JPS62502661A - 形質転換された酵母及びヒルジンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換酵母によるヒルジンの発現 るＤＮＡ配列を発現するためのベクター、これらのベクターにより形質転換され た酵母の培養培地中へのヒルジンの分泌、および醗酵により活性なヒルジンを得 ることのできるプロセス並びに得られたヒルジンに関するものである。

医用ヒル（Ｈｌｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｅｉｎａｌｉｓ　）の唾液腺中に存在する抗 凝血活性の原因物質は、ヒルジンとして知られる小型ポリペプチドである（１） 。この極めて特異的な、極めて有効なトロンビン阻害剤は、極めて有用な治療剤 を提供する可能性があるため、最近では、広く研究されている。しかしながら、 それの単離及び精製が極めて困難であり、費用がかさむため、あまり広く用いら れるに至っておらず、更には、臨床の立場から研究する可能性さえ排除されてき た。

組換えＤＮＡ技法を用いて遺伝子をクローニングし、発現させてヒルジンを製造 することの可能なことは、既に、ヒルジンをコードする天然のヒル遺伝子の微生 物旦。

ｃｏｌｔでのクローニング及び発現（１９８４年３月２７日出願の本出願人名義 のフランス特許出願第８４１０４゜７５５号）により証明されている。Ｅ、　ｃ ｏｌｉ中で生物学的活性をもつペプチドを産生させることは可能となっていても 、他のタイプの微生物中でヒルジンを産生させることは極めて重要である。実際 、ヒルジンを臨床的に使用するには、製品が極めて高い純度をもっことが要求さ れ、発熱性汚染物の除去が、大腸菌抽出物からのヒルジンの精製に当っての問題 となりうる。

離、精製しなければならない。こうした理由で、ヒトに対し発熱性又は毒性を示 す物質を生産せず、かつ培地中へ蛋白質を分泌できる酵母内で、ヒルジン遺伝子 を発現させることは有用である。

抗凝血剤としてのヒルジンの作用機構は、解明されはじめたばかりである。ヒル ジンが結合する基質は、トロンビンであり、このトロンビンは、酵母前駆体（チ モーゲン）であるプロトロンビンから活性化（活性化された楯Ｘ因子による）さ れると、循環血中のフィブリノーゲンを切断して、これを血液凝塊（クロット） の形成に必要なフィブリンに変換する蛋白質分解酵母である。１：１トロンビン −ヒルジン複合体の解離定数（０，３ｘ１０−ＩＱ）は、これらの分子間の会合 が極めて強いことを示している（２）。実際上、これら２分子間の非共有結合に よる複合体は、生体内で解離不可能と考えうる。

天然の基質であるフィブリノーゲンよりもずっと高い親和性をもつ。しかも、他 の凝固因子又は他の血漿成分が存在することは必要でない。ヒルジンの抗トロン ビン作用が特異的でかつ極めて強力であるため、これを抗凝血剤として臨床的に 使用できることは明かである。

ヒルジンは、その抗凝血性のため、動物ではかなりの程度まで研究されている。

最も詳細な研究（３）は、ラットでの静脈血栓症、血管閉塞及び播種住血管内凝 固（Ｄ　Ｉ　Ｃ）の予防におけるヒルジンの作用を記述している。ヒルジンは、 極めて精製された形で静脈内投与されたときには、ラット、イヌ、ウサギ及びマ ウスによく忍容される。マウスでのＬＤ５ｏは、体重１ｋｇ当り５０万単位（即 ち６０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　）以上である。他の研究（４）は、静脈内投与、 皮下投与とも、マウスはＩｇ／ｋｇまでの用量に耐え、ウサギはｌｏｍｇ／ｋｇ まで忍容することを示している。マウスでは、２週間の反復注射では感作反応に 至らない。

また、実験動物では、ヒルジンは、腎を介して、朱だ活性のある形で速やかに排 泄される（半減期は１時間のオーダーである）（３）。

別の２つの研究、一つはイヌを用いたもの（５）、他はラットでのＤＩＣの予防 におけるヒルジンの活性を示したもの（６）は、マルクヴアルト（Ｍ　ａｒｋｗ ａｒｄｔ）らの正の結果と一致している。これらの研究者は、ヒトの止血系に対 する天然ヒルジンの作用の初めての生体内解析を最近発表している（７）。何ら の毒性副作用の徴候もなく、期待通りの生物学的効果を被験者は示した。

ヒルジンがブタでの内毒素誘発ＤＩＣを防止しく８）、かくしてブタで高い致死 率をもたらす内毒素血症が惹起する極めて重大な問題を解決しうるちのとなるこ とを証明することもできた。

ごく最近の一つの発表（７）は、ヒトへのヒルジンの静脈内投与及び皮下投与を 記述している。６名の志願者を用いて、ヒルジンの１回投与（１０００ＡＴ−Ｕ ／ｋｇ）の薬物動態と止血系への影響が評価された。静脈内投与時、ヒルジンの 半減期は５０分であり、注射から２４時間のうちにヒルジンの５０％が活性な形 で尿中に表われる。血漿中ヒルジン濃度に応じて凝固時間（インヴイトロでトロ ンビン、トロンボプラスチン及びプロトロンビンについて測定）の延長が観察さ れ、これは、ヒルジン分子が被験者の循環血中で生物学的活性を保持しているこ とを示す。血小板数、フィブリノーゲン濃度あるいはフィブリン分解系について 変化は認められない。

静脈内注射の場合と同様に、ヒルジンの皮下投与もよく忍容され、何らの副作用 も起こさない。アレルギー反応発現の可能性を試験するため、同じ被験者らに４ 週間の間隔をおいて２回の皮内注射が行なわれたが、感作の徴候は認められなか った。さらに血清中に抗ヒルジン抗体も検出されなかった。

これらの研究者は、ヒルジンが抗凝血剤として有用な臨床薬剤となりうろことを 示唆している。ヒルジンの作用の特異性が高いため、血液凝固の前段階は影響さ れない。その抗トロンビン活性は、用量依存性であり、ヒルジンの作用は、その 速かな腎排泄の結果、速かな可逆性を示す。ＤＩＣには抗トロンビン■（ヘパリ ンの作用に必要な補足因子）の減少と非常に有効な抗ヘパリン剤である血小板因 子４の放出とが伴うという事実からみて予測できた通り、ヒルジンはＤＩＣの処 置についてはヘパリンよりずっと優れていることが証明されている（３゜性を証 明している（９）。もつとも、得られた結果には若干理解しがたいところもある 。

細胞を含まない粗製ヒル抽出物の市販製剤が、軟膏と−ム、西ドイツのプランド ルガン　ヴエルケ社のエクスヒルドープルートゲル）。しかし、これが有利な投 与経路であるかどうかを確かめるためには、高度に精製された材料をより高用量 でさらに試験することが必要である。

一般的にいって、好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内及び経皮経路である。他 のヒルジン投与経路、特に経口も報告されている［ＢＳＭ（フランス医薬特許） ３７９２Ｍ］。

他の成分と組合わせる時、この製品は、西ドイツ特許出願公開２１０１３９３号 に記載されているように、乾癖及び同じタイプの他の皮膚障害の処置にも使用で きる。

さらに、ヒルジンは、臨床検査室試験における抗凝固剤として、また研究のツー ルとして利用することができる。この場合、血液凝固の一つの段階のみに対する 高い特異性のため、作用特異性のずっと低い、最も多用されている凝固剤に比し てかなり有利となりうる。

また、ヒルジンは、体外循環系及び透析系での抗凝固剤としても、極めて有用で ありうる。これらの系では、特にそれら人工循環系の表面に活性な形で固定され たならば、他の抗凝固剤よりもかなり有利となりうる。

しかも、ヒルジンのトロンビンへの結合活性は、第Ｖ■因子などの凝固因子をそ の精製時に間接的に保護することを可能にしうる。

最後に、標識ヒルジンの使用は、トロンビシ及びプロトロンビンの濃度を測定す るための簡単で有効な方法となりうる。特に、標識ヒルジンは、クロット形成過 程でクロットを可視化する目的で使用できる。何故ならば、凝固現象は、形成部 位での循環血中プロトロンビンのトロンビンの転化を包含し、標識ヒルジンは、 トロンビンに結合され、可視化されうるからである。

また、形質転換酵母をヒルジン放出薬として、例えばヒルジンを皮膚上に分泌す る該酵母を含有するクリームを塗付することにより、直接利用することも考えら れる。

要約すると、本発明のヒルジンには、下記に例示する可能性ある用途が数多くあ る。： １）現にある血栓の拡大の阻止及び予防のための、臨床的血栓症状態での抗凝固 剤として； ２）顕微鏡外科手術後の血腫及び腫脹を減じるための抗凝固剤として（この状況 下では、現在生きたヒルがかなり用いられている）； ３）体外循環系での抗凝固剤として、また合成生体材料４）検査室実験での血液 サンプルの臨床検査に際しての抗凝固剤として； ５）凝固に関する臨床研究に際しての抗凝固剤として、また実験ツールとして： ６）痔、静脈瘤及び浮腫の処置における皮膚適用の可能性ある局所用薬剤として ； ７）乾廚症及び関連疾患の処置における一成分として；８）最後に、ヒルジンは 、血液の保存中及び血液由来物の（血小板、第ｖ■因子、第Ｘ因子）調製中のト ロンビン結合用に利用できる。

目安として、ヒルジンは治療用組成物中で１００〜５００００抗トロンビンＵ／ ｋｇ／日に相当する濃度で使用することができる。

ヒルジンは水溶性であるので、薬理学上許容される担体及び賦形剤を用いて注射 用又はその他の経路で適用可能な医薬組成物を得るのは容易である。

最後に、インヴイトロ検定或いはインヴイヴオイメージングのために、特にクロ ット形成の可視化のために、既知の手段により放射性標識又は任意のタイプの酵 素又は螢光性標識で標識化したヒルジンを使用することができる。

全ヒルジン体からのヒルジン製剤が、該当蛋白質のアミノ酸配列の決定に使用さ れている（１０．１１）。以下の実験では、絶食ヒルの頭部でメツセンジャーＲ ＮＡとして発現される遺伝子のクローニングがなされた。この遺伝子は、ヒルの 全身中に見出される蛋白質（ＨＶ−１として知られる蛋白質）とはかなり配列の 異なる蛋白質（ヒルジン変種２、即ちＨＶ−２）に関する情報を担持している。

ＨＶ−１とＨＶ−２との間にはアミノ酸残基で９ケ所の相違があり、両者のＮＨ ２末端残基の差（Ｖａ　１−Ｖａ　１又はＩ　１　ｅ−Ｔｈ　ｒ）により、ヒル ジンＮＨ２末端に関する文献上の一見しての矛盾を説明できるかもしれない（１ ２）。

第１図は、ＨＶ　−２ｍ　ＲＮ　Ａに相当するｃＤＮＡのコピーを含有する組換 えプラスミドｐＴＧ７１７のＤＮＡ配列を、ｂ）のところではそのＤＮＡ配列か ら推論されるアミノ酸配列を、Ｃ）のところではこの配列とＨＶ−１のアミノ酸 配列との差を示している。

このｃＤＮＡ配列は恐らく不完全であり、成熟型蛋白質の始端よりも上流にシグ ナル配列があるのでないかと考えるのが妥当である。

微生物におけるＨＶ−２ｃＤＮＡの発現は、相当する蛋白質が抗トロンビン活性 をもつことを示す。

下記の実験は変種ＨＶ−２について行なわれたものであるが、以下に「ヒルジン 」、「ヒルジンをコードする遺伝子」とは、特に断らない限り、いずれがの変種 、即ぢＨＶ−１又はＨＶ−２、また他の可能な変種、及び対応する配列を表わす ものとする。

本発明の主題の一つは、酵母によりヒルジンを調製することである。

酵母は、単細胞真核生物である。サツカロマイセス属の酵母は、実験室で生化学 的、遺伝学的に徹底的に研究されている株を包含している；それはまた、食品工 業（パン、アルコール性飲料、その他）で用いられており、従って大量に生産さ れている株を包含している。

古典的手法により又は遺伝子工学から導かれる手法により、さらにはこれら両タ イプの手法の組合わせによりサツカロマイセス・セレヴイシアセ（Ｓ　ａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞を容易に操作できるため、がっ この酵母種の産業上の歴史が長いため、この種が異種ポリペプチド製造のための 優れた宿主となる。

それゆえ、本発明は、より詳しくは、少くとも・ヒルジン又はその変種のひとつ をコードする遺伝子（以下Ｈ遺伝子）、 ・酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含有するＤＮＡ配列（Ｓ　ｔｒ ） を含むことを特徴とする、酵母からのヒルジンの調製を可能ならしめる機能性Ｄ ＮＡブロックに関するものである。

プラスミド又は酵母、好ましくはサツカロマイセス属酵母の染色体に組込まれた とき、この機能性ブロックは、該酵母の形質転換後に、ヒルジンを活性型又は活 性化によりヒルジンを再生しうる不活性前駆体型で発現させう゛る。

サツカロマイセス・セレヴイシアエの価値は、この酵母が培地中に成る種の蛋白 質を分泌できるので、この分泌をもたらす機構の研究の上で大きな進歩がなされ つつあることにあり、適切な操作を加えれば、ヒト血清中に見出だされるものに 全ての点で類似の、正確なプロセッシングを受けたヒトホルモンをこの酵母に分 泌させることができることが示されている（１３．１４）。

本発明に関して言えば、この性質を活用して、ヒルジンの分泌を達成しようとす るものであり、これには多くの利点があるからである。

まず第一に、酵母はごく僅かの種類の蛋白質しか分泌しないが、このため、若し ある異種の蛋白質の分泌の誘導を高度に達成することができれば、総分泌蛋白質 で高い比率を占める成る生成物を培地中に得ること、従ってめる蛋白質の精製作 業を容易にすることが可能となるという利点がある。

数種の蛋白質またはポリペプチドが酵母により分泌される。既知の全ての場合に 、これらの蛋白質はより長い前駆体の形で合成され、それらのＮＨ２末端配列が 分泌に至る代謝過程へ入るのに極めて重要である。

異種蛋白質の配列を伴うこれら前駆体の一つのＮＨ２末端配列を含む混成（ハイ ブリッド）蛋白質の酵母内での合成が、その異種蛋白質の分泌につながる場合が ある。

この異種蛋白質が前駆体の形で、従って一般には不活性な形で、合成されるとい う事実が請求める分子が有するかもしれない毒性作用から細胞を保護することを 可能にし、活性蛋白質を遊離させるその切断は、該蛋白質を細胞質から隔離する ゴルジ体由来の小胞中で行なわれるだけである。

従って、異種蛋白質を酵母に生産させるために分泌に至る代謝経路を利用するこ とにはいくつかの利点がある：１）培養上澄中で十分に純粋な生成物を回収でき る；２）成熟型蛋白質が有するかもしれない毒性作用から細胞を保護できる； ３）更に、分泌された蛋白質が修飾（グリコジル化、硫酸化など）を受けうる場 合がある。

このため、本発明の発現ブロックは、より詳しくは、次の構造をもつであろうニ ー　−５ｔｒ−−Ｌｅｘ−−８ｃｉ　−Ｈ遺伝子　。

ＬｅｘはＨ遺伝子に相当する蛋白質の分泌に必要なリーダー配列をコードする； Ｓｃｌは切断部位をコードするＤＮＡ配列である；また、５ｃｌ−Ｈ遺伝子と言 う要素は数分泌系の一例として、アルファフェロモンのそれを選んだ。即ち、上 記配列において、配列Ｌｅｘは、酵母のα性フェロモンをコードする遺伝子に由 来するものを選んだ。しかし、他の系を利用できる（たとえばキラー蛋白質の系 ）（１３）。

酵母のα性フェロモンは、性タイプＭＡＴαの酵母Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ によって培地中へ分泌される１３個のアミノ酸からなるペプチドである（第２図 において囲んである）。α因子は０１期に性タイプが反対（ＭＡＴａ）の細胞を とらえて、両タイプの細胞の交配に必要な生化学的及び形態学的変化を誘発する 。クリャン（Ｋｕｒｊａｎ　）とへルスコヴイツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　）　 （１６）は、α因子の構造遺伝子をクローン化し、この遺伝子の配列から、この １３個のアミノ酸からなるα因子は、１６５個のアミノ酸からなる前駆体プレプ ロ蛋白質の形で合成されると推論した（第２図）。この前駆体は、２２残基（破 線のアンダーライン）からなる疎水性アミノ末端配列を含み、これに３ケ所のグ リコジル化部位を包含する６１個のアミノ酸からなる配列が続き、最後にα因子 の４コピーが続く。それら４つのコピーは、「スペーサー」配列により隔てられ ていて、下記の酵母活性の結果として成熟型蛋白質が前駆体から遊離される： １）Ｌｙｓ−ＡｒｇジペプチドのＣ０ＯＨ側で切断するカテプシンＢ型エンドペ プチダーゼ（切断部位を太い矢印で示す）： ２）切り出されたペプチドのＣ０ＯＨ末端に存在する塩基性残基を切り取るカル ボキシペプチダーゼＢ型エキソペプチダーゼ： ３）　Ｇｌｕ−Ａｌａ及びＡｓｐ−Ａｌａの残基を除去するジペプチジルアミノ ペプチダーゼ（Ａとして知られる）。

この前駆体のヌクオレチド配列は、更に、４ケ所の）（１ｎｄｍ制限部位（矢印 Ｈで示す）を含む。

αフェロモン遺伝子と成熟型ヒルジン配列との融合を何回か行なった。ＭＡＴα 型酵母細胞は、これらの融合遺伝子を発現できる。相当するハイブリッド蛋白質 は、つぎに、それらが含有し、αフェロモン前駆体のプレプロ配列に由来するシ グナルの結果としてプロセッシングを受けることができる。従って、ヒルジン配 列を有するポリペプチドが培養上澄み中に回収されるであろうと期待される。

これらの構成の一つにおいては、ｓｅｔ配列が、Ｈ遺伝子に先行する３′末端に ＡＴＧコドンを含有する；従って、融合蛋白質は、成熟型ヒルジン配列の最初の アミノ酸のすぐ上流にメチオニンを含有する。臭化シアンで切断すると、このポ リペプチドはヒルジン分子を生じ、これは復元段階で活性とすることができる。

他の構成では、αフェロモン産生のために普通用いられる切断シグナルが、培養 上澄み中に抗トロンビン活性をもつポリペプチドを産生ずるのに役立つ。配列Ｓ ｃｌがＬｙｓ−Ａｒｇをコードする２つのコドン、即ち、ＡＡＡ又はＡＡＧとＡ ＧＡ又はＡＧＧを３′末端に含む場合がそうである；ポリペプチドは、Ｃ０ＯＨ 側のＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドを切り離すエンドペプチダーゼによって切断され 、ヒルジンを遊離する。　・ 本発明はとりわけ、ヒルジン遺伝子に先行する配列が次のアミノ酸配列のいずれ かをコードする構成に関する＝１）　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ 　Ａｌａ　Ｔｒｐ　ＬｅｕＧｉｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　、Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ 　ヒルジン・・・・・・２）　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌ ａ　ヒルジン・・・４）　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ、Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｌｅｕ　ＡｓｐＴｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ヒルジンまたは５）　Ｌｙｓ　Ａｒｇ 　ヒルジン・・・・・・・・・アミノ酸レベルで酵素により選択的に切断される 他の配列を用いることももちろん考えうる。ただし、この切断部位がヒルジン自 体の中にも存在していてはならない。

最後に、発現ブロックはＨ遺伝子の後方に、酵母のターミネータ−配列、例えば ＰＧＫ遺伝子のそれを有していてもよい。

一般に、本発明の発現ブロックは、独自的に複製するプラスミド或いは酵母染色 体の中へ組込んで酵母、特にサツカロマイセス内に導入しても良い。

プラスミドが独立存在性である場合、それはその複製に備えての要素、すなわち ２μプラスミドのそれの如き複製開始点を含むであろう。更に、該プラスミドは 、ｕｒａ３−又は１ｅｕ２−酵母の相補正性を与える選択要素、例えばＵＲＡ３ 又はＬＥＵ２遺伝子を含んでいてもよい。これらのプラスミドは、プラスミドを 「シャトル」プラスミドとしなければならないときに細菌中でのそれらの複製を 行なう要素、例えばｐＢＲ３２２のそれの如き複製開始点、Ａｍｐ　ｒの如きマ ーカー遺伝子及び／又は当業者に既知の他の要素をも含みうる。・本発明はまた 、本発明の発現ブロックにより形質転換された酵母株に関し、該ブロックはプラ スミドに担持されていでも或いはその染色体に組込まれていてもよい。

これらの酵母の中でも、サツカロマイセス属の酵母、特にＳ、セレヴイシアエに 特に言及しなければならない。

プロモーターがαフェロモン遺伝子のそれ・である場合、酵母は性タイプがＭＡ Ｔαのものであることが好ましい。

例えば、遺伝子型がｕｒａ３−又は１　ｅｕ２−等で、適切な淘汰圧を加えて酵 母中でプラスミドが維持されるようにプラスミドを導入された酵母株を用いる。

適当な培地中で上記形質転換株を培養し、細胞内にヒルジンを蓄積させることに より、ヒルジンを調製することも可能であるが、上記説明かられかるように、ヒ ルジ゛　ンを、成熟型で又はインヴイトロでプロセッシングに付されるべ前駆体 の形で、培地中に分泌させることがより好ましい。

この成熟化は、幾つかの段階で実施できる。まず、Ｌｅｘ配列の翻訳で生じた成 る種の要素を切断する必要があるかもしれない。この切断をＳｃｌに相当する配 列についても行なう。上に述べたように、成熟型ヒルジンには臭化シアンにより 選択的に切断されるメチオニンが先行していてよい。ヒルジンをコードする配列 は、メチオニンを含んでいないので、この方法を利用できる。

特定のエンドペプチダーゼによりＣ０ＯＨ側で切断されるＬｙｓ−Ａｒｇジペプ チドをＮ末端に配置することも可能である；この酵素は分泌過程においても活性 であるので、このようにして成熟型蛋白質を直接培地中に得ることが可能である 。しかしながら、場合によっては、特定の酵素を添加して分泌後に酵素的切断を 行なうことも必要である。

場合によっては、特に臭化シアン処理の後に、ジスルフィド橋を再形成すること による復元が必要であるかも知れない。このためには、ペプチドを例えば塩酸グ アニジンを用いて変性し、次に還元型及び酸化型グルタチオンの存在下に復元す る。

最後に、本発明は、本発明のプロセスによ・って得られたヒルジンに関する。

本発明のその他の特質及び長所は以下の実施例を読めば明かになるであろう。

第１図は、ｐＴＧ７１７中にクローンされたヒルジンｃＤＮＡ断片のヌクレオチ ド配列を示す。

第２図は、α性フエロモン前駆体のヌクレオチド配列を示す。

第３図は、ｐＴ０８３４の構築法を模式的に示す。

第４図は、ｐＴＧ８８０の構築法を模式的に示す。

第５図は、ｐＴＧ８８２の構築法を模式的に示す。

第６図は、Ｍ１３ＴＧ８８２の構築法を模式的に示す。

第７図は、ｐＴＧ８７４の構築法を模式的に示す。

第８図は、ｐＴＧ８７６の構築法を模式的に示す。

第９図は、ｐＴＧ８８１の構築法を模式的に示す。

第１０図は、ｐＴＧ８８６の構築法を模式的に示す。

第１１図は、ｐＴＧ８９７の構築法を模式的に示す。

第１２図は、ｐＴＧ８８６及びｐＴＧ８９７によって形質転換された酵母を培養 した後の培地中に得られたＭＷ＞１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気泳 動図を示す。

第１３図は、ｐＴＧ８８６及びｐＴＧ８９７によって形質転換された酵母を培養 した後の培地中に得られたＭＷ＞１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気泳 動図を示す。

第１４図は、ｐＴＧ１８０５の構築法を模式的に示す。

第１５図は、ｐＴＧ８４７及びｐＴＧ１８０５によって形質転換された酵母を培 養した後の培地中に得られたＭＷ＞１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気 泳動図を示す。

第１６図は、種々の構成物質中の最初の切断位置（Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｒｇ）から 下流のアミノ酸配列の比較を示す図である。

本明細書をわずられしくないよう、本明細書ではアミノ酸配列及びヌクレオチド 配列を反復させていないが、それらも本明細書の明かな一部となるものである。

実施例１−ｐＴＧ８２２の構築 ヒルジンＨＶ−２のｃＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴは成熟型ヒルジン配列の最 初のコドンの下流で切断する。

酵素Ａ　ｈａｍはヒルジン配列の停止コドンを（３′）の後方約３０塩基対のと ころで切断する。こうして得たＨ　ｉｎｆ、　Ｉ　−ＡｈａＩ［［断片をアガロ ースゲル上で単離し、このゲルから溶出した。

成熟型蛋白質をコードする配列をベクターｐＴＧ８８０に導入した。ベクターｐ ＴＧ８８０は、ベクターｐＴ０８３８の誘導体である（第３図）。プラスミドｐ ＴＧ■切断部位に関する以外はｐＴＧ８３３と同じである。

この部位をフレノウポリメラーゼの埋め込み（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）作用によ って除去したものがｐＴＧ８３８である。

プラスミドｐＴＧ８３３は、酵母／Ｅ、ｃｏｌｉシャトルプラスミドである。こ のプラスミドは、酵母中での異種遺伝子発現用に設計した。このベクター（第３ 図）の基本的要素は次のものである：酵母中での選択マーカーとしてのＵＲＡ３ 遺伝子、酵母２μプラスミドの複製開始点、Ｅ、　ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ３ ２２のアンピシリン耐性遺伝子と複製開始点（これらの２要素はこのプラスミド の大腸菌中での増殖と選択を可能にする）、酵母ＰＧＫ遺伝子の５ａｌＩ部位ま でをコードする配列をもったこの遺伝子の５′フランキング（側面を接する）領 域、ｐＢＲ３２２の５ａｌＩ−ＰｖｕＩＩ断片及びＰＧＫ遺伝子ターミネータ− （１９）。このプラスミドは、既に本出願人の１９８４年５月９日に提出のフラ ンス特許出願第８４１０７１２５号中に記載されている。

ＥｃｏＲＩ及び旦ｇｌＩＩで切断したｐＴＧ８３８に短いポリリンカー領域（バ クテリオファージＭ１３由来）を挿入することによりｐＴ０８３８　（第４図） からプラスミドｐＴＧ８８０を構築した。それは、酵母ＰＧＫ遺伝子に接する５ ′領域のすぐ後方に一連のロクーニング部位をＢｇｌｌＩ、ＰｓｔＩ、Ｈｉｎｄ 　ｍ、ＢａｍＨＩ　、ＳｍａＩ及び旦ｃｏＲＩの順序で配置することを可能にす る。プラスミドｐＴＧ８８０のＤＮＡをＢｇｌＩｒ及びＳ　ｍａ　Ｉ　テ消化り 、、この消化で生じた大きい断片を単離し、ゲルから溶出した。

ヒルジンＭＶ−２をコードする配列の大部分を含存するｐＴＧ７１７のＨｌｎｆ 　Ｉ−ＡｈａＩ［断片を、消化ｐＴＧ８８０並びにヒルジン配列のＮＨ２末端領 域の再構成を意図した３種の合成オリゴヌクレオチド（第５図）と混合した。そ れらヌクレオチドは、ベクターの且■■部位をヒルジン含有断片のＨｉｎｆ　Ｉ 部位に再連結するものであｃｏｌｔ細胞の形質転換に用いた。形質転換体中にプ ラスミドｐＴＧ８２２が回収された。

このプラスミドは、ＰＧＫプロモーターの支配下にヒルジンを生産する目的で酵 母細胞の形質転換にも用いた。

しかしながら、このベクターで形質転換した細胞の粗抽出物中にはヒルジン活性 が検出されなかった。活性ヒルジンの産生が見られなかった理由は未だ不明であ る。しかし、構築したｐＴＧ８８２は、下記酵母分泌ベクター用のヒルジンをコ ードする配列の供給源として役立った。

ＥｃｏＲＩ断片（２３０ｂｐ）をバクテリオファージＭ１３ｍｐ８　（第６図） のＢａｍＨＩ部位と且匹ＲＩ部位との間へ移した。これによりファージＭｌＢＴ Ｇ＄８２が得られ、これよりＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍ断片（約２４５　ｂ　 ｐ）を単離することができた。この断片はヒルジンＨＶ−２全体をコードする配 列、Ｂａｍ１（Ｉ／ＢｇｌＩＩ融合部位及び酵母分泌ベクターｐＴＧ８８１　（ 第９図）へのクローニ及びサッカロイマイセス・セルヴイシアエのウヴアルム（ ｕｖａｒｕｍ）株及びカルルベルゲンシス（ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ　）ン （及び他のβ−ラクタム抗生物質）への抵抗性を得ることができる。更に、この プラスミドは、Ｅ、　ｃｏｌｔ及びサツカロマイセスの諸株中で発現される酵母 遺伝子ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を担持している。従って、旦、並置又はサツカロマ イセス中にこのプラスミドが存在すれば、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲ ナーゼ又はＯＭＰデカルボキシラーゼ欠損株の相補性を得ることができる。

プラスミドｐＴＧ８８１は次のようにして構築する：出発プラスミドはｐＴＧ８ ４８　（ｕｒａ３遺伝子の向きが逆になっている以外はフランス特許第８，３／ １５７１６号に記載されているｐＴＧ８４９と同一である）であり、それは次の ＤＮＡ断片からなる（第７図）。

１）プラスミドｐＪＤＢ２０７　＜１７）由来の約３．３ｋｂのＥｃｏＲＩ　− Ｈｌｎｄ　ｍ断片。ＨｉｎｄＩＩ［部位は２μプラスミドＢ型の座標１０５に相 当し、ＥｃｏＲＩ部位は座標２２４３に相当する。この断片には、Ｂ型２μ断片 のＰｓｔＩ部位でのポリデオキシアデニレート／ポリデオキシチミジレートによ ってＬＥＵ２遺伝子が挿入されている（１７）； ２）ＵＲＡ３遺伝子のＨ１ｎｄｍ断片（１８）；３）ｐＢＲ３２２の大きいＥｃ ｏＲＩ（座標０）−８ａｌＩ−Ｈ１ｎｄｕ断片（その両端は４種のヌクレオチド の存在下にフレノウ酵素の作用により前もって平滑にされている）が挿入されて いる（１９）。ｐＢＲ３２２のＰｖｕＩＩ末端にＰＧＫ遺伝子の削られたＥｃｏ ＲＩ末端を結合すると、ＥｃｏＲＩ部位が再生される；４）ＰＧＫ遺伝子（１９ ）のＨ１ｎｄ゛Ｉ［ｌ−８ａｌＩ断片（２，１５ｋｂ）。

レオチドの存在下にフレノウ酵素で処理して平滑化する。

２断片のライゲーションを行ない。形質転換前に、このライゲーション混合物に Ｈ１ｎｄ■を作用させる。これによりＨｌｎｄＩ［部位（１ケ所又は２ケ所）を 保持してきたあらゆるプラスミド形態を除去できる。Ｅ、　ｃｏｌｔ（７）ＢＪ ５１８３　（ｐｙｒ　Ｆ）株を形質転換し、形質転換体をアンピシリン抵抗性及 びｐｙｒ＋性で選択する。かくしてプラスミドｐＴＧ８７４が得られる（第７図 ）。そこでは、２ケ所のＨｉｎｄＩ［Ｉ部位が除去され、ＵＲＡ３遺伝子の配置 がホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のそれとと同じ方向の転写を起 こさせるようになっている。

プラスミドｐＴＧ８７４をＳｍａＩ及び５ａｌＩで切断し、８．６ｋｂの断片を アガロースゲルから単離する。ｐＢＲ３２２の同じ部位にクローニングされたＭ Ｆα１遺伝子のＥｃｏＲＩ−８ａｌＩ断片（約１．４ｋｂ）を含むプラスミドｐ ＴＧ８６４をＥｃｏＲＩで切断する。この様にして線状としたプラスミドの両端 を４種のヌクレオチドの存在下にフレノウ酵素の作用により平滑化する。次に酵 素５ａｌＩで消化を行ない、ＭＦα１遺伝子に相当する旦ｃｏＲＩ（平滑端）− ΣａｌＩ断片を単離する。後者の断片をｐＴＧ８７４のＳｍａＩ−８ａｌＩ片（ ８，６ｋｂ）とライゲートすることにより、プラスミドｐＴＧ８７６を得る。（ 第８図）。

ＭＦα１プロモーター配列の近位の旦虹■部位を無くすべく、プラスミドｐＴＧ ８７６のＢｇｌＩＩ部位による部分消化に引続いて、４種のデオキシリボヌクレ オチドの存在下にフレノウ酵素を作用させる。得られた新しいプとの間に異種コ ーディング配列を挿入することができる。

り同じ読取り位相で翻訳が行なわれうるようになると、得られたハイブリッド蛋 白質はαフェロモンのプレプロ部分を含むことになる。

ヒルジン遺伝子を有するＨｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＩ断片をｐＴＧ８８１にクロ ーニングすると、プラスミドｐＴＧ８８６が得られる（第１０図）。クローニン グを行なった後では、この断片から下流にＢｇｌＩＩ部位があり、これによりそ の断片をＨｌｎｆ　Ｉ　−ＢｇｌｌＩ形で再抽出することができる。Ｈｆｎｆ　 １部位は上で用いたものと同じである。

ルジンの５′配列を再構成する３種のオリゴヌクレオチ熟ヒルジン配列とが読取 り枠をそろえて読み取られるようにすることは極めて容易である。

この新しいプラスミドはｐＴＧ８９７として知られる（第１１図）。

実施例３−酵母によるヒルジンの発現 ｐＴＧ８９７のＤＮＡを用いて、既に記載されている１５）酵母をｕｒａ＋に形 質転換した。

形質転換コロニーを継代培養し、１０回の最小培地プラス　カザミノ酸（０，５ ％）への播種に用いた。２０時間培養後、細胞を遠心分離し、上澄みを蒸留水に 対して透析し、蒸発（真空下の遠心）により濃縮した。

平行して、ｐＴＧ８８６により形質転換したＴＧＹＩｓｐ４の培養及びヒルジン をコードする配列をもたないプラスミドで形質転換したＴＧＹＴＩｓｐ４の培養 （ＴＧＹＩ　ｓｐ４／ｐＴＧ８５６）を同様に処理した。

乾いたペレットを５０μＱの水にとり、２０μＱを２．８％ＳＤＳと１００ｍＭ メルカプトエタノールとの存在下に煮沸し、次いでアクリルアミド−８ＤＳ　（ １５％アクリルアミド：０．１％５ＤＳ）ゲル上にのせた（２１）。固定し、ク ーマシーブルーで染色すると、ＴＧＹＩ　ｓｐ４／ｐＴＧ８８６及びＴＧＹＩｓ ｐ４／ｐＴＧ８９７の培養上澄み中に蓄積したポリペプチドを検出できるが、対 照培養の上澄み中にはそれらが存在しない（第１２図）。更に、これら一連の付 加ペプチドを［３５Ｓ］　システィンで重く標識すると、ヒルジンペプチドにつ いて予測できるように、分子はシスティンに極めて富んでいる（第１０図）。

−第１２図及び第１３図に示した電気泳動パターンは次のようにして製出した： 第１２図の場合は、抽出物質を次のようにして調製した：１０−の最小培地［ア ミノ酸なしのイーストナイトロジエンベースデイフコ（６，７ｇ／Ｑ　）及びグ ルコース（１０ｇ／（２）］にカザミノ酸を０．５％加え、種々の株をうえ、２ ０時間培養した（定常期）。細胞を遠心分離し、上澄みを水に対して透析しく最 小滞留分子量１０００）、真空下の遠心により乾燥した。次に試料を負荷（ロー ディング）用緩衝液５０μＱに取り、その２０μＱを上述の通り処置し、アクリ ルアミド−３ＤＳ　（１５％アクリルアミド、０．１％５ＤＳ）（２１）にのせ た。

用いた株は次の通りである： ウエル２：ヒルジン配列を含まないプラスミドで形質転換したＴＧＹ１ｓｐ４　 （対照）； ウェル３　：　Ｔ）ＴＧ８８６で形質転換したＴＧＹＩｓｐ４ウェル４　：　ｐ ＴＧ８９７で形質転換したＴＧＹＩｓｐ４ウェル１：ウェル１には標準マーカー を入れた（ファルマシアＬＭＷキット：上から下へ：　９４０００．６７０００ ．４３０００．３００００　、２０１００．１４０００　）。

バンドはクーマシープルーＲ−２５０により染色して可視化した。

第１３図の場合には、抽出物質を次の通りに調製した＝１００ｍＧの最小培地＋ ４０μＱ／ＷＱのヒスチジンに種々の株をうえ、−夜培養した。細胞密度が約５ Ｘ１６６（対数増殖期）に達したとき、３５　Ｓシスティン（９，８ｍＣｉ／Ｔ ＩＩＱ；　１．０１５Ｃｉ／ｍｍｏ　１）４０μＱを各培養に加えた。１０分後 に細胞を遠心分離し、完全培地（３０℃）１０ｍ１２にとり、攪拌下に３０℃で インキュベートした。３時間後に上澄み１０ｍＧを水に対して透析し、第１２図 の場合について記載したようにして体積０．５鵬まで濃縮した。約３５０００ｃ ｐｍ　（４０μＱ）をアクリルアミド−８ＤＳ　（１５％アクリルアミド、０． １％５ＤＳ）ゲルにのせた。蛋白質バンドはフルオログラフィー後に可視化した 。

用いた株は次の通りである： ウエル２：ヒルジン配列を含まないプラスミドにより形質転換したＴＧＹＩｓｐ ４　； ウェル３　：　ｐＴＧ８８６により形質転換したＴＧＹＩｓウェル４　：　ｐＴ Ｇ８９７により形質転換したＴＧＹＩｓウェル１：ウェル１には表示の分子量（ ×１０３）を有するマーカーを入れた。

しかし、これらのポリペプチドを含有する上澄みを抗トロンビン活性について試 験したところ、活性を検出できなかった。

ＴＧＹＩ　ｓｐ４／ｐＴＧ８８６により分泌されたポリペプチドの場合、これは 、αフェロモン前駆体の正常な段階の切断を受けると予期され、そのためＮＨ２ 末端に８個のアミノ酸の延長されたヒルジンが得られるであろう。従って、ＴＧ ＹＩ　ｓｐ４／ｐＴＧ８８６細胞により分泌されたポリペプチドが活性でないの は驚くには当たらない。

これに対し、ＴＧＹＩ　ｓ　ｐ４／ｐＴＧ８９７により分泌されたポリペプチド の場合には、このポリペプチドは１）蛋白質の成熟が不完全で、ＥＧＦについて 記載されている（１４）のように、Ｇｌｕ−Ａｌａ　残基がＮＨ２末端に残って いる可能性がある。

２）蛋白質が正しいコンホメーションをもっていないため、或いは培養上澄み中 に活性を阻害する分子量１０００の蛋白質又は分子が存在するため、蛋白質が不 活性である。

３）細胞内及び／又は細胞外で蛋白質分解を受けたため活性欠如の原因がＮＨ２ 末端に負荷的なアミノ酸が存在していることに関係があるのであれば、ＴＧＹＬ ＳＩ）４　／　ｐ　Ｔ　Ｇ　８８６が分泌したペプチドを臭化シアンによる切断 に付すことによって活性を回復することが可能であろう。この試剤は、実際、メ チオニン残基に対して特異性をもち、ｐＴＧ８８６がコードする融合蛋白質はメ チオニンを１個しか含まない。この反応は次のようにして行なったニブラスミド ｐＴＧ８８６を含む酵母又はヒルジン挿入部を含まない対照プラスミドを含む酵 母を１０−の培地中で２４時間培養する。この時点で培養は７乾燥する。乾燥粉 末を７０％蟻酸１ｍＧに溶かし、１アリコートを用いて総蛋白質含量を測定する （クーマシーブルー染色法、バイオライド社市販試薬による染色法）；調製液の 残部を新鮮な臭化シアンの７０％蟻酸溶液（３０ｎｇ／ｍ１２）１ｍＧで処理す る。

窒素気流により酸素を除去した後、チューブを暗所で室温にて４時間インキュベ ートする。臭化シアン存在下の操作は全て適切な注意を払い、ドラフト内で行な う。

臭化シアンにより切断反応を１０倍量の蒸留水の添加によって停止しついで溶液 を凍結乾燥する。

切断ペプチドを蒸留水１０−に再溶解し、再凍結乾燥し、これをもう一度繰返す 。最後に、ペプチドを少量の蒸留水に溶解し、１アリコートを抗トロンビン活性 の測定に用いる。試料の残部を凍結乾燥し、下記の復元工程に付す。

ヒルジン活性は分子中のジスルフィド結合の存在に依存している（１）ので、臭 化シアンで切断したペプチドを正確に復元して生物活性を示すようにしなければ ならないように思われる。従って、切断したペプチドを５ＭＧｕＨＣ（２中で変 成した後、当業者に既知の方法に従って復元した。

要約して言えば、凍結乾燥したペプチドを５Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣＩ２） の２５０ｍＭ）リスＨＣｌ２溶液、（ｐＨ９，０）４００μＱに溶かす；次いで 溶液を還元型グルタチオン中で２ｍＭ、酸化型グルタチオン中で０．２ｍＭとし 最終体積２．　Ｏｒ［ｌＧとする（最終濃度は１．０ｍＭ　ＧｕＨＣ１２，５０ ｍＭ）リス）。

暗所にて２３℃で１６時間のインキュベーションの後、試料を５０ｍＭｈリスー ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）９．５０ｍＭＮａＣＱを含む２Ｑに対して３回２３℃で ２４時間透析し、最終透析物を遠心分離により澄明化する。

ついで上澄みの抗トロンビン活性を測定する。第１表に示したこの実験の結果、 プラスミドｐＴＧ８８６に感染させた細胞の上澄み中に抗トロンビン活性が回復 していることを明瞭に示している。対照プラスミドの場合には活性ない。

第　１　表 酵母培養上澄みの抗トロンビン活性 プラスミド　上澄みの処理　活　性　比活性Ｕ／　ｍＱ　Ｕ／ｍｇ初期蛋白質 ｐＴＧ８８８　ａ）切断後復元前　＜０．３ｂ）切断復元後　２．４８　１０２ ．５対　照　ａ）切断後復元前　＜０．３−ｂ）切断後復元後　＜　０．１５　 ＜　５．６結論として、組換えプラスミドを担持する酵母細胞は、切断反応と復 元反応との後にヒルジンの生物活性をもつペプチドを、分泌できると言える。こ れにより、ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６培養物中に存在するポリペプチドに活 性がないのはＮＨ２末端に余分なアミノ酸が存在することで充分に説明できるこ とが示される。ＴＧＹ　１ｓ、、ｐ　４／　ｐ　ＴＧ８９７培養物の場合（Ｇｌ ｕ−Ａｌａｌゴテ）も多分そうであろう。

１％Ｊ５　ヒルジンＨＶ−２をコードする配列の最初のアミノ酸の直前への新し い切断部位の導入−プラスミドｐＴＧ１８０５ ｐ　ＴＧ８９７の構築では、分泌されたペプチドがＮＨ２末端にＧｌｕ−Ａｌａ ｌゴテを保持しているおそれ（それによりこの物質に抗トロンビン活性が欠けて いることを説明できよう）がある。この仮説が当たっているとにより、上澄み中 で直接活性を回復できるであろう。

これを、フェロモン前駆物質（第２図）の成熟に係わるエンドペプチダーゼの認 識部位であるＬｙｓ−Ａｒｇダブレットをコードする配列を付加することにより 実行した。

構築は、２種の合成オリゴヌクレオド（第１４図）の配列に関する以外は、正確 にブラスミｋｐＴＧ８９７について記載したと同様にして得た。得られたプラス ミドをｐＴＧ１８０５と呼ぶ。このプラスミドを用いてＴＧＹｌｓｐ４株をｕｒ ａ＋に形質転換した。上澄み中へ分泌された物質を上記と同様のゲル電気泳動法 により分析し、ＴＧＹＩ　ｓｐ４／ｐＴＧ８９７を用いて得た物質と比較した（ 第１５図）。

使用した株は次の通りである： ウエル１：第１２図のものと同じマーカー；ウェル２　：　ｐＴＧ８９７で形質 転換したＴＧＹＩ　ｓ　ｐ４　；ウェル３　：　ｐＴＧ１８０５で形質転換した ＴＧＹＩ　ｓ　ｐ４； ウェル４：ヒルジンを産生じない対照。

ＴＧＹＩｓｐ４／ｐＴＧ１８０５株に特異的なポリペプチドは、ＴＧＹＩ　ｓ　 ｐ４／ｐＴＧ８９７株に特異的なそれらよりもゆっくりと移動する。この結果は 、新しい切断部位が相当するエンドペプチダーゼによって有効に利用されていな いことを示唆する。しかし、上澄み中のヒルジンをその生物活性に基いて定量す ると、この物質のわずかな部分が、物質が明瞭に不活性なＴＧＹＩｓｐ４／　ｐ 　Ｔ　Ｇ　８９７の培養で得られるところとは対照的に、活性であることがわか る（第２表）。

第２表 酵母培養上澄み（１０ｍ（１）中の抗トロンビン活性プラスミド　比活性Ｕ／ｍ ｇ　総括性Ｕ（１０ｍＱ）ｐＴＧ８５６　検出できず　− ｐＴＧ８９７　検出できず ｐＴ０１８０５　’２１　２．０ 実施例６　成熟型ヒルジンの遊離を可能にする新しい、より有効な切断部位を包 含する新構築物上記構築（ｐＴＧ８９７）では、上澄み中に少企のヒルジン活性 しか得られなかったが、これは多分、成熟型ヒルジンの遊離のため設計した第二 の切断部位の認識が効率的でないからであろう。従って、この付加切断部位の上 流に、天然には最初のＬｙｓ−Ａｒｇダブレットの上流に存在する３つのアミノ 酸の配列Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｐを併行なった（第２図及び第１６図 ）。

用いた手法は、オリゴヌクレオチドの配列が次の通りであること以外は上に記載 したものと同じである：切断領域のアミノ酸配列は第１６図に示されている。

相当するプラスミドをｐＴＧ１８１８と呼ぶが、これは、Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ 　−Ａ　ｓｐのコドンに相当するヌクレオチド５′−ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡが 挿入されている点でのみｐＴＧ１８０５と異なる。

既に記載されている標準的条件に従って、ＴＧＹＩｓｐ４／ｐＴＧ１８１８の培 養上澄み中で測定された活性は、培養液１０−当り約２００単位で、前の実施例 で見出された活性の約１００倍に相当する。未濃縮培養液１０ｍ１を用いてアッ セイを実施できることは注目すべきことである。

合成に導く構成 上記２つの実施例で、成熟ヒルジン配列の冒頭のすぐ上流に新しいＬｙｓ−Ａｒ ｇ部位を付加することが、上澄み中への活性物質の遊離を可能ならしめることが 示された。

しかし、それらの実施例では、前駆体の切断が最初のＬｙｓ−Ａｒｇ部位（成熟 型配列の冒頭からみて遠位）で起る一方、ＮＨ２末端で延長されたヒルジン鎖に 相当するより重い不活性不純物が培養液中に得られうる。これは、不活性不純物 が多くを占めるＴＧＹＩｓｐ４／ｐＴＧ１８０５の場合にとくに明瞭である。Ｔ ＧＹＩ　ｓ　ｐ４／ｐＴＧ１８１８の培養の場合にも依然同様で、不活性不純物 が多くを占めはしないが、ＥＧＦの場合について他の研究者が記載している（１ ４）ように存在しうるであろう。不活性物質の合成で表わされるこの収率上のロ スを避けるべく、Ｌｙｓ−Ａｒｇ切断部位と成熟型ヒルジン配列の最初のアミノ 酸との間にＧ　ｌｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ配列がない点でのみ ＴＧＹＩｓｐ４／ｐＴＧ８９７細胞が合成するものと相違するだけの前駆体の合 成に導く新しい構成を取り上げることとした。

次の酵母株を、１９８５年４月３０日に、パリ市１５区ドクテユールールー通り ２８番地のパスツール研究所付属国立微生物培養コレクション（ＣＮＣＭ）に寄 託ずみであるニ ー　ＴＧＹＩ　ｓ　ｐ４／ｐＴＧ１８１８　ニブラスミドｐＴＧ１８１８により ｕｒａ＋に形質転換されたサツカロマイセス挙セレヴイシアエＴＧＹ１　ｓ　ｐ ４／　（ＭＡＴαｕｒａ３−２５１−３７３−３２８−ｈｉｓ３−１１−１５） 株；寄託番号Ｉ４４１゜ −ＴＧＹｌ　ｓ　ｐ４／ｐＴＧ８８６　ニブラスミドｐ　ＴＧ８８６によりｕｒ ａ十に形質転換されたサツカロマイセス・セレヴイシアセＴＧＹＩ　ｓｐ４　（ ＭＡＴａｕ　ｒａ３−２５１−３７３−３２８−ｈｉ　５３−１ｌ−１５）株； 寄託番号Ｉ４４２ 参考文献 １、ディー、バジー（Ｄ、ＢＡＤＧＹ）　、イー、バラバス（Ｅ、ＢＡＢＲＢＡ Ｓ）　、エル、グラフ（Ｌ、　ＧＲＡＦ）　、ティー、イー、ベーターセン（Ｔ 、　Ｅ、　ＰＥＴＥＲ８ＥＮ）及びニス、マグナソン（Ｓ、ＭＡＧＮＵＳＳＯＮ ）（１９７６）　“メソツズ　イン　エンザイモロジー　バー）Ｂ”　（Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｐａｒｔＢ）　、ｖｏｌ、４５．　１） Ｔ）、６６９〜６７８２、エフ、マークワ−）　（Ｆ、ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）（ Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、１９．　ｐ　ｐ、９２ ４３、エフ、マークワード（Ｆ、ＭＡＲＫＷＡ、ＲＤＴ）、ジュー。ハウブトマ ン（Ｊ、ＨＡＵＰＴＭＡＮＮ）、ジー、ノバク（Ｇ、Ｎ０ＷＡＫ）１、シーエイ チ、クレツセン（Ｃｈ、ＫＬＥＳＳＥＮ）及びピー、ワルスマン（Ｐ、ＷＡＬＳ ＭＡＮＮ）（１９８２）　“トロンボ、ヘモスタシス”　（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈｅ ｍｏｓｔａｓｉｓ　）シュトットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）　４７．２２６ 〜２２９４、ピー、ワルスマン（Ｐ、ＷＡＬＳＭＡＮＮ）及びエフ、マークワー ド、（Ｆ、ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）（１９８１）“ディー　ファルマツイー”　（ ＤｉｅＰｈａｒｍａｚｉｅ）　１０．　６５３〜６６０５、テイーエイチ、クロ ス（Ｔｈ、ＫＬＯ８Ｓ）及びニー、ミツトマン（Ｕ、ＭＩＴＴＭＡＮＮ）　“ロ ンゲンベツクス　アルヒ、チルールク”　（Ｌ　ｏｎｇｅｎｂｅｅｋｓ６、エイ 、インカワ（Ａ、ｌ５ＨＩＫＡＷＡ）、アール。

ハフター（Ｒ，ＨＡＦＴＥＲ）　、ニー、ゼーミュラ−（Ｕ、ＳＥＥＭＵＬＬＥ Ｒ）　、ジエイ、エム、ゴーケル（Ｊ、Ｍ、ＧＯＫＥＬ）及びエム、グローフ（ Ｍ。

ＧＲＡＥＦＦ）（１９８０）　“トロンボシス　リサーチ”’　（Ｔｈｒｏｍｂ ｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）１９．３５１〜３５ジー、ノバク（Ｇ、Ｎ０Ｗ ＡＫ）　、ジエー、′シュトウルツエベルガー（Ｊ、５ＴＵＲＺＥＢＥＲＧＥＲ ）、ニー、グライスバデイ（Ｕ、ＧＲＥＩＳＢＡＤＩ）、ピー、ワルスマンＣＰ 、ＷＡＬＳＭＡＮＮ）及びジー。

フォーゲルＣＧ、ＶＯＧＥＬ）　“トロンボ　ヘモスタシス”　（Ｔｈｏｍｂ、 Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　）シュトットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）　５２．　 １６０〜１６３　。

８、シー、ノバク（Ｃ，Ｎ０ＷＡＫ）及びエフ、マークワ−）　（Ｆ、ＭＡＰＫ ＷＡＲＤＴ）（１９８０）　“エクスペリメンタル　パソロジー”　（Ｅｘｐｔ 　、Ｐａｔｈ　、　）１８．４３８〜４４３ ９、ニー、エイチ、スーター（Ａ、Ｈ，５ＵＴＯＲ）、ニス、クツツブ（Ｓ、Ｋ ＮＯＰ）及びディー、アドラー（Ｄ、ＡＤＬＥＲ）　“コントローレ　アンテイ トロンボチカ”　（Ｋｏｎｔｒｏｌｌｅ　Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａ）　 ２３回シンポジウム　ブルートゲリンヌング （Ｂ　ｌｕｔｇｅｒｉｎｎｕｎｇ）　）’ンブルク（Ｈａｍｂｕｒｋ）　Ｓｐ　 ｐ。

１１７〜１２３ ｉｏ、ティー、イー、ベーターセン（Ｔ、Ｅ、ＰＥＴＥＲ５ＥＮ）、エル、ソト ラツプーイエンセン（Ｌ、Ｓ。

ＴＴＲＵＰ−ＪＥＮ’５ＥＮ）　、ニス、マグナソン（Ｓ。

ＤＧＹ）（１９７６）　“プロタイズ　ビオ口、フルイズ、ブロク、コロク、　 ”　（Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　Ｂｉｏｌ、Ｆｌｕｉｄｅｓ。

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ＭＯ８ＯＬＯＶ）（１９８３）　”）Ｏンボシス　リサーチ”　（Ｔｈｒｏｍｂ 、Ｒｅｓ、）３０，４５９〜４６７１３、エイチ、バツセイ（Ｈ，ＢＵＳＳＹ） 　、ディー、サビール（Ｄ、５ＡＶＩ　ＬＬＥ）　、ディー、グリーン（Ｄ、Ｇ ＲＥＥＮＥ）他（１９８Ｂ）　“モル、セル。

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ニー、ヘーバーライン（Ｕ、Ａ、ＨＥＢＥＲＬＥＩＮ）、エフ、アール、マリア ーツ（Ｆ、Ｒ，ＭＡＲＩＡＲＥＮＢＡＣＨ）　、エム、ニス、ウーデア（Ｍ、Ｓ 、ＵＲＤＥＡ）、ピー、バレンスエラ（Ｐ、ＶＡＬＥＮＺＵＥＬＡ）及びピー、 ジエイ、バー（Ｐ、Ｊ、ＢＡＲＲ）（１９８４）　“プロシーディンゲス　オブ 　ザナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス　オブザ　ニー、ニス、エイ”　 （Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　。

Ｓｅｔ、ＵＳＡ）８１．４６４２〜４６４６１５、ジー、エイ、ビター（Ｇ、Ａ 、Ｂ　ＩＴＴＥＲ）　、ケイ、ケイ、チェノ（Ｋ、に、ＣＨＥＮ）　、エイ、ア ール、バンクス（Ａ、Ｒ，ＢＡＮＫＳ）及びピー、エイチ、ライ（Ｐ、Ｈ，ＬＡ Ｉ）（１９８４）　“プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ− オブ　サイエンス　オブ　ザ　ニー９ニス、エイ“　（ＰＩ３、ジエイ、カージ ャン（Ｊ、ＫＵＲＪＡＮ）及びアイ。

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ＦＵＫＵＤＡ）　、ケイ、ムラタ（Ｋ、ＭＵＲＡＴＡ）及びエイ、キムテ（Ａ、 ＫＩＭ’ＵＲＡ）（１９８３）“ジャーナル　オブ　バクテリオロジー″　（Ｊ 。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　１５３．　１６３〜１６８２１、グイ。ケイ、シー 、レムリ　（、に、Ｃ，ＬＡＥＭＭ６８０〜６８５ ２２、ダブリュー、クラマー（Ｗ、ＫＲＡＭＥＲ）　、ケイ。

−、ヤンセン（Ｈ，Ｗ、ＪＡＮＳＥＮ）その他（１９ＦＩＧ−３、、、、、・− ・・ら１　・・・・ズＩ・含ｐづ）′シへイし、８ｇ１ＺＩ クレノウん工！ （Ｃｏ　ｌ’Ｌｌ＋　１１ｇ１　ｘｕ　Ｉ＝よる５自化＋ ポリリンカー冷貝ヱ烏、（巳９１１１．Ｅｃｏ日１）Ｍ１３　変１才！ ＋　３”−の合床オリゴヌクレオチド Ｗ９質耘諌：貼弧、ρｙｒＦ− １１　ｍｅｒ　１５　ｍａｒ ｌ　２　３　４ ＋　〇ネ皇のオリゴヌクレオチド １７　ｍｅｒ　１５　ｍｅｒ ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰ ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １酵母からのヒルジンの調製を可能ならしめる機能性ＤＮＡブロツクであつて少 くとも ・ヒルジン又はその変種の一つをコードする遺伝子（Ｈ遺伝子） 及び ・Ｈ遺伝子の酵母による転写のためのシグナルを含むＤＮＡ配列（Ｓｔｒ） を含むことを特徴とするＤＮＡブロツク。 ２少くとも次の配列を有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の機能性 ブロツク： −Ｓｔｒ−Ｌｅｘ−Ｓａｌ−Ｈ遺伝子−ここに、Ｌｅｘは遺伝子産物の分泌を達 成するのに必要なリーダー（先導）配列であり、Ｓｃｌは切断部位をコードする ＤＮＡ配列であり、更にＳｃｌ−Ｈ遺伝子なる要素は数回反復されていてもよい 。 ３配列Ｌｅｘが酵母のα性フエロモンのそれであることを特徴とする請求の範囲 第２項に記載の機能性ブロツク。 ４ＳｃｌがＨ遺伝子の３′末端に先立つＡＴＧコドンを含む配列であることを特 徴とする請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の機能性ブロツク。 ５ＳｃｌがＨ遺伝子の３′末端より前方の、Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする２つの コドンを含む配列であることを特徴とする請求の範囲第１〜３項のいずれかに記 載の機能性ブロツク。 ６Ｓｃｌが３′末端のＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする５ つのコドンを含有する配列であることを特徴とする請求の範囲第１〜３項のいず れかに記載の機能性ブロツク。 ７Ｈ遺伝子の後に酵母のターミネーター配列が続くことを特徴とする請求の範囲 第１〜６項のいずれかに記載の機能性ブロツク。 ８酵母のターミネーター配列がＰＧＫ遺伝子のそれであることを特徴とする請求 の範囲第７項に記載の機能性ブロツク。 ９次のアミノ酸配列をコードする少くとも一つの配列を含むことを特徴とする請 求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の機能性ブロツク。 １−【配列があります】ヒル ジン……； ２−【配列があります】ヒルジ ン……； ３−【配列があります】 ヒルジン……； ４−【配列があります】 ヒルジン または ５−【配列があります】ヒルジン…… １０請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の機能性ブロツクと酵母における少 くとも一つの複製開始点とを含むことを特徴とする、酵母によるヒルジンの分泌 に必要な諸要素を含むプラスミド。 １１複製開始点が２μプラスミドのそれであることを特徴とする請求の範囲第１ ０項に記載のプラスミド。 １２更に選択性を有することを特徴とする請求の範囲第１０項及び１１項のいず れかに記載のブラスミド。 １３選択性がＵＲＡ３遺伝子により与えられることを特徴とする請求の範囲第１ ２項に記載の方法。 １４請求の範囲第１０〜１３項に記載のプラスミドまたは第１〜８項に記載の発 現ブロツクによつて形質転換された酵母。 １５サツカロマイセス属の酵母であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記 載の酵母。 １６性のタイプがＭａｔαであることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の 酵母。 １７サツカロマイセス・セレヴイシアエの一菌株であることを特徴とする請求の 範囲第１４〜１６項のいずれかに記載の酵母。 １８請求の範囲第１４〜１７項のいずれかに記載の酵母を培地中で醗酵させ、培 地中に産生された成熟型またはイン・ヴイトロで成熟させうるヒルジン前駆体型 のヒルジンを回収することを特徴とするヒルジンの調製方法。 １９ヒルジンを培地中で回収することを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の 方法。 ２０前駆体からＳｃｌに相当する配列を化学的または酵素的に切断して成熟型ヒ ルジンを得ることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１メチオニンの位置での化学的切断によつて成熟型ヒルジンを得ることを特徴 とする請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２前駆体をＬｙｓ−Ａｒｇ配列または【配列があります】配列の後で酵素的に 切断して成熟型ヒルジンを得ることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の方 法。 ２３前駆体の切断後に得たヒルジンを復元することを特徴とする請求の範囲第１ ８〜２２項のいずれかに記載の方法。 ２４請求の範囲第１８〜２３項のいずれかに記載の方法を実施して得たヒルジン 。 ２５請求の範囲第２４項に記載のヒルジンの医薬としての応用。 ２６請求の範囲第２４項に記載のヒルジンのヒトまたは動物での凝血塊形成検出 試剤としての応用。 ２７体外血液回路の少くとも一部が請求の範囲第２４項に記載のヒルジンによつ て被覆された表面をもつことを特徴とする体外血液回路へのヒルジンの応用。 ２８請求の範囲第１４〜１７項に記載の酵母のヒルジン遊離薬物としての応用。 ２９請求の範囲第２４項に記載のヒルジンを含有する抗凝血剤。 ３０標識された請求の範囲第２４項に記載のヒルジン。 ３１請求の範囲第３０項に記載のヒルジンの生体内での像形成への応用。