JPS6041487A - 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用 - Google Patents
酵母発現系でのアルフア因子配列の使用Info
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- JPS6041487A JPS6041487A JP8276884A JP8276884A JPS6041487A JP S6041487 A JPS6041487 A JP S6041487A JP 8276884 A JP8276884 A JP 8276884A JP 8276884 A JP8276884 A JP 8276884A JP S6041487 A JPS6041487 A JP S6041487A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
発明の利用分野
本発明は、一般に、干渉となる量の所望で１よいプレ配
列又は他の発現用人為構造を伴なわ７よい分離した産物
として異種タンパクを産生、プロセッシング及び分泌す
る酵母宿主系及び発現ベヒクルを使用する組換ＤＮＡ技
術に係る。 親細胞の細胞膜を通って分泌されろタンパクは通常細胞
内で「ブレ」タンパクとして産生される。この形態のタ
ンパクは伺加的なポリペプチドに融合しており、このポ
リペプチドは恐う（タンパクの分泌及び局在化の補助と
なる。この付加的タンパクは「シグナル」ポリペプチド
といわれ、分泌過程中に分泌される「成熟」タンパクか
ら切り取られると信じ、もれている。プレタンパクのシ
グナルペプチドはい、（らが類似する共通部分を有して
いるがその一次措造はかなり違つ
列又は他の発現用人為構造を伴なわ７よい分離した産物
として異種タンパクを産生、プロセッシング及び分泌す
る酵母宿主系及び発現ベヒクルを使用する組換ＤＮＡ技
術に係る。 親細胞の細胞膜を通って分泌されろタンパクは通常細胞
内で「ブレ」タンパクとして産生される。この形態のタ
ンパクは伺加的なポリペプチドに融合しており、このポ
リペプチドは恐う（タンパクの分泌及び局在化の補助と
なる。この付加的タンパクは「シグナル」ポリペプチド
といわれ、分泌過程中に分泌される「成熟」タンパクか
ら切り取られると信じ、もれている。プレタンパクのシ
グナルペプチドはい、（らが類似する共通部分を有して
いるがその一次措造はかなり違つ
【いる。所与の生体で
さえもシグナルペプチドのこのような変化が見い出され
ている。 例えは、ヒト成長ホルモンのシグナルはヒトインシュリ
ンのシグナルとは実質的に異なっている。このことは、
各々のタンパクがその特定のタンパクの細胞膜を通過し
ての転置に特にうまく適合するようなシグナル配列をも
つように進化して来たことを示唆している。 本発明は、異種タンパクをコードしているＤＮＡを、酵
母α因子遺伝子のプロモーター及び／又はシグナルペプ
チドをコードしている部分のＤＮＡ配列に有効に（発現
するように）結合すると、実質的に成熟なタンパクが酵
母にょっ見に基づくものである（本明細書の開示から明
らかとなるように酵母は少な（とも２種のα因子遺伝子
を有する。「α因子遺伝子」という用語はそのような機
能性遺伝子全てを含むものとする）。即ち、基本的に本
発明は、所望のタンパクをコードしているＤＮＡを含有
する発現ベヒクルをもつ生細胞を含む酵母の培養培地か
ら有用な量の異種タンパクを得る手段及び方法に係る・
この場合、前記異型タンパクをコードしているＤＮＡは
、酵母α因子遺伝子のプロモーター及び／又はシグナル
部分を含むＤＮＡ配列異種ＤＮＡの発現により細胞培養
培地中に有用な分離状態（融合していない２）のタンパ
ク産物１、れることである。 酵母のα因子は、通常完全な分泌作用の際にα因子から
除去される「プレプロ」配列を含有する。従って、有効
操作上の面からは後に更に説明するように培地中への分
泌過程に於いてプレプロ配列がシグナル配列として機能
する。本発明で得られた結果から明らかなよ５に、異種
タンパクに融合したα因子の上記定義のシグナル配列を
含むペプチドは酵母生体によってうまくプロセッシング
され、成熟異種タンパクが周囲の培地に分泌されること
になる。従って、この「プレプロ」シグナルを使用する
ことによって得られる利点は、シグナル／異種タンパク
遺伝子配列がα因子プロモーターの制御下又は酵母内で
機能する他のプロモーターの制御下にあるか否か罠かか
わらず実現される。同様に１本発明によって得られた結
果が示すところによると、α因子プロモーターは典雅遺
伝子の発現に効果的であり、そのような発現はシグナル
配列を発現ベヒクルの中間に挿入しな（ても得られる。 従って、本発明は、酵母系で具種ペプチドを発現させる
ための４予プロモーターにしＺｇぴル ブロモ−クーの使用に関し、更に、酵母中での発現の結
果産生された異種タンパクの有効なブ本発明の背景を明
らかにし、特定の場合には本発明の実施に関する更に詳
細な説明を与えるべ（本明細書中に引用する刊行物やそ
の他の資料は引用によって本明細書に包含されるものと
する。便宜上これらに番号を付しまとめて本明細書末尾
の参考文献の欄に記載する。 又、本発明は、１９８２年１１月１日に出願された米国
特許出願第０６／４３８，２３６号及びその親出願並び
に１９８３年４月２５日に出願された米国特許出願第Ｑ
６７４８８，３３７号に関連するものであり、ここに引
用したことによりこれら出願の開示内容を本明細書に包
含するものとする。 発明の背景 天然の酵母生体を工、細胞表面成長のため及び細胞代謝
に必須な機能として、少数のある種の同脛（内因化）タ
ンパクを原形質膜まで及び時にはそれを通して輸送する
。娘細胞の前低の初期成長として細胞が出芽する際には
、代亦は勿論細胞壁及び原形質膜の生成に仲他の付加的
なタンパクが必要である。これらのタンパクのあるもの
は機能的にある意味で関与する筈であるし、従つ℃、分
泌経路が存在するとイ４じられている（１）。上記過程
に含まれるある種の同種りど３ ンパク（工小胞体に結合したりボゾーム１指訳によって
形成される。同種タンパクは通常酵母種によって産生さ
れ、その生存のために必要なタンパクである。これらは
生成された後ゴルジ装置へ移送され、小胞内へ包入され
、原形質膜へ移送され、そこで結合し、又はある程度そ
こをれる。同種タンパクの少数のものは完全に細胞壁を
通過して外へｉｌｌ几送されるらしい。例えばα−因子
及びキジ−ｍＸ （ｋｉｕｅｒ ｔｏｘｉｎ ）がある
（２．３）。 又、細胞の出芽領域は小＋１ｉｉに魅きつけられる部位
であり、出芽の内部表面に融合することにより、原形質
膜そして恐らく細胞壁の全体の生長に寄与する（４，５
．（ｉ）。いわゆる分泌過程でタンパクのグリコジル化
（ｇｌｙｃｏｓｙｌαｔｉｏｎ）が関係するか否かは未
だに論議のあるところである。更に、本発明でいうよう
な「分泌」タンパクは、シグナルプレペプチドと考えら
れ、脆表面への輸送及びそこでの導入過程に関連すると
思われる。しかしながら、全体としての分泌過程の正確
なメカニズノ、は充分には埋確されていない。 組換ＤＮＡ技術により、酵母生体中の分あ過程に関する
広く知られた質問に対する解答を与える有用な手段が得
られ、これを適用することで、前記の如き生体又は他の
生体にコピー量（大量）の異種ポリペプチド産物を内因
的に産生させ得（例えば、７〜１７参照）、酵母宿主を
適当に操作して異種タンパクを個別の成熟形態で分泌せ
しめ得ると考えられていた。これは実際に達成されてお
り、係属中の米国出願第４３８．２３６号及びその親出
願（止揚）゛の主題となっている。この出願には、最初
その天然のシグナルを伴なうプレタンパク又はそれらの
ハイブリッドとして発現された異種タンパクが酵母によ
ってプロセッシングを受けて成熟タンパクとして分泌さ
れ得るという知見が記載されている。 発明の概要 本発明は、酵母生体を、通常は酵母生体にとって異種で
ありしかもその生存に必要とされないタンパクを産生じ
、プロセッシング処理し且つ分泌するようにせしめ得る
という知見に基づ（ものである。即ち、このタンパクは
、生存し且つ再生する酵母細胞を支持する培地から、所
屋でないペプチドプレ配列又は他の発現用の人為構造を
実質的に伴なわン、Ｃい分離（個別）形態で得ることが
できる。この目的のために、所望の異種タンパクをコー
ドしているＤＮＡ配列を（このタンパクに対しては）非
天然の酵母α−因子シグナル配列をコードしているＤＮ
Ａ配列に結合する。α−因子シグナル（プレプロ）ペプ
チド及びプロモーターをコードしている前記の如きＤ
Ｎ Ａに有効に（発現ずろように）連結し且つ異種タン
パクをコードしている前記の如きＤＮＡを担持する発現
ベヒクルで適切な酵母細胞を形質転換する。異種タンパ
クをコードしている配列と共にα−因子シグナルペプチ
ドをブードしている配列を発現させると、発現産物はプ
ロセッシングを受けて成熟真菰タンパクが細胞培養の培
地中に輸送され、生体酵母細胞を破砕する必要なくこの
培地から成熟タンパクを回収し得ろ。従って、所望で１
．ｃいプレ配列又は他のある種の発現用人為構造（例え
ば、ＡＵＧ翻訳開始シグナルコドンの発現の結果である
４の場合には第１ＯＮ−末端アミノ酸に結合したメチメ
ニン）を除去する必要なく、使用に際し他の点では実質
的に成熟な形態でタンパクを回収する。即ち、生体又は
破砕（即ち、溶菌又は他の方法で破壊した）細胞を実質
的に含有しない形態の培地が得られ、これは所望の産物
を含有しているのでより容易に使用できる精製技術：Ｙ
〆Ｚさる にカフ硝製後のこのような産物は意図する用途に適合す
る。例えば、ヒト白血球インターフェロン産物はその用
途としてヒト抗ウィルス及び／又は抗腫瘍剤がある（一
般的文献として７〜１７参照）。 要約すると１本発明は、酵母のα因子シグナル配列及び
／又はプロモーターを使用して１通常は酵母生体に異種
であり且つその生存に必要としないタンパクを、酵母の
発現、プロセッシング及び分泌の産物として、ｌ１ｂｌ
的にペプチドプ１／配列又は他の発現用人為構造を伴な
わない分離形態で産生することを含む。更に、本発明は
、前記の如きタンパクを産生じ得る１１Ｙ母培養物及び
その培養の結果得られる産物として前記の如きタンパク
を含有するαＹ母培養培地を提供する。より特定的には
、本発明は、異種遺伝子を発現せしめるためにα因子プ
ロモーターを使用する酵母での異種タンパク産生方法及
びこの方法に使用する発現ベヒクル及び生体に関する。 更に、本発明は、発現した外来タンパクのプロセッシン
グ及び分泌のためのα因子用シグナル（プレプロ）配列
の使用、α因子Ｄ ＮＡ配列乞有効に担持する組換発現
ベヒクル、並びにこのようなベヒクルで形質転換された
細胞は係る。 本明細畏で使用する用語「異種タンパク」は、酵母生体
によって通常は産生されず又はその生存に必要でないタ
ンパクを意味する。この用語は、前記の如きタンパクを
コードしているＤＮＡな組換ＤＮＡ技術により発現ベヒ
クル中に機能的に挿入し、次いでこれを酵母生体宿主の
形質転換に使用することも意図している。ｐ ｌ！］
Ａの機能的挿入とは、異種タンパクをコードしているＤ
ＮＡなα−因子プロモーターの制御下にある及び／又は
α−因子シグナルをコードしているＤＮＡ配列に連結さ
れた発現ベクター中に挿入することを意味する。この結
果、ハイブリッドプレタンパク、即ち異種タンパクに融
合したα−因子シグナルペプチドを含有するタンパクが
イＵられる。このような異種タンパクの例としテハ、ホ
ルモン例工ばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン等、
リンホカイン類、酵素、インターフェロン例えはヒト繊
維芽細胞、ヒト免疫並びにヒト及びハイブリッド白血球
インターフェロン、ウシインターフェロン等、ウィルス
抗原又は免疫原例えば日持病抗原、インフルエンザ抗原
タンパク、肝炎コア及び表面抗原等、成長に付随する因
子例えはヒトインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１及び
Ｉ（）Ｆ−２）、表皮成長因子（ＥＣ）Ｆ） 及び神経
成長因子（Ｎ（）Ｆ）並びに他の種々のポリペプチド例
えはレンニン、ヒト血清アルブミン、ヒトインシュリン
、種々の糖タンパク等がある。 本例＃Ｉ店で使用する「分泌」は、原形質膜ビ通して且
つ少なくとも酵母生体の細胞壁内への又はそれを通過し
て、細胞培養を支持する培地中−１の産物の輸送を意味
する。因みに、ある場合には、「分泌」産物は何らかの
態様で細胞壁と結合しており、恐らくは異なる１Ｗ製手
順を必要とし、又は酵母宿主の構造及び機能のイω正が
必要となる。 「プロセッシング」とは、成熟タンパクからα−因子シ
グナルペプチドを細胞内で開裂して実質的にシグナル配
列部分を伴なわないで又は異質のペプチドを伴なわない
いわゆる分離（個別の）成熟形態で異拙タンパクを産生
ずることを意味している。「異質の」ペプチドにはメチ
オニンのような発現用の人為措造であるペプチドが包含
される。プロセッシングはｓ 成Ｎｆｌ タンパクと結
合したシグナルペプチドの正確な点とは、Ｓれた（しか
し意味のあるようなＭ要な違いとはならない）場所での
シグナルポリペプチドの開裂を許容する。 られた数のタンパクしか培養培地量へ分泌しない。培地
中に見い出されるタンパクの１つはα−フエ目モン即ち
α−因子である（２１゜α−因子Ｑ戸−Ｌｅルー Ｔｒｐ−Ｌｅ〒−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇ４ｎ−Ｐ
ｒｏ −Ｍ６ｔ（又はＭ ｅ ｔ ＰＩ Ｏ）一つ’ｙ
ｒ−ＣＯＯＨを有する１２〜１３個のアミノ酸残基から
成る４稚のオリゴペプチドの嫉であることはＤｕ １１
ｆ、Ｚ（’！ ”：Ｅによって最初に決定された（１
８．１９）。 第３図に、α−因子遺伝子σ月つＭＦ’、−１のプロセ
ッシング前の産物中の４棺のペプチドの位置を示す。枠
で囲ったセグメントだけが培地中に分泌され、歿りの配
列は分泌されない、残りの配列のうちのどれだけが、分
泌されるために少な（とも一部はプロセッシングを受け
る「真の」シグナル（プレ）配列であるのか、及びどれ
だけが従来の前駆体クンバク（例えはグロレンニン、プ
ロインシュリン）の意味テ「プロ」配列なのかは明らか
でない。 同様に、第４図に示す、町α２遺伝子の産物中で「枠で
囲った」部分だけが分泌され残りの配列の性質はＬＦｃ
ｔｌ中のものと同様に記載し得る。 本発明の実施研死中に、他のグループ（４４）は、本発
明とは鶴なる方法でα−因子遺伝子の１つＣＭＦｃｔｌ
）の単離及び配列決定に成功した。 後述するように、２種のび一因子造伝子が本発明者等に
より単離され、α−因子のプロモーター及びシグナルペ
プチドに対するＤ Ｎ Ａ配列が細菌の形質転換には、
Ｅ、ｃｏＬｉ Ｋ−１２株２９４ （ｅｐ仏ｔｈｉ −
ｂｓｒ −ｈｓｍ ’ ） （ＡＴＣＣ３１４４６）
（２２）を使用した。ｒ母宿主としては、１９８２年３
月５日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ１６２０６２６で制限
なしに寄託されている酵母白株２０Ｂ−１２（α、且昌
と■工）を使用した。 Ｂ、増殖培地 通常の酵母増殖培地はバクト酵母抽出物（Ｄａｃｔｏ−
ｙｅａｓｔ ｅ×ｔｒａｃｔ） １ ％、バクトベプト
ン（Ｅ、ａｃｔｏ −ｐｅｐｔｏｎｅ ） ２ ’Ｉｓ
及びデキスト１コース２幅を含んでいた。ｅ母最小培地
（・二アミノ酸不含バクト酵母窒素４．−ＩＨｏ、 ６
７循、デキストロース２俤及びｇａｒ３％を含んでぃ７
こ。 酵母の形質転換用にはＩ Ｍソルビトール１補充した最
小培地を使用した。市Ｉ ｒｒｖの増殖培地は］・Ｂ（
２５）であり、これ（工形質転換に匣用するどきはアン
ピシリン／ ２ ｃ） ａｇ／ ｔａｒ、を心ｉ充した
。 コロニースクリーニングに使用したＳ−寒天プレートは
、ｌｅ当り、トリプトン３２！、ｔｅａＣ１５，９、Ｄ
ｉｆｃｏ 寒天１５ 、？及びｈｂＯＨＯ，２１を含有
し、表示したようにアンピシリン又はクロラムフェニコ
ールを添加した。 Ｃ０形質転換 旦、競ム２９４は刊行物（２３）に記載の手順を用いて
形質転換した。酵母は本質的に文献（２１，２４）の記
載のようにして形質転換した。 Ｄ、酵素及びＤＮＡ調製物 制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ及
び１１ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ から購入し製造元の推奨に従って使用
した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ から入手し、２０ｒｒ）Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ （ｐ Ｈ７，５）、 １０１ＴＩ１０１Ｔ
Ｉ、、１０＋ｙＨＭジチオトレイトール、１ｒ４ＭＡＴ
Ｐ中１４℃で使用した。仔ウシアルカリ性ホスファター
ゼはＢｎｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ から購
入し、ｌ ＯＯ曽Ｍ ＮａＣＬ、５０ＴＴＴＭ Ｔｒｉ
ｓ −ＨＣｌ （１）Ｈ７，４）、１０ｙｐＭ ＭｇＳ
Ｏ４、ｌ、Ｍ２−メルカプト−エタノール中３７℃で使
用したＯ プラスミドＤＮＡは透明溶菌液法（ｃｌｅａｒｅｄｌｙ
ｓａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ） ’（２９）で調製し、Ｂ
ｉｏ −Ｒａｄ アガロースＡ−５０カラムクロマトグ
ラフィーで精製した。少量のプラスミドＤＮＡは個々の
旦、刈旦形質転換体から急速スクリーニング法（ａｕｉ
ｃｋ −ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ）
（２０）によって調製した。ＤＮＡ制限断片は ・１憾
アガロースゲルから電気溶出し次いでフェノ−゛ル／ク
ロロホルム抽出及びエタノール沈殿１−て単離した。オ
リゴ−デオキシヌクレオチドプローブはホスホトリエス
テル法（４１）で調製した。 ■＋】、ハイブリダイゼーションプローブのデザインα
−因子遺伝子用１５量体（１５−ｍａｒ ）オリゴヌク
レオチドプローブをフェロモンのアミノ醒配列（１９）
及び酵母のコドン使用頻度（ｙｅＦ＞ｓｔ Ｃ０ｄＯ１
］ ｕｓａｇｅ ｆｒａａｕｅｎｃｌｅｓ ）に基づい
てデザインした。その原理を第１図に概略的に示す。第
１図にはα−因子の最後の５個Ｃ）アミノ酸と可能な全
てのコドン及びそれらの使用頻度を示す（コドン使用頻
度は２種の異なるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼクローン（３０１３１）及びアルコールデ
ヒドロゲナーゼエの総計である）。これら及びその他の
遺伝子のコドン使用頻度は最近概略が刊行されている（
４６）。第１図から明らかなように、５個のアミノ酸を
コードしているほとんど全ての可能な配列はオリゴヌク
レオチド配列５’−ＧＧ、、ＣＡＡＣＣ：ＡＴＧＴＡＣ
に包含される。 従って、各々２種のオリゴヌクレオチドから成り上記配
列に相補的な２種のプールを合成した。 フェロモン中の他の連続する５個のアミノ酸はいずれも
このような限られたオリゴヌクレオチドのセットではカ
バーされ得ない。 Ｆ１組換プラスミドのスクリーニング ５ａｕ３Ａで部分消化した酵母ＤＮＡなＹＲ，７（３２
）のＢａｍ ＨＩ 部位に挿入して作製したゲノムライ
ブラリーを、α−因子遺伝子クローンの存在に対してス
クリーニングした。盈、姐星形質転換体を、アンピシリ
ン５ｏｌ／ｍｌを含有−１−るＳ−寒天プレート上に載
置したニトロセルロース１紙上で増殖させた。３７℃、
６時間後、クロラムフェニコール１５ｏ ９ ／ｍｌ
Ｙ 含Ｔｉスル”−寒天プレートにフィルターを移した
。１５時間の増幅後、修正」翼店襄 コロニースクリー
ニング法（３Ｂ）を用いてコロニーのノ）イブリダイゼ
ーションをテストした。ハイブリダイゼーションブロー
プとして上記３２ｐ−標識合成オリゴヌクレオチド（４
０）を使用した。１０ｒｎＭＴｒ１．ｓ （ｐ Ｈ７，
５）、６ｙｎＭ ＥＤＴＡ 、 ０．１ ｍＭＡ Ｔ
Ｐ、１１ＴＩＭピロリン酸ナトリウム、０．８ＭＮａ１
ｌ、Ｉ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液、ｏ、５ｌＮ
Ｐ−４０及びｏ、１ｍ９／威 見、鵠旦 ｔＲＮＡ中４
２゛Ｃで一晩フイルターをハイブリダイズした。フィル
ターを３０°、６Ｘ８８Ｃ中で２０分３回洗浄した。乾
燥したフィルターを一８０°でＤｕｐｏｎｔＬｉｇｈｔ
ｎｉｎｇ −Ｐｌｕｓ増感スクリー７Ｙ用（ＳてＫｏｄ
ａｋＸＲ−２Ｘ−ｆｌ’ａフィルムに露出した。 Ｇ、α−因子遺伝子を含有する組換プラスミドのｙす１ 組換プラスミドを含有するコロニー約４５００個を、３
２ｐ−末端標識オリゴヌクレオチドブールエ（第１図）
を用いる１ｎｓｉｔｔ４ ハイブリダイゼーション（３
８） でテストｔ７た。２４個のプラスミドが様々な程
度でハイブリダイズした。 これら２４個のコロニーから少量のプラスミドＤ Ｎ
ＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ の方法（２
ｏ）で′ＰＡ製し、ＤＮＡサンプルなニド四セルロース
フィルター上にスポットした後同じプローブとのハイブ
リダイゼーションに関ｔ７てテストした。 プラスミド２４個のうちの２個が強（ハイプリダイスし
、これらを夫々ｐ５１及びｐ５２と命名して以後の実験
用に選択した。プラスミドｐ５１及びｐｓ２％ｚオリゴ
ヌクレオチドブール■ともハイブリダイズした。 ■（、ハイブリダイズする配列のザブクローニング合成
プローブとハイブリダイズしたインサートの＊ａ決定を
するために、クローンｐ５１及びｐ５２から調製したプ
ラスミドＤ ＮＡ’ａ？旦四ＲＩ、凪■、旦匹１１１、
川■ＨＩ及びシ些■ によって制限酵素解析した。第２
図人に示したように、２種の組換プラスミド（工全（異
なるものであった。２種のプラスミドのＥ ＣＯＰＩ及
びＰｓｔｌ消化の場合だけ各々１個の共通な断片が得ら
れた。双方の場合で共通の１１１片はＴＩ’（Σ１ イ
ンサートであり、１．３８ Ｐｓｔ Ｉ断片はＶワ１及
び三 遺伝子中のＰｓｔ、 Ｉ部位間のＤＮＡである。 プローブに相補的な配列を含有する断片な５Ｏｕｔｈｅ
ｒｎ法（４２）で同定した。ｆｉ２［ｍＢかられかるよ
うに、１例な除いて、５種の制限酵素での消化の金側で
プローブに特異的にハイブリダイズする断片が得られた
。ｐ ５２ Ｄ ２ＪＡをＨｌｎｄｍで制限して生成す
る断片１ざいずれもハイブリダイゼーションハ′観察さ
れなかった。 合成プローブに相補的な配列を含む最小の制限断片は、
ｐ５２では１．７ ｋｂｐ以徂Ｒ４断片であり、ｐ５１
では１．８ ｋｂｐ叫■断片であった。これら２ｆｔｌ
ｌのＤＮＡ断片な分取用（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ）
アガロースゲルから電気溶出して単離し、適当に開裂
したプラスミドｐＢＲ３２２（３３）ＤＮＡに個別に結
合した。結合混合物を用いて旦ヨ２９４を形質転換し、
この形質転換体からのプラスミドＤＮＡを急速スクリー
ン法（ｑｕｉｃｋ −５ｃｒｅｅｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒ
’ｅ。 ２０）で分析した。夫々１．７ ｋｂｐ Ｅｃｏ Ｂ
Ｉ及び１．８ ｋｂｐ Ｈｌｎｃｌ ｍ断片インサート
を含有する２個の形質転換体をｐ５３及びｐ５６と命名
し、以下のようにして分析した。即ち、プラスミド２４
個ビｐｓ３及びｐ５ｅから調製し、匹旦Ｈ１，Ｃ１ａＩ
、ＰｖｕＩ、ＰｓｔＩ及びＳａｌ Ｉで個別に消化した
。得られたＤＮＡ断片をｌ係アガ【ノースゲルで分離り
、二ｌ−ロセルロースフィルターペーパー（４２）に移
し、３２Ｐ−標識プローブとのハイブリダイゼーション
に関してテストした。制限消化物及び対応するｐ５３Ｄ
ＮＡ（この組換プラスミドはＥｃｏ ＲＩ断片としての
１．７ｋｂｐ酵母ＤＮＡビ含有している）のハイブリダ
イゼーションパターンの解析によって、このクローン中
の酵母ＤＮＡが１個の肋↓■部位及び２個のＰｓｔＩ部
位を含有していること、並びにプローブに相補的な配列
が０．５ ｋｂｐｙＰＰｓ ｔｌ −Ｓａｌ Ｉ断片中
に包含されていることが示された。クローンｐ６６中の
酵母Ｄ Ｎ ＡのＨｌｎｄ ＩＩＩ断片はこれらの酵素
にあする制限部位を欠いて：ｌ（量り、ｐＢＲ３２２ベ
クター中のこれらの酵素に対する唯一の制限部位で開裂
して得られた直結化プラスミドはプローブとハイブリダ
イズした。 次にこのプラスミドを多（の他の制限エンドヌフレアー
ゼで消化し、消化物を上記５ｏｕｔｈｅｒｎ法で解析し
た。このプラスミド中のハイブリダイズする配列は１．
３ ｋｂｐ Ｈｌｎｒｌｍ −Ｓａｃ Ｉ断片上に含ま
れていることが判明した。 α−因子によるｒａＪ細胞の成長阻害特性を利用してク
ローン化した１、７ ｋｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ及び１、８
１ｃｂｐ Ｈｉｎｄ ｍ断片に含まれるフェロモン遺伝
子が機能性であるかどうかテストした。活性のあるα−
因子フェロモン遺伝子がプラスミド中に存在していれは
、マルチコピーのプラスミドを含有する細胞では染色体
コピー（又は多コピー）の遺伝子しか含有しない細胞よ
りも有意に多量のフェロモンが合成されると期待される
であろう。すると、感応性の「ａＪ細胞の菌叢中に非増
殖領域が増大して（ることで高レベルのα−因子が検出
し得るであろう。≧旦Ｒ１で消化したｐ ５３ ＤＮＡ
から単離した１、７ ｋｂｐ断片とＨｌｎｄｍで消化し
たｐ５６ＤＮＡから単離した１、８ ｋ、ｂｐ断片とを
、酵母選択可能マーカーｇＲｐ１ 及び２ｚｚｍｉ％母
プラスミド（４３）由Ｊ汐 来酵母復製オリジンを含むｐＢＲをベースとするベクタ
ープラスミドに個別に結合した。酵母菌株２０Ｂ−１２
を、これらの１ラスミド及びα−因子をコードしている
ＤＮＡ配列を欠くコントロールプラスミドで個別に形質
転換した。次に形質転換体のフェロモン産生を比較した
。プラスミド上にＭＦ、１又はＭＦα２ をコードする
配列な含有する形質転換体は、コントロールプラスミド
で形質転換された同じ菌株よりも有意に多量のα−因子
を産生じた。このことから、１．７ ｋｂｐ加菖Ｒ１（
ＭＦ、工１）及び１．８ｋｂｐ邑匹Ｉｒ［（ＭＦｃｔ２
）断片が活性α−因子フェロモン遺伝子を含有すると結
論した。１ｔ４ Ｆｃｌ ｌで得られた結果はＫｕｒｊ
ａｎ ａｎｄ Ｈｅｒ：ｋｏｖｉｔＱ （４４）が記載
した結果と一致している。何故ならばこの遺伝子は彼ら
の記載した遺伝子に対応しているからである。 １、Ｄ ）Ｊ Ａ配列決定 ＤＮＡ配列決定は既に文献（４５）に記載されているよ
うにして行なった。要約すると、チェインターミネーシ
ョン法（４７）によか吟Ｄ Ｎ Ａ配列決定の際には、
α−”ＰｄＣＴＰ（４００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ、 Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）の存在下で、一本領［鋳型Ｊ ＤＮＡの
起源として相撲ファージＭ １３ ｍｐ ８及びｍｐ９
（３９）’ｆ且つＥ、 Ｃｏ１１ Ｄ Ｎ Ａ ポリメ
ラーゼ■のブライミングには合成オリゴヌクレオチド（
大断片、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）
を使用した。反応混合物を５係ポリアクリルアミド／８
Ｍ尿素「薄層」ゲル（４７）上で電気泳動した。ゲルを
３１（λ（紙（Ｗｈａｔｒｎａｎ ）上に乾燥し２〜１
２時間Ｘ−綜フィルムに露出した。 第３図に１．フｋｂｐ Ｅ＋匹−Ｒ１断片、第４図に１
．３ｋｂｐ−山、ｎｃｊｍ−伽！■断片の大部分のヌク
レオチド配列を夫々示す。ｐ５３配列＆Ｘ１６５個のア
ミノ酸残基がら成るタンパクンコードしテイルオーブン
屏読枠を含有しており、このタンパクはそのＣ−末端側
の半分の内に４個の内部ｔ Ｉｔ遥七単位をもっている
。各単位はＬｙｓ −Ａｒｇ で始まりα−因子配列で
終る。各単位内子から分離されている。タンパクのＮ−
末端側の半分は２２個のアミノ酸からハ！る疎水性に富
む配列で始まっているが、この配列は恐ら（分泌用のシ
グナル配列を表すのであろう。この疎水性配列と最初の
繰り返し単位の間の６１個のアミノ酸残基は、３個の可
能なＮ−グリコジル化部位（第３図中横棒で示す）を含
有している。 ｐ５３クローンが含有するフェロモン遺伝子のこの遺伝
子は４箇所で、胚１α１ とは異なっている。肛α１
は−８，−７及び１２５０位匠に位置の代わりに）Ｔ残
基な、６０４の位置に（Ｃの代わりに）Ａ残基を含有し
ている。１２５の位置での違いのため、４２番目のアミ
ノ酸のところでＴ ＣＡ （Ｓｅｒ ）ではなくＴＴＡ
（Ｌｅｕ）コドンがある。ｐ５３が含有する遺伝子４旦
１゜１と命名した。 別のα−因子遺伝子、ＭＦα２ はｐ５６クローン中に
存在する。この遺伝子の組織構造はｙ！α１ に類似し
ている（第４図）が同一ではない。この遺伝子がコード
しているα−因子は、明らかに、フェロモンの２個のコ
ピーを含有する１２０個のアミノ酸残基から成る前駆体
タンパクとして作成される。この推定される前駆体に含
有されるα−フェロモントリデカペプチドの１方は、ｙ
ヱα１ 遺伝子がコードしているフェロモンコピーと同
一であるが、他の１方はＧｕｎな有している。 これらの前駆体の組織構成は、ある種の哺乳類の神経性
内分泌ペプチドの前駆体と驚く程類似している。即ち、
プロピオメラノコルチン（ｐｒｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃ
ｏｒｔｉｎ ） （４８、４９） 、ゲロニンケファリ
ン（ｐｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｐ） （５０−５２）及
びプロジノルフイ％ ｐｒｏｄｙｎｏｒｐｈｉｎ）（５
３）と同様に酵母前駆体は分泌に関与する多重ペプチド
単位を含んでいる。これらの前駆棒金′Ｃに於いて、分
泌される単位（ユニット）を工前駆体のＣ−末端側の半
分にある。Ｎ−末端側の半分は可能なグリコジル化部位
Ｚもっている。哺乳類の多機能性（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃ
ｔ、１ｏｎａｌ ）前駆体の場合と同様に、α−因子前
駆体の正確なプロセッシングにはグリコジル化が含まれ
るであろう。然しなから、酵母前駆体の実際のプロセッ
シングステップは哺乳類前駆体タンパクの場合とは違う
であろうと考えられる。哺乳類の前駆体では放出部位を
提供する塩基性残基対（Ｌｙｓ −Ａｒｇ ） ＋Ｓ分
泌されるペプチドの直ぐ倶ｊに配置されているのに対し
て、α−因子前駆体で（・１これらの部位で開裂が起こ
るとＮ−末端にイ＜ツかの付加的アミノ酸が付いたフェ
ロモン単位が放出されるであろう（第３図及び第４図参
照）。これらのＮ−末端延長部はＭヱｃｔ１及びｙヱα
２ 遺伝子の双方がコードしている前駆体中にある繰り
返し−Ｘ−Ａｌａ−配列から成る。 最近の研究（５４，５５）によると、α−因子前駆体の
１０セツシングの最終段階はジペプチジルアミノペプチ
ダーゼによるこれらの配列の除去であることが示唆され
ている。ミツバチ毒メリチン（５６）及びカエル皮膚セ
ルレイン（５７）の前駆体は明らかに類似のメ芳ニズム
で１０セツシングされる。 ８１発現用プラスミドの４１９及びヒトインターフェロ
ンの分泌 上述したように本発明のＤＮＡ配列データはα−因子が
１６５個及υ・１２０個のアミノ酸かも成る前駆体クン
バクとして合成されることを示唆しているが、このよう
なタンノくりにつ（・ては過去に報告はｆｚい。α−因
子のプロセッシング及び分泌メカニズムは知られていな
い。しかしながら、変容（ａｌｔＰｒｅｄ ）α−因子
を用（・た最近の研究の示唆するところによると、成熟
α−因子の産生り最終ステップは明らかにｇｌｕ −ａ
ｌａ又はａｓｐ −ａ、ｌａの除去であり、この後に、
基本配列がＨ，Ｎ −（Ｔｒｐ） −）（ｉｓ −Ｔｒ
ｐ −Ｌｅｕ −Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−（）ｌｙ−
Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ （又はＭｅｔＳＯ） −Ｔｙ
ｒ −ＣＯＯＨである１２〜１３個のアミノ酸から成る
α−因子オリゴペプナドカー放出される。 異種遺伝子産物の発現及び分泌に於けるα−因子プロモ
ーター及びα−因子プレ配列の有用性を示すためのプラ
スミドの調製法の概略ン第５図に示す。異種遺伝子産物
の発現及び分泌用のα−因子プレ配列をコードしている
ＤＮＡ配列の概略を第５図に示す。α−因子ペグチドを
コードしているＤＮＡ配列なα−因子クローンの１つ（
ｐ５３）から除去した。得られたプラス−ター配列を含
んでいた。次にこの配列をヒトインターフェロンＤ（Ｉ
ＦＮ−α□）遺伝子に結合してプラスミドｐ５８を形成
した。ヒトインターフェロンＤ遺伝子（５８）は、Ｌｅ
ｕ −Ｇｌｕ −Ｐｈｅ に対応するＤＮＡ配列が開始
メチオニンコドンの前に付けられるように修正した。修
正インターフェロンＤ遺伝チンα−因子の「プレプロ」
及びプロモーター配列と結合した後に、これらの配列を
単離し、酵母−Ｌ仝す」１シヤトルプラスミドＹＥｐ
９ Ｔ （第６図）中に挿入した。 プラスミドＹＥｐ９Ｔは、プラスミドＹＥｐｌＰＴ（５
９）中の旦弦ＲＩ−出痣夏断片をｐＢＲ３２２由来しＲ
Ｉ−工Ｉ断片で置き換えることによって予じめ作製した
。このプラスミドはＥ、 ｃａｌｉ中での選択及び複製
に必要なＰＢＲ３２２（３３）ＤＮＡを含んでいる。加
えて、このプラスミドいる。これらの酵母由来の２種の
ＤＮＡ断片により、酵母内での選択が可能になり、自己
複製及びプラスミドとしての維持が可能になる。 ２ｎオリジンが転写停止／ポリアデニル化シグナル（３
７）ｙ含有しているので１図示したインサートの配向を
有するプラスミド、ｐ６０を選択した。ｐ６０中に存在
するα因子［プレプロ」配列と修正ＬｅＩＦＮ−Ｄ遺伝
子の接合部のＤＮＡ配列を第７図に示す。ｐ６Ｑプラス
ミドを酵母菌株２０Ｂ−１２に導入し、 ｔｒｐ＋形質
転換体を増殖してインターフェロン産生について検定し
た。 （以下余白） １（・ 堺消」ｔ５地及び削１１）泡抽出１勿のインタ
ーフェロンアッセイ 形質伝せさ体の１固々のコロニーケＹＮＢ十ＣＡＡ２０
ｍ１．中３０℃でＡａａｏが約ｌＯになる壕でＪ？Ｊ
５１１１しグζ。アッセイ用に試料ｌＯ戯ｏｒｖａｌ
Ｓ Ｍ ２４０−ター中７ Ｋ ｒｐｍで１０分間趙６
分Ｉ誦した。独々の希釈度で上ｎ＾（培地）を検定（ア
ッセイラした。 刑ＩＩ ｊｌｔ！！金等滲のガラスピーズをゴむ７Ｍグ
ア＝ジン−１４ＣＬ ０．５ ｍｌ ＶＣ４壇１ｆｆｉ
瀾し高速−′ｃ２分間ボルテンク（ｖｏｒＬａｘ ）
処理した。次に、ｒｉｌｌノ活Ｉｕ ｒＪ？＋ １５ｆ
ｆ及び培地のｕｌｉｉ ：ａをバイオアッセイのために
ＰＢＳ／ＢＳＡ（１５０ｍＭＮａｃＬ、 ２０ ｍ＋〜
１リン１穎ナトリクム（ｐｌ（＝ ７．９ ）及び０．
５％ウシ１０１ ？ｌ″」アルプミンノ中に布ダくした
。細施変注効果（ＣＰＥ）ＩＡｉ古アッセイ（至）によ
って、＋４母抽出、物中のイノクーフェロンｔインター
フェロン標準（スタンダードリと比＋１少しで検出した
。壇燗）台地１ｔＫＮきｌ ＋Ａにユニットなでのイン
ターフェロンが検出された。ｔｆｉｌｌ ｂ’ｃｌ １
１１１出ツ勿からも同様Ｑ′こｊ’ｄ夾物ｉｔ当り１０
０ＸＩＵ’ユニツトの割合でインターフェロンが（１’
） ７Ｌ ｆｃ。 Ｌ ｊ；’ｊ地インターフェロンのＩ、ｌＶ ’ｉンゼ
ｊ厚母萌イ未ｐ ６０／２０ Ｂ−１２の単一のコロニ
ｆ ＹＮＢ＋ＣＡＡ ５ Ｌｌ ｏ ｍｌ、中３０℃−
Ｉ：Ａ６６Ｇが２．４ニｙｊ ル”Ｊ テＪｉ！殖した
。Ｃ（１） ＪＪ！ｔ ｄ Ｑ勿５００ ｍｌ ｆ Ｙ
ＮＢ十ＣＡＡで５Ｌにｊｎ釈してＡ６ｅｏ’ｋＯ８２１
とし、１ηられた５Ｌ培つＩ（物を３０℃でＡ６６０＝
７０ ＵでＪ’ｊｒ １ａｉｎした。この時点で５Ｌ
培ｌ物を７．００ Ｏｒｐｍでｌυ分間逓心分子＋ｆｉ
ｔ、て収偵した。発、・１１月”Ｊ Ｊｌ）ｊ的Ｑこ
１ηｍｅの試ネ１勿取り出し光学冴度、−ｆンターフエ
ロ／産生及び分Ｅ ｋ ｌｌｌ１１足し／こ。アッセイ
に先見ら、’（’ｒ試１Ｆをベンチ−トップ伶却煮沈含
（ｂｅｎｃｈ −ｔｏｐｒａｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ ｃ
ｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ）中５分間遠心して細ｊ４Ｍｋ培
地η）も分離し１こ。培地及び細彪全上記の如く俊足し
た（第８図６ｉｔて〕。２４ＡＵＸ）異ｌよる元酵を行
ｌ工つｌこ。培地中のインターフェロン・ビーク活１主
は夫々１を尚ジ３ Ｘ １０’及び２ＸｌＯ’ユニツト
でら” ｆＣ０Ｊｉｌｌ力己抽出“１勿・１１のインタ
ーフェロンン占注はノ？ｌ地１を当りＩ Ｘ ｌ Ｏ１
′及び２ Ｘ １０’ユニツトであった０ 保結、啼地１を及びＶｔ金で６ツｉ、・Ｃ１シ、χ′Ｊ
〜１−５限外１戸ノＦ’Ｊ Ｅ４ ｋ ｉ走用して２．
５ ｔ ｈｍ１ｃｏｎＪＪｚ４）Ｊ三ｌ７７（５ｔｉｒ
ｒｅｄｃａｌｌ ） （Ａｍ１ｃｏｎ ２０００ ）内
−ひ２５ ＋ＭＩ Ｔｒｉｓ ＋１０ ｍＭ ＥＤＴＡ
、ｐＨ８，０に対して透析して最長ｄ・１１．１１６
ｍＢとした。残留）でり（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ）の−
翻試イ１は直接配列ｊ・ノγ析し曲の一部はアセトン沈
１；゛コχし′Ｃかｌ：）配列解析した３、 ハ縮培地１ ｍｅをアセトン４−で沈設し、マイクロ遠
沈ｉｆ （ｍｌｃｒｏｆｕｇｅ ）中で回転沈降し、ア
セトンで洗浄し／こ。ペレット全ｏ、ｉ％’ｒ Ｆ Ａ
にゼ）ｉｉｉｉｉンｚＪＬＳｙｎｃｂｒｏｐａｋ ＩＬ
Ｐ −Ｐカラムの１１１）ＬＣで史に棺製し７’ｊ （
） ：’Ｊ ７ ムｋ Ｏ−１９に ’１’ Ｆ Ａ
”Ｐ ノ０−１０ Ｕ Ｘ７ セトニトリルのＩｆｆ
ＭＪ勾ｒ記で６０分間かげてｒＷ出しｆｃ。 イＳ製したＩＦＮ−αＡＤのサンプル１２μすτコント
ロールとしてクロマトグラフィーにかけンも。２８０＋
ｌＩ！ＩＭ己クリ 配列）’ｎ析はＥｄｍａｎ分屏Ｑηに茫ついて行ｉよっ
た。 液体試：ｊ’） ？ｒ修正Ｂｅｃｋｍｎｎ ８９０Ｂ
ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃａｐｓｅｑｕｅｎｃｃｒ のキャ
ップ（ｃａｐ ）中に尋人した。 Ｐｏ１ｙｂｒｅｎｅ ｆキャンプ（至）中のキャリヤと
じて１更用した。使用した試薬はＢｅｃｋｍａｎｓ ５
ｅｑｕｅｎｃｅ ｇｒａｄｅ の０、１ Ｍ Ｑｕａｄ
ｒｏｌ ｄｌｆｊｇ、フェニル−インチオシアイ・−ト
及びヘプタフルオロ陥１没で・ｂっだ。谷ツ゛イクル中
内部標準として１史用［るためノルロイシンをＱｕａｄ
ｒｏｌ緩衝液と共に添加した。谷クロマトグラム中にＰ
Ｔ Ｈ−ノルロイシンがイＴ′、在するとＰＴＪＩア
ミノ１哀ヲ保哀詩保持時間て同ボする助けと１よる。 アミノ戚配列１’ｆイ析によって、 Ｎ）ｉ、−末）・
糊配列ＮＨｚ−Ｇｌｕ −Ａｌａ −Ｇｌｕ −Ａｌ
ａ −Ｌｅ ｕ −’Ｇｌ ｕ −Ｐｈｅ−１ν１ｏｔ
ｉｈ−する１１１）ニー４！］１のインターフェロン分
子が示された。このｎｅｔはインターフェロンｘｆｆ
伝＋のＮ−末端の６ｉｊ始コドンによるもｖ−ｃｉす、
１１［つて、ｔ’Ｑ生し）ζタンパクは７個の余分なア
ミノＦ１’ｌ ｋΩんＣいる。このうち３１固は４Ｌ貫
者に白米する。即らＬｒ＋ｕ −Ｇｌｕ −Ｐｉｋｅ
（ｇｆ４７図””１（ｉ） Ｃ？ ６す、残りの４１固
はα−因子のブレを配列にｖ目Ｓする、即らＧｌｕ−Ａ
ｌａ −Ｇｌｕ−Ａｌａである１、こ＋７個のアミン＋
＋２から成るＮ−末端姑艮副ｋ ’ａ４むポリペプチド
はインターフェロンｒａ ｔｌ ｋ １呆４ｉ’ Ｌ−
Ｃいる。 Ｉ−コ、ｉ！ｉの異ト１）遺伝子産物の麓りＩ５及び分
−Ｖ・α−因子プロモーター及び１゛プレグロ」配列の
イ］ｉｔ］ Ｉ生をテストする過程Ｃ１プロモーターと
「プレグ口」配列が取り扱い易い（・；多送し１りる）
ｉ＋１ｌｌｌ奴１チ１ハとしで単離できる↓′）ＶＣ
α−因子１−プレグロ」！Ｈ１ｇ列の末尾に制限エンド
ヌクレアーゼ部１ｓ’ｌ ｋ Ｆｉ１１成した（第７図
ｊｊｊｊｊづ。次に、削切ｌ工「付７１°Ｓ」末ｉ、７
Ｊ宏ａ７汀する旺、仏の候柑示云子Ｖこ対丁４）この元
現及び分泌システムのイ丁幼注τテスｍｌ−／）７ｃ・
りに、１１１当ｌニブラスミド侘１１・フィシし１！１
７辷。このｆＣＫンにうらり表フラれら遺伝子はこれを
含むプラスミドのＩＵｃｏ ＲＩ ？ｌ’４化によって
取得した。例えば、１９８２年１１月１日出−の米国時
１［出−第４３８，１２８号（ウシＩＦＮ）：１９Ｂ１
年８月２８日出＆！ｉＩの禾し］竹許出１１’Ｊ１ ｉ
粘２９７．３８０号（ＭＳＡ）： １９８１年ｌＯ月１
９日出願の米国特許出願１１３ｔ ２，４８９号（ｒｌ
ＦＮ ） ： Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ＋ｓ（ｅｒｉｇａｎ＋ ｅｔ ａｌｌＡｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ、 （１９８２）＋ Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｂｅＳｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ ｏｎ″Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉ３ｉｏ１ｏ
ｇｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ： Ｒｅ１ａｔｉ
ｏｎ−ｓｈｉｐ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ″＋
ｈｅｌｄ Ｍａｒｃｂ ８−１２゜１９８２＋ Ｓｑ
ｕａｗ Ｖａｌｌｅｙ＋ Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ ：
Ｌａｗｎ＋ ｅｔ ｌ！、＋ＮｕｃｌｅｌｃＡａｌｄｓ
Ｒｅａａａｒｃｈ＋ ９．６１０３（１９８１） ；
Ｇｒａｙ。 郵ＩリリＮ懸旦り、Ａ１５，５０３（１９８２）参ｌｉ
ｔ粍Ｌ−ＦＡ及びレンニン遺伝子−ひは制限−位の位同
のために、上記のように直接発現グラスミドＸ１′４Ｍ
’５にすることは現実的ではｌ工く他の１ψ正した力
演をとった。ｔ−ＰＡ兄現プラスミドの傳築を第１０図
に示す。この場汗はプラスミドｐｔ−ｐＡｔｒｐ １２
−勿藺用しΔｂａ Ｉ及びＬｌｇｌｌで切ばしてｔ−Ｐ
Ａ逍伝す會青、他にｐＢＩ （米国ｌｒケｄ′Ｆ出願第
４３８．２３６号曾上４）及びＹＥｐ １３ ！１１
ｋ １９ｉ用する。レンニン発現グラスミドは、ｐＲＩ
（１９８２年１２月２２日出ｖｉ＋の米国！１ヶ５゛［
出！ｆｉ１１第４５２，２２７号） ｔ Ｘｂａ ｌ−
Ｒ蛙１切除によって１ｕたレンニン遺伝子倉使用して同
様に組立で１ξ。こ２’Ｌりの２つのプラスミドは、・
孝りはでの選択用の４四２をよイｊ゛する。従って、こ
れらのプラスミドで形ｙ″ｉｉ転ツ應するｆｃ メＶＣ
αｌｅｕ湾孝母Δｆ較ｔ１吏用した。プロし／ニン発現
グラスミドｐｉｕは、Ｅａｏ ＲＩ Ｐｓｔ Ｉ −ｅ
開裂したγ−Ｉ ｍｍグラスミド盆’ｌ’４リガーゼの
イ（：ｎ＝Ｆ５′セグメント及び３′セグメ／トと共に
インキュベートしてイＡ’４＆し７ｔｏｒ −ｌＡ４１
１１ は１９８１年１０月１９日出願の米国！１ケＷＦ
出願第、１１２，４８９号及びＧｒａｙ、結社・―止揚
に記載されたｐＢＲ３２２由来プラスミドである。。 ５′末端１１７片は以Ｆ Ｋ ’ａｔ２ｔｍ＜ ＃−る
工９にけ成ｄ片とクローンＰＦＬＡ由来断片との結オ物
であった。 合成断片の構造は仄のとおりでめる。 （ＭｅｔＪＣＡｌａ〕ＣＧｌｕ）Ｄｉｅ）（Ｔｈｒ）ｄ
ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＡＧＧ Ｔ
ＡＣＣＧＴ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＴ ’ｌ’ｃ Ｃ’
ｌ’ＡＧ ｄ１昨抗方向→ この配列は、「上流端」にＥｃｏ ＲＩ １ｊｌ１位及
びＡＴＧ開始コドンを含有し、こ扛にグロレンニンの最
初の４個のアミノ酸をコードしている配列が続き、釣ｔ
ｍ １■１部位で終わっている。 遺伝子の５′−末端を形成するためにこの汗成１＋：ｔ
ｉ片？結合するクローン化１０１片は、遺伝子の５′−
末端に由来する約４４０塩基対の盈曹−μ巴１（１１ソ
を片からなる。 適当７ｊ４４０ｂｐ断片は、プライマーとしでｄＧＡ工
゛ＣＣＧＴＣＧＡＡＴ′ｒＣＧＧ１即ら「プライマーグ
ローブ」を使用して未分画ｍＲＮＡから＊ｐｉ２！７シ
たＣＤＮＡから取イｒｊ した。このプライ１−全１史
用して形成し之ｃＤＮＡｉ上１ｊ己のμ日くザイズ分１
曲し、１，０００１盆基対以上の大きさの〜「片１ｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔ Ｉ 部位に押入してクローニングし
た。イＱら）したクローンケ、プローブとしてＴｔｈプ
ローブ及びプライマー／グローブの双方を使用して選択
した。双方とハイブリダイズするコロニーのみを選択し
ｆｃ。 １２８０１１４Ｊの形ｊイ転侯コロニーかう双方のプロ
ーブとハイブリダイゼーションを示すコロニー約Ｊ００
１固７）Ｚｌηられた。こ扛らの中にグロレンニン配列
の５′部分が存在するか否かｔ以下のよ’＞ Ｋ Ｌ。 て倹討した。 Ａひ１−！凹１．ＡひＩ−巾りＩｌｌ、馬１１−Ｂａｍ
Ｈ１及Ｕ Ｂｇｌ Ｉ−４理ＲＩを用いる一理の二重
消化の結果？解析した。既知のめツＩ及び穐」Ｔ部位ケ
利用し、ｐＢＲ３２２カ匹部泣のいすｔ′Ｌかの側の谷
々１２５塩茫対ンＯＤ １’Ｊ Ａ配列の仲人に１更用
した。これらの消化によって１９・ｒル「に適したＥ断
片が侍ら扛る。 同定されたクローンから調製したｍ１ｎｔ ｐｒｅｐｍ
の上１１己二虜消化９勿についてアクリルアミドゲル・
「托気泳！ＩＩＩＩｍ析全行なってｊヅ１望のクローン
、ＰＦＬＡを選択した。次にプラスミド−＋ｐＦｉ、Ａ
クローンがき単離し、１３ａｍＨＩ及び役竺１で二車消
化し、４４０ｂｐ断片金ゲルｌに気泳動によって回収し
／ヒ。 次に、Ｔ４リガーゼと共に合成断面及びＰＦＬＡクロー
ンＢａｍ ｆ（Ｉ −Ｘｍａ Ｉ断片を１史用する俤準
的連結反し？５鏝よ４凹１及び以遠１０で開裂して「完
全な」５′−木端を創成した３、侍し扛た連軸配列をア
クリルアミドゲル電気泳動で精製して適当な４５５項晶
対断片を選択した。 ３′−末端−１片はＰＦＬＡクローンの調製に使用した
と同様な方法でｗ、１製した。プライマーとしてオリゴ
−ｄＴｉ用いて未分画メツセンジャーＲＮＡかろイ４チ
た＞１０ｉ１１０ｂｐｋ宮むＣＤＮＡ１上６己と同様に
クローン化し、コロニー２ Ｔｔｈグローブで選択した
。約５０１固のコロニーが（？７られた。上記（！：
Ｉ＝Ｊ ａｎに２心１１インサ一トバロ位に吋接する旦
す１及び製！部位を利用して、聾Ｉｌｌ ｆ−ｆ Ｉ
／ ＢｇｌＩ＋ ｒ加Ｉ／抑Ｈ１，触１口／加ｌ及び艷
Ｉ ／ Ｗｃｏ ＲＩで二重消化したプラスミドｍ１ｎｉｐ
ｒｅｐｓに対して行ｌ工ったゲルα気泳１１１ｂの結果
を解析−づ−ることたよｐＩツ「望のクローンを選択し
た。Ｉツ「望のコロニー刀１らのプラスミドを単Ｆ＋［
し、仄いで凪１及び均す１で開裂し、電気泳動に工って
ｒ ３−３７５Ｊケノ［片の８００ｂｐ配列を単ｎ１ｌ
ｒｃ。このｒ３−３７５Ｊ伸びでいる。っ 佃々の発現プラスミドｆ、担持する形質転俣体を過当ｌ
工培地で増殖した。Ｊ行ｊｔ物を上ｒ＋’ｆと細胞に分
画し１ヒ。上ｉｎ （培地少及び卸１胞抽出４勿を拙々
のツバ伝子殖物の発現及び分必に関して便だし１と。ウ
シインターフェロンン占性はインターフェロン標ｊ表と
比較して細胞変性効果によって逆電した。、 −ｆ：の
他出 の腫物の培地中及び則ｔｒ嗣淀４中の或はラジオイムノ
アッセイによって決定した。表に（（」け定値はピーク
活１生である。細用内ｔ−ＰＡ及び分泌されたし−ＰＡ
分子は双方とも生物学的活性ｔもっていた。 ０、分泌クシインターフェロンの特性決定堵喪培地中に
分泌されたウシインターフェロン−αＩをドｉ己の如く
精製して特性決定した。 培養培地７ｔを水酸化ナトリウムでｐＨ８，０２にｉ”
ｊｒＪ ｄｌした。次にこのＭ ？ｆｋ ｋ、５０ ｍ
ｒＶ４ｔｒｉｓ、 Ｉ）Ｈ８，０で予じめ平向化した２
、 ５ Ｘ １８ Ｌ７Ａ Ｎｕｇｅｌ Ａ ＣＡカラ
ムに充填した。充填後、Ａ２Ｂ６がｅよ（・よＯになる
までカラムｆ ５０ ｍＭ ｔｒｌｓ＋ １％（ｗ／ｖ
） ＰＥＧ３０００゜ｐＨ８，０で洗浄した。次にカ
ラム（！：、１００ ｍＡ ｒｎｌ役ア／モニウム＞
２９６ （ｗ／ｖ）Ｐ ＥＧ ８０υｏ、ｐＨ５，０で
、仄いで２０？ｎム４γリソン、 ２．５９（、（ｗ／
ｖ）ＰＥＧ８０００ 、ｐＬ１２．０−Ｑ浴出し７ｊ
０インターフエロン活性の主要部はｐＨ５，０の浴出で
早−ビークとして出現した。ＩＶＪｕｇｅ１カラム（８
８ｍＬ 、 １５０Ｍユニット）からプールしたＨ科乞
、２５ ｍＭ（−９詐敵アンモニワム、 ｐＨ５，（ｌ
で予じめ半価化した２、５Ｘ ５． Ｏｃｍｓ ｉ−５
３カラムに充填した。インターフェロン活性は塩化ナト
リワム沼出甲に早−ビーこの材料の、１１１１度はＳＤ
Ｓ ＰＡＧｇ’Ｃ約８Ｑ−９０％とｄ′ｒ価された。 ５ａ−ｓａプールｌυｍｌｉ、２５ ｍ （ｙｌリン鍍
ナトリワム、ｐＨ６，０中で半画化した２、 ５ Ｘ
１８ 、市５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムにか
（／−Ｊた。カラムを上記の緩イ萌孜で溶出するとイン
ターフェロンγ占性が〔Ｆ−ピークとして浴出した。こ
の最ホさプール、はＳｉｉ；−５３プールに、げ仕−［
るタンパク（ＤＮ−木端配列解析に工２１に、、ｄｆ、
＃：が分泌したシシインクーフエロンは３棟の異なる部
位でグロセッシング分受けている。グロセツシングのこ
の３＋Ｉｔｆｆｌｖｏ１１位と各々の相対虚は次のと２
９である。 −８−６−３ −２ｙｓ −ａｒｇ −ｇｌｕ −ａｌａ −ｇｌｕ
−ａｌａ −１ｅｕ −ｇｌｕ −ｐｈａ６３％ ＋□
１３＋Ｘ２４夕Ｃ −ｍａ ｔ −ｃｙ＠−ｈｉｓ−（ｎｕ −ｐｒｏ −
ｈｉｓ ・＝上に示し７ｊ工うシこ、ウシインターフェ
ロンのＮ−末端の直＋＞ｉＪにｍθｔがあり、短いペプ
チドがついてい一〇もインターフェロンｉ古１生を失な
うことは７エい。 成熟異槙タンパクの産生及び分泌 分泌ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸配列が次冨ざｎた
両刀の楊叶（ヒ） ＩＦＮ−α１及びクシｘｒｐＮ−α
１）で、メンバクは開始メチオニンに加えて２〜７ ｆ
ｌａｔの余分なアミノば忙浮んでいた。これらのポリペ
プチドは生物学的に油性ではあるが、天然の起υ皐に出
来するタンパクと同じタンパクを謂殖層地中に圧生分泌
することが好よしいでりろう。 （天然のＩＦＮ−α１の」濁汁のように）Ｎ−木端アミ
ノばとしてシスティン全貧有〜づ−るインターフェロン
分子乞座生するために、因子「プレグ口」配列とＩＦＮ
−αｌ遺伝子との接片部を修正して、修正「プレグ口」
配列パ′顧去−７ｔｈ４天然のＮ−木端（ｊ−言イｊす
る成熟インターフェロン分子が放出されるようにする必
委があった。七の工う１２候合蛍１ｑるための手順の概
略を記１１図にボーづ一０ｉＶＩＦα１プロモーター及
び「プレグ口」配列並ひに１喰正ＩＦＮ−αｌ遺伝子を
貧イＪ−するＤＮＡ断片を単購しＭ１３ ｍｐ８ ｔＩ
υのｕｎｃｏ ｉｔ １１ｊ１１位にクローニングした
。一本領１）ＮＡ鋳型は過当な配向−０４７丈−ト勿は
イ１する組侠ファージかりＷ勺製しｉ仁。こりＷｅｔφ
をリンば化メリゴヌクレＡチドと共にアニールし７’Ｃ
０酋成オリゴヌクレオチドは２４塩基の夜さでｄりジ、
「プレグ口」配列のＣ−末ｐ席付肛のｌｅｕ −ａｓｐ
−１ｙｓ −ａｒｇ ｋコードしている１２塩基及び天
然ＩＦＮ−ｔｉ、の最初の４個のアミノｔｊｉ２ ＋
ｃｙｓ−ａｓｐ−１ｅｕ −ｐｒｏケコードしでいるｘ
２を盈りりに相４１０的で必る。このプライマー−−則
ノ”＋’ｉ中間体’；ｔｓ ５００ｍ１＼１ｄＡＴＰ、
１００１７１Ｍ ｄＴｉ”１７ 、１００＋ｉ＋Ｊ
ｄＧＴＰ、１００ｍｌ４ｄＣＴＰ 、 ２０ｍＭ ｄＡ
ＴＰ 、３ ｊ−ニットのＤ Ｎ Ａボリメジーゼ（Ｋ
ｌｅｎｏｗ ）及び４ ｏＵ−１−＝７トのＴ４ＤＮＡ
リガーゼの打圧ド、１０ ｒｒｔ＋Ｖｉ ’Ｉ’ｒｉｓ
、 ｐＨ７，４，５０ｎｔ＋ＶＩ ＮａＣ１及び１０
ｍ Ｍ ＋Ｖ１７ＳＯ４甲ｃ１２３℃Ｉ２１１．７間
の沖長及び運結反応に付した。仄に、史に３ユニットの
」〕１寸Ａポリメラーゼ（ｊ（ｋｎｏｗ ）及び４００
ｊ−二ソＩ−（１）Ｔ ４υ１”ＪＡリヵ−ゼ足力１
１え、ｍ汁物ｔ２３℃で２１＋、？１ｉＪＪ次いで１４
’Ｃで１５１１芋１）ｊＪインキュベートシ／こ。こ
の？昆片１１勿ｔ１史って貝、ヨ旦Ｊ Ｍ １０１ ｌ
Ｉｉ罎を形頁伝決した。ファージグラークｋ Ｐ ａ＝
ａＡリゴヌクレＡチドとのバイブリグイセ−ジョンによ
りスクリーニングした。２個のｌ＋１（ｐｏＩ］ＩｔＩ
ｖｅ）の組換ファージかり鋳型に型取られた１）ＮＡを
調製しＩ Ｆ ｉ（−α、ＤＮＡに相補ＩＩ′ジｌよプ
ライマーにＩ更）月してｄ己列火＞、１ｊＬ７ζ、１１
向の組換ノアージかｂ ＩＪｒ屋の欠失（第１１図にル
ープでボす２４ヌクレオチドの欠失用１１する二本鎖Ｄ
ＮＡを調製した。［プレグ口Ｊ ＹＢ己列と１上゛１リ
ーα。 ）以云″子との修正された接片を苫ひ肋１１ζｌ断片？
単醐し旦ｃｏ ＲＩで開裂したＹＥＰ９Ｔに連結した。 この（昆合ｊ勿で長、並且を形貝１駄且へした鏝、正４
１１鱈な自己向のインサート４４丁−［る）゛ラスミド
（ｐ７６）で＋８んで更に倹討した。 ｐ７６ １）ＮＡｋ上・四状から□ｒ、ｌ製し、こｆｔ
ｒ ノｌｊυ・て酵母の２０Ｂ−１２株（ＡＴＣＣ２
０６２６Ｊｉ形１４転換したｆｌ １個の形員伝侯体の
冶養吻１０を倉ｓａ ＞ｍし％ ｊ’Ｊ倭Ｐａ：ｔｔｌ
ｕｒ遠心して＋Ｎ１１Ｉ Ｊｌｆｆｌ カＩ−） Ｊ４
地ｆ分１）１１（７た。 Ｉ惇’ｉｔ ｊｉ地５ Ｕ Ｏｍｌ？ｚ ２５ ｎ＋Ｊ
’ｆ”ｒｉｓ＋ ｐＨｄ、 Ｕ 。 ｌＵ７ｎＭｌ；ＤＴＡ中に透析した。矢に透析し７ｃ堵
ｊｌｌ ｋ Ｎ天然／！￥吻（ＬｅＩＦＡ）に対づ−る
七ツクローン化した抗体に８有する児投アクイニテイ力
うム中にノ１） し／こ。 ２ ４ｍＭ ’ｆ’ｒｉｓ
、 ｐＨ８，０、１０ｍＭ ｍ ＤＴＡで洗浄１ρ、イ
ンターフェロンン占注τ０．２ Ｍ ｊＷ＝ばで浴出し
た。インターフェロンン占注の主要部は画分、−Ｍ２Ｓ
に見らＩした。このＨ分２００μｔ ＝ ｒｊｉ＋記の
如くＮ−末端アミノＩ！＋２配列Ｊ’ｌｌ ’ｆｉｒに
付した。見い出された主要な配列は天然インターフェロ
ンＤのものでめった。タンパクの最初の８個のＮ−末端
アミノ酵はａｙｓ −ａｓｐ−１ｅｕ −ｐｒｏ −ｇ
ｌｕ−ｔｂｒ ｈｉｓ −５ｅｒでめった。 回向の付加的＋ｊＳ！明 第２図 α−因子グローブと、ｐ５１（ａｌ及びｐ５２ （ｂ）
ｍ侠プラスミド由米Ｄ ｌｉ Ａ １１；Ｑ片との間の
・１１」同（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ）の位１ａ、２個のプ
ラスミドとイル々の１間１奴エンドヌクレアーゼでＹ白
化し、仄に１％アガロースゲル上でｔＩｔ気兆励した。 υＮ Ａ ｌｊ；Ｉｆ片をニトロセルロースベーパーに
移し Ｐ−標識グローブとハイブリダイズし７こ。パネ
ルＡ：具化エチジウム染色ゲル。パネルＢ ： ５６ｕ
ｔ１１ｅｒｎプロツト。レーンユニー腔ル１，２−、山
■Ｉ 、 ３−ＩＨｎｄ員、４−１１μｔｒｏ上１１．
５−＃艷空−艷Ｉ。矢印Ｖよツーグクローニングし／Ｃ
２１固のＤＮＡ断片和７Ｊて−１−ｏサイズ惰・す〜Ｊ
管ｊλ、ｒＲｐ’７ 又はｐ ＢＨ３２２Ｄ ｉ’Ｊ
Ａ 炉’） １＋ｆ５后ルた。 シＩｔ ３１ＺＩ フランキング・頭載のヌクレオチド配列。フェロモン前
、躯体の予見されるアミノ酸ＩＶ列も／Ｉり”ｒ ｌ）
ｆＪＬ４列の上１；の叔字は夫々アミノｌＶ及びヌク
レオチドのｆｉ”ｆ、 ７１’；（全示す。α−因子配
列の４ ｊ１？−１のコピーか枠−ひ囲った１頂域に民
含されている。星印は、α−囚十をコードしているｍｌ
域の１個以上のコピー間ひのヌクレオチド配列に力ｔけ
る違い？Ｉニアｉ：している１）３個の「り曲なＮ−グ
リコモル化４識部位は俸（太勝りで示す。この遺伝子は
１（ｕｒｊａｎ＋ ！！ｔ ａｌ、 ｔＩ婚の報乞し〕
ζものに対応しＣいる。 第４図 ±１α２遺伝子及びその非ａ１１１訳５′−及び３′−
フランキング領域のヌクレオチド配列。アンダーライン
を付したアミノ酸はＭＦα２遺伝子がコード第５図 ＩＦＮ−α、Ｊａ仏子とび一因子グロモーター及びα−
因子プレ配列との接会。第３図に示したように、１．８
ｋｂｐ旦鵠ＲＩ断片はブロモ−ター全白イ１しているの
で、５′から成熟α−因子ｔコードしている配列まで全
ＤＮＡ配列は、α−因子グレ目己列及びＩＦＮ−α１タ
ンパクがα−因子プロモーター（ｉ″使用て単一のＭｉ
Ｊ Ｉｄ体タンパクとして＠ｌ戎さｎるように、修正Ｉ
ＦＮ−αＩ遺伝子に接汗した０ 第７図 α−囚因子グレグロ」及び修正ＩＦＮ−αｌ迫仏子の接
合■１分のタンパク及びＬ１１’ＪＡ配列。、３Ｂ 、
７１４ＱのＪ（ｂａ Ｉ及び皿部ｌζ１部位が示さｔし
ている。 第８図 づ酌孝中のに山１１己及、び〕音」也ＩＦＮ−α、レベ
ル９１．ｉｌ。 、トハの時間間［イ４で堵−Ｊ（吻ｌＯｍｅｆ：釦１序
４・１Ｊから取り出し・遠心して細胞と培地で分離した
。刑１１胞抽出物瞥」上記のように、％裏しＩＣｏ梧地
及び抽出′南中のインターフェロンレベルオ決菫シフＣ
０ 、俄工可 ル配列を才、１１する１、 １２ ｋｂｐ旦鵠ｌ化Ｉ断
片全ｐ５８から単離しＹｋ２ｐ９’ｒのＪＰｃｏ ｉｔ
Ｉ部位に仲人した。 １ｉＳ１０図 組織プラスミノーゲン油性化因子の発現及び分ａ用グラ
スミドｐ６８の組立。 部１１図 ｉｎ ｖｌｔｒｏ欠失突然変）°４のスキーム。」１α
ｌ「グレグロ」配列と１６正ＩＦＮ−α１遺伝子の按汗
都Ｃ欠失されｆ（−２４ヌクレオチドは図中ループとし
て承り−。 ６１４１２図 、Ｊ Ｆ’α１及びＭＦα２遺伝子がコードしでいる補
足α−因子前駆体のアミノ酸配列の此式。最大の相同ｋ
４ｆ−ｆる配列勿整列するたりに秤々のギャップが生
じている。 参考文献 １、 Ｎｏｖｌａｋ、！！！ａ１．．Ｃｅ１１２１．２
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９３，７１７（１９８１Ｊ。 １５、Ｋｌｅｉｄ、ｅＬａｌ、＋５ｃｉｅｎｃｏ２１４
，１１２５（１９８１，）。 １６、 Ｌａｗｎ＋ ａｔ ａｌ、＋ Ｎｕｃｌｅｌｃ
Ａｃ１ｄｓ ｌＬａ５．旦、６１０３（１９８１）。 １７、Ｗｅｃｋ＋ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ ）ｔｅｑ、 ！、 ６１５３（１９８１，
）。 １８、５ｔｏｔｌｚｅｒ＋ ａｔ ｓｌ、、 Ｅｕｒ、
Ｊ、 ＢＩｏｃｌ＋ｅｍ、 ６５．２５７−２ｅｚ（
１９ｖ６）− １９、５ｔｏＬｌｚｅｒ、 ｅｔ ａｌ−＋ ｇｕｒ、
Ｊ、 １３１ｏｃｈｅｍ、免シ３９７−４００（１９
７６）。 ２０、 Ｊ３１ｒｎｂｏｉｍ＋ Ｊ（、Ｃ０＋ ａｔ
ａｌ、＋ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ７．１５１３（１９７９）。 ２１、Ｈｉｎｎｅｎ、 Ａ、、 ｅｔす＋ｌ Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｌ。 （ＵＳＡ、）７５．１９２９（１９７８，ｌ。 ２２、Ｂａｃｋｍａｎ＋ ａｔ ａｌ−＋ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ （ＵＳＡＪす、４
１７４−（１９７６）。 ２３、Ｍａｎｄｏｌ、 Ｑ ａｌ、、 Ｊ、 ｔｓｆｆ
ｑｌ、 Ｂｉｏｌ、 ５３．１５９（１９７す。 ２４、ｆ３ｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ２７５．１０４（１
９７８Ｊ。 ２５、 ｊνｌ１ｌｌｅｒ、Ｊ、ｔ（、＋ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌＡｒＧｅｎｏｔｌ
ｃｓ＋ ｐｐ、 ４３１． Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
１ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎ、 Ｙ。 ２６、Ｓｔｅｗａｒｔ、 Ｗ、 Ｅ、 ＩＩ ’ｆ’ｈ
ｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｎｔｏｍ（Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ＋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＋ １９７９ ）。 ２７、Ｐ、 Ｅｄｍａｎ、 Ｇ、 Ｂｅｇｇ−Ａ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｏｎｃｅｒ”Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 １．８０（１９６７）。 ２８、Ｔａｒｒ＋ Ｇ、 ｇ＋Ｉ ａｔ ａｌ、＋ Ａ
ｎａｌ、 Ｂｌｏｃｂｅｍ、 ８４＋６２２（１９７８
）。 ２９、Ｃ１ｅｒｎｅｌＬ ！ｔす、、 Ｂｌｏｃｈａｒ
ｎｉｓｔｒｙ ９．４４２８（１９７す。 ３０、 Ｈｏ１ｌａｎｄ＋ ｅｔａｌ−＋ Ｊ、ＩＪＩ
ｏｌ、ＣＩＩＱＩＩ＋、２５４． ９８：う９（１９７
’Ｑ。 ３１、 Ｈｏ１ｌａｎｄ、 ａｔす、、 Ｊ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃ１１ｅ＋ｎ、亜、 ２５９６（１９８０）、３
２、 ５ｔｒｕｈｌ＋ ａｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
ｉ’Ｊａｔ１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＪＳＡ ７
６゜１０３５（１９７９）。 ３３、 １３ｏ１ｉｖａｒ、Ｆ’、、ｅｔａｌ、＋Ｇｅ
ｎｅｇ、９５０１１３（１９’７７、）。 ３４、 ｊｔｉｒｒｃｈｃｏｍｂ＋ ＩＪ、 Ｔ、＋
ａｔ ａｌすＮａｔｕｒｅ虱３９（１９７９）。 ３５、 １（ｉｎｇｓｍａｎ、 ｅｔａｌ、＋ Ｊ、
Ｇｅｎｅ ７＋ １４１（１９７９）。 ３６、Ｔｓｃｂｕｍｐｅｒ＋ Ｇ、、 ｅｔａｌ−＋
Ｇｅｎｅ １０． （１９８す・３７、Ｈａｒｔｌｅｙ
、 Ｊ、 Ｌ、 ｅｔ ａｌ−＋ ｔｒ、 Ｅ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ ２８Ｇ、 ８６０（１９１３０）。 ３８、 Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ＋ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ１ｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ■
、３９６１（１９７５，）。 ３９、 Ｍｏｓａｉｎｇ＋ ｅｔ ａｌ、、Ｎｕｃｌａ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｌｔ ９． ３０９
（１９８１，）。 ４０、 Ｍａｘａｍ＋ Ａ、 ｆＶｌｌａｎｄ Ｇ１１
ｂｅｒｔ、 ｙＶ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ胸堕呻、
懸、 ４９０（１９８す。 ２３３１（１９８０）。 ４２、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ａｌｏｌ、Ｂｉｏｌ、
９１Ｌ５０３（１９７５）。 ４３、Ｂｒｏａｃｈ＋ｅｔａ１．、Ｇｅｎｅｌｏ、１５
７（１９７９，）。 ４４、 Ｋｕｒｊａｎ＋ｅｔａ１．、Ｃｅ１１３０．９
３３（１９８Ｊ。 ４５、Ｓｍ１ｔｈ、 ＋ｖｌ＋世捜仄塑ジ皿当長、４９
９（１９８０）。 ４６、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ＋ Ｊ、 Ｌ、＋ ｅｔａｌ
、＋ Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５Ｌ３０２６
（１９８２）。 ４７、 ８ａｎｇｅｒ＋ ｅｔ ａｌ−＋ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ７４．５
４６３（１９７７、ｌ。 ４Ｂ、Ａｈｉｎｓ＋ ｅｌ ａｌ、＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡた。３０１
４（１９７７）。 ５１、Ｇｕｂｌｅｒ、 ｅｔａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ
２９５．２０６（１９８２，）。 ５２、Ｎｏｄａ、ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ２９５．２
０２（１９８２）。 ５３、Ｋｏｋｉｄａｎｉ＋ ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９８．２４５（１９８２，）。 ５４、Ｂａｒｎｅｓ、ａｔａｌ、、ＭｅｒｋｅｌｅｙＷ
ｏｒｋｓｂｏｐｏｎ、ＩｔｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓ
Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ （１９８２）：Ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ １）Ｎ
ＡＩ ＥｓｐｏｓｉＬｏ＋ ａｔ旦、 Ｅｄｓ、、 ｐ
ｐ。 ２９５−３ Ｃ１５＋ Ｌａｗｒｅｎｃｅ １ｔｎｄｉ
ａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｃａ１ｌｆｏｒｎｉａ＋ ｆｌｅｒｋｅｌ
ｅｙ＋ ＣＡ。 ５５、Ｊｕｌｉｕｓ、、ｅｔａｌ、、ｃｅｉ１３２，８
３９（１９８２）。 ５６、Ｋｒｅｉｌ、 ｅｔ ａｌ、＋ Ｅｕｒ、 Ｊ、
Ｂｉｏｃｈａｍ、 １１１．４９（１９８す。 ５７、Ｍｏｆｆｍａｎ、ｅｔａｌ、、ＥＭＢＯＪ、２，
１１１（１９８３，）。 ５８、ｖ％’ｅｃｋ、 ａｔ ａｌ、＋ Ｎｕｃ、 Ａ
ｃ１ｄ ｌ１ｅａ、 ９．６１５３（１９８す。 ５９、ＨＩｔｚｅｍａｎｅｔａｌ、＋５ｃｉｅｎｃｅ２
１９，６２０（１９８３Ｊ。 ６０、Ｐｅｎｎ１ｃａ＋ｅｔａ１．＋Ｎａｔｕｒｅ３０
１，２１４（１９８３Ｊ。 ６１、ＭＪｓｉｇ、 Ｊ、 （１９８１）ｐｐ、 １４
３−１５３ ｉｎ Ｔｈ１ｒｄＣ１ｅｖｅｌａｎｄ Ｓ
ｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏ＋ｍ１ｏｃｕｌｅ
ｓ ：Ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ ＤＮＡＩ Ｅｄ、んＷ
ａｌむｏｎ、 ｇｌｓｅｖｉｅｒ＋Ａｍｓｔｅｒｄａｍ
。 ６２、 Ｍｅｓｓｉｇ、 Ｊ、＋ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ
２．４３ （１９７９）。 ４・ 区間の＋ｌＯ単なａ明 第１図は、α−因子の逍伝子全単＋：１−ｖ−るｆｃめ
にハイブリダイゼーションプローブ 計成詞すコヌクレオチドのプールの４Ｑｆ 造ｋ ７Ｊ
ｅ Ｔ ＩｓＪ、第２図は、第１図のグローブ全期用し
て青らｔしたＩ） Ｎ Ａ ＋ｉｊｉ片の１０、ス（激
動の結果を示し、第３図及び４１３４図は、α−因子遺
伝子のヌクレオチド１記列を示−す図、 と１シ５図は、ヒトインターフェロンＤ（１）遺伝子と
α−因子プロモーター及びシグナル配列の遺伝子との接
片のスキームを示す図、 ｉ゛ｌ’４５図は、ヒトインターフェロンＬ）（工ＦＮ
−αθ元現用の目Ｙ母元現グラスミドの構３１１のスキ
ーム図、第７図は、α−因子シグナル配列及び１６正Ｉ
Ｆ１ｑ−αｌ迫伝子の接合部のタンパク及びＤＮＡ配列
を）ｊぐ丁図、 第８図は、ｆＦ’Ｎ−α１ を発現−「る酵猷形賀転コ
キ（体の培養の培地及び雌側抽出物中のＩｆｉ’ｉ寸−
α。 レベルτ７Ｊ（丁図、 第９図は、α−因子グロモーター及Ｏ・／グナルボリベ
プナド迫伝子配列を期用する異性遺伝子の発現１４４酵
母／呈、」シャトルベクターの４１グイ！ス・■−ム図
、 第１０図は、組識プラスミノーゲ／油注化因子の９ｆ；
９１用酵母／旦、虱プラスミドの組立図、第１１図は
、ｇｌ１分的α−因子／グナル配列（！？七−づ−る“
発現産物としての成熟”）４４１ｉＩり／ノ＜り（図に
示したのはヒトインターフェロン）の産生、α−因子成
分のグロセツシング及び成熟クンノ（りの文ｊ；ｒ培地
への分泌を遂行するたりに１史用されたｔｉ１染ｔ７Ｊ
＜丁図、 第１２図は、第３図及び第４図のＩＶｌ、 Ｆα１及び
ＩＶｌ Ｆα２ポリペプチド間のコンセンツース（−」
・（）の桿１及をボ丁凶でるる・ 代理人 プ「埋土 今 ４・１ ノし 第１頁の続き （−ｉ）Ｉｎｔ、、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号
０ １２ Ｆ（１：８６り） −丁・李ン■ネｉｆｊ、■二１：薯（万代）％式％（３
８ ２、発明の名称 耐ＩΣｌ発現系Ｃの〕Ｉルノノ′因子
配列の１山川３、ン＋ｌｉ ｉｔをりる貨 ・＋１ ＋’ｌどの関係 １１１几′１出摺１人名 称
シ１ネンブツク・イン−１−ボレイワツ１−１、代
理 人 中ｊ＋！ ７Ｉｌｌ新ＩＩ：ｉ区新１？」月１
１１番＋１ｊ７； １１１１１１ヒル（′１）明細１１
：中、ｆｆ；７１ｄｉり’＋３ＭＩに「・・・・・・の
（、，１１１１１合・小し、」と（（りるイー、Ｉ・・
・・の結果を示すフバ１、］とン市１［づる。 （２）淵’Ｘ； （ｄ：用イＺ ’ｒ８ ｉｆ’ ％用
Ｉｔ（ニｆｉＹ明１ｃ ：”、四’ ７ｗ ＋１１１
Ｉｆイ＋＝Ｉｌ’１ｌｌｌｌｌ （第１、反−研 カル
ボＡシ未ｆｆ１Ｇ１ｙ −−Ｇｌｎ −−Ｐｒ。 ｂ己１．狽相゛的ぢ呑成・ 工、５・−ＧＴＡＣＡＴＴ
ＧＧＴＴＧＡＣＣ才１−＞’に’７Ｌ１−７）−” Ｖ
ｏ−ル″Ｉ１． ５”−ＧＴＡＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＣ
Ｃ−−Ｍｅむ −−Ｔｙｒ ＣＯＯＨ （１） （０）
さえもシグナルペプチドのこのような変化が見い出され
ている。 例えは、ヒト成長ホルモンのシグナルはヒトインシュリ
ンのシグナルとは実質的に異なっている。このことは、
各々のタンパクがその特定のタンパクの細胞膜を通過し
ての転置に特にうまく適合するようなシグナル配列をも
つように進化して来たことを示唆している。 本発明は、異種タンパクをコードしているＤＮＡを、酵
母α因子遺伝子のプロモーター及び／又はシグナルペプ
チドをコードしている部分のＤＮＡ配列に有効に（発現
するように）結合すると、実質的に成熟なタンパクが酵
母にょっ見に基づくものである（本明細書の開示から明
らかとなるように酵母は少な（とも２種のα因子遺伝子
を有する。「α因子遺伝子」という用語はそのような機
能性遺伝子全てを含むものとする）。即ち、基本的に本
発明は、所望のタンパクをコードしているＤＮＡを含有
する発現ベヒクルをもつ生細胞を含む酵母の培養培地か
ら有用な量の異種タンパクを得る手段及び方法に係る・
この場合、前記異型タンパクをコードしているＤＮＡは
、酵母α因子遺伝子のプロモーター及び／又はシグナル
部分を含むＤＮＡ配列異種ＤＮＡの発現により細胞培養
培地中に有用な分離状態（融合していない２）のタンパ
ク産物１、れることである。 酵母のα因子は、通常完全な分泌作用の際にα因子から
除去される「プレプロ」配列を含有する。従って、有効
操作上の面からは後に更に説明するように培地中への分
泌過程に於いてプレプロ配列がシグナル配列として機能
する。本発明で得られた結果から明らかなよ５に、異種
タンパクに融合したα因子の上記定義のシグナル配列を
含むペプチドは酵母生体によってうまくプロセッシング
され、成熟異種タンパクが周囲の培地に分泌されること
になる。従って、この「プレプロ」シグナルを使用する
ことによって得られる利点は、シグナル／異種タンパク
遺伝子配列がα因子プロモーターの制御下又は酵母内で
機能する他のプロモーターの制御下にあるか否か罠かか
わらず実現される。同様に１本発明によって得られた結
果が示すところによると、α因子プロモーターは典雅遺
伝子の発現に効果的であり、そのような発現はシグナル
配列を発現ベヒクルの中間に挿入しな（ても得られる。 従って、本発明は、酵母系で具種ペプチドを発現させる
ための４予プロモーターにしＺｇぴル ブロモ−クーの使用に関し、更に、酵母中での発現の結
果産生された異種タンパクの有効なブ本発明の背景を明
らかにし、特定の場合には本発明の実施に関する更に詳
細な説明を与えるべ（本明細書中に引用する刊行物やそ
の他の資料は引用によって本明細書に包含されるものと
する。便宜上これらに番号を付しまとめて本明細書末尾
の参考文献の欄に記載する。 又、本発明は、１９８２年１１月１日に出願された米国
特許出願第０６／４３８，２３６号及びその親出願並び
に１９８３年４月２５日に出願された米国特許出願第Ｑ
６７４８８，３３７号に関連するものであり、ここに引
用したことによりこれら出願の開示内容を本明細書に包
含するものとする。 発明の背景 天然の酵母生体を工、細胞表面成長のため及び細胞代謝
に必須な機能として、少数のある種の同脛（内因化）タ
ンパクを原形質膜まで及び時にはそれを通して輸送する
。娘細胞の前低の初期成長として細胞が出芽する際には
、代亦は勿論細胞壁及び原形質膜の生成に仲他の付加的
なタンパクが必要である。これらのタンパクのあるもの
は機能的にある意味で関与する筈であるし、従つ℃、分
泌経路が存在するとイ４じられている（１）。上記過程
に含まれるある種の同種りど３ ンパク（工小胞体に結合したりボゾーム１指訳によって
形成される。同種タンパクは通常酵母種によって産生さ
れ、その生存のために必要なタンパクである。これらは
生成された後ゴルジ装置へ移送され、小胞内へ包入され
、原形質膜へ移送され、そこで結合し、又はある程度そ
こをれる。同種タンパクの少数のものは完全に細胞壁を
通過して外へｉｌｌ几送されるらしい。例えばα−因子
及びキジ−ｍＸ （ｋｉｕｅｒ ｔｏｘｉｎ ）がある
（２．３）。 又、細胞の出芽領域は小＋１ｉｉに魅きつけられる部位
であり、出芽の内部表面に融合することにより、原形質
膜そして恐らく細胞壁の全体の生長に寄与する（４，５
．（ｉ）。いわゆる分泌過程でタンパクのグリコジル化
（ｇｌｙｃｏｓｙｌαｔｉｏｎ）が関係するか否かは未
だに論議のあるところである。更に、本発明でいうよう
な「分泌」タンパクは、シグナルプレペプチドと考えら
れ、脆表面への輸送及びそこでの導入過程に関連すると
思われる。しかしながら、全体としての分泌過程の正確
なメカニズノ、は充分には埋確されていない。 組換ＤＮＡ技術により、酵母生体中の分あ過程に関する
広く知られた質問に対する解答を与える有用な手段が得
られ、これを適用することで、前記の如き生体又は他の
生体にコピー量（大量）の異種ポリペプチド産物を内因
的に産生させ得（例えば、７〜１７参照）、酵母宿主を
適当に操作して異種タンパクを個別の成熟形態で分泌せ
しめ得ると考えられていた。これは実際に達成されてお
り、係属中の米国出願第４３８．２３６号及びその親出
願（止揚）゛の主題となっている。この出願には、最初
その天然のシグナルを伴なうプレタンパク又はそれらの
ハイブリッドとして発現された異種タンパクが酵母によ
ってプロセッシングを受けて成熟タンパクとして分泌さ
れ得るという知見が記載されている。 発明の概要 本発明は、酵母生体を、通常は酵母生体にとって異種で
ありしかもその生存に必要とされないタンパクを産生じ
、プロセッシング処理し且つ分泌するようにせしめ得る
という知見に基づ（ものである。即ち、このタンパクは
、生存し且つ再生する酵母細胞を支持する培地から、所
屋でないペプチドプレ配列又は他の発現用の人為構造を
実質的に伴なわン、Ｃい分離（個別）形態で得ることが
できる。この目的のために、所望の異種タンパクをコー
ドしているＤＮＡ配列を（このタンパクに対しては）非
天然の酵母α−因子シグナル配列をコードしているＤＮ
Ａ配列に結合する。α−因子シグナル（プレプロ）ペプ
チド及びプロモーターをコードしている前記の如きＤ
Ｎ Ａに有効に（発現ずろように）連結し且つ異種タン
パクをコードしている前記の如きＤＮＡを担持する発現
ベヒクルで適切な酵母細胞を形質転換する。異種タンパ
クをコードしている配列と共にα−因子シグナルペプチ
ドをブードしている配列を発現させると、発現産物はプ
ロセッシングを受けて成熟真菰タンパクが細胞培養の培
地中に輸送され、生体酵母細胞を破砕する必要なくこの
培地から成熟タンパクを回収し得ろ。従って、所望で１
．ｃいプレ配列又は他のある種の発現用人為構造（例え
ば、ＡＵＧ翻訳開始シグナルコドンの発現の結果である
４の場合には第１ＯＮ−末端アミノ酸に結合したメチメ
ニン）を除去する必要なく、使用に際し他の点では実質
的に成熟な形態でタンパクを回収する。即ち、生体又は
破砕（即ち、溶菌又は他の方法で破壊した）細胞を実質
的に含有しない形態の培地が得られ、これは所望の産物
を含有しているのでより容易に使用できる精製技術：Ｙ
〆Ｚさる にカフ硝製後のこのような産物は意図する用途に適合す
る。例えば、ヒト白血球インターフェロン産物はその用
途としてヒト抗ウィルス及び／又は抗腫瘍剤がある（一
般的文献として７〜１７参照）。 要約すると１本発明は、酵母のα因子シグナル配列及び
／又はプロモーターを使用して１通常は酵母生体に異種
であり且つその生存に必要としないタンパクを、酵母の
発現、プロセッシング及び分泌の産物として、ｌ１ｂｌ
的にペプチドプ１／配列又は他の発現用人為構造を伴な
わない分離形態で産生することを含む。更に、本発明は
、前記の如きタンパクを産生じ得る１１Ｙ母培養物及び
その培養の結果得られる産物として前記の如きタンパク
を含有するαＹ母培養培地を提供する。より特定的には
、本発明は、異種遺伝子を発現せしめるためにα因子プ
ロモーターを使用する酵母での異種タンパク産生方法及
びこの方法に使用する発現ベヒクル及び生体に関する。 更に、本発明は、発現した外来タンパクのプロセッシン
グ及び分泌のためのα因子用シグナル（プレプロ）配列
の使用、α因子Ｄ ＮＡ配列乞有効に担持する組換発現
ベヒクル、並びにこのようなベヒクルで形質転換された
細胞は係る。 本明細畏で使用する用語「異種タンパク」は、酵母生体
によって通常は産生されず又はその生存に必要でないタ
ンパクを意味する。この用語は、前記の如きタンパクを
コードしているＤＮＡな組換ＤＮＡ技術により発現ベヒ
クル中に機能的に挿入し、次いでこれを酵母生体宿主の
形質転換に使用することも意図している。ｐ ｌ！］
Ａの機能的挿入とは、異種タンパクをコードしているＤ
ＮＡなα−因子プロモーターの制御下にある及び／又は
α−因子シグナルをコードしているＤＮＡ配列に連結さ
れた発現ベクター中に挿入することを意味する。この結
果、ハイブリッドプレタンパク、即ち異種タンパクに融
合したα−因子シグナルペプチドを含有するタンパクが
イＵられる。このような異種タンパクの例としテハ、ホ
ルモン例工ばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン等、
リンホカイン類、酵素、インターフェロン例えはヒト繊
維芽細胞、ヒト免疫並びにヒト及びハイブリッド白血球
インターフェロン、ウシインターフェロン等、ウィルス
抗原又は免疫原例えば日持病抗原、インフルエンザ抗原
タンパク、肝炎コア及び表面抗原等、成長に付随する因
子例えはヒトインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１及び
Ｉ（）Ｆ−２）、表皮成長因子（ＥＣ）Ｆ） 及び神経
成長因子（Ｎ（）Ｆ）並びに他の種々のポリペプチド例
えはレンニン、ヒト血清アルブミン、ヒトインシュリン
、種々の糖タンパク等がある。 本例＃Ｉ店で使用する「分泌」は、原形質膜ビ通して且
つ少なくとも酵母生体の細胞壁内への又はそれを通過し
て、細胞培養を支持する培地中−１の産物の輸送を意味
する。因みに、ある場合には、「分泌」産物は何らかの
態様で細胞壁と結合しており、恐らくは異なる１Ｗ製手
順を必要とし、又は酵母宿主の構造及び機能のイω正が
必要となる。 「プロセッシング」とは、成熟タンパクからα−因子シ
グナルペプチドを細胞内で開裂して実質的にシグナル配
列部分を伴なわないで又は異質のペプチドを伴なわない
いわゆる分離（個別の）成熟形態で異拙タンパクを産生
ずることを意味している。「異質の」ペプチドにはメチ
オニンのような発現用の人為措造であるペプチドが包含
される。プロセッシングはｓ 成Ｎｆｌ タンパクと結
合したシグナルペプチドの正確な点とは、Ｓれた（しか
し意味のあるようなＭ要な違いとはならない）場所での
シグナルポリペプチドの開裂を許容する。 られた数のタンパクしか培養培地量へ分泌しない。培地
中に見い出されるタンパクの１つはα−フエ目モン即ち
α−因子である（２１゜α−因子Ｑ戸−Ｌｅルー Ｔｒｐ−Ｌｅ〒−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇ４ｎ−Ｐ
ｒｏ −Ｍ６ｔ（又はＭ ｅ ｔ ＰＩ Ｏ）一つ’ｙ
ｒ−ＣＯＯＨを有する１２〜１３個のアミノ酸残基から
成る４稚のオリゴペプチドの嫉であることはＤｕ １１
ｆ、Ｚ（’！ ”：Ｅによって最初に決定された（１
８．１９）。 第３図に、α−因子遺伝子σ月つＭＦ’、−１のプロセ
ッシング前の産物中の４棺のペプチドの位置を示す。枠
で囲ったセグメントだけが培地中に分泌され、歿りの配
列は分泌されない、残りの配列のうちのどれだけが、分
泌されるために少な（とも一部はプロセッシングを受け
る「真の」シグナル（プレ）配列であるのか、及びどれ
だけが従来の前駆体クンバク（例えはグロレンニン、プ
ロインシュリン）の意味テ「プロ」配列なのかは明らか
でない。 同様に、第４図に示す、町α２遺伝子の産物中で「枠で
囲った」部分だけが分泌され残りの配列の性質はＬＦｃ
ｔｌ中のものと同様に記載し得る。 本発明の実施研死中に、他のグループ（４４）は、本発
明とは鶴なる方法でα−因子遺伝子の１つＣＭＦｃｔｌ
）の単離及び配列決定に成功した。 後述するように、２種のび一因子造伝子が本発明者等に
より単離され、α−因子のプロモーター及びシグナルペ
プチドに対するＤ Ｎ Ａ配列が細菌の形質転換には、
Ｅ、ｃｏＬｉ Ｋ−１２株２９４ （ｅｐ仏ｔｈｉ −
ｂｓｒ −ｈｓｍ ’ ） （ＡＴＣＣ３１４４６）
（２２）を使用した。ｒ母宿主としては、１９８２年３
月５日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ１６２０６２６で制限
なしに寄託されている酵母白株２０Ｂ−１２（α、且昌
と■工）を使用した。 Ｂ、増殖培地 通常の酵母増殖培地はバクト酵母抽出物（Ｄａｃｔｏ−
ｙｅａｓｔ ｅ×ｔｒａｃｔ） １ ％、バクトベプト
ン（Ｅ、ａｃｔｏ −ｐｅｐｔｏｎｅ ） ２ ’Ｉｓ
及びデキスト１コース２幅を含んでいた。ｅ母最小培地
（・二アミノ酸不含バクト酵母窒素４．−ＩＨｏ、 ６
７循、デキストロース２俤及びｇａｒ３％を含んでぃ７
こ。 酵母の形質転換用にはＩ Ｍソルビトール１補充した最
小培地を使用した。市Ｉ ｒｒｖの増殖培地は］・Ｂ（
２５）であり、これ（工形質転換に匣用するどきはアン
ピシリン／ ２ ｃ） ａｇ／ ｔａｒ、を心ｉ充した
。 コロニースクリーニングに使用したＳ−寒天プレートは
、ｌｅ当り、トリプトン３２！、ｔｅａＣ１５，９、Ｄ
ｉｆｃｏ 寒天１５ 、？及びｈｂＯＨＯ，２１を含有
し、表示したようにアンピシリン又はクロラムフェニコ
ールを添加した。 Ｃ０形質転換 旦、競ム２９４は刊行物（２３）に記載の手順を用いて
形質転換した。酵母は本質的に文献（２１，２４）の記
載のようにして形質転換した。 Ｄ、酵素及びＤＮＡ調製物 制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ及
び１１ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ から購入し製造元の推奨に従って使用
した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ から入手し、２０ｒｒ）Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ （ｐ Ｈ７，５）、 １０１ＴＩ１０１Ｔ
Ｉ、、１０＋ｙＨＭジチオトレイトール、１ｒ４ＭＡＴ
Ｐ中１４℃で使用した。仔ウシアルカリ性ホスファター
ゼはＢｎｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ から購
入し、ｌ ＯＯ曽Ｍ ＮａＣＬ、５０ＴＴＴＭ Ｔｒｉ
ｓ −ＨＣｌ （１）Ｈ７，４）、１０ｙｐＭ ＭｇＳ
Ｏ４、ｌ、Ｍ２−メルカプト−エタノール中３７℃で使
用したＯ プラスミドＤＮＡは透明溶菌液法（ｃｌｅａｒｅｄｌｙ
ｓａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ） ’（２９）で調製し、Ｂ
ｉｏ −Ｒａｄ アガロースＡ−５０カラムクロマトグ
ラフィーで精製した。少量のプラスミドＤＮＡは個々の
旦、刈旦形質転換体から急速スクリーニング法（ａｕｉ
ｃｋ −ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ）
（２０）によって調製した。ＤＮＡ制限断片は ・１憾
アガロースゲルから電気溶出し次いでフェノ−゛ル／ク
ロロホルム抽出及びエタノール沈殿１−て単離した。オ
リゴ−デオキシヌクレオチドプローブはホスホトリエス
テル法（４１）で調製した。 ■＋】、ハイブリダイゼーションプローブのデザインα
−因子遺伝子用１５量体（１５−ｍａｒ ）オリゴヌク
レオチドプローブをフェロモンのアミノ醒配列（１９）
及び酵母のコドン使用頻度（ｙｅＦ＞ｓｔ Ｃ０ｄＯ１
］ ｕｓａｇｅ ｆｒａａｕｅｎｃｌｅｓ ）に基づい
てデザインした。その原理を第１図に概略的に示す。第
１図にはα−因子の最後の５個Ｃ）アミノ酸と可能な全
てのコドン及びそれらの使用頻度を示す（コドン使用頻
度は２種の異なるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼクローン（３０１３１）及びアルコールデ
ヒドロゲナーゼエの総計である）。これら及びその他の
遺伝子のコドン使用頻度は最近概略が刊行されている（
４６）。第１図から明らかなように、５個のアミノ酸を
コードしているほとんど全ての可能な配列はオリゴヌク
レオチド配列５’−ＧＧ、、ＣＡＡＣＣ：ＡＴＧＴＡＣ
に包含される。 従って、各々２種のオリゴヌクレオチドから成り上記配
列に相補的な２種のプールを合成した。 フェロモン中の他の連続する５個のアミノ酸はいずれも
このような限られたオリゴヌクレオチドのセットではカ
バーされ得ない。 Ｆ１組換プラスミドのスクリーニング ５ａｕ３Ａで部分消化した酵母ＤＮＡなＹＲ，７（３２
）のＢａｍ ＨＩ 部位に挿入して作製したゲノムライ
ブラリーを、α−因子遺伝子クローンの存在に対してス
クリーニングした。盈、姐星形質転換体を、アンピシリ
ン５ｏｌ／ｍｌを含有−１−るＳ−寒天プレート上に載
置したニトロセルロース１紙上で増殖させた。３７℃、
６時間後、クロラムフェニコール１５ｏ ９ ／ｍｌ
Ｙ 含Ｔｉスル”−寒天プレートにフィルターを移した
。１５時間の増幅後、修正」翼店襄 コロニースクリー
ニング法（３Ｂ）を用いてコロニーのノ）イブリダイゼ
ーションをテストした。ハイブリダイゼーションブロー
プとして上記３２ｐ−標識合成オリゴヌクレオチド（４
０）を使用した。１０ｒｎＭＴｒ１．ｓ （ｐ Ｈ７，
５）、６ｙｎＭ ＥＤＴＡ 、 ０．１ ｍＭＡ Ｔ
Ｐ、１１ＴＩＭピロリン酸ナトリウム、０．８ＭＮａ１
ｌ、Ｉ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液、ｏ、５ｌＮ
Ｐ−４０及びｏ、１ｍ９／威 見、鵠旦 ｔＲＮＡ中４
２゛Ｃで一晩フイルターをハイブリダイズした。フィル
ターを３０°、６Ｘ８８Ｃ中で２０分３回洗浄した。乾
燥したフィルターを一８０°でＤｕｐｏｎｔＬｉｇｈｔ
ｎｉｎｇ −Ｐｌｕｓ増感スクリー７Ｙ用（ＳてＫｏｄ
ａｋＸＲ−２Ｘ−ｆｌ’ａフィルムに露出した。 Ｇ、α−因子遺伝子を含有する組換プラスミドのｙす１ 組換プラスミドを含有するコロニー約４５００個を、３
２ｐ−末端標識オリゴヌクレオチドブールエ（第１図）
を用いる１ｎｓｉｔｔ４ ハイブリダイゼーション（３
８） でテストｔ７た。２４個のプラスミドが様々な程
度でハイブリダイズした。 これら２４個のコロニーから少量のプラスミドＤ Ｎ
ＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ の方法（２
ｏ）で′ＰＡ製し、ＤＮＡサンプルなニド四セルロース
フィルター上にスポットした後同じプローブとのハイブ
リダイゼーションに関ｔ７てテストした。 プラスミド２４個のうちの２個が強（ハイプリダイスし
、これらを夫々ｐ５１及びｐ５２と命名して以後の実験
用に選択した。プラスミドｐ５１及びｐｓ２％ｚオリゴ
ヌクレオチドブール■ともハイブリダイズした。 ■（、ハイブリダイズする配列のザブクローニング合成
プローブとハイブリダイズしたインサートの＊ａ決定を
するために、クローンｐ５１及びｐ５２から調製したプ
ラスミドＤ ＮＡ’ａ？旦四ＲＩ、凪■、旦匹１１１、
川■ＨＩ及びシ些■ によって制限酵素解析した。第２
図人に示したように、２種の組換プラスミド（工全（異
なるものであった。２種のプラスミドのＥ ＣＯＰＩ及
びＰｓｔｌ消化の場合だけ各々１個の共通な断片が得ら
れた。双方の場合で共通の１１１片はＴＩ’（Σ１ イ
ンサートであり、１．３８ Ｐｓｔ Ｉ断片はＶワ１及
び三 遺伝子中のＰｓｔ、 Ｉ部位間のＤＮＡである。 プローブに相補的な配列を含有する断片な５Ｏｕｔｈｅ
ｒｎ法（４２）で同定した。ｆｉ２［ｍＢかられかるよ
うに、１例な除いて、５種の制限酵素での消化の金側で
プローブに特異的にハイブリダイズする断片が得られた
。ｐ ５２ Ｄ ２ＪＡをＨｌｎｄｍで制限して生成す
る断片１ざいずれもハイブリダイゼーションハ′観察さ
れなかった。 合成プローブに相補的な配列を含む最小の制限断片は、
ｐ５２では１．７ ｋｂｐ以徂Ｒ４断片であり、ｐ５１
では１．８ ｋｂｐ叫■断片であった。これら２ｆｔｌ
ｌのＤＮＡ断片な分取用（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ）
アガロースゲルから電気溶出して単離し、適当に開裂
したプラスミドｐＢＲ３２２（３３）ＤＮＡに個別に結
合した。結合混合物を用いて旦ヨ２９４を形質転換し、
この形質転換体からのプラスミドＤＮＡを急速スクリー
ン法（ｑｕｉｃｋ −５ｃｒｅｅｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒ
’ｅ。 ２０）で分析した。夫々１．７ ｋｂｐ Ｅｃｏ Ｂ
Ｉ及び１．８ ｋｂｐ Ｈｌｎｃｌ ｍ断片インサート
を含有する２個の形質転換体をｐ５３及びｐ５６と命名
し、以下のようにして分析した。即ち、プラスミド２４
個ビｐｓ３及びｐ５ｅから調製し、匹旦Ｈ１，Ｃ１ａＩ
、ＰｖｕＩ、ＰｓｔＩ及びＳａｌ Ｉで個別に消化した
。得られたＤＮＡ断片をｌ係アガ【ノースゲルで分離り
、二ｌ−ロセルロースフィルターペーパー（４２）に移
し、３２Ｐ−標識プローブとのハイブリダイゼーション
に関してテストした。制限消化物及び対応するｐ５３Ｄ
ＮＡ（この組換プラスミドはＥｃｏ ＲＩ断片としての
１．７ｋｂｐ酵母ＤＮＡビ含有している）のハイブリダ
イゼーションパターンの解析によって、このクローン中
の酵母ＤＮＡが１個の肋↓■部位及び２個のＰｓｔＩ部
位を含有していること、並びにプローブに相補的な配列
が０．５ ｋｂｐｙＰＰｓ ｔｌ −Ｓａｌ Ｉ断片中
に包含されていることが示された。クローンｐ６６中の
酵母Ｄ Ｎ ＡのＨｌｎｄ ＩＩＩ断片はこれらの酵素
にあする制限部位を欠いて：ｌ（量り、ｐＢＲ３２２ベ
クター中のこれらの酵素に対する唯一の制限部位で開裂
して得られた直結化プラスミドはプローブとハイブリダ
イズした。 次にこのプラスミドを多（の他の制限エンドヌフレアー
ゼで消化し、消化物を上記５ｏｕｔｈｅｒｎ法で解析し
た。このプラスミド中のハイブリダイズする配列は１．
３ ｋｂｐ Ｈｌｎｒｌｍ −Ｓａｃ Ｉ断片上に含ま
れていることが判明した。 α−因子によるｒａＪ細胞の成長阻害特性を利用してク
ローン化した１、７ ｋｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ及び１、８
１ｃｂｐ Ｈｉｎｄ ｍ断片に含まれるフェロモン遺伝
子が機能性であるかどうかテストした。活性のあるα−
因子フェロモン遺伝子がプラスミド中に存在していれは
、マルチコピーのプラスミドを含有する細胞では染色体
コピー（又は多コピー）の遺伝子しか含有しない細胞よ
りも有意に多量のフェロモンが合成されると期待される
であろう。すると、感応性の「ａＪ細胞の菌叢中に非増
殖領域が増大して（ることで高レベルのα−因子が検出
し得るであろう。≧旦Ｒ１で消化したｐ ５３ ＤＮＡ
から単離した１、７ ｋｂｐ断片とＨｌｎｄｍで消化し
たｐ５６ＤＮＡから単離した１、８ ｋ、ｂｐ断片とを
、酵母選択可能マーカーｇＲｐ１ 及び２ｚｚｍｉ％母
プラスミド（４３）由Ｊ汐 来酵母復製オリジンを含むｐＢＲをベースとするベクタ
ープラスミドに個別に結合した。酵母菌株２０Ｂ−１２
を、これらの１ラスミド及びα−因子をコードしている
ＤＮＡ配列を欠くコントロールプラスミドで個別に形質
転換した。次に形質転換体のフェロモン産生を比較した
。プラスミド上にＭＦ、１又はＭＦα２ をコードする
配列な含有する形質転換体は、コントロールプラスミド
で形質転換された同じ菌株よりも有意に多量のα−因子
を産生じた。このことから、１．７ ｋｂｐ加菖Ｒ１（
ＭＦ、工１）及び１．８ｋｂｐ邑匹Ｉｒ［（ＭＦｃｔ２
）断片が活性α−因子フェロモン遺伝子を含有すると結
論した。１ｔ４ Ｆｃｌ ｌで得られた結果はＫｕｒｊ
ａｎ ａｎｄ Ｈｅｒ：ｋｏｖｉｔＱ （４４）が記載
した結果と一致している。何故ならばこの遺伝子は彼ら
の記載した遺伝子に対応しているからである。 １、Ｄ ）Ｊ Ａ配列決定 ＤＮＡ配列決定は既に文献（４５）に記載されているよ
うにして行なった。要約すると、チェインターミネーシ
ョン法（４７）によか吟Ｄ Ｎ Ａ配列決定の際には、
α−”ＰｄＣＴＰ（４００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ、 Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）の存在下で、一本領［鋳型Ｊ ＤＮＡの
起源として相撲ファージＭ １３ ｍｐ ８及びｍｐ９
（３９）’ｆ且つＥ、 Ｃｏ１１ Ｄ Ｎ Ａ ポリメ
ラーゼ■のブライミングには合成オリゴヌクレオチド（
大断片、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）
を使用した。反応混合物を５係ポリアクリルアミド／８
Ｍ尿素「薄層」ゲル（４７）上で電気泳動した。ゲルを
３１（λ（紙（Ｗｈａｔｒｎａｎ ）上に乾燥し２〜１
２時間Ｘ−綜フィルムに露出した。 第３図に１．フｋｂｐ Ｅ＋匹−Ｒ１断片、第４図に１
．３ｋｂｐ−山、ｎｃｊｍ−伽！■断片の大部分のヌク
レオチド配列を夫々示す。ｐ５３配列＆Ｘ１６５個のア
ミノ酸残基がら成るタンパクンコードしテイルオーブン
屏読枠を含有しており、このタンパクはそのＣ−末端側
の半分の内に４個の内部ｔ Ｉｔ遥七単位をもっている
。各単位はＬｙｓ −Ａｒｇ で始まりα−因子配列で
終る。各単位内子から分離されている。タンパクのＮ−
末端側の半分は２２個のアミノ酸からハ！る疎水性に富
む配列で始まっているが、この配列は恐ら（分泌用のシ
グナル配列を表すのであろう。この疎水性配列と最初の
繰り返し単位の間の６１個のアミノ酸残基は、３個の可
能なＮ−グリコジル化部位（第３図中横棒で示す）を含
有している。 ｐ５３クローンが含有するフェロモン遺伝子のこの遺伝
子は４箇所で、胚１α１ とは異なっている。肛α１
は−８，−７及び１２５０位匠に位置の代わりに）Ｔ残
基な、６０４の位置に（Ｃの代わりに）Ａ残基を含有し
ている。１２５の位置での違いのため、４２番目のアミ
ノ酸のところでＴ ＣＡ （Ｓｅｒ ）ではなくＴＴＡ
（Ｌｅｕ）コドンがある。ｐ５３が含有する遺伝子４旦
１゜１と命名した。 別のα−因子遺伝子、ＭＦα２ はｐ５６クローン中に
存在する。この遺伝子の組織構造はｙ！α１ に類似し
ている（第４図）が同一ではない。この遺伝子がコード
しているα−因子は、明らかに、フェロモンの２個のコ
ピーを含有する１２０個のアミノ酸残基から成る前駆体
タンパクとして作成される。この推定される前駆体に含
有されるα−フェロモントリデカペプチドの１方は、ｙ
ヱα１ 遺伝子がコードしているフェロモンコピーと同
一であるが、他の１方はＧｕｎな有している。 これらの前駆体の組織構成は、ある種の哺乳類の神経性
内分泌ペプチドの前駆体と驚く程類似している。即ち、
プロピオメラノコルチン（ｐｒｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃ
ｏｒｔｉｎ ） （４８、４９） 、ゲロニンケファリ
ン（ｐｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｐ） （５０−５２）及
びプロジノルフイ％ ｐｒｏｄｙｎｏｒｐｈｉｎ）（５
３）と同様に酵母前駆体は分泌に関与する多重ペプチド
単位を含んでいる。これらの前駆棒金′Ｃに於いて、分
泌される単位（ユニット）を工前駆体のＣ−末端側の半
分にある。Ｎ−末端側の半分は可能なグリコジル化部位
Ｚもっている。哺乳類の多機能性（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃ
ｔ、１ｏｎａｌ ）前駆体の場合と同様に、α−因子前
駆体の正確なプロセッシングにはグリコジル化が含まれ
るであろう。然しなから、酵母前駆体の実際のプロセッ
シングステップは哺乳類前駆体タンパクの場合とは違う
であろうと考えられる。哺乳類の前駆体では放出部位を
提供する塩基性残基対（Ｌｙｓ −Ａｒｇ ） ＋Ｓ分
泌されるペプチドの直ぐ倶ｊに配置されているのに対し
て、α−因子前駆体で（・１これらの部位で開裂が起こ
るとＮ−末端にイ＜ツかの付加的アミノ酸が付いたフェ
ロモン単位が放出されるであろう（第３図及び第４図参
照）。これらのＮ−末端延長部はＭヱｃｔ１及びｙヱα
２ 遺伝子の双方がコードしている前駆体中にある繰り
返し−Ｘ−Ａｌａ−配列から成る。 最近の研究（５４，５５）によると、α−因子前駆体の
１０セツシングの最終段階はジペプチジルアミノペプチ
ダーゼによるこれらの配列の除去であることが示唆され
ている。ミツバチ毒メリチン（５６）及びカエル皮膚セ
ルレイン（５７）の前駆体は明らかに類似のメ芳ニズム
で１０セツシングされる。 ８１発現用プラスミドの４１９及びヒトインターフェロ
ンの分泌 上述したように本発明のＤＮＡ配列データはα−因子が
１６５個及υ・１２０個のアミノ酸かも成る前駆体クン
バクとして合成されることを示唆しているが、このよう
なタンノくりにつ（・ては過去に報告はｆｚい。α−因
子のプロセッシング及び分泌メカニズムは知られていな
い。しかしながら、変容（ａｌｔＰｒｅｄ ）α−因子
を用（・た最近の研究の示唆するところによると、成熟
α−因子の産生り最終ステップは明らかにｇｌｕ −ａ
ｌａ又はａｓｐ −ａ、ｌａの除去であり、この後に、
基本配列がＨ，Ｎ −（Ｔｒｐ） −）（ｉｓ −Ｔｒ
ｐ −Ｌｅｕ −Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−（）ｌｙ−
Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ （又はＭｅｔＳＯ） −Ｔｙ
ｒ −ＣＯＯＨである１２〜１３個のアミノ酸から成る
α−因子オリゴペプナドカー放出される。 異種遺伝子産物の発現及び分泌に於けるα−因子プロモ
ーター及びα−因子プレ配列の有用性を示すためのプラ
スミドの調製法の概略ン第５図に示す。異種遺伝子産物
の発現及び分泌用のα−因子プレ配列をコードしている
ＤＮＡ配列の概略を第５図に示す。α−因子ペグチドを
コードしているＤＮＡ配列なα−因子クローンの１つ（
ｐ５３）から除去した。得られたプラス−ター配列を含
んでいた。次にこの配列をヒトインターフェロンＤ（Ｉ
ＦＮ−α□）遺伝子に結合してプラスミドｐ５８を形成
した。ヒトインターフェロンＤ遺伝子（５８）は、Ｌｅ
ｕ −Ｇｌｕ −Ｐｈｅ に対応するＤＮＡ配列が開始
メチオニンコドンの前に付けられるように修正した。修
正インターフェロンＤ遺伝チンα−因子の「プレプロ」
及びプロモーター配列と結合した後に、これらの配列を
単離し、酵母−Ｌ仝す」１シヤトルプラスミドＹＥｐ
９ Ｔ （第６図）中に挿入した。 プラスミドＹＥｐ９Ｔは、プラスミドＹＥｐｌＰＴ（５
９）中の旦弦ＲＩ−出痣夏断片をｐＢＲ３２２由来しＲ
Ｉ−工Ｉ断片で置き換えることによって予じめ作製した
。このプラスミドはＥ、 ｃａｌｉ中での選択及び複製
に必要なＰＢＲ３２２（３３）ＤＮＡを含んでいる。加
えて、このプラスミドいる。これらの酵母由来の２種の
ＤＮＡ断片により、酵母内での選択が可能になり、自己
複製及びプラスミドとしての維持が可能になる。 ２ｎオリジンが転写停止／ポリアデニル化シグナル（３
７）ｙ含有しているので１図示したインサートの配向を
有するプラスミド、ｐ６０を選択した。ｐ６０中に存在
するα因子［プレプロ」配列と修正ＬｅＩＦＮ−Ｄ遺伝
子の接合部のＤＮＡ配列を第７図に示す。ｐ６Ｑプラス
ミドを酵母菌株２０Ｂ−１２に導入し、 ｔｒｐ＋形質
転換体を増殖してインターフェロン産生について検定し
た。 （以下余白） １（・ 堺消」ｔ５地及び削１１）泡抽出１勿のインタ
ーフェロンアッセイ 形質伝せさ体の１固々のコロニーケＹＮＢ十ＣＡＡ２０
ｍ１．中３０℃でＡａａｏが約ｌＯになる壕でＪ？Ｊ
５１１１しグζ。アッセイ用に試料ｌＯ戯ｏｒｖａｌ
Ｓ Ｍ ２４０−ター中７ Ｋ ｒｐｍで１０分間趙６
分Ｉ誦した。独々の希釈度で上ｎ＾（培地）を検定（ア
ッセイラした。 刑ＩＩ ｊｌｔ！！金等滲のガラスピーズをゴむ７Ｍグ
ア＝ジン−１４ＣＬ ０．５ ｍｌ ＶＣ４壇１ｆｆｉ
瀾し高速−′ｃ２分間ボルテンク（ｖｏｒＬａｘ ）
処理した。次に、ｒｉｌｌノ活Ｉｕ ｒＪ？＋ １５ｆ
ｆ及び培地のｕｌｉｉ ：ａをバイオアッセイのために
ＰＢＳ／ＢＳＡ（１５０ｍＭＮａｃＬ、 ２０ ｍ＋〜
１リン１穎ナトリクム（ｐｌ（＝ ７．９ ）及び０．
５％ウシ１０１ ？ｌ″」アルプミンノ中に布ダくした
。細施変注効果（ＣＰＥ）ＩＡｉ古アッセイ（至）によ
って、＋４母抽出、物中のイノクーフェロンｔインター
フェロン標準（スタンダードリと比＋１少しで検出した
。壇燗）台地１ｔＫＮきｌ ＋Ａにユニットなでのイン
ターフェロンが検出された。ｔｆｉｌｌ ｂ’ｃｌ １
１１１出ツ勿からも同様Ｑ′こｊ’ｄ夾物ｉｔ当り１０
０ＸＩＵ’ユニツトの割合でインターフェロンが（１’
） ７Ｌ ｆｃ。 Ｌ ｊ；’ｊ地インターフェロンのＩ、ｌＶ ’ｉンゼ
ｊ厚母萌イ未ｐ ６０／２０ Ｂ−１２の単一のコロニ
ｆ ＹＮＢ＋ＣＡＡ ５ Ｌｌ ｏ ｍｌ、中３０℃−
Ｉ：Ａ６６Ｇが２．４ニｙｊ ル”Ｊ テＪｉ！殖した
。Ｃ（１） ＪＪ！ｔ ｄ Ｑ勿５００ ｍｌ ｆ Ｙ
ＮＢ十ＣＡＡで５Ｌにｊｎ釈してＡ６ｅｏ’ｋＯ８２１
とし、１ηられた５Ｌ培つＩ（物を３０℃でＡ６６０＝
７０ ＵでＪ’ｊｒ １ａｉｎした。この時点で５Ｌ
培ｌ物を７．００ Ｏｒｐｍでｌυ分間逓心分子＋ｆｉ
ｔ、て収偵した。発、・１１月”Ｊ Ｊｌ）ｊ的Ｑこ
１ηｍｅの試ネ１勿取り出し光学冴度、−ｆンターフエ
ロ／産生及び分Ｅ ｋ ｌｌｌ１１足し／こ。アッセイ
に先見ら、’（’ｒ試１Ｆをベンチ−トップ伶却煮沈含
（ｂｅｎｃｈ −ｔｏｐｒａｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ ｃ
ｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ）中５分間遠心して細ｊ４Ｍｋ培
地η）も分離し１こ。培地及び細彪全上記の如く俊足し
た（第８図６ｉｔて〕。２４ＡＵＸ）異ｌよる元酵を行
ｌ工つｌこ。培地中のインターフェロン・ビーク活１主
は夫々１を尚ジ３ Ｘ １０’及び２ＸｌＯ’ユニツト
でら” ｆＣ０Ｊｉｌｌ力己抽出“１勿・１１のインタ
ーフェロンン占注はノ？ｌ地１を当りＩ Ｘ ｌ Ｏ１
′及び２ Ｘ １０’ユニツトであった０ 保結、啼地１を及びＶｔ金で６ツｉ、・Ｃ１シ、χ′Ｊ
〜１−５限外１戸ノＦ’Ｊ Ｅ４ ｋ ｉ走用して２．
５ ｔ ｈｍ１ｃｏｎＪＪｚ４）Ｊ三ｌ７７（５ｔｉｒ
ｒｅｄｃａｌｌ ） （Ａｍ１ｃｏｎ ２０００ ）内
−ひ２５ ＋ＭＩ Ｔｒｉｓ ＋１０ ｍＭ ＥＤＴＡ
、ｐＨ８，０に対して透析して最長ｄ・１１．１１６
ｍＢとした。残留）でり（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ）の−
翻試イ１は直接配列ｊ・ノγ析し曲の一部はアセトン沈
１；゛コχし′Ｃかｌ：）配列解析した３、 ハ縮培地１ ｍｅをアセトン４−で沈設し、マイクロ遠
沈ｉｆ （ｍｌｃｒｏｆｕｇｅ ）中で回転沈降し、ア
セトンで洗浄し／こ。ペレット全ｏ、ｉ％’ｒ Ｆ Ａ
にゼ）ｉｉｉｉｉンｚＪＬＳｙｎｃｂｒｏｐａｋ ＩＬ
Ｐ −Ｐカラムの１１１）ＬＣで史に棺製し７’ｊ （
） ：’Ｊ ７ ムｋ Ｏ−１９に ’１’ Ｆ Ａ
”Ｐ ノ０−１０ Ｕ Ｘ７ セトニトリルのＩｆｆ
ＭＪ勾ｒ記で６０分間かげてｒＷ出しｆｃ。 イＳ製したＩＦＮ−αＡＤのサンプル１２μすτコント
ロールとしてクロマトグラフィーにかけンも。２８０＋
ｌＩ！ＩＭ己クリ 配列）’ｎ析はＥｄｍａｎ分屏Ｑηに茫ついて行ｉよっ
た。 液体試：ｊ’） ？ｒ修正Ｂｅｃｋｍｎｎ ８９０Ｂ
ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃａｐｓｅｑｕｅｎｃｃｒ のキャ
ップ（ｃａｐ ）中に尋人した。 Ｐｏ１ｙｂｒｅｎｅ ｆキャンプ（至）中のキャリヤと
じて１更用した。使用した試薬はＢｅｃｋｍａｎｓ ５
ｅｑｕｅｎｃｅ ｇｒａｄｅ の０、１ Ｍ Ｑｕａｄ
ｒｏｌ ｄｌｆｊｇ、フェニル−インチオシアイ・−ト
及びヘプタフルオロ陥１没で・ｂっだ。谷ツ゛イクル中
内部標準として１史用［るためノルロイシンをＱｕａｄ
ｒｏｌ緩衝液と共に添加した。谷クロマトグラム中にＰ
Ｔ Ｈ−ノルロイシンがイＴ′、在するとＰＴＪＩア
ミノ１哀ヲ保哀詩保持時間て同ボする助けと１よる。 アミノ戚配列１’ｆイ析によって、 Ｎ）ｉ、−末）・
糊配列ＮＨｚ−Ｇｌｕ −Ａｌａ −Ｇｌｕ −Ａｌ
ａ −Ｌｅ ｕ −’Ｇｌ ｕ −Ｐｈｅ−１ν１ｏｔ
ｉｈ−する１１１）ニー４！］１のインターフェロン分
子が示された。このｎｅｔはインターフェロンｘｆｆ
伝＋のＮ−末端の６ｉｊ始コドンによるもｖ−ｃｉす、
１１［つて、ｔ’Ｑ生し）ζタンパクは７個の余分なア
ミノＦ１’ｌ ｋΩんＣいる。このうち３１固は４Ｌ貫
者に白米する。即らＬｒ＋ｕ −Ｇｌｕ −Ｐｉｋｅ
（ｇｆ４７図””１（ｉ） Ｃ？ ６す、残りの４１固
はα−因子のブレを配列にｖ目Ｓする、即らＧｌｕ−Ａ
ｌａ −Ｇｌｕ−Ａｌａである１、こ＋７個のアミン＋
＋２から成るＮ−末端姑艮副ｋ ’ａ４むポリペプチド
はインターフェロンｒａ ｔｌ ｋ １呆４ｉ’ Ｌ−
Ｃいる。 Ｉ−コ、ｉ！ｉの異ト１）遺伝子産物の麓りＩ５及び分
−Ｖ・α−因子プロモーター及び１゛プレグロ」配列の
イ］ｉｔ］ Ｉ生をテストする過程Ｃ１プロモーターと
「プレグ口」配列が取り扱い易い（・；多送し１りる）
ｉ＋１ｌｌｌ奴１チ１ハとしで単離できる↓′）ＶＣ
α−因子１−プレグロ」！Ｈ１ｇ列の末尾に制限エンド
ヌクレアーゼ部１ｓ’ｌ ｋ Ｆｉ１１成した（第７図
ｊｊｊｊｊづ。次に、削切ｌ工「付７１°Ｓ」末ｉ、７
Ｊ宏ａ７汀する旺、仏の候柑示云子Ｖこ対丁４）この元
現及び分泌システムのイ丁幼注τテスｍｌ−／）７ｃ・
りに、１１１当ｌニブラスミド侘１１・フィシし１！１
７辷。このｆＣＫンにうらり表フラれら遺伝子はこれを
含むプラスミドのＩＵｃｏ ＲＩ ？ｌ’４化によって
取得した。例えば、１９８２年１１月１日出−の米国時
１［出−第４３８，１２８号（ウシＩＦＮ）：１９Ｂ１
年８月２８日出＆！ｉＩの禾し］竹許出１１’Ｊ１ ｉ
粘２９７．３８０号（ＭＳＡ）： １９８１年ｌＯ月１
９日出願の米国特許出願１１３ｔ ２，４８９号（ｒｌ
ＦＮ ） ： Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ＋ｓ（ｅｒｉｇａｎ＋ ｅｔ ａｌｌＡｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ、 （１９８２）＋ Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｂｅＳｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ ｏｎ″Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉ３ｉｏ１ｏ
ｇｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ： Ｒｅ１ａｔｉ
ｏｎ−ｓｈｉｐ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ″＋
ｈｅｌｄ Ｍａｒｃｂ ８−１２゜１９８２＋ Ｓｑ
ｕａｗ Ｖａｌｌｅｙ＋ Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ ：
Ｌａｗｎ＋ ｅｔ ｌ！、＋ＮｕｃｌｅｌｃＡａｌｄｓ
Ｒｅａａａｒｃｈ＋ ９．６１０３（１９８１） ；
Ｇｒａｙ。 郵ＩリリＮ懸旦り、Ａ１５，５０３（１９８２）参ｌｉ
ｔ粍Ｌ−ＦＡ及びレンニン遺伝子−ひは制限−位の位同
のために、上記のように直接発現グラスミドＸ１′４Ｍ
’５にすることは現実的ではｌ工く他の１ψ正した力
演をとった。ｔ−ＰＡ兄現プラスミドの傳築を第１０図
に示す。この場汗はプラスミドｐｔ−ｐＡｔｒｐ １２
−勿藺用しΔｂａ Ｉ及びＬｌｇｌｌで切ばしてｔ−Ｐ
Ａ逍伝す會青、他にｐＢＩ （米国ｌｒケｄ′Ｆ出願第
４３８．２３６号曾上４）及びＹＥｐ １３ ！１１
ｋ １９ｉ用する。レンニン発現グラスミドは、ｐＲＩ
（１９８２年１２月２２日出ｖｉ＋の米国！１ヶ５゛［
出！ｆｉ１１第４５２，２２７号） ｔ Ｘｂａ ｌ−
Ｒ蛙１切除によって１ｕたレンニン遺伝子倉使用して同
様に組立で１ξ。こ２’Ｌりの２つのプラスミドは、・
孝りはでの選択用の４四２をよイｊ゛する。従って、こ
れらのプラスミドで形ｙ″ｉｉ転ツ應するｆｃ メＶＣ
αｌｅｕ湾孝母Δｆ較ｔ１吏用した。プロし／ニン発現
グラスミドｐｉｕは、Ｅａｏ ＲＩ Ｐｓｔ Ｉ −ｅ
開裂したγ−Ｉ ｍｍグラスミド盆’ｌ’４リガーゼの
イ（：ｎ＝Ｆ５′セグメント及び３′セグメ／トと共に
インキュベートしてイＡ’４＆し７ｔｏｒ −ｌＡ４１
１１ は１９８１年１０月１９日出願の米国！１ケＷＦ
出願第、１１２，４８９号及びＧｒａｙ、結社・―止揚
に記載されたｐＢＲ３２２由来プラスミドである。。 ５′末端１１７片は以Ｆ Ｋ ’ａｔ２ｔｍ＜ ＃−る
工９にけ成ｄ片とクローンＰＦＬＡ由来断片との結オ物
であった。 合成断片の構造は仄のとおりでめる。 （ＭｅｔＪＣＡｌａ〕ＣＧｌｕ）Ｄｉｅ）（Ｔｈｒ）ｄ
ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＡＧＧ Ｔ
ＡＣＣＧＴ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＴ ’ｌ’ｃ Ｃ’
ｌ’ＡＧ ｄ１昨抗方向→ この配列は、「上流端」にＥｃｏ ＲＩ １ｊｌ１位及
びＡＴＧ開始コドンを含有し、こ扛にグロレンニンの最
初の４個のアミノ酸をコードしている配列が続き、釣ｔ
ｍ １■１部位で終わっている。 遺伝子の５′−末端を形成するためにこの汗成１＋：ｔ
ｉ片？結合するクローン化１０１片は、遺伝子の５′−
末端に由来する約４４０塩基対の盈曹−μ巴１（１１ソ
を片からなる。 適当７ｊ４４０ｂｐ断片は、プライマーとしでｄＧＡ工
゛ＣＣＧＴＣＧＡＡＴ′ｒＣＧＧ１即ら「プライマーグ
ローブ」を使用して未分画ｍＲＮＡから＊ｐｉ２！７シ
たＣＤＮＡから取イｒｊ した。このプライ１−全１史
用して形成し之ｃＤＮＡｉ上１ｊ己のμ日くザイズ分１
曲し、１，０００１盆基対以上の大きさの〜「片１ｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔ Ｉ 部位に押入してクローニングし
た。イＱら）したクローンケ、プローブとしてＴｔｈプ
ローブ及びプライマー／グローブの双方を使用して選択
した。双方とハイブリダイズするコロニーのみを選択し
ｆｃ。 １２８０１１４Ｊの形ｊイ転侯コロニーかう双方のプロ
ーブとハイブリダイゼーションを示すコロニー約Ｊ００
１固７）Ｚｌηられた。こ扛らの中にグロレンニン配列
の５′部分が存在するか否かｔ以下のよ’＞ Ｋ Ｌ。 て倹討した。 Ａひ１−！凹１．ＡひＩ−巾りＩｌｌ、馬１１−Ｂａｍ
Ｈ１及Ｕ Ｂｇｌ Ｉ−４理ＲＩを用いる一理の二重
消化の結果？解析した。既知のめツＩ及び穐」Ｔ部位ケ
利用し、ｐＢＲ３２２カ匹部泣のいすｔ′Ｌかの側の谷
々１２５塩茫対ンＯＤ １’Ｊ Ａ配列の仲人に１更用
した。これらの消化によって１９・ｒル「に適したＥ断
片が侍ら扛る。 同定されたクローンから調製したｍ１ｎｔ ｐｒｅｐｍ
の上１１己二虜消化９勿についてアクリルアミドゲル・
「托気泳！ＩＩＩＩｍ析全行なってｊヅ１望のクローン
、ＰＦＬＡを選択した。次にプラスミド−＋ｐＦｉ、Ａ
クローンがき単離し、１３ａｍＨＩ及び役竺１で二車消
化し、４４０ｂｐ断片金ゲルｌに気泳動によって回収し
／ヒ。 次に、Ｔ４リガーゼと共に合成断面及びＰＦＬＡクロー
ンＢａｍ ｆ（Ｉ −Ｘｍａ Ｉ断片を１史用する俤準
的連結反し？５鏝よ４凹１及び以遠１０で開裂して「完
全な」５′−木端を創成した３、侍し扛た連軸配列をア
クリルアミドゲル電気泳動で精製して適当な４５５項晶
対断片を選択した。 ３′−末端−１片はＰＦＬＡクローンの調製に使用した
と同様な方法でｗ、１製した。プライマーとしてオリゴ
−ｄＴｉ用いて未分画メツセンジャーＲＮＡかろイ４チ
た＞１０ｉ１１０ｂｐｋ宮むＣＤＮＡ１上６己と同様に
クローン化し、コロニー２ Ｔｔｈグローブで選択した
。約５０１固のコロニーが（？７られた。上記（！：
Ｉ＝Ｊ ａｎに２心１１インサ一トバロ位に吋接する旦
す１及び製！部位を利用して、聾Ｉｌｌ ｆ−ｆ Ｉ
／ ＢｇｌＩ＋ ｒ加Ｉ／抑Ｈ１，触１口／加ｌ及び艷
Ｉ ／ Ｗｃｏ ＲＩで二重消化したプラスミドｍ１ｎｉｐ
ｒｅｐｓに対して行ｌ工ったゲルα気泳１１１ｂの結果
を解析−づ−ることたよｐＩツ「望のクローンを選択し
た。Ｉツ「望のコロニー刀１らのプラスミドを単Ｆ＋［
し、仄いで凪１及び均す１で開裂し、電気泳動に工って
ｒ ３−３７５Ｊケノ［片の８００ｂｐ配列を単ｎ１ｌ
ｒｃ。このｒ３−３７５Ｊ伸びでいる。っ 佃々の発現プラスミドｆ、担持する形質転俣体を過当ｌ
工培地で増殖した。Ｊ行ｊｔ物を上ｒ＋’ｆと細胞に分
画し１ヒ。上ｉｎ （培地少及び卸１胞抽出４勿を拙々
のツバ伝子殖物の発現及び分必に関して便だし１と。ウ
シインターフェロンン占性はインターフェロン標ｊ表と
比較して細胞変性効果によって逆電した。、 −ｆ：の
他出 の腫物の培地中及び則ｔｒ嗣淀４中の或はラジオイムノ
アッセイによって決定した。表に（（」け定値はピーク
活１生である。細用内ｔ−ＰＡ及び分泌されたし−ＰＡ
分子は双方とも生物学的活性ｔもっていた。 ０、分泌クシインターフェロンの特性決定堵喪培地中に
分泌されたウシインターフェロン−αＩをドｉ己の如く
精製して特性決定した。 培養培地７ｔを水酸化ナトリウムでｐＨ８，０２にｉ”
ｊｒＪ ｄｌした。次にこのＭ ？ｆｋ ｋ、５０ ｍ
ｒＶ４ｔｒｉｓ、 Ｉ）Ｈ８，０で予じめ平向化した２
、 ５ Ｘ １８ Ｌ７Ａ Ｎｕｇｅｌ Ａ ＣＡカラ
ムに充填した。充填後、Ａ２Ｂ６がｅよ（・よＯになる
までカラムｆ ５０ ｍＭ ｔｒｌｓ＋ １％（ｗ／ｖ
） ＰＥＧ３０００゜ｐＨ８，０で洗浄した。次にカ
ラム（！：、１００ ｍＡ ｒｎｌ役ア／モニウム＞
２９６ （ｗ／ｖ）Ｐ ＥＧ ８０υｏ、ｐＨ５，０で
、仄いで２０？ｎム４γリソン、 ２．５９（、（ｗ／
ｖ）ＰＥＧ８０００ 、ｐＬ１２．０−Ｑ浴出し７ｊ
０インターフエロン活性の主要部はｐＨ５，０の浴出で
早−ビークとして出現した。ＩＶＪｕｇｅ１カラム（８
８ｍＬ 、 １５０Ｍユニット）からプールしたＨ科乞
、２５ ｍＭ（−９詐敵アンモニワム、 ｐＨ５，（ｌ
で予じめ半価化した２、５Ｘ ５． Ｏｃｍｓ ｉ−５
３カラムに充填した。インターフェロン活性は塩化ナト
リワム沼出甲に早−ビーこの材料の、１１１１度はＳＤ
Ｓ ＰＡＧｇ’Ｃ約８Ｑ−９０％とｄ′ｒ価された。 ５ａ−ｓａプールｌυｍｌｉ、２５ ｍ （ｙｌリン鍍
ナトリワム、ｐＨ６，０中で半画化した２、 ５ Ｘ
１８ 、市５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムにか
（／−Ｊた。カラムを上記の緩イ萌孜で溶出するとイン
ターフェロンγ占性が〔Ｆ−ピークとして浴出した。こ
の最ホさプール、はＳｉｉ；−５３プールに、げ仕−［
るタンパク（ＤＮ−木端配列解析に工２１に、、ｄｆ、
＃：が分泌したシシインクーフエロンは３棟の異なる部
位でグロセッシング分受けている。グロセツシングのこ
の３＋Ｉｔｆｆｌｖｏ１１位と各々の相対虚は次のと２
９である。 −８−６−３ −２ｙｓ −ａｒｇ −ｇｌｕ −ａｌａ −ｇｌｕ
−ａｌａ −１ｅｕ −ｇｌｕ −ｐｈａ６３％ ＋□
１３＋Ｘ２４夕Ｃ −ｍａ ｔ −ｃｙ＠−ｈｉｓ−（ｎｕ −ｐｒｏ −
ｈｉｓ ・＝上に示し７ｊ工うシこ、ウシインターフェ
ロンのＮ−末端の直＋＞ｉＪにｍθｔがあり、短いペプ
チドがついてい一〇もインターフェロンｉ古１生を失な
うことは７エい。 成熟異槙タンパクの産生及び分泌 分泌ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸配列が次冨ざｎた
両刀の楊叶（ヒ） ＩＦＮ−α１及びクシｘｒｐＮ−α
１）で、メンバクは開始メチオニンに加えて２〜７ ｆ
ｌａｔの余分なアミノば忙浮んでいた。これらのポリペ
プチドは生物学的に油性ではあるが、天然の起υ皐に出
来するタンパクと同じタンパクを謂殖層地中に圧生分泌
することが好よしいでりろう。 （天然のＩＦＮ−α１の」濁汁のように）Ｎ−木端アミ
ノばとしてシスティン全貧有〜づ−るインターフェロン
分子乞座生するために、因子「プレグ口」配列とＩＦＮ
−αｌ遺伝子との接片部を修正して、修正「プレグ口」
配列パ′顧去−７ｔｈ４天然のＮ−木端（ｊ−言イｊす
る成熟インターフェロン分子が放出されるようにする必
委があった。七の工う１２候合蛍１ｑるための手順の概
略を記１１図にボーづ一０ｉＶＩＦα１プロモーター及
び「プレグ口」配列並ひに１喰正ＩＦＮ−αｌ遺伝子を
貧イＪ−するＤＮＡ断片を単購しＭ１３ ｍｐ８ ｔＩ
υのｕｎｃｏ ｉｔ １１ｊ１１位にクローニングした
。一本領１）ＮＡ鋳型は過当な配向−０４７丈−ト勿は
イ１する組侠ファージかりＷ勺製しｉ仁。こりＷｅｔφ
をリンば化メリゴヌクレＡチドと共にアニールし７’Ｃ
０酋成オリゴヌクレオチドは２４塩基の夜さでｄりジ、
「プレグ口」配列のＣ−末ｐ席付肛のｌｅｕ −ａｓｐ
−１ｙｓ −ａｒｇ ｋコードしている１２塩基及び天
然ＩＦＮ−ｔｉ、の最初の４個のアミノｔｊｉ２ ＋
ｃｙｓ−ａｓｐ−１ｅｕ −ｐｒｏケコードしでいるｘ
２を盈りりに相４１０的で必る。このプライマー−−則
ノ”＋’ｉ中間体’；ｔｓ ５００ｍ１＼１ｄＡＴＰ、
１００１７１Ｍ ｄＴｉ”１７ 、１００＋ｉ＋Ｊ
ｄＧＴＰ、１００ｍｌ４ｄＣＴＰ 、 ２０ｍＭ ｄＡ
ＴＰ 、３ ｊ−ニットのＤ Ｎ Ａボリメジーゼ（Ｋ
ｌｅｎｏｗ ）及び４ ｏＵ−１−＝７トのＴ４ＤＮＡ
リガーゼの打圧ド、１０ ｒｒｔ＋Ｖｉ ’Ｉ’ｒｉｓ
、 ｐＨ７，４，５０ｎｔ＋ＶＩ ＮａＣ１及び１０
ｍ Ｍ ＋Ｖ１７ＳＯ４甲ｃ１２３℃Ｉ２１１．７間
の沖長及び運結反応に付した。仄に、史に３ユニットの
」〕１寸Ａポリメラーゼ（ｊ（ｋｎｏｗ ）及び４００
ｊ−二ソＩ−（１）Ｔ ４υ１”ＪＡリヵ−ゼ足力１
１え、ｍ汁物ｔ２３℃で２１＋、？１ｉＪＪ次いで１４
’Ｃで１５１１芋１）ｊＪインキュベートシ／こ。こ
の？昆片１１勿ｔ１史って貝、ヨ旦Ｊ Ｍ １０１ ｌ
Ｉｉ罎を形頁伝決した。ファージグラークｋ Ｐ ａ＝
ａＡリゴヌクレＡチドとのバイブリグイセ−ジョンによ
りスクリーニングした。２個のｌ＋１（ｐｏＩ］ＩｔＩ
ｖｅ）の組換ファージかり鋳型に型取られた１）ＮＡを
調製しＩ Ｆ ｉ（−α、ＤＮＡに相補ＩＩ′ジｌよプ
ライマーにＩ更）月してｄ己列火＞、１ｊＬ７ζ、１１
向の組換ノアージかｂ ＩＪｒ屋の欠失（第１１図にル
ープでボす２４ヌクレオチドの欠失用１１する二本鎖Ｄ
ＮＡを調製した。［プレグ口Ｊ ＹＢ己列と１上゛１リ
ーα。 ）以云″子との修正された接片を苫ひ肋１１ζｌ断片？
単醐し旦ｃｏ ＲＩで開裂したＹＥＰ９Ｔに連結した。 この（昆合ｊ勿で長、並且を形貝１駄且へした鏝、正４
１１鱈な自己向のインサート４４丁−［る）゛ラスミド
（ｐ７６）で＋８んで更に倹討した。 ｐ７６ １）ＮＡｋ上・四状から□ｒ、ｌ製し、こｆｔ
ｒ ノｌｊυ・て酵母の２０Ｂ−１２株（ＡＴＣＣ２
０６２６Ｊｉ形１４転換したｆｌ １個の形員伝侯体の
冶養吻１０を倉ｓａ ＞ｍし％ ｊ’Ｊ倭Ｐａ：ｔｔｌ
ｕｒ遠心して＋Ｎ１１Ｉ Ｊｌｆｆｌ カＩ−） Ｊ４
地ｆ分１）１１（７た。 Ｉ惇’ｉｔ ｊｉ地５ Ｕ Ｏｍｌ？ｚ ２５ ｎ＋Ｊ
’ｆ”ｒｉｓ＋ ｐＨｄ、 Ｕ 。 ｌＵ７ｎＭｌ；ＤＴＡ中に透析した。矢に透析し７ｃ堵
ｊｌｌ ｋ Ｎ天然／！￥吻（ＬｅＩＦＡ）に対づ−る
七ツクローン化した抗体に８有する児投アクイニテイ力
うム中にノ１） し／こ。 ２ ４ｍＭ ’ｆ’ｒｉｓ
、 ｐＨ８，０、１０ｍＭ ｍ ＤＴＡで洗浄１ρ、イ
ンターフェロンン占注τ０．２ Ｍ ｊＷ＝ばで浴出し
た。インターフェロンン占注の主要部は画分、−Ｍ２Ｓ
に見らＩした。このＨ分２００μｔ ＝ ｒｊｉ＋記の
如くＮ−末端アミノＩ！＋２配列Ｊ’ｌｌ ’ｆｉｒに
付した。見い出された主要な配列は天然インターフェロ
ンＤのものでめった。タンパクの最初の８個のＮ−末端
アミノ酵はａｙｓ −ａｓｐ−１ｅｕ −ｐｒｏ −ｇ
ｌｕ−ｔｂｒ ｈｉｓ −５ｅｒでめった。 回向の付加的＋ｊＳ！明 第２図 α−因子グローブと、ｐ５１（ａｌ及びｐ５２ （ｂ）
ｍ侠プラスミド由米Ｄ ｌｉ Ａ １１；Ｑ片との間の
・１１」同（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ）の位１ａ、２個のプ
ラスミドとイル々の１間１奴エンドヌクレアーゼでＹ白
化し、仄に１％アガロースゲル上でｔＩｔ気兆励した。 υＮ Ａ ｌｊ；Ｉｆ片をニトロセルロースベーパーに
移し Ｐ−標識グローブとハイブリダイズし７こ。パネ
ルＡ：具化エチジウム染色ゲル。パネルＢ ： ５６ｕ
ｔ１１ｅｒｎプロツト。レーンユニー腔ル１，２−、山
■Ｉ 、 ３−ＩＨｎｄ員、４−１１μｔｒｏ上１１．
５−＃艷空−艷Ｉ。矢印Ｖよツーグクローニングし／Ｃ
２１固のＤＮＡ断片和７Ｊて−１−ｏサイズ惰・す〜Ｊ
管ｊλ、ｒＲｐ’７ 又はｐ ＢＨ３２２Ｄ ｉ’Ｊ
Ａ 炉’） １＋ｆ５后ルた。 シＩｔ ３１ＺＩ フランキング・頭載のヌクレオチド配列。フェロモン前
、躯体の予見されるアミノ酸ＩＶ列も／Ｉり”ｒ ｌ）
ｆＪＬ４列の上１；の叔字は夫々アミノｌＶ及びヌク
レオチドのｆｉ”ｆ、 ７１’；（全示す。α−因子配
列の４ ｊ１？−１のコピーか枠−ひ囲った１頂域に民
含されている。星印は、α−囚十をコードしているｍｌ
域の１個以上のコピー間ひのヌクレオチド配列に力ｔけ
る違い？Ｉニアｉ：している１）３個の「り曲なＮ−グ
リコモル化４識部位は俸（太勝りで示す。この遺伝子は
１（ｕｒｊａｎ＋ ！！ｔ ａｌ、 ｔＩ婚の報乞し〕
ζものに対応しＣいる。 第４図 ±１α２遺伝子及びその非ａ１１１訳５′−及び３′−
フランキング領域のヌクレオチド配列。アンダーライン
を付したアミノ酸はＭＦα２遺伝子がコード第５図 ＩＦＮ−α、Ｊａ仏子とび一因子グロモーター及びα−
因子プレ配列との接会。第３図に示したように、１．８
ｋｂｐ旦鵠ＲＩ断片はブロモ−ター全白イ１しているの
で、５′から成熟α−因子ｔコードしている配列まで全
ＤＮＡ配列は、α−因子グレ目己列及びＩＦＮ−α１タ
ンパクがα−因子プロモーター（ｉ″使用て単一のＭｉ
Ｊ Ｉｄ体タンパクとして＠ｌ戎さｎるように、修正Ｉ
ＦＮ−αＩ遺伝子に接汗した０ 第７図 α−囚因子グレグロ」及び修正ＩＦＮ−αｌ迫仏子の接
合■１分のタンパク及びＬ１１’ＪＡ配列。、３Ｂ 、
７１４ＱのＪ（ｂａ Ｉ及び皿部ｌζ１部位が示さｔし
ている。 第８図 づ酌孝中のに山１１己及、び〕音」也ＩＦＮ−α、レベ
ル９１．ｉｌ。 、トハの時間間［イ４で堵−Ｊ（吻ｌＯｍｅｆ：釦１序
４・１Ｊから取り出し・遠心して細胞と培地で分離した
。刑１１胞抽出物瞥」上記のように、％裏しＩＣｏ梧地
及び抽出′南中のインターフェロンレベルオ決菫シフＣ
０ 、俄工可 ル配列を才、１１する１、 １２ ｋｂｐ旦鵠ｌ化Ｉ断
片全ｐ５８から単離しＹｋ２ｐ９’ｒのＪＰｃｏ ｉｔ
Ｉ部位に仲人した。 １ｉＳ１０図 組織プラスミノーゲン油性化因子の発現及び分ａ用グラ
スミドｐ６８の組立。 部１１図 ｉｎ ｖｌｔｒｏ欠失突然変）°４のスキーム。」１α
ｌ「グレグロ」配列と１６正ＩＦＮ−α１遺伝子の按汗
都Ｃ欠失されｆ（−２４ヌクレオチドは図中ループとし
て承り−。 ６１４１２図 、Ｊ Ｆ’α１及びＭＦα２遺伝子がコードしでいる補
足α−因子前駆体のアミノ酸配列の此式。最大の相同ｋ
４ｆ−ｆる配列勿整列するたりに秤々のギャップが生
じている。 参考文献 １、 Ｎｏｖｌａｋ、！！！ａ１．．Ｃｅ１１２１．２
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ｏｌ、ＣＩＩＱＩＩ＋、２５４． ９８：う９（１９７
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ｎｅｇ、９５０１１３（１９’７７、）。 ３４、 ｊｔｉｒｒｃｈｃｏｍｂ＋ ＩＪ、 Ｔ、＋
ａｔ ａｌすＮａｔｕｒｅ虱３９（１９７９）。 ３５、 １（ｉｎｇｓｍａｎ、 ｅｔａｌ、＋ Ｊ、
Ｇｅｎｅ ７＋ １４１（１９７９）。 ３６、Ｔｓｃｂｕｍｐｅｒ＋ Ｇ、、 ｅｔａｌ−＋
Ｇｅｎｅ １０． （１９８す・３７、Ｈａｒｔｌｅｙ
、 Ｊ、 Ｌ、 ｅｔ ａｌ−＋ ｔｒ、 Ｅ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ ２８Ｇ、 ８６０（１９１３０）。 ３８、 Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ＋ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ１ｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ■
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ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｌｔ ９． ３０９
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ｂｅｒｔ、 ｙＶ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ胸堕呻、
懸、 ４９０（１９８す。 ２３３１（１９８０）。 ４２、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ａｌｏｌ、Ｂｉｏｌ、
９１Ｌ５０３（１９７５）。 ４３、Ｂｒｏａｃｈ＋ｅｔａ１．、Ｇｅｎｅｌｏ、１５
７（１９７９，）。 ４４、 Ｋｕｒｊａｎ＋ｅｔａ１．、Ｃｅ１１３０．９
３３（１９８Ｊ。 ４５、Ｓｍ１ｔｈ、 ＋ｖｌ＋世捜仄塑ジ皿当長、４９
９（１９８０）。 ４６、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ＋ Ｊ、 Ｌ、＋ ｅｔａｌ
、＋ Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５Ｌ３０２６
（１９８２）。 ４７、 ８ａｎｇｅｒ＋ ｅｔ ａｌ−＋ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ７４．５
４６３（１９７７、ｌ。 ４Ｂ、Ａｈｉｎｓ＋ ｅｌ ａｌ、＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡた。３０１
４（１９７７）。 ５１、Ｇｕｂｌｅｒ、 ｅｔａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ
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０２（１９８２）。 ５３、Ｋｏｋｉｄａｎｉ＋ ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９８．２４５（１９８２，）。 ５４、Ｂａｒｎｅｓ、ａｔａｌ、、ＭｅｒｋｅｌｅｙＷ
ｏｒｋｓｂｏｐｏｎ、ＩｔｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓ
Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ （１９８２）：Ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ １）Ｎ
ＡＩ ＥｓｐｏｓｉＬｏ＋ ａｔ旦、 Ｅｄｓ、、 ｐ
ｐ。 ２９５−３ Ｃ１５＋ Ｌａｗｒｅｎｃｅ １ｔｎｄｉ
ａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｃａ１ｌｆｏｒｎｉａ＋ ｆｌｅｒｋｅｌ
ｅｙ＋ ＣＡ。 ５５、Ｊｕｌｉｕｓ、、ｅｔａｌ、、ｃｅｉ１３２，８
３９（１９８２）。 ５６、Ｋｒｅｉｌ、 ｅｔ ａｌ、＋ Ｅｕｒ、 Ｊ、
Ｂｉｏｃｈａｍ、 １１１．４９（１９８す。 ５７、Ｍｏｆｆｍａｎ、ｅｔａｌ、、ＥＭＢＯＪ、２，
１１１（１９８３，）。 ５８、ｖ％’ｅｃｋ、 ａｔ ａｌ、＋ Ｎｕｃ、 Ａ
ｃ１ｄ ｌ１ｅａ、 ９．６１５３（１９８す。 ５９、ＨＩｔｚｅｍａｎｅｔａｌ、＋５ｃｉｅｎｃｅ２
１９，６２０（１９８３Ｊ。 ６０、Ｐｅｎｎ１ｃａ＋ｅｔａ１．＋Ｎａｔｕｒｅ３０
１，２１４（１９８３Ｊ。 ６１、ＭＪｓｉｇ、 Ｊ、 （１９８１）ｐｐ、 １４
３−１５３ ｉｎ Ｔｈ１ｒｄＣ１ｅｖｅｌａｎｄ Ｓ
ｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏ＋ｍ１ｏｃｕｌｅ
ｓ ：Ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ ＤＮＡＩ Ｅｄ、んＷ
ａｌむｏｎ、 ｇｌｓｅｖｉｅｒ＋Ａｍｓｔｅｒｄａｍ
。 ６２、 Ｍｅｓｓｉｇ、 Ｊ、＋ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ
２．４３ （１９７９）。 ４・ 区間の＋ｌＯ単なａ明 第１図は、α−因子の逍伝子全単＋：１−ｖ−るｆｃめ
にハイブリダイゼーションプローブ 計成詞すコヌクレオチドのプールの４Ｑｆ 造ｋ ７Ｊ
ｅ Ｔ ＩｓＪ、第２図は、第１図のグローブ全期用し
て青らｔしたＩ） Ｎ Ａ ＋ｉｊｉ片の１０、ス（激
動の結果を示し、第３図及び４１３４図は、α−因子遺
伝子のヌクレオチド１記列を示−す図、 と１シ５図は、ヒトインターフェロンＤ（１）遺伝子と
α−因子プロモーター及びシグナル配列の遺伝子との接
片のスキームを示す図、 ｉ゛ｌ’４５図は、ヒトインターフェロンＬ）（工ＦＮ
−αθ元現用の目Ｙ母元現グラスミドの構３１１のスキ
ーム図、第７図は、α−因子シグナル配列及び１６正Ｉ
Ｆ１ｑ−αｌ迫伝子の接合部のタンパク及びＤＮＡ配列
を）ｊぐ丁図、 第８図は、ｆＦ’Ｎ−α１ を発現−「る酵猷形賀転コ
キ（体の培養の培地及び雌側抽出物中のＩｆｉ’ｉ寸−
α。 レベルτ７Ｊ（丁図、 第９図は、α−因子グロモーター及Ｏ・／グナルボリベ
プナド迫伝子配列を期用する異性遺伝子の発現１４４酵
母／呈、」シャトルベクターの４１グイ！ス・■−ム図
、 第１０図は、組識プラスミノーゲ／油注化因子の９ｆ；
９１用酵母／旦、虱プラスミドの組立図、第１１図は
、ｇｌ１分的α−因子／グナル配列（！？七−づ−る“
発現産物としての成熟”）４４１ｉＩり／ノ＜り（図に
示したのはヒトインターフェロン）の産生、α−因子成
分のグロセツシング及び成熟クンノ（りの文ｊ；ｒ培地
への分泌を遂行するたりに１史用されたｔｉ１染ｔ７Ｊ
＜丁図、 第１２図は、第３図及び第４図のＩＶｌ、 Ｆα１及び
ＩＶｌ Ｆα２ポリペプチド間のコンセンツース（−」
・（）の桿１及をボ丁凶でるる・ 代理人 プ「埋土 今 ４・１ ノし 第１頁の続き （−ｉ）Ｉｎｔ、、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号
０ １２ Ｆ（１：８６り） −丁・李ン■ネｉｆｊ、■二１：薯（万代）％式％（３
８ ２、発明の名称 耐ＩΣｌ発現系Ｃの〕Ｉルノノ′因子
配列の１山川３、ン＋ｌｉ ｉｔをりる貨 ・＋１ ＋’ｌどの関係 １１１几′１出摺１人名 称
シ１ネンブツク・イン−１−ボレイワツ１−１、代
理 人 中ｊ＋！ ７Ｉｌｌ新ＩＩ：ｉ区新１？」月１
１１番＋１ｊ７； １１１１１１ヒル（′１）明細１１
：中、ｆｆ；７１ｄｉり’＋３ＭＩに「・・・・・・の
（、，１１１１１合・小し、」と（（りるイー、Ｉ・・
・・の結果を示すフバ１、］とン市１［づる。 （２）淵’Ｘ； （ｄ：用イＺ ’ｒ８ ｉｆ’ ％用
Ｉｔ（ニｆｉＹ明１ｃ ：”、四’ ７ｗ ＋１１１
Ｉｆイ＋＝Ｉｌ’１ｌｌｌｌｌ （第１、反−研 カル
ボＡシ未ｆｆ１Ｇ１ｙ −−Ｇｌｎ −−Ｐｒ。 ｂ己１．狽相゛的ぢ呑成・ 工、５・−ＧＴＡＣＡＴＴ
ＧＧＴＴＧＡＣＣ才１−＞’に’７Ｌ１−７）−” Ｖ
ｏ−ル″Ｉ１． ５”−ＧＴＡＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＣ
Ｃ−−Ｍｅむ −−Ｔｙｒ ＣＯＯＨ （１） （０）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （ＩＩ Ｗ母発現産物として酵母にとって異種のタンパ
クを取得する方法であって、 酵母生体にとって異種のタンパクをコードしているＤＮ
Ａ配列に有効に連結された酵母α因子用プロモーター（
’Ｉ Ｄ Ｉ！ Ａ配列を含む酵母発現ベヒクルで酵母
生体を形質転換し、 形質転換された生体を培養し、 培養物からタンパクを回収する ことからなる方法。 （２） 酵母発現産物として酵母にとって異種のタンパ
クを取得する方法であって、 酵母生体にとって異種の成熟タンパクをコードしている
Ｄ Ｎ Ａ配列に翻訳解読枠で有効に連結され実質的に
酵母α因子のプレプロペプチドをコードしているＤＮＡ
配列を含む発現ベヒクルで酵母生体を形質転換し、 形質転換された生体を培養し、 培養物からタンパクを回収する ことからなる方法。 （３） 酵母にとって異種のタンパクを酵母の発現、グ
ロセツシング及び分泌の産物として取得する方法であっ
て、 酵母生体にとって異種の成熟タンパクをコードしている
ＤＮＡ配列に翻訳′Ｍ読枠で有効に連結され実質的に酵
母α因子のプレプロペプチド配列をコードしている遺伝
子に有効に結合したプロモーターのＤＮＡ配列を含む発
現ベヒクルでＯγ母母体体形質転換し、 形質転換された酵母生体を培養し、 その支持培地からタンパクを回収する ことからなる方法。 （４）酵母にとって異種のタンパクを支持培地中に分泌
する方法であって、 酵母生体にとって異種の成熟タンパクをコードしている
ＤＮＡ配列に翻訳解読枠で有効に連結され実質的に酵母
α因子のプレプロペプチドをコードしているＤ Ｎ Ａ
配列を含む発現ベヒクルで酵母生体を形質転換し、 形？・１転換された生体を培養する ことからなる方法。 （５）前記ＤＮＡ配列がα因子プロモーターの制御下に
あることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の方
法。 （６） 酵母生体にとって異種のタンパクをコードして
いるＤＮＡ配列に有効に連結された酵母α因子遺伝子の
プロモーターのＤ’ Ｎ Ａ配列を含む酵母発現ベヒク
ル。 （７） 酵母生体にとって異種の成熟タンパクをコード
しているＤ Ｎ Ａ配列に翻訳解読枠上流で有効に結合
され実質的に酵母α因子のプレプロペプチドをコードし
−（いるＤＮＡ配列を更に含むことを特徴とする特許請
求の範囲第６項に記載の発現ベヒクル。 （８） 酵母生体にとって異種の成熟タンパクをコード
しているＤ Ｎ Ａ配列に翻訳カフ胱枠で有効に連結さ
れ実質的に酵母α因子のプレプロペプチドをコードして
いるＤＮＡ配列を含む酵母発現ベヒクル。 （９） 異種タンパクをコードしているＤ Ｎ Ａがヒ
トインターフェロン、ウシインターフエ四ン、組織プラ
スミノーゲン活性化因子及びレンニンで構成されるグル
ープから選択されるタンパクをコードしていることを特
徴とする特許請求の範囲第６項乃至第８項のいずれかに
記載の発現ベヒクル。 ０Ｉ 異種タンパクをコードしているＤＮＡがインシュ
リン様成長因子をコードしていることを特徴とする特許
請求の範囲第６項乃至第８項のいずれかに記載の発現ベ
ヒクル。 ａυ 特許請求の範囲第６項乃至第１θ項のいずｈかに
記載の発現ベヒクルで形質転換した酵母生体。 ０ｚ 特許請求の範囲第１項に記載の方法で産生される
タンパク。 ０３ 特許請求の範囲第２項に記載の方法で産生される
タンパク。 ０４ 特許請求の範囲第３項に記載の方法で産生される
タンパク。 霞 特許請求の範囲第４項に記載の方法で産生されるタ
ンパク。 αＱ 酵母α因子Ｄ Ｎ Ａ由来のＮ−末端プレ配夕１
１２ ＜＋ ｒＪう・柚発現、前記プレ配列のプロセッ
シング及び支持培地中への成熟タンパクの分泌の肱物と
して前記培地中に成熟異種タンパクを産生じ得る酵母生
体。 αη 成熟異種タンパクがヒトインシュリン様成長因子
であることを特徴とする特許請求の範囲第１６項に記載
の生体。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48832383A | 1983-04-25 | 1983-04-25 | |
| US488323 | 1983-04-25 | ||
| US506098 | 1983-06-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6041487A true JPS6041487A (ja) | 1985-03-05 |
Family
ID=23939275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8276884A Pending JPS6041487A (ja) | 1983-04-25 | 1984-04-24 | 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6041487A (ja) |
| ZA (1) | ZA843060B (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62502661A (ja) * | 1985-05-02 | 1987-10-15 | トランスジ−ン ソシエテ アノニム | 形質転換された酵母及びヒルジンの製造方法 |
| JPS6398397A (ja) * | 1986-10-14 | 1988-04-28 | Shionogi & Co Ltd | 酵母におけるヒトｐｓｔｉの製造法 |
| JPS6485082A (en) * | 1986-07-10 | 1989-03-30 | Transgene Sa | Method for manufacturing functional dna block and plasmid for coding hirudine, trasformation yeast and hirudine, said hirudine and medical use thereof |
| JPH02194A (ja) * | 1987-10-30 | 1990-01-05 | Delta Biotechnol Ltd | ヒト血清アルブミンのｎ‐未端を含有するポリペプチド |
| JPH03290186A (ja) * | 1990-04-04 | 1991-12-19 | Fuji Oil Co Ltd | リパーゼの製造方法 |
| EP0683233A2 (en) | 1994-05-18 | 1995-11-22 | The Green Cross Corporation | Process for producing recombinant human serum albumin |
| WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
| EP2390333A1 (en) | 2002-07-23 | 2011-11-30 | Novozymes Biopharma DK A/S | Polypeptides comprising a modified human serum albumin secretion pre-sequence with improved secretion yield |
-
1984
- 1984-04-24 JP JP8276884A patent/JPS6041487A/ja active Pending
- 1984-04-25 ZA ZA843060A patent/ZA843060B/xx unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62502661A (ja) * | 1985-05-02 | 1987-10-15 | トランスジ−ン ソシエテ アノニム | 形質転換された酵母及びヒルジンの製造方法 |
| JPH09103295A (ja) * | 1985-05-02 | 1997-04-22 | Transgene Sa | 形質転換酵母によるヒルジンの発現及び抗凝血剤組成物 |
| JPS6485082A (en) * | 1986-07-10 | 1989-03-30 | Transgene Sa | Method for manufacturing functional dna block and plasmid for coding hirudine, trasformation yeast and hirudine, said hirudine and medical use thereof |
| JPS6398397A (ja) * | 1986-10-14 | 1988-04-28 | Shionogi & Co Ltd | 酵母におけるヒトｐｓｔｉの製造法 |
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| JPH03290186A (ja) * | 1990-04-04 | 1991-12-19 | Fuji Oil Co Ltd | リパーゼの製造方法 |
| JP2513896B2 (ja) * | 1990-04-04 | 1996-07-03 | 不二製油株式会社 | リパ―ゼの製造方法 |
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| EP2390333A1 (en) | 2002-07-23 | 2011-11-30 | Novozymes Biopharma DK A/S | Polypeptides comprising a modified human serum albumin secretion pre-sequence with improved secretion yield |
| WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA843060B (en) | 1984-11-28 |
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