KR0134997B1 - 스트렙토키나제 발현 미생물 및 그를 이용한 스트렙토키나제의 제조방법 - Google Patents

스트렙토키나제 발현 미생물 및 그를 이용한 스트렙토키나제의 제조방법

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Abstract

본 발명은 스트렙토키나제를 발현하는 미생물 및 그를 이용한 스트렙토키나제의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 스트렙토키나제 발현벡터와 그것으로 형질전환된 재조합 미생물 및 재조합 미생물로부터 스트렙토키나제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본발명의 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100으로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 경우, 임상적으로 안전한 고순도의 스트렙토키나제를 경제적으로 대량생산하는 효과를 가진다.

Description

스트렙토키나제 발현 미생물 및 그를 이용한 스트렙토키나제의 제조방법
제1도는 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100의 구조를 나타내는 그림이다.
제2도는 pSK100벡터를 제조하는 공정을 도식적으로 나타낸 그림이다
제3도는 pSK100벡터로 형질전환된 재조합 대장균 JM109의 배양시간에 따른 스트렙토키나제 발현정도를 나타내는 그래프이다
제4a도는 재조합 대장균JM109의 배양시 생성된 단백질 중 페리플라즘 분획의 젤 전기영동 사진이다.
제5b는 재조합 대장균 JM109의 배양시 생성된 단백질 중 세포의 분획의 젤 전기영동 사진이다.
본 발명은 스트렙토키나제 를 발현하는 미생물 및 그를 이용한 스트렙토키나제 의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본발명은 스트렙토키나제 발현벡터와 그것으로 형질전환된 재조합 미생물 및 재조합 미생물로부터 스트렙토키나제를 제노하는 방법에 관한 것이다.
스트렙토키나제 (streptokinase)는 혈액속의 플라스미노겐(plasminogen)을 활성화시킴으로써 혈전을 분해하는 기능을 가지고 있어, 혈관내의 혈액응고에 의하여 유발되는 죄졸증 및 급성 심근경색 등의 치료제로서 널리 사용되고 있다. 그러나, 시판되고 있는 스트랩 토키나제는 모두 스트렙토코커스(Streptococcus sp.)균주에 의해 제조됨으로써, 생산수율 및 제품의 순도가 낮아지기 때문에, 이를 주사용 제제로 사용하기 위해서는 매우 복잡한 정제 공정이 필요하며, 그과정에서 막대한 배용과 시간이 소모된다는 문제점을 지니고 있다. 더욱이, 용혈성 스트렙토키나제는 백일해 및 패혈증 등을 유발하는 병원균이기 때문에, 이러한 균주에 의해 제조되어진 스트렙토키나제는 인체에 유해한 독소를 함유할 가능성이 많다는 문제점을 지니고 있다.
한편, 에스트라다(Estrada)등은 트립토판 (trp) 전사촉진제(promoter)하류에 스트렙토키나제 유전자를 함유하는 스트렙토키나제 의 발현 벡터 pEKG-3호 형질전환시킨 재조합 대장균을 사용하여 스트렙토키나제 를 생산 함으로써, 임상적 안전성을 해결하고자 하였다(M.P.Estrada, et al., Biotwchnology, 10:1138-1142(1992); Pat. No. AV9178101 A 91/11/28, 9204). 이 경우, 순도 25%가량의 스트렙토키나제 가 대장균의 세포질에 생산된다고 보고되었으나,스트렙토키나제가 세포질내에 축적됨으로써 정제과정에는 여전히 많은 문제점을 내포하고 있었다. 즉, 대장균의 세포질에는 많은 다른 단백질이 존재하기 때문에, 고순도의 스트렙토키나제 를 제노하게 위하여 보다 복잡한 정제과정을 거치게 됨으로써 경제적이지 못한 것으로 알려졌다. 따라서, 당업계에서는 임상적으로 안전한 고순도의 스트렙토키나제를 정제 과정에 문제가 없도록 페리플라즘(periplasm)이나 배양액내에 축적되도록 유도하여, 보다 경제적으로 스트렙토키나제를 생산할수 있는 제조방법을 개발하여야 할 필요성이 절실히 요구되고 있는 실정에 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 대장균에서 강력하게 발현되는 tac전사 촉진제와 페리플라즘으로분비시키는 ompA신호 서열을 이용하여 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100을 구축하고,이 pSK100 벡터로 형질전환시킨 재조합 균주를 개발하였다. 아울러, 이 재조합 균주를 배양하여 스트렙토키나제 가 세포질이 아닌 페리플라즘과 배양액내에 축적되도록 유도한 결과, 약 85%이상의 고순도 스트렙토키나제를 배양액 1㎖당 5,000/이상의 수율로 대량 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 tac촉진제, ompA 신호서열 및 스트렙토키나제 유전자를 함유하는 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 전기 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100에 의하여 형질전환되어 스트렙토키나제를 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째목적은 전기 재조합 미생물로부터 스트렙토키나제 를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다.
본 발명의 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100은 대장균에서 강력하게 발현되는 /전사촉진제 (promoter), 그하류 (downstream)의 ompA신호 서열 (signal sequence), 스트렙토키나제를 코딩하는 유전자 skc,pSK100이 대장균 내에서 복제되는데 필요한 유전자 ori 및 배양액의 대장균이 플라스미드를 유지하도록 하는 기능의 선택표지(Selection marker)인 유전자 Ampr로 구성된다.
아울러, pSK100은 다음과 같은 공정에 의해 제조된다: 먼저,pIN-III- ompA-Hind 멕터를 제한효소 Xbal과 BamHI으로 절단한 다음, 클레노우단편 (Klenow fragment ,이하 'Klenow F' 라 함)을 처리하여 ompA신호서열을 포함하는 약 80bp의 DNA를 제조하였다. 그런다음, 전기DNA와 강력한 tac전사촉진제를 가지는 pKK223-3벡터를 HindIII,EcoRI 및 Klenow F.로 처리하여 4552bp의 DNA를 수득하고, 연결효소(ligase)로 결합하여 pKK-omp벡터를 제조하였다. 이어서, 중합효소 연쇄반응(polymerase dhain reaction,이하 'PCR' 이라함)에 의해 수득한 스트렙토키나제 유전자를 PstI로 처리한다음, pKK- omp를 HindIII, Klenow F 및 PstI으로 차례로 처리하여 수득한 DNA와 결합시켜 최정적으로 pSK100를 제조하였다.
본 발명은 재조합 미생물인 SMB20균주는 전기 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100를 이용하여 다음과 같이 제조한다 : 먼저, 대장균 (E. coli)JM109균주를 형질전환이 용이한 세포 (competent cell)로 제조한 다음, 전기 세포 50㎕ 에 pSK100벡터 1㎕을 가하여, 얼음속에 10분간 바치하고, 42℃에서 90초간 열충격(heat shock)을 가하였다. 여기서 LB배양액 0.5㎖을 가하고 37℃에서 1시간 배양한 다음, 앰피실린 (ampicillin)을 함유한 LB-아가배지에 접종하여 37℃에서 10시간 배양하였다. 생성된 콜로니 (colony)가 pSK100에 의하여 형질전환되었음을 확인하고, SMB20으로 명명하였다.
1리터 비이커에 LB배양액을 200㎖씩 넣은 다음, 전배양한 전기 SMB20균주 20㎖을 접종하고 30℃의 진탕배양기에서 배양하였다. 접종하고 3시간 경과후에 이소흐로필 베타-디-티오갈락피라노시드(isopropy1 β-D- thiogalactopyranoside: IPTG) 를 1mM의 농도로 첨가하여 스트렙토키나제 발현을 유도하였다.
발현된 스트렙토키나제 활성을 다음과 같이 측정하였다: 활성측정용 완충용액 1.26㎖에 친체 흘라스미노겐 용액 150㎕와 스트렙토키나제 시료 60㎕을 가한 다음, 30℃에서 3분간 방치하여 CLN 용액 30㎕을 넣어 혼합하고, 분광광도계를 이용하여340nm에서 1분간 흡광도 증가량을 측정하였다. 그결과, pSK100으로 형질 전환된 대장균 (E.coli JM109)을 30℃에 배양하면서 OD600값이 0.5일 때 IPTG를 최종 1mM농도가 되도록 가하여 스트렙토키나제의 발현을 10시간 이상 유도하였을 경우, 대장균의 페리플라즘과 배양액에서 85%이상의 고순도 스트렙토키나제 를 배양액 1㎖당 5,000/이상의 수율로 수득할 수 있었다.
본 발명의 신규한 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 경우 스트렙토키나제가 페리흘라즘과 배양액내에 축적됨으로써, 임상적으로 안전한 고순도의 스트렙토키나제를 경제적으로 대량생산하는 효과를 가진다. 아울러, 제조된 스트렙토키나제는 경구용 제제는 물론이고 고순도룰 요구하는 주사용 제제의 제조에 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는 다는 것은 당업게에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다
[실시예 1:스트렙토키나제 발현벡터 pSK100의 제조]
본 발명의 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100은 대장균에서 강력하게 발현되는 tac 전사촉진제를 가지고 있으며, 그 하류에 ompA 신호서열을 가지고 있다. ompA 신호서열은 대장균의 세포질에서 생산된 스트렙토키나제가 세포막을 통과하여 페리플라즘으로 분비되도록 작용하며, 스트렙토키나제를 코딩하는 유전자 skc는 스트렙토키나제 속의 미생물로부터 클로닝 (cloning)된 것으로서, 이 유전자로부터 생성되는 스트렙토키나제는 사람의 플라스미노겐을 효과적으로 활성화시킨다고 밝혀졌다 (참조:Byun, SM. et al., korean Biochem. J. , 19:391(1986) )한편, pSK100이대장균에서의 복제를 위하여 유전자 ori가 필요하며, 배양액의 대장균이 플라스미드를 유지하도록 하는 기능을 가지는 선택표지로서 유전자 Ampr이 필요하다(참조: 제1도).
pSK100을 제조하기 위하여, pIN-III- ompA- Hind벡터(참조: Renter-Delrue, F. et al. , Nucleic Acids Res. , 16:8725(1988))를 제한 효소 Xbal과 BamHI으로이중 절단한 다음, Klenow F.을 처리하여 ompA신호서열을 포함하는 약 80bp의 DNA를 수득하였다. 그런 다음 , 전기 DNA와 강력한 tac 전사 촉진제를 가지는 pKK223-3 벡터 ( pharmacia Dong-il Co., Ltd., korea)를 HindIII, EcoRI 및 klenow F.로 처리하여 4552bp의 DNA를 수득하고, 연결효소로 결합하여 pkK223-3벡터를 제조 하였다. 이어서 하기에서 설명되는 PCR반응에 의해 수득한 스트렙토키나제 유전자를 PstI로 처리한 다음, 상기 pKK-omp를 hindIII , Klenow F, 및 PstI으로 차례로 처리하여 수득한 DNA와 결합시켜 최종적으로 pSK100을 제조하였다.
스트렙토키나제 유전자를 제조하기 위한 PCR반응은 다음과 같다: 스트렙토키나제 유전자를 pU19벡터의 EcoRI 부위에 도입하고, 이것을 부위 특히 돌연변이를 위한 주형 DNA로 이용 하였다. 그리고 전기 주형 DNA100ng돌연변이 유발성 올리고 뉴클레오티드(5 '- ATTACTGAATCCAACTTCGCG-3')50 pmole, pUC19의 역 (reverse) 종합반응 연쇄 시발 물질 50 pmole,4dNTP 혼합물 200uM, 10배 Vent DNA중합효소 완충용액 10 ㎕, Vent DNA중합효소 4단위( unit)를 총 100㎕의 반응 용액이 되도록 증류수로 조정한 다음, 전기 반응용액을 500㎕용량의 에펜도르프 튜브에 넣고JM109 그위에 50㎕의 미네랄오일을 첨가하였다.
그런다음 , 반응액이 들어있는 전기 에펜도르프 튜브를 다음과 같은 조건으로 PCR반응시켰다 : 즉, 1번째 주기는 94℃에서 2분간 변성 (denaturation), 55℃ 1분간 결합 (annealing), 72℃에서 2분간 연장(extention) 반응: 2번째부터 29번째 까지의 주기는 94℃에서 1분간변성 ,55℃에서 30초간 결합, 72℃에서 1분간 연장반응: 및, 마지막 주기는 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 30초간 결합, 72℃에서 10분간 연장 반응 시켰다.그런다음, 이의 반응산물 100㎕를 1%아가로스 젤에서 전기영동하여 약 1450bp에 해당하는 DNA밴드를 수득하였다.
[실시예 2: 스트렙토키나제 대량발현 재조합 미생물인 SMB20균주의 제조]
실시예1에서 제조된 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100을 이용하여,본 발명의 재조합 미생물인 SMB20균주를 아래와 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 다음과 같이 대장균 JM109균주를 형질전환이 용이한 세포(competent cell)로 전환시켰다.50㎖의 LB배지에 진탕배양한 대장균 JM109균주 50㎕를 접종하고, 37℃에서 2시간 배양하였다. 그런다음 ,원심분리 하여 세포를 수득하고, 16.7㎖의 하기 표 1의 RF1용액에 현탁하여 얼음속에 30분간 방치하였다. 이것을 다시 원심분리하여 침전된 세포가 하기 표2의 RF2영역 4㎖을 가하여 현탁시키고 이중 50㎕을 형질전환에 사용하였다.
형질전환은 다음과 같이 수행하였다: 50㎕의 형질전환이 용이한 세포에 pSK100 1㎕을 가하고 얼음속에 10분간 방치한 다음, 43℃에서 90초간 열충격을 가하였다. 여기에 LB배양액 0.5㎖을 가하고 37℃에서 1시간 배양한 다음 앰피실린을 함유한 LB-아가배지에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양후 10시간이 경과하면, 생성된 콜로니를 다시 재배양하여 pSK100에의하여 형질전환되었음을 확인하고, SMB20이라 명명하였다.전기균주는 대장균 JM109/pSK100(Escherichia coli JM109/pSK100)으로 정식 명명되었으며, 1995년 3월 24일, 한국과학기숙연구원 부설 유전공학연구소 유전자은행 (KCTC)에 기탁번호 KCTC8653P로 기탁되었다.
[실시예 3: SMB20 균주로부터 스트렙토스키나제의 발현 및 활성 측정]
1리터 비이커에 LB배양액을 200㎖씩 넣은 다음, 전배양한 실시예 2의 SM20균주 20㎖를 접종하고 30℃의 진탕배양기에서 배양하였다. 접종하고 3시간 경과 후에 1PTG를 1mM의 농도로 첨가하여 스트렙토키나제 발현을 유도하였다. 매시간 배양액 5㎖을 취하여, 1mM은 분광광도계를 이용하여 (OD600)을 측정하였고 , 4㎖은 원심분리한 다음, 상등액을 '세포외 분획'으로 명명하였다. 침전된 세포에 표3의STE용액 0.2㎖을 넣어 섞은 다음 , 얼음에 10분간 방치하고, 다시 원심분리하여 상등액을 '페리플라즘 분획'으로 명명하였다. 최종 침전된 세포에 20mM Tris 완충용액(pH 8.0) 0.2㎖을 넣고 초음파로 분쇄한 다음, 다시 원심분리하여 상등액을 '세포질 분획'으로 명명하였다.
분획 각각의 스트렙토키나제 활성은 다음과 같이 측정하였다.:하기 표4의 활성측정용 완충용액 1.26㎖에 인체 플라스미노겐 용액(표4 의 활성 측정용 완충용액 1㎖에 2IU 의 인체 플라스미노겐을 용해시켜 제조) 150㎕와 스트렙토키나제 시료 60㎕을 가한후 30℃에 3분간 방치하였다. 여기에 CLN 용액(증류수와 디메칠포름아미드(dimethylformamide)을 1:1로 혼합한 용액에 알파-카보벤족시-L-라이신-파라-니트로페닐에스테르(α-carbobenzoxy-L-lysine-p-nitrophenyl ester)를 20mM 농도로 용해시제조) 30㎕을 넣고 혼합하여 분광광도계를 이용하여 340 nm에서 1 분간 흡광도 증가량을 측정하였다. 이때 1분간 흡광도가 0.01증가한 값을 1CLN단위(unite)로 결정하였는데, 국제단위 (international unit)가 정해진 스트렙토키나제 (Sigma chemical Co. , USA)를 구입하여 동일한 방법으로 측정함으로써 CLN단위와 국제단위의 비율을 정하고, 이 비율에 따라 시료의 CLN단위를 국제단위로 환산하였다.
시간에 따른 세포의 OD600증가와 각분획의 스트렙토키나제 활성은 제 3도에 나타내었다. 제 3도에서, (―●―)는 페리 플라즘 분획, (─+─)는 세포질 분획, (―*―)는 세포외 분획, (―■―)는 600nm에서의 흡광도, (―×―)는 IPTG무첨가 대조군위 페리흘라즘 분획을 각각 나타낸다. 각각의 세포외 분획 0.2㎖을 농축한 것과, 각각위 페리흘라즘 분획 20㎕를 소디움도데실썰페이트-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동법(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 으로 분석하여 그 결과를 제 4도에 나타내었다. 제4도에서 세로 숫자는 단백질의 분자량이며, 가로 숫자는 배양시간을 나타낸다. 이상과 같이, pSK100으로 형질전환된 본 발명의 재조합 균주인 대장균(E. coli) JM109를 30℃에서 배양하면서 (OD)값이 0.5일 때 IPTG를 최종 1 mM농도가 되도록 가하여 스트렙토키나제의 발현을 10시간 이상 유도하였을 경우, 대장균위 페리플라즘과 배양액에사 85%이상의 고순도 스트렙토키나제를 배양액 1㎖당 5,000IU이상의 수율로 수득할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 tac전사촉진제와 ompA 신호서열 및 스트렙토키나제 유전자를 함유하는 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100, 전기 pSK100에 의하여 형질전환되어 스트렙토키나제를 생산하는 재조합 미생물 및 그로부터 스트렙토키나제 를 제조하는 방법을 제공 한다, 본발명의 신규한 스트렙토키나제 발현백터 pSK100로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 경우, 스트렙토키나제 가 페리흘라즘과 배양액내에 축적됨으로써, 임상적으로 안전한 고순도의 스트렙토키나제를 경제적으로 대량 생산하는 효과를 가진다. 아울러, 제조된 스트렙토키나제는 경구용 제제는 물론이고 고순도를 요구하는 주사용 제제의 제조에 사용할 수 있다.

Claims (4)

  1. tac 전사촉진제, ompA 신호서열 및 스트렙토키나제 유전자를 포함하는 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100.
  2. 제1항의 스트렙토키나제 발현벡터 pSK100에 의하여 형질전환 되어 스트렙토키나제를 생산하는 재조합 미생물 대장균 JM109/pSK100(Escherichia coli JM109/pSK100)(KCTC 8653P).
  3. 제2항의 재조합 미생물 대장균 JM109/pSK100(Escherichia coli JM109/pSK100)을 배양하여 수득하는 공정을 포함하는 고순도의 스트렙토키나제 제조방법.
  4. 제1항의 스트렙토키나제 발현 벡터 pSK100로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여 수득하는 공정에 의해 제조된 스트렙토키나제 .
KR1019950007251A 1995-03-31 1995-03-31 스트렙토키나제 발현 미생물 및 그를 이용한 스트렙토키나제의 제조방법 KR0134997B1 (ko)

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KR1019950007251A KR0134997B1 (ko) 1995-03-31 1995-03-31 스트렙토키나제 발현 미생물 및 그를 이용한 스트렙토키나제의 제조방법

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KR20190070519A (ko) 2017-12-13 2019-06-21 주식회사 저스티스어드벤처 수리 조선 작업공정의 실시간 보고 및 관리 방법

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