JP2010500043A - 乾燥自由流動性ハイドロフォビン調製物を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
で表されるポリペプチドである。
で表されるポリペプチドである。
噴霧助剤を、空気又は不活性ガスと一緒に、噴霧によって噴霧装置(好ましくは、噴霧塔)の中に導入する。噴霧助剤の導入は、便宜上、霧化ユニットの上方で行う。適切な噴霧塔は、当業者には既知の全ての形状のものである(例えば、「K. Masters, Spray Drying Handbook, ISBN 0-582-06266-7」を参照されたい)。
名称
ハイドロフォビンA: YaaD-DewA-His6
ハイドロフォビンB: 40 AA YaaD-DewA-His6
乾燥物質含有量: DS [重量%]
活性試験
タンパク質活性を評価するために、再溶解させた噴霧乾燥ハイドロフォビン融合タンパク質又は噴霧造粒ハイドロフォビン融合タンパク質のコーティング特性を使用する。コーティング特性の評価は、それぞれ、親水性表面又は疎水性表面のモデルとして、好ましくは、ガラス又はテフロンの上で行う。
ガラス:
・ ハイドロフォビンの濃度:50 mg/L;
・ ガラスプレートを10mM Tris(pH8)中で一晩インキュベーション(温度:80℃);
・ コーティング後、脱塩水中で洗浄;
・ 次いで、インキュベーション 10分間/80℃/1% SDS;
・ 脱塩水中で洗浄。
・ 濃度:50 mg/L;
・ テフロンプレートを10mM Tris(pH8)中で一晩インキュベーション(温度:80℃);
・ コーティング後、脱塩水中で洗浄;
・ インキュベーション 10分間/80℃/0.1% Tween 20;
・ 脱塩水中で洗浄;
・ 次いで、インキュベーション 10分間/80℃/1% SDS;
・ 脱塩水中で洗浄。
2つのサイドシケインを有する1000mL容のエーレンマイヤーフラスコ内で、200mLの複合培地に、LB-Amp プレート(100μg/mLアンピシリン)から YaaD-DewA-His6 又は 40 AA YaaD-DewA-His6 を発現しているE.coli株を接種する(=第1前培養)。その株を、OD600nmが約3.5になるまで、d0=2.5cmの200rpmの振盪機上で37℃でインキュベートする。その後、シケインを有する1000mL容の4つのさらなるエーレンマイヤーフラスコ(いずれの場合にも、200mLの複合培地を有している)に、それぞれ、1mLの第1前培養を用いて接種し、振盪キャビネット(d0=2.5cm、n=200rpm)内で37℃でインキュベートする(=第2前培養)。OD600nmが6を超えたら直ぐに、この第2振盪培養から、複合培地で満たされている前発酵槽(prefermenter)に接種する。OD600nmが9を超えるか又はOTR=80mmol/(l*h)に達した後、主発酵槽に接種する。その主培養を、極めて少量の複合成分を含んでいる無機培地内でフェドバッチ法で実施する。OD600nmが70を超えた時点で、細胞を50μmのIPTGで誘導する。4〜20時間の誘導時間が経過した後、発酵を終了させ、容器の内容物を4℃に冷却する。発酵終了後、例えばプレートセパレーター(例えば、ノズルセパレーター)を用いることによって又は精密濾過によって、細胞を発酵ブロスから分離させ、脱塩水に再度懸濁させる。プレートセパレーターを用いることによって又は精密濾過によってもう1度分離させた後、再度再懸濁させた細胞を、2000barの圧力差で高圧ホモジナイザーを用いて破壊する。そのホモジネートを、プレートセパレーター(例えば、ノズルセパレーター)を用いて分離させ、数回洗浄する。得られた濃厚物をpH12.5に調節する。約15分間経過した後、pHを9まで低下させる。中和されたハイドロフォビン含有溶液を、管状遠心分離器にかけて固体を分離する。SDS-PAGE 分析によれば、最終の遠心分離後、ハイドロフォビンは上清中に存在している。この上清を、以下では「ハイドロフォビン水溶液」と称する。ハイドロフォビン水溶液の乾燥物質含有量は、通常、2〜4重量%である。ELISAを用いて求められたハイドロフォビン濃度は、この段階では、典型的には、4〜35g/Lの範囲内にある。
3.4重量%の固形分を有する866kgのハイドロフォビンA水溶液に、28.6kgのマンニトールを撹拌しながら入れる。その溶液を、Gerig Gr.0 型ツインマテリアルノズルを用いて、41kg/hの噴霧速度で1200kg/hの窒素の中に並流的に噴霧する。噴霧塔は、800mmの直径及び12mの高さを有している。ここで、乾燥ガスの入り口温度は161度である。乾燥ガスの出口温度は80度である。フィルターにおいて付着物が生じ、31.7kgの乾燥物質が回収される。6.1kgの乾燥物質を噴霧塔から取り除く。再溶解させたハイドロフォビン含有乾燥物質について活性試験で得られた接触角を表1に記載する。再溶解させた乾燥物質のタンパク質ゲルを図1に示す。
2.4重量%の固形分及び4.5g/Lのハイドロフォビン濃度を有する109kgのハイドロフォビンB水溶液に、2.4kgのマンニトールを撹拌しながら入れる。その溶液を、3mm Niro ツインマテリアルノズルを用いて、12.8kg/hの噴霧速度で450kg/hの窒素の中に並流的に噴霧する。噴霧塔(製造会社 Niro)は、1200mmの直径及び2650mmの円柱高さを有している。円錐の断面の高さは600mmである。乾燥ガスの入り口温度は163度である。乾燥ガスの出口温度は79度である。サイクロン排出において4.1kgの乾燥物質が回収される。下流のフィルター排出において0.73kgの乾燥物質が回収される。再溶解させたハイドロフォビン含有乾燥物質について活性試験で得られた接触角を表2に記載する。再溶解させた乾燥物質のタンパク質ゲルを図2に示す。
3.4重量%の固形分及び31g/Lのハイドロフォビン含有量を有する155kgのハイドロフォビンA水溶液に、5.4kgの硫酸ナトリウムを撹拌しながら入れる。その溶液を、3mm Niro ツインマテリアルノズルを通して、12.2kg/hの噴霧速度で450kg/hの窒素の中に並流的に噴霧する。噴霧塔(製造会社 NIRO)は、1200mmの直径及び2650mmの円柱高さを有している。円錐の断面の高さは600mmである。乾燥ガスの入り口温度は165度である。乾燥ガスの出口温度は84度である。サイクロン排出において5.5kgの乾燥物質が回収される。
20g/Lの乾燥物質含有量を有する2LのハイドロフォビンB水溶液に、40gの硫酸ナトリウムを撹拌しながら入れる。その溶液を、乾燥ガスとして窒素を用いる Buchi 実験室用噴霧乾燥機の中で乾燥させる。ガスの入り口温度は160度である。ガスの出口温度は80度である。サイクロン排出において40gが回収される。再溶解させた乾燥物質について得られた接触角を表3に記載する。
20g/Lの乾燥物質含有量を有する2LのハイドロフォビンB水溶液に、40gのマルトデキストリンを撹拌しながら入れる。その溶液を、乾燥ガスとして窒素を用いる Buchi 実験室用噴霧乾燥機の中で乾燥させる。ガスの入り口温度は160度である。ガスの出口温度は80度である。サイクロン排出において39gが回収される。再溶解させた乾燥物質について得られた接触角を表4に記載する。
240kgのハイドロフォビンA水溶液(TS=3.4重量%、ハイドロフォビン濃度 31g/L)を濃縮する。これにより、13重量%の固形分及び117g/Lのハイドロフォビン含有量を有する65kgのハイドロフォビンA水溶液が得られる。その濃厚溶液を、3mm Niro ツインマテリアルノズルを通して、13.7kg/hの噴霧速度で450kg/hの窒素の中に噴霧する。噴霧塔(製造会社 NIRO)は、1200mmの直径及び2650mmの円柱高さを有している。円錐の断面の高さは600mmである。乾燥ガスの入り口温度は165度である。乾燥ガスの出口温度は84度である。サイクロン排出において6.1kgの乾燥物質が回収される。再溶解させたハイドロフォビン含有乾燥物質について活性試験で得られた接触角を表5に記載する。再溶解させた乾燥物質のタンパク質ゲルを図3に示す。
894kgのハイドロフォビンB水溶液(TS=2.4重量%、ハイドロフォビン濃度 6.3g/L)を濃縮する。これにより、226kgの濃厚なハイドロフォビンB水溶液(TS=9.7重量%、ハイドロフォビン濃度 35.4g/L)が得られる。9.6%の固形分(ハイドロフォビン含有量 約35.4g/L)を有する75kgのその濃厚なハイドロフォビンB水溶液を、直径2mmのシングルマテリアルノズル(Niro)を用いて、13.6kg/hの噴霧速度で25度の温度で450kg/hの窒素の中に並流的に噴霧する。噴霧塔(製造会社 NIRO)は、1200mmの直径及び2650mmの円柱高さを有している。円錐の断面の高さは600mmである。ここで、乾燥ガスの入り口温度は168度である。乾燥ガスの出口温度は84度である。サイクロンにおいて5kgの生成物が回収され、フィルターにおいて1.2kgの生成物が回収される。噴霧乾燥された物質のかさ密度は、100kg/m3である。得られた物質の純度(ここで、該純度は、総タンパク質濃度に対するハイドロフォビンの百分率(%)として定義される)は、45%である。再溶解させたハイドロフォビン含有乾燥物質について活性試験で得られた接触角を表6に記載する。再溶解させた乾燥物質のタンパク質ゲルを図4に示す。
921kgのハイドロフォビンA水溶液(TS=2.3重量%、ハイドロフォビン濃度 18g/L)を濃縮する。これにより、241kgの濃厚なハイドロフォビンA水溶液(TS=9.6重量%、ハイドロフォビン濃度 98.3g/L)が得られる。その濃厚なハイドロフォビンA水溶液を、最初に乾燥ハイドロフォビンAを充填した噴霧流動床(d=150mm、A=0.177m2)に導入する。直径2mmの2-マテリアルノズルを通して、濃厚なハイドロフォビンA水溶液を噴霧する。
894kgのハイドロフォビンB水溶液(DS=2.4重量%、ハイドロフォビン濃度 6.3g/L)を濃縮する。226kgの濃厚なハイドロフォビンB水溶液(DS=9.7重量%、ハイドロフォビン濃度 35.4g/L)が得られる。
Claims (8)
- 自由流動性の安定な乾燥ハイドロフォビン調製物を製造する方法であって、噴霧装置内で、ハイドロフォビン溶液(該ハイドロフォビン溶液は、適切な場合には、添加剤を含んでいる)を噴霧及び乾燥させることによる、前記方法。
- 前記ハイドロフォビン溶液を5〜200重量%(該溶液のハイドロフォビン固体含有量を基準とする)の有機又は無機の噴霧助剤を補助的に用いて噴霧し、そのようにして得られた噴霧助剤を含んでいる粒子を乾燥させる、請求項1に記載の方法。
- 噴霧装置に加えて流動床も使用する、顆粒の形態にあるハイドロフォビン調製物を製造するための、請求項1に記載の方法。
- 噴霧助剤として1種類以上の糖アルコール、セルロース又はデンプンを使用する、請求項1に記載の方法。
- 噴霧助剤としてマンニトールを使用する、請求項1に記載の方法。
- 前記噴霧を120〜200℃の入り口空気温度で実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記噴霧を50〜120℃の出口空気温度で実施する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に従って得られる、自由流動性の安定な乾燥ハイドロフォビン調製物。
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