JPH0662869A - 超好熱性α−アミラーゼ遺伝子 - Google Patents
超好熱性α−アミラーゼ遺伝子Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
Abstract
(57)【要約】
【目的】 超好熱性のα−アミラーゼ遺伝子、それを用
いたα−アミラーゼの製造法を提供する。 【構成】 超好熱性のα−アミラーゼをコードするポリ
ヌクレオチドから本質的になるDNA断片。該DNA断
片で形質変換した宿主細胞を培養して該DNA断片を発
現させてα−アミラーゼを製造する。
いたα−アミラーゼの製造法を提供する。 【構成】 超好熱性のα−アミラーゼをコードするポリ
ヌクレオチドから本質的になるDNA断片。該DNA断
片で形質変換した宿主細胞を培養して該DNA断片を発
現させてα−アミラーゼを製造する。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的にはクローニン
グしたα−アミラーゼ遺伝子に関するものであり、特
に、クローニングした超好熱性α−アミラーゼ遺伝子、
ならびにこの遺伝子を用いたα−アミラーゼの製造方法
に関するものである。
グしたα−アミラーゼ遺伝子に関するものであり、特
に、クローニングした超好熱性α−アミラーゼ遺伝子、
ならびにこの遺伝子を用いたα−アミラーゼの製造方法
に関するものである。
【0002】
【従来の技術】α−アミラーゼは広く天然に分布する。
α−アミラーゼの活性は、工業的には液化として知られ
る過程で、α−1,4グルコシド結合をエンド様式で加
水分解することによって特徴づけられる。粘度が高く、
物質移動の問題があるので、工業的な液化は、できるだ
け高い温度で行われる。通常、バチルス・リケニホルミ
ス( Bacillus licheniformis )から得たα−アミラ
ーゼを使用して、デンプンスラリーをカルシウムイオン
とともに100℃で5〜10分間インキュベートし、次
に、95℃で1〜2時間インキュベートする〔たとえ
ば、ケニーリーら(T. K. および W. F. Keneally )、
サーモフィルス:ジェネラル,モレキュラーアンド ア
プライド マイクロバイオロジー( Thermophiles : Ge
neral , Molecular and Applied Microbiology )、
ブロック( T. D. Brock )編、ジョン・ウィリー・ア
ンド・サンズ(John Wiley & Sons )、ニューヨー
ク(1986)所収〕。この過程は、いくつかの産業で
欠くことのできないものとなっている。各種の重合度の
グルコース重合体が、製紙、布の製造、醸造、および発
酵で利用されている。液化は、安価なソースから大量の
D−グルコースを製造することのできる糖化を行うにあ
たっての予備工程である。
α−アミラーゼの活性は、工業的には液化として知られ
る過程で、α−1,4グルコシド結合をエンド様式で加
水分解することによって特徴づけられる。粘度が高く、
物質移動の問題があるので、工業的な液化は、できるだ
け高い温度で行われる。通常、バチルス・リケニホルミ
ス( Bacillus licheniformis )から得たα−アミラ
ーゼを使用して、デンプンスラリーをカルシウムイオン
とともに100℃で5〜10分間インキュベートし、次
に、95℃で1〜2時間インキュベートする〔たとえ
ば、ケニーリーら(T. K. および W. F. Keneally )、
サーモフィルス:ジェネラル,モレキュラーアンド ア
プライド マイクロバイオロジー( Thermophiles : Ge
neral , Molecular and Applied Microbiology )、
ブロック( T. D. Brock )編、ジョン・ウィリー・ア
ンド・サンズ(John Wiley & Sons )、ニューヨー
ク(1986)所収〕。この過程は、いくつかの産業で
欠くことのできないものとなっている。各種の重合度の
グルコース重合体が、製紙、布の製造、醸造、および発
酵で利用されている。液化は、安価なソースから大量の
D−グルコースを製造することのできる糖化を行うにあ
たっての予備工程である。
【0003】熱安定性α−アミラーゼは、工業的液化で
使用される高温に極めて適しており、これは、この酵素
が熱安定性であればあるほど高温での加水分解が効率的
に進行するからである。好熱性微生物から単離された酵
素は、その微生物の最適成育温度に見合った、その微生
物に固有の熱安定性を示す。したがって、その微生物の
最適成育温度が高ければ高いほど、その微生物が工業上
の用途に適したα−アミラーゼを産生する可能性が高い
わけである。
使用される高温に極めて適しており、これは、この酵素
が熱安定性であればあるほど高温での加水分解が効率的
に進行するからである。好熱性微生物から単離された酵
素は、その微生物の最適成育温度に見合った、その微生
物に固有の熱安定性を示す。したがって、その微生物の
最適成育温度が高ければ高いほど、その微生物が工業上
の用途に適したα−アミラーゼを産生する可能性が高い
わけである。
【0004】これまでにも、熱安定特性を示すα−アミ
ラーゼが数多く精製されている。これらの熱安定性α−
アミラーゼには、最適酵素活性が50〜80℃の範囲に
ある中等度好熱菌〔アントランキアン( Antrankian
)、アプライド バイオケミストリー アンド バイ
オテクノロジー( Applied Biochem. and Biotech.
)、20/21:267(1989)、グリンフら(
Glymph および Stutzenberger )、アプライド エンバ
イロンメンタル マイクロバイオロジー( AppliedEnvi
ron. Microbiol. )、34:391(1977)、長
谷川( Hasegawa )ら、ジャーナル オブ バイオケミ
ストリー( J. Biochem. )79:35(1976)〕
から、最適酵素活性が80℃以上の超好熱菌〔シューマ
ン( Schumann )ら、エフイービーエス(FEBS)2
82:122(1991)、コッホ(Koch )ら、アー
カイブス オブ マイクロバイオロジー( Arch. Micro
biol.)、155:572(1991)、レーダーマン
( Laderman )ら、(1992)〕まで各種のものがあ
る。最適成育温度が100℃あるいはその近辺にある微
生物から単離されたα−アミラーゼは、酵素活性がこの
温度で最適となり、120℃という高温でも酵素活性が
残存しているので、工業上の用途に理想的に合致してい
ることが見いだされている。
ラーゼが数多く精製されている。これらの熱安定性α−
アミラーゼには、最適酵素活性が50〜80℃の範囲に
ある中等度好熱菌〔アントランキアン( Antrankian
)、アプライド バイオケミストリー アンド バイ
オテクノロジー( Applied Biochem. and Biotech.
)、20/21:267(1989)、グリンフら(
Glymph および Stutzenberger )、アプライド エンバ
イロンメンタル マイクロバイオロジー( AppliedEnvi
ron. Microbiol. )、34:391(1977)、長
谷川( Hasegawa )ら、ジャーナル オブ バイオケミ
ストリー( J. Biochem. )79:35(1976)〕
から、最適酵素活性が80℃以上の超好熱菌〔シューマ
ン( Schumann )ら、エフイービーエス(FEBS)2
82:122(1991)、コッホ(Koch )ら、アー
カイブス オブ マイクロバイオロジー( Arch. Micro
biol.)、155:572(1991)、レーダーマン
( Laderman )ら、(1992)〕まで各種のものがあ
る。最適成育温度が100℃あるいはその近辺にある微
生物から単離されたα−アミラーゼは、酵素活性がこの
温度で最適となり、120℃という高温でも酵素活性が
残存しているので、工業上の用途に理想的に合致してい
ることが見いだされている。
【0005】理論的には、遺伝子工学の技術を使用する
ことにより、遺伝子をクローニングして、その遺伝子が
コードする酵素を、工業上の用途に十分な量生成するこ
とが可能である。好熱性のα−アミラーゼをコードする
数多くの遺伝子が単離され、そしてエシェリキア・コリ
( Escherichia coli )およびバチルス・スブチリス
( Bacillus subtilis )で発現されている〔フクスミ
( Fukusumi )ら、ヨーロピアン ジャーナル オブ
バイオケミストリー( Eur. J. Biochem. )、98:
95(1985)、塚越( Tsukagoshi )ら、モレキュ
ラー アンドジェネラル ジェネティクス( Mol. Gen.
Genet.)、195:58(1984)、ジャーナル
オブ バクテリオロジー( J. Bacteriology )、16
4:1182(1985)〕。遺伝子がその生物の内部
で翻訳される温度は、形質転換受容性細胞中でのその遺
伝子の発現に対して影響を及ぼすものではないようであ
る。したがって、好熱性の酵素を、周囲温度で成育させ
た宿主細胞中で産生させることが可能である。しかし、
これまでのところ、超好熱性のα−アミラーゼをコード
する遺伝子は、成功裡にクローニングされていなかっ
た。
ことにより、遺伝子をクローニングして、その遺伝子が
コードする酵素を、工業上の用途に十分な量生成するこ
とが可能である。好熱性のα−アミラーゼをコードする
数多くの遺伝子が単離され、そしてエシェリキア・コリ
( Escherichia coli )およびバチルス・スブチリス
( Bacillus subtilis )で発現されている〔フクスミ
( Fukusumi )ら、ヨーロピアン ジャーナル オブ
バイオケミストリー( Eur. J. Biochem. )、98:
95(1985)、塚越( Tsukagoshi )ら、モレキュ
ラー アンドジェネラル ジェネティクス( Mol. Gen.
Genet.)、195:58(1984)、ジャーナル
オブ バクテリオロジー( J. Bacteriology )、16
4:1182(1985)〕。遺伝子がその生物の内部
で翻訳される温度は、形質転換受容性細胞中でのその遺
伝子の発現に対して影響を及ぼすものではないようであ
る。したがって、好熱性の酵素を、周囲温度で成育させ
た宿主細胞中で産生させることが可能である。しかし、
これまでのところ、超好熱性のα−アミラーゼをコード
する遺伝子は、成功裡にクローニングされていなかっ
た。
【0006】超好熱性の古細菌であるピロコッカス・フ
リオズス( Pyrococcus furiosus)は、硫質噴気孔の
泥から単離されたもので、最適成育温度が100℃であ
ることが見いだされている〔アーカイブス オブ マイ
クロバイオロジー、145:56(1968)〕。ピロ
コッカス・フリオズスから得られたα−アミラーゼの活
性は、無細胞の培養上清〔アントランキアン、WO 9
0/11352(1990)〕および細胞の粗抽出物
〔ブラウン( Brown )ら、アプライド エンバイロン
メンタル マイクロバイオロジー、56:1985(1
990)〕で検出されている。これらのα−アミラーゼ
の活性の至適pHは、前者では4.5に、後者では5.
6付近に存在する。この細菌由来のα−アミラーゼは、
高温でも安定であることが知られており、産業の諸分野
での広範な使用が期待されている。
リオズス( Pyrococcus furiosus)は、硫質噴気孔の
泥から単離されたもので、最適成育温度が100℃であ
ることが見いだされている〔アーカイブス オブ マイ
クロバイオロジー、145:56(1968)〕。ピロ
コッカス・フリオズスから得られたα−アミラーゼの活
性は、無細胞の培養上清〔アントランキアン、WO 9
0/11352(1990)〕および細胞の粗抽出物
〔ブラウン( Brown )ら、アプライド エンバイロン
メンタル マイクロバイオロジー、56:1985(1
990)〕で検出されている。これらのα−アミラーゼ
の活性の至適pHは、前者では4.5に、後者では5.
6付近に存在する。この細菌由来のα−アミラーゼは、
高温でも安定であることが知られており、産業の諸分野
での広範な使用が期待されている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】しかし、ピロコッカス
・フリオズスからこの酵素を工業的に生成する方法は確
立されておらず、また、この酵素の遺伝子の構造もアミ
ノ酸配列も報告されていない。
・フリオズスからこの酵素を工業的に生成する方法は確
立されておらず、また、この酵素の遺伝子の構造もアミ
ノ酸配列も報告されていない。
【0008】本発明は、超好熱性α−アミラーゼをコー
ドするクローニングした配列を、はじめて開示する。こ
の配列が明らかとなったことにより、この酵素を工業規
模で製造することが可能となるものである。
ドするクローニングした配列を、はじめて開示する。こ
の配列が明らかとなったことにより、この酵素を工業規
模で製造することが可能となるものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明は、α−アミラー
ゼ、特に、超好熱性のα−アミラーゼをコードするヌク
レオチド配列を有する、単離されたDNA断片に関する
ものである。本発明は、さらに、超好熱性α−アミラー
ゼを生成する遺伝子組換え法による方法に関するもので
ある。本発明は、この種の方法に使用するのに適した発
現ベクターにも関するものである。
ゼ、特に、超好熱性のα−アミラーゼをコードするヌク
レオチド配列を有する、単離されたDNA断片に関する
ものである。本発明は、さらに、超好熱性α−アミラー
ゼを生成する遺伝子組換え法による方法に関するもので
ある。本発明は、この種の方法に使用するのに適した発
現ベクターにも関するものである。
【0010】本発明の一般的な目的は、超好熱性のα−
アミラーゼをコードする遺伝子を提供することにある。
アミラーゼをコードする遺伝子を提供することにある。
【0011】本発明の特定の目的のひとつは、ピロコッ
カス・フリオズスから得たα−アミラーゼをコードする
遺伝子を提供することにある。
カス・フリオズスから得たα−アミラーゼをコードする
遺伝子を提供することにある。
【0012】本発明の別の目的は、ベクターと上述の遺
伝子から構成される組換えDNA分子を提供すること、
ならびにこの組換えDNA分子を含む宿主細胞を提供す
ることにある。
伝子から構成される組換えDNA分子を提供すること、
ならびにこの組換えDNA分子を含む宿主細胞を提供す
ることにある。
【0013】本発明のさらに別の目的は、超好熱性のα
−アミラーゼを生成する方法を提供することにある。
−アミラーゼを生成する方法を提供することにある。
【0014】本発明の上記以外の目的および利点は、以
下の説明を読むにしたがって明らかとなるはずである。
下の説明を読むにしたがって明らかとなるはずである。
【0015】本発明は、超好熱性細菌、好ましくは古細
菌、特に好ましくはピロコッカス・フリオズスから得た
α−アミラーゼの全部あるいは一部をコードする、単離
されたDNA断片に関するものである。本発明は、この
DNA断片を含む組換え分子、およびこの組換えDNA
分子で形質転換した細胞にも関するものである。本発明
は、さらなる実施態様では、超好熱性のα−アミラーゼ
を製造する方法に関するものである。
菌、特に好ましくはピロコッカス・フリオズスから得た
α−アミラーゼの全部あるいは一部をコードする、単離
されたDNA断片に関するものである。本発明は、この
DNA断片を含む組換え分子、およびこの組換えDNA
分子で形質転換した細胞にも関するものである。本発明
は、さらなる実施態様では、超好熱性のα−アミラーゼ
を製造する方法に関するものである。
【0016】本発明が対象とするDNA断片は、図1乃
至図3に示すアミノ酸配列(図1乃至図3に示す特定の
DNA配列は一つの例にすぎない)の全体をコードする
ものとすることも、また、少なくとも15個のアミノ酸
(45個のヌクレオチドと対応)、好ましくは少なくと
も25個のアミノ酸(75個のヌクレオチドと対応)、
さらに好ましくは35個のアミノ酸(105個のヌクレ
オチドと対応)、そして特に好ましくは75個のアミノ
酸(225個のヌクレオチドと対応)を含むその一部を
コードするものとすることもできる。このDNA断片
は、cDNA配列であってもよい。当業者であれば、こ
うした部分が、たとえばプローブとしての用途を有する
ものであることがわかるはずである。本発明の対象とす
るDNA断片は、ピロコッカス・フリオズスのα−アミ
ラーゼと実質的に同一の酵素活性を有するタンパク質
(あるいはポリペプチド)(たとえば、図1乃至図3の
アミノ酸配列の、機能的に同等な対立遺伝子あるいは種
による変形例)をコードする断片も包含するものであ
る。
至図3に示すアミノ酸配列(図1乃至図3に示す特定の
DNA配列は一つの例にすぎない)の全体をコードする
ものとすることも、また、少なくとも15個のアミノ酸
(45個のヌクレオチドと対応)、好ましくは少なくと
も25個のアミノ酸(75個のヌクレオチドと対応)、
さらに好ましくは35個のアミノ酸(105個のヌクレ
オチドと対応)、そして特に好ましくは75個のアミノ
酸(225個のヌクレオチドと対応)を含むその一部を
コードするものとすることもできる。このDNA断片
は、cDNA配列であってもよい。当業者であれば、こ
うした部分が、たとえばプローブとしての用途を有する
ものであることがわかるはずである。本発明の対象とす
るDNA断片は、ピロコッカス・フリオズスのα−アミ
ラーゼと実質的に同一の酵素活性を有するタンパク質
(あるいはポリペプチド)(たとえば、図1乃至図3の
アミノ酸配列の、機能的に同等な対立遺伝子あるいは種
による変形例)をコードする断片も包含するものであ
る。
【0017】本発明は、ベクターと上述のDNA断片
(図1乃至図3に示すタンパク質をコードするDNA断
片とするのが有利である)とを含む組換えDNA分子に
も関するものである。ベクターは、ウイルスあるいはプ
ラスミドベクターの形態とすることができる。こうした
ベクターの例としては、たとえば、λファージの誘導体
あるいはpUCプラスミド(たとえば、pUC18およ
びpUC19)、ならびにpETベクターを挙げること
ができる。DNA断片は、たとえばプロモーター(たと
えば、熱ショックプロモーター)といった調節要素が作
用可能なかたちで結合したベクター中に位置させること
ができる。本発明の方法で使用するのに適したプロモー
ターとしては、真正細菌、たとえばエシェリキア・コリ
およびバチルス・スブチリスあるいは真核生物、たとえ
ば酵母中で機能するプロモーターが挙げられる。本発明
の組換え分子は、原核細胞あるいは真核細胞を形質転換
するのに適したものである可能性がある。
(図1乃至図3に示すタンパク質をコードするDNA断
片とするのが有利である)とを含む組換えDNA分子に
も関するものである。ベクターは、ウイルスあるいはプ
ラスミドベクターの形態とすることができる。こうした
ベクターの例としては、たとえば、λファージの誘導体
あるいはpUCプラスミド(たとえば、pUC18およ
びpUC19)、ならびにpETベクターを挙げること
ができる。DNA断片は、たとえばプロモーター(たと
えば、熱ショックプロモーター)といった調節要素が作
用可能なかたちで結合したベクター中に位置させること
ができる。本発明の方法で使用するのに適したプロモー
ターとしては、真正細菌、たとえばエシェリキア・コリ
およびバチルス・スブチリスあるいは真核生物、たとえ
ば酵母中で機能するプロモーターが挙げられる。本発明
の組換え分子は、原核細胞あるいは真核細胞を形質転換
するのに適したものである可能性がある。
【0018】本発明は、別の実施態様では、上述の組換
え細胞で形質転換した宿主細胞に関するものである。宿
主細胞は、原核生物(たとえば、エシェリキア・コリお
よびバチルス・スブチリスのような細菌)とすること
も、下等真核生物(すなわち、酵母のような菌類)とす
ることも、また高等真核生物(すなわち哺乳類)とする
こともできる。形質転換は、当業界で公知の方法を使用
することによって行うことができる。組換え分子を発現
系の形態とする場合には、形質転換細胞を上述のタンパ
ク質のソースとして使用することができる。
え細胞で形質転換した宿主細胞に関するものである。宿
主細胞は、原核生物(たとえば、エシェリキア・コリお
よびバチルス・スブチリスのような細菌)とすること
も、下等真核生物(すなわち、酵母のような菌類)とす
ることも、また高等真核生物(すなわち哺乳類)とする
こともできる。形質転換は、当業界で公知の方法を使用
することによって行うことができる。組換え分子を発現
系の形態とする場合には、形質転換細胞を上述のタンパ
ク質のソースとして使用することができる。
【0019】後述の実施例では、超好熱菌であるピロコ
ッカス・フリオズス( P. furiosus )〔( Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen )に寄託。認識番
号、DSM3638〕に言及する。この細菌からα−ア
ミラーゼ遺伝子をクローニングする方法、そしてこの遺
伝子を含む形質転換体を調製する方法は、一般的には以
下のように記載することができる。
ッカス・フリオズス( P. furiosus )〔( Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen )に寄託。認識番
号、DSM3638〕に言及する。この細菌からα−ア
ミラーゼ遺伝子をクローニングする方法、そしてこの遺
伝子を含む形質転換体を調製する方法は、一般的には以
下のように記載することができる。
【0020】(1) ピロコッカス・フリオズスの細胞抽
出物からα−アミラーゼを精製する。 (2) 上記の工程(1)で得た酵素の部分アミノ酸配列
を、エドマン法で決定する。 (3) ピロコッカス・フリオズスから染色体DNAを抽
出する。 (4) 上記の工程(2)で得たアミノ酸配列に基づい
て、遺伝子増幅のためのオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドのプライマーを合成し、これらのプライマーのうちの
2種と、上記の工程(3)で得た染色体DNAを鋳型と
して用いることにより、PCRによる増幅を行う。 (5) 上記の工程(3)で得た染色体DNAを適当な制
限酵素で消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動で分
離し、膜に移す。工程(4)で増幅して得たDNAを標
識し、ハイブリダイゼーションを行う。ゲルからDNA
断片(断片のサイズはハイブリダイゼーションから推定
する)を回収する。 (6) ベクターDNAを酵素でその酵素に特有の位置で
切断し、上記の工程(5)で得たDNA断片を挿入す
る。 (7) ベクターに挿入したDNA断片を宿主細胞に導入
し、目的の配列(α−アミラーゼをコードする配列)を
含む形質転換体を選びだす。 (8) 上記の工程(7)で選びだした形質転換体から、
プラスミドDNAを抽出する。 (9) α−アミラーゼをコードする配列を、プラスミド
の翻訳シグナル(SD配列)にSD配列が作用可能なか
たちで結合して、翻訳が適切なリーディング・フレーム
で生じる発現プラスミドを構築する。 (10) 上記の工程(9)で得た発現プラスミドから3’
−非コード配列を取り除いて、発現レベルのさらに高い
別の発現プラスミドを生成する。 (11) 宿主細胞を、上記の工程(10)で得た発現プラ
スミドで形質転換する。 (12) 上記の工程(11)で得た形質転換体を培養し、
培養細胞の抽出物からα−アミラーゼを生成する。
出物からα−アミラーゼを精製する。 (2) 上記の工程(1)で得た酵素の部分アミノ酸配列
を、エドマン法で決定する。 (3) ピロコッカス・フリオズスから染色体DNAを抽
出する。 (4) 上記の工程(2)で得たアミノ酸配列に基づい
て、遺伝子増幅のためのオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドのプライマーを合成し、これらのプライマーのうちの
2種と、上記の工程(3)で得た染色体DNAを鋳型と
して用いることにより、PCRによる増幅を行う。 (5) 上記の工程(3)で得た染色体DNAを適当な制
限酵素で消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動で分
離し、膜に移す。工程(4)で増幅して得たDNAを標
識し、ハイブリダイゼーションを行う。ゲルからDNA
断片(断片のサイズはハイブリダイゼーションから推定
する)を回収する。 (6) ベクターDNAを酵素でその酵素に特有の位置で
切断し、上記の工程(5)で得たDNA断片を挿入す
る。 (7) ベクターに挿入したDNA断片を宿主細胞に導入
し、目的の配列(α−アミラーゼをコードする配列)を
含む形質転換体を選びだす。 (8) 上記の工程(7)で選びだした形質転換体から、
プラスミドDNAを抽出する。 (9) α−アミラーゼをコードする配列を、プラスミド
の翻訳シグナル(SD配列)にSD配列が作用可能なか
たちで結合して、翻訳が適切なリーディング・フレーム
で生じる発現プラスミドを構築する。 (10) 上記の工程(9)で得た発現プラスミドから3’
−非コード配列を取り除いて、発現レベルのさらに高い
別の発現プラスミドを生成する。 (11) 宿主細胞を、上記の工程(10)で得た発現プラ
スミドで形質転換する。 (12) 上記の工程(11)で得た形質転換体を培養し、
培養細胞の抽出物からα−アミラーゼを生成する。
【0021】ピロコッカス・フリオズスDSM3638
からのα−アミラーゼの精製は、前出のレーダーマンら
(1992)の方法を使用することによって行うことが
でき、この方法では、一連のクロマトグラフィーによる
分離ならびに、それに続く分離用電気溶出を行う。
からのα−アミラーゼの精製は、前出のレーダーマンら
(1992)の方法を使用することによって行うことが
でき、この方法では、一連のクロマトグラフィーによる
分離ならびに、それに続く分離用電気溶出を行う。
【0022】この方法によって生成したα−アミラーゼ
は、分子量が130kDaのホモ二量体である。この酵
素は、92℃でのpH最適値が6〜8で、カルシウムイ
オンとは独立の有意な活性ならびに安定性を示す。10
0℃で3時間のインキュベーションを行った後も、この
酵素は当初の活性の80%以上を保持している。
は、分子量が130kDaのホモ二量体である。この酵
素は、92℃でのpH最適値が6〜8で、カルシウムイ
オンとは独立の有意な活性ならびに安定性を示す。10
0℃で3時間のインキュベーションを行った後も、この
酵素は当初の活性の80%以上を保持している。
【0023】この精製したα−アミラーゼから、自動化
エドマン法〔ハンカピラー( Hunkapiller )ら、メソ
ッズ イン エンザイモロジー( Methods in Enzymo
logy)、91:399〜413(1983)〕を使用す
ることにより、部分アミノ酸配列情報を得た。α−アミ
ラーゼのタンパク質のN末端配列を、下記の表1に示
す。この配列を配列1と称するものとする。臭化シアン
およびトリプシンで消化を行った後の精製断片のN末端
配列の一つを、下記の表1に示す。この配列を配列2と
称するものとする。
エドマン法〔ハンカピラー( Hunkapiller )ら、メソ
ッズ イン エンザイモロジー( Methods in Enzymo
logy)、91:399〜413(1983)〕を使用す
ることにより、部分アミノ酸配列情報を得た。α−アミ
ラーゼのタンパク質のN末端配列を、下記の表1に示
す。この配列を配列1と称するものとする。臭化シアン
およびトリプシンで消化を行った後の精製断片のN末端
配列の一つを、下記の表1に示す。この配列を配列2と
称するものとする。
【0024】 表 1 α−アミラーゼの部分アミノ酸配列 配列1 : DKINFIFGIHNHQPLGN 配列2 : TLNDMRQEYYFK 配列1 (配列表の配列番号3);本発明のα−アミラーゼのN末端の配列 配列2 (配列表の配列番号4);本発明のα−アミラーゼのトリプシン及 び臭化シアンによる分解産物の精製断片のN末端の配列 ───────────────────────────────────
【0025】ピロコッカス・フリオズスの染色体DNA
を、この生物の100℃での静置培養から抽出した。抽
出、精製、および制限酵素による消化は、当業界で周知
であり、モレキュラー クローニング ア ラボラトリ
ー マニュアル( MolecularCloning , A Laboratory
Manual )〔マニアティス( Maniatis )ら、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー( Cold Sprin
g Harbor Laboratory )、1982、第75〜178
頁〕にも詳しく説明されている方法によって行うことが
できる。
を、この生物の100℃での静置培養から抽出した。抽
出、精製、および制限酵素による消化は、当業界で周知
であり、モレキュラー クローニング ア ラボラトリ
ー マニュアル( MolecularCloning , A Laboratory
Manual )〔マニアティス( Maniatis )ら、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー( Cold Sprin
g Harbor Laboratory )、1982、第75〜178
頁〕にも詳しく説明されている方法によって行うことが
できる。
【0026】α−アミラーゼ遺伝子をクローニングする
にあたっては、下記の表2に示すプライマー1,2、お
よび3を使用した。これらのプライマーは、エドマン法
で得た部分アミノ酸配列情報に基づいて設計した。これ
らのプライマーとピロコッカス・フリオズスの染色体D
NAとを使用して2工程PCR(ネステッドPCR)を
行うと、DNA断片を特異的に増幅できることを見いだ
した。増幅した断片のヌクレオチド配列(図1乃至図
3)を同定し、この断片でコードされる可能性のあるア
ミノ酸配列を推定した。こうして推定したアミノ酸配列
の一つの中に、エドマン法で得た配列1(表1)のアミ
ノ酸配列が見いだされた。このように、増幅したDNA
断片をプローブとして使用することにより、α−アミラ
ーゼ遺伝子をコードするDNA断片がクローニングされ
た。
にあたっては、下記の表2に示すプライマー1,2、お
よび3を使用した。これらのプライマーは、エドマン法
で得た部分アミノ酸配列情報に基づいて設計した。これ
らのプライマーとピロコッカス・フリオズスの染色体D
NAとを使用して2工程PCR(ネステッドPCR)を
行うと、DNA断片を特異的に増幅できることを見いだ
した。増幅した断片のヌクレオチド配列(図1乃至図
3)を同定し、この断片でコードされる可能性のあるア
ミノ酸配列を推定した。こうして推定したアミノ酸配列
の一つの中に、エドマン法で得た配列1(表1)のアミ
ノ酸配列が見いだされた。このように、増幅したDNA
断片をプローブとして使用することにより、α−アミラ
ーゼ遺伝子をコードするDNA断片がクローニングされ
た。
【0027】 表 2 PCRによるプローブ作製に用いるプライマー配列 プライマー1 : GATAAAATTAATTTTATTTT C G C C C C A A プライマー2 : TGGTATTCATAATCATCAACC C C C C C C G A A G プライマー3 : TTTAAAATAATATTCTTGACTCATATCATT C G G G C C G G G G T C プライマー1及びプライマー2(配列表の配列番号5,
6)は配列1に、プライマー3(配列表の配列番号7)
は配列2に基づいてデザインした。
6)は配列1に、プライマー3(配列表の配列番号7)
は配列2に基づいてデザインした。
【0028】α−アミラーゼ遺伝子をクローニングする
方法は、一般的には、以下のように説明することができ
る。
方法は、一般的には、以下のように説明することができ
る。
【0029】Pst I、Hind III、Xho I、および EcoR
Iを使用してピロコッカス・フリオズスの染色体DNA
を消化することにより、サザン・ハイブリダイセーショ
ンを行い、α−アミラーゼ遺伝子をコードする配列の付
近の染色体DNAの制限酵素地図を作成する。この得ら
れた制限酵素地図(図4参照)に基づいて、α−アミラ
ーゼ遺伝子全体を含む断片を得ることができ、この断片
をプラスミドベクターに挿入することができる。この目
的には、数多くの入手可能なプラスミドベクターの任意
のもの、例えばpUC18,pUC19,pTV118
N、及びpTV119Nを使用することができる。挿入
の方法は当業界で公知である。
Iを使用してピロコッカス・フリオズスの染色体DNA
を消化することにより、サザン・ハイブリダイセーショ
ンを行い、α−アミラーゼ遺伝子をコードする配列の付
近の染色体DNAの制限酵素地図を作成する。この得ら
れた制限酵素地図(図4参照)に基づいて、α−アミラ
ーゼ遺伝子全体を含む断片を得ることができ、この断片
をプラスミドベクターに挿入することができる。この目
的には、数多くの入手可能なプラスミドベクターの任意
のもの、例えばpUC18,pUC19,pTV118
N、及びpTV119Nを使用することができる。挿入
の方法は当業界で公知である。
【0030】宿主としては、例えばエシェリキア・コリ
の野生型の系統、あるいは遺伝的に修飾した系統を使用
することができる。しかし、制限に関して不完全であ
り、修飾に関して正常である系統(r- 、m+ )を使用
するのが好適である。DNAの宿主への導入は、公知の
方法、たとえば、上述のモレキュラー クローニングア
ラボラトリー マニュアル)の250ページに記載さ
れたような方法で行うことができる。プラスミドDNA
を含むエシェリキア・コリの細胞(形質転換体)は、使
用したベクター中に存在するマーカー遺伝子に基づいて
選びだすことができる。たとえば、pTV118Nをベ
クターとして使用した場合には、アンピシリンに対して
耐性のコロニーを選びだすことによって、プラスミドを
含む細胞を得ることができる。
の野生型の系統、あるいは遺伝的に修飾した系統を使用
することができる。しかし、制限に関して不完全であ
り、修飾に関して正常である系統(r- 、m+ )を使用
するのが好適である。DNAの宿主への導入は、公知の
方法、たとえば、上述のモレキュラー クローニングア
ラボラトリー マニュアル)の250ページに記載さ
れたような方法で行うことができる。プラスミドDNA
を含むエシェリキア・コリの細胞(形質転換体)は、使
用したベクター中に存在するマーカー遺伝子に基づいて
選びだすことができる。たとえば、pTV118Nをベ
クターとして使用した場合には、アンピシリンに対して
耐性のコロニーを選びだすことによって、プラスミドを
含む細胞を得ることができる。
【0031】次に、α−アミラーゼ遺伝子を含む形質転
換体を選びだす。この選択は、当業界で周知のように、
使用したベクターの特性に応じて、コロニーハイブリダ
イゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーション
によって行う。
換体を選びだす。この選択は、当業界で周知のように、
使用したベクターの特性に応じて、コロニーハイブリダ
イゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーション
によって行う。
【0032】以上に記載した順にしたがって、α−アミ
ラーゼ遺伝子の全体を含む Pst I断片を有するプラス
ミドを得、このプラスミドを発現ベクターpTV118
NのPst I部位に挿入した。以下では、このプラスミド
をpKENFと称する。
ラーゼ遺伝子の全体を含む Pst I断片を有するプラス
ミドを得、このプラスミドを発現ベクターpTV118
NのPst I部位に挿入した。以下では、このプラスミド
をpKENFと称する。
【0033】宿主としては、本明細書に記載したクロー
ニングの研究の場合と同じく、エシェリキア・コリを使
用した。しかし、宿主としては、原則として、適当なベ
クターで形質転換した任意の中温性( methophilic )
細菌、場合によっては好熱菌を使用することができ、た
とえば、バチルス・スブチリスあるいはバチルス・ブレ
ヴィス( Bacillus brevis )を使用することが可能で
ある。
ニングの研究の場合と同じく、エシェリキア・コリを使
用した。しかし、宿主としては、原則として、適当なベ
クターで形質転換した任意の中温性( methophilic )
細菌、場合によっては好熱菌を使用することができ、た
とえば、バチルス・スブチリスあるいはバチルス・ブレ
ヴィス( Bacillus brevis )を使用することが可能で
ある。
【0034】発現ベクターを構築するにあたっては、α
−アミラーゼ遺伝子を含む断片のヌクレオチド配列(図
1乃至図3)を同定することが必要である。Nco Iの認
識配列は、Nco Iの認識配列中のATG開始コドンが正
しくフレーム中に位置するように、α−アミラーゼ遺伝
子の5’末端付近に導入することができる。この部位特
異的突然変異誘発の過程は、MutanTM - K あるいはMuta
nTM - G を使用した通常の方法で行うことも、PCRを
使用して行うこともできる。本発明においてはMutanTM
- K を使用して、Nco Iの認識配列をpKENFに導入
して、プラスミドpKENF−−2Nを得た。ベクター
配列上と、α−アミラーゼ遺伝子断片の5’末端付近と
の2か所に位置する Nco I認識配列の間の配列を欠失
させると、別の発現プラスミドが得られ、これをプラス
ミドpKENF−Nと命名した。α−アミラーゼ遺伝子
からの発現は、この遺伝子がlacZ遺伝子のプロモー
ターの制御下で転写される場合には、IPTGによって
誘導することができる。
−アミラーゼ遺伝子を含む断片のヌクレオチド配列(図
1乃至図3)を同定することが必要である。Nco Iの認
識配列は、Nco Iの認識配列中のATG開始コドンが正
しくフレーム中に位置するように、α−アミラーゼ遺伝
子の5’末端付近に導入することができる。この部位特
異的突然変異誘発の過程は、MutanTM - K あるいはMuta
nTM - G を使用した通常の方法で行うことも、PCRを
使用して行うこともできる。本発明においてはMutanTM
- K を使用して、Nco Iの認識配列をpKENFに導入
して、プラスミドpKENF−−2Nを得た。ベクター
配列上と、α−アミラーゼ遺伝子断片の5’末端付近と
の2か所に位置する Nco I認識配列の間の配列を欠失
させると、別の発現プラスミドが得られ、これをプラス
ミドpKENF−Nと命名した。α−アミラーゼ遺伝子
からの発現は、この遺伝子がlacZ遺伝子のプロモー
ターの制御下で転写される場合には、IPTGによって
誘導することができる。
【0035】本発明に際しての研究では、pKENF−
Nの、α−アミラーゼ遺伝子の3’部位に位置する非コ
ード領域(二つの Hind III 部位の間)を欠失させ
て、発現レベルがさらに高い、別の発現プラスミドを得
た。以下では、この発現プラスミドをpKENF−NH
と称する。pKENF、pKENF−2N、pKENF
−N、およびpKENF−NHの構造ならびに構築の手
順を、図5に示す。
Nの、α−アミラーゼ遺伝子の3’部位に位置する非コ
ード領域(二つの Hind III 部位の間)を欠失させ
て、発現レベルがさらに高い、別の発現プラスミドを得
た。以下では、この発現プラスミドをpKENF−NH
と称する。pKENF、pKENF−2N、pKENF
−N、およびpKENF−NHの構造ならびに構築の手
順を、図5に示す。
【0036】pKENF−NHを含むエシェリキア・コ
リ細胞を培養し、細胞抽出物を得た。10分間の熱処理
(100℃)の後も、抽出物は、有意なレベルのα−ア
ミラーゼ活性を有していた。発現ベクターであるpTV
118Nを含むエシェリキア・コリ細胞から得た細胞抽
出物では、活性は検出されなかった。
リ細胞を培養し、細胞抽出物を得た。10分間の熱処理
(100℃)の後も、抽出物は、有意なレベルのα−ア
ミラーゼ活性を有していた。発現ベクターであるpTV
118Nを含むエシェリキア・コリ細胞から得た細胞抽
出物では、活性は検出されなかった。
【0037】エシェリキア・コリJM109細胞をpK
ENF−NHで形質転換し、成育の旺盛な形質転換体
を、ブダペスト条約にしたがって、1992年3月7日
に、日本の工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し
た。その際、名称は Escherichiacoli JM109/p
KENF−NHとし、受託番号はFERM BP−37
82であった。
ENF−NHで形質転換し、成育の旺盛な形質転換体
を、ブダペスト条約にしたがって、1992年3月7日
に、日本の工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し
た。その際、名称は Escherichiacoli JM109/p
KENF−NHとし、受託番号はFERM BP−37
82であった。
【0038】Escherichia coli JM109/pKEN
F−NHの培養1mlからは、キャラウェー法(後述)
で測定して300単位の極めて熱安定性のα−アミラー
ゼが得られ、したがって、この酵素の工業規模での製造
が可能となるものである。
F−NHの培養1mlからは、キャラウェー法(後述)
で測定して300単位の極めて熱安定性のα−アミラー
ゼが得られ、したがって、この酵素の工業規模での製造
が可能となるものである。
【0039】
【実施例】本発明の特定の態様を、以下の実施例によっ
てさらに詳しく説明する。なお、本発明は、これらの実
施例によって限定されるものではない。
てさらに詳しく説明する。なお、本発明は、これらの実
施例によって限定されるものではない。
【0040】実施例 1 ピロコッカス・フリオズスDSM3638からの細胞内
α−アミラーゼの精製、ならびに部分アミノ酸配列の決
定。
α−アミラーゼの精製、ならびに部分アミノ酸配列の決
定。
【0041】0.3%のトリプトン、0.7%の酵母抽
出物、および0.1%の可溶性馬鈴薯デンプンを補助的
に加えた人工海水からなる培養液ブルメンタルス( Blu
mentals )、〔アプライド アンド エンバイロンメン
タル マイクロバイオロジー、56(7):1992
(1990)〕を改良した複合培養液で、細菌を成育さ
せた。培養液を調製し、2lの瓶に分注してから、オー
トクレーブにかけた。滅菌の後、上述の補助塩類に加え
て、元素状態の硫黄と亜硫酸ナトリウムとを、それぞれ
156mMおよび2mM加えた。90℃に冷えるまで、
培養液を窒素でパージし、前もって成育させておいた培
養から採取した1容積%の接種材料を加え、そして瓶を
密閉した。培養を98℃の恒温で16時間にわたりイン
キュベートし、その後集めた。各インキュベーションで
使用した成育用培養液の容積は通常20lで、細胞の収
率は0.7〜1.0g/l(湿潤重量)であった。
出物、および0.1%の可溶性馬鈴薯デンプンを補助的
に加えた人工海水からなる培養液ブルメンタルス( Blu
mentals )、〔アプライド アンド エンバイロンメン
タル マイクロバイオロジー、56(7):1992
(1990)〕を改良した複合培養液で、細菌を成育さ
せた。培養液を調製し、2lの瓶に分注してから、オー
トクレーブにかけた。滅菌の後、上述の補助塩類に加え
て、元素状態の硫黄と亜硫酸ナトリウムとを、それぞれ
156mMおよび2mM加えた。90℃に冷えるまで、
培養液を窒素でパージし、前もって成育させておいた培
養から採取した1容積%の接種材料を加え、そして瓶を
密閉した。培養を98℃の恒温で16時間にわたりイン
キュベートし、その後集めた。各インキュベーションで
使用した成育用培養液の容積は通常20lで、細胞の収
率は0.7〜1.0g/l(湿潤重量)であった。
【0042】精製は以下のようにして行った。 (A)粗生成物。細胞を、成育用培養液から、7000
Xgで10分間集めた〔ベックマン( Beckman )社製
JAローターで8000回転/分〕。上清を静かに傾斜
ペレットを集めた。20lの成育用培養液から得た細胞
を、50mMの燐酸ナトリウム(pH5.5)に最終容
積が15mlとなるように再懸濁し、その後、ソニファ
ー( Sonifer)社製、細胞破砕装置を使用して、最大出
力の50%で、間欠的に3分間音波処理することにより
破砕した。95800Xgで1時間超遠心をおこなった
後(ベックマン社製Ti45ローターで35000回転
/分)、溶解物の細胞質ゾル分画を集めた。その後の精
製過程はいずれも室温でおこなった。タンパク質溶液は
4℃で貯蔵した。
Xgで10分間集めた〔ベックマン( Beckman )社製
JAローターで8000回転/分〕。上清を静かに傾斜
ペレットを集めた。20lの成育用培養液から得た細胞
を、50mMの燐酸ナトリウム(pH5.5)に最終容
積が15mlとなるように再懸濁し、その後、ソニファ
ー( Sonifer)社製、細胞破砕装置を使用して、最大出
力の50%で、間欠的に3分間音波処理することにより
破砕した。95800Xgで1時間超遠心をおこなった
後(ベックマン社製Ti45ローターで35000回転
/分)、溶解物の細胞質ゾル分画を集めた。その後の精
製過程はいずれも室温でおこなった。タンパク質溶液は
4℃で貯蔵した。
【0043】(B)イオン交換(1)。細胞質ゾル分画
を、前もって50mMの燐酸ナトリウム(pH5.5)
(緩衝液A)で平衡化しておいたQ−セファロースカラ
ム(直径1.5cm、ベッド高さ45.5cm)に加え
た。こうした条件下で、このカラムに結合したアミラー
ゼ活性部分を、50mMの燐酸ナトリウム(pH5.
5)と1MのNaCl(緩衝液B)で、200分の線型
勾配(100%Aから100%Bへ)を使用することに
より溶出させた。分画を集め、アミラーゼ活性を含む試
験管を活性によって同定し、分取した。
を、前もって50mMの燐酸ナトリウム(pH5.5)
(緩衝液A)で平衡化しておいたQ−セファロースカラ
ム(直径1.5cm、ベッド高さ45.5cm)に加え
た。こうした条件下で、このカラムに結合したアミラー
ゼ活性部分を、50mMの燐酸ナトリウム(pH5.
5)と1MのNaCl(緩衝液B)で、200分の線型
勾配(100%Aから100%Bへ)を使用することに
より溶出させた。分画を集め、アミラーゼ活性を含む試
験管を活性によって同定し、分取した。
【0044】(C)イオン交換(2)。分取したサンプ
ルを、等容積の緩衝液Aで希釈し、85%の緩衝液Aお
よび15%の緩衝液Bで再度平衡化しておいたカラムに
再度加えた。このサンプルを、上述の緩衝液で、195
分の線型勾配(85%Aおよび15%Bから40%Aお
よび60%Bへ)を使用することにより溶出させた。再
度、分画を活性を基準として分取し、50mMの炭酸ナ
トリウム(pH10.3)(緩衝液A’)に対して一晩
透析した。
ルを、等容積の緩衝液Aで希釈し、85%の緩衝液Aお
よび15%の緩衝液Bで再度平衡化しておいたカラムに
再度加えた。このサンプルを、上述の緩衝液で、195
分の線型勾配(85%Aおよび15%Bから40%Aお
よび60%Bへ)を使用することにより溶出させた。再
度、分画を活性を基準として分取し、50mMの炭酸ナ
トリウム(pH10.3)(緩衝液A’)に対して一晩
透析した。
【0045】(D)イオン交換(3)。透析したサンプ
ルを、前もって緩衝液A’で平衡化しておいたQ−セフ
ァロースカラム(直径1.5cm、ベッド高さ46.5
cm)に加え、50mMの燐酸ナトリウム(pH5.
5)と1MのNaCl(緩衝液B’)で、200分の線
型勾配(100%A’から100%B’へ)を使用する
ことにより溶出させた。α−アミラーゼ活性を含む分画
を集め、分取した。次にこの活性画分を、セントリコン
( Centricon )社製30微量濃縮装置で、20分の間
隔をおいて3020Xgで〔ソーヴァル( Sorvall )
社製SS34ローターで5000回転/分〕、全容積が
2ml未満となるまで濃縮した。
ルを、前もって緩衝液A’で平衡化しておいたQ−セフ
ァロースカラム(直径1.5cm、ベッド高さ46.5
cm)に加え、50mMの燐酸ナトリウム(pH5.
5)と1MのNaCl(緩衝液B’)で、200分の線
型勾配(100%A’から100%B’へ)を使用する
ことにより溶出させた。α−アミラーゼ活性を含む分画
を集め、分取した。次にこの活性画分を、セントリコン
( Centricon )社製30微量濃縮装置で、20分の間
隔をおいて3020Xgで〔ソーヴァル( Sorvall )
社製SS34ローターで5000回転/分〕、全容積が
2ml未満となるまで濃縮した。
【0046】(E)電気溶出。バイオ−ラッド( Bio -
Rad )社製モデル491プレップ・セル( Prep Cel
l )を使用して、未変性PAGEから電気溶出させるこ
とにより、精製を完了させた。装置の組み立ては、高さ
6cmの8%アクリルアミドゲルが、高さ1cmの上述
のようにして調製した4%の濃縮用ゲルとともに入った
内径28mmのゲルチューブを使用することにより行っ
た。冷却用緩衝液の流れは100ml/分に保持し、連
続的な溶出流は1ml/分とした。サンプルは、2x未
変性サンプル緩衝液の量を調製し、2.5ml以下の容
積を加えた。電気泳動を40mVの定常電流で行い、分
画を2.5分の間隔をおいて集めた。タンパク質の溶出
をイスコ( Isco )社製流動吸光度検出装置で280n
mにて監視して、集めた特定の分画と、タンパク質のバ
ンドのゲルからの溶出とを相関させることができるよう
にした。α−アミラーゼを含有する分画を活性によって
検出し、銀染色未変性PAGEを使用することにより、
純度についてスクリーニングした。銀染色の解像レベル
で純粋であることが示された活性分画を、最終生成物と
してプールした。部分アミノ酸配列を得るために、スト
ーン( Stone )ら〔プラクティカルガイド トウ プ
ロテイン アンド ペプチド ピューリフィケーション
フォー マイクロシークエンシング( Practical Gu
ide to Protein and Peptide Purification for
Microsequencing )、マツダイラ( P. T. Matsuda
ira )編、アカデミック・プレス( Academic Press
)、ニューヨーク、第33〜47頁(1989)〕の
方法を改変した方法を用いて、精製した酵素を、トリプ
シンで還元およびピリジルエチル化してから、臭化シア
ンで消化した。次に、得られた断片の分離を、ダイオネ
ックス( Dionex )社製Al−450バイオ(Bio)
LC装置を使用して、アクアポア( Aquapore )社製R
P−300逆相小孔径カラム(0.2cm×25cm)
上で、0.1%(v/v)のトリフルオロ酢酸(TF
A)を含有する100%の水から、0.1%(v/v)
のTFAを含有する70%アセトニトリルへの勾配から
勾配溶離させることによって行った。
Rad )社製モデル491プレップ・セル( Prep Cel
l )を使用して、未変性PAGEから電気溶出させるこ
とにより、精製を完了させた。装置の組み立ては、高さ
6cmの8%アクリルアミドゲルが、高さ1cmの上述
のようにして調製した4%の濃縮用ゲルとともに入った
内径28mmのゲルチューブを使用することにより行っ
た。冷却用緩衝液の流れは100ml/分に保持し、連
続的な溶出流は1ml/分とした。サンプルは、2x未
変性サンプル緩衝液の量を調製し、2.5ml以下の容
積を加えた。電気泳動を40mVの定常電流で行い、分
画を2.5分の間隔をおいて集めた。タンパク質の溶出
をイスコ( Isco )社製流動吸光度検出装置で280n
mにて監視して、集めた特定の分画と、タンパク質のバ
ンドのゲルからの溶出とを相関させることができるよう
にした。α−アミラーゼを含有する分画を活性によって
検出し、銀染色未変性PAGEを使用することにより、
純度についてスクリーニングした。銀染色の解像レベル
で純粋であることが示された活性分画を、最終生成物と
してプールした。部分アミノ酸配列を得るために、スト
ーン( Stone )ら〔プラクティカルガイド トウ プ
ロテイン アンド ペプチド ピューリフィケーション
フォー マイクロシークエンシング( Practical Gu
ide to Protein and Peptide Purification for
Microsequencing )、マツダイラ( P. T. Matsuda
ira )編、アカデミック・プレス( Academic Press
)、ニューヨーク、第33〜47頁(1989)〕の
方法を改変した方法を用いて、精製した酵素を、トリプ
シンで還元およびピリジルエチル化してから、臭化シア
ンで消化した。次に、得られた断片の分離を、ダイオネ
ックス( Dionex )社製Al−450バイオ(Bio)
LC装置を使用して、アクアポア( Aquapore )社製R
P−300逆相小孔径カラム(0.2cm×25cm)
上で、0.1%(v/v)のトリフルオロ酢酸(TF
A)を含有する100%の水から、0.1%(v/v)
のTFAを含有する70%アセトニトリルへの勾配から
勾配溶離させることによって行った。
【0047】ポートン・インストルメンツ( Porton I
nstruments )社製モデル2020オフラインシーケン
サーで、標準プログラム番号1を使用することにより、
アミノ配列を分析した。PTHアミノ酸分析を、ベック
マン・システム( BeckmanSystem )社製のゴールド
( Gold )システムで、改良酢酸ナトリウム勾配プログ
ラムを用い、ヒューレット・パッカード( Hewlett Pa
ckard )社製の小孔径C18カラムを使用することによ
って行った。
nstruments )社製モデル2020オフラインシーケン
サーで、標準プログラム番号1を使用することにより、
アミノ配列を分析した。PTHアミノ酸分析を、ベック
マン・システム( BeckmanSystem )社製のゴールド
( Gold )システムで、改良酢酸ナトリウム勾配プログ
ラムを用い、ヒューレット・パッカード( Hewlett Pa
ckard )社製の小孔径C18カラムを使用することによ
って行った。
【0048】実施例 2 ピロコッカス・フリオズスからの染色体DNAの作製。
ピロコッカス・フリオズスを、実施例1に記載した培養
液2l中で成育させた。細胞を集め、25%スクロース
および0.05Mのトリス−HCl(pH8.0)を含
む4mlの混合物に懸濁させた。次に、この懸濁液に、
800μlのリゾチーム(5mg/ml)を加えた。こ
の混合物を20℃で1時間インキュベートした後、混合
物に24mlのSET溶液〔150mMのNaCl、1
mMのEDTA、および20mMのトリス−HCl(p
H8.0)〕を加えた。4mlの5%SDSおよび40
0μlのプロテイナーゼK(10mg/ml)を加え、
混合物を37℃で1時間インキュベートし、フェノール
−クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させ
た。滅菌つま楊枝に巻きとることにより、DNAを回収
した。これらの工程によって、3.2mgのゲノムDN
Aが得られた。
ピロコッカス・フリオズスを、実施例1に記載した培養
液2l中で成育させた。細胞を集め、25%スクロース
および0.05Mのトリス−HCl(pH8.0)を含
む4mlの混合物に懸濁させた。次に、この懸濁液に、
800μlのリゾチーム(5mg/ml)を加えた。こ
の混合物を20℃で1時間インキュベートした後、混合
物に24mlのSET溶液〔150mMのNaCl、1
mMのEDTA、および20mMのトリス−HCl(p
H8.0)〕を加えた。4mlの5%SDSおよび40
0μlのプロテイナーゼK(10mg/ml)を加え、
混合物を37℃で1時間インキュベートし、フェノール
−クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させ
た。滅菌つま楊枝に巻きとることにより、DNAを回収
した。これらの工程によって、3.2mgのゲノムDN
Aが得られた。
【0049】実施例 3 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNAプローブ
の作製。100pモルのプライマー1および100pモ
ルのプライマー3(表2を参照のこと)とともに、50
0ngのピロコッカス・フリオズスの染色体DNAを鋳
型として使用した。PCRのプロファイルは、94℃で
0.5分、40℃で2分、そして72℃で2分とした。
PCRは35サイクルにわたって、総容積で100μl
行った。反応混合物の1μlを、プライマー2(表2を
参照のこと)およびプライマー3で再度増幅した。PC
Rのプロファイルは上記の場合と同一としたが、サイク
ル数は30とした。5μlのこの混合物をアガロースゲ
ル電気泳動で分析した。長さ約1kbpのDNA断片を
特異的に増幅させた。増幅したDNA断片の末端を平滑
とし、pUC18の Hinc II 部位にサブクローニング
した。クローニングしたプラスミドの配列を、ジデオキ
シ法によって決定した。
の作製。100pモルのプライマー1および100pモ
ルのプライマー3(表2を参照のこと)とともに、50
0ngのピロコッカス・フリオズスの染色体DNAを鋳
型として使用した。PCRのプロファイルは、94℃で
0.5分、40℃で2分、そして72℃で2分とした。
PCRは35サイクルにわたって、総容積で100μl
行った。反応混合物の1μlを、プライマー2(表2を
参照のこと)およびプライマー3で再度増幅した。PC
Rのプロファイルは上記の場合と同一としたが、サイク
ル数は30とした。5μlのこの混合物をアガロースゲ
ル電気泳動で分析した。長さ約1kbpのDNA断片を
特異的に増幅させた。増幅したDNA断片の末端を平滑
とし、pUC18の Hinc II 部位にサブクローニング
した。クローニングしたプラスミドの配列を、ジデオキ
シ法によって決定した。
【0050】実施例 4 染色体DNAのサザンハイブリダイゼーションによる分
析。ピロコッカス・フリオズスの染色体DNA5μg
を、Pst I、Hind III 、あるいは EcoR Iで消化し、
アガロースゲルを通して電気泳動させた。DNAをナイ
ロン膜に移し、実施例3で得たDNAプローブとハイブ
リダイズさせた。このプローブを、ランダムプライマー
法で放射線標識した。2xSSC、0.1%SDS、5
xデンハート溶液、100μg/mlの子牛胸腺DN
A、および1×107 cpm/mlの32Pで標識したプ
ローブの入ったハイブリダイゼーション用バッグの中
で、ハイブリダイゼーションを65℃にて2時間にわた
って行った。膜を、65℃の2xSSCおよび0.1%
SDSの溶液で40分、そして65℃の0.5xSSC
および0.1%SDSの溶液で20分洗浄した。この膜
に対してX線フィルムを一晩感光させ、オートラジオグ
ラフィー像を得た。長さ5.3kbの Pst I断片、長
さ3.1kbの Hind III 断片、長さ5.3kbの X
ho I断片、ならびに長さ0.7kbおよび2.4kb
の EcoR I断片が陽性であることを見いだした。
析。ピロコッカス・フリオズスの染色体DNA5μg
を、Pst I、Hind III 、あるいは EcoR Iで消化し、
アガロースゲルを通して電気泳動させた。DNAをナイ
ロン膜に移し、実施例3で得たDNAプローブとハイブ
リダイズさせた。このプローブを、ランダムプライマー
法で放射線標識した。2xSSC、0.1%SDS、5
xデンハート溶液、100μg/mlの子牛胸腺DN
A、および1×107 cpm/mlの32Pで標識したプ
ローブの入ったハイブリダイゼーション用バッグの中
で、ハイブリダイゼーションを65℃にて2時間にわた
って行った。膜を、65℃の2xSSCおよび0.1%
SDSの溶液で40分、そして65℃の0.5xSSC
および0.1%SDSの溶液で20分洗浄した。この膜
に対してX線フィルムを一晩感光させ、オートラジオグ
ラフィー像を得た。長さ5.3kbの Pst I断片、長
さ3.1kbの Hind III 断片、長さ5.3kbの X
ho I断片、ならびに長さ0.7kbおよび2.4kb
の EcoR I断片が陽性であることを見いだした。
【0051】実施例 5 α−アミラーゼ遺伝子を含むDNA断片のクローニン
グ。実施例4で得た5.3kbの Pst I断片をクロー
ニングするために、50μgのピロコッカス・フリオズ
スの染色体DNAを Pst Iで消化した。消化物をアガ
ロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから長さが約5.3
kbのDNA断片を精製した。プラスミドpTV118
Nを Pst Iで消化し、脱ホスホリル化し、上記の長さ
が約5.3kbのDNA断片を、T4DNAリガーゼで
プラスミドDNAにライゲーションした。このライゲー
ション混合物を使用して、エシェリキア・コリJM10
9細胞を形質転換した。目的とする配列を含む組換えプ
ラスミドを、コロニーハイブリダイゼーションによって
スクリーニングした。略述すると、349個のコロニー
をナイロン膜に移し、このコロニーを0.5NのNaO
Hおよび1.5MのNaClで溶解させ、膜を、1.5
MのNaClを含有する1Mのトリス−HCl(pH
7.0)で中和した。次に、紫外線を照射することによ
って、DNAを膜に固定した。DNAプローブの調製と
ハイブリダイゼーションの条件は、実施例4に記載した
のと同一とした。三つの陽性クローンの一つから得たプ
ラスミドを、pKENFと称することとした。
グ。実施例4で得た5.3kbの Pst I断片をクロー
ニングするために、50μgのピロコッカス・フリオズ
スの染色体DNAを Pst Iで消化した。消化物をアガ
ロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから長さが約5.3
kbのDNA断片を精製した。プラスミドpTV118
Nを Pst Iで消化し、脱ホスホリル化し、上記の長さ
が約5.3kbのDNA断片を、T4DNAリガーゼで
プラスミドDNAにライゲーションした。このライゲー
ション混合物を使用して、エシェリキア・コリJM10
9細胞を形質転換した。目的とする配列を含む組換えプ
ラスミドを、コロニーハイブリダイゼーションによって
スクリーニングした。略述すると、349個のコロニー
をナイロン膜に移し、このコロニーを0.5NのNaO
Hおよび1.5MのNaClで溶解させ、膜を、1.5
MのNaClを含有する1Mのトリス−HCl(pH
7.0)で中和した。次に、紫外線を照射することによ
って、DNAを膜に固定した。DNAプローブの調製と
ハイブリダイゼーションの条件は、実施例4に記載した
のと同一とした。三つの陽性クローンの一つから得たプ
ラスミドを、pKENFと称することとした。
【0052】実施例 6 α−アミラーゼを発現するpKENF−NHの構築。図
5は、プラスミドpKENF−NHを構築する過程を示
すものである。まず、実施例5で得たプラスミドpKE
NFのα−アミラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンの付近
に、MutanTM - K を使用してNco I部位を創出した。こ
のプラスミド(pKENF−2N)を Nco Iで消化
し、自己ライゲーションさせて、余分な5’−非コード
領域を取り除いた。得られたプラスミド(pKENF−
N)を Hind III で消化し、自己ライゲーションさせ
て、3’−非コード領域を欠失させた。この組換えプラ
スミドを、pKENF−NHと称することとした。
5は、プラスミドpKENF−NHを構築する過程を示
すものである。まず、実施例5で得たプラスミドpKE
NFのα−アミラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンの付近
に、MutanTM - K を使用してNco I部位を創出した。こ
のプラスミド(pKENF−2N)を Nco Iで消化
し、自己ライゲーションさせて、余分な5’−非コード
領域を取り除いた。得られたプラスミド(pKENF−
N)を Hind III で消化し、自己ライゲーションさせ
て、3’−非コード領域を欠失させた。この組換えプラ
スミドを、pKENF−NHと称することとした。
【0053】このプラスミドを含むエシェリキア・コリ
JM109細胞を、 Escherichiacoli JM109/p
KENF−NHと称することとし、日本の工業技術院微
生物工業技術研究所に、FERM BP−3782とし
て寄託した。
JM109細胞を、 Escherichiacoli JM109/p
KENF−NHと称することとし、日本の工業技術院微
生物工業技術研究所に、FERM BP−3782とし
て寄託した。
【0054】実施例 7 粗細胞抽出物の生成ならびにα−アミラーゼ活性の検
定。実施例6で得た E. coli JM109/pKENF
−NH細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含有
するLブロス5ml中で、37℃にて15時間成育させ
た。次に、1mlの培養から細胞を集め、200μlの
溶解用溶液(50mMのトリス−HCl(pH7.
6)、2mMのメルカプトエタノール、10%のグリセ
ロール、4mMのp−アミジノフェニル−メタンスルホ
ン酸フッ化物、および0.1mg/mlのリゾチーム)
に懸濁させ、37℃で60分間インキュベートした。次
に、混合物を音波処理し、遠心分離した。上清を99℃
で10分間インキュベートし、再度遠心分離した。この
上清を、粗細胞抽出物として使用した。
定。実施例6で得た E. coli JM109/pKENF
−NH細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含有
するLブロス5ml中で、37℃にて15時間成育させ
た。次に、1mlの培養から細胞を集め、200μlの
溶解用溶液(50mMのトリス−HCl(pH7.
6)、2mMのメルカプトエタノール、10%のグリセ
ロール、4mMのp−アミジノフェニル−メタンスルホ
ン酸フッ化物、および0.1mg/mlのリゾチーム)
に懸濁させ、37℃で60分間インキュベートした。次
に、混合物を音波処理し、遠心分離した。上清を99℃
で10分間インキュベートし、再度遠心分離した。この
上清を、粗細胞抽出物として使用した。
【0055】キャラウェー〔 W. T. Caraway 、アメ
リカン ジャーナル オブ クリニカル パソロジー
( American Journal of Clinical pathology )、
32:97〜99、1959〕の方法にしたがって、ア
ミラーゼ検定用キット(アミラーゼ・テスト・ワコー
( Amylase Test Wako )、和光純薬社製、日本)を
使用して、α−アミラーゼ活性を測定した。略述する
と、上述のようにして得た20μlの粗細胞抽出物を、
可溶性デンプンを含む緩衝液1mlを前もって90℃で
5分間あたためておいたものに加えた。90℃でインキ
ュベートした後、反応混合物を、1mlの色素原反応物
質および5mlの蒸留水と混合した。660nmでの吸
光度を測定し、下記の式でα−アミラーゼ活性(キャラ
ウェー単位)を計算した。 活性(キャラウェー単位)=(EB1−ES )/EB1×8
00 ここで、ES は、サンプル溶液を使用した場合の測定
値、そしてEB1は、サンプル溶液のかわりに蒸留水を使
用した場合(酵素についてのブランク)の測定値であ
る。1mlの培養液から300単位のα−アミラーゼが
得られた。ここで得られたα−アミラーゼの至適pH
は、pH6〜pH8の付近であった。
リカン ジャーナル オブ クリニカル パソロジー
( American Journal of Clinical pathology )、
32:97〜99、1959〕の方法にしたがって、ア
ミラーゼ検定用キット(アミラーゼ・テスト・ワコー
( Amylase Test Wako )、和光純薬社製、日本)を
使用して、α−アミラーゼ活性を測定した。略述する
と、上述のようにして得た20μlの粗細胞抽出物を、
可溶性デンプンを含む緩衝液1mlを前もって90℃で
5分間あたためておいたものに加えた。90℃でインキ
ュベートした後、反応混合物を、1mlの色素原反応物
質および5mlの蒸留水と混合した。660nmでの吸
光度を測定し、下記の式でα−アミラーゼ活性(キャラ
ウェー単位)を計算した。 活性(キャラウェー単位)=(EB1−ES )/EB1×8
00 ここで、ES は、サンプル溶液を使用した場合の測定
値、そしてEB1は、サンプル溶液のかわりに蒸留水を使
用した場合(酵素についてのブランク)の測定値であ
る。1mlの培養液から300単位のα−アミラーゼが
得られた。ここで得られたα−アミラーゼの至適pH
は、pH6〜pH8の付近であった。
【0056】以上で引用した参考文献の内容は、本発明
にすべて参考文献として包含させるものである。
にすべて参考文献として包含させるものである。
【0057】当業者であれば、本発明の開示内容を読む
ことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、
形態や詳細に種々の変更を加えうることがわかるはずで
ある。その意味で、当業者であれば、ピロコッカス・フ
リオズスから誘導した遺伝子配列を、ピロコッカス・フ
リオズス内に存在するプロモーターとは異なったプロモ
ーターの制御のもとにおくという発想が、α−アミラー
ゼ以外のピロコッカス・フリオズスのタンパク質をコー
ドする配列、たとえば、プルラナーゼ、α−グルコシダ
ーゼ、β−グルコシダーゼ、およびプロテアーゼをコー
ドする配列にも適用できることを理解できるはずであ
る。その際、ピロコッカス・フリオズスのタンパク質の
発現を、エシェリキアおよびバチルスといった種々の種
で行うことも可能であると推定される。
ことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、
形態や詳細に種々の変更を加えうることがわかるはずで
ある。その意味で、当業者であれば、ピロコッカス・フ
リオズスから誘導した遺伝子配列を、ピロコッカス・フ
リオズス内に存在するプロモーターとは異なったプロモ
ーターの制御のもとにおくという発想が、α−アミラー
ゼ以外のピロコッカス・フリオズスのタンパク質をコー
ドする配列、たとえば、プルラナーゼ、α−グルコシダ
ーゼ、β−グルコシダーゼ、およびプロテアーゼをコー
ドする配列にも適用できることを理解できるはずであ
る。その際、ピロコッカス・フリオズスのタンパク質の
発現を、エシェリキアおよびバチルスといった種々の種
で行うことも可能であると推定される。
配列番号:1 配列の長さ:3139 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 配列: CTGCAGGGGA GTTTGCAAAG CTAATAACTT CAGTAGCTGG TGGAGGAGGC GGAGGAAGAA 60 AAGAACTAGC TCAAGGTAAG ATAAGAGACA TAGAAAAAGC AAAAGAGGCA ATAGAAAAAG 120 TTAAGGGCTC TCTATAGCTT TCTACTCTCC TTCTTTTGGA ATCAGAAATA TTTCATATTC 180 TGATCTCCAG AATGGGAGCT TGTTCATCTT TATTTTTATA TAATACTCGG TGCTTTTCTC 240 TCTGTATATT TTCTCCACTA CTTCCTGGGG CAGTTGGAAC TGAACTATAA TTTCAGCATC 300 CTCTGATAAC TTTGTTTCAA ATTTTGAAGT ACCCTTGTAA TCCTTTCCAT TTACCTTTAT 360 GAGATAATTT GTGCCCTCTG GAAATTCTAT TTCGAAGTTG AAATCTGAGA CAATTTTTTC 420 CACTTTTAGC GTAAATAACC CCCAACCGTC TTTTTCAACT ATTGTAACTG TCCTGTTTTC 480 CTTATAGAAT ATCTCACTTG ATTCTTTTTC ATTAATGGTT GCAGGAGGCA TTTTTGCCGT 540 TCTCATGGCA AGCACTAGAA GGACTATAAA AATTATTGCT ACAGCTGTTA TTTTCTTGTC 600 CATGCTAACA CCCTGTAATG AGATTTGGAT TTTCCTATAT AAAAAGCCTT AGTTATTTTT 660 GAGCCATTAA ATATATAAGG AAGTATCACT CTTAGTGATT AATGGGTGGA CGGAAGTGGG 720 AGATAAAATT AACTTCATAT TTGGAATTCA CAACCATCAG CCCCTGGGCA ACTTTGGATG 780 GGTGTTTGAG GAGGCTTATG AAAAGTGTTA CTGGCCGTTT CTGGAGACTC TGGAGGAATA 840 TCCAAACATG AAGGTTGCCA TTCATACAAG TGGCCCCCTC ATTGAGTGGC TCCAAGATAA 900 TAGACCCGAA TACATAGACT TGCTTAGAAG TCTAGTGAAA AGAGGACAGG TGGAGATAGT 960 CGTTGCTGGG TTCTACGAGC CTGTGCTAGC ATCAATCCCA AAGGAAGATA GAATAGAGCA 1020 GATAAGGTTA ATGAAAGAGT GGGCTAAGAG TATTGGATTT GATGCTAGGG GAGTTTGGCT 1080 AACTGAAAGA GTATGGCAAC CAGAGCTCGT AAAGACCCTT AAGGAGAGCG GAATAGATTA 1140 TGTAATAGTT GACGATTACC ACTTCATGAG TGCGGGATTA AGTAAAGAGG AGCTGTACTG 1200 GCCATATTAT ACGGAAGATG GTGGGGAAGT TATAGCTGTT TTCCCGATAG ATGAGAAGTT 1260 GAGATATTTG ATTCCCTTTA GACCCGTTGA TAAGGTCTTA GAATACCTGC ATTCTCTCAT 1320 AGATGGTGAT GAGAGCAAAG TTGCAGTATT TCATGACGAT GGTGAGAAGT TTGGAATCTG 1380 GCCTGGAACT TATGAGTGGG TGTATGAAAA GGGATGGTTA AGAGAATTCT TTGATAGAAT 1440 TTCAAGTGAT GAAAAGATAA ACTTAATGCT TTACACTGAA TACTTAGAAA AATATAAGCC 1500 TAGAGGTCTT GTTTATCTTC CAATAGCTTC ATATTTTGAG ATGAGCGAAT GGTCATTGCC 1560 AGCAAAGCAG GCAAGGCTCT TTGTGGAGTT CGTCAATGAG CTTAAAGTTA AAGGTATATT 1620 TGAAAAGTAC AGGGTATTTG TTAGGGGAGG AATTTGGAAG AATTTCTTCT ATAAATACCC 1680 AGAGAGCAAC TACATGCACA AGAGAATGCT AATGGTAAGT AAGTTAGTGA GAAACAATCC 1740 TGAGGCCAGG AAGTATCTGC TGAGAGCACA ATGTAACGAT GCTTATTGGC ACGGCCTCTT 1800 CGGTGGAGTA TATTTACCCC ATCTTAGGAG GGCCATCTGG AACAATTTAA TCAAGGCCAA 1860 CAGCTATGTA AGCCTTGGAA AGGTCATAAG GGATATCGAC TACGATGGCT TTGAGGAAGT 1920 TCTCATAGAG AATGACAACT TTTATGCAGT GTTTAAACCC TCTTACGGTG GTTCCTTGGT 1980 GGAGTTTTCA TCAAAGAATA GACTCGTGAA TTATGTAGAT GTTCTGGCAA GAAGGTGGGA 2040 ACACTATCAT GGCTATGTGG AAAGTCAATT TGATGGAGTA GCCAGCATTC ATGAGCTCGA 2100 GAAAAAGATA CCAGATGAAA TAAGAAAAGA AGTTGCTTAC GACAAGTACA GAAGGTTCAT 2160 GCTTCAAGAT CACGTAGTCC CCCTGGGAAC AACTCTGGAA GACTTCATGT TCTCAAGACA 2220 ACAGGAGATC GGAGAGTTTC CTAGGGTTCC ATACTCATAT GAACTACTAG ATGGAGGAAT 2280 AAGGCTGAAG AGGGAACACT TGGGAATAGA AGTTGAAAAA ACAGTGAAGT TAGTGAATGA 2340 TGGATTTGAG GTGGAGTATA TAGTGAACAA CAAGACAGGA AATCCTGTAT TGTTCGCAGT 2400 GGAACTTAAC GTTGCAGTTC AGAGCATAAT GGAGAGCCCA GGAGTTCTAA GGGGGAAAGA 2460 AATTGTCGTT GATGACAAGT ATGCAGTTGG GAAGTTTGCA CTGAAGTTTG AAGACGAAAT 2520 GGAAGTCTGG AAGTATCCAG TAAAGACTCT CAGTCAAAGT GAAAGTGGCT GGGATCTAAT 2580 CCAGCAGGGT GTCAGCTACA TAGTTCCAAT AAGGTTGGAG GATAAAATAA GGTTTAAGCT 2640 AAAATTTGAG GAAGCCTCGG GATAGGGAGG CCCTCATCAC CAATCAGGGC CCGAAAGACT 2700 CCCTCATCGG CCCTTCTATT TTATTTTAAA CGTCAATGGT TTACCAAGTT TCCAAAACTT 2760 ACAAAATGAA CAAATCTCTC CACTTGCGGG CATTCCACAT ATCTTGCACT CTTTGAGGTC 2820 TTTCCCCTTC ACTTCTGGCT CGAAAAGTTT TTTCTTTCTT AGGAATCCTC TCACGAAGTT 2880 GAACTTTGTT CCAGGCCTTT TTTCCTCCAA TTCATTGAGA ACTTCCTTCA TGTCAAGAGT 2940 TGTCGCACCT CTTGCATAAG GACACTCCTC TACTATGTAC TCCAATCCAA CGGCAATGGC 3000 ATAGGCAACA ACTTCCCTCT CAGTTAATTC GTAGAGAGGT TTGATCTTCT TTACGAACTT 3060 TCCTTCCCCT GGGAGCAGAG GACCTCCCTT AGCCAGGTAC TCTGTATTCC AGTGGAGTAA 3120 GTTGTTCATG AGAAAGCTT 3139 配列番号:2 配列の長さ:649 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:蛋白質 配列: Met Gly Asp Lys Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln 1 5 10 15 Pro Leu Gly Asn Phe Gly Trp Val Phe Glu Glu Ala Tyr Glu Lys 20 25 30 Cys Tyr Trp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Glu Glu Tyr Pro Asn Met 35 40 45 Lys Val Ala Ile His Thr Ser Gly Pro Leu Ile Glu Trp Leu Gln 50 55 60 Asp Asn Arg Pro Glu Tyr Ile Asp Leu Leu Arg Ser Leu Val Lys 65 70 75 Arg Gly Gln Val Glu Ile Val Val Ala Gly Phe Tyr Glu Pro Val 80 85 90 Leu Ala Ser Ile Pro Lys Glu Asp Arg Ile Glu Gln Ile Arg Leu 95 100 105 Met Lys Glu Trp Ala Lys Ser Ile Gly Phe Asp Ala Arg Gly Val 110 115 120 Trp Leu Thr Glu Arg Val Trp Gln Pro Glu Leu Val Lys Thr Leu 125 130 135 Lys Glu Ser Gly Ile Asp Tyr Val Ile Val Asp Asp Tyr His Phe 140 145 150 Met Ser Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Tyr Trp Pro Tyr Tyr 155 160 165 Thr Glu Asp Gly Gly Glu Val Ile Ala Val Phe Pro Ile Asp Glu 170 175 180 Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Pro Phe Arg Pro Val Asp Lys Val Leu 185 190 195 Glu Tyr Leu His Ser Leu Ile Asp Gly Asp Glu Ser Lys Val Ala 200 205 210 Val Phe His Asp Asp Gly Glu Lys Phe Gly Ile Trp Pro Gly Thr 215 220 225 Tyr Glu Trp Val Tyr Glu Lys Gly Trp Leu Arg Glu Phe Phe Asp 230 235 240 Arg Ile Ser Ser Asp Glu Lys Ile Asn Leu Met Leu Tyr Thr Glu 245 250 255 Tyr Leu Glu Lys Tyr Lys Pro Arg Gly Leu Val Tyr Leu Pro Ile 260 265 270 Ala Ser Tyr Phe Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Pro Ala Lys Gln 275 280 285 Ala Arg Leu Phe Val Glu Phe Val Asn Glu Leu Lys Val Lys Gly 290 295 300 Ile Phe Glu Lys Tyr Arg Val Phe Val Arg Gly Gly Ile Trp Lys 305 310 315 Asn Phe Phe Tyr Lys Tyr Pro Glu Ser Asn Tyr Met His Lys Arg 320 325 330 Met Leu Met Val Ser Lys Leu Val Arg Asn Asn Pro Glu Ala Arg 335 340 345 Lys Tyr Leu Leu Arg Ala Gln Cys Asn Asp Ala Tyr Trp His Gly 350 355 360 Leu Phe Gly Gly Val Tyr Leu Pro His Leu Arg Arg Ala Ile Trp 365 370 375 Asn Asn Leu Ile Lys Ala Asn Ser Tyr Val Ser Leu Gly Lys Val 380 385 390 Ile Arg Asp Ile Asp Tyr Asp Gly Phe Glu Glu Val Leu Ile Glu 395 400 405 Asn Asp Asn Phe Tyr Ala Val Phe Lys Pro Ser Tyr Gly Gly Ser 410 415 420 Leu Val Glu Phe Ser Ser Lys Asn Arg Leu Val Asn Tyr Val Asp 425 430 435 Val Leu Ala Arg Arg Trp Glu His Tyr His Gly Tyr Val Glu Ser 440 445 450 Gln Phe Asp Gly Val Ala Ser Ile His Glu Leu Glu Lys Lys Ile 455 460 465 Pro Asp Glu Ile Arg Lys Glu Val Ala Tyr Asp Lys Tyr Arg Arg 470 475 480 Phe Met Leu Gln Asp His Val Val Pro Leu Gly Thr Thr Leu Glu 485 490 495 Asp Phe Met Phe Ser Arg Gln Gln Glu Ile Gly Glu Phe Pro Arg 500 505 510 Val Pro Tyr Ser Tyr Glu Leu Leu Asp Gly Gly Ile Arg Leu Lys 515 520 525 Arg Glu His Leu Gly Ile Glu Val Glu Lys Thr Val Lys Leu Val 530 535 540 Asn Asp Gly Phe Glu Val Glu Tyr Ile Val Asn Asn Lys Thr Gly 545 550 555 Asn Pro Val Leu Phe Ala Val Glu Leu Asn Val Ala Val Gln Ser 560 565 570 Ile Met Glu Ser Pro Gly Val Leu Arg Gly Lys Glu Ile Val Val 575 580 585 Asp Asp Lys Tyr Ala Val Gly Lys Phe Ala Leu Lys Phe Glu Asp 590 595 600 Glu Met Glu Val Trp Lys Tyr Pro Val Lys Thr Leu Ser Gln Ser 605 610 615 Glu Ser Gly Trp Asp Leu Ile Gln Gln Gly Val Ser Tyr Ile Val 620 625 630 Pro Ile Arg Leu Glu Asp Lys Ile Arg Phe Lys Leu Lys Phe Glu 635 640 645 Glu Ala Ser Gly 配列番号:3 配列の長さ:17 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Asp Lys Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln Pro Leu 1 5 10 15 Gly Asn 配列番号:4 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列番号:5 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 配列: GAYAARATHA AYTTYATHTT 20 配列番号:6 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 配列: YGGNATHCAY AAYCAYCARC C 21 配列番号:7 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 配列: YTTRAARTAR TAYTCYTGNC KCATRTCRTT 30 配列番号:8 配列の長さ:647 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:蛋白質 配列: Asp Lys Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln Pro Leu 1 5 10 15 Gly Asn Phe Gly Trp Val Phe Glu Glu Ala Tyr Glu Lys Cys Tyr 20 25 30 Trp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Glu Glu Tyr Pro Asn Met Lys Val 35 40 45 Ala Ile His Thr Ser Gly Pro Leu Ile Glu Trp Leu Gln Asp Asn 50 55 60 Arg Pro Glu Tyr Ile Asp Leu Leu Arg Ser Leu Val Lys Arg Gly 65 70 75 Gln Val Glu Ile Val Val Ala Gly Phe Tyr Glu Pro Val Leu Ala 80 85 90 Ser Ile Pro Lys Glu Asp Arg Ile Glu Gln Ile Arg Leu Met Lys 95 100 105 Glu Trp Ala Lys Ser Ile Gly Phe Asp Ala Arg Gly Val Trp Leu 110 115 120 Thr Glu Arg Val Trp Gln Pro Glu Leu Val Lys Thr Leu Lys Glu 125 130 135 Ser Gly Ile Asp Tyr Val Ile Val Asp Asp Tyr His Phe Met Ser 140 145 150 Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Tyr Trp Pro Tyr Tyr Thr Glu 155 160 165 Asp Gly Gly Glu Val Ile Ala Val Phe Pro Ile Asp Glu Lys Leu 170 175 180 Arg Tyr Leu Ile Pro Phe Arg Pro Val Asp Lys Val Leu Glu Tyr 185 190 195 Leu His Ser Leu Ile Asp Gly Asp Glu Ser Lys Val Ala Val Phe 200 205 210 His Asp Asp Gly Glu Lys Phe Gly Ile Trp Pro Gly Thr Tyr Glu 215 220 225 Trp Val Tyr Glu Lys Gly Trp Leu Arg Glu Phe Phe Asp Arg Ile 230 235 240 Ser Ser Asp Glu Lys Ile Asn Leu Met Leu Tyr Thr Glu Tyr Leu 245 250 255 Glu Lys Tyr Lys Pro Arg Gly Leu Val Tyr Leu Pro Ile Ala Ser 260 265 270 Tyr Phe Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Pro Ala Lys Gln Ala Arg 275 280 285 Leu Phe Val Glu Phe Val Asn Glu Leu Lys Val Lys Gly Ile Phe 290 295 300 Glu Lys Tyr Arg Val Phe Val Arg Gly Gly Ile Trp Lys Asn Phe 305 310 315 Phe Tyr Lys Tyr Pro Glu Ser Asn Tyr Met His Lys Arg Met Leu 320 325 330 Met Val Ser Lys Leu Val Arg Asn Asn Pro Glu Ala Arg Lys Tyr 335 340 345 Leu Leu Arg Ala Gln Cys Asn Asp Ala Tyr Trp His Gly Leu Phe 350 355 360 Gly Gly Val Tyr Leu Pro His Leu Arg Arg Ala Ile Trp Asn Asn 365 370 375 Leu Ile Lys Ala Asn Ser Tyr Val Ser Leu Gly Lys Val Ile Arg 380 385 390 Asp Ile Asp Tyr Asp Gly Phe Glu Glu Val Leu Ile Glu Asn Asp 395 400 405 Asn Phe Tyr Ala Val Phe Lys Pro Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Val 410 415 420 Glu Phe Ser Ser Lys Asn Arg Leu Val Asn Tyr Val Asp Val Leu 425 430 435 Ala Arg Arg Trp Glu His Tyr His Gly Tyr Val Glu Ser Gln Phe 440 445 450 Asp Gly Val Ala Ser Ile His Glu Leu Glu Lys Lys Ile Pro Asp 455 460 465 Glu Ile Arg Lys Glu Val Ala Tyr Asp Lys Tyr Arg Arg Phe Met 470 475 480 Leu Gln Asp His Val Val Pro Leu Gly Thr Thr Leu Glu Asp Phe 485 490 495 Met Phe Ser Arg Gln Gln Glu Ile Gly Glu Phe Pro Arg Val Pro 500 505 510 Tyr Ser Tyr Glu Leu Leu Asp Gly Gly Ile Arg Leu Lys Arg Glu 515 520 525 His Leu Gly Ile Glu Val Glu Lys Thr Val Lys Leu Val Asn Asp 530 535 540 Gly Phe Glu Val Glu Tyr Ile Val Asn Asn Lys Thr Gly Asn Pro 545 550 555 Val Leu Phe Ala Val Glu Leu Asn Val Ala Val Gln Ser Ile Met 560 565 570 Glu Ser Pro Gly Val Leu Arg Gly Lys Glu Ile Val Val Asp Asp 575 580 585 Lys Tyr Ala Val Gly Lys Phe Ala Leu Lys Phe Glu Asp Glu Met 590 595 600 Glu Val Trp Lys Tyr Pro Val Lys Thr Leu Ser Gln Ser Glu Ser 605 610 615 Gly Trp Asp Leu Ile Gln Gln Gly Val Ser Tyr Ile Val Pro Ile 620 625 630 Arg Leu Glu Asp Lys Ile Arg Phe Lys Leu Lys Phe Glu Glu Ala 635 640 645 Ser Gly
【図1】α−アミラーゼ遺伝子を含む Pst I− Hind
III 断片のヌクレオチド配列の最初の部分を示す。
III 断片のヌクレオチド配列の最初の部分を示す。
【図2】同上配列の図1に示した部分に続く部分を示
す。
す。
【図3】同上配列の図2に示した部分に続く部分を示
す。なお、図1、図2および図3に示したヌクレオチド
配列(配列表の配列番号1)において、プライマー1お
よびプライマー2の配列に下線が付してある。増殖させ
た断片のヌクレオチド配列から推定した配列と合致した
アミノ酸配列を四角で囲んである。pKENF−NHを
含む大腸菌で産生されるα−アミラーゼは、発現ベクタ
ーに Nco Iの認識配列を導入してあるので、ピロコッ
カス・フリオズスの細胞抽出物から精製したその対応物
(配列表の配列番号8)と比べると、MetおよびGl
yをアミノ末端に有している(配列表の配列番号2)。
す。なお、図1、図2および図3に示したヌクレオチド
配列(配列表の配列番号1)において、プライマー1お
よびプライマー2の配列に下線が付してある。増殖させ
た断片のヌクレオチド配列から推定した配列と合致した
アミノ酸配列を四角で囲んである。pKENF−NHを
含む大腸菌で産生されるα−アミラーゼは、発現ベクタ
ーに Nco Iの認識配列を導入してあるので、ピロコッ
カス・フリオズスの細胞抽出物から精製したその対応物
(配列表の配列番号8)と比べると、MetおよびGl
yをアミノ末端に有している(配列表の配列番号2)。
【図4】α−アミラーゼをコードする Pst I断片の制
限酵素地図。
限酵素地図。
【図5】発現プラスミドpKENF−NHの構造および
構築を示す。
構築を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:125) (C12N 9/26 C12R 1:19) (C12N 9/26 C12R 1:125) (72)発明者 上森 隆司 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 向井 博之 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 クリスチャン・ビー・アンフィンゼン アメリカ合衆国メリーランド州21208、バ ルティモア、タナー、コート 4 (72)発明者 ケネス・レーダーマン アメリカ合衆国カリフォルニア州90025、 ウエスト、ロス、アンジェルス、ナンバー 215、ベロイト、アヴェニュー 1745
Claims (18)
- 【請求項1】 超好熱性のα−アミラーゼをコードする
ポリヌクレオチドから本質的になるDNA断片。 - 【請求項2】 α−アミラーゼが古細菌のα−アミラー
ゼである請求項1に記載のDNA断片。 - 【請求項3】 α−アミラーゼがピロコッカス・フリオ
ズス( Pyrococcusfuriosus )のα−アミラーゼである
請求項2に記載のDNA断片。 - 【請求項4】 DNA断片が、図1乃至図3に示すアミ
ノ酸配列をコードするものである請求項3に記載のDN
A断片。 - 【請求項5】 図1乃至図3に示すアミノ酸配列、ある
いは、その一部である少なくとも15個の連続したアミ
ノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから本質的にな
るDNA断片。 - 【請求項6】 (i) ベクター、および(ii)請求項1ある
いは5に記載のDNA断片からなる組換えDNA分子。 - 【請求項7】 上記ベクターがプラスミドベクターであ
る請求項6に記載の組換えDNA分子。 - 【請求項8】 上記DNA断片が、プロモーターによる
作用が可能なかたちで結合している請求項6に記載の組
換えDNA分子。 - 【請求項9】 上記プロモーターが、上記DNA断片に
天然に付随するものとは異なるプロモーターである請求
項8に記載の組換えDNA分子。 - 【請求項10】 上記プロモーターが、真正細菌中で機
能するものである請求項9に記載の組換えDNA分子。 - 【請求項11】 請求項6に記載の組換えDNA分子で
形質転換した宿主細胞。 - 【請求項12】 上記宿主細胞が原核細胞である請求項
11に記載の宿主細胞。 - 【請求項13】 上記宿主細胞がエシェリキア( Esche
richia )あるいはバチルス( Bacillus )の細胞であ
る請求項11に記載の宿主細胞。 - 【請求項14】 超好熱性のα−アミラーゼを製造する
にあたり、請求項11に記載の宿主細胞の培養を、上記
DNA断片が発現し、それによって上記α−アミラーゼ
が生成するような条件下で行う工程からなる超好熱性α
−アミラーゼの生成方法。 - 【請求項15】 ピロコッカス・フリオズス( Pyrococ
cus furiosus )のタンパク質を生成するにあたり、
(i) 上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドから
本質的になるDNA断片を、上記DNA断片に天然に付
随するものとは異なり、しかも、翻訳によって宿主細胞
中で上記タンパク質を生成しうるようなmRNAの合成
を誘導するのに有効なプロモーターによる作用が可能な
かたちで該プロモーターに結合してカセットを形成し、
(ii)このカセットを、上記宿主細胞に導入し、そして(i
ii) 工程(ii)で得た上記宿主細胞を、上記DNA断片が
発現し、それによって上記タンパク質が生成するような
条件下でインキュベートする、工程よりなるタンパク質
の生成方法。 - 【請求項16】 上記タンパク質が酵素である請求項1
5に記載の方法。 - 【請求項17】 上記酵素が、α−アミラーゼ、プルラ
ナーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、お
よびプロテアーゼよりなる群から選ばれるものである請
求項16の方法。 - 【請求項18】 上記宿主細胞が、エシェリキア( Esc
herichia )およびバチルス( Bacillus )から選ばれ
る請求項15に記載の方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/894,212 US5366883A (en) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | α-amylase gene |
US894212 | 1992-06-09 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPH0662869A true JPH0662869A (ja) | 1994-03-08 |
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Family
ID=25402762
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16430893A Expired - Fee Related JP3266166B2 (ja) | 1992-06-09 | 1993-06-07 | 超好熱性α−アミラーゼ遺伝子 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5366883A (ja) |
EP (1) | EP0579360B1 (ja) |
JP (1) | JP3266166B2 (ja) |
DE (1) | DE69319972T2 (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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KR100777227B1 (ko) * | 2005-10-08 | 2007-11-28 | 한국해양연구원 | 고호열성 dna 중합효소 및 이의 제조방법 |
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