JPH03219877A - 水素細菌由来チトクロームｃ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高度好熱性絶対独立栄養性水素細菌であるヒド
ロゲノバクター　サーモフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏ
ｂａｃｔｅｒ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のチト
クロームＣ−５５２蛋白質をコードする遺伝子および該
遺伝子を用いたＣ−５５２の製造方法に関するものであ
る。

（従来の技術） チトクロームＣは生体内でチトクロームオキシダーゼ、
レダクターゼなどの酸化還元酵素と速やかに電子のやり
とりをしている。この電子の授受はヘム鉄の酸化還元反
応に基づいている。最近、チトクロームＣを中心とした
金属蛋白質について、こうした電子移動反応を応用的に
発展させる研究が始まっている（例えば、Ｊ、　Ｒｏｍ
ｉｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１６４．１１１
．１９８７）　。その将来的な展望は生物の素材、素子
をまねた新素材、すなわちバイオチップの開発である。

従来の半導体素子では得られなかった生物学的な新しい
機能が期待されているのであるが、たとえば、生体分子
機能を有する触媒電極の作製が期待されている。現時点
では溶液中でチトクロームＣを金属電極表面に並べて電
子伝達を行う研究がなされている（Ｈ，Ａ、Ｏ，Ｈｉｌ
ｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ、　
Ｃｈｅｍ、、　２１７、１４１．１９８７）。この電子
伝達にはヘムＣ近傍のりジン残基の正電荷が重要である
といわれている（ＭＪ、　Ｅｄｄｏｗｅｓ、　Ｊ、　Ａ
ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１０１．７１１３、１
９７９）。

Ｃ−５５２は、アミノ酸配列の結果からりジン残基を多
く含み、さらに蛋白質全般からみても特異的に等電点が
高いことから、それらのりジン残基の多くは分子表面に
位置すると思われる（Ｙ、　５ａｎｂ。

ｎｇｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
１？１．６５．１９８９）　。こうした理由から、Ｃ−
５５２は電子伝達を効率よく行うことかでき、電極素子
として用いる上で優れている。またＣ−５５２は報告さ
れているチトクロームＣの中で最も低分子量であること
から、電極表面に接触する密度も高くなる点も優れた点
である。

さらに、通常のチトクロームＣは８０℃前後で変性する
が、Ｃ−５５２はきわめて熱安定性が高＜１２０℃でも
変性しない。この点は他のチトクロームＣにはない優れ
た特徴である（Ｙ、　Ｓａｎｂｏｎｇｉ　ｅｔ　ａｌ、
　ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ、　１？１．６５．１９８９）
。

またウマ由来のチトクロームＣは、心筋梗塞、脳出血な
どの脳血管障害、−酸化炭素中毒症、肺疾患による呼吸
困難などの組織酸素欠乏状態に起因する諸症状の改善に
対して有効である。Ｃ−５５２は分子量が小さく、安定
性が優れていることがら医薬としても優れていると思わ
れる。

Ｃ−５５２は、ヒドロゲノバクター　サーモフィラスの
細胞のペリプラズム画分に存在する蛋白質で、その発現
レベルはかなり大きいと推定されている（Ｙ、　Ｓａｎ
ｂｏｎｇｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、　１７１６５１９８９）。したがって、Ｃ−５５２の
発現を制御しているプロモーター、ターミネータ−、シ
グナルペプチドは、効率よく機能していると考えられ、
これらの構造を知ることも有意義である。

また、Ｃ−５５２は食品等の変異原性を低下せしめるた
めにも有用である。食品、特にコーヒー飲料は突然変異
原性を有する場合があり、その突然変異原性は、ペルオ
キシダーゼを添加することにより消失させることができ
る（特開昭６０−６２９４５号）。しかし、従来知られ
ているペルオキシダーゼでは、耐熱性が不十分で娶り、
高温（例えば、８０℃以上）において、または長い時間
（例えば、２４時間以上）において活性を保持できるも
のは知られていないので、コーヒー飲料の製造に用いる
場合、実用上の問題があった。

一方、チトクロームＣには、ペルオキシダーゼ活性があ
ることが知られている。本発明における水素細菌チトク
ロームＣは、前述のように、極めて熱に対して安定性を
有し、かつ、ペルオキシダーゼ活性を高温で、長時間保
持することができる。従って、コーヒー飲料の変異原性
を消失させるうえで、本発明におけるチトクロームＣを
用いることは非常に有用である。

また、過酸化水素は、細胞毒性や発癌性を有することが
既に知られている。これに本発明におけるチトクローム
Ｃを用いれば、過酸化水素を通常よりも過酷な条件下で
長時間処理することにより分解し続けられるので、細胞
毒性や発癌性の低減に有用である。

以上に述べたようにＣ−５５２は、優れた物性を持った
蛋白質であるが、ヒドロゲノバクター　サーモフィラス
は、水素を利用する絶対独立栄養細菌であり、培養は水
素、酸素、二酸化炭素の混合ガスを培地中に通気し、約
７０℃で培養する。本菌は有機物を資化せず、代わりに
水素を必要とするが、水素ガスは引火性の強いガスであ
るので大量に培養するのは危険を伴う。また、７０℃を
維持するのはコストが高くつく。一方、Ｃ−５５２遺伝
子を得、組換えＤＮＡの手法により培養の容易な宿主中
で発現させることによりＣ−５５２を発現できれば、有
用なＣ−５５２をよりたやすく、大量に得ることが出来
る。Ｃ−５５２のアミノ酸配列は前述のように公知では
あるが、１）原核生物のチトクロームＣ遺伝子には、蛋
白質をコードする配列の他にシグナルペプチドのコード
配列があり、チトクロームＣの生合成に重要な役割を担
っているが、Ｃ−５５２のアミノ酸配列からこのシグナ
ルペプチドの配列を予想することはできず、遺伝子の塩
基配列を決定することが必須である、２）蛋白質のアミ
ノ酸配列の分析結果にはしばしば誤りがありうるので、
Ｃ−５５２の遺伝子の塩基配列を決定して初めて、正確
な構造を知ることが出来る、３）アミノ酸配列から遺伝
子の塩基配列を類推することができるが、コドンの縮重
の問題から遺伝子の配列を１通りに決定できず、人為的
に合成したＤＮＡ配列ではしばしば発現に不都合を生じ
る、といった問題を解決するためにはＣ−５５２の遺伝
子を得て、その塩基配列を決定する必要がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、Ｃ−５５２遺伝子および該遺伝子を有するプ
ラスミド、該プラスミドにより形質転換された組換え宿
主細胞、及び該宿主細胞を培養してＣ−５５２を製造す
る方法を提供する。

Ｃ−５５２はシグナルペプチドをともなって生合成され
るので、本発明によればこのシグナルペプチドも一緒に
用いて酵母や大腸菌等の大量培養に適する宿主中で蛋白
質の分泌生産を行うことが可能である。Ｃ−５５２は菌
体の中でかなり高いレベルで発現していると思われ、高
発現を担っているＣ−５５２のプロモーター領域やター
ミネータ−領域の構造も有用であろう。とくにこれらの
シグナルペプチドやプロモーターは高温で正常に機能す
るという特徴を持っている。従って、これらは例えば高
温で生育する生物で蛋白質を発現させるときに有用であ
ろう。

また原核生物のチトクロームＣのアミノ酸配列は真核生
物のチトクロームＣのアミノ酸配列とは相同性か低く、
多様性に富んでいる（Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ　。

５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　２４２．
１３７．１９８０）。Ｃ−５５２は原核生物の典型的な
チトクロームＣであり、Ｃ５５２が発現すれば他の原核
生物のチトクロームＣも発現すると思われる。このよう
なチトクロームＣの例として、硫酸還元菌のチトクロー
ムＣ３が挙げられる。

以上に述べたことを目的として、Ｃ−５５２遺伝子のク
ローニングと構造解析、及び酵母および大腸菌での発現
を行った。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、遺伝子組換えＤＮＡ技術を用いてＣ−５
５２の遺伝子を単離し、構造遺伝子、シグナル配列、プ
ロモーター、およびターミネータ−領域の塩基配列を決
定した。

すなわち、本発明は、ヒドロゲノバクター　サーモフィ
ラスＣ−５５２をコードしているＤＮＡ配列、そのシグ
ナル配列、プロモーター、ターミネータ−の配列、これ
らを含有するプラスミド及び該プラスミドにより形質転
換された宿主細胞を提供するものである。それらの配列
は後に詳述する各図面に記載されている。なお、本明細
書中でアミノ酸配列または塩基配列に関して、「実質的
に同一な配列」という表現を用いた場合は、自然界で通
常起こりうる、表現型に影響を及ぼさない程度のアミノ
酸の置換、削除および／または挿入を含む変異配列を意
味する。

Ｃ−５５２蛋白質をコードする遺伝子は例えば次のよう
にして得ることが出来る。すなわち、既に知られている
蛋白質のアミノ酸配列から推察される遺伝子の塩基配列
に基づきオリゴヌクレオチドを２つ合成し、これをプロ
ーブとしてＣ−５５２の遺伝子のクローニングを行った
。ヒドロゲノバクターサーモフィラス菌体より得た染色
体ＤＮＡをいくつかの制限酵素で消化後、サザンブロッ
テイングし、合成オリゴヌクレオチドを用いてハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結
果、プローブは染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ
で消化して得られた２、５ｋｂのＤＮＡ断片と強くハイ
ブリダイズした。この断片を回収後、ｐＢＲ３２７のＨ
ｉｎｄ１１１部位にサブクローニングし、大腸菌を形質
転換した。形質転換株からプラスミドを得て、先はどの
プローブを用いて同様にハイブリダイゼーションを行い
、プローブとハイブリダイズするＤＮＡをもつ形質転換
株を得た。

この形質転換株は、ＢｉｎｄＩＩＩで切り出される２゜
５ｋｂのＤＮＡを含むプラスミドを持っていた。このプ
ラスミドの制限酵素処理とその消化物のサザンハイブリ
ダイゼーションを繰り返した結果、合成した２種のプロ
ーブはＡｃｃ　ＩとＰｓｔｌで切り出される１、１ｋｂ
のＤＮＡ断片とハイブリダイズした。この断片を大腸菌
でのクローニング用プラスミドｐＵｃ１９（宝酒造）の
Ｐｓｔｌ、　ＡｃｃＩ部位にサブクローニングしたプラ
スミドを調製し、このプラスミドを鋳型に、合成ヌクレ
オチドをブライマーとして用いて塩基配列の決定を行っ
た。その結果、Ｃ−５５２の翻訳領域、シグナル配列、
プロモーター、ターミネータ−領域の塩基配列が明らか
になった（第２Ａ図〜第２Ｅ図を参照）。

次に、Ｃ−５５２の酵母での発現を行った。発現用ベク
ターに組み込むため、Ｃ−５５２遺伝子の終止コドン（
第２Ａ図の４７２〜４７４番目のＴＡＡ）の直後に、部
位特異的に変異をおこさしめる方法にて制限酵素５ａ１
１部位を作製し、さらに、開始コドン（第２Ａ図の１７
８〜１８０番目のＡＴＧ）の直前に制限酵素ＥｃｏＲＩ
部位を作製するか、またはシグナル配列（第２Ａ図の１
７８７８番目〜２３１番目のＣ）の直後にＥｃｏＲｒ部
位と開始コドンＡＴＧを同様の方法にて作製した。こう
して用意された２種の変異ＤＮＡの一方は、挿入された
二つの制限部位の間にｃ−５５２の翻訳領域を有し、そ
して他方は該領域をそのシグナル配列とともに有してい
る。これら２種のＤＮＡからＥｃｏＲＩと５ａｉｌで切
り出されるＤＮＡ断片を酵母の発現ベクターにつなぎこ
んだ。このプラスミドを、イソ−１チトクロームＣ遺伝
子ｃｙｃ　ｔを欠損してい、るために乳酸を炭素源にし
て増殖できない酵母の株ＸＳ−３０−２Ｂ八ＣＹＣＩに
導入したところ、何れの変異ＤＮＡで形質転換した酵母
も乳酸を炭素源として生育するようになった。これは、
Ｃ−５５２が酵母のイソ−１チトクロームＣの代わりに
酵母の電子伝達系で機能したことを示している。換言す
れば、Ｃ−５５２がヘムＣを持つ形で酵母内で発現した
ことになる。酵母が、原核生物のしかも分子量が異なり
、アミノ酸配列の相同性の低いＣ−５５２を発現できた
ことは予想外のことである。酵母はＣ−５５２のみなら
ず、原核生物、真核生物のあらゆるチトクロームＣ（例
えばチトクロームＣ３，チトクロームＣ２を発現できる
と予想される。

また、前述のＣ−５５２をコードしているＤＮＡを大腸
菌の発現ベクターにつなぎ、大腸菌を形質転換したうち
、「シグナルペプチドをもたないＣ−５５２をコードし
ているＤＮＡを有する」形質転換株は、Ｃ−５５２を発
現しており、この形質転換株から得た組換えＣ−５５２
蛋白質は、ヒドロゲノバクター　サーモフィラス由来の
Ｃ−５５２と同様の優れた性質を有していた。

ここで決定した塩基配列を利用すれば、組換えＣ−５５
２を製造したり、あるいは、プロモーターなどを利用し
て高温で蛋白質を生産したりできる。

また組換え酵母を培養することにより、優れた特徴を持
つＣ−５５２を大量に、容易に得ることができる。以下
に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。実験の手
順は特に記述しない限り、ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏ１
ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ、　１９８２）によった。

（１）ヌクレオチドプローブの合成 既に決定したＣ−５５２のアミノ酸配列のうち、７番目
から１５番目までのアミノ酸配列、Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−）１ｉｓ−Ａ
ｓｐ−に基づいてオリゴヌクレオチドを合成した。第１
図に示したような２本の１７７−のオリゴヌクレオチド
、プローブ１（５°ＴＧＴＡＴＧＧＣＮＴＧＴＣＡＴＧ
Ａ　３°）、プローブ２（５“ＣＡＧＡＡＧＧＧＮＴＧ
ＴＡＴＧＧＣ３’）をベックマン社のＤＮＡ合成装置Ｓ
ｙｓｔｅｍ−１により合成した。ここでＮはＧ、Ａ、Ｔ
。

Ｃの４種のうちのいずれかの塩基を意味する。合成した
ヌクレオチドはベックマン社の推奨する方法で精製した
。

（２）ヒドロゲノバクター　サーモフィラスの染色体Ｄ
ＮＡの調製 本菌の染色体ＤＮＡを以下のようにして精製した。培養
した菌体２ｇを２０ｍ１のＳＴＥ緩衝液（２０％サッカ
ロース、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ８，０
，１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁後、８０ｍｇのリゾチームを
加えて３７℃で１０分間保持した。これに終濃度５０μ
ｇ／ｍｌになるようにプロテイナーゼＫを添加し、３７
℃で３０分間保持した。次に１０％ＳＤＳを終濃度０．
５％になるように添加し、さらにプロテイナーゼＫを１
００μｇ／ｍｌになるように加えた後、３７℃で３０分
間保持した。さらに１０％ＳＤＳを終濃度２％になるよ
うに添加した後、５０℃で６０分間保持した。

この液に等量のフェノール／クロロフォルム（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）を
加え、穏やかにかくはんした後に遠心分離し、上層を回
収した。この操作を３回繰り返した。これに倍量のエタ
ノールを加えて、遠心してＤＮＡを沈澱として回収した
。

このＤＮＡを１０ｍ１のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩｐＨ８，０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に懸濁
し、ＲＮａｓｅを終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添
加し、３７℃で３０分間保持した後、ＴＥ緩衝液に透析
して、染色体ＤＮＡ溶液として以下の実験に用いた。

（３）サザンハイブリダイゼーション 常法によりサザンハイプリダイゼーションを行った。得
られた染色体ＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩで消
化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブ
レンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ　（アマジャム社）にサザンプロ
ットした。プロットしたメンブレンを（γ−”Ｐ）　Ａ
ＴＰでラベルしたプローブ１．２を用いてハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーションしたメン
ブレンをフィルムに感光させ、オートラジオグラムを得
た。

オートラジオグラムの結果、２．５ｋｂの断片と両プロ
ーブが特異的にハイブリダイズしたことが分かった。従
って、Ｃ−５５２の遺伝子はこのＤＮＡ断片中に存在し
ていることが分かった。

（４）サブクローニング ２．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化断片を含むアガロース
ゲル部分を切り出し、常法によりＤＮＡを回収した。

他方、大腸菌のベクターとして広く用いられているｐＢ
Ｒ３２７をＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化後、常法に従っ
てアルカリフォスファターゼ処理し、フェノール／クロ
ロフォルム抽出を行った。このＤＮＡ断片と先はどの２
　、５ｋｂのＤＮＡ断片を常法どおりライゲースにより
結合させ、大腸菌）ＩＢＩＯＩ株を形質転換した。

１５９株の形質転換株か得られたので、先述のプローブ
を用いてコロニーハイブリダイゼーションの手法にて、
スクリーニングを行った。その結果、１１個の陽性クロ
ーンを得た。

１１個の陽性クローンを２ｍｌ培養し、常法に従いプラ
スミドＤＮＡを得た。このＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌで消
化後、サザンハイブリダイゼーションを行った。

その結果２種のプローブとハイブリダイズする１つのプ
ラスミドを得て、ｐＴ１３５とした。ｐＴ１３５を用い
て、制限酵素消化とサザンハイプリダイゼーションを繰
り返した結果、１．１ｋｂのＡｃｃ’−ＰｓｔＩ断片が
両プローブとハイブリダイズした。

このＤＮＡ断片をＡｃｅ　ＩとＰｓｔｌで消化したｐＵ
ｃ１９とライゲーションし、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転
換した。得られたプラスミドをｐＵＨＴｃ１３５とした
。

なお、該プラスミドにより形質転換された大腸菌はＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＳＡＭ　１３０６と命
名され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１０５４６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５４６）として寄
託されたが、平成２年２月１日にブタベスト条約上の寄
託に移管され、ＦＥＪ？Ｍ　ＢＰ−２７４８の寄託番号
が付与された。

（５）塩基配列の決定 プラスミドｐＵＨＴｃ１３５を常法どおり得た。このプ
ラスミドを鋳型にして、スクリーニングに用いたプロー
ブ２およびリバースプライマー（宝酒造）をブライマー
にして、２末鎖グイデオキシシークエンス法を行い、Ｃ
−５５２の遺伝子配列を決定した。２重鎖ダイデオキシ
シークエンス法の詳細は例えば高浪らの続生化学実験講
座、遺伝子研究法Ｉ（東京化学同人）に示されている。

決定できた塩基配列中（第２Ａ図）には、Ｃ−５５２の
シグナルペプチドをコードする領域、プロモーター領域
およびターミネータ−領域も含まれていた。

シグナル領域も含めた翻訳領域は、開始コドンＡＴＧ　
（第２Ａ図、１７８〜１８０番目）から翻訳が始まり終
止コドンＴＡＡ（第２Ａ図、４７２〜４７４番目）で翻
訳が終了する、９８アミノ酸をコードしていた。

すでに決定されているＣ−５５２のアミノ酸配列は１９
番目のアスパラギン（第２八図中、Ｎで示されている）
から始まっており、このアスパラギン以後の配列はＣ−
５５２の配列と完全に一致した（第２Ｄ図）。アミノ末
端より前の１８番目までのアミノ酸配列はＣ−５５２に
は含まれない配列で、Ｃ−５５２が細胞のベリプラズマ
画分に存在することから、Ｃ−５５２をベリプラズマ画
分に移行させるためのシグナルペプチドとして機能して
いるものと考えられる（第２Ｃ図）。また翻訳領域のＧ
Ｃ含量が高いことが特徴的である。

５°非翻訳領域には、原核生物のプロモーターとして知
られている一３５領域１−１０領域及びＳＤ領領域対応
する塩基配列が存在している。したがって、この部分が
Ｃ−５５２のプロモーターである（第２Ｂ図）。また、
３′非翻訳領域にはＣＡＧＣＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧ
という回文様配列が存在しており、これがＣ−５５２の
転写等の終了に寄与しているターミネータ−であると考
えられる（第２Ｅ図）。

実施例２　　Ｃ−５５２遺云　の　母による発現実施例
１で得たＣ−５５２の遺伝子を用いて酵母での発現を行
った。酵母での異種のチトクロームＣの発現については
、特開平１−３７２９１号に詳しく記載されており、Ｃ
−５５２の発現についても同様の方法において行った。

部位特異的に変異を起こす方法は、バイオラド社のミュ
ータジェネシスキットによった。ここで用いた合成ヌク
レオチドは、アプライドバイオシステムズ社の３９ＯＡ
　　ＤＮＡ合成装置にて合成した。

プラスミドｐＵＨＴｃ１３５をＨｉｎｄｒｌＩとｘｂａ
ｒで消化して得られるｌ　、　ＩｋｂのＤＮＡ断片をＭ
１３ｍｐ１９のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａｌによる消化物
とライゲーションし、大腸菌ＭＶ１１９（１に形質転換
した。ホワイトプラークを成す形質転換株から、−本鎖
ＤＮＡを調製した。この−本鎖ＤＮＡに、合成ヌクレオ
チドＡ２４９　（５°ＣＧＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡ
ＣＴＴＴＡＴ３°）をアニールさせ、バイオラド社のミ
ュータジェネシスキソトを用いて部位特異的な変異を起
こさせた。この操作によりＣ−５５２遺伝子の終止コド
ンの３°側に制限酵素５ａ１１部位が生じる。

次にこの組換えＭ１３ファージの１本鎖ＤＮＡを鋳型に
して合成ヌクレオチドＡ２３７　（５°ＴＧＴＴＣＡＴ
ＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧ３　’　）とＡ２
３８　（５°ＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣ
３°）でそれぞれ同様に変異を起こさせた。Ａ２３７の
変異はＣ−５５２のシグナルペプチドの直後にＥｃｏＲ
１部位を作製すると同時に開始コドンであるＡＴＧを挿
入するためのものである。この変異を持つ組換え２本鎖
Ｍ１３ＤＮＡをＭ２Ｓ−１２とした。Ａ２３８の変異は
Ｃ−５５２の開始コドンＡＴＧの直前にＥｃｏＲ１部位
を作製するためのもので、この変異を持つ組換え２本鎖
Ｍ１３ＤＮＡをＭ２Ｓ−１１とした。両者の挿入部分の
配列を常法に従い決定し、予期した通りの変異が起こっ
ていることを確認した。また、Ｃ−５５２遺伝子の配列
に異常が生じていないことも確認した。

ｐＹＨｃｃｌｏｌ　（特開平１−３７２９１号参照）は
酵母と大腸菌のシャトルベクターであり、かつ酵母での
発現ベクターである。このプラスミドは工業技術院微生
物工業技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−９４７５の寄託番号
で寄託されたが、平成２年２月２３日にブタベスト条約
上の寄託に移管され、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７６７の寄託
番号が付与された。このプラスミドにおいてはヒトチト
クロームＣ遺伝子が酵母のグリセルアルデヒド３燐酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）　フｏモーターにより転写さ
れる。このヒトチトクロームＣ遺伝子の代わりに、Ｃ−
５５２の遺伝子を導入し酵母中で転写、発現させる目的
で以下のように行った。Ｍ２Ｓ−１１，Ｍ２Ｓ−１２を
それぞれＥｃｏＲＩと５ａｉｌで切り出されるＣ−５５
２遺伝子を含むＤＮＡ断片と、ｐＹＨｃｃｌｏｌのＥｃ
ｏＲＩと５ａｌＴで切り出される約８ｋｂのＤＮＡ断片
をライゲーションし、大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換した
。得られた目的のプラスミドをそれぞれｐＹＨＴＣｌｌ
、ｐＹＨＴｃ１２とした。両者は共ｉ：ｃ−５５２遺伝
子を含むが、前者はシグナル配列を含んでいる点で後者
と異なっている。これらのプラスミドの造成過程の概略
を第３図に示す。

これら２種のプラスミドで、酵母ＸＳ−３０−２ＢΔＣ
ＹＣ１（Ｍａｔ　ａ、ｔｒｐｌ、　　ｈｉｓ３．　　ｕ
ｒａ３．　１ｅｕ２゜ｃｙｃ　ｌ　：　：　ＬＥＵ２　
）を形質転換した。トリプトファンの合成能を回復した
形質転換株とＸＳ−３０−２ＢΔＣＹＣＩについて、必
要な栄養素（ヒスチジン、ウラシル、必要ならばトリプ
トファン）を添加したＹＮＥＬ培地（０６７％　Ｄｉｆ
ｃｏ　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ、　０
．０５％Ｄｉｆｃｏ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、　
２％乳酸ナトリウム）での増殖を調べた。すなわち、Ｙ
ＮＥＤ培地（ＹＮＥＬ培地の乳酸ナトリウムの代わりに
２％ぶどう糖を含む）で前培養した後、ＹＮＥＬ培地に
１％植菌し、増殖を６６０ｎＩの吸光度の変化で追跡し
た。結果を第４図に示した。ＸＳ−３０−２ＢΔＣＭＣ
Ｉは、電子伝達系蛋白質であるイソ−１チトクロームＣ
をコードしているＣＹＣｌを欠損しているので、非発酵
性炭素源である乳酸を資化できず、ＹＮＥＬ培地では増
殖しなかった。

ところが、ｐＹＩＭ２３７．またはｐＹＩＭ２３８で形
質転換した株は第４図に示したように、乳酸を資化して
生育した。これは、異種の蛋白質であるＣ−５５２が酵
母において、発現し、電子伝達系の１成分として機能し
たことを示す。したがって、この組換え酵母を培養すれ
ば酵母菌体からＣ−５５２を得ることができる。

次に、形質転換株すなわちＸＳ−３０−２ＢΔＣＹＣＩ
　（ｐＹＨＴＣｌｌ）とＸＳ−３０−２Ｂ八ＣＹＣ１（
ｐＹＨＴｃ１２）を培養シタ。

炭素源として２％ぶどう糖と１５％乳酸ナトリウムを含
むパークホルダー培地（ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒＳＡｒｎ
、Ｊ、Ｂｏｔ、３０．２０６．１９４３）　４００ｍ１
で、よく攪はんして３０℃で培養した。対照のため、Ｘ
Ｓ−３０−２８とＸＳ−３０−２ＢΔＣＹＣ１も同様の
条件で培養した。集菌後、ジャーマンらの方法（Ｓｈｅ
ｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ２４３、５４４６．１９６８）により、酵母を２ｍｌ
の水と１ｍｌの酢酸エチルに懸濁し、室温で一晩振とう
した。遠心分離して水層を回収し、この画分のチトクロ
ームＣ含量と蛋白量を定量した。チトクロームＣ量は還
元型吸収スペクトルを分光光度計（日立２２ＯＡ）で測
定し、５５０ｎｍの分子吸光係数２７７ｍＭを利用して
定量した。蛋白定量はピアス社のＢＣＡ蛋白定量キット
を用いた。ＸＳ−３０−２ＢΔＣＹＣＩのチトクローム
Ｃ含量は蛋白質１ｍｇあたり０，０７５ｎｍｏｌｅであ
ったが、ｐＹＨＴｃｌｌによる形質転換株のチトクロー
ムＣ含量は蛋白質１ｍｇあたり０．４８ｎｍｏｌｅ、　
ｐＹＨＴｃｌ２による形質転換株のチトクロームＣ含量
は蛋白質１ｍｇあたり０．４０ｎｍｏｌｅであった。ｐ
ＹＨＴｃｌ　１．ｐＹｌ（ＴＣ１２による形質転換株は
ＸＳ−３０−２８八ＣＹＣＩよりチトクロームＣ含量か
高いので、Ｃ−５５２が発現したと考えられる。

そこで、これらの酢酸エチル抽出画分をＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロットを行っ
た後、抗水素細菌Ｃ−５５２を用いて、Ｃ−５５２の発
現を検討した。この方法は、たとえば、今堀ら、純生化
学実験講座、蛋白質の化学、東京化学同人（１９８７）
に示されている。その結果、ｐＹＨＴｃｌ２による形質
転換株の抽出画分には抗Ｃ−５５２抗体と反応するバン
ドが見られた。その分子量は、天然のＣ−５５２と一致
した（第６Ａ図）。

実施例３　　Ｃ−５５２の　　菌によるｐＹＨＴｃｌｌ
及びｐＹＨＴｃｌ２をそれぞれＥｃｏＲｌと５ａｉｌで
消化して得られるＣ−５５２遺伝子含むＤＮＡ断片を市
販の大腸菌の発現ベクターであるｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア社）をＥｃｏＲＩ　と５ａｉｌで消化したも
のとライゲーションした。こうして得られた目的のプラ
スミドは、Ｃ−５５２遺伝子が大腸菌のｔａｃプロモー
ターで制御される。一連のプラスミド構築の過程を第５
図に示した。ｐＹＨＴｃ１１由来のものをｐＫＨＣｌｌ
、そしてｐＹＨＴｃ１２由来のものをｐＫＨｃｌ２とし
た。

さらに、ｐＫＨｃｌ２をＢａｍ）ＩＩ　とＳｃａ　ｌで
消化して得られるＤＮＡ断片のうち、Ｃ−５５２遺伝子
を含む断片を回収した。これとｐＵｃＩＩ８（宝酒造）
をＢａｍＨＩ　とＨｉｎｃＩＩで消化したＤＮＡ断片を
連結し、得られたプラスミドをｐＵＫ８１２とした。こ
れらのプラスミドの構築には宿主大腸菌としてＪＭ１０
９を用いた。

形質転換体、ＪＭ１０９（ｐＫＨｃｌｌ）、　ＪＭ１０
９（ｐＫＨｃｌ２）、ＪＭ１０９（ｐｌｌに８１２）を
Ｌ培地にて２−培養後、１．２１の硝酸塩を含む培地（
１％ぶどう糖、０．０８％硝酸ナトリウム、５０ｍＭ炭
酸１ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム、０．７
％リン酸１カリウム、０．０５％クエン酸３ナトリウム
、０，１％硫酸アンモニウム、１μｇ／−チアミン、１
２μＭモリブデン酸アンモニウム、１μＭセレン酸、１
２ｍＭクエン酸ｅ、０．５％バクトベプトン、ｐＨ７、
０）に１ｗｉ植菌し、３７℃で２４時間、静置培養した
。またこの際、必要に応じて最終濃度０　、５ｍＭのイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）を発現誘導剤として加えた。培養後、集菌して、以
下の実験に供した。

菌体の破砕物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気
泳動し、ウェスタンプロットの後、抗Ｃ−５５２抗体を
用いて、Ｃ−５５２の検出を行った。その結果を第６Ｂ
図に示した。即ち、調べたＪＭ１０９、ＪＭ１０９（ｐ
ＫＨｃｌｌ、−ＩＰＴＧ）、ＪＭ１０９（ｐＫＨｃｌｌ
、　＋ＩＰＴＧ）、ＪＭ１０９（ｐＫＨｃｌ２．−ＩＰ
ＴＧ）、ＪＭ１０９（ｐＫＨｃｌ２．　＋ＩＰＴＧ）の
うちＪＭ１０９（ｐＫＨｃｌ２　、÷ＩＰＴＧ）だけに
天然のＣ−５５２と同じ位置に特異的なバンドが観察さ
れた。この結果から、大腸菌においてＣ−５５２蛋白が
発現していることがわかる。ここでは、Ｃ−５５２のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子を含むｐＫＨｃｌ　
１による形質転換株においては、抗体と反応するものが
みられなかったのに対し、シグナルペプチドを含まない
遺伝子を含むｐＫＨｃｌ２による形質転換株においての
み発現がみられるという予想外の結果が得られた。また
、ＪＭ１０９（ｐＫＨｃｌ２．＋　ＩＰＴＧ）の培養菌
株を分画し、Ｃ−５５２の細胞内での局在性を調べたと
ころ、Ｃ−５５２は細胞質に存在していた。

次にＣ−５５２の発現レベルを調べるために、前述のよ
うに培養した菌体をフレンチプレスにて破砕後、可溶性
画分の蛋白量及びチトクロームＣ量を測定した。ＪＭ１
０９（ｐＫＨｃ１２、＋　ＩＰＴＧ）　、ＪＭ１０９（
ｐＵＫ８１２．　＋　ＩＰＴＧ）のＣ−５５２含量は全
蛋白質の約０．４％であった。

次に、ＪＭ１０９（ｐＵＫ８１２．　＋　ＩＰＴＧ）の
菌体から公知の方法（Ｙ、　Ｓａｎｂｏｎｇｉ　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、、１７１６５、
１９８９）により組み換えＣ−５５２を精製した。

実施例４　　　えチトクロームＣ−５５２の性精製した
Ｃ−５５２の吸収スペクトル、熱安定性、酵素学的性質
は天然のＣ−５５２と一致した。以下に精製したＣ−５
５２の性質について述べる。

えチトクロームＣＣ−５５２の性 精製した組換えチトクロームＣ−５５２の還元型吸収ス
ペクトルを測定した結果を天然型のチトクロームＣ−５
５２のそれと比較して第７図に示した。両者の吸収スペ
クトルは一致した。チトクロームＣの吸収スペクトルは
、その分子構造を反映することは公知であり、したがっ
て、組み換えチトクロームＣ−５５２は、そのアミノ末
端にメチオニン残基をもつにもかかわらす、天然のチト
クロームＣ−５５２と同じ構造をしていることがわかる
。

さらに組み換えチトクロームＣ−５５２の構造を調べる
ためにそのＣＤ（円二色性）を測定した。ＣＤを測定す
ることにより、蛋白質分子の二次構造を推定することが
できる。チトクロームＣ−５５２を５０μｇｏｄとなる
ように１０ｍＭ　Ｋｌ（２ＰＯ，−ＮａＯＨ（ｐＨ’１
．ｏ）に溶解し、２１０　ｎｍから２５０　ｎｍのＣＤ
スペクトルをＪＡＳＣＯａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｒｅｃｏ
ｒｄｉｎｇ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ　
Ｍｏｄｅｌ　Ｊ−２０（日本分光）を使用して測定した
。また、チトクロームＣ溶液を１２０℃、１０分間オー
トクレーブした後、室温に戻し、ＣＤスペクトルを測定
した。結果を第８図に示した。図中Ａはオートクレーブ
前、Ｂはオートクレーブ後のＣＤスペクトルである。第
８図から、組み換えＣ−５５２と天然Ｃ−５５２は同じ
構造をしていること、並びに組み換えＣ−５５２も天然
Ｃ−５５２もオートクレーブ処理により、構造が変化し
ないことがわかる。したがって、組み換え法により生産
したＣ−５５２は、その熱安定性という産業上好都合な
性質を保持していることが分かった。ちなみに、ウマチ
トクロームＣは、オートクレーブ後のＣＤスペクトルが
顕著に変化しており、変性してしまったことがわかる。

実施例５　　　えチトクロームＣのアミノ　配■丘 組み換えＣ−５５２のアミノ末端のアミノ酸配列をアプ
ライド　バイオシステムズ社の気相法シークエンサーに
て決定した。その結果、以下の配列を有していた： Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙこの配列はアミノ末端に
メチオニン残基が付加されていることを除けば、天然の
Ｃ−５５２のアミノ末端配列と一致した。メチオニン残
基の付加によっても、Ｃ−５５２の産業上好ましい性質
は損なわれていなかったので、ここに記載した方法によ
って、組み換えＣ−５’５２を大量に、安価に製造でき
るようなったと考えられる。なお、ここで使用したプロ
モーター、大腸菌宿主などは、−例であり、他のプロモ
ーターや宿主を用いても、発現は可能である。

（発明の効果） 以上のようにして、ヒドロゲノバクター　サーモフィラ
スＣ−５５２遺伝子のクローニングと塩基配列の決定を
行った。さらに、この遺伝子を酵母の発現ベクターにつ
ないで、乳酸を資化できない酵母に導入したところ、乳
酸の資化能が回復し、チトクロームＣ量も上昇したので
、Ｃ−５５２が酵母で発現した。したがって、Ｃ−５５
２を組換えＤＮＡの手法を用いて大量かつ容易に得るこ
とができる。また、酵母は真核生物のチトクロームＣの
みならず、それとは構造が似ていない原核生物のチトク
ロームＣをも発現できる。

また、大腸菌の発現ベクターを用いると、大腸菌でも組
換えＣ−５５２を発現させることができた。

大腸菌が生産する組換えＣ−５５２は、ヒドロゲノバク
ター　サーモフィラスの生産するＣ−５５２と実質的に
同一であり、産業上好ましい性質を保持していた。同様
にして、他の宿主生物を用いても、組換えＣ−５５２の
生産は可能と思われる。

また、高温でも機能できるという特徴をもつそのプロモ
ーター、ターミネータ−、シグナルペプチドの構造が解
明された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｃ−５５２遺伝子をスクリーニングするため
の合成プローブの配列を対応するアミノ酸配列および可
能性のあるコドンとともに示した図であり、 第２Ａ−１図および第２Ａ−２図は、Ｃ−５５２遺伝子
の塩基配列を、プロモーター配列、シグナル配列、ター
ミネータ−配列も含めて示す一連の図であり、 第２Ｂ図は、Ｃ−５５２遺伝子のプロモータ一部分の塩
基配列を、その−３５，−１０およびＳＤ配列に下線を
付けて示した図であり、 第２Ｃ図は、Ｃ−５５２のシグナル配列およびそれをコ
ードする遺伝子の配列を示す図であり、第２Ｄ図は、Ｃ
−５５２の翻訳領域とそれをコードする遺伝子の配列を
示す図であり、 第２Ｅ図は、Ｃ−５５２のターミネータ−の塩基配列を
回文構造をなす部分に下線を付けて示した図であり、 第３図は、Ｃ−５５２の酵母での発現に用いたプラスミ
ドの造成について概略を示した図であり、第４図は、乳
酸を炭素源としたときのＣ−５５２遺伝子を発現してい
る酵母の増殖を示したグラフであり、 第５図は、Ｃ−５５２の大腸菌での発現に用いたプラス
ミドの造成について概略を示した図であり、第６Ａ図お
よび第６Ｂ図は、それぞれ酵母中で発現させたＣ−５５
２および大腸菌中で発現させたＣ−５５２を、抗Ｃ−５
５２抗体を用いて検出した結果を示す電気泳動写真であ
り、 第７Ａ図および第７Ｂ図は、それぞれ天然型のチトクロ
ームＣ−５５２および組換えチトクロームＣ−５５２の
還元型吸収スペクトル図であり、第８Ａ図、第８Ｂ図お
よび第８Ｃ図は、それぞれ天然型のチトクロームＣ−５
５２、組換えチトクロームＣ−５５２およびウマ心筋チ
トクロームＣのＣＤスペクトル図である。 アミノ酸配列 可能性のあるコ プローブ１ プローブ２ ７　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１５−Ｃ１ｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｙ−
Ｃｙｓ−Ｍｅ　ｔ−Ａｌ　ａ−Ｃｙｓ−Ｈｉ　５−Ａ５
ｐ−Ｆ：／　　　ＣＡＲＡＡＲＧＧＮ　　ＴＧＹ　　Ａ
ＴＧ　　ＧＣＮ　　ＴＧＹ　　ＣＡＹ　　ＧＡＹ５’　
　　ＴＧＴ　　ＡＴＧ　　ＧＣＮ　　ＴＧＴ　　ＣＡＴ
　　ＧＡ　　３”５’　　ＣＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧＮ
　　ＴＧＴ　　ＡＴＧ　　ＧＣ３゜Ｎ： Ａ。 Ｃ２ Ｇ　またはＴ、　　Ｒ：ＡまたはＧ、　　Ｙ：Ｃまたは
Ｔ茅 ４ 国 地（晦 間 （晴間） Ｐｔａｃ　：　ｔａｃｙ’υを−ター ６　Ｎ 、） ９　　４　　５ す１ケレー・＼　Ｃ−夕５２ ハしＹ　Ｃ，ｒ、　Ｘδ−３）−２β ｘ、ｓ’−３つ−２Ｂ ｐＹ！−７こｔ７＋ノータ゛−１′−＋）メツＹＨＣ／
２　　リーグ−（−） ′　手トクν−ム　ニータジ ２、７　Ｍ　／　ｉ、’　”　（デｊＸＥＴ７ｔ、４１
Ｍ）ｊ　　ｐＲＨＣｉｌｌ？Ｔコ（−）　　＋１　　グ
ーζ十）Ａ、、、ＫＨＣＩお、′ρＴＧ（す ”Ｙ７Ａ凹 ％ｆ３Ａ図 第８Ｂズ 第８Ｃ雪 第７Ｂ凹 燻 （ｎｍ） ６００　　　　　　　、！；５０ 波　−ｔ（ｎｍ） ００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （ I ） で表される高度好熱性チトクロームＣ−５５２（以下Ｃ
   −５５２と略す）をコードするＤＮＡ、及びそのプロモ
   ーター、ターミネーターの塩基配列またはこれと実質的
   に同一な塩基配列。 ２、下式（ I ａ）： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （ I ａ） で表される、高度好熱性チトクロームＣ−５５２をその
   リーダー配列とともにコードするＤＮＡの塩基配列また
   はこれと実質的に同一な塩基配列。 ３、下式（ I ｂ）： 【遺伝子配列があります】 で表される、高度好熱性チトクロームＣ−５５２をコー
   ドするＤＮＡの塩基配列またはこれと実質的に同一な塩
   基配列。 ４、式（ I ）の塩基配列を染色体中に含む、ヒドロゲ
   モナスサーモフィラスの染色体ＤＮＡからＡｃｃ I と
   Ｐｓｔ I で切り出される約１．１ｋｂのＤＮＡ断片。 ５、高度好熱性絶対独立栄養性水素細菌であるＨｙｄｒ
   ｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのチ
   トクロームＣ−５５２のシグナルのアミノ酸配列及びそ
   れをコードするＤＮＡ。 ６、次式： 【遺伝子配列があります】 で表される請求項第５記載のＤＮＡまたはこれと実質的
   に同一なＤＮＡ。 ７、請求項第１、２または３項記載のＣ−５５２の遺伝
   子の全部または一部を含むプラスミド。 ８、請求項第１、２または３項記載のＣ−５５２の遺伝
   子の全部または一部を含むプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え宿主細胞。 ９、酵母または大腸菌である、請求項第８項記載の組換
   え宿主細胞。 １０、請求項第８または９項記載の宿主細胞を培養し、
   その培養菌体からＣ−５５２を採取することを特徴とす
   る、Ｃ−５５２の製造方法。