JPH0616716B2 - 酵母におけるヒトｐｓｔｉの製造法 - Google Patents

酵母におけるヒトｐｓｔｉの製造法

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JPH0616716B2
JPH0616716B2 JP61245049A JP24504986A JPH0616716B2 JP H0616716 B2 JPH0616716 B2 JP H0616716B2 JP 61245049 A JP61245049 A JP 61245049A JP 24504986 A JP24504986 A JP 24504986A JP H0616716 B2 JPH0616716 B2 JP H0616716B2
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human psti
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトＰＳＴＩの製造方法に関する。更に詳し
くは、ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を有するベクタ
ーにより酵母を形質転換し、酵母にヒトＰＳＴＩを産生
させヒトＰＳＴＩを得る、ヒトＰＳＴＩの製造方法に関
する。
従来の技術 膵臓に由来するトリプシン・インヒビタには、膵分泌性
トリプシン・インヒビター（pancreatic secretory try
psin inhibitor、以下ＰＳＴＩと略記）と塩基性膵トリ
プシン・インヒビター（basic pancreatic trypsin inh
ibitor）の２種類がある。前者は哺乳動物に存在し、膵
臓の他、腎臓、肺臓、脾臓、肝臓、脳などの臓器にも分
布する。後者は反芻動物の膵臓の他、各種臓器に分布す
るがヒトをはじめとする他の哺乳動物には存在しない。
Pubolsら(J.Biol.Chem.249,2235,1974)およびFeinstein
ら(Eur.J.Biochem.43,569,1974)はそれぞれヒト膵液中
からヒトＰＳＴＩを分離精製し、Greeneら(Meth.Enzymo
l.45,813,1976)によりその構造が明らかにされた。ヒト
ＰＳＴＩは第１図に示すとおり５６個のアミノ酸からな
るペプチドで、分子量は６２４２である。またCysのSH
基はアミノ酸配列９と３８番目、１６と３５番目、２４
と５６番目で、それぞれＳ−Ｓ結合をしており、遊離Ｓ
Ｈ基は存在しない。但し、Greeneらによるアミノ酸配列
が、２１番目Ａｓｎ、２９番目Ａｓｐであるのに対し
て、本発明者らが決定した配列は２１番目Ａｓｐ、２９
番目Ａｓｎである点で異なっている。Eddelandら(Hoppe
-Seyler's Z.physiol.Chem.359,671,1978)および北原ら
(Biomed.J.3,1119,1979)はそれぞれ膵液中から得たヒト
ＰＳＴＩを抗原としたラジオイムノアッセイ系を確立
し、血中ＰＳＴＩの測定を可能にした。山本ら(Bioche
m.Biophys.Res.Commun.132,605,1985)はヒトＰＳＴＩの
ＤＮＡ配列を明らかにした（第２図参照）。
急性膵炎の自己消化は蛋白分解酵素によって惹起され
る。何らかの原因で活性化した少量のトリプシンがトリ
プシノーゲンをはじめ他のzymogenの連鎖反応的活性化
を行なうためと言われている。膵腺房細胞に存在するＰ
ＳＴＩは、膵酵素とともに膵液中に分泌されて、膵管内
で起こったトリプシンの活性化を阻止する。更に、ＰＳ
ＴＩの一部は逸脱インヒビターとして血中に移行してfr
eeな状態で存在する（胆と膵、２，231,1981）．血中Ｐ
ＳＴＩは膵疾患、特に急性膵疾患で大きな変動を示し、
高値維持期間もアミラーゼに比し長期間である。またプ
ロテアーゼインヒビターとは無関係に、血中ＰＳＴＩの
変動は膵侵襲を鋭敏に反映する（胆と膵、３，383,198
2）。従って、血中ＰＳＴＩを測定することにより、膵
疾患の診断と経過観察が可能になる。
近年の遺伝子工学の発展により、目的のペプチドをコー
ドする遺伝子をベクターに組込み、大腸菌などの細菌に
導入して該ペプチドを大量に得ることは容易な技術とな
りつつある。しかし一般に発現したペプチドは細胞内に
蓄積されるため、生成された蛋白質が細胞の成育増殖を
阻害したり、過剰に生成されると負のフィードバックに
よって生産性が抑制されることがある。また、短鎖のペ
プチドを細菌内に産生させると、細菌中のペプチターゼ
によって分解されることがある。目的の蛋白質を採集す
るためには、まず細胞を採集破壊し、該細胞破壊物から
目的の蛋白質を精製しなければならない。この細胞破壊
物中には多くの不純物が含まれ、その一部は人体に有害
であり、そこから純粋な目的の蛋白質を得ることは必ず
しも容易なことではない。
細胞膜を構成する蛋白質や分泌蛋白質などは、その一端
に細胞内外の膜を通過するために必要なアミノ酸配列シ
グナルペプチドを持つ前駆体ポリペプチドとして合成さ
れ、膜通過の際に膜に存在するペプチダーゼによりシグ
ナルペプチド部分は切断され、本来の蛋白質分子となり
その活性および機能を発揮する。上記のような遺伝子組
換技術における欠点を克服するために、この分泌機構を
利用して、菌体外へ目的のペプチドを分泌させる試みが
なされている。特に分泌生産においては、宿主として酵
母が好適であり、酵母を宿主として様々なペプチドが分
泌生産されている（例えば、特開昭５８−１７４３９
６、特開昭６０−７００７９、特開昭５９−１９６０９
３、特開昭５９−２０５９９７、特開昭５９−１９８９
８０、特開昭６０−４１４８７など）。
発明が解決しようとする問題点 現在、膵疾患の診断および経過観察の為に、ＲＩＡによ
るＰＳＴＩの測定が広く採用されている。この測定に際
しては、標準試薬等としてヒトＰＳＴＩが必須がある
が、これはヒト膵液中から分離精製されているため、量
が限られ、大量に得ることは不可能であった。
また、ヒトＰＳＴＩが遺伝子工学を利用して産生された
例は全く無かった。
問題点を解決する為の手段 本発明は、ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を有するベ
クターにより酵母を形質転換し、該酵母にヒトＰＳＴＩ
を産生させ、ヒトＰＳＴＩを得ることを特徴とするヒト
ＰＳＴＩの製造方法を提供する。
ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子は、山本ら（前述）に
よりヒト組織細胞ｍＲＮＡからクローニングされ、その
配列も明らかになっている。従って、ヒトＰＳＴＩをコ
ードする遺伝子は山本らの方法に従ってヒト組織細胞か
ら調製することも、合成することも可能である。該遺伝
子は第１図に示すＤＮＡ配列のみならず、第１図に示す
アミノ酸配列をコードするものであればよい。なお、本
明細書中でヒトＰＳＴＩ遺伝子とは、ヒトＰＳＴＩをコ
ードする構造遺伝子のみならず、プロモーター領域、シ
グナルペプチドをコードする領域、転写終結シグナルお
よびポリアデニル化シグナルなど発現に関与する領域を
含んで意味する場合がある。
ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を運搬するベクターと
しては、一般に酵母の形質転換に用いられるベクターを
使用することができる。例えば、ＹＩｐ５、ＹＩｐ３２
などのＹＩｐ、ｐＪＤＢ２１９、ＹＥｐ１３などのＹＥ
ｐ、ＹＲｐ７、ＹＲｐ１６などのＹＰｐ、ＹＣｐ１９な
どのＹＣｐ、ｐＹｃ１、ｐＹｃ２などのコスミド、２μ
ｍＤＮＡなどから構築されるベクターなどが挙げるれ
る。また、公知の発現ベクター、ＰｐＡＭ８２、ｐＡＴ
７７、ＹＥｐ５２、ＡＨ５、ＡＨ９、ＡＨ１０、ＡＨ２
１、ｐＧＰＤ−２なども利用可能である。しかし、これ
らに限定されるものではなく、ヒトＰＳＴＩ遺伝子を運
搬し酵母に導入し、発現させることが可能なものであれ
ば良い。
ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子をベクターに導入する
際には、適当なプロモーターの下流に該ヒトＰＳＴＩを
コードする構造遺伝子を配し、さらに必要があればその
下流に転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナル
を配すればよい。該プロモーター、および転写終結シグ
ナルおよびポリアデニル化シグナルとしては、エノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフ
ルクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼＩ、酸性
ホスファターゼ、ガラクトース利用に関する酵素、イソ
・チトクロームｃなどの発現に関与するものが、単独で
または組み合わせて用いる事ができる。もちろん上記の
配列以外でも、ヒトＰＳＴＩを発現できる配列であれ
ば、いかなるものでもよい。さらに、ヒトＰＳＴＩを分
泌生産されるためには、適当なシグナルペプチドをコー
ドする遺伝子の直後に該ヒトＰＳＴＩ構造遺伝子を接続
すればよい。該シグナルペプチドをコードする遺伝子と
しては、α−ファクター、ａ−ファクター、酸性ホスフ
ァクターゼ、インベルターゼなどの遺伝子を使用でき
る。これらに限らず、通常分泌される蛋白質のシグナル
ペプチドをコードする遺伝子であれば使用可能であろ
う。ヒト組織細胞からヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子
を調製した場合には、ヒトＰＳＴＩ構造遺伝子と共に、
シグナルペプチドをコードする遺伝子、および転写終結
シグナルおよびポリアニデニル化シグナルがクローニン
グされるため（第２図参照）、適当なプロモーターの下
流に接続して使用することが有利である。ただし、ポリ
アニデニル化シグナルは必須ではない。もちろん、ヒト
ＰＳＴＩ遺伝子は公知であり比較的短縮であるため、化
学合成してもよい。
宿主としては、ヒトＰＳＴＩを分泌させるためには、酵
母を用いるのが好ましい。使用可能な酵母として、サッ
カロマイセス・セレビジェ(Saccharomyces cerevisiae)
の菌株、ＫＭ−４６（ＡＴＣＣ２６９２３）、Ｈ−４２
（ＡＴＣＣ２６９２２）、ＢＨ−６４−１Ａ（ＡＴＣＣ
２８３３９）などが挙げるれるが、これらに限らず一般
的に宿主として用いられる酵母は、すべて本発明に適用
できる。もちろん、酵母に限らず、常法に従って、枯草
菌や大腸菌のベクターにヒトＰＳＴＩをコードする遺伝
子を挿入し、枯草菌や大腸菌を形質転換してヒトＰＳＴ
Ｉを得ることも可能である。
発現されたヒトＰＳＴＩは、常法通り、クロマトグラフ
ィー、アフィティークロマトグラフィー、遠心分離操作
などを適当に組み合わせて精製できる。特に、分泌生産
された場合には、培養培地から、クロマトグラフィーな
どにより容易に精製できる。
実施例 ヒトＰＳＴＩｃＤＮＡのクローニング 外科手術により除去されたヒト膵臓、唾液腺、胃、肝臓
を直ちに液体窒素中で凍結し、−７０℃で保存する。全
細胞ＲＮＡはグアニジン・フェノール／クロロホルム法
(Gene 28,263-270,1984)によって分離した。オリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィーを繰り返
して、全ＲＮＡからポリ（Ａ）ＲＮＡを精製し、Schibl
erらの方法(Cell 15、1495-1509(1978))に従って二重鎖
ｃＤＮＡの合成を行なった。得られたｃＤＮＡは、Royc
houdhuryらの方法(Methods in Enzymology 65、43-62)の
通り、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、末端転移酵素を用い
てｄＣ末満を付加し、PstI消化されｄＧ末端を付加され
たpBR322とアニーリングする。このアニーリング混合物
を用い、Dagertらの方法(Gene 6、23-28(1979))により、
大腸菌Ｋ１２ＨＢ１０１株を形質転換する。形質転換細
菌は、テトラサイクリン含有平板寒天上で選択し、ｃＤ
ＮＡライブラリーとして用いる。
ホスホトリエステル法(Nucleic Acid Research 10、4467
-4482)によって、公知のヒトＰＳＴＩアミノ酸配列(Met
hods in Enzymology 45、813-825)から予想されるオリゴ
ヌクレオチドプローブ（１４塩基長）を合成した。ヒト
におけるコード利用頻度を参考にして(Nucl Acids Res.
9、43、1981)下図に示すような１６個の可能なオリゴヌク
レオチドを合成した。
これらのオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣで精製した後、
５′末端へＴ４オリゴヌクレオチドキナーゼで32Ｐを付
加してからプローブとしてハイブリダイゼーションに用
いる。
前述のｃＤＮＡライブラリー約１８００コロニーをGrun
steinらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72、3961-396
5(1975))に従い、ナイロンフィルターに写し取り、この
プローブでハイブリダイゼーションを行なったところ、
９個のポジティブクローンを得た。その中から制限酵素
分析により、ＰＳＴＩｃＤＮＡの一部をインサートして
いると考えられるクローンｐＨＴ１９を選び出し、その
ｃＤＮＡインサートを精製してプローブとし、再度ｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ、４３１
ｂｐのｃＤＮＡインサートをもつｐＨＴＩ１１２を得る
ことができた。さらにＭ１３法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.74、560-564(1977))によりＰＳＴＩ遺伝子の全塩基
配列を決定した。
発現ベクターの構築 クローニングによって得られたヒトＰＳＴＩｃＤＮＡを
含有するプラスミドｐＨＴＩ１１２(Yamamoto et al.Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.605-612,132,1985)を制限酵
素Stu Iで切断した。２０μｇのプラスミドＤＮＡを、
４００μｌのStu I緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．０）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナ
トリウム、７ｍＭ２−メメルカプトエタノール、０．０
１％ウシ血清アルブミン）中で、２０単位のStu Iを用
いて３７℃で６０分間処理を行なった。反応終了後、フ
ェノール・クロロホルム抽出をして、１０分の１量の３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）、２．５倍量のエタノ
ールを加えてエタノール沈澱を行ない、軽く減圧乾燥し
て水に溶かし、次の反応に用いた。このフェノールクロ
ロホルム抽出、エタノール沈澱の操作は、以後各酵素処
理後に毎回行なって先に進めている。
次に、Sal Iリンカー（ｐｄＧＧＴＣＧＡＣＣという配
列の自己相補オリゴヌクレオチドからなる）を結合させ
て、ｐＵＣ９のSal I部位に挿入するためのSal I切断部
位を作る。２μｇのStu I切断ｐＨＴＩ１１２を、３２
ｐｍｏｌｅｓの５′−リン酸化合成オリゴヌクレオチド
ｐｄＧＧＴＣＧＡＣＣの存在下４０μｌのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液（６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、
１．０ｍＭＡＴＰ、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、０．０１％ウシ血清アルブミン
中で３５０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１８℃で１
２時間処理した。溶液を７０℃で１０分間加熱してリガ
ーゼ反応を停止させ、大腸菌Ｋ１２株ＨＢ１０１にトラ
ンスフォームし、目的の形質転換体を得る。次ぎに調製
したプラスミド２０μｇをSal Iで切断する。反応液
に、次の成分を指定の濃度に成るように加え、Sal I緩
衝液とする。
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５） ７ｍＭ塩化マグネシウム １７５ｍＭ塩化ナトリウム ０．２ｍＭＥＤＴＡ ７ｍＭ２−メルカプトエタノール ０．０１％ウシ血清アルブミン １０単位のSal Iを用いて３７℃６０分間処理した。
リンカーをSal I切断したＤＮＡをさらにPst Iで二重切
断し、Pst I、Sal I端を持つＰＳＴＩ構造遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を単離する。２０μｇのSal I切断したＤＮ
Ａを２００μｌPst I緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
硫酸アンモニウム、０．０１％ウシ血清アルブミン）中
で３２単位のPst Iを用いて３７℃で６０分間処理を行
なった。この反応物を５％ポリアクリルアミド電気泳動
で分離し、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線で断
片の位置を定め所望の断片を含むゲルを切り取った。ゲ
ル片は、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ内で粉砕し、上清を集めエタノール沈澱の操作
を行ない、所望のＤＮＡ断片を回収する。
プラスミドｐＵＣ９をPst I、Sal Iで二重切断し、単離
したＰＳＴＩ構造遺伝子を含むPst I Sal I断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼで挿入する。０．１μｇのPst I Sal I
切断ｐＵＣ９と、０．５μｇのＰＳＴＩ構造遺伝子を含
むPst I Sal I断片を、３０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液中で３５０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１８
℃で１２時間処理した反応液を用いて、MandelとHigaの
方法(J.Mol.Biol.53、154(1970))に従って、大腸菌ＨＢ
１０１を形質転換させた。形質転換菌は、アンビシリン
含有平板寒天上で選択し、得られたアンピシリン耐性コ
ロニーより数個のコロニーを選び、プラスミドＤＮＡを
単離し所望の断片の存在を制限酵素切断パターンの分析
により確認した。得られたプラスミドをｐＹＩと名づけ
た。
プラスミドｐＹＩをPst Iで切断した後、BAL31ヌクレ
アーゼでＰＳＴＩｃＤＮＡの５′非翻訳領域を削った
後、Xho Iリンカー（ｐｄＣＣＴＣＧＡＧＧという配列
の自己相補オリゴヌクレオチドからなる）を結合させて
ｐＡＭ８２のXho I部位に挿入するためのXho I切断部
位を作る。
３μｇのPst I切断ｐＹＩを、７５μｌのBAL31ヌクレア
ーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１
２ｍＭ塩化カルシウム、１２ｍＭ塩化マグネシウム、１
ｍＭＥＤＴＡ、０．６Ｍ塩化ナトリウム）中で、２．６
単位のBAL31ヌクレアーゼを用いて、３０℃１〜１０分
間処理する。次ぎに、先と同様に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
でBAL31切断ｐＹ１にXho Iリンカーを結合させる。この
リガーゼ反応液を用いてMandelとHigaの方法に従って大
腸菌ＨＢ１０１を形質転換させた。形質転換菌はアンピ
シリン含有平板寒天上で選択し、得られたアンピシリン
耐性コロニーより数個のコロニーを選び、プラスミドＤ
ＮＡを単離し、BAL31ヌクレアーゼで、どこまで削れて
いるかをSangerらの方法(J.Mol.Biol.143,161-178,198
0)に従ってM13DNAシークエンシグプライマーを使ったジ
デオキシ法で塩基配列を調べることにより確かめた。得
られたプラスミドＤＮＡより、ＰＳＴＩｃＤＮＡの５′
非翻訳領域を、ＡＴＧの２５ｂｐ上流まで削ったものを
選び、これより先の構築に用いることにした。
この選び出したプラスミドＤＮＡを、Xho I、Sal Iで
二重切断し、Xho I、Sal I端を持つＰＳＴＩ構造遺伝子
を含むＤＮＡ断片を単離する。１０μｇのプラスミドＤ
ＮＡを１００μｌのXho I緩衝液（１０ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、７ｍＭ２−メルカプトエタノール）
中で２４単位のXho Iを用いて３７℃６０分間処理を行
なった。さらに、Xho I切断したＤＮＡをSal Iで切断
し、先と同様に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない所望のＤＮＡ断片を回収する。
酵母の発現ベクターであるｐＡＭ８２(Miyanohara et a
l Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.80,1-5,1983、微工研条寄
第３１３号（ＦＥＲＭ−ＢＰ ３１３）、微工研菌寄第
６６６８号より移管）をXho Iで切断し、ＰＳＴＩ構造
遺伝子を含むXho I Sal I断片をリガーゼで挿入する。
０．５μｇのXho I切断ｐＡＭ８２と２μｇをＰＳＴＩ
構造遺伝子を含むXho I Sal I断片を３０μｌのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液中で３５０単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて１８℃１２時間処理する。反応液を用いて、
MandelとHigaの方法に従い、大腸菌ＨＢ１０１を形質転
換させた。形質転換菌はアンピシリン含有平板寒天上で
選択し、得られたアンピシリン耐性コロニーより数個の
コロニーを選び、プラスミドＤＮＡを単離し、所望の断
片の存在と、挿入断片がＰＨ０５プロモーターに対して
正方向あるいは逆方向に導入されていることを制限酵素
切断パターンの分析により確認した。
ヒトＰＳＴＩの発現および精製 単離したプラスミドＤＮＡを用いてHinnenらの方法(Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75,1929-1933,1978)に従って酵
母ＡＨ２２株を形質転換させた。形質転換菌は、ヒスチ
ジン含有重層寒天中で選択し、得られたロイシン非要求
性の酵母（ｐＹＩＡＭ８２／ＡＨ２２）を、以後ＰＳＴ
Ｉの発現実験に使用した。
目的とする発現プラスミドを持つことが確認された酵母
のクローン（ｐＹＩＡＭ８２／ＡＨ２２）は、ＰＨ０５
プロモーターを有するので、培地中で無機リン酸の有無
によって簡単に発現のＯＮ−ＯＦＦのスイツチが行なえ
る(Nakao et al,Molec.Cell.Biol.6,2613-2623,1986)。
すなわち、リン酸欠乏条件下で誘導されるので、以下の
方法に従ってＰＳＴＩの発現実験を行なった。
以下の方法は主に、Miyanoharaらの方法（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.80,1-5,1983）に従う。
１）培地の調製 Burkholder minimal mediumのリン酸添加培地（１．５
ｇリン酸二水素カリウム／Ｌ）と無添加培地（１．５ｇ
塩化カリウム／Ｌ）を使用した。
リン酸添加培地（Ｐ＋培地）あるいは無添加培地（Ｐ−
培地）の４倍濃縮stock溶液（表１）２５０ｍｌ、ビタ
ミンstock溶液（表２）１ｍｌ、グルコース２０ｇ、ア
スパラギン２ｇに水を加え１Ｌとする。
撹拌後、５０ｍｇのヒスチジン塩酸塩を添加し０．２Ｎ
水酸化ナトリウムでＰ＋培地をｐＨ６．０およびＰ−培
地をｐＨ７．５に調整する。
ｐ＋培地は１２０℃で１０分間、Ｐ−培地は１１０℃で
１０分間それぞれオートクレーブして滅菌操作を行な
う。
表１ Metal elementのstock溶液の調製法 ホウ酸 ３０ｍｇ 硫酸マンガン７水和物 ５０ｍｇ 硫酸亜鉛７水和物 １５０ｍｇ 硫酸銅５水和物 ２０ｍｇ 以上を滅菌水に溶かして５０ｍｌとする モリブデン酸ナトリウム２水和物 １００ｍｇ 滅菌水に溶かして５０ｍｌとする 塩化鉄６水和物 １２５ｍｇ 滅菌水に溶かして５０ｍｌとする 以上全てオートクレーブ操作は行なわない 表２ ビタミンのstock溶液の調製法 ビタミンＢ１ ２０ｍｇ ピリドキシン ２０ｍｇ ニコチン酸 ２０ｍｇ パントテン酸カルシウム ２０ｍｇ ビオチン ０．２ｍｇイノシトール １ｇ 以上を水に溶かして１００ｍｌとする。ミリポアフィル
ターに通してフィルター滅菌を行なう。
２）ＰＳＴＩ発現の誘導 プレート上に成育したコロニーをＰ＋培地１０ｍｌに植
菌し、３０℃で２昼夜振盪培養し、その一部（０．２ｍ
ｌ）をＰ−培地での培養に使用し、残りはＰ＋培地のサ
ンプルとして後述の方法に従って、分画分析した。一
方、上述のＰ＋培地での培養液０．２ｍｌを２Ｍトリス
−塩酸（ｐＨ７．０）０．０５ｍｌを添加したＰ−培地
１０ｍｌに加えて、３０℃で２昼夜振盪培養し、これを
Ｐ−培地のサンプルとした。
３）培養液の分画とＰＳＴＩの測定 Ｐ＋培地およびＰ−培地の培養液について、下図の方法
に従って分画した。すなわち、Ｐ＋およびＰ−の各培養
液を２５００×ｇ、５分間遠心し、酵母菌体を沈殿とし
て回収する。上清は分泌画分として保存する。
次いで、沈殿（菌体）に１ｍＭＰＭＳＦ(phenylmethyls
ulfonyl fluoride:protease阻害剤）を含むスフェロプ
ラスティングバッファー（１．２Ｍソルビトール、５０
ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）、３００〜５００μ
ｇ／ｍｌザイモリエイス（生化学工業、60000Units/m
g）、１４ｍＭ２−ルカプトエタノール）１ｍｌを加
え、Ｖｏｒｔｅｘ(Scientific Industries Inc.)で撹拌
後、３０℃で１時間インキュベートする。次いでこれを
２５００×ｇで５分間遠心し、上清にペリプラズム層
を、沈殿にスフェロプラストを得る。
このようにして得た沈殿（スフェロプラスト）に１ｍｌ
の融解緩衝液（０．２％トライトン、１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍ
ＭＰＭＳＦ）を加え、Ｖｏｒｔｅｘで撹拌後１時間氷中
で反応させることにより、スフェロプラストを溶解させ
る。
次ぎに、得られた溶解物を１５０００×ｇで２０分間遠
心し、その上清を細胞抽出物として得ることができる。
上述の方法で得た酵母菌の分泌画分、ペリプラズム画分
および細胞抽出画分について、イムノアッセイ法でＰＳ
ＴＩの産生量を測定できる。結果を表３に示す。
表３の結果より、産生されたＰＳＴＩは酵母の菌体外に
多く分泌されることが判明したので、大量培養実験（３
Ｌ）を行ない、ＰＳＴＩの分離・精製を目的とした。
４）大量培養実験 プレート上のコロニーをＰ＋培地１０ｍｌに植菌し、３
０℃で２昼夜振とう培養する。得られた培養液の５ｍｌ
を再びＰ＋培地１００ｍｌに添加し、３０℃で２昼夜振
とう培養する。次いでこの培養液６０ｍｌをＰ−培地３
Ｌに添加して、３０℃で２昼夜振とう培養後、７０００
×ｇで１０分間遠心して、その上清（分泌画分）を次の
精製実験に使用した。
５）精製 酵母培養液７７０ｍｌを１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ
８．０とした後、牛トリプシン−ＣＨ−セファロース４
Ｂのカラム（１×３．２ｃｍ）に吸着させた。０．０５
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０、０．５Ｍ食塩を含む）、蒸
留水で順次カラムを洗浄した後１０ｍＭ塩酸でＰＳＴＩ
を溶出させ凍結乾燥し精製品０．６９ｍｇを得た。
得られたヒトＰＳＴＩ（１２μｇ）を試験管（１０×９
０ｍｍ）にとり、４Ｍメタンスルホン酸（０．２％３−
（２−アミノエチル）インドール含有）５０μｌを加
え、減圧下、１１０℃、２４時間加水分解した。アミノ
酸分析は日立８３５型アミノ酸分析計により行なった。
得られたＰＳＴＩのアミノ酸組成は表４の様になり天然
のヒトＰＳＴＩと完全に一致した。
またＮ末端から３残基のアミノ酸配列をEdman法（Iwana
gaの変法、Eur.J.Biochem.8,189-199,1969）で調べたと
ころ、Asp-Ser-Leuとなり天然のヒトＰＳＴＩに一致し
た。さらに得られたヒトＰＳＴＩは牛トリプシンを１：
１のモル比で化学量論的に阻害し、天然ヒトＰＳＴＩの
抗体（ウサギ抗血清ポリクローナル）との免疫反応性
も、その希釈曲線が天然ヒトＰＳＴＩの挙動に一致し
た。
【図面の簡単な説明】
第１図はヒトＰＳＴＩをコードするｃＤＮＡおよびヒト
ＰＳＴＩのアミノ酸配列を示す。第２図はヒト膵臓ｍＲ
ＮＡよりクローニングされたヒトＰＳＴＩｃＤＮＡおよ
びそのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列を示す。第
３図はｐＹＩＡＭ８２構築の概略図である。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列の第２４位〜第７９位
    のアミノ酸配列で示されるヒトＰＳＴＩの製造方法であ
    って、下記の全アミノ酸配列をコードする遺伝子を含有
    しているベクターで酵母を形質転換し、該酵母を培養す
    ることにより、該酵母にヒトＰＳＴＩを分泌生産させる
    ことからなるヒトＰＳＴＩの製造方法：
  2. 【請求項２】該遺伝子が下記のＤＮＡ配列で示されるも
    のである第１項に記載の製造方法：
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