JPH0847393A - 酵母からタンパク質を分泌させるためのシグナル配列 - Google Patents

酵母からタンパク質を分泌させるためのシグナル配列

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JPH0847393A
JPH0847393A JP6331663A JP33166394A JPH0847393A JP H0847393 A JPH0847393 A JP H0847393A JP 6331663 A JP6331663 A JP 6331663A JP 33166394 A JP33166394 A JP 33166394A JP H0847393 A JPH0847393 A JP H0847393A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、クルイベロミセスマルシアヌス
（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）
由来のイヌリナーゼの分泌シグナルペプチド、前記分泌
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド、前記ヌク
レオチドを含む発現分泌ベクター、前記発現分泌ベクタ
ーにより形質転換された組換え酵母細胞、及び前記組換
え酵母細胞を培養することにより目的タンパク質を生産
する方法に関する。 【効果】 本発明の分泌シグナル配列は、組換え酵母で
発現された目的タンパク質を菌体外にほぼ完全に分泌さ
せる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵母細胞内で発現され
た目的タンパク質を効率よく分泌させる新規な分泌シグ
ナル配列（ペプチド）に関する。詳述すると、組換え酵
母細胞内で発現された目的タンパク質を菌体外にほぼ完
全に分泌させるクルイベロミセスマルシアヌス（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）由来のイ
ヌリナーゼ（ｉｎｕｌｉｎａｓｅ）の分泌シグナル配
列、前記分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配
列、前記ヌクレオチド配列を含む発現分泌ベクター、前
記発現分泌ベクターにより形質転換された組換え酵母細
胞、及び前記組換え酵母細胞を培養することにより目的
タンパク質を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多様なタンパク質、特に医薬品として使
用されるタンパク質は安定性が広く認識されているサッ
カロミセス属を含む酵母から生産してきたし（Ｍａｒｔ
ｅｎ＆ Ｓｅｏ，Ｃｈａｐ．７，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄＰｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ
ｒＤＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｅｄ．ｂｙ Ｈａｔｃ
ｈ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，４７
７ （１９９１））、目的タンパク質を生産及び分泌さ
せるために“プロモーター＋分泌シグナル配列をコード
するＤＮＡ＋目的タンパク質の構造遺伝子＋ターミネー
ター”のように構成された発現分泌プラスミドを使用し
てきた。そのようなプラスミドに使用するためのプロモ
ーターとしては、ＰＧＫ（Ｌｏｉｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，大韓民国特許公開第８８−７７２７号及び第８８
−７００２３４号各明細書；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．，６，７２（１９８８））、ＧＡＰＤＨ、交配因子
α（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−α，ＭＦα−１）、
ＰＨＯ５（Ｍｅｙｈａｃｋ ｅｔａｌ．，大韓民国特許
公開第８６−３８１号及び第８７−６１８５号各明細
書；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ｅｄ．ｂｙ Ｈｅｒｓｈｂ
ｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．３１１−３２１（１
９８９），アメリカ微生物学会刊）、及びグルコースの
ない培地にガラクトースを添加することによって遺伝子
発現を誘導できるＧＡＬ１等のＧＡＬプロモーターシリ
ーズが使用されている。しかしながら、ＰＧＫ、ＧＡＰ
ＤＨ、又はＭＦα−１プロモーターの調節下において
は、遺伝子が構成的に、又は菌体増殖期の末期に発現さ
れるので発現量が少なく、そのようなプロモーターを含
むプラスミドの安定性は培養途中で低下しやすい。ＰＨ
Ｏ５プロモーターは、培地内のリン酸塩の濃度が低いと
き、遺伝子の発現を誘導するが、組換え酵母の発酵途中
で培地内のリン酸塩濃度をおとすことは複雑で煩わしい
工程である。このような理由で、ＧＡＬシリーズプロモ
ーターが目的遺伝子発現調節用として好ましく使用され
ている。
【０００３】酵母から目的タンパク質を分泌させるため
に現在使用されている分泌シグナル配列としては、イン
ベルターゼシグナル配列（アメリカ特許第５，０１０，
００３号）、酸性ホスファターゼシグナル配列（アメリ
カ特許第５，０１３，６５２号）、及び交配因子αのシ
グナル配列（ｐｒｅｐｒｏ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ；以下、ｐｐＬと略称する；アメリカ特許第４，
５８８，６８４号）などがある。この中でｐｐＬがもっ
とも広く使われている。分泌シグナル配列としてｐｐＬ
を利用して酵母細胞からヒトリポコルチン−Ｉ（３４６
個のアミノ酸）とヒトインターロイキン−２（１３３個
のアミノ酸）の分泌に対し研究する間、本発明者らは相
当量のリポコルチン−Ｉとインターロイキン−２が細胞
内に残留することを観察した。また、チェボ（Ｚｓｅｂ
ｏ）らは、分泌シグナル配列としてｐｐＬを利用して酵
母から異種タンパク質を分泌させるとき、アミノ酸３１
個からなるベータエンドルフィン（β−ｅｎｄｏｒｐｈ
ｉｎ）やアミノ酸３２個からなるカルシトニン（ｃａｌ
ｃｉｔｏｎｉｎ）は菌体外に完全に分泌されたが、アミ
ノ酸１６６個からなるα−インターフェロンは９５％が
細胞内に残留することを報告した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２６１，５８５８ー５８６５（１９８６））。
以上は、ｐｐＬが、比較的高分子量のタンパク質を分泌
するための分泌シグナル配列としては、適当ではないこ
とを示した。
【０００４】一方、クルイベロミセスマルシアヌスは、
イヌリナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルコール脱水
素酵素などのタンパク質を大量に分泌する子嚢菌類酵母
である（Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ Ｒｉｊ；Ｔｈｅ Ｙｅ
ａｓｔｓ：Ａ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｓｔｕｄｙ，３ｒ
ｄ ｅｄ．，ｐ．２３３−２３６（１９８４），Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。ラルー（Ｌａｌｏ
ｕｘ）らは、クルイベロミセスマルシアヌスでは生産さ
れたイヌリナーゼの４０％が分泌され、組換えサッカロ
ミセスセレビジエでは生産されたイヌリナーゼの７０％
が分泌されたことを報告した（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，
２８９，６４−６８（１９９１））。後者の結果は、高
重煥の博士学位論文（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ
Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，農芸化学、
東京大学、１９９０）でも観察された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、以上の
ような既存の分泌シグナルの欠点を補完し、比較的高分
子量の目的タンパク質を組換え酵母細胞外に効率的に分
泌させる新規な分泌シグナル配列を開発すべく鋭意研究
を行った結果、クルイベロミセスマルシアヌスから由来
したイヌリナーゼの分泌シグナルペプチドをコードする
新規なヌクレオチド配列が、酵母細胞で発現された高分
子量の目的タンパク質をほぼ完全に細胞外に分泌させる
ことを発見して、本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、目的
タンパク質を組換え酵母から細胞外培地へ効率的に分泌
させる新規な分泌シグナル配列及びこの分泌シグナルペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに関する。更に、
本発明は、分泌シグナル配列をコードする前記ポリヌク
レオチド；シグナル−コード配列の上流に位置し、遺伝
子転写を促進でき得る酵母プロモーター；シグナル−コ
ード配列の下流に位置し、目的タンパク質のＤＮＡ配列
を、シグナル−コード配列と共に開放型読み取り枠（ｏ
ｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）になるようにベ
クター内に挿入するための部位；目的タンパク質のＤＮ
Ａ配列の挿入のための部位から下流にあるターミネータ
ーを含む発現分泌ベクター、及びこのベクターの目的タ
ンパク質のＤＮＡ配列の挿入のための部位に、目的タン
パク質をコードするＤＮＡ配列が、シグナル−コード配
列と共に開放型読み取り枠になるように挿入された組換
え発現分泌ベクターにも関する。また、本発明は、目的
タンパク質を細胞外培地に完全に分泌することができ
る、上記の発現分泌ベクターにより形質転換された組換
え酵母細胞、及び組換え酵母細胞を培養し、培地から目
的タンパク質を回収することを含む、酵母細胞で目的タ
ンパク質を生産する方法にも関する。
【０００７】以下、本発明を詳述する。１．新規な分泌シグナル配列 クルイベロミセスマルシアヌスＡＴＣＣ１２４２４（ラ
ルー等及び高重煥、前記文献参照）から由来したイヌリ
ナーゼのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を比較する
と、同一菌株から由来したものであっても、７個のアミ
ノ酸、２７個のヌクレオチド及び開放型読み取り枠（ｏ
ｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；以下、ＯＲＦと
称することもある。）の外の上流部分と下流部分でのヌ
クレオチド配列が、相互に異なる。この事実を基にし
て、ラルー等がクローニングしたイヌリナーゼ遺伝子を
ＩＮＵ１と、高重煥がクローニングしたイヌリナーゼ遺
伝子をＩＮＵ１Ａと、それぞれ命名する。同一菌株にイ
ヌリナーゼ遺伝子が２種類以上存在するのは２倍体酵母
細胞から遺伝子の２倍体複製数（ｄｉｐｌｏｉｄ ｃｏ
ｐｉｅｓ）が原因である（高重煥の前記論文参照）。
【０００８】以上において、本発明者らは、クルイベロ
ミセスマルシアヌス（Ｒｏｕｗｅｎｈｏｒｓｔ ｅｔ
ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５６，３３３７−３３４５（１９９０））及び組
換えサッカロミセスセレビジエ（ラルー等、前記文献参
照）細胞の外に分泌される全ての成熟イヌリナーゼのＮ
末端が２４番目のアミノ酸から始まる共通点を有し；イ
ヌリナーゼ遺伝子ＩＮＵ１及びＩＮＵ１Ａによりコード
されたタンパク質の２２、２３番のアミノ酸がそれぞれ
リジン、アルギニンであり；このリジン−アルギニン配
列はサッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエンドプロテアーゼ
ｙｓｃＦ（ＫＥＸ２遺伝子の発現物）の認識部位であり
（Ｊｕｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３７，１０
７５−１０８９（１９８４））；イヌリナーゼ遺伝子Ｉ
ＮＵ１及びＩＮＵ１Ａによりコードされたタンパク質の
１番アミノ酸であるメチオニンから２３番アミノ酸であ
るアルギニンまでからなるポリペプチドが分泌シグナル
配列と推定されるという事実を基にして、新規な分泌シ
グナルを発見した。
【０００９】イヌリナーゼ遺伝子によりコードされたタ
ンパク質の１番目から２３番目までのアミノ酸からなる
本発明の新規な分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列は
次のとおりである。 N-Met Lys Z Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala
Gly Val Ser Ala Ser Val Ile Asn Tyr Lys Arg-C 上記配列で、ＺはＩＮＵ１Ａの場合にはロイシン（Ｌｅ
ｕ）（配列番号：１）で、ＩＮＵ１の場合にはフェニル
アラニン（Ｐｈｅ）（配列番号：２）である。なお、イ
ヌリナーゼ遺伝子の１番から６９番までのヌクレオチド
からなる本発明の新規な分泌シグナルペプチドをコード
する代表的であるポリヌクレオチド（配列番号：３）は
次のとおりである。 5'-ATG AAG TTM GCA TAC TCC CTC TTG CTT CCA TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTK ATC AAT TAC AAG AGA-3' 上記の配列で、Ｍ及びＫはＩＮＵ１Ａの場合にはそれぞ
れＡ及びＴであり、ＩＮＵ１の場合にはそれぞれＣ及び
Ｇである。
【００１０】一方、前記アミノ酸配列において、アミノ
酸の置換、添加又は削除が起こることがあり、遺伝暗号
（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ）の縮退（ｄｅｇｅｎｅ
ｒａｃｙ）及び酵母のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕ
ｓａｇｅ）により、同一のアミノ酸配列をコードでき得
る多数のヌクレオチド配列の存在が有り得る。こうして
生成されたアミノ酸配列が、目的タンパク質の分泌のた
めの元の配列と機能的に同等である限り、そのような変
化も本発明の範囲に含まれる。前記ポリヌクレオチド
は、イヌリナーゼ遺伝子から分離することによって得る
ことができるばかりでなく、化学的に合成することもで
きる。
【００１１】２．組換え発現分泌ベクター及び形質転換
体 本発明の新規な分泌シグナル配列は、目的タンパク質を
細胞外培地へ効率的に分泌させるためのベクターシステ
ム、例えば、ＹＥｐ３５２（Ｈｉｌｌ ｅｔａｌ．，Ｙ
ｅａｓｔ，２，１６３（１９８６））、ｐＹＥＳ２．０
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）などの酵母ベクター
に幅広く用いることができる。目的タンパク質をコード
するＤＮＡを、前記分泌シグナル配列をコードする構造
遺伝子の下流に連結して開放型読み取り枠（ＯＲＦ）を
形成することによって、組換え発現分泌ベクターを構築
する。このような組換えベクターの例としては、リポコ
ルチン−Ｉ遺伝子と前記分泌シグナル配列とをプラスミ
ド内に連結して構築されたプラスミドｐＹＧＩＬＰ−
１、ｐＹＧＩＬＰ−２、ｐＹＧＩＬＰ−３、及びｐＹＧ
ＩＬＰ−４等が含まれる。もうひとつの組換えベクター
の例として、インターロイキン−２構造遺伝子と前記分
泌シグナル配列とをプラスミド内に連結して構築された
プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２とｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆも含
まれる。目的とするタンパク質、使用されたプロモータ
ー及びターミネーター等により、多様な組換え発現分泌
ベクターが存在することが有り得る。そのような組換え
発現分泌ベクターも本発明の範囲に含まれる。。
【００１２】組換え発現分泌ベクターを用いて生産でき
る目的タンパク質としては、リポコルチン、インターフ
ェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子（ｃｏｌ
ｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）、
プロウロキナーゼ（ｐｒｏｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ウロ
キナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｉ
ｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏ
ｒ）、リゾチーム、インスリン、因子（ｆａｃｔｏｒ）
VIII、ヒルジン、スーパーオキシドジスムターゼ、カル
シトニン、インスリン様増殖因子、表皮成長因子、ヒト
成長ホルモン等が含まれる。上記の組換え発現分泌ベク
ターを用いて、通常の方法、例えば、文献（Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｅ
ｄ．Ｆ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，ａｎｄ
Ｊ．Ｂ．Ｈｉｃｋｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８６）の方法によ
り、酵母細胞を形質転換させることができる。
【００１３】宿主細胞としては、サッカロミセス属（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属
（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイ
ベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセ
ヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒ
ｒｏｗｉａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）に属する多様
な酵母細胞等、好ましくはサッカロミセスセレビジエを
使用することができる。形質転換された酵母細胞を、宿
主細胞及び使用された発現システムによって選択された
培地上で適切な条件下に培養し、培地へ分泌されたタン
パク質を精製することによって、目的タンパク質を得る
ことができる。
【００１４】下記実施例等は、本発明をより詳細に説明
するためのものであり、本発明の範囲を制限せず、実施
例に使用された実験方法等は、別に言及しない限り、下
記に与えられた比較例により行うことができる。また、
固体混合物中固体、液体中液体及び液体中固体に対して
下記に与えられたパーセントは、別に断らない限り、そ
れぞれ重量／重量、容量／容量及び重量／容量による。
【００１５】
【実施例】比較例１ （段階１）ヒトリポコルチン−Ｉ構造遺伝子を増幅及び
制限酵素認識部位を導入するために、下記ヌクレオチド
配列を有するプライマーＩ、IIをＤＮＡ合成器（Ｍｏｄ
ｅｌ ３９１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社、米国）を利用して合成した。 プライマー（Ｉ）（配列番号：４） 5’− CGCCGTCTAG ATAAAAGGAT GGCAATGGTA TCAG −
3’ プライマー（II）（配列番号：５） 5’− TCTTCTGATC ATAGCTGTCG ACCATCAAGG GAATGT −
3’ プライマーＩ及びIIそれぞれ１μｌ（１００ｐｍｏｌｅ
ｓ）、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＬＣ１−Ｓ（ＫＣ
ＴＣ８４１８Ｐ）２ｎｇ、１０倍濃縮ポリメラーゼ緩衝
液（ベーリンガーマンハイム社）１０μｌ、及び１０倍
濃縮ｄＮＴＰ混合液（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及
びｄＣＴＰがそれぞれ２ｍＭ；ベーリンガーマンハイム
社）１０μｌの混合物に、滅菌蒸留水７２μｌを加えて
総容量を１００μｌにし、反応混合物の蒸発を防止する
ためにミネラルオイル（シグマ社）１００μｌを加え
た。反応混合物を９５℃で５分間加熱した後、７２℃ま
で冷却させた。１μｌ（５単位）のＴａｑ ＤＮＡ ポ
リメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社）を混合物に添
加し、ＥＺ循環器（Ｅｒｉｃｏｍｐ Ｉｎｃ．；米国）
を使用して９４℃、１分；５５℃、２分；７２℃、３分
で構成されたポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲ
と称する）サイクルを２５回反復することによってＰＣ
Ｒを行った。
【００１６】このＰＣＲで得た０．１μｇのＤＮＡ断片
（約１、０６０ｂｐ）をＸｂａＩ及びＳａｌＩで切断し
て、生成した断片を、ＸｂａＩ及びＳａｌＩであらかじ
め切断したプラスミドｐブルースクリプトＳＫ（ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米
国）と連結して、プラスミドｐＢＬＰを構築した。プラ
スミドｐＢＬＰをＸｂａＩ及びＳａｌＩで切断して、リ
ポコルチン−Ｉ遺伝子を含む約１，０５０ｂｐの断片を
分離した（断片１）。プラスミドｐＹＥＧα−ＨＩＲ５
（ＫＣＴＣ ８５１８Ｐ）をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで
切断して、ｐｐＬを含む約３００ｂｐのＤＮＡ断片を分
離した（断片２）。プラスミドｐＹＥＳ２．０（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社；米国）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで
切断して得た約５，９００ｂｐのＤＮＡ断片を、断片
１、２と連結して、プラスミドｐＹＧＬＰを構築した。
プラスミドｐＹＧＬＰは、ＧＡＬ１プロモーター、ＭＦ
αー１のｐｐＬのペプチド（８５個のアミノ酸）をコー
ドするポリヌクレオチド、ＡＴＧ開始コドンから始まる
リポコルチン−Ｉ構造遺伝子及びＣＹＣ１ターミネータ
ーの順になっている。プラスミドｐＹＧＬＰの構築過程
を図１に示す。
【００１７】（段階２）イトーらの塩化リチウム法（Ｉ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５
３、１６３−１６８（１９８３））によって、段階１で
製作したプラスミドｐＹＧＬＰでサッカロミセスセレビ
ジエＳＥＹ２１０２（ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２，ｌｅ
ｕ２−３，−１１２，ｈｉｓ４−５１９，ｓｕｃ２−Δ
９；Ｅｍｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，７０８０−７０８
４（１９８３））を形質転換させた。ＹＰＤ培地（酵母
エキス１％、バクトーペプトン２％、グルコース２％）
１０ｍｌにサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２を
接種し、３０℃で１晩振盪培養した。培養液１００μｌ
を更にＹＰＤ培地１０ｍｌに接種し、６００ｎｍで培養
液の光学的密度が１．０になるまで３０℃で振盪培養し
た。１０ｍｌの培養液を２，０００ｒｐｍで５分間遠心
して培地を除去し、細胞沈殿物を得た後、これをＴＥ緩
衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭＥＤ
ＴＡ）５ｍｌで洗浄した。細胞沈殿物に０．５ｍｌのＴ
Ｅ緩衝液と０．５ｍｌの０．２Ｍ塩化リチウム（シグマ
社；米国）を加えよく懸濁し、３０℃で１時間振盪し
た。振盪液１００μｌを別のエッペンドルフチューブに
移し、段階１で用意したプラスミドｐＹＧＬＰ溶液０．
１μｇを振盪液に添加した。
【００１８】この混合物を３０℃で３０分間振盪し、７
０％ＰＥＧ４０００溶液１５０μｌを加え懸濁し、生成
された溶液を３０℃で１時間振盪した後、４８℃で１０
分間ヒートショックをかけた。生成物は１５，０００ｒ
ｐｍで１分間遠心して上澄み液を捨て、２０ｍｇ／ｌの
アンピシリンを含む食塩水で細胞沈殿物を洗浄した後、
前記食塩水２００μｌに懸濁した。懸濁液を最小選択培
地（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔ
ｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ０．６７％、グルコ
ース２％、ロイシン０．００３％、ヒスチジン０．００
２％、バクトアガ２％）に広げ３０℃で４日間培養した
後、酵母形質転換体、すなわちサッカロミセスセレビジ
エＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＬＰを選別した。
【００１９】（段階３） （ｉ）サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２（宿主
細胞）を１０ｍｌのＹＰＤ培地で３０℃で７２時間振盪
培養した。 （ii）（段階２）で得たサッカロミセスセレビジエＳＥ
Ｙ２１０２／ｐＹＧＬＰを１０ｍｌのＹＰＤ培地で３０
℃で７２時間振盪培養した。 （iii)サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２（宿主
細胞）を１０ｍｌのＹＰＤＧ培地（酵母エキス１％、バ
クトーペプトン２％、グルコ−ス０．４％、ガラクトー
ス２％）で３０℃で７２時間振盪培養した。 （iv）（段階２）で得たサッカロミセスセレビジエＳＥ
Ｙ２１０２／ｐＹＧＬＰを１０ｍｌのＹＰＤＧ培地で３
０℃で７２時間振盪培養した。
【００２０】実施例１ イヌリナ−ゼ（ＩＮＵ１Ａ）分泌シグナルをコードする
ポリヌクレオチドを６つのオリゴヌクレオチド（III
）、（IV）、（Ｖ）、（VI）、（VII ）及び（VIII）
に分けてＤＮＡ合成器で合成した。 オリゴヌクレオチド（III ）（配列番号：６） 5'-GA TCT ATG AAG TTA GCA TAC TCC CTC TTG-3' オリゴヌクレオチド（IV）（配列番号：７） 3'-A TAC TTC AAT CGT ATG AGG GAG AAC GAA GGT-5' オリゴヌクレオチド（Ｖ）（配列番号：８） 5'-CTT CCA TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTT-3' オリゴヌクレオチド（VI）（配列番号：９） 3'-AAC CGT CCT CAG TCA CGA AGT CAA TAG TTA-5' オリゴヌクレオチド（VII ）（配列番号：１０） 5'-ATC AAT TAC AAG AGA ATG GCA ATG GTA TCA G-3' オリゴヌクレオチド（VIII）（配列番号：１１） 3'-ATG TTC TCT TAC CGT TAC CAT AGT CTT AA-5' 上記オリゴヌクレオチド（III ）、（IV）、（Ｖ）、
（VI）、（VII ）及び（VIII）それぞれ１μｌ（１００
ｐｍｏｌｅｓ）を混合してポリヌクレオチドキナーゼ
（Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓ
ｅ、ベーリンガーマンハイム社）でリン酸化した後、会
合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応で二重鎖を形成させた。
リガーゼ（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ベーリンガー
マンハイム社）でそれぞれの二重鎖ポリヌクレオチドを
連結した後、アガロースゲル電気泳動を行ない、ゲルか
ら約１００ｂｐの断片を切出し、ＩＮＵ１Ａの分泌シグ
ナルをコードする断片３を得た。比較例１で構築したプ
ラスミドｐＢＬＰをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断して
リポコルチン−Ｉ構造遺伝子を含む約ｌ，０３０ｂｐの
断片を得た（断片４）。プラスミドｐＹＥＳ２．０（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；米国）をＢａｍＨＩ及びＸｈｏ
ｌで切断して得た約５，９００ｂｐのＤＮＡ断片５を、
断片３及び断片４と連結し、生成したプラスミドｐＹＧ
ＩＬＰ−１で、比較例１の段階２に記述された方法を使
用してサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２を形質
転換させた。プラスミドｐＹＧＩＬＰ−１で形質転換さ
れたサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２は、韓国
標準菌株収集所（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ；以下、ＫＣＴＣ
と称する）に寄託番号第ＫＣＴＣ００８５ＢＰ号として
１９９３年９月１４日付で寄託された。プラスミドｐＹ
ＧＩＬＰ−１の構築過程を図２に示す。
【００２１】実施例２ オリゴヌクレオチド（IX）及び（Ｘ）をＤＮＡ合成器で
合成した。 オリゴヌクレオチド（IX）（配列番号：１２） 5'-GA TCT ATG AAG TTC GCA TAC TCC CTC TTG-3' オリゴヌクレオチド（Ｘ）（配列番号：１３） 3'-A TAC TTC AAG CGT ATG AGG GAG AAC GAA GGT-5' 上記オリゴヌクレオチド（Ｖ）、（VI）、（VII ）、
（VIII）、（IX）及び（Ｘ）それぞれ１μｌ（１００ｐ
ｍｏｌｅｓ）を混合して、実施例１のようにリン酸化及
びリガーゼ処理し、アガロースゲル電気泳動によりゲル
からＩＮＵ１の分泌シグナルをコードする約１００ｂｐ
の断片６を得た。断片４、５及び６をつないで、ＩＮＵ
１Ａの分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチド
の９番目塩基であるＡがＣになった（分泌シグナルペプ
チドの３番目アミノ酸がフェニルアラニンになった）プ
ラスミドｐＹＧＩＬＰ−２を構築した。比較例１の段階
２に記述した方法を使用して、プラスミドｐＹＧＩＬＰ
−２で形質転換されたサッカロミセスセレビジエＳＥＹ
２１０２を得た。
【００２２】実施例３ オリゴヌクレオチド（XI）及び（XII ）をＤＮＡ合成器
で合成した。 オリゴヌクレオチド（XI）（配列番号：１４） 5'-CTT CCA TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTG -3' オリゴヌクレオチド（XII ）（配列番号：１５） 3'-AAC CGT CCT CAG TCA CGA AGT CAC TAG TTA -5' 上記オリゴヌクレオチド（III ）、（IV）、（VII ）、
（VIII）、（XI）及び（XII ）それぞれ１μｌ（１００
ｐｍｏｌｅｓ）を混合して、実施例１のようにリン酸化
及びリガーゼ処理し、アガロースゲル電気泳動してゲル
からＩＮＵ１Ａの分泌シグナルをコードする約１００ｂ
ｐの断片７を得た。断片４、５、及び７をつないで、Ｉ
ＮＵ１Ａの分泌シグナルペプチドをコードするポリヌク
レオチドの５４番目の塩基であるＴがＧに置換されたプ
ラスミドｐＹＧＩＬＰ−３を構築した。比較例１の段階
２のような方法を使用して、プラスミドｐＹＧＩＬＰ−
３で形質転換されたサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２
１０２を得た。
【００２３】実施例４ 上記オリゴヌクレオチド（VII ）、（VIII）、（IX）、
（Ｘ）、（XI）及び（XII ）それぞれ１μｌ（１００ｐ
ｍｏｌｅｓ）を混合して、実施例１のようにリン酸化及
びリガーゼ処理し、アガロースゲル電気泳動してゲルか
ら約１００ｂｐの断片８を得た。断片４、５、及び８を
つないで、ＩＮＵ１Ａの分泌シグナルペプチドをコード
するポリヌクレオチドの９番目塩基であるＡ及び５４番
目塩基であるＴがＣ及びＧでそれぞれ置換されＩＮＵ１
の分泌シグナルと一致するプラスミドｐＹＧＩＬＰ−４
を構築した。比較例１の段階２のような方法を使用し
て、プラスミドｐＹＧＩＬＰ−４で形質転換されたサッ
カロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２を得た。以上のよ
うに構築したプラスミドのイヌリナーゼ分泌シグナルの
塩基配列及びリポコルチン−Ｉ遺伝子の塩基配列は、ジ
デオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５
４６３−５４７６（１９７７））で確認した。
【００２４】実施例５ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−１を使用して、比較例１の段階３の（ｉ）の手順を
反復した。
【００２５】実施例６ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−１を使用して、比較例１の段階３の（iii）の手順
を反復した。
【００２６】実施例７ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−２を使用して、比較例１の段階３の（ｉ）の手順を
反復した。
【００２７】実施例８ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−２を使用して、比較例１の段階３の（iii）の手順
を反復した。
【００２８】実施例９ 比較例１の段階３の（ｉ）〜（iv）及び実施例５〜８の
各培養液２ｍｌを遠心（２，０００ｒｐｍ、５分）し
て、培養培地と細胞沈澱物をそれぞれ分離した。デモル
デルーらの方法（Ｄｅｍｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２，１７９−１８９
（１９９４））によって、培養培地に２００μｌの０．
２％（Ｗ／Ｖ）デオキシコール酸ナトリウム（シグマ
社）を加えて、生成された混合物を５分間室温に放置し
た後、２００μｌの１００％（Ｗ／Ｖ）トリクロロ酢酸
を加えた。生成された溶液を０℃で３０分間放置した
後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心してタンパク質
沈澱物を得た。沈澱物を５００μｌのアセトンで洗浄し
て、１０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐ
Ｈ６．８、１００ｍＭジチオトレイトール、２％ＳＤ
Ｓ、５％２−メルカプトエタノール、０．１％ブロモフ
ェノールブルー、及び１０％グリセリン）に溶かして、
１００℃で５分間加熱した。生成された溶液を培養培地
タンパク質画分と命名した。
【００２９】ホフマンとウィンストンの方法（Ｈｏｆｆ
ｍａｎ ＆ Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｇｅｎｅ，５７，２６７
（１９８７））によって、細胞沈澱物を破砕緩衝液（２
％トリトンＸ−１００，１％ＳＤＳ，１００ｍＭ塩化ナ
トリウム，１０ｍＭトリス−Ｃｌ，ｐＨ８．０，及び１
ｍＭ ＥＤＴＡ）２ｍｌに懸濁して、０．４〜０．５ｍ
ｍのガラスビーズで菌体を破砕した。生成された細胞均
質液（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）に５倍濃縮溶解緩衝液を
０．５ｍｌ加えて、１００℃で５分間加熱した。生成さ
れた溶液を菌体タンパク質画分と命名した。
【００３０】培養培地タンパク質画分及び菌体タンパク
質画分のそれぞれ１０μｌを、５％濃縮ゲル（ｐＨ６．
８、横２０ｃｍ、縦３．０ｃｍ、厚さ１ｍｍ）と１０％
分離ゲル（ｐＨ８．８、横２０ｃｍ、縦１０ｃｍ、厚さ
１ｍｍ）からなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで１
００〜２００ボルト、３０ｍＡで３時間電気泳動した。
ゲルをクーマシーブルー染色液（１０％イソプロパノー
ル、１０％酢酸、及び０．０５％クーマシーブリリアン
トブルーＲ−２５０）で５時間染色し、脱色液（１０％
イソプロパノール、及び１０％酢酸）で３時間脱色し
た。その結果を図３に示す。
【００３１】図３において、第１列は標準分子量標識
（上からそれぞれ１０６、８０、５０、３３、２７ｋＤ
ａ）を、第２列は比較例１段階３の（ｉ）の菌体タンパ
ク質を、第３列は比較例１段階３の（iii)の菌体タンパ
ク質を、第４列は比較例１段階３の（ii）の菌体タンパ
ク質を、第５列は比較例１段階３の（iv）の菌体タンパ
ク質を、第６列は実施例５の菌体タンパク質を、第７列
は実施例６の菌体タンパク質を、第８列は実施例７の菌
体タンパク質を、第９列は実施例８の菌体タンパク質
を、第１０列は比較例１段階３の（ｉ）の培養培地タン
パク質を、第１１列は比較例１段階３の（iii)の培養培
地タンパク質を、第１２列は比較例１段階３の（ii）の
培養培地タンパク質を、第１３列は比較例１段階３の
（iv）の培養培地タンパク質を、第１４列は実施例５の
培養培地タンパク質を、第１５列は実施例６の培養培地
タンパク質を、第１６列は実施例７の培養培地タンパク
質を、第１７列は実施例８の培養培地タンパク質を、第
１８列は精製リポコルチン−Ｉ０．１μｇを示す。図３
の第１８列の精製リポコルチン−Ｉは、サッカロミセス
セレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＬＰをＹＰＤＧ培地
で４８時間培養した後、上澄み液をＳＰ陽イオン交換ク
ロマトグラフィーで１次精製して、Ｇ−７５ゲル濾過ク
ロマトグラフィーで２次精製したものである。
【００３２】前記結果で、リポコルチン−Ｉ（約３７ｋ
Ｄａ、第１８列）に相当するバンドは、培養培地タンパ
ク質と菌体タンパク質のどちらにも示されなかった。こ
の結果は、リポコルチン−Ｉが全く発現されなかった
か、あるいは、非常に少量しか発現されずにクーマシー
ブルー染色によっては検出できないことを意味するの
で、結果を確認するためにウエスタンブロッティングを
用いる分析を行った。
【００３３】実施例１０ バーネトルの方法（Ｂｕｒｎｅｔｌｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１１２，１９５（１９８１））によっ
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
て分離されたタンパク質を、クーマシーブルー染色しな
いで、電気泳動転写装置（Ｈｏｅｆｅｒ社、ｔａｎｋ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｎｉｔ，ｍｏｄｅｌＴＲ−２２）
を用いて１５０ｍＡ、５０Ｖで１時間、ニトロセルロー
ス膜に転写した。膜に転写されたタンパク質を１／５，
０００に希釈したウサギの抗リポコルチンポリクローナ
ル抗体（Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．，２４，４５３−４６０（１９９１））と３
０分間反応させて、リポコルチン−Ｉのバンドをウエス
タンブロッティングＡＰシステム（ヤギの抗ウサギＩｇ
Ｇ｛Ｈ＋Ｌ又はＦｃ｝−アルカリホスファターゼ結合
体、プロメガ社、米国）で確認した。その結果を図４に
示す。
【００３４】図４において、第１列は標準分子量標識
（上からそれぞれ１０６、８０、５０、３３、２７ｋＤ
ａ）を、第２列は比較例１段階３の（ｉ）の菌体タンパ
ク質を、第３列は比較例１段階３の（iii)の菌体タンパ
ク質を、第４列は比較例１段階３の（ii）の菌体タンパ
ク質を、第５列は比較例１段階３の（iv）の菌体タンパ
ク質を、第６列は実施例５の菌体タンパク質を、第７列
は実施例６の菌体タンパク質を、第８列は実施例７の菌
体タンパク質を、第９列は実施例８の菌体タンパク質
を、第１０列は比較例１段階３の（ｉ）の培養培地タン
パク質を、第１１列は比較例１段階３の（iii)の培養培
地タンパク質を、第１２列は比較例１段階３の（ii）の
培養培地タンパク質を、第１３列は比較例１段階３の
（iv）の培養培地タンパク質を、第１４列は実施例５の
培養培地タンパク質を、第１５列は実施例６の培養培地
タンパク質を、第１６列は実施例７の培養培地タンパク
質を、第１７列は実施例８の培養培地タンパク質を、第
１８列は精製リポコルチン−Ｉ０．１μｇを示す。
【００３５】精製されたリポコルチン−Ｉは、実施例９
に示した方法により得た。前記結果で、リポコルチン−
Ｉ（約３７ｋＤａ、第１８列）に相当するバンドは、比
較例１段階３の（ｉ）及び（iii)の宿主細胞の菌体タン
パク質又は培養培地タンパク質のいずれにも見られなか
った（第２、３、１０及び１１列）。ＹＰＤ培地で培養
された比較例１段階３の（ii）のＳＥＹ２１０２／ｐＹ
ＧＬＰの菌体タンパク質又は培養培地タンパク質のいず
れにも、リポコルチン−Ｉバンドが見えないが（第４列
及び第１２列）、ＹＰＤＧ培地で培養された比較例１段
階３の（iv）のＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＬＰの菌体タン
パク質及び培養培地タンパク質においては、全てリポコ
ルチン−Ｉバンドが検出された（第５列及び第１３
列）。この結果は、細胞内で発現されたリポコルチン−
Ｉが、培地中に完全には分泌されてはいないことを意味
する。ＹＰＤＧ培地で培養されたＳＥＹ２１０２／ｐＹ
ＧＬＰの場合、培養培地タンパク質内のリポコルチンの
量は約０．０５μｇであり、菌体タンパク質内のリポコ
ルチンの量は約０．７μｇであるので、分泌率はわずか
約７％であった。
【００３６】ＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬＰ−１の場合
には、ＹＰＤ培地で培養したときは、培養培地タンパク
質又は菌体タンパク質のいずれにもリポコルチン−Ｉバ
ンドが見えなかった（実施例５、第６列及び第１４
列）。しかし、リポコルチン−Ｉの発現がガラクトース
によって誘導されると、すなわち、細胞をＹＰＤＧ培地
で培養すると、菌体タンパク質ではリポコルチン−Ｉバ
ンドが見えず、培養培地タンパク質ではリポコルチン−
Ｉバンドが観察された（実施例６、第７列及び第１５
列）。
【００３７】また、ＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬＰ−２
の場合、これをＹＰＤ培地で培養したときは、培養培地
タンパク質又は菌体タンパク質のいずれにもリポコルチ
ン−Ｉバンドが見えない（実施例７、第８列及び第１６
列）。しかし、リポコルチン−Ｉの発現がガラクトース
によって誘導されると、菌体タンパク質ではリポコルチ
ン−Ｉバンドが見えず、培養培地タンパク質ではリポコ
ルチン−Ｉバンドが観察された（実施例８、第９列及び
第１７列）。この結果は、細胞内で発現されたリポコル
チン−Ｉがイヌリナーゼ分泌シグナルによって菌体外に
ほぼ完全に分泌されたことを意味し、分離されたリポコ
ルチン−Ｉの量もｐｐＬシグナルペプチドを使用した場
合よりずっと多い（第１３列、第１５列及び第１７列参
照）。
【００３８】実施例１１及び１２ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−３及びサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／
ｐＹＧＩＬＰ−４をそれぞれ使用して、比較例１段階３
の（iii)、実施例９、１０の手順を反復した。その結果
は、それぞれ図４の第７列及び第１５列並びに第９列及
び第１７列と一致した。
【００３９】比較例２ （段階１）分泌シグナルとしてｐｐＬを利用した酵母用
のインターロイキン−２発現分泌ベクターの構築 ＤＮＡ合成器でプライマー（XIII）及び（XIV ）を合成
した。 プライマ−（XIII）（配列番号：１６） 5'-CGC CGT CTA GAT AAA AGA ATG GCG CCT ACT TCA AGT
TCT ACA-3' プライマ−（XIV ）（配列番号：１７） 5'-TGT CGA CCA TCA AGG GAA TGT TTA AGT TAG TGT TGA
GAT-3' プライマ−（XIII）及び（XIV ）それぞれ１μｌ（１０
０ｐｍｏｌｅｓ）並びに鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐ
ＮＫＭ２１（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．，５，１６３−１６８（１９９１））２ｎｇ
を使用して、比較例１の段階１に記述したＰＣＲの方法
で約４００ｂｐの断片を得た。この断片をＸｂａＩ（部
分切断）及びＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動してゲルからインターロイキン−２構造遺伝子を含む
約４００ｂｐの断片９を得た。ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５
（ＫＣＴＣ８５１９Ｐ）をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで切
断して、ＧＡＬ１０プロモ−タ−及びｐｐＬ配列を含む
約７００ｂｐの断片１０を得た。一方、プラスミドＹＥ
Ｇα−ＨＩＲ５２５をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し
て約５，８００ｂｐの断片１１を得た。断片９、１０及
び１１をつないでプラスミドｐＩＬ−２を作製した。プ
ラスミドｐＩＬ−２は、ＧＡＬ１０プロモーター＋ＭＦ
α−ＩのｐｐＬペプチド（８５アミノ酸）をコードする
ポリヌクレオチド＋ＧＣＧコドン（アラニン）から始ま
るインターロイキン−２構造遺伝子＋ＧＡＬ７ターミネ
ーターのように構成されている。プラスミドｐＩＬ−２
の構築過程を図５に示す。
【００４０】（段階２）プラスミドｐＹＧＬＰの代わり
にｐＩＬ−２を使用して、前記比較例１の段階２と同じ
方法で形質転換菌株サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２
１０２／ｐＩＬ−２を得た。
【００４１】（段階３） （ｉ）サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わ
りにサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＩＬ
−２を使用して、前記比較例１の段階３の（ｉ）と同じ
方法を行った。 （ii）サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わ
りにサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＩＬ
−２を使用して、前記比較例１の段階３の（iii ）と同
じ方法を行った。
【００４２】実施例１３：ＩＮＵ１Ａ分泌シグナルを利
用した酵母用のインターロイキン−２発現分泌ベクター
の構築 ＤＮＡ合成器でオリゴヌクレオチド（XV）、（XVI ）、
（XVII）及び（XVIII）を合成した。 オリゴヌクレオチド（XV）（配列番号：１８） 5'- AA TTC ATG AAG TTA GCA TAC TCC CTC TTG -3' オリゴヌクレオチド（XVI ）（配列番号：１９） 3'- G TAC TTC AAT CGT ATG AGG GAG AAC GAA GGT -5' オリゴヌクレオチド（XVII）（配列番号：２０） 5'- ATC AAT TAC AAG AGG G -3' オリゴヌクレオチド（XVIII ）（配列番号：２１） 3'- ATG TTC TCC CGC -5' 前記オリゴヌクレオチド（XV）、（XVI ）、（XVII）及
び（XVIII ）並びに実施例１のオリゴヌクレオチド
（Ｖ）及び（VI）を用いて、実施例１のようにリン酸化
及びリガーゼ処理した後、アガロースゲル電気泳動を行
なった。アガロースゲルからＩＮＵ１Ａの分泌シグナル
をコードする約８０ｂｐの断片１２を得た。比較例２の
断片９をＮａｒＩ及びＳａｌＩで切断してインターロイ
キン−２構造遺伝子を含む約４００ｂｐの断片１３を得
た。ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ
で切断してＧＡＬ１０プロモ−タ−を含む約６，３００
ｂｐの断片１４を得た。断片１２、１３及び１４をつな
いでプラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２を作製した。プラスミ
ドｐＹＧＩ−ＩＬ２は、ＧＡＬ１０プロモーター＋ＩＮ
Ｕ１Ａの分泌シグナル配列＋ＧＣＧコドンから始まるイ
ンターロイキン−２構造遺伝子＋ＧＡＬ７ターミネータ
ーのように構成されている。プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ
２の構築過程を図６に示す。
【００４３】実施例１４：ＩＮＵ１分泌シグナルを利用
した酵母用のインターロイキン−２発現分泌ベクターの
構築 プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆの構築過程は、ＩＮＵ１
分泌シグナルの合成用のオリゴヌクレオチドが違うだけ
で、他の過程は図６と同じである。ＤＮＡ合成機でオリ
ゴヌクレオチド（XIX ）及び（XX）を合成した。 オリゴヌクレオチド（XIX ）（配列番号：２２） 5'-AA TTC ATG AAG TTC GCA TAC TCC CTC TTG -3' オリゴヌクレオチド（XX）（配列番号：２３） 3'-G TAC TTC AAG CGT ATG AGG GAG AAC GAA GGT -5' 前記オリゴヌクレオチド（XIX ）と（XX）、実施例１３
のオリゴヌクレオチド（XVII）と（XVIII ）、及び実施
例１のオリゴヌクレオチド（Ｖ）と（VI）を利用して、
実施例１のようにリン酸化及びリガーゼ処理し、アガロ
ースゲル電気泳動してゲルからＩＮＵ１分泌シグナルを
コードする約８０ｂｐの断片１５を得た。実施例１３の
断片１３及び断片１４を断片１５につないでプラスミド
ｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆを構築した。プラスミドｐＹＧＩ−
ＩＬ２Ｆは、ＧＡＬ１０プロモーター＋ＩＮＵ１の分泌
シグナル配列＋ＧＣＧコドン（アラニン）から始まるイ
ンターロイキン−２構造遺伝子＋ＧＡＬ７ターミネータ
ーのように構成されている。以上のプラスミドのイヌリ
ナーゼ分泌シグナル及びインターロイキン−２構造遺伝
子の塩基配列は、実施例４に示したサンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ）のジデオキシ法で確認した。
【００４４】実施例１５ プラスミドｐＹＧＬＰの代わりにｐＹＧＩ−ＩＬ２とｐ
ＹＧＩ−ＩＬ２Ｆをそれぞれ使用して、前記比較例１の
段階２と同じ方法で、２種類の形質転換菌株サッカロミ
セスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２及び
ＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆを得た。サッカロ
ミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２
は、１９９４年９月２７日付でＫＣＴＣへ寄託番号ＫＣ
ＴＣ０１２０ＢＰ号として寄託された。
【００４５】実施例１６ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりにサ
ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
Ｌ２を使用して、前記比較例１の段階３の（ｉ）と同じ
方法を行った。
【００４６】実施例１７ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりにサ
ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
Ｌ２を使用して、前記比較例１の段階３の（iii ）と同
じ方法を行った。
【００４７】実施例１８ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりにサ
ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
Ｌ２Ｆを使用して、前記比較例１の段階３の（ｉ）と同
じ方法を行った。
【００４８】実施例１９ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりにサ
ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
Ｌ２Ｆを使用して、前記比較例１の段階３の（iii ）と
同じ方法を行った。
【００４９】実施例２０ 比較例２の段階３の（ｉ）及び（ii）並びに実施例１６
及び１７の培養液各々１ｍｌを遠心（２，０００ｒｐ
ｍ、５分）して培養培地と細胞沈澱物とに分離し、実施
例９の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行なった後、実施例１０の方法で抗インターロイキン
−２抗体（ベーリンガーマンハイム社）を使ってウェス
タンブロッティングを行った。結果を図７に示す。図７
において、第１列は標準分子量標識（上から３３、２
７、１８ｋＤａ）を、第２列は比較例１の段階３の
（ｉ）の菌体タンパク質を、第３列は比較例１の段階３
の（iii ）の菌体タンパク質を、第４列は比較例２の段
階３の（ｉ）の菌体タンパク質を、第５列は比較例２の
段階３の（ii）の菌体タンパク質を、第６列は実施例１
６の菌体タンパク質を、第７列は実施例１７の菌体タン
パク質を、第８列は比較例１の段階３の（ｉ）の培養培
地タンパク質を、第９列は比較例１の段階３の（iii ）
の培養培地タンパク質を、第１０列は比較例２の段階３
の（ｉ）の培養培地タンパク質を、第１１列は比較例２
の段階３の（ii）の培養培地タンパク質を、第１２列は
実施例１６の培養培地タンパク質を、第１３列は実施例
１７の培養培地タンパク質を示す。
【００５０】比較例１の宿主細胞の菌体タンパク質と培
養培地タンパク質のいずれにもインターロイキン−２バ
ンドが示されなかった（第２、３、８及び９列）。サッ
カロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＩＬ−２をＹ
ＰＤ培地で培養すると（比較例２の段階３の（ｉ））、
菌体タンパク質と培養培地タンパク質のいずれにもイン
ターロイキン−２バンドが見えないが（第４及び１０
列）、ＹＰＤＧ培地で培養すると（比較例２の段階３の
（ii））、菌体タンパク質と培養培地タンパク質にイン
ターロイキン−２バンド（約１５ｋＤａ）が検出された
（第５及び１１列）。この結果は、ｐｐＬが細胞内で発
現されたインターロイキン−２を効果的に分泌させない
ことを意味する。菌体内のインターロイキン−２（第５
列）の量と培養培地中のインターロイキン−２（第１１
列）の量を比較すると、分泌率はわずか１０％に過ぎな
い。サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧ
Ｉ−ＩＬ２の場合、ＹＰＤ培地（実施例１６）では、菌
体タンパク質と培養培地タンパク質いずれにもインター
ロイキン−２バンドが見られなかった（第６列及び第１
２列）。しかし、ＹＰＤＧ培地（実施例１７）におい
て、菌体タンパク質にはインターロイキン−２バンドが
見えないが（第７列）、培養培地タンパク質にはインタ
ーロイキン−２バンドが観察された（第１３列）。これ
は、細胞内に発現されたインターロイキン−２が大部分
効率的に分泌されたことを意味する。実施例１８、１９
のサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ
−ＩＬ２Ｆも、サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０
２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２と同じ結果を示した。したがっ
て、既存の分泌シグナルとしてもっとも普遍的に使用さ
れるＭＦα−１のｐｐＬよりも、本発明で開発したイヌ
リナーゼ（ＩＮＵ１ＡとＩＮＵ１遺伝子の産物）分泌シ
グナルの方が、ヒトリポコルチン−Ｉだけでなくヒトイ
ンターロイキン−２等の異種タンパク質の発現分泌にお
いて、ずっと優れていることがわかる。本発明を特定の
実施態様について記述したが、本発明が属する技術分野
で熟練した者であれば、特許請求の範囲に記載された本
発明の範囲内で変更又は修正できることが認識されるべ
きである。
【００５１】
【発明の効果】本発明の分泌シグナル配列によれば、組
換え酵母で発現された目的タンパク質を菌体外にほぼ完
全に分泌させることができる。
【００５２】
【配列表】
【００５３】配列番号：１ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATG AAG TTM GCA TAC TCC CTC TTG CTT CCA 30 TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTK ATC AAT 60 TAC AAG AGA 69
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 CGCCGTCTAG ATAAAAGGAT GGCAATGGTA TCAG 34
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 TCTTCTGATC ATAGCTGTCG ACCATCAAGG GAATGT 36
【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCTATGAA GTTAGCATAC TCCCTCTTG 29
【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAAGCAAG AGGGAGTATG CTAACTTCAT A 31
【００６０】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCCATTGG CAGGAGTCAG TGCTTCAGTT 30
【００６１】配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTGATAACT GAAGCACTGA CTCCTGCCAA 30
【００６２】配列番号：１０ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCAATTACA AGAGAATGGC AATGGTATCA G 31
【００６３】配列番号：１１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCTGATA CCATTGCCAT TCTCTTGTA 29
【００６４】配列番号：１２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCTATGAA GTTCGCATAC TCCCTCTTG 29
【００６５】配列番号：１３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAAGCAAG AGGGAGTATG CGAACTTCAT A 31
【００６６】配列番号：１４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCCATTGG CAGGAGTCAG TGCTTCAGTG 30
【００６７】配列番号：１５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTGATCACT GAAGCACTGA CTCCTGCCAA 30
【００６８】配列番号：１６ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 CGCCGTCTAG ATAAAAGAAT GGCGCCTACT TCAAGTTCTA CA 42
【００６９】配列番号：１７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 TGTCGACCAT CAAGGGAATG TTTAAGTTAG TGTTGAGAT 39
【００７０】配列番号：１８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCATGAA GTTAGCATAC TCCCTCTTG 29
【００７１】配列番号：１９ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAAGCAAG AGGGAGTATG CTAACTTCAT G 31
【００７２】配列番号：２０ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCAATTACA AGAGGG 16
【００７３】配列番号：２１ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCCCTCTTG TA 12
【００７４】配列番号：２２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCATGAA GTTCGCATAC TCCCTCTTG 29
【００７５】配列番号：２３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAAGCAAG AGGGAGTATG CGAACTTCAT G 31
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＹＧＬＰの構築過程を模式的に示
す説明図である。
【図２】プラスミドｐＹＧＩＬＰ−１の構築過程を模式
的に示す説明図である。
【図３】宿主細胞及びリポコルチン−Ｉを生産する組換
え酵母の菌体タンパク質及び培養培地タンパク質を用い
たＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）分析の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】宿主細胞及びリポコルチン−Ｉを生産する組換
え酵母の菌体タンパク質及び培養培地タンパク質を用い
たウェスタンブロッティング分析の結果を示す図面に代
わる写真である。
【図５】プラスミドｐＩＬ−２の構築過程を模式的に示
す説明図である。
【図６】プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２の構築過程を模式
的に示す説明図である。
【図７】宿主細胞及びインターロイキン−２を生産する
組換え酵母の菌体タンパク質及び培養培地タンパク質を
用いたウェスタンブロッティング分析の結果を示す図面
に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 ヤン スン−アー 大韓民国大邱直轄市東区新川１洞626−10 番地 (72)発明者 朴 英薫 大韓民国大田直轄市儒城区道龍洞391番地 タウンハウス５棟101号

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 クルイベロミセスマルシアヌス由来のイ
    ヌリナーゼの分泌シグナルペプチドを含む、酵母から目
    的タンパク質を分泌させるための分泌シグナル配列。
  2. 【請求項２】 配列表の配列番号１又は配列番号２で表
    されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の分泌シグナ
    ル配列。
  3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載の分泌シグ
    ナル配列をコードするポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列表の配列番号３で表される塩基配列
    を有する請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 分泌シグナル配列をコードする請求項３
    又は請求項４に記載のポリヌクレオチドと、 シグナル−コード配列の上流に位置し、酵母で転写を促
    進でき得るＤＮＡ配列と、 シグナル−コード配列の下流に位置し、目的ＤＮＡ配列
    を、シグナル−コード配列と共に開放型読み取り枠にな
    るようにベクター内へ挿入するための部位と、 目的ＤＮＡ配列の挿入のための部位の下流にあるターミ
    ネーターとを含む発現分泌ベクター。
  6. 【請求項６】 目的ＤＮＡ配列の挿入のための部位に、
    目的タンパク質をコードする目的ＤＮＡ配列を、シグナ
    ル−コード配列と共に開放型読み取り枠になるように挿
    入させた請求項５記載の発現分泌ベクター。
  7. 【請求項７】 プラスミドｐＹＧＩＬＰ−１（ＫＣＴＣ
    ００８５ＢＰ）、ｐＹＧＩＬＰ−２、ｐＹＧＩＬＰ−３
    又はｐＹＧＩＬＰ−４である請求項６に記載のヒトリポ
    コルチン−Ｉ発現分泌ベクター。
  8. 【請求項８】 プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２（ＫＣＴＣ
    ０１２０ＢＰ）又はｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆである請求項６
    に記載のヒトインターロイキン−２発現分泌ベクター。
  9. 【請求項９】 請求項５〜８のいずれか一項に記載の発
    現分泌ベクターにより形質転換された組換え酵母細胞。
  10. 【請求項１０】 サッカロミセス属、シゾサッカロミセ
    ス属、クルイベロミセス属、ハンセヌラ属、ヤロウィア
    属又はピヒア属に属する酵母である請求項９に記載の組
    換え酵母細胞。
  11. 【請求項１１】 サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１
    ０２／ｐＹＧＩＬＰ−１（ＫＣＴＣ００８５ＢＰ）又は
    サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−
    ＩＬ２（ＫＣＴＣ０１２０ＢＰ）である請求項１０に記
    載の組換え酵母細胞。
  12. 【請求項１２】 請求項９に記載の組換え酵母細胞を培
    養し、培地から目的タンパク質を回収することを含む、
    酵母細胞により目的タンパク質を生産する方法。
  13. 【請求項１３】 組換えサッカロミセスセレビジエＳＥ
    Ｙ２１０２／ｐＹＧＩＬＰ−１又はＳＥＹ２１０２／ｐ
    ＹＧＩ−ＩＬ２からヒトリポコルチン−Ｉ又はヒトイン
    ターロイキン−２を生産する請求項１２に記載の方法。
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