９７８）　）に従って二
重鎖ｃＤＮＡの合成を行なった。得られたｃＤＮＡは、
Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５．４３−６２　）の
通り、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、末端転移酵素を用い
てｄＣ末端を付加し、Ｐｓｔ　Ｉ消化されｄＧ末端を付
加されたｐＢＲ３２２とアニーリングする。このアニー
リング混合物を用い、Ｄａｇｅｒｔらの方法（Ｇｅｎｅ
６．２３−２８　（１９７９））により、大腸菌に１２
ＨＢ１０１株を形質転換する。形質転換細菌は、テトラ
サイタリン含有平板寒天上で選択し、ｃＤＮＡライブラ
リーとして用いる。

ホスホトリエステル法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　１０．４４６７−４４８２　）によッ
テ、公知のヒトＰｓＴエアミノ酸配列（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　４５．８１３−８２５
　）から予想きれるオリゴヌクレオチドプローブ（１４
塩基長）を合成した。ヒトにおけるコード利用頻度を参
考にして（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

２．４３．１９８１）下図に示すような１６個の可能な
オリゴヌクレオチドを合成した。

これらのオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣで精製した後、
５′末端八Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで１ｆｆｉＰ
を付加してからプローブとしてハイブリダイゼーション
に用いる。

前述のｃＤＮＡライブラリー約１８００コロニーをＧｒ
ｕｎｓｔｅｉｎらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２．３９６１−３９６５　
（１９７５）　）に従い、ナイロンフィルターに写し取
り、このプローブでハイブリダイゼーションを行なった
ところ、９個のポジティブクローンを得た。その中から
制限酵素分析により、ＰＳＴＩｃＤＮＡの一部をインサ
ートしていると考えられるクローンｐＨＴ１９を選び出
し、そのｃＤＮＡインサートを精製してプローブとし、
再度ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ
、４３１ｂｐのｃＤＮＡインサートをもつｐＨＴ１１１
２を得ることができた。

きらにＭ２Ｓ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ。

Ａ、７４．５６０−５６４　（１９７７））によりＰＳ
ＴＩ遺伝子の全塩基配列を決定した。

発　ベクターの クローニングによって得られたヒトＰＳＴＩｃＤＮＡを
含有するプラスミドｐＨＴ１１１２（Ｙａｍａｍｏｔｏ
　ａｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

６０５−６１２．１３２．１９８５）を、制限酵素Ｓｔ
ｕ　Ｉで切断した。２０μｇのプラスミドＤＮＡを、４
００μｍ（７）ＳｔｕＩ緩衝液（１０ｍＭｈリス塩酸（
ｐＨ８，０）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩
化ナトリウム、７ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
０１％ウシ血清アルブミン）中で、２０単位のＳｔｕ　
Ｉを用いて３７℃で６０分間処理を行なった。反応終了
後、フェノール・クロロホルム抽出をして、１０分の１
量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，３）、２．５倍量の
エタノールを加えてエタノール沈澱を行ない、軽く減圧
乾燥して水に溶かし、次の反応に用いた。このフェノー
ルクロロホルム抽出、エタノール沈澱の操作は、以後各
酵素処理後に毎回行なって先に進めている。

次に、Ｓａｌ　Ｉリンカ−（ｐ　ｄＧＧＴＣＧＡＣＣと
いう配列の自己相補オリゴヌクレオチドからなる）を結
合させて、ｐＵＣ９のＳａｌ　Ｉ部位に挿入するための
５ａｌＩ切断部位を作る。２μｇのＳｔｕ　Ｉ切断ｐＨ
Ｔ１１１２を、３２ｐｍｏｌｅＳの５１−リン酸化合成
オリゴヌクレオチドｐｄＧＧＴＣＧＡＣＣの存在下４０
μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６６ｍＭｈリスー塩
酸（ｐＨ７，４）、１．０ｍＭＡＴＰ、６６ｍＭ塩化マ
グネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、０．０１％
ウシ血清アルブミン中で３５０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて１８℃で１２時間処理した。溶液を７０°Ｃで
１０分間加熱してリガーゼ反応を停止許せ、大腸菌に１
２株ＨＢ　１０１にトランスフオームし、目的の形質転
換体を得る。次ぎに調製したプラスミド２０μｇを５ａ
ｌ　Ｉで切断する。反応液に、次の成分を指定の濃度に
成るように加え、シＩＩ緩衝液とする。

１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５） ７ｍＭ塩化マグネシウム １７５ｍＭ塩化ナトリウム ０．２ｍＭＥＤＴＡ ７ｍＭ２−メルカプトエタノール ０．０１％ウシ血清アルブミン １０単位の５ａｌ　Ｉを用いて３７℃６０分間処理した
。

リンカ−を５ａｌＩ切断したＤＮＡをさらにＰｓｔ　Ｉ
で二重切断し、Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｓａｌ　Ｉ端を持つＰ
ＳＴＩ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離する。２０μ
ｇのＳａｌ　Ｉ切断したＤＮＡを２００μｌ　Ｐｓｔ　
Ｉ　１ｍｍ液液１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、
１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ硫酸アンモニウム
、０．０１％ウシ血清アルブミン）中で３２単位のｐｓ
ｔ　Ｉを用いて３７℃で６０分間処理を行なった。この
反応物を５％ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、エ
チジウムブロマイドで染色し、紫外線で断片の位置を定
め所望の断片を含むゲルを切り取った。ゲル片は、１０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）、ｉｍＭＥＤＴＡ内で
粉砕し、上清を集めエタノール沈澱の操作を行ない、所
望のＤＮＡ断片を回収する。

プラスミドｐＵＣ９をＰｓｔＩ　、５ａｌＩで二重切断
し、単離したＰＳＴＩ構造遺伝子を含むＰｓｔ　Ｉ　５
ａｌＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで挿入する。０．１μ
ｇのＰｓｔ　Ｉ　Ｓａｌ　Ｉ切断ｐｕｃｃ＋と、０．５
μｇのＰＳＴＩ構造遺伝子を含むＰｓｔ　Ｉ　Ｓａｌ　
Ｉ断片を、３０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で３
５０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１８℃で１２時間
処理した反応液を用いて、ＭａｎｄｅｌとＨｉｇａの方
法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。邸、１５４　（１９７
０））に従って、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換させた。

形質転換菌は、アンピシリン含有平板寒天上で選択し、
得られたアンピシリン耐性コロニーより数個のコロニー
を選び、プラスミドＤＮＡを単離し所望の断片の存在を
制限酵素切断パターンの分析により確認した。得られた
プラスミドをｐＹＩと名づけた。

プラスミドｐＹＩをｐｓｔ　Ｉで切断した後、ＢＡＬ３
１ヌクレアーゼでＰＳＴＩｃＤＮＡの５′非翻訳領域を
削ツタ後、ＸｈｏＩ　’）ンカ−（ｐｄＣＣＴＣＧＡＧ
Ｇという配列の自己相補オリゴヌクレオチドからなる）
を結合させてｐＡＭ８２のＸｈｏ　Ｉ部位に挿入するた
めのＸｈｏ　Ｉ切断部位を作る。

３μｇのＰｓｔ　Ｉ切断ｐＹＩを、７５μｍのＢＡＬ３
１ヌクレアーゼ緩衝液（２０ｍＭｌ−リス−塩酸（ｐＨ
８，０）、１２ｍＭ塩化カルシウム、１２ｍＭ塩化マグ
ネシウム、１ｍＭＥＤＴＡ、０．６Ｍ塩化ナトリウム）
中で、２．６単位のＢＡＬ３１ヌクレアーゼを用いて、
３０℃１〜１０分間処理する。

次ぎに、先と同様に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでＢＡＬ３１
切断ｐＹＩにＸｈｏ　Ｉリンカ−を結合させる。このリ
ガーゼ反応液を用いてＭａｎｄｅｌとＨｉｇａの方法に
従って大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換させた。形質転換菌
はアンピシリン含有平板寒天上で選択し、得られたアン
ピシリン耐性コロニーより数個ノーｒ口二一を選び、プ
ラスミドＤＮＡを単離し、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼで、
どこまで削れているかをＳａｎｇｅｒらの方法（Ｊ、　
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４３．１６１（７８，１９８
０）に従ってＭ１３ＤＮＡシークエンジグブライマーを
使ったジデオキシ法で塩基配列を調へることにより確か
めた。得られたプラスミドＤＮＡより、ＰＳＴＩｃＤＮ
Ａの５”非翻訳領域を、ＡＴＧの２５ｂｐ上流まで削っ
たものを選び、これより先の構築に用いることにした。

この選び出したプラスミドＤＮＡを、ＸｈｏＩ、５ａｌ
Ｉで二重切断し、Ｘｈｏ　Ｉ　、Ｓａｌ　Ｉ端を持つＰ
ＳＴＩ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離する。１０μ
ｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのＸｈｏ　Ｉ緩衝液
（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、７ｍＭ塩化マ
グネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール 単位のＸｈｏ　Ｉを用いて３７°Ｃ６０分間処理を行な
った。ひらに、Ｘｈｏ　Ｉ切断したＤＮＡｆ！：Ｓａｌ
Ｉで切断し、先と同様に５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行ない所望のＤＮＡ断片を回収する。

酵母の発現ベクターであるｐ　Ａ　Ｍ　８　２　（　Ｍ
ｉｙａｎ。

ｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ。

靭．　１−５．　１９８３、微工研条寄第３１３号（Ｆ
ＥＲＭ−ＢＰ　　３１３）、微工研菌寄第６６６８号よ
り移管）をＸｈｏ　Ｉで切断し、ＰＳＴＩ構造遺伝子を
含むＸｈｏ　Ｉ　Ｓａｌ　Ｉ断片をリガーゼで挿入する
。

０、５μｇのＸｈｏ　Ｉ切断ｐＡＭ８２と２μｇのＰＳ
ＴＩ構造遺伝子を含むＸｈｏ　Ｉ　Ｓａｌ　Ｉ断片を３
０μｌの７４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で３５０単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて１８℃１２時間処理する。反
応液を用いて、ｌｉａｎｄｅｌとＨｉｇａの方法に従い
、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換許せた。形質転換菌はア
ンピシリン含有平板寒天上で選択し、得られたアンピシ
リン耐性コロニーより数個１７）コロニーを選び、プラ
スミドＤＮＡを単離し、所望の断片の存在と、挿入断片
がＰＨ０　５プロモーターに対して正方向あるいは逆方
向に導入されていることを制限酵素切断パターンの分析
により確認した。

ヒトＰＳＴＩの発現および精製 単離したプラスミドＤＮＡを用いてＨｉｎｎｅｎらの１
９一 方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．
　Ｕ．Ｓ．Ａ．　７５．　１９２９−４９３３．　１９
７８）に従って酵母ＡＨ２　２株を形質転換させた。形
質転換菌は、ヒスチジン含有重層寒天中で選択し、得ら
れたロイシン非要求性の酵母（　ｐ　Ｙ　Ｉ　ＡＭ８　
２／ＡＨ２　２　）を、以後ＰＳＴＩの発現実験に使用
した。

目的とする発現プラスミドを持つことが確認された酵母
のクローン（ｐＹＩＡＭ８２／ＡＨ２２）は、ＰＨ０　
５プロモーターを有するので、培地中で無機リン酸の有
無によって簡単に発現のＯＮ−ＯＦＦのスイッチが行な
える（　Ｎａｋａｏ　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｏｌｅｃ．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ旦．　２６１３−
２６２３．　１９８６）。

すなわち、リン酸欠乏条件下で誘導されるので、以下の
方法に従ってＰＳＴＩの発現実験を行なった。

以下の方法は主に、Ｍｉｙａｎｏｈａｒａらの方法（Ｐ
ｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｌｌ．
Ｓ．Ａ．　８０．　１−５．　１９８３）に従う。

１）培地の調製 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｃｒ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｍｅｄｉｕｍ
のリン酸添加培地（１．５ｇリン酸二二本カリウム／Ｌ
）と無添加培地（１。５ｇ塩化カリウム／Ｌ）を使用し
た。

リン酸添加培地（Ｐ十培地）あるいは無添加培地（Ｐ−
培地）の４倍濃縮ｓｔａｃｋ溶液（表１）２５０ｍｌ，
　　ビタミンｓｔａｃｋ溶液（表２）１ｍｌ、グルコー
ス２０ｇ１アスパラギン２ｇに水を加えてＩＬとする。

攪拌後、５０ｍｇのヒスチジン塩酸塩を添加し０、２Ｎ
＊酸化ナトリウムでＰ十培地をｐＨ６　。

０およびＰ−培地をｐＨ７　、５に調整する。

Ｐ十培地は１２０℃で１０分間、Ｐ−培地は１１０°Ｃ
で１０分間それぞれオートクレーブして滅菌操作を行な
う。

（以下体白う 表１ Ｐ＋あるいはＰ−培地の４倍濃縮５ｔａｃｋ溶液硫酸マ
グネシウム７水和物　　　　２ｇ塩化カルシウム２水和
物　　１．３２ｇ０．０５％ヨウ化カリウム　　０．８
ｍ１Ｍｅｔａｌ　ｅｌｅｍｅｎｔ　（ｘｔｏ’＞　（表
１′）ＢＶＭｎ、、Ｚｎ、Ｃｕ　　　　　　０．２ｍ１
Ｆｅ　　　　　　　　　　　　　０．２ｍ１Ｍｏ　　　
　　　　　　　　　　　０．２ｍｌに水を加えてＩＬと
する。オートクレーブ操作は行なわない。

表１゛ Ｍｅｔａｌ　ｅｌｅｍｅｎｔの５ｔｏｃｋ溶液の調製法
ホウ酸　　　　　　　　　　　　　　　　３０ｍｇ硫酸
マンガン７水和物　　　　　　　５０ｍｇ硫酸亜鉛７水
和物　　　　　　　　１５０ｍｇ硫酸銅５水和物　　　
　　　　　　　２０ｍｇ以上を滅菌水に溶かして５０ｍ
１とするモリブデン酸ナトリウム２水和物　１００ｍｇ
滅菌水に溶かして５０ｍ１とする 塩化鉄６水和物　　　　　　　　　１２５ｍｇ滅菌水に
溶かして５０ｍ１とする 以上全てオートクレーブ操作は行なわない表２ ビタミンの５ｔａｃｋ溶液の調製法 ビタミンＢ、　　　　　　　　　　　２０ｍｇピリドキ
シン　　　　　　　　２０ｍｇニコチン酸　　　　　　
　　　２０ｍｇパントテン酸カルシウム　　　２０ｍｇ
ビオチン　　　　　　　　　０　、２ｍｇイノシトール
　　　　　　　　　１ 以上を水に溶かして１００ｍ１とする。ミリポアフィル
タ−に通してフィルター滅菌を行なう。

２）ＰＳＴＩ発現の誘導 プレート上に成育したコロニーをＰ＋培地１０ｍ１に植
菌し、３０°Ｃで２昼夜振盪培養し、その一部（０，２
ｍｌ・）をＰ−培地での培養に使用し、残りはＰ十培地
のサンプルとして後述の方法に従って、分画分析した。

一方、上述のＰ十培地での培養液０．２ｍｌを２Ｍトリ
ス−塩酸（ｐＨ７，０）０．０５ｍ１を添加したＰ−培
地１０ｍ１に加えて、ｓｏ’ｃで２昼夜振盪培養し、こ
れをＰ−培地のサンプルとした。

３）培養液の分画とＰＳＴＩの測定 Ｐ十培地およびＰ−培地の培養液について、下図の方法
に従って分画した。すなわち、Ｐ＋およびＰ−の各培養
液を２５００Ｘｇ、５分間遠心し、酵母菌体を沈殿とし
て回収する。上清は分泌画分として保存する。

次いで、沈殿（菌体）に１ｍＭＰＭＳＦＣｐｈｅｎｙ１
ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ　：
　ｐｒｏｔｅａｓｅ阻害剤）を含むスフェロプラスティ
ングバッファ−（１，２Ｍソルビトール、５０ｍＭリン
酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）、３００〜５００μｇ　／　
ｍ　１ザイモリエイス（生化学工業、６００００Ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇ　）、１４ｍＭ２−メルカプトエタノール）
１ｍｌを加え、Ｖ　ｏ　ｒ　ｔ　ｅ　ｘ　（５ｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　ＩｎＣ，）で攪拌
後、３０℃で１時間インキユヘートする。次いでこれを
２５００Ｘｇで５分間遠心し、上清にペリプラズム層を
、沈殿にスフェロプラストを得る。

このようにして得た沈殿（スフェロプラスト）１ｍ　１
　ｍ　ｌの融解緩衝液（０，２％トライトン、１０ｍＭ
リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）、１５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭＰＭＳＦ）を加え、ＶＯｒｔｅｘで攪拌後
１時間水中で反応させることにより、スフェロプラスト
を溶解させる。

次ぎに、得られた溶解物を１５００　ｏｘｇで２０分間
遠心し、その上清を細胞抽出物として得ることができる
。

酵母培養液の分画法 酵母培養液 ↓ 遠心（２５００ｘｇ、５ｍ１ｎ　） 上清　　沈殿（菌体） （分泌画分）　↓ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒｌｍＭＰ
ＭＳＦを含む ↓ Ｖｏｒｔｅｘ、３０℃ｌｈｒ振盪 ↓ 遠心（２５０Ｑｘｇ、５ｍ１ｎ） 上清　　　　　　沈殿（Ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ　）く
ペリプラズム層）　　　　↓ １ｙｔｉｃ　ｍ１ｘｔｕｒｅ ↓ Ｖｏｒｔｅｘ、０℃ｌｈｒ放置 ↓ 遠心（１５０００Ｘｇ、２０ｍ１ｎ　）上清　　　　　
　沈殿 （細胞抽出画分） 上述の方法で得た酵母菌の分泌画分、ペリプラズム画分
および細胞抽出画分について、イムノアッセイ法でＰＳ
ＴＩの産生量を測定できる。結果を表３に示す。

表３ 各両分のＰＳＴＩの測定 表３の結果より、産生されたＰＳＴＩは酵母の菌体外に
多く分泌されることが判明したので、大量培養実験（３
Ｌ）を行ない、ＰＳＴＩの分離・精製を目的とした。

４）大量培養実験 プレート上のコロニーをＰ十培地１０ｍ１に植菌し、３
０℃で２昼夜振とう培養する。得られた培養液の５ｍｌ
を再びＰ十培地１００ｍ１に添加し、３０°Ｃで２昼夜
振とう培養する。次いでこの培養液６０ｍ１をＰ−培地
３Ｌに添加して、３゜’Ｃで２昼夜振とう培養後、７０
００Ｘｇで１０分間遠心して、その上清（分泌画分）を
次の精製実験に使用した。

５）精製 酵母培養液７７０ｍ１をＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ８
，０とした後、牛トリプシンーＣＨ−セファロース４Ｂ
のカラム（ＩＸ３．２　ｃｍ）に吸着させた。０．０５
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０゜０．５Ｍ食塩を含む）、蒸
留水で順次カラムを洗浄した後１０ｍＭ塩酸でＰＳＴＩ
を溶出させ凍結乾燥し精製品０．６９ｍｇを得た。

得られたヒトＰＳＴＩ（１２μｇ）を試験管（１０Ｘ９
０ｍｍ）にとり、４Ｍメタンスルポン酸（０，２％３−
（２−アミノエチル）インドール含有）５０μｍを加え
、減圧下、１１０″Ｃ１２４時間加水分解した。アミノ
酸分析は日立８３５型アミノ酸分析計により行なった。

得られたＰＳＴＩのアミノ酸組成は表４の様になり天然
のヒトＰＳＴＩと完全に一致した。

（以下な白ン 表４ アミノ酸　　　　実験値　　　　　理論値Ａｓｐａｒｔ
ｉｃ　ａｃｉｄ　　　７　、９　　　　　　８Ｔｈｒｅ
ｏｎｉｎｅ　　　　　３　、７　　　　　　４Ｓｅｒｉ
ｎｅ　　　　　　２　、５　　　　　　３Ｇｌｕｔａｍ
ｉｃ　ａｃｔｄ　　　６　、２　　　　　　６Ｐｒｏｌ
ｉｎｅ　　　　　　３　、１　　　　　　３Ｇｌｙｃｉ
ｎｅ　　　　　　５　、２　　　　　　５Ａｌａｎｉｎ
ｅ　　　　　　１．１　　　　　　１Ｃｙｓｔｉｎｅ　
　　　　　２　、７　　　　　　３Ｖａｌｉｎｅ　　　
　　　２　、１　　　　　　２Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　
　　　Ｏ、Ｏ０Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　　　　２　、９
　　　　　　３Ｌｅｕｃｉｎａ　　　　　　４　、０　
　　　　　４Ｉｙｒｏｓｉｎｅ　　　　　２　、９　　
　　　　３Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　　　１．１　
　　　　　１Ｌｙｓｉｎｅ　　　　　　３　、９　　　
　　　４）１ｉｓｔｉｄｉｎｅ　　　　　Ｏ、Ｏ０Ｔｒ
ｙｐｔｏｐｈａｎ　　　　Ｏ、ＯＯＡｒｇｉｎｉｎｅ　
　　　　３　、　Ｏ３またＮ末端から３残基のアミノ酸
配列をＥｄｍａｎ法（Ｉｗａｎａｇａらの変法、Ｅｕｒ
、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、旦、１８９−１９９．１９
６９）で調べたところ、Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｌｅｕとなり
天然のヒトＰＳＴＩに一致した。さらに得られたヒトＰ
ＳＴＩは牛トリプシンを１：１のモル比で化学量論的に
阻害し、天然ヒＩ−ＰＳＴＩの抗体（ウサギ抗血清ポリ
フロルナル）との免疫反応性も、その希釈曲線が天然ヒ
トＰＳＴＩの挙動に一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＰＳＴＩをコードするｃＤＮＡおよびヒ１
−ＰＳＴＩのアミノ酸配列を示す。第２図はヒト膵臓ｍ
　ＲＮ　ＡよりクローニングされたヒトＰＳＴＩｃＤＮ
ＡおよびそのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列を示
す。第３図はｐＹＩＡＭ８２構築の概略図である。 特許出願人　塩野義製薬株式会社 ＝３２− ＡｓｐＳｅｒＬｅｕＧＩｙＡｒｇＧＩｕＡＩａＬｙｓＣ
ｙＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧ、ＧＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡ
ＡＴＧＡｓｐＰｒ　ｏＶａ　ｌｃｙｓＧｌｙＴｈｒＡｓ
ｐＧｌｙＡｓＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧ
ＡＴＧＧＡＡＡＡｓｎＡｒｇＬｙｓＡｒｇＧｌｎＴｈｒ
Ｓｅｒ　Ｉ　１　ｅＬｅ＋ＡＡＴＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣ
ＡＧＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＴ（第１図 Ｊ　Ｉ　１ｅＧｌｎＬｙｓＳｅｒＧ１ｙＰｒｏＣｙｓ＊
＊＊ＥＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣＣＴＴＧＣＴ
ＧＡＭｅｔＬｙｓＶａｌＴｈｒＧｌｙＩＩｅＰｈｅＬｅ
ｕＬｅＴｈｒＧＩｙＡｌａＡｓｐＳｅｒＬｅｕＧ］ｙＡ
ｒｇＧＩＬｙｓＩ　１ｅＴｙｒＡｓｐＰｒｏＶａｌＣｙ
ｓＧＩｙＴｈＣｙｓＰｈｅＧｌ　ｕＡｓｎＡｒｇＬｙｓ
ＡｒｇＧｌｎＴｈ＋３］０ 第２図

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＰＳＴＩ遺伝子を有するベクターで酵母を形
   質転換し、該酵母にヒトＰＳＴＩを生産させるヒトＰＳ
   ＴＩの製造方法。
2. （２）該酵母に該ヒトＰＳＴＩを分泌生産させる特許請
   求の範囲第１項に記載の製造方法。
3. （３）該ヒトＰＳＴＩ遺伝子が第１図に示されるアミノ
   酸配列をコードする遺伝子である特許請求の範囲第１項
   に記載の製造方法。
4. （４）該ヒトＰＳＴＩ遺伝子が第１図に示される遺伝子
   である特許請求の範囲第１項に記載の製造方法。
5. （５）該ヒトＰＳＴＩ遺伝子が第２図に示されるアミノ
   酸配列をコードする遺伝子である特許請求の範囲第１項
   に記載の製造方法。
6. （６）該ヒトＰＳＴＩ遺伝子が第２図に示される１〜２
   ３７の遺伝子である特許請求の範囲第１項に記載の製造
   方法。
7. （７）該ヒトＰＳＴＩ遺伝子が第２図に示される−２５
   〜２７８の遺伝子である特許請求の範囲第１項に記載の
   製造方法。