PT592358E - Processo para a producao de inibidores de proteases - Google Patents

Description

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-1-DESCRIÇÃO wl "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE INIBIDORES DE PROTEASES" O invento situa-se no campo da tecnologia de DNA recombinante e diz respeito a um método para a produção de inibidores de trombina, mais especialmente dessulfato-hirudinas, recorrendo a células de levedura modificadas geneticamente, às referidas células de levedura modificadas geneticamente, a vectores híbridos portadores dos genes das referidas dessulfato-hirudinas e a métodos para a preparação das referidas células de levedura e referidos vectores híbridos.

As hirudinas são agentes anticoagulantes que ocorrem naturalmente nas sanguessugas (e.g. na sanguessuga medicinal Hirudo medicinalis). As hirudinas são polipeptídeos com uma actuação semelhante tendo em comum uma acumulação de aminoácidos hidrofóbicos no extremo N e aminoácidos polares no extremo C, três pontes dissulfureto e actividade anticoagulante. Uma propriedade característica da maior parte das hirudinas é a presença de um resíduo de sulfato de tirosina na parte C-terminal (Tir ) das moléculas. Para além das variantes de hirudina bem conhecidas HV1, HV2 e HV3, foram descritas outras hirudinas na natureza, ver, por exemplo, M. Scherf et al., FEBS Lett. 255, 105-110 (1989), que apoia o conceito das hirudinas como uma família de isoinibidores.

As hirudinas, por exemplo a variante de hirudina HV1, são os inibidores de trombina mais potentes e mais específicos conhecidos, a protease de serina que catalisa o passo final (a conversão do zimogénio fibrinogénio em fibrina coagulável) da coagulação do sangue. Outras enzimas da cascata de -2- -2- ψ coagulação do sangue não são inibidas pelas hirudinas. Ao contrário da heparina que é o anticoagulante preferido na terapia anticoagulante convencional, as hirudinas exercem a sua acção inibidora directamente na trombina e, ao contrário da primeira, não actuam através da antitrombina III. O único efeito farmacologicamente detectável das hirudinas purificadas é a inibição da coagulação do sangue e a profilaxia da trombose. Após administração intravenosa de hirudina a cães, mesmo em doses elevadas, não foram detectados quaisquer efeitos secundários, tais como efeitos no batimento cardíaco, respiração, pressão sanguínea, contagem de trombócitos, fibrinogénio e hemoglobina. Numa série de modelos animais as hirudinas demonstraram serem eficazes na trombose experimental (induzida por estase ou por injecção de trombina), no choque por endotoxinas e também em DIC (coagulação intravascular disseminada). Sempre que foram realizados testes de comparação directa, as hirudinas provaram serem superiores à heparina.

Nos últimos anos cDNAs e genes sintéticos codificadores de variantes de hirudina foram clonados e expressos em hospedeiros microbianos, tais como Escherichia coli e, em particular, Saccharomvces cerevisiae. Se bem que os produtos de expressão não possuam o grupo sulfato monoéster na Tir -e foram portanto designados "dessulfato-hirudinas" - observou-se que apresentam essencialmente a mesma actividade biológica das hirudinas sulfatadas naturais. Tem sido colocada alguma ênfase na expressão de variantes de dessulfato-hirudina na levedura Saccharomvces cerevisiae. Estirpes de S. cerevisiae contendo vectores epissómicos com uma cassete de expressão de dessulfato-hirudina compreendendo um promotor forte constitutivo ou induzível de levedura (e.g. promotor de PH05, GAP, factor a), uma sequência sinal ou líder de levedura (e.g. a sequência sinal da invertase ou de PH05 ou o líder do factor a) e um gene da dessulfato-hirudina proporcionam, ainda que em grau diferente, a expressão e exportação de dessulfato-hirudina para o meio de cultura, a partir do qual pode ser isolada (ver, por exemplo, Pedidos de Patente Europeia N° 200655, 225633, 252854, 341215 e 341215). Os sistemas de expressão disponíveis desenvolvidos para S. cerevisiae dão rendimentos baixos a satisfatórios para dessulfato-hirudina farmaceuticamente aplicável. Face a isto, e considerando a necessidade de grandes quantidades de dessulfato-hirudina na investigação clínica e, eventualmente, na terapia, existe a necessidade de métodos melhorados que tomem possível a produção económica de dessulfato-himdinas farmaceuticamente aplicáveis numa grande escala. Constitui um objectivo do presente invento proporcionar tais métodos.

As metalotioneínas (MTs) são pequenos polipeptídeos ricos em cisteína que se ligam a metais largamente distribuídos entre os eucariotas. S. cerevisiae contem uma única proteína MT que é codificada pelo gene CUP1. Mostrou-se que para as leveduras o locus CUP1 confere resistência ao cobre. São conhecidas duas variantes naturais de S. cerevisiae relativamente à resistência ao cobre: as estirpes sensíveis a cobre 0,3 mM que contêm uma única cópia do locus CUP1 (consisitindo em duas cópias arranjadas em tandem do gene CUP1) e são designadas cupls, e as estirpes resistentes a cobre 0,3 mM que contêm várias cópias repetidas em tandem do locus CUP1 e são designadas CUPlr. A resistência ao cobre baseia-se numa combinação^ da amplificação de CUP1 e indução da tradução de CUP1 após a adição de cobre exógeno. Foi identificado um sítio de activação a montante, que actua em cis (UASC), necessário à promoção da transcrição do gene CUP1 induzível por cobre, assim como a ligação de um factor celular a UASC. O factor de ligação é o produto do gene ACE1 (=CUP2) que é essencial para a transcrição do gene CUP1 induzida por cobre. A proteína ACE1 é um activador da transcrição que se liga ao cobre alterando assim a sua conformação e activando o seu domínio de ligação ao DNA. A alteração conformacional da proteína ACE1 eventualmente permite que o gene CUP1 seja transcrito. Uma característica importante do sistema CUP1 é a -4- CL*—-uí sua auto-regulação. Esta depende da capacidade da própria proteína CUP1 se ligar aos iões cobre. Assim, a proteína CUP1 parece reprimir a sua própria síntese ao complexar-se com os iões de cobre livres nas células, o que, por sua vez, interfere com a activação de ACE1.

Existem poucos exemplos na literatura da utilização do promotor induzível CUP1 para a expressão de proteínas heterólogas por levedura (cf. T.R. Butt et al, Microbiol. Rev. 51, 351-364, 1987; T. Etcheveny, Methods Enzymol. 185, 319-329, 1990; Patente US N° 4 940 661). Os métodos descritos incluem a cultura de uma estirpe de levedura transformada, portadora de um vector de expressão com uma cassete de expressão CUP1, em meio mínimo de levedura contendo iões cobre. Os meios mínimos quimicamente definidos são escolhidos porque de uma maneira geral se pensa que os componentes (proteínas etc.) dos meios complexos interactuam (complexam-se) com os iões de cobre evitando assim a activação de ACE1. A densidade celular atingível (valor de DO) e, como consequência, os títulos obtidos são correspondentemente baixos. Estes últimos resultados limitaram até agora uma aplicação ampla do sistema promotor CUP1 na pesquisa e produção biotecnológica.

Surpreendentemente, encontrou-se agora que, ao contrário de todas as expectativas, os meios complexos para leveduras podem ser usados com a cassete de expressão de CUP1 induzida por cobre, sem que seja observável qualquer efeito prejudicial no nível ou eficiência da expressão. Ainda, quando o promotor CUP1 é usado de forma pseudo-constitutiva, i.e. o meio de cultura é suplementado com cobre logo no momento da inoculação, para dirigir a secreção de dessulfato-hirudina pela levedura para o meio de cultura, surpreeendentemente encontrou-se que este promotor é superior aos promotores consitutivos fortes de levedura, tais como o promotor GAP encurtado (constituivo) ("GAPFL"), se bem que a proteína heteróloga dessulfato-hirudina não seja tóxica para as células de levedura. -5- -5- wl C~

Assim, o presente invento está relacionado com um método melhorado para a produção de dessulfato-hirudina, compreendendo a cultura num meio de cultura complexo de uma estirpe de levedura portadora de um vector de expressão de levedura compreendendo uma cassete de expressão de dessulfato-hirudina, consistindo no promotor CUP1 de levedura ligado operacionalmente a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal de levedura ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e isolamento da dessulfato-hirudina produzida a partir do caldo de cultura, em que o meio de cultura é suplementado, na altura da inoculação, com uma quantidade de um sal de cobre indutora do promotor CUP1. O termo "dessulfato-hirudina" destina-se a abranger todos os compostos de dessulfato-hirudina descritos na literatura ou obtidos a partir de uma estirpe de microrganismo transformada contendo DNA que codifique uma dessulfato-hirudina. Tais dessulfato-hirudinas são, por exemplo, variantes de dessulfato-hirudina HV1, HV2 e HV3 (PA), assim como outras proteínas de hirudina descritas por M. Scharf et ai, {supra). Deve-se entender que os derivados de hirudina tendo actividade de hirudina {i.e. tendo uma acção inibidora da trombina) estão também incluídos pelo termo "dessulfato-hirudina". Tais derivados são, por exemplo, dessulfato-hirudinas encurtadas no extremo C, i.e. dessulfato-hirudinas sem um a sete, preferencialmente um a quatro, aminoácidos no extremo C e muteínas de hirudinas diferindo pela substituição de um ou mais, e.g. um a cinco, aminoácidos relativamente aos aminoácidos genuínos. A dessulfato-hirudina preferida é a dessulfato-hirudina variante HV1.

Estirpes de levedura adequadas de acordo com o invento incluem -6- estirpes de Saccharomvces cerevisiae contendo o plasmídeo endógeno de dois micra ou estirpes que tenham sido curadas do referido plasmídeo endógeno de dois micra (ver Pedido de Patente Europeias N° 340170). As estirpes de levedura preferidas de acordo com o invento não possuem o plasmídeo endógeno de dois micra (chamadas "estirpes cir°"). As estirpes de levedura preferidas são estirpes de levedura deficientes numa ou mais proteases, i.e. estirpes de levedura especialmente sem actividade proteolítica de carboxipeptidase ysca e yscY e, facultativamente ainda sem actividade de protease yscA e/ou yscB (ver Pedido de Patente Europeia N° 341215). As estirpes de levedura adequadas para o processo de acordo com o presente invento contêm 0-16, em particular 2-6, cópias do gene cromossómico CUP1. Facultativamente, as estirpes de levedura de acordo com o invento contêm 1-3 cópias adicionais do gene cromossómico ACE1. Numa outra realização do presente invento, são usadas estirpes de levedura tendo uma mutação na proteína do factor de choque térmico endógeno. Tais mutantes conduzem a um aumento dos níveis de transcrição de CUP1 em condições de pressão (cf. P. Silar et al., Mol.Cell. Biol. (1991) 11, 1232-1238).

As estirpes de levedura, e.g., derivadas do género S. cerevisiae. podem ser haplóides, diplóides ou poliplóides. As estirpes de levedura preferidas têm uma ploidia igual ou superior a dois, estas estirpes são, e.g., octaplóides, tetraplóides, triplóides e especialmente diplóides. Uma estirpe diplóide ou poliplóide de S. cerevisiae é construída, e.g., conjugando duas estirpes haplóides dos tipos de conjugação a e α ou através da fusão de protoplastos. Numa realização preferida do invento, as estirpes de levedura diplóides são formadas usando estirpes de levedura haplóides e isogénicas que apenas diferem no tipo de conjugação.

As estirpes de levedura transformadas são cultivadas usando métodos conhecidos. Assim, as estirpes de levedura transformadas de acordo com -Ι ο invento são cultivadas num meio de cultura líquido complexo contendo componentes que são essenciais para a estirpe de levedura sobreviver e crescer, tais como fontes de carbono e azoto assimiláveis, sais inorgânicos, vitaminas, substâncias promotoras do crescimento, tais como aminoácidos adicionais, açúcares e similares. São conhecidos meios de cultura complexos correspondentes que podem ser usados para a cultura de leveduras. Por exemplo, tais meios de cultura contêm triptona, peptona, extractos de came, extractos de malte, extractos de levedura, xarope de milho, farinha de soja etc., e especialmente misturas dos mesmos, e são, facultativamente, ainda suplementados com açúcares (e.g. dextrose, glucose, sucrose etc.), vitaminas (e.g. biotina), aminoácidos individuais, sais inorgânicos (por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio, sais correspondentes de micronutrientes, tais como ferro, zinco e manganês) e similares tendo em consideração que todos os componentes essenciais, conforme descrito atrás, deverão estar presentes no meio. Um meio de cultura preferido é o meio YPD ("yeast extract", extracto de levedura, peptona dextrose; cf. Methods Enzymol. 194, 13) comercial, suplementado com sais inorgânicos e vitaminas. A cultura é realizada empregando técnicas convencionais. As condições de cultura, tais como temperatura, pH do meio e tempo de fermentação são seleccionados de forma a que sejam produzidos níveis máximos de dessulfato-hirudina. Uma estirpe de levedura escolhida é preferencialmente crescida em condições de aerobiose, em cultura submersa, com agitação, a uma temperatura de cerca de 25° a 33°C, preferencialmente a cerca de 28°C, a um valor de pH entre 4 e 7, por exemplo a pH de aproximadamente 5 a 6, e durante pelo menos 1 a 3 dias, preferencialmente 3 a 4 dias, de forma a serem obtidos rendimentos satisfatórios de dessulfato-hirudina. A cultura pode ser realizada -8- como um processo de carga, como um processo de carga alimentada, como um processo de carga alimentada repetidamente ou continuamente.

Quando da inoculação, o meio de cultura é suplementado com uma quantidade de um sal de cobre (II), particularmente sulfato de cobre, indutora do promotor CUP1. A quantidade óptima de cobre (a quantidade que proporciona títulos máximos de dessulfato-hirudina) depende, acima de tudo, do fundo genético da célula hospedeira, dos componentes do vector de expressão usado e da composição do meio de cultura, e pode ser determinada pelos familiarizados com a matéria aplicando testes convencionais, e.g. "titulação" (determinação do título de dessulfato-hirudina por HPLC em função da quantidade de cobre adicionada). Um ensaio de rotina foi descrito por T. Etchveriy (loc. Cit. , página 324). A determinação da concentração correcta de cobre é importante porque níveis de cobre desnecessariamente elevados podem causar uma inibição da maquinaria metabólica da célula.

Independentemente da estirpe de levedura, do promotor e peptídeo sinal usados, a dessulfato-hirudina produzida é predominantemente (i.e. mais de 90%) secretada para o meio de cultura. A dessulfato-hirudina pode ser isolada a partir dele por meios convencionais. Por exemplo, o primeiro passo consiste geralmente na separação das células do fluido de cultura por meio de centrifugação. O sobrenadante resultante pode ser enriquecido em dessulfato-hirudina por tratamento com polietileneimina, de forma a remover a maior parte do material não proteico, e precipitação das proteínas por saturação da solução com sulfato de amónio. As proteínas do hospedeiro, se presentes, podem também ser precipitadas por meio de acidifícação com ácido acético (por exemplo 0,1%, pH 4-5). Um enriquecimento posterior em dessulfato-hirudina pode ser conseguido através da extracçãoo do sobrenadante de ácido acético com n-butanol. Outros passos de purificação incluem, por exemplo, remoção dos sais, -9- «a processos cromatográfícos, tais como cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de partição, HPLC, HPLC em fase reversa e similares. A separação dos constituintes da mistura pode também ser efectuada por diálise, de acordo com a carga, por meio de electroforese em gel ou electroforese sem veículo, de acordo com o tamanho molecular por meio de uma coluna de Sephadex adequada, por cromatografia de afinidade, por exemplo com anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais ou com trombina acoplada a um veículo adequado para cromatografia de afinidade, ou por outros processos, especialmente os conhecidos da literatura. Em geral, são necessários apenas alguns passos de purificação de forma a obter-se um produto dessulfato-hirudina essencialmente livre de contaminantes. O teste com anticorpos anti-hirudina ou anti-dessulfato-hirudina (por exemplo anticorpos monoclonais), o teste da trombina [M.U. Bergmeyer (ed.), Methods in Enzymatic Analysis, Vol. II, p. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (FRG) 1983] ou o teste de coagulação do sangue [F. Markwardt et al., Thromb. Haemost. 47, 226 (1982)] pode ser usado para detectar a actividade de hirudina durante os passos de isolamento e purificação. E também possível usar meios cromatográfícos, tais como HPLC.

As células de levedura transformadas de acordo com o invento podem ser preparadas por técnicas de DNA recombinante compreendendo os passos de - obtenção de um vector para expressão em levedura compreendendo uma cassete de expressão de dessulfato-hirudina consistindo no promotor CUP1 de levedura ligado operacionalmente à primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma - 10- segunda sequência de DNA codificadora de dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação de transcrição de levedura, - transformação de uma estirpe de levedura com o referido vector de expressão de levedura e selecção das células de levedura transformadas de entre as células de levedura não transformadas.

Vectores de expressão de levedura A sequência de DNA do promotor CUP1 é conhecida (T.R. Butt et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 81 (1984) 3332-3336). Assim, o promotor CUP1 pode ser obtido por síntese química ou isolado a partir de DNA genómico de S. cerevisiae usando sondas de DNA adequadas, e.g. por reacção em cadeia com polimerase (PCR). O promotor CUP1 usado no presente invento inclui os sinais de iniciação da transcrição e a sequência de activação a montante (UASC) situados nas posições -105 a -148 (relativamente ao local do início da transcrição de CUP1; P. Fiirst et al. Cell 55 (1988) 705-717). Preferencialmente, utilizam-se sítios de restrição existentes em 5' relativamente a UAS, e.g. sítio BamHI situado na posição -455 do gene CUP1 (T.R. Butt et al, supra) e um sítio de restrição 3' relativamente a sinais de início da transcrição {e.g. um sítio EcoRI) introduzido artificialmente por síntese química ou pelo oligonucleótido usado no PCR.O fragmento de restrição resultante, e.g. um fragmento BamHI-EcoRI de 0,4 Kb, especialmente o contido na construção descrita em SEQ ID NO:l, pode ser ligado à sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal de levedura. A sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal de levedura ("sequência sinal") é, preferencialmente, derivada de um gene de levedura - 11 -

At.k.rir' codificador de um polipeptídeo que seja normalmente secretado. As sequências sinal de levedura são, por exemplo, as sequências sinal e prepro dos genes da invertase de levedura, factor a, peptidase de feromona (KEX1), "toxina assassina" e fosfatase ácida reprimível (PH05) e a sequência sinal da glucoamilase de Aspergillus awamori. Outras sequências, tais como sequências pro ou espaçadoras que podem ser portadoras de sinais de processamento específicos, podem ser igualmente incluídas nas construções para facilitar o processamento preciso de moléculas precursoras. Por exemplo, os sinais de processamento contêm um resíduo Lis-Arg, que é reconhecido por uma endopeptidase de levedura situada nas membranas do Golgi. As sequências sinal preferidas de acordo com o presente invento são as do gene PH05 de levedura e o gene da invertase de levedura. A sequência de DNA codificadora da dessulfato-hirudina ou seu derivado pode ser isolada a partir do DNA genómico de sanguessuga ou de um DNA de dessulfato-hirudina de cadeia dupla (cDNA ds de dessulfato-hirudina) que é produzido por complementaridade com o mRNA de dessulfato-hirudina, ou um gene codificador da sequência de aminoácidos de dessulfato-hirudina ou seu derivado produzido por meio de processos químicos e enzimáticos, de modo conhecido per se.

Uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição é preferencialmente a sequência flanqueante 3' de um gene de levedura que contem sinais apropriados de terminação da transcrição e poliadenilação. A sequência flanqueante preferida é a do gene PH05 de levedura. O promotor CUP1 de levedura, a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal, a sequência de DNA codificadora da dessulfato-hirudina e a sequência de DNA contendo os sinais de terminação da transcrição de levedura -12- estão ligados operacionalmente uns aos outros, i.e. eles estão justapostos de forma a que sejam mantidas as suas funções normais. O arranjo é tal que o promotor CUP1 efectua a expressão correcta do complexo sequência sinal-gene da dessulfato-hirudina, os sinais de terminação da transcrição efectuam a terminação correcta da transcrição e a sequência de poliadenilação e a sequência sinal estão ligadas na grelha de leitura correcta ao gene da dessulfato-hirudina, de forma a que o último codão da sequência sinal esteja ligado directamente ao primeiro codão do gene da dessulfato-hirudina e ocorra secreção da dessulfato-hirudina madura. O promotor CUP1 é preferencialmente ligado à sequência sinal entre a iniciação principal do mRNA e o ATG do gene CUP1. A sequência sinal tem o seu próprio ATG para a iniciação da tradução. A junção destas sequências pode, por exemplo, ser efectuada por meio de oligodesoxinucleótidos adaptadores sintéticos portadores da sequência de reconhecimento de uma endonuclease.

Para além da cassete de expressão da dessulfato-hirudina, os vectores de expressão de acordo com o invento compreendem uma origem de replicação de levedura. Assim, os vectores compreendem um segmento de DNA derivado de DNA de dois micra contendo a origem de replicação ou, se for usada uma estirpe sem DNA de dois micra, DNA total de dois micra. Prefere-se este último tipo de vector. Por exemplo, os vectores de acordo com o invento contêm o DNA de dois micra completo numa forma não interrompida, i.e. o DNA de dois micra é clivado uma vez com uma endonuclease de restrição, o DNA linearizado é ligado aos outros componentes do vector antes da recircularização. O sítio de restrição é escolhido de forma a que seja mantida a função normal dos genes REP1, REP2 e FLP e dos sítios ORI, STB, IR1 e IR2 do DNA dois micra. Facultativamente, o sítio de restrição é escolhido de forma a que o gene D do DNA de dois micra seja também mantido intacto. Os sítios de restrição adequados são, por exemplo, o sítio único PstI situado dentro do gene D e os sítios únicos Hpal e SnaBI situados fora de todos os genes e sítios referidos. No - 13 - entanto, é igualmente possível inserir a cassete de expressão e outros componentes (cf. Abaixo) em sítios de restrição diferentes (por exemplo dois), especialmente os referidos atrás, dentro do DNA de dois micra.

Preferencialmente, os vectores de expressão de acordo com o invento incluem uma ou mais, especialmente uma ou duas, marcas genéticas selectivas para levedura e tal marca e uma origem de replicação para um hospedeiro bacteriano, especialmente Escherichia coli.

Numa realização preferida do invento, as duas regiões entre sítios FRT inversamente repetidos da forma circular do DNA de dois micra têm aproximadamente o mesmo comprimento.

Tal derivado do plasmídeo pode compreender apenas dois sítios FRT inversamente repetidos ou um terceiro sítio adicional. O primeiro tipo de plasmídeo é daqui em diante designado um "vector híbrido tipo dois micra simétrico". Este último tipo de plasmídeo é daqui em diante designado "vector de de integração tipo dois micra simétrico", apesar de não ser um plasmídeo simétrico real mas dá origem a um vector híbrido tipo dois micra simétrico na célula de levedura transformada com ele.

Um vector híbrido do tipo dois micra simétrico do invento preferencialmente não contem sequências de DNA bacteriano ou virai, i.e. DNA derivado de um genoma bacteriano, de plasmídeo ou virai. No entanto, um vector de desintegração do tipo dois micra do invento pode compreender sequências de DNA de origem procariótica entre os dois sítios FRT directamente repetidos que são removidos do vector na célula de levedura transformada em que o vector tipo dois micra simétrico é gerado a partir do vector de desintegração. Estas sequências de DNA são sequências bacterianas, como descrito abaixo, e podem - 14- proporcionar ao vector características estruturais ou funcionais essenciais, ou podem também ter apenas uma função estrutural de preenchimento das duas regiões entre os sítios FRT inversamente repetidos de um derivado do plasmídeo tipo dois micra assimétrico ou de um vector de desintegração "assimétrico" de forma a construir um vector híbrido dois micra simétrico ou um vector de desintegração simétrico.

Num vector híbrido tipo dois micra que é simétrico dentro do significado do presente invento, ou num vector de desintegração que dá origem a tal vector híbrido tipo dois micra simétrico, os comprimentos das regiões situadas entre os dois sítios FRT inversamente repetidos têm uma proporção entre cerca de 1:1 até cerca de 5:4, i.e. a região maior é até cerca de 20% maior que a menor.

Relativamente às marcas genéticas selectivas para levedura, qualquer marca genética pode ser usada desde que facilite a selecção de transformantes devido à expressão fenotípica da marca genética. São marcas adequadas para levedura, por exemplo, as que expressam resistência a antibióticos ou, no caso de mutantes de levedura auxotróficos, genes que complementem lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exemplo, resistência aos antibióticos G418, higromicina ou bleomicina ou conferem prototrofia num mutante de levedura auxotrófíco, por exemplo o gene URA3, LEU2. LYS2 ou TRP1.

Uma vez que a amplificação dos vectores de expressão é, por conveniência, realizada num procariota, como seja E. coli. uma marca genética de procariota, e.g. de E. coli. e uma origem de replicação de procariota, e.g. de E. coli. são com vantagem incluídos. Estes podem ser obtidos a partir dos correspondentes plasmídeos procarióticos, por exemplo plasmídeos de E. coli. tais como pBR322 ou um plasmídeo pUC, por exemplo pUC18 ou pUC19, os - 15- quais contêm uma origem de replicação e uma marca genética procariótica, e.g. de E. coli. que confere resistência a antibióticos, tais como ampicilina.

Para além da cassete de expressão CUPl-dessulfato-hirudina, uma ou mais origens de replicação e uma ou mais marcas genéticas, os vectores de expressão de acordo com o invento contêm ainda, facultativamente, cassetes de expressão adicionais, tais como 1 a 3 cassetes de expressão de dessulfato-hirudina adicionais e/ou ainda uma cassete de expressão do activador da expressão ACE1. As cassetes de expressão de dessulfato-hirudina adicionais são idênticas ou diferentes umas das outras, e são idênticas ou diferentes da cassete de expressão CUPl-dessulfato-hirudina já presente no vecto,r e cada uma compreende um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura. Um promotor de levedura adequado para tais cassetes de expressão de dessulfo-hirudina adicionais é, por exemplo, qualquer promotor constitutivo ou induzível que possa ser usado para a expressão de dessulfato-hirudina por levedura em meios complexos. Tais promotores são e.g. os promotores de CUP1, GAPDH (incluindo suas versões constituivas encurtadas, e.g. GAPFL etc. ) GAL1 (10), PYK, TPI, ADH e PGK. Prefere-se o promotor GAPFL constitutivo de GAPFL. As sequências sinal e os sinais de terminação da transcrição adequados são especialmente os descritos atrás. Cassetes de expressão da dessulfato-hirudina correspondentes estão descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Europeia N° 341215. Uma cassete de expressão adicional ACE1 inclui os seus próprios sinais de iniciação e terminação da transcrição e tradução ou, em alternativa, a sua transcrição é controlada por um promotor de levedura constitutivo ou induzível diferente do promotor de ACE1, como seja o promotor CUP1 ou um promotor GAPDH constitutivo (encurtado) (e.g. promotor GAPFL). -16-

Uma cassete de expressão ACE1 adequada está contida, por exemplo, no fragmento genómico EcoRV de 1,7 Kb de S. cerevisiae (cf. P. Fíirst et al. (1988) Cell 55, 705-717). O promotor ACE1 genuíno pode ser substituído por um outro promotor de levedura, e.g. o promotor CUP1, por meios e métodos convencionais. A direcção da transcrição da dessulfato-hirudina adicional e/ou das cassetes de expressão de ACE não é crucial e pode ter a mesma direcção ou direcção oposta à da transcrição da cassete de expressão CUP1-dessulfato-hirudina já presente nos vectores do invento.

Os vectores de expressão de acordo com o invento são preparados por métodos conhecidos, por exemplo ligando a cassete de expressão CPU1-dessulfato-hirudina, consistindo no promotor CUP1 de levedura ligado operacionalmente a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal de levedura ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura, os fragmentos de DNA contendo as marcas genéticas selectivas para o hospedeiro de levedura e bacteriano, as origens de replicação para levedura e para bactéria, e as cassetes de expressão de dessulfato-hirudina e/ou ACE1 adicionais facultativas na ordem pré-determinada usando processos convencionais de síntese química ou biológica in vitro. Preferencialmente os vectores são construídos e preparados usando técnicas de DNA recombinante. Para a preparação por técnicas de DNA recombinante, fragmentos de DNA adequados são ligados in vitro de forma convencional. A mistura de ligação é então usada para transformar hospedieros procarióticos ou eucarióticos adequados dependendo da natureza dos elementos reguladores usados e um transformante contendo o vector pretendido é seleccionado de acordo com processos convencionais. Os vectores podem ser multiplicados por meio dos hospedeiros transformados e podem ser isolados de forma convencional. A escolha do hospedeiro depende das sequências

reguladoras situadas no vector. Uma vez que os vectores de expressão do invento preferencialmente compreendem sequências reguladoras funcionais em procariotas, e.g. E. coli. prefere-se um hospedeiro procariótico, e.g. E. coli. para a construção e multiplicação do vector.

Estirpes de leveduras transformadas A transformação de levedura com os vectores de expressão de acordo com o invento pode ser conseguida de acordo com métodos conhecidos.

As estirpes de levedura preferidas são as referidas atrás, especialmente estirpes de S. cerevisiae que tenham sido curadas do plasmídeo dois micra endógeno ("estirpes cir°") e deficientes numa ou mais proteases de levedura, tais como as carboxipeptidases ysca e yscY. Os métodos para a produção de tais estirpes de levedura estão descritos, por exemplo, nos Pedidos de Patente Europeia Nos. 340 170 e 341 215. São conhecidas estirpes de levedura contendo 0-16, em particular 2-6, cópias do gene cromossómico CUP1 ou podem ser preparadas de forma conhecida per se. Por exemplo, partindo de uma estirpe de levedura convencional sensível ao cobre, contendo e.g. 2-4 cópias cromossómicas do gene CUP1, podem ser obtidas estirpes de levedura tendo menos cópias do gene CUP1 através da introdução de deficiências no genoma de levedura, e.g. por mutagénese dirigida, interrupção de genes ou substituição de genes [cf. Rudolph et al, Gene, 36 (1985) 87-95]. Uma vez que é conhecida a sequência do gene cromossómico CUP1 este pode ser tomado defectivo através de inserção ou deleção fazendo uso do processo de mutagénese dirigida [ver, por exemplo MJ. Zoller e M. Smith (1983) Methods Enzymol. 100, 468] que envolve a preparação de uma sequência iniciadora oligodesoxirribonucleotídica mutagénica adequadamente desenhada. Como alternativa o gene CUP1 genómico pode ser substituído por DNA estranho ou o referido DNA estranho pode ser - 18- inserido num sítio de restrição adequado do gene CUP1. Por exemplo, para preparar um mutante de levedura deficiente na totalidade ou parte dos genes cromossómicos CUP1 existentes, DNA estranho é inserido num sítio de restrição adequado dentro do gene CUP1. No caso da estirpe de levedura usada ter um defeito num gene cromossómico codificador de uma enzima da biossíntese de aminoácidos ou de purina (e.g. uracilo), um gene intacto correspondente (como seja URA3) pode ser inserido no gene CUP1 cromossómico, proporcionando assim prototrofia na estirpe de levedura auxotrófica e ao mesmo tempo mudando o genótipo de CUP1 para cupl. Os processos de substituição de genes ou de mutagénese dirigida são normalmente aplicados e são absolutamente reprodutíveis. Para aumentar a resistência ao cobre de uma dada estirpe de levedura (i.e. aumentando o número de genes cromossómicos CUP1) que é moderadamente resistente ao cobre, a referida estirpe de levedura pode ser exposta a concentrações mais elevadas de cobre no meio causando uma amplificação do locus CUPl. As células de levedura sobreviventes resultantes contêm mais genes cromossómicos CUP1 (por exemplo 10-16) do que a estirpe parental e podem ser isoladas a partir do meio de forma conhecida per se.

Ainda, um outro método convencional para criar estirpes de levedura tendo um fundo genético pretendido, por exemplo tendo a totalidade ou parte dos genes cromossómicos CUP1 interrompidos e/ou tendo deficiências em certas proteases, consiste no cruzamento meiótico de estirpes de levedura adequadas e subsequente análise de tétradas. As tétradas, que derivam das células diplóides, são dissecadas de acordo com técnicas genéticas convencionais. A distribuição ao acaso entre os quatro esporos de uma tétrada permite a construção de mutantes adequados em cruzamentos subsequentes. A análise de esporos ao acaso pode também ser usada como um sistema alternativo. - 19-

As estirpes de levedura contendo 1-3 cópias adicionais do gene cromossómico ACE1 podem também ser preparadas de forma convencional. Por * exemplo, um ou mais genes ACE1 podem ser inseridos num ou mais sítios de restrição adequados de um ou mais genes cromossómicos que conferem resistência a antibióticos ou num ou mais genes envolvidos na síntese de aminoácidos ou das bases puiinas e pirimidinas, tomando as estirpes de levedura resultantes, contendo tais cópias adicionais do gene ACE1, sensíveis a antibióticos, e , respectivamente, auxotróficas relativamente ao correspondente aminoácido, base purina ou pirimidina.

Breve descrição dos desenhos

Na parte experimental que se segue são descritas várias realizações do presente invento com referência aos desenhos juntos em que:

Fig. 1 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pPFY56.

Fig. 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pPFY58.

Fig. 3 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pPFY59R.

Fig. 4 éuma ilustração esquemática do plasmídeo pPFY79.

As abreviaturas que se seguem são usadas nas figuras: term = terminador da transcrição de PH05; p em CUPlp, GAPFLp e ACElp = promotor.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento e não deverão ser pensados como limitantes do mesmo. -20-

Parte experimental Estirpes e plasmídeos E. coli DH5aF': Escherichia coli K12F endAl hsdR17(r'm+) supE44 thil recaAl pyrA relAl PHI181acZdelM15 del(lacZYA-argF)U169; Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557 (Bethesda Research Laboratories). S. cerevisiae H449: Saccharomvces cerevisiae MATa, ura3A15, leu2-3, leu2-112, prbl, cpsl, [cir°]. DSM 4413; 18 de Fevereiro, 1988. S. cerevisiae HT462/TH3: MATa, cupl::URA3, kexl, prcl, leu2-3; leu2-212; DSM 7190; 22 de Julho, 1992. S. cerevisiae estirpe 55.6B; MATa, his3, leu2, trpl, ura3-52, cupl::URA3; cf. Thiele, D.J. et al Science 231 (1986), 854-856

Plasmídeo pDP34:EP-A-340 170, Fig. 3; um vector vai-vem para levedura-R coli com a marca genética de resistência à ampicilina para R coli e as marcas selectivas para levedura URA3 e dLEU2. Contem a sequência completa de 2 micra na forma A e é proficiente para REP1, REP2 e FLP. DSM 4473; 14 de Março, 1988.

Plasmídeo pJDB207/GAPFL-YHIR: um plasmídeo de levedura para a expressão de dessulfato-hirudina variante HV1 sob o controlo de um promotor constitutivo curto do gene da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) de levedura. A sequência codificadora da dessulfato-hirudina consiste em codões preferidos de levedura; cf. EP-A-340 170 -21 -

Plasmídeo pTZ18R: Plasmídeo derivado de pUC18 inclui uma origem de replicação de Ml3 de forma a poder transformar-se em cadeia simples e ser empacotado em cabeças do fago Ml3 com a ajuda de um fago auxiliar de Ml3. Mead DA, Szczesna-Skorupa E, Kemper B, Single stranded DNA 'blue* T7 promotor plasmids: a versatile tandem promoter system for cloning and protein engineering. Protein Engineering 1 (1986), 67-74 (Pharmacia).

Plasmídeo pFBY2: Este plasmídeo foi construído através da inserção do fragmento Alui de 166 pb contendo o sítio FRT do plasmídeo dois micra de S. cerevisiae entre os locais HindIII e EcoRI de pTZ18R e a totalidade do plasmídeo dois micra cortado com Xbal no sítio único Xbal de pTZ18R. DSM 6271; 14 de Dezembro, 1990.

Plasmídeo pFBY4: Este plasmídeo consiste num fragmento Xbal de 1,1 Kb contendo a totalidade do gene URA3 de S. cerevisiae clonado no único sítio Xbal de pTZ18R. Este plasmídeo serve como fonte adequada de um fragmento Xbal de 1,1 Kb contendo URA. DSM6272; 14 de Dezembro, 1990.

Plasmídeo pFBY5: pFBY5 deriva de um plasmídeo grande contendo a totalidade do plasmídeo dois micra de S. cerevisiae mais os genes URA3 e Leu2 de S. cerevisiae no vector bacteriano pUC18. No único sítio Sall deste vector está inserido um fragmento Sall de 1,1 Kpb contendo uma cassete de expressão consistindo num promotor derivado do gene GAPDH de S. cerevisiae fundido com a sequência sinal de PH05, que por sua vez está fundido com um fragmento de DNA sintético codificador da hirudina, o qual é seguido de um terminador de PH05. DSM 6273; 14 de Dezembro, 1990. -22-

Plasmídeo pFBY29: este plasmídeo consiste num fragmento BamHI/SalI de 2 Kb contendo o gene Leu2. O fragmento está inserido entre os sítios BamHI e Sall de pTZ18R. PFBY29 serve como fonte de um fragmento de 2,0 Kpb contendo LEU2. DSM 6275; 14 de Dezembro, 1990.

Todas as manipulações, excepto caso seja referido o contrário, são realizadas de acordo com protocolos convencionais (e.g. Maniatis, T. et al.: Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York (1982).

Exemplo 1: Construção do plasmídeo pRFY56. Um gene híbrido contendo o promotor CUP1. a sequência líder de PHQ5 e um gene sintético da hirudina

Para se conseguir um nível de expressão induzível elevado de dessulfato-hirudina secretada, sequências de DNA codificadoras de hirudina HV1 e da sequência líder PH05 foram fundidas e colocadas sob o controlo do promotor CUP1 induzível pelo cobre. pDP34 (cf. Pedido de Patente Europeia N° 340 170, Fig. 3) é um vector vai-vem para levedura-E. coli com a marca de resistência à ampicilina de E. coli e as marcas selectivas de levedura URA3 e dLEU2. Contem a sequência completa de 2 micra na forma A e é proficiente para REP1, REP2 e FLP. O plasmídeo pDP34 foi digerido com BamHI. Os extremos coesivos do local de restrição foram preenchidos numa reacção com polimerase do DNA Klenow (T. Maniatis et al., em "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). O DNA foi ainda cortado com Sall e o fragmento vector de 11,8 Kb foi isolado num gel preparativo de 0,6% de agarose. O DNA foi recuperado por electroeluição e precipitação com etanol. -23- C—«.Ui O plasmídeo pJDB207/GAPFL-YHIR (um plasmídeo de levedura para expressão de dessulfato-hirudina variante VH1 sob o controlo de um promotor curto constitutivo do gene da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH); a sequência codificadora da dessulfato-hirudina consiste em codões preferidos para levedura; cf. Pedido de patente Europeia B° 340 170) foi digerido com HindIII. Os extremos coesivos foram convertidos em extremos cerses pela polimerase do DNA Klenow. O DNA foi precipitado com etanol e ainda digerido com Sall. O fragmento de 1,1 Kb SalI-[HindIII]/extremo cerse contem a cassete de expressão completa com sequências de pBR322, o promotor GAPFL, a sequência sinal de PH05 fundida na mesma grelha de leitura com a sequência codificadora (codões de levedura preferidos) da dessulfato-hirudina e o fragmento de terminação da transcrição de PH05. O fragmento de 1,1 Kb foi isolado num gel preparativo de 0,8% de agarose, recuperado do gel por electroeluição e purificado por cromatografia de permuta iónica em DE52 e precipitação com etanol. 0,2 pmoles do fragmento de 1,1 Kb e 0,1 pmoles do fragmento vec-tor de 11,8 Kb foram ligados em 10 μΐ de tris-HCl 60 mM pH 7,5, MgCb 10 mM, DTT 5 mM, ATP 3,5 mM e 400 unidades de ligase do DNA de T4 (Biolabs) durante 16 horas a 15°C. Usou-se uma alíquota de um μΐ para transformar células E. çoli HB101 Ca2+. Analisaram-se 5 colónias transformadas resistentes à ampicilina. O DNA de plasmídeo foi digerido com BamHI e SalI/BamHI. Um clone com os fragmentos de restrição correctos foi seleccionado e designado pDP34/GAPFL-YHIR (para detalhes, ver Pedido de Patente Europeia N° 340 170). O gene sintético da hirudina, fundido com a sequência líder de PH05, foi isolado a partir do plasmídeo pDP34/GAPFL-Yhir como um fragmen- to EcoRI de 0,5 Kb que também contem sequências terminadoras da transcrição de PH05. O promotor CUP1 (T.R. Butt et ai, (1984) Proc. Natl. Acad. Sei USA 81, 3332-3336) foi clonado a partir de DNA genómico de S. cerevisiae por reacção em cadeia com polimerase (PCR) usando o estojo de PCR da Perkin Elmer e as duas sequências iniciadoras seguintes: 5'-GGATCCATTACCGACATTTGGGCGCTAT SEQ ID NO:3 5 ' -GAATTCACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTA SEQ ID NO:4 100 ng de DNA genómico de levedura (isolado a partir da estirpe H449) foi incubado em 0,1 ml com 2,5 unidades de polimerase do DNA Taq, 0,02 mM de cada sequência iniciadora e 0,2 mM de dATP, dCTP, TTP e dGTP em Tris 10 mM pH 8,3, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM. A reacção foi incubada durante 30 ciclos: 30 seg a 92°C, durante 1 min a 42°C e a 72°C durante 1 min. O fragmento do promotor de CUP1 de 0,4 Kb, após isolamento, purificação e restrição com BamHI e EcoRI, foi inserido em pBR322 cortado com BamHI e EcoRI. O plasmídeo resultante pBR322-CUPl foi cortado com EcoRI. O vector de 4,4 Kb contendo o promotor de CUP1 foi isolado, purificado e ligado com o fragmento da hirudina de 0,5 Kb. E. cofi HB101 foi transformada com o plasmídeo resultante pPFY53. pPFY53 foi testado quanto à orientação correcta do fragmento da hirudina por digestão com Sall. O fragmento BamHI/SalI de 1082 pb contendo o promotor de CUP1, a sequência líder de PH05, o gene da hirudina e o terminador de PH05 estão apresentados em SEQ ID NO: 1. A cassete de expressão de CUP1-hirudina foi isolada a partir de -25- pPFY53 como um fragmento Sall de 1,1 Kb. Este fragmento foi então inserido em pDP34 linearizado com Sall. E. coli HB101 foi transformada com o plasmídeo resultante pPFY56. A orientação foi testada por digestão com Kpnl. A estirpe de E. coli transformada foi designada E. coli /PFY56. pPFY56 está apresentado na Figura 1.

Exemplo 2: Construção do plasmídeo pPFY58. Coexpressão de hirudina a partir do promotor CUP1 e de ACE1 a partir do promotor ACE1 A proteína Acel é o factor de transcrição que responde ao cobre e que regula a expressão de CUP1. É expressa constitutivamente. A regulação ocorre após a tradução. O gene ACE1 (P. Fuerst et ai, (1988) Cell 55, 705-717) foi clonado a partir de DNA genómico de cerevisiae por reacção em cadeia com polimerase (PCR) usando o estojo de PCR da Perkin Elmer e as duas sequências oligonucleotídicas iniciadoras que se seguem: 5 1 -GATATCGATCGTGAAAGAATATTTGCT SEQ ID NO: 6 5 ' -GATATCATGAGGATGATGACAAAGAAGAC SEQ ID NO:7 100 ng de DNA genómico de levedura foi incubado em 0,1 ml com 2,5 unidades de polimerase do DNA Taq, 0,02 mM de cada sequência iniciadora e 0,2 mM de dATP, dCTP, TTP e dGTP em Tris 10 mM pH 8,3, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM. A reacção foi incubada durante 30 ciclos: 30 seg a 92°C, durante 1 min a 42°C e a 72°C durante 1 min. O fragmento de 1,7 Kb do gene ACE1, após isolamento, purificação e restrição com EcoRV, foi inserido no sítio único SnaBl de pPFY56 (exemplo 1) conduzindo ao plasmídeo pPFY58 que foi usado para transformar E. coli HB101. A orientação foi testada por restrição com Ncol. -26- A estirpe de E. coli transformada foi designada E. coli/PFY58. pPFY58 está apresentado na Figura 2.

Exemplo 3: Construção do plasmídeo pPFY59R. Coexpressão de dessulfato-hirudina a partir do promotor de CUP1 e de ACE1 a partir de CUP1

Para se conseguir um nível de expressão bem regulado e elevado de ACEl, o promotor constitutivo de ACEl presente no fragmento EcoRV de 1,7 Kb (exemplo 2) foi trocado pelo promotor de CUP1. Para a fusão das sequências codificadoras de ACEl com o promotor de CUP1, introduziu-se por mutagénese dirigida um sítio EcoRI a montante do codão de iniciação de ACEl. O fragmento EcoRV de 1,7 Kb (exemplo 2) contendo o gene ACEl foi subclonado no local EcoRV do vector pBluescriptKS+ (Stratagene, La Jolla, Ca, USA) para dar o plasmídeo pKSACEl. Para introduzir um novo sítio EcoRI por mutagénese in vitro usando o método de uracilo-DNA (estojo Bio-Rad Muta-Gene Ml3, Bio-Rad, Richmond, Ca, USA) usou-se como sequência iniciadora o oligonucleótido que se segue: 5 ' -CTGATAATCAGTGAATTCACAGAATG- 3 ' SEQ ID NO:7

Em primeiro lugar, pKSACEl foi usado para transfectar E. coli CJ236 para incorporar uracilo (estojo Muta-Gene, supra). O DNA de cadeia simples derivado de CJ236 transfectada foi isolado usando o fago auxiliar de M13 (Stratagene, supra). 200 pmoles do oligonucleótido foram fosforiladas num volume de 0,03 ml contendo 3 μΐ de Tris-HCl pH 8,0, 0,3 μΐ de Tris-HCl 1M pH 8,0, 0,3 μΐ -27- de MgCl2, 0,75 μΐ de DTT 0,2M, 0,6 μΐ de ATP 20 mM e 5 unidades de cinase de polinucleótidos de T4. A mistura foi incubada a 37°C durante 60 min e a 65°C durante 15 min. O oligonucleótido fosforilado foi emparelhado com o DNA molde como se segue: 0.1 pmoles de DNA contendo uracilo derivado de pKSACEl foram incubados com 2 pmoles de sequência iniciadora fosforilada em 10 μΐ de tampão de emparelhamento (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, MgCl2 2mM, NaCl 50 mM). A mistura foi incubada durante 10 min a 80°C e depois deixada arrefecer lentamente a 25°C.

Subsequentemente a cadeia complementar foi sintetizada: 10 μΐ da reacção de emparelhamento foram incubados com 4 μΐ de dNTPs 2 mM, 0,75 μΐ de Tris-HCl 0,5M pH 7,5, 0,75 μΐ de MgCl2 0,1 M, 2,2 μΐ de DTT 0,2M, 1 unidade de polimerase do DNA de T4 e 2 unidades de ligase do DNA de T4. A mistura de reacção foi incubada em gelo durante 10 min, a 25°C durante 10 min a 37°C durante 90 min. O DNA de cadeia dupla resultante foi usado para transformar E. çoli JMIOl.Os plasmídeos foram preparados e analisados relativamente ao sítio EcoRI correcto. Um plasmídeo com o novo sítio EcoRI foi designado pKSACEl-Eco. O fragmento EcoRI de 1,5 Kb derivado de pOSACEl-Eco que contem a sequência codificadora de ACE1 e as sequâncias de terminação sem o promotor ACE1 foi clonado no sítio EcoRI do vector pBR322-CUPl (exemplo 1) para colocar ACE1 sob o controlo do promotor CUP1. O plasmídeo resultante pCup-ACE foi usado para transfectar E. çoli HB101. O fragmento BamHI/SnaBl de 1,2 Kb derivado de pCup-ACE foi ligado ao vector pDP34 linearizado com BamHA, 30 fmoles do fragmento BamHI/SnaBl, Tris 20 mM pH 7,5, MgCl2 1 mM, DTT 1 mM, ATP 0,1 mM e 1 unidade de ligase do DNA de T4. Após incubação durante 60 minutos a 25°C as -28- C_Λ moléculas foram dotadas de extremos cerses em 50 μΐ contendo Tris-HCl 20 mM pH 7,5, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM. DNTPs 0,1 mM e 1 unidade do fragmento Klenow da polimerase de DNA de E. coli. A mistura foi incubada durante 10 minutos a37°C.

As moléculas de extremos cerses foram então circularizadas por ligação em 100 μΐ contendo Tris-HCl 20 mM pH 7,5, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, ATP 0,1 mM e 1 unidade de ligase do DNA de T4 durante 18 horas a 15°C. O plasmídeo resultante pPFY54 foi usado para transfectar E. coli HB101 e testado relativamante à orientação por restrição com PvuII. O fragmento Sall e 1,1 Kb do pPFY53 contendo a cassete de expressão de CUPl-hirudina (exemplo 1) foi subclonado no vector pPFY54 linearizado com Sall. O plasmídeo derivado de pPFY59R foi usado para transfectar E. coli HB101. A orientação foi testada por digestão com Kpnl. A estirpe de E. coli portadora de pPFY59R foi designada E. coli/PFY59R. pPFY59R está apresentado na Figura 3.

Exemplo 4: Construção de pPFY79. Expressão de dessulfato-hirudina a partir de dois promotores diferentes

Para aumentar os níveis de mRNA da hirudina, sequências codificadoras de hirudina podem ser simultaneamente expressas a partir de dois promotores diferentes. A cassete de expressão CUPl-hirudina foi isolada como um fragmento Sall de 1,1 Kb a partir do plasmídeo pPFY53 (exemplo 1). Este fragmento foi clonado no único sítio Sall do vector pDP34/GAPFL-Yhir. A orientação do fragmento Sall no plasmídeo resultante pPFY79 foi testada por -29- restrição com BamHI. E. coli HB101 transfectada com pPFY79 foi designada E. coli/PFY79.pPFY79 está apresentado na Figura 4.

Exemplo 5: Transformação de Saccharomvces cerevisiae estirpe Trl456 com os plasmideos pPFY56. pPFY58. pPFY59R. pPFY79 e pDP34- GAPFL-Yhir

Saccharomvces cerevisiae estirpe Trl456 foi construída como descrito no Pedido de Patente Europeia N° 341215. Partindo de Saccharomvces cerevisiae estirpe H449, em duas séries subsequentes de experiências as duas carboxipeptidases ysca e yscY foram removidas da estirpe H449 através da interrupção dos seus genes codificadores KEX1 e PRC1, respectivamente. Primeiro foi interrompido o gene codificador de ysca, KEX1. Para tal, a estirpe H449 foi transformada com um fragmento de DNA codificador do gene KEX1, com a totalidade do gene URA3 inserida no meio da região codificadora de KEX1. Os transformantes prototróficos para uracilo foram seleccionados e testados relativamente à ausência de actividade ysca. Em seguida o gene URA3 inserido no locus KEX1 foi interrompido através da transformação com um plasmídeo contendo uma versão interrompida do gene URA3, ura3A (ver Pedido de Patente Europeia N° 341215). Os transformantes que auxotróficos ura3 foram seleccionados e no passo seguinte interrompidos no seu gene endógeno PRC1 codificador da carboxipeptidase yscY. A experiência foi realizada de forma análoga ao descrito para a disrupção de KEX1. O derivado isogénico resultante da estirpe H449 foi designado Trl456 e tem o seguinte genótipo:

Trl456 = MATa, leu2-3, 112, ura3, prbl, kex::ura3, prcl::ura3, [cir°] A transformação da estirpe Trl456 com os plasmideos pDP34/GAPDL - Yhir, pPFY56, pPF58, pPFY59R e pPFY79 foi realizada de -30- acordo com Dohem et al. [1989, Curr. Genet. 15, 319-325]. As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para leveduras suplementado com leucina e deficiente em uracilo. Os clones de levedura transformados foram isolados e referidos como:

Saccharomvces cerevisiae Trl456/pDP34/GAPL-Yhir Saccharomvces cerevisiae Trl456/pPFY 56 Saccharomvces cerevisiae Trl456/pPFY58 Saccharomvces cerevisiae Trl456/pPFY59R Saccharomvces cerevisiae Trl456/pPFY79

Exemplo 6: Expressão de dessulfato-hirudina em meio mínimo com diferentes concentrações de cobre Células de Saccharomvces cerevisiae Trl456/pPFY56, Saccharomvces cerevisiae Trl456/pPFY58 e Saccharomvces cerevisiae Trl456/pPFY59R foram cultivadas em duas culturas subsequentes compostas por (g/1):

Base azotada de levedura Difco (sem aminoácidos) 6,7 L-asparagina 10 L-histidina 1 L-leucina 0,1

Glucose 20

As primeiras culturas foram cultivadas durante 60 h a 30°C e 180 rpm. As segundas culturas foram inoculadas com 2% (volume por volume) das primeiras culturas e crescidas durante 24 horas a 30°C e 180 rpm. Após 24 h as culturas foram centrifugadas, as células lavadas uma vez com soro fisiológico e ressuspensas no volume original de meio fresco (ver acima), ao qual foram -31 - Μ^γΙη C_ adicionadas diferentes concentrações de sulfato de cobre. As células foram cultivadas durante mais 24 horas a 30°C e 180 rpm, após o que as células foram removidas por centrifugação e a quantidade de dessulfato-hirudina no sobrenadante medida por HPLC conforme descrito no pedido de patente 340170. Os resultados estão resumidos na Tabela 1.

Tabela 1: Expressão de dessulfato-hirudina em meio mínimo

Dessulfato-hirudina (mg/1)

Concentração de sulfato de cobre (mM) 0 0,05 0,125 0,25 0,4 Trl456/pPFY56 2 1 20 20 11 Trl456/pPFY58 8 24 20 12 3 Trl456/pPFY59R 3 23 23 10 1

Nas condições escolhidas, a dessulfato-hirudina é expressa em todos os transformantes contendo uma das construções de plasmídeo. A expressão é estrictamente dependente de cobre, uma vez que na ausência do suplemento de cobre encontra-se pouca dessulfato-hirudina. A concentração de cobre óptima nestas condições é entre 0,05 e 0,25 mM.

Exemplo 7: Comparação dos títulos de dessulfato-hirudina sob o controlo do promotor GAPFL em oposição ao promotor CUP1 em meio complexo

Anteriormente, conforme descrito no Pedido de Patente Europeia N° 340 170, a expressão de dessulfato-hirudina foi optimizada em meio complexo rico sob o controlo de um fragmento curto do promotor forte GAPDH. Assim, os plasmídeos contendo o promotor CUP1 foram comparados nas condições -32- anteriormente descritas, adição de cobre +/-. Foi ainda determinada a altura óptima para a adição de cobre. Células de Saccharomvces cerevisiae TR1456/pPFY56 ou TR1456/pPFY58 ou TR1456/pPFY59R ou TR14546/pDP34/GAPFL-Yhir foram cultivadas, em duas pré-culturas subsequentes, em 20 ml de meio sintético composto por (g/1):

Base azotada de levedura Difco (sem aminoácidos) 6,7 L-asparagina 10 L-histidina 1 L-leucina 0,1

Glucose 20 O pH do meio foi ajustado a 5,8. A primeira pré-cultura foi crescida durante 60 h a 28°C e 180 rpm. A segunda pré-cultura foi inoculada com 2% (volume por volume) da primeira pré-cultura e incubada durante 24 h a 28°C e 180 rpm. O meio da cultura principal é composto por (g/1): peptona 5 extracto de levedura 10 glucose 20 sucrose 40 sulfato de amónio 3 di-hidrogenofosfato de potássio 2 sulfato de magnésio hepta-hidrato 0,5 cloreto de sódio 0,1 cloreto de cálcio 0,1 biotina 10-5 -33-

C &>*· A cultura principal (100 ml de meio) foi inoculada com cerca de 2 x 106 células/ml e incubada durante 96 h a 28°C e 180 rpm. Sulfato de cobre estéril numa concentração de 200 μΜ foi adicionado às culturas principais às 0 h, 7 h, 11 h, 14 h ou 24 h após inoculação da cultura principal. No final da fermentação retiraram-se alíquotas da cultura, as células foram removidas por filtração e o sobrenadante da cultura foi analisado relativamente à dessulfato-hirudina como descrito atrás. Os resultados estão apresentados na tabela 2 que se segue.

Tabela 2: Influência da altura da indução do promotor na produção de dessulfato-hirudina controlada por CUP1 em meio complexo

Secreção de dessulfato-hirudina (mg/1)

Altura da adição de cobre (h após inoculação da cultura principal) Estirpe/plasmídeo 0 7 11 14 24 Testemunha* TR1456/pPFY56 123 104 79 71 72 10 TR1456/pPFY58 185 170 143 94 100 13 TR1456/pPFY59R 146 117 88 95 105 18 TR1456/pPD34/ GAPFL-Yhir 127 131 135 121 105 111 *nenhum cobre foi adicionado à cultura principal A maior expressão de dessulfato-hirudina a partir do promotor de CUP1 foi obtida quando o promotor foi usado de forma "pseudo-constitutiva" (i.e., a indução do promotor ocorre juntamente com a inoculação da cultura principal) e quando o gene ACE1 estava presente no plasmídeo que contem a cassete de expressão da hirudina. Inesperadamente, nas condições de indução que são aqui descritas, obtêm-se títulos mais altos de hirudina com as estirpes S. cerevisiae TR1456/pPFY58 e TR1456/pPFY59R do que com a estirpe SL cerevisiae TR1456/pDP34/GAPFL-Yhir que contem uma cassete de expressão da -34- hirudina sob o controlo de uma versão melhorada do promotor forte constitutivo de GAPDH.

Exemplo 8: Ootimizacão da concentração de cobre para a secreção de dessulfato-hirudina controlada por CUP1 em meio complexo Células de Saccharomvces cerevisiae TR1456/pPFY56, TR1456/pPFY58, TR1456/pPFY59R ou TR1456/pDP34/GAPFL-Yhir foram cultivadas em duas pré-culturas subsequentes, em 20 ml de meio sintético, como descrito na secção anterior. A cultura principal foi cultivada no meio descrito atrás e inoculada com cerca de 2 x 106 células/ml e incubada durante 96 h a 28°C e 180 rpm. Imediatamente após a inoculação das culturas principais, adicionou-se ao meio sulfato de cobre estéril nas concentrações que se seguem: 0 μΜ, 50 μΜ, 200 μΜ, 500 μΜ, 1 mM, 2,5 mM ou 5 mM. No final da fermentação retiraram-se alíquotas das culturas, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante da cultura foi analisado relativamente à dessulfato-hirudina como descrito atrás. Os resultados estão apresentados na tabela 3.

Tabela 3: Influência da concentração de sulfato de cobre na secreção de dessulfato-hirudina HV1 controlada por CUP1

Secreção de dessulfato-hirudina (mg/1)

Concentração de sulfato de cobre no meio (μίν [) Estirpe/plasmídeo 0 50 200 500 1000 2500 5000 TR1456/pPFY56 8 70 113 176 236 182 35 TR1456/pPFY58 11 159 169 168 174 177 38 TR1456/pPFY59R 22 100 130 194 233 129 46 TR1465/pDP34/ GAPFL-YHir 128 125 120 123 136 119 26 -35- C—.(

Em concentrações óptimas de cobre, foram obtidos títulos consideravelmente mais altos de dessulfato-hirudina quando foi usada uma cassete de expressão CUPl-Yhir do que quando a cassete de expressão da hirudina estava sob o controlo do fragmento GAPFL constitutivo forte do promotor GAPDH. Em concentrações de sulfato de cobre abaixo de 200-500 μΜ, os plasmídeos pPFY58 e pPFY59R que contêm o gene do activador da transcrição ACE1 são superiores ao plasmídeo pPFY56 que não tem o gene ACE1.

Exemplo 9: Construção do plasmídeo pDP34/fGAPFL-HIRlD com duas cassetes de expressão da hirudina num arranio em tandem O plasmídeo pDP34/[GAPFL-HIR]D compreende um inserto de DNA que consiste em duas cassetes de expressão da hirudina num arranjo em tandem cabeça com cauda. As duas cassetes são idênticas e contêm a sequência codificadora da sequência sinal PH05 e dessulfato-hirudina HV1 sob o controlo de um promotor curto constitutivo GAP49 (TDH3) (GAPFL) e o terminador da transcrição PH05. O plasmídeo pJDB207/[GAPFL-HIR]D tem a cassete de expressão em tandem no vector pJDB207 de levedura. Esta construção está descrita em EP 225633. PJDB207/[GAPFL-HIR]D foi cortado no único sítio HindIII. Os extremos coesivos dos locais cortados foram convertidos em extremos cerses pela polimerase Klenow do DNA. A digestão parcial com Sall na presença de 0,01 mg/ml de brometo de etídio permite o isolamento do fragmento Sall-extremo cerse de 2,1 Kb com as duas cassetes de expressão. O plasmídeo pDP34 (ver Exemplo 1) foi cortado com BamHI, tratado com a polimerase Klenow do DNA e digerido com Sall. O fragmento grande isolado do vector foi usado para clonar o fragmento Sall-extremo cerse de 2,1 Kb. Um clone correcto foi referido como Ψ)Λ· -36- pDP34/[GAPFL-HIR]D com as cassetes em tandem clonadas numa orientação contrária aos ponteiros do relógio.

Exemplo 1 fí: Comparação dos títulos de dessulfato-hirudina obtidos usando plasmídeos com uma ou duas cassetes de expressão da hirudina. respectivamente

As células de Saccharomvces cerevisiae TR1456/pPDP34/GAPFL-Yhir, TR1456/pPFY56, TR1456/pPFY79 ou TR1456/pDP34/[GAPFL-HIR]D foram cultivadas em duas pré-culturas subsequentes seguido de uma cultura principal como descrito no Exemplo 7. A cultura principal foi inoculada com cerca de 2 x 106 células/ml e incubada durante 96 h a 28°C e 180 rpm. Imediatamente após a inoculação da cultura principal, adicionou-se sulfato de cobre estéril numa concentração de 0 μΜ, 50 μΜ, 200 μΜ, 500 μΜ, 750 μΜ, 1 mM ou 2,5 mM. No final da fermentação retiraram-se alíquotas das culturas, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante da cultura foi analisado relativamente à dessulfato-hirudina por HPLC. Os resultados estão apresentados na tabela 4 que se segue:

Tabela 4: _ Secreção de dessulfato-hirudina (mg/1)

Concentração de sulfato de cobre no meio (μΜ I) Estirpe/plasmídeo 0 50 200 500 750 1000 2500 TR1456/pPFY56 5 86 118 164 188 236 63 TR1456/pPFY79 90 158 151 192 214 233 93 TR1456/pPFY34/ [GAPFL-HIRJD 96 n.d. 84 n.d. n.d. 102 n.d. TR1456/pDP34- GAPFL-YHir 94 n.d. 88 n.d. n.d. 98 n.d. n.d. = não determinado -37-

Nas condições da experiência, o plasmídeo pPFY79 que contem uma cassete de expressão GAPFL-Yhir constitutiva e uma segunda cassete de expressão CUPl-Yhir induzível pelo cobre é superior 1.) a um plasmídeo, como seja pPD34/GAPFL-Yhir, o qual contem apenas uma cassete de expressão constitutiva, ou 2.) a um plasmídeo, como seja pPFY56/CUPl-Hir que contem apenas uma cassete de expressão induzível pelo cobre ou 3.) a um plasmídeo, como seja pDP34/GAPFL-Yhir + GAPFL-Yhir que contem duas cassetes de expressão constitutivas.

Exemplo 11: Construção de um derivado isogénico de Saccharomvces cerevisiae estirpe Trl456 resistente ao cobre

Saccharomvces cerevisiae estirpe Trl456 é - tal como a maior parte das estirpes de levedura - uma estirpe moderadamente resistente à adição de cobre ao meio. Esta resistência é devida à presença de um segmento de 2 Kb de DNA cromossómico que contem aproximadamente 3 cópias do locus endógeno CUP1 [D. Hamer, et al. Science 228 (1985), 685-690]. Na presença de grandes quantidades de cobre no meio, derivados ainda mais resistentes são obtidos devido à reiteração em tandem do segmento de DNA cromossómico contendo CUP1 de 2 Kb referido atrás. Para construir tal derivado mais resistente, S. cerevisiae Tr1456 foi inoculada em meio mínimo sintético, conforme descrito no exemplo 6, suplementado com sulfato de cobre 1,2 mM. A cultura foi cultivada durante 8 dias a 30°C e 180 rpm. A cultura foi então semeada em meio mínimo sintético sem adição de cobre, numa densidade adequada à obtenção de colónias isoladas. Preparou-se DNA a partir de colónias individuais seleccionadas, digeriu-se com EcoRI, separou-se em géis de agarose e analisou-se relativamente à presença e comprimento do locus CUP1 através de transferência Southern. As condições experimentais foram de acordo com Hamer et al. [ver atrás]. Uma -38- colónia com uma alteração na mobilidade electroforética do locus CUP1 indicadora da presença de pelo menos 10 cópias do locus CUP1 foi seleccionada e designada S. cerevisiae estirpe Tr 1631.

Exemplo 12: Transformação de S. cerevisiae estirpe Trl631 com plasmídeos nPFY56. pPFY58 e nPFY59R A transformação de S. cerevisiae estirpe Trl631 com os plasmídeos pPFY56, pPFY58, pPFY59R foi realizada como descrito atrás. Clones de levedura transformados individuais foram isolados e referidos como:

Saccharomvces cerevisiae Trl631/pPFY56 Saccharomvces cerevisiae Trl631/pPFY58 e Saccharomvces cerevisiae Trl 63 l/pPFY59R

Exemplo 13: Comparação de S. cerevisiae transformada resistente ao cobre estirpe Trl 631 com a estirpe transformada Trl456 em concentrações de cobre elevadas Células de S. cerevisiae Trl631/pPFY56, S. cerevisiae Trl631/pPFY58, S. cerevisiae Trl631/pPFY59R e células de S. cerevisiae Trl456/pPFY58, S. cerevisiae Trl456/pPFY58 e S. cerevisiae Trl456/pPFY59R foram cultivadas como descrito nos Exemplos 7 e 8. À cultura principal adicionou-se sulfato de cobre 0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM ou 4 mM imediatamente após inoculação da cultura principal. As culturas foram crescidas durante 72 horas a 30°C e 180 rpm. No final da fermentação retiraram-se alíquotas das culturas, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante da cultura foi analisado relativamente à dessulfato-hirudina por HPLC. Os resultados estão apresentados na tabela 5.

Tabela 5: Comparação da estirpe transformada Trl631 com a estirpe transformada Trl456

Dessulfato-hirudina (mg/1)

Concentração de sulfato de cobre (mM) Estirpe 0 0,5 1 2 4 TR1631/pPFY56 7 115 165 154 83 TR1631/pPFY58 6 106 115 124 103 TR163 l/pPFY59R 18 131 163 165 87 TR1465/pPFY56 5 184 239 87 39 TR1465/pPFY58 6 146 132 133 43 TR1465/pPFY59R 12 160 221 166 37

Os resultados mostram uma produtividade superior de dessulfato-hirudina na estirpe de S. cerevisiae transformada resistente ao cobre Trl631 em concentrações elevadas de cobre no meio de cultura.

Exemplo 14: Conjugação de S. cerevisiae estirpe 55.6B (cupliiURASl com S. cerevisiae estirpe TR1456 e análise dos esporos relativamente à sensibilidade ao cobre A estirpe 55.6B de SL cerevisiae (MATa his3 leu2 trpl ura3-52, cup::URA3; cf. Thiele, DJ. et al. Science (1986), 854-856) que não possui o locus CUP1 foi conjugada com a estirpe TR1456 (MATa leu2-3, 212, ura3D5 -40- kexl prcl) portadora de aproximadamente 3 cópias do locus CUP1 (i.e. 6 cópias do gene CUP1 arranjados em tandem). Células heterozigóticas diplóides do genótipo cupl::URA3/CUPl foram isoladas a partir deste cruzamento. As tétradas derivadas das células diplóides foram dissecadas de acordo com técnicas genéticas convencionais [Methods in Yeast Genetics 1986 (Sherman F., Fink G.R., Hicks J.B., eds.) Cold spring Harbor Laboratory, N.Y.]. Os descendentes dos quatro esporos de cada tétrada foram testados quanto à sua capacidade para crescer em placas de agar YPD (10 g de extracto de levedura, 20 g de peptona, 20 g de glucose e 25 g de agar por litro de água bidestilada) suplementado com sulfato de cobre 0 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ ou 1 mM. Os esporos que herdaram o gene CUP1 intacto deram origem a progénie que cresce vigorosamente em agar com cobre, enquanto que os esporos que herdaram o gene cupl::URA3 interrompido deram origem a progénie que cresce mal em agar com cobre. Os descendentes de dois esporos sensíveis ao cobre de várias tétradas foram testados quanto à sua capacidade para se conjugar com a estirpe TR1456. Os descendentes de um esporo com o tipo de conjugação adequado foram cruzados com TR1456 e as células heterozigóticas diplóides do genótipo cupl::URA3/CUPl foram isoladas a partir deste cruzamento. As tétradas que derivaram das células diplóides foram dissecadas e os esporos foram testados relativamente à sensibilidade ao sulfato de cobre como descrito atrás. As colónias sensíveis ao cobre, obtidas a partir de aproximadamente 50 tétradas completas, foram testadas relativamente ao crescimento em agar SD (6,7 g de base azotada de leveduras Bacto sem aminoácidos, 20 g de glucose e 25 g de agar por litro de água) e em agar SD suplementado com leucina 200 M. As colónias que não cresceram em placas SD mas que cresceram em agar SD suplementado com leucina 200 M têm o genótipo cupl::URA3, HIS3, TRP1, leu2-3,212 e foram seleccionadas para análise posterior.

Exemplo 15: Classificação dos mutantes cupl::URA3 confirmados relativamente à deficiência adicional da protease vscY e da protease vsc alfa e transformação dos mutantes

Os mutantes cupl::URA3 de S. cerevisiae obtidos conforme descrito no exemplo 14 foram ainda classificados relativamente à deficiência em proteases codificadas pelos genes KEX1 e PRC1. As colónias deficientes no gene KEX1 foram identificadas com base na sua capacidade reduzida para secretar o factor a. No Pedido de Patente Europeia N° 341215, exemplo 1 aí incluído, pode ser encontrada uma descrição detalhada do processo usado para discriminar entre colónias portadoras de um gene KEX1 selvagem e as colónias mutagenizadas no gene kexl. As colónias deficientes no gene PCR1 foram identificadas por meio de um teste bioquímico que mede a actividade proteolítica do produto do gene PCR1, nomeadamente protease yscY. Este teste foi descrito em EP 341215. Uma colónia individual do genótipo cupl::URA3 kexl prcl leu2-3,212 foi repicada e designada Saccharomvces cerevisiae HT462/TH3. As células da estirpe HT462/TH3 foram transformadas respectivamente com o plasmídeo pDP34/GAPFL-YHIR, plasmídeo pPFY56, plasmídeo pPFY58 ou plasmídeo pPFY59R. O método usado para a transformação foi descrito em EP341215. Repicaram-se colónias de levedura transformadas individuais contendo o plasmídeo pPFY56, plasmídeo pPFY58, plasmídeo pPFY59R ou plasmídeo pDP34-GAPFL-YHIR. Escolheu-se uma colónia transformada de cada tipo para trabalho posterior e foram designadas como

Saccharomvces cerevisiae TH3/pPFY56,

Saccharomvces cerevisiae TH3/pPFY58,

Saccharomvces cerevisiae TH3/pPFY59R e

Saccharomvces cerevisiae TH3/pDP34/GAPFL-YHIR, respectivamente.

Exemplo 16: Fermentação da estirpe TH3 transformada numa escala laboratorial Células de Saccharomvces cerevisiae TH3/pDP34/GAPFL-YHIR, Saccharomvces cerevisiae TH3/pPFY56 ou Saccharomvces cerevisiae TH3/pPFY58 foram cultivadas em duas pré-culturas subsequentes de 20 ml de meio sintético como descrito no exemplo 7. A cultura principal foi cultivada no meio complexo descrito no exemplo 7. Foi inoculada a cerca de 2 x 106 células/ml e incubada durante 66 h a 28°C e 180 rpm. Imediatamente após a inoculação das culturas principais, adicionou-se ao meio sulfato de cobre estéril nas seguintes concentrações: 0 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 25 μΜ, 50 μΜ, 100 μΜ e 500 μΜ. No final da fementação retiraram-se amostras das culturas, as células foram removidas por filtração e o sobrenadante da cultura foi analisado relativamente à dessulfato-hirudina por HPLC. Os resultados estão apresentados na tabela 6 que se segue:

Tabela 6:

Secreção de dessulfato-hirudina (mg/1)

Concenl tração de sulfato de cobre no meio (μΜ) Estirpe/plasmídeo 0 5 10 25 50 100 200 500 TH3/pPFY56 99 106 103 105 104 95 85 34 TH3/pPFY58 110 117 110 112 113 107 95 113 TH3/pDP34/GAPFL- YHIR 75 77 73 71 73 66 53 41

Numa estirpe hospedeira, como seja TH3, cuja cópia cromos-sómica do gene CUP1 foi eliminado, a melhor produção de hirudina foi obtida quando foi introduzido um plasmídeo que contem, para além da cassete de expressão CUPl-Yhir, uma cópia do gene ACE1 sob o contolo do promotor -43- ACE1. A concentração óptima de sulfato de cobre para a indução do promotor é consideravelmente mais baixa do que quando é usada uma estirpe contendo 3 ou mais cópias do locus CUP1.

Exemplo 17: Produção de dessulfato-hirudina variante HV1 numa escala de 501

Um banco de trabalho de células da estirpe transformada de Saccharomvces cerevisiae Tr456/pPFY56 ou da estirpe Saccharomvces cerevisiae Trl456/pDP34/GAPFL-YHIR foi usado como fonte de inoculo para a produção de dessulfato-hirudina numa escala de 50 1.

Ampolas do banco de trabalho de células foram preservadas na fase de vapor num contentor de azoto líquido. O conteúdo de uma ampola foi usado para inocular um cultura num frasco de agitação, contendo um meio selectivo consistindo em (g/1)

Base azotada de levedura 8,4 L-asparagina mono-hidrato 11,4 L-histidina 1,0 L-leucina 0,1 D-glucose mono-hidrato 20,0 O frasco de 500 ml contem 100 ml de meio e foi incubado durante 48 horas a 28°C num agitador orbital, a uma velocidade de agitação de 180 rev/min. A segunda pré-cultura em frasco de agitação consiste no mesmo meio do qual 600 ml estão num frasco de 2 1 que tem quatro antivortex. A quantidade de inoculo da primeira pré-cultura é 5% do volume (30 ml) e os - 44 - frascos foram incubados durante 48 horas a 28°C num agitador orbital a uma velocidade de 120 rev/min.

Uma terceira pré-cultura foi fermentada num bio-reactor de aço inoxidável de 50 1 equipado com 4 antivortex e um agitador de turbina de disco único com um diâmetro de 115 mm. O meio acima foi também usado para esta cultura, sendo o volume de partida de 30 1. Um único frasco de 2 1 contendo 600 ml de cultura foi usado para inocular o bio-reactor de 50 1 (2,5%). A fermentação durou 48 h a uma temperatura de 28°C. A velocidade de agitação foi de 600 rev/min, a velocidade de arejamento foi de 0,5 vvm e o reactor foi operado com uma sobrepressão de 0,3 bar.

Um bio-reactor semelhante de 50 1, equipado para processos de fed-bactch, foi usado para a fase de produção de dessulfato-hirudina. Um meio consistindo em (g/1)

Peptona de came (Merck) 6,0 Extracto de levedura 37,5 Sulfato de amónio 6,0 Sulfato de magnésio hepta-hidrato 1,0 Cloreto de sódio 0,1 di-hidrogenofosfato de potássio 4,0 foi usado nesta fase. O volume de partida foi reduzido para 24 1 para compensar a solução de glucose mono-hidrato adicionada durante a fermentação. O inoculo da terceira fase de pré-cultura foi de 2,5%. A fermentação durou 78 h, a uma temperatura de 28°C e a velocidade de agitação foi ajustada a 900 rev/min. A sobrepressão foi inicialmente estabelecida a 0,3 bar e foi aumentada após 48 h para 1,0 bar. O fluxo de ar inicial foi de 0,25 wm mas este foi aumentado para -45 - 0,5 vvm após 9 h, para 0,75 vvm após 24 h e finalmente um posterior aumento para 1,0 vvm após 48 h. O aumento da sobrepressão e velocidade de arejamento no decurso da fermentação foi realizado para assegurar um fornecimento adequado de oxigénio e para manter a tensão de oxigénio dissolvido acima de 20% de saturação do ar.

Após a inoculação adicionou-se à cultura 10 g de sulfato de cobre penta-hidrato, dissolvido em 500 ml de água desionizada, para iniciar a expressão da dessulfato-hirudina que está sob o controlo do promotor CUP1. O valor de pH cai durante a parte inicial da fermentação para um valor de 5,0 que é mantido através do fornecimento automático de hidróxido de amónio. Para evitar a produção excessiva de etanol através do crescimento de células de levedura, foi fornecida uma solução concentrada de glucose mono-hidrato (70% p/v) a uma velocidade inicial constante de 60 ml/h. Após 18 h a velocidade de alimentação foi aumentada linearmente com um factor de 5 ml/h. Após 18 h a velocidade de alimentação foi aumentada linearmente com um factor de 5 ml/h atingindo um valor final de 360 ml/h no final da fermentação. Este fornecimento limitado da fonte de carbono (tecnologia de carga alimentada) suporta uma concentração de biomassa final e um título de dessulfato-hirudina consideravelmente superiores relativamente a uma cultura de carga simples.

Quando necessário, usaram-se pequenas adições de um composto anti-espuma baseado em silicone. Uma fracção do gás que se liberta do bio-reactor foi analisada em paralelo para proporcionar informação acerca do consumo de oxigénio e velocidade de libertação de dióxido de carbono. A tensão de oxigénio dissolvido foi também medida em simultâneo usando um eléctrodo esterilizável tipo Clark. -46-

Retiraram-se amostras com intervalos de 6 horas ao longo da fermentação e mediu-se a densidade óptica (DO) e analisou-se glucose, etanol, fosfato e magnésio. O título da dessulfato-hirudina foi controlado por HPLC. No final da fermentação a dessulfato-hirudina secretada foi recuperada a partir do sobrenadante de cultura. O título da fermentação de S. cerevisiae estirpe Trl456/pPFY56 foi comparado com uma fermentação idêntica de S. cerevisiae estirpe Trl456/pDP34/GAPFL-YHIR, sem adição de cobre. Os resultados estão apresentados na tabela 7.

Tabela 7: Comparação entre a expressão consititutiva (GAPFL-Hir) e regulada (CUPl-Hir) de dessulfato-hirudina na estirpe Trl456. DO: densidade óptima; Sp. Hir: produção específica de dessulfato-hirudina. 1456/pDP34-GAPFL-YHIl R 1456/PPFY56 Tempo (h) DO Hirudina (mg/1) sp. Hir (mg/DO) DO Hirudina (mg/1) sp. Hir (mg/DO) 24 17 78 4,59 21 61 2,90 30 37 166 4,49 49 220 4,49 36 64 289 4,52 76 319 4,20 42 86 421 4,90 94 541 5,76 48 99 519 5,24 114 613 5,38 54 142 613 4,32 120 901 7,51 60 142 746 5,25 138 1234 8,94 66 144 835 5,80 129 1442 11,18 72 149 891 5,98 128 1654 12,92 78 - - - 137 1793 13,09

Com o sistema CUP1 não só o título final da dessulfato-hirudina -47- como também a produtividade específica de dessulfato-hirudina é consideravelmente melhorada comparativamente com o sistema GAPFL-YHIR.

Exemplo 18: Isolamento e purificação de dessulfato-hirudina variante HV1 produzida numa escala de 501 A dessulfato-hirudina foi isolada a partir do caldo de cultura de 501 de fermentação, usando a estirpe de levedura Trl456/pPFY56 (ver exemplo 17). Foram realizados controlos, para monitorização da pureza, por cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa e cromatografia de permuta aniónica analítica. Os dados obtidos foram comparados com os resultados de uma fermentação de 501 usando a estirpe de levedura Trl456/pDP34-GAPFL-YHir.

Após terminação da fermentação o pH foi ajustado a cerca de 3 e o caldo de cultura aplicado numa resina polimérica hidrofóbica. A resina com a dessulfato-hirudina adsorvida foi lavada com NaCl 1M e eluída com tampão de acetato de amónio. Na fracção contendo a actividade proteica, foram ajustados o pH (pH 3) e a conductividade. A dessulfato-hirudina foi então ainda purificada usando cromatografia de permuta catiónica (Macro-Prep S, Biorad) seguido de ultrafiltração. Para remover os compostos de alto peso molecular e impurezas coradas utilizou-se filtração em gel. Após ajustamento do pH a 5, a fracção contendo dessulfato-hirudina foi sujeita a cromatografia em resina de permuta aniónica (Macro-Prep Q, Biorad). A solução de dessulfato-hirudina obtida foi analisada relativamente à pureza por HPLC de fase reversa e cromatografia de permuta aniónica. O teor em cobre foi determinado usando espectroscopia de emissão de plasma.

Os dados experimentais indicam que a produção de dessulfato-hirudina com a estirpe Trl456/pPFY56 conduz a pelo menos uma qualidade igual -48- C_Λ* de dessulfato-hirudina por HPLC e pureza por FPLC como se fosse produzida com a estirpe Trl456/pDP34-GAPFL-YHir. Com os títulos mais elevados obtidos na fermentação induzida por cobre, são obtidos maiores rendimentos de dessulfato-hirudina no processamento posterior. A adição de cobre ao meio de fermentação não causa alteração significativa no padrão de subprodutos. Os dados mostram que o cobre pode ser facilmente passado para níveis de ppm baixos.

Exemplo 19: Construção de pFBY23 2 pg de pFBY2 foi totalmente clivado por FspI em tampão CA (Tris (hidroximetil)aminometano 20 mM; MgCl2 7 mM; ditiotreitol 5 mM; KC1 100 mM; HC1 para pH 7,5). A endonuclease de restrição foi inactivada por aquecimento a 65°C, durante 10 min. O volume foi duplicado pela adição de água e os fragmentos de DNA foram dotados de extremos cerses com 1 unidade de polimerase de T4 na presença de dATP, dCTP, dGTP e dTTP 0,05 mM cada durante 30 minutos a 37°C. A enzima foi inactivada pelo calor a 65°C, durante 10 min. Após precipitação com etanol o DNA foi novamente cortado com HindIII e EcoRI. Estes fragmentos foram separados num gel de 2% de LTG (agarose de temperatura de gelificação baixa) em tampão TAE (Tris(hidroximetil)amino-metano 40 mM; Ácido etilenodiaminatetracético (sal di-sódico) 2 mM Ácido acético para pH7,6. Os fragmentos de 170 pb e 523 pb foram cortados e os DNAs purificados por cromatografia em ElutipD®.

Cortou-se totalmente 2 pg de pTZ18R com EcoRI e HindIII em tampão CA. Estes fragmentos foram separados num gel de 0,8% de LTG em tampão TAE. A banda de 2,8 Kpb foi removida e o DNA purificado por cromatografia em ElutipD®. -49-

Aproximadamente 20 ng de cada um dos fragmentos preparados foram ligados com 10 pM de um adapatador BamHI não fosforilado com a sequência GGGATCCC, ATP 1 mM e tampão de ligação, com 0,5 unidades de ligase de T4 durante 3 horas à temperatura ambiente.

Esta mistura de ligação foi usada para transformar 40 μΐ de células competentes E. coli DH5ctF e semeadas em placas de 2YT (16 g de Triptona; 10 g de extracto de levedura; 10 g de NaCl por litro de H2O) contendo ampicilina, Xgal e IPTG. Para confirmar pFBY23, repicaram-se colónias brancas após 16 h de incubação a 37°C e testaram-se usando dupla digestão com EcoRI/HindIII para confirmar a presença do inserto correcto e uma dupla digestão HindIII/BamHI para mostrar o adaptador BamHI no sítio FspI anterior.

Exemplo 20: Construção de pFBY24 2 pg de pFBY23 foram totalmente clivadas por HindIII e EcoRI em tampão CA. Estes fragmentos foram separados num gel de 0,8% de LGT em tampão TAE. A banda de 701 pb foi removida e o DNA purificado por cromatografia em ElutipD®. 2 pg de pFBY2 foram totalmente clivadas por HindIII e PstI em tampão CA. Estes fragmentos foram separados num gel de 0,8% de LGT em tampão TAE. O fragmento de 3,8 Kpb foi removido e o DNA purificado por cromatografia em ElutipD®. 2 pg de pFBY2 foram totalmente clivadas por PstI e Xbal em tampão CA. Estes fragmentos foram separados num gel de 0,8% de LGT em tampão TAE. O fragmento de 1,95 Kb foi removido e o DNA purificado por cromatografia em ElutipD®. -50- -50-

*Λ 2 pg de pFBY2 foram totalmente clivadas por Xbal e EcoRI em tampão CA. Estes fragmentos foram separados num gel de 0,8% de LGT em tampão TAE. O fragmento de 2,9 Kb foi removido e o DNA purificado por cromatografia em ElutipD®.

Aproximadamente 20 ng de cada um dos fragmentos preparados foram ligados em conjunto na presença de ATP 1 mM e tampão de ligação, com 0,5 unidades de ligase de T4, durante 3 horas, à temperatura ambiente.

Esta mistura de ligação foi usada para transformar 40 μΐ de células competentes E. coli DH5aF' e semeadas em placas de 2YT contendo ampicilina, Xgal e IPTG. Após 16 de incubação a 37°C, as colónias brancas foram repicadas e testadas usando digestões duplas HindIII/EcoRI e PstI/Xbal para confirmar a presença dos insertos correctos e BamHI para mostrar a presença do novo sítio BamHI. PFBY24 é idêntico a pFBY2 com as sequências completas dos plasmídeos pTZ18R e 2 μ separadas por sítios de repetições directas FRT, excepto para a inserção de um sítio BamHI no local FspI no extremo 3' do gene FLP.

Exemplo 21: Construção de pFBY74 2 pg de pFBY29 foram totalmente clivadas por BamHI em tampão CA. Estes fragmentos foram separados num gel de 0,8% de LGT em tampão TAE. A banda de 2,0 Kpb foi removida e o DNA purificado por cromatografia em ElutipD®. -51 - Μ 2 pg de pFBY24 foram totalmente clivadas por BamHI em tampão CA. Os grupos fosfato 5' foram removidos com 500 unidades de BAP em tampão BAP (Tris(hidroximetil)aminometano 50 mM; NaCl 50 mM; HC1 até pH 8,0) a 65°C durante 30 minutos para evitar a autoligação do vector. Estes fragmentos foram separados num gel de 0,8% de LGT em tampão TAE. A banda de 9,3 Kb foi removida e o DNA purificado por cromatografia em ElutipD®.

Aproximadamente 20 ng dos fragmentos preparados foram ligados em conjunto na presença de ATP 1 mM e tampão de ligação, com 0,5 unidades de ligase de T4, durante 3 horas, à temperatura ambiente. Esta mistura de ligação foi usada para transformar 40 μΐ de células competentes E. coli DH5otF que se semearam em placas de 2YT contendo ampicilina, Xgal e IPTG. Após 16 de incubação a 37°C, as colónias brancas foram repicadas e testadas usando BamHI e uma digestão dupla com Sall/Xbal para confirmar a presença e orientação dos insertos correctos. O gene LEU2 está na mesma orientação de ampR de pFBY74. PFBY74 é um LEU2 simétrico contendo o plasmídeo dois micra que perde as sequências bacterianas em levedura.

Exemplo 22: Construção dos plasmídeos pMK5xl e pMK5x2: Dois plasmídeos simétricos de 2 micra que perdem as sequências bacterianas em levedura e contêm a cassete de expressão CUPl-hirudina 2 pg g do plasmídeo pFBY4 foram clivadas com EcoRI. O fragmento de DNA obtido foi separado num gel de 0,8% de agarose, removido e purificado por cromatografia em ElutipD® (Schleicher und Schtill, Dassel, Germany). O fragmento foi subsequentemente dotado de extremos cerses com 1 unidade de polimerase de T4 na presença de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 0,05 mM cada, durante 30 minutos a 37°C. A plimerase foi inactivada pelo calor a 65°C durante 10 min. -52-

Aproximadamente 30 ng do fragmento foram ligadas com 0,4 pmoles de um adaptador Sall desfosforilado com a sequência GGTCGACC e ATP 1 mM, com 0,5 unidades de ligase de T4, durante 3 horas à temperatura ambiente. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes R coli DH5aF' (Hanahan, D.: J. Mol. Biol. 166 (1983), 557 e as células foram semeadas em meio LB com ampicilina. As colónias resistentes à ampicilina foram repicadas e analisadas cortado o DNA plasmídico com Sall para mostrar a presença do adapatador Sall no anterior sítio EcoRI. O plasmídeo obtido foi desigando pMK2. 2 μg de pMK2 foram clivadas com BamHI. Os grupos fosfato 5' foram removidos com 500 unidades de BAP (fosfatase alcalina bovina) em tampão BAP a 65°C durante 30 minutos. O fragmento foi separado num gel preparativo de 0,8% de agarose, removido e purificado por cromatografia em ElutipD© (Schleicher und Schull, Dassel, Germany). O fragmento foi subsequentemente dotado de extremos cerses com 1 unidade de polimerase de T4 na presença de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 0,05 mM cada, durante 30 minutos a 37°C. A polimerase foi inactivada pelo calor a 65°C durante 10 min. 2 pg de pPFY53 (ver exemplo) foram clivadas com Sall. O fragmento de 1,3 Kb contendo a cassete de expressão CUPl-hirudina foi separado num gel de 0,8% de agarose, purificado e dotado de extremos cerses com polimerase de T4 como descrito atrás. Aproximadamente 20 ng de cada um dos fragmentos preparados foram ligados em conjunto na presença de ATP 1 mM com 0,5 unidades de ligase de T4 durante 3 horas à temperatura ambiente. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5aF' (Hanahan, D.: J. Mol. Biol. 166 (1983), 557 e as células foram semeadas em meio LB com ampicilina. As colónias resistentes à ampicilina foram repicadas e -53- -53- ¢-1 C—Λ analisadas para confirmar a presença do inserto correcto e para determinar a orientação. Os plasmídeos gerados foram designados pMK3/l e pMK3/2. pMK3/l contem a cassete de expressão CUPl-hirudina na mesma orientação comparado com o gene URA3, enquanto pMK3/2 contem os respectivos genes na orientação contrária. 2 pg de pFBY74 foram cortadas com SnaBI. Os grupos fosfato 5' foram removidos com BAP e o fragmento de DNA obtido foi purificado num gel de 0,8% de agarose seguido de cromatografia em ElutipD® como descrito atrás. 2 pg de pMK3/2 foram cortadas com Sall. O fragmento de 2,6 Kb, contendo a cassete de expressão CUPl-hirudina e o gene URA3 foi purificado em gel e dotado de extremos cerses como descrito atrás. PFBY74 e o fragmento pMK3/2, aproximadamente 20 ng de cada, foram ligados em conjunto e usados para transformar células competentes E. coli DH5aF', como descrito atrás. As colónias resistentes à ampicilina foram analisadas cortando o seu DNA plasmídico com Sall e Ncol para confirmar o inserto correcto e para determinar a orientação. Dois plasmídeos foram designados pMK5xl e pMK5x2. A diferença entre estes dois plasmídeos é que no primeiro a cassete de expressão CUPl-hirudina tem a orientação contrária ao gene LEU2 e no último tem a mesma orientação do gene LEU2.

Exemplo 23: Alteração do tipo de conjugação da estirpe TR1456 A geração de uma estirpe diplóide de levedura normalmente ocorre através da conjugação de duas estirpes haplóides do tipo α e a, respectivamente. Para se obter a versão diplóide isogénica da estirpe haplóide TR1456, o tipo de conjugação a ( ver Exemplo 5), o tipo de conjugação oposto de Trl456 teve de ser manipulado através da alteração do tipo de conjugação. O fundamento e princípio deste método estão descritos em Herskowitz e Jensen (1991), Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 132-146. -54- A estirpe TR1456 foi transformada com o plasmídeo pGAL-HO, que contem o gene da endonuclease HO sob o controlo do promotor GAL10, a marca URA3 e as funções CEN4 (Herskowitz e Jensen (1991), Methods in Enzymology, Col. 194, p. 132-146). A transformação e selecção em meio mínimo para leveduras suplementado com leucina e deficiente em uracilo foram realizadas como descrito no Exemplo 5. Os clones de levedura transformados foram isolados e um clone foi crescido em 20 ml de meio sintético composto por (g/1):

Base azotada de leveduras Difco sem aminoácidos 8,4 L-asparagina 10 L-histidina 1 L-leucina 0,1

Glucose 20 A pré-cultura foi crescida durante a noite a 30°C e 180 rpm. Subsequentemente a cultura foi diluida 20 vezes no meio descrito atrás, mas contendo apenas 0,25% de glucose. A cultura foi novamente incubada a 30°C e 180 rpm e o consumo de glucose controlado usando bastonetes para testar glucose (Diabur-Test 500 ®, Boehimger Mannheim). Assim que a glucose foi consumida, adicionou-se galactose ao frasco para uma concentração final de 2% para induzir o promotor GAL10. Após 7 h de incubação a 30°C e 180 rpm, retirou-se 1 ml de cultura e as células foram lavadas e ressuspensas em 10 ml do meio complexo, descrito no Exemplo 7, e ainda incubadas durante 4 horas a 30C e 180 rpm. Subsequentemente, uma amostra das células foi retirada , diluida em água destilada e semeada numa concentração de aproximadamente 200 células por placa no seguinte meio complexo (g/1): -55-

Extracto de levedura Bacto 20

PeptonaBacto 10

Agar Bacto 20

Glucose 20

As placas foram incubadas a 30°C durante 2 dias até as colónias atingirem um tamanho de aproximadamente 2 mm.

As colónias foram então testadas relativamente ao tipo celular (a, α ou a/α) através do ensaio convencional para a produção do factor de conjugação ("ensaio de halo"). O processo usado está descrito extensivamente por Sprague (1991), Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 77-93.

Oito colónias apresentando o tipo de conjugação α foram repicadas e cada uma delas foi inoculada em 5 ml do seguinte meio complexo (g/1):

Peptona Bacto 20

Extracto de levedura Bacto 10

Glucose 20

As células foram crescidas durante 16 horas a 30°C e 180 rpm. Uma amostra das células foi retirada, diluída em água destilada e semeada numa concentração de aproximadamente 200 células por placa em meio complexo descrito atrás. As placas foram incubadas a 30°C durante dois dias até as colónias atingirem um tamanho de aproximadamente 2 mm. Estas colónias foram novamente testadas quanto ao tipo de conjugação α usando o "ensaio de halo". Concomitantemente as colónias foram repicadas para meio mínimo suplementado -56- com leucina e deficiente em uracilo como descrito no Exemplo 5. As colónias que perderam o plasmídeo pGAL-HO não podem crescer neste meio, uma vez que perderam a marca URA3.

Uma colónia que repetidamente apresenta o tipo de conjugação α e que perdeu o plasmídeo pGAL-HO, foi repicada e e riscada em meio complexo. A estirpe representa a contraparte do tipo de conjugação α isogénico de TR1456 e foi designada GPY11.

Exemplo 24: Formação de diplóides usando as estirpes TR1456a e GPY1 la

Pedaços de riscado da estirpe TR1456 e da estirpe GPY11 foram cuidadosamente misturados com um palito numa placa de YPD consistindo em (g/1):

Peptona Bacto 20

Extracto de levedura Bacto 10

Glucose 20

Agar Bacto 10 A placa foi incubada à temperatura ambiente para permitir a conjugação das células. Após aproximadamente 12 h, um inoculo da mistura de conjugação foi diluído com água destilada e uma amostra foi aplicada numa placa de YPD como uma única risca. A placa foi sujeita a micromanipulação usando um micromanipulador CIT Alcatel conjuntamente com um microscópio Leitz (ampliação de 250 vezes). Os zigotos foram facilmente detectados microscopicamente pela sua forma característica. 10-20 potenciais zigotos foram separados -57- da mistura de conjugação na placa de YPD. A placa foi então incubada à temperatura ambiente durante 2-3 dias até os zigotos terem formado colónias. O estado diplóide dos zigotos foi verificado realizando o "ensaio de halo" para a produção da feromona de conjugação como descrito atrás. As células diplóides não secretam o factor α ou o factor a.

Uma colónia diplóide confirmada foi escolhida e designada GPY18. Ela representa a versão diplóide isogénica da estirpe TR1456.

Exemplo 25: Produção de dessulfato-hirudina pelas estirpes TR1456 e GPY18 transformadas com o plasmídeo dPFY56 ou pMK5x2 crescidas em frascos de agitação em meio complexo Células da estirpe TR1456 e GPY18 foram transformadas com os plasmídeos pPFY56 (Exemplo 1) e pMK5x2 (Exemplo 22), respectivamente, como descrito no Exemplo 5.

As estirpes TR1456/pPFY56, TR1456/pMK5x2, GPY18/pPFY56 e GPY18/pMK5x2 foram crescidas numa pré-cultura (10 ml; composição descrita no Exemplo 23) durante 72 h a 28°C e 250 rpm. O meio da cultura principal (50 ml) está descrito no Exemplo 7, excepto o sulfato de cobre ser adicionado para uma concentração de 1 mM. A cultura principal foi inoculada com células da pré-cultura para uma DO 600 de 0,1. As culturas foram crescidas até 72 h a 28°C e 250 rpm. Após a fermentação as células foram removidas por centrifugação e a quantidade de dessulfato-hirudina nos sobrenadantes foi medida por HPLC como descrito em EP-A-340 170. Os resultados estão resumidos na tabela 8. -58-

Tabela 8

Produção de dessulfato-hirudina (mg/1)

Estirpe/plasmídeo ’empo de fermentação 24h 48h 72h TR1456/pPFY56 47 131 245 GPY18/pPFY56 64 158 277 TR1456/pMK5x2 50 172 328 GPY18/pMK5x2 67 194 348

Nas condições da experiência, a estirpe diplóide GPY18 mostra títulos mais elevados de hirudina comparado com a estirpe parental haplóide TR1456. A transformação com o plasmídeo pMK5x2 conduz a títulos de hirudina mais elevados tanto na estirpe haplóide como na diplóide comparativamente com o plasmídeo pPFY56.

Depósito de microrganismos

As estirpes de microrganismos que se seguem foram depositadas na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Maschroder Weg lb, D-3300 Braunschweig (são apresentados números de acesso e datas de depósito).

Saccharomvces cerevisiae H449 Saccharomvces cerevisiae HT462/TH3 E. çoli DH5aF'/pFBY2 E. coli DH5aFVpFBY4 R çoli DH5aF'/pFBY5 R çoli DH5aF'/pFBY29 R çoli JM109/pDP34 DSM 4413 8 de Fevereiro, 1988 DSM 7190 22 de Julho, 1992 DSM 6271 14 de Dezembro, 1990 DSM 6272 14 de Dezembro, 1990 DSM 6273 14 de Dezembro, 1990 DSM 6275 14 de Dezembro, 1990 DSM 4473 14 de Março, 1988 -59- LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: CIBA GEIGY AG (B) RUA: Klybeckstr. 141 (C) CIDADE: Basileia (E) PAÍS: Suissa (F) CÓDIGO POSTAL: 4002 (G) TELEFONE: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 (A) NOME: UCP Gen-Pharma (B) RUA: Solothumstrasse 24 (C) CIDADE: Kirchberg (E) PAÍS: Suissa (F) CÓDIGO POSTAL: 8044 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Processo para a produção de inibidores de proteases (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 7 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM (C ) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (vi) DADOS DE PEDIDOS DE PATENTE ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: EP 92810681.4 (B) DATA DE ENTREGA: 04-SET-1992 -60- (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1082 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica misc. (B) LOCALIZAÇÃO: 1..6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /função= "adaptador BamM" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: promotor (B) LOCALIZAÇÃO: 7..432 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: / nome convencional= "promotor CUP1" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica misc. (B) LOCALIZAÇÃO: 433..441 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /função= "adaptador EcoRI" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: peptídeo sinal (B) LOCALIZAÇÃO: 442..492 (D)OUTRA INFORMAÇÃO: nome convencional^ "sequência sinal PH05" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: peptídeo maduro (B) LOCALIZAÇÃO: 493..690 -61 - (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto= "Dessulfato-hirudina HVl"/nome convencional- HV1" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: terminador (B) LOCALIZAÇÃO: 691..1068 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nome convencional^ "terminador da transcrição PH05" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica misc. (B) LOCALIZAÇÃO: 1069..1082 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /função- "adaptador Sall" (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 442-690 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto- "transcrito primário" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: (B) LOCALIZAÇÃO: (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 1: GGATCCCCAT TACCGACATT TGGGCGCTAT ACGTGCATAT GTTCATGTAT GTATCTGTAT 60 TTAAAACACT TTTGTATTAT TTTTCCTCAT ATATGTGTAT AGGTTTATAC GGATGATTTA 120 ATTATTACTT CACCACCCTT TATTTCAGGC TGATATCTTA GCCTTOTTAC TAGTTAGAAA 180 AAGACATTTT TGCTGTCAGT CACTGTCAAG AGATTCTTTT GCTGGCATTT CTTCTAGAAG 240 CAAAAAGAGC GATGCGTCTT TTCCGCTGAA CCGTTCCAGC AAAAAAGACT ACCAACGCAA 300 TATGGATTGT CAGAATCATA TAAAAGAGAA GGAAATAACT CCTTGTCTTG TATCAATTGC 360 ATTATAATAT CTTCTTGTTA GTGCAATATC ATATAGAAGT CATCGAAATA GATATTAAGA 420

AAAACAAACT GTGAATTCAA A ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATTTTA 471 Met Phe Lys Ser Vai Vai Tyr Ser Ile Leu -17 -15 -10 GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACC GAA TCT 519 Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser -5 1 5 GGT CAA AAC TTG TGT TTG TGT GAA GGT TCT AAC GTT TGT GGT CAA GGT 567 Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly 10 15 í 20 25 AAC AAG TGT ATC TTG GGT TCT GAC GGT GAA AAG AAC CAA TGT GTT ACC 615 Asn Lys Cys He Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr 30 35 40 GGT GAA GGT ACC CCA AAG CCA CAA TCT CAC AAC GAC GGT GAC TTCGAA 663 Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu 45 50 55 GAA ATC CCA GAA GAA TAC TTG CAA TAGGATCCTG GTACGTTCCT CAAGGTGCTC 717 Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin 60 65 GTGTCTACAC CGAAAAATTC CAATGTTCTA ACGACACCTA CGTCAGATAC GTCATTAACG 777 ATGCTGTTGT TCCAATTGAA ACCTGTTCCA CTGGTCCAGG GTTCTCTTGTGAAATCAATG 837 ACTTCTACGA CTATGCTGAA AAGAGAGTAG CCGGTACTGA CTTCCTAAAG GTCTGTAACG 897 TCAGCAGCGT CAGTAACTCT ACTGAATTGA CCTTCTACTG GGACTGGAAC ACTACTCATT 957 ACAACGCCAG TCTATTGAGA CAATAGTTTT GTATAACTAA ATAATATTGG AAACTAAATA 1017 CGAATACCCA AATTTTTTAT CTAAATTTTG CCGAAAGATT AAAATCTGCA GCCAAGCTGG 1077 TCGAC 1082 -63- (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 82 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2

Met Phe Lys Ser Vai Vai Tyr Ser ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn -17 -15 -10 -5

Ala Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr 1 5 Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly 20 Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys 35 Pro Gin Ser Hls Asn Asp Gly Asp 50 55

Glu ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu 10 15 Gin Gly Asn Lys Cys lie Leu Gly 25 30 Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys 40 45 Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr 60

Leu Gin 65 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) -64- (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica misc. (B) LOCALIZAÇÃO: 1..28 "sequência (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = iniciadora de PCR" 28

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GGATCCATTA CCGACATTTG GGCGCTAT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica misc. (C) LOCALIZAÇÃO: 1..30 "sequência (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = iniciadora de PCR" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

GAATTCACAG TTTGTTTTTC TTAATATCTA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) -65- (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica misc. (D) LOCALIZAÇÃO: 1..27 "sequência (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = iniciadora de PCR" 27

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 5: GATATCGATC GTGAAAGAAT ATTTGCT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica misc. (E) LOCALIZAÇÃO: 1..29 "sequência (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = iniciadora de PCR" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

GATATCATGA GGATGATGAC AAAGAAGAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear -66- (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica misc. (F) LOCALIZAÇÃO: 1..26 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "sequência iniciadora de PCR" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: CTGATAATCA GTGAATTCAC AGAATG 26

Lisboa, 22 de Dezembro de 2000

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial rua ViCTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a produção de dessulfato-hirudina compreendendo a cultura, num meio de cultura complexo, de uma estirpe de levedura portadora de um vector de expressão de levedura, compreendendo uma cassete de expressão de dessulfato-hirudina consistindo no promotor CUP1 operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal de levedura ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura, e isolamento da dessulfato-hirudina produzida a partir do caldo de cultura, em que o meio de cultura é suplementado, na altura da inoculação, com uma quantidade de um sal de cobre indutora do promotor CUP1.
2. 2. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que a dessulfato-hirudina é seleccionada do grupo consistindo na dessulfato-hirudina variante HV1, HV2, HV3 e um derivado de qualquer uma destas variantes de dessulfto-hirudina.
3. 3. Um método de acordo com a reivindicação 1 para a produção de dessulfato-hirudina variante HV1.
4. 4. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que a estirpe de levedura é uma estirpe de Saccharomvces cerevisiae.
5. 5. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que a estirpe de levedura é uma estirpe cir° de Saccharomvces cerevisiae. -2-
6. 6. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que a estirpe de levedura é deficiente numa ou mais proteases.
7. 7. Um método de acordo com a reivindicação 6 em que a estirpe de levedura é deficiente na actividade de carboxipeptidase ysca e yscY.
8. 8. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que a estirpe de levedura contem 0-16, em particular 2-6, cópias do gene cromossómico CUP1.
9. 9. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que a estirpe de levedura contem 1-3 cópias adicionais do gene cromossómico ACE1.
10. 10. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe de levedura tem uma ploidia superior ou igual a dois.
11. 11. Um método de acordo com a reivindicação 10, em que a estirpe de levedura é diplóide.
12. 12. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor CUP1 do vector de expressão de levedura é o fragmento BamHI-EcoRI de 0,4 Kb descrito em SEQ ID NO: 1.
13. 13. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de DNA do vector de expressão de levedura codificador de um peptídeo sinal é seleccionado do grupo constituido pelas sequências sinal e prepro dos genes da invertase de levedura, factor a, pepetidase de feromona (KEX1), "toxina assassina" e fosfatase ácida reprimível (PH05) e a sequência sinal da glucoamilase de Aspergillus awamori.
14. Ο Ι 4. Um método de cordo com a reivindicação 1, em que a sequência de DNA do vector de expressão de levedura codificadora de um peptídeo sinal é seleccionada do grupo constituído pela sequência sinal da invertase de levedura e de PH05.
15. 15. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de DNA do vector de expressão de levedura contendo os sinais de terminação de transcrição de levedura é a sequência flanqueante 3' de um gene de levedura que contem sinais adequados para a terminação da transcrição e poliadenilação.
16. 16. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que o vector de expressão de levedura contem o DNA de dois-micra completo.
17. 17. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que o vector de expressão de levedura compreende 1 a 3 cassetes de expressão de dessulfato-hirudina adicionais.
18. 18. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que o vector de expressão de levedura apresenta simetria e não possui sequências bacterianas. Lisboa, 22 de Dezembro de 2000 *" Λ. 1-¾ ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA