BRPI0609545A2 - uso de hidrofobinas, processo para tratar superfìcies, e, superfìcie revestida com pelo menos uma hidrofobina - Google Patents

Abstract

USO DE HIDROFOBINAS, PROCESSO PARA TRATAR SUPERFìCIES, E, SUPERFìCIE REVESTIDA COM PELO MENOS UMA HIDROFOBINA. Uso de hidrofobinas para o tratamento da superficie de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica, processo para o tratamento de referidas superfícies e também superficies de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica que apresentam um revestimento compreendendo hidrofobinas.

Description

"USO DE HIDROFOBINAS, PROCESSO PARA TRATAR SUPERFÍCIES, E, SUPERFICIE REVESTIDA COM PELO MENOS UMA HIDROFOBINA"

A presente invenção refere-se ao uso de hidrofobinas para tratar a superfície de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica, a um processo para tratar referidas superfícies e também superfícies de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica que apresentam um revestimento compreendendo hidrofobinas.

É de conhecimento geral que superfícies interiores e exteriores podem ser revestidas com revestimentos para aperfeiçoar a durabilidade e/ou o aspecto da superfície. Referidos revestimentos devem, por exemplo, conservar, repelir umidade, inibir sujidade ou facilitar a limpeza da superfície.

Os revestimentos podem ser revestimentos permanentes, por exemplo, revestimentos inspirados pelo efeito do lótus, como divulgado na EP-A 933 388.

Os revestimentos também podem ser revestimentos temporários. Um efeito repelente de sujeira temporário do tipo referido pode ser obtido, por exemplo, por meio de substâncias em uma formulação de limpeza que são aplicadas no curso da limpeza da superfície. Estas podem ser limpadores para azulejos, por exemplo.

WO 03/002620 divulga o uso de (met)acrilatos de dialquilaminoalquila como polímeros liberadores de sujeira para superfícies duras, por exemplo, pisos de pedras finas ou superfícies de aço inoxidável. As formulações divulgadas compreendem de 0,1 % a 5 % em peso do polímero.

DE-A 100 61 897 divulga composições limpadoras compreendendo partículas hidrofílicas contendo silicato que levam ao desprendimento aperfeiçoado da sujeira associado com sujidade reduzido. As partículas são captadas pela superfície das substâncias a serem limpadas e, assim, afetam as propriedades da superfície.

Hidrofobinas são proteínas pequenas com cerca de 100 a 150 aminoácidos que são características de fungos filamentosos, por exemplo, Schizophyllum commune. Elas geralmente apresentam 8 unidades cisteína.

Hidrofobinas apresentam uma afinidade marcante por interfaces e, portanto, são úteis para revestir superfícies. Por exemplo, Teflon pode ser revestido com hidrofobinas para se obter uma superfície hidrofílica.

Hidrofobinas podem ser isoladas de fontes naturais. Mas também é possível sintetizar hidrofobinas não-naturalmente ocorrentes por meio de métodos de produção químicos e/ou biotecnológios. Nosso pedido anterior DE 102005007480.4 revela um processo para produzir hidrofobinas que não ocorrem na natureza.

Há estado da técnica que propõe o uso de hidrofobinas para várias aplicações.

WO 96/41882 propõe o uso de hidrofobinas como emulsificadores, espessantes ou tensoativos, para proporcionar propriedades hidrofílicas a superfícies hidrofóbicas, para aperfeiçoar a resistência à água de substratos hidrofílicos, para preparar emulsões óleo-em-água ou emulsões água-em-óleo. Propostas adicionais incluem aplicações farmacêuticas, como a preparação de ungüentos ou cremes, e também aplicações cosméticas, como proteção da pele ou a produção de xampus ou condicionadores.

EP-A 1 252 516 revela o revestimento de janelas, lentes de contato, biossensores, dispositivos médicos, recipientes para realização de ensaios ou para armazenamento, cascos de embarcações, partículas sólidas ou chassis ou carrocerias de veículos de passageiros com uma solução contendo hidrofobina a de 30 a 80°C.

WO 03/53383 revela o uso de hidrofobina para tratar materiais de queratina em aplicações cosméticas.

WO 03/10331 revela um sensor revestido com hidrofobina (um eletrodo de medição, por exemplo) a que liga de forma não-covalente substâncias adicionais, por exemplo, substâncias eletro-ativas, anticorpos ou enzimas.

Nenhuma das referências indicadas divulga o tratamento de superfície de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmicas.

É um objeto da presente invenção proporcionar técnicas inéditas para tratar referidas superfícies, com o que se obtém pelo menos um efeito repelente de sujeira e/ou hidrofobizador e/ou conservador.

Nós verificamos que este objeto é obtido com o uso de uma hidrofobina para tratar uma superfície de um material selecionado do grupo que consiste de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica. Em uma concretização preferida, usa-se para tal fim uma formulação compreendendo uma hidrofobina e também pelo menos um solvente.

Em um segundo aspecto da presente invenção proporciona-se um processo para tratar uma superfície, que compreende contactar referida superfície com pelo menos uma hidrofobina, sendo que referida superfície compreende a superfície de um material selecionado do grupo que consiste de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmicas.

Em um terceiro aspecto da presente invenção proporciona-se uma superfície revestido com pelo menos uma hidrofobina, sendo que referida superfície compreende materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica.

Nós verificamos com surpresa que mesmo quantidades extremamente pequenas de hidrofobinas são suficientes para um tratamento repelente de sujeira e/ou hidrofobizador e/ou conservador efetivo das superfícies de materiais construtivos minerais endurecidos, pedras ou cerâmicas.

Uma descrição detalhada da presente invenção é dada a seguir: De acordo com a presente invenção, usa-se pelo menos uma hidrofobina para tratar a superfície de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmicas. Usa-se também uma mistura de uma pluralidade de diferentes hidrofobinas.

O termo "hidrofobinas" como usado aqui deve referir, abaixo, a polipeptídeos da fórmula estrutural geral (I)

Xn-Cl-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)

sendo que X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturalmente ocorrentes (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Thr, Asn, Lys, Vai, Ala, Asp, Glu, Gly). Cada X pode ser igual ou diferente. Os índices próximas de X indicam em cada caso o número de aminoácidos, C representa cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina sujeito à condição de que pelo menos quatro dos aminoácidos identificados com C são cisteína, e os índices nem são independentemente números naturais na faixa de 0 a 500 e, de preferência, na faixa de 15 a 300.

Os polipeptídeos de Fórmula (I) são caracterizados adicionalmente pela propriedade (após revestimento de uma superfície de vidro) de incrementar o ângulo de contato de uma gota de água em pelo menos 20°, de preferência, pelo menos 25°, mais preferivelmente pelo menos 30° e, da forma mais preferível, pelo menos 35°, em comparação com o ângulo de contato formado por uma gota de água do mesmo tamanho com a superfície de vidro não revestida, sendo que cada medição é realizada à temperatura ambiente.

Os aminoácidos indicados como de C1 a C8 são, de preferência, cisteínas; mas eles também podem ser substituídos por outros aminoácidos de tamanho similar, de preferência, por alanina, serina, treonina, metionina ou glicina. No entanto, pelo menos quatro, de preferência, pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 6 e, particularmente, pelo menos 7 das posições de C1 a C8 devem consistir de cisteínas. Cisteínas em proteínas usadas de acordo com a presente invenção podem estar presentes em forma reduzida ou formam pontes dissulfeto entre si. Prefere-se particularmente a formação intramolecular de pontes C-C, em particular que envolvem pelo menos uma, de preferência, 2, mais preferivelmente 3 e, da forma mais preferível, 4 pontes dissulfeto intramoleculares. No caso da troca de cisteínas por aminoácidos de tamanho similar, como descrito acima, é vantajoso que referidas posições de C estejam envolvidas numa troca pareada como são capazes de formar pontes dissulfeto intramoleculares entre si.

Quando cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas ou treoninas são usadas nas posições designadas com X, a numeração das posições de C individuais nas fórmulas gerais pode alterar-se correspondentemente.

Prefere-se o uso de hidrofobinas da fórmula geral (II) Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (H) sendo que X, C e os índices próximos a X são, cada um, como definido acima, os índices nem representam números na faixa de 0 a 300, e as proteínas distinguem-se adicionalmente pela alteração do ângulo de contato como indicado acima.

Prefere-se usar hidrofobinas da fórmula geral (III) Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-l8-C8-Xm (III)

sendo que X, C e os índices próximos a X são, cada um, como definido acima, os índices nem representam números na faixa de 0 a 200, e as proteínas distinguem-se adicionalmente pela alteração do ângulo de contato como indicado acima e, adicionalmente, pelo menos seis dos aminoácidos indicados com C são cisteína. É particularmente preferível que todos os aminoácidos indicados com C sejam cisteína.

Os radicais Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeos que podem ser ligadas naturalmente a uma hidrofobina. No entanto, um ou ambos os radicais Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeos que não são ligadas naturalmente a uma hidrofobina. Isto também inclui radicais Xn e/ou Xm em que uma seqüência de peptídeos naturalmente ocorrente em uma hidrofobina é estendida por uma seqüência de peptídeos não naturalmente ocorrente em uma hidrofobina.

Quando Xn e/ou Xm são seqüências de peptídeos que não ocorrem naturalmente em hidrofobinas, o comprimento de referidas seqüências é geralmente de pelo menos 20 aminoácidos, de preferência, pelo menos 35 aminoácidos, mais preferivelmente, de pelo menos 50 aminoácidos e, da forma mais preferível, pelo menos 100 aminoácidos. Um radical deste tipo, que não é ligado naturalmente a uma hidrofobina, também será referido como uma porção de parceiro de fusão abaixo. Isto destina-se a articular o fato de que as proteínas consistem de uma porção de hidrofobina e uma porção de parceiro de fusão que não ocorrem conjuntamente nesta forma, na natureza. Referidas proteínas também serão referidas como proteínas de fusão.

A porção de parceiro de fusão pode ser selecionada dentre uma multiplicidade de proteínas. Também é possível que uma pluralidade de porções de parceiros de fusão seja ligada a uma porção de hidrofobina, por exemplo, na ponta amino (Xn) ou na ponta carbóxi (Xm) da porção de hidrofobina. Mas também é possível, por exemplo, ligar duas porções de parceiros de fusão a uma posição (Xn ou Xm) da proteína usada de acordo com a presente invenção.

Particularmente, porções de parceiros de fusão são polipeptídeos que ocorrem naturalmente em microorganismos, em particular em E. coli ou Bacillus subtilis. Exemplos de referidas porções de parceiros de fusão são as seqüências yaad (SEQ ID NO: 15 e 16), yaae (SEQ ID NO: 17 e 18) e tiorredoxina. Também são altamente vantajosos fragmentos ou derivados das seqüências previamente indicadas que compreendem apenas uma porção, de preferência, de 70 % a 99 % e, mais preferivelmente, de 80 % a 98 %, de referidas seqüências, ou em que aminoácidos ou nucleotídeos individuais foram alterados, em comparação com a seqüência indicada.

Proteínas usadas de acordo com a presente invenção podem ser modificadas adicionalmente em sua seqüência de polipeptídeos, por exemplo, por meio de glicosilação, acetilação ou, então, por meio de reticulação química, por exemplo, com glutaraldeído.

Uma propriedade das proteínas usadas de acordo com a presente invenção é a alteração de propriedades de superfície quando as superfícies são revestidas com as proteínas. A alteração de propriedades de superfície pode ser determinada experimentalmente por meio de medição do ângulo de contato de uma gota de água antes e após revestimento da superfície com a proteína e determinando-se a diferença entre as duas medições.

Uma pessoa versada na arte saberá, em princípio, como realizar medições de ângulo de contato. As condições experimentais precisas para medição do ângulo de contato são descritas na porção experimental. Nas condições indicadas aqui, as proteínas usadas acordo com a presente invenção têm a propriedade de incrementar o ângulo de contato de uma gotícula de água sobre uma superfície de vidro em pelo menos 20°, de preferência, pelo menos 25° e, mais preferivelmente, pelo menos 30°.

As posições dos aminoácidos polares e apolares na porção hidrofobina das hidrofobinas conhecidas até hoje são preservadas, resultando em um diagrama característico de hidrofobicidade. Diferenças das propriedades biofísicas e a hidrofobicidade levaram às hidrofobinas conhecidas até aqui são classificadas em duas classes, I e II (Wessels et ai, Ann. Rev. Phytopathol., 1994, 32, 413-437). As membranas combinadas de hidrofobinas de classe I são altamente solúveis (mesmo em uma solução aquosa a 1 % em peso de n- dodecil sulfato de sódio (SDS) a uma temperatura elevada e só podem ser dissociadas novamente com ácido trifluoroacético (TFA) concentrado ou ácido fórmico. Em contraste, as formas combinadas de hidrofobinas de classe II são menos estáveis. Elas podem ser dissolvidas novamente com apenas 60 % em peso etanol ou 1 % em peso de SDS (à temperatura ambiente).

Comparação das seqüências de aminoácidos revela que o comprimento da região entre cisteína C3 e cisteína C4 é distintamente mais curto em hidrofobinas de classe II do que em hidrofobinas de classe I. Hidrofobinas de classe II apresentam adicionalmente aminoácidos mais carregados do que as de classe I.

Hidrofobinas particularmente preferidas para concretização da presente invenção são aquelas do tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, que são caracterizadas estruturalmente na listagem de seqüências abaixo. Elas também podem ser apenas partes ou derivados das mesmas. Também é possível ligar uma pluralidade de hidrofobina, de preferência, 2 ou 3, com a mesma estrutura ou com uma estrutura diferente, em conjunto e a uma seqüência de polipeptídeo vantajosa correspondente que não é conectada naturalmente a uma hidrofobina.

E particularmente vantajoso para a prática da presente invenção que as proteínas de fusão apresentem as seqüências de polipeptídeos indicadas nas SEQ ID NO: 20, 22, 24 e também as seqüências de ácido nucleico que codificam para as mesmas, em particular as seqüências de acordo com SEQ ID NO: 19, 21, 23. Concretizações particularmente preferidas incluem adicionalmente proteínas que, partindo das seqüências de polipeptídeos indicados nas SEQ ID NO. 22, 22 ou 24, resultam da substituição, inserção ou deleção de pelo menos um, até 10, de preferência, 5, mais preferivelmente 5 % de todos os aminoácidos e que ainda apresentam pelo menos 50 % da propriedade biológica das proteínas de partida. A propriedade biológica das proteínas usadas de acordo com a presente invenção deve compreender o significado da alteração descrita acima no ângulo de contato em pelo menos 20°.

Polipeptídeos usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados quimicamente por meio de técnicas familiares da síntese peptídica, por exemplo, a síntese de fase sólida de Merrifield.

Hidrofobinas naturalmente ocorrentes podem ser isoladas de fontes naturais com o emprego de métodos vantajosos. Como um exemplo, ver Wõsten et ai., Eur. JCell Bio. 63, 122-129 (1994) ou WO 96/41882.

Proteins de fusao nao-naturalmente ocorrentes sao preparadas, de preferência, por meio de processos de manipulação genética em que uma seqüência de ácido nucleico, em particular uma seqüência de DNA, codificando para o parceiro de fusão e uma seqüência de ácido nucleico, em particular uma seqüência de DNA, codificando para a porção de hidrofobina são combinadas de tal forma que a proteína desejada seja gerada em um organismo hospedeiro por meio de expressão gênica da seqüência de ácido nucleico combinada. Um método de preparação do tipo referido é divulgado em nosso pedido estado da técnica DE 102005007480.4.

Organismos hospedeiros, ou produtores, vantajosos para o método de preparação mencionado incluem procariontes (incluindo Archaea) ou eucariontes, particularmente bactérias incluindo halobactérias e metanococos, fungos, células de insetos, células de plantas e células mamíferas, mais preferivelmente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacilos, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas), etc.

Para os fins da presente invenção, é possível usar construções de expressão obtidas, sob o controle genético de seqüências de ácido nucleico reguladoras, uma seqüência de ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo usado de acordo com a presente invenção, e também vetores compreendendo pelo menos uma destas construções de expressão, para preparar hidrofobinas.

Construções de expressão usadas compreendem, de preferência, um promotor 5' a montante da seqüência codificante particular e uma seqüência terminadora 3' a jusante da seqüência codificante particular e também, se apropriado, elementos reguladores usuais adicionais, sendo que cada um é ligado operacionalmente à seqüência codificante.

"Ligação operativa" refere-se à disposição seqüencial de promotor, seqüência codificante, terminador e, se desejado, elementos reguladores adicionais de tal forma que cada um dos elementos reguladores seja capaz de preencher sua função conforme requerido na expressão da seqüência codificante.

Exemplos de seqüências ligáveis operacionalmente são seqüências de objetivação e também acentuadores, sinais de poliadenilação e análogos. Elementos reguladores adicionais compreendem marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e análogos. Seqüências reguladoras vantajosas são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego5CA (1990).

Adicionalmente a estas seqüências reguladoras, a regulação natural destas seqüências pode ainda estar presente a montante dos genes estruturais efetivos e, se desejado, pode ter sido geneticamente modificada de tal forma que a regulação natural tenha sido desativada e a expressão dos genes tenha sido acentuada.

Uma construção de ácido nucleico preferida também compreende vantajosamente uma ou mais das seqüências acentuadoras previamente indicadas que são ligadas funcionalmente ao promotor e que permitem uma expressão acentuada da seqüência de ácido nucleico. Seqüências vantajosas adicionais, como elementos reguladores adicionais ou terminadores, também podem ser inseridas na ponta 3' das seqüências de DNA.

Os ácidos nucleicos podem estar presentes na construção em uma ou mais cópias. A construção também pode compreender marcadores adicionais, como genes de resistências a antibióticos ou agentes complementadores de auxotrofia, se desejado para o fim de selecionar referida construção.

Seqüências reguladoras vantajosas para o processo estão presentes, por exemplo, em promotores, como cos, tac, trp, tet, trp- tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR ou promotor imlambda-P, sendo que referidos promotores são usados vantajosamente em bactérias Gram-negativas. Seqüências reguladoras vantajosas adicionais estão presentes, por exemplo, nos promotores Gram- positivos amy e SP02, nos promotores de levedura ou fungicos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Também é possível usar promotores artificiais para regulação.

Para expressar a construção de ácido nucleico em um organismo hospedeiro, ele é inserido vantajosamente em um vetor, por exemplo, um plasmídeo ou fago, que permite expressão ótima dos genes no hospedeiro. Vetores, e também plasmídeos e fagos, incluem adicionalmente todos os outros vetores conhecidos per se, i.e., por exemplo, vírus, como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transpósons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos, e DNA linear ou circular, e também o sistema de Agrobacterium.

Estes vetores podem ser replicados autonomamente no organismo hospedeiro ou cromossomicamente. Estes vetores constituem uma forma adicional da invenção. Exemplos de plasmídeos vantajosos são, em E. coli, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19,2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN- ΙΙΓ'3-Bl, tgtl 1 ou pBdCI, in Streptomyces, plJlOl, pIJ364, plJ702 ou plJ361, in Bacillus pUBllO, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALSl, plL2 ou pBBlló, em leveduras 2alpha, pAG-1, YEp6, YEpl3 ou pEMBLYe23 ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Os plasmídeos indicados constituem uma pequena seleção dos plasmídeos possíveis. Plasmídeos adicionais são conhecidos per se e podem ser encontrados, por exemplo, no livro Cloning Vectors (Eds. Pouwels Ρ. H. et ai. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018).

Para expressar os outros genes que estão presentes, a construção de ácido nucleico também compreende vantajosamente seqüências reguladoras 3'- e/ou 5'-terminais para acentuar a expressão que são selecionadas para expressão ótima de acordo com a escolha do organismo hospedeiro e gene ou genes.

Estas seqüências reguladoras destinam-se a permitir a expressão específica dos genes e expressão de proteína. Dependendo do organismo hospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que o gene é expresso ou superexpresso apenas após indução, ou que é expresso e/ou superexpresso imediatamente.

Prefere-se a expressão dos genes que foram introduzidos e que podem ser influenciados positivamente e, com isto, acentuados pelos fatores ou seqüências reguladoras. Assim, os elementos reguladores podem ser acentuados vantajosamente no nível de transcrição por meio do uso de sinais de transcrição fortes, como promotores e/ou acentuadores. No entanto, adicionalmente a isto, também é possível acentuar a tradução por meio, por exemplo, do aperfeiçoamento da estabilidade do mRNA.

Em uma forma adicional do vetor, o vetor que compreende a construção de ácido nucleico ou o ácido nucleico também pode ser introduzido vantajosamente nos microorganismos em forma de um DNA linear e ser integrado no genoma do organismo hospedeiro via recombinação heterológa ou homóloga. Este DNA linear pode consistir de um vetor linearizado, como um plasmídeo, ou apenas da construção de ácido nucleico ou do ácido nucleico.

Para expressão ótima de genes heterólogos em organismos é vantajoso modificar as seqüências de ácido nucleico de acordo com o uso de códon específico usado no organismo. O uso de códon pode ser determinado facilmente com o auxílio de análises de computador de outros genes conhecidos do organismo em questão.

Uma cassete de expressão é preparada com a fusão de um promotor vantajoso a uma seqüência de nucleotídeos codificante vantajosa e a um terminador ou sinal de poliadenilação. Com este objetivo e posição usar técnicas comuns de recombinação e clonagem como descrito, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor5 NY (1989) e também em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987).

Para se obter a expressão em um organismo hospedeiro vantajoso, a construção de ácido nucleico recombinante, ou construção gênica, é inserida vantajosamente em um vetor específico-para-hospedeiro que proporciona expressão ótima dos genes no hospedeiro. Vetores são conhecidos per se e podem ser obtidos, por exemplo, de "Cloning Vectors" (Pouwels Ρ. H. et al., Eds, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

É possível preparar, com o auxílio dos vetores, microorganismos recombinantes que são transformados, por exemplo, com pelo menos um vetor e que podem ser usados para a produção dos polipeptídeos usados de acordo com a invenção. De maneira vantajosa, as construções recombinantes descritas acima são introduzidas em um sistema hospedeiro vantajoso e expressas. Em conexão com isto, métodos de clonagem e transfecção familiares conhecidos pela pessoa versada na arte, como, por exemplo, coprecipitação, fusão de protoplasto, eletroporação, transfecção retroviral e análogos, são usados, de preferência, para causar a expressão de ácidos nucleicos no sistema de expressão particular. Sistemas vantajosos encontram-se descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997, ou Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Também é possível preparar microorganismos recombinados homologamente. Para este fim, um vetor que compreende pelo menos uma seção de um gene a ser usado de acordo com a invenção ou de uma seqüência codificante em que se introduziu, se apropriado, pelo menos uma deleção de aminoácido, adição de aminoácido ou substituição de aminoácido para modificar, por exemplo, romper funcionalmente, a seqüência (vetor de knockout). A seqüência introduzida também pode ser, por exemplo, um homólogo de um microorganismo relacionado ou pode ser derivada de uma fonte mamífera, de levedura ou de inseto. Alternativamente, o vetor usado para recombinação homóloga pode ser projetado de tal forma que o gene endógeno, no caso de recombinação homóloga, é mutado ou, de outra forma, alterado, mas ainda codifica a proteína funcional (p. ex., a região reguladora a montante pode ter sido alterada de tal forma que a expressão da proteína endógena é alterada com isso). A seção alterada do gene usado de acordo com a invenção é no vetor de recombinação homóloga. A construção de vetores que são vantajosos para recombinação homóloga é descrita, por exemplo, em Thomas, K.R. e Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503.

Organismos hospedeiros recombinantes vantajosos para o ácido nucleico usado de acordo com a invenção ou a construção de ácido nucleico são, em princípio, quaisquer organismos procariontes ou eucariontes. De maneira vantajosa, usa-se microorganismos, como bactérias, fungos ou leveduras, como organismos hospedeiros. Usa-se de maneira vantajosa bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, de preferência, bactérias das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae ou Nocardiaceae, de forma particularmente preferível, bactérias dos gêneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium ou Rhodococcus.

Os organismos usados no processo de preparação de proteínas de fusão são, dependendo do organismo hospedeiro, desenvolvidos ou cultivados de uma maneira conhecida da pessoa versada na arte. Microorganismos são desenvolvidos usualmente em um meio líquido que compreende uma fonte de carbono, usualmente em forma de açúcares, uma fonte de nitrogênio, usualmente em forma de fontes de nitrogênio orgânico, como extrato de levedura ou sais, como sulfato de amônio, traços de elementos, como sais de ferro, sais de manganês e sais de magnésio e, se desejado, vitaminas, em temperaturas de entre O0C e IOO0C, de preferência, entre IO0C e 60°C, enquanto são abastecidos com oxigênio. Em conexão com isto, o pH do líquido nutriente pode ser mantido em um valor fixo, i.e. pode ou não ser regulado durante o cultivo. O cultivo pode ser realizado em modo de bateladas, em modo de semi-bateladas ou continuamente. Nutrientes podem ser introduzidos inicialmente no início da fermentação ou podem ser introduzidos subseqüentemente de uma maneira semicontínua ou contínua. As enzimas podem ser isoladas dos organismos por meio do processo descrito nos exemplos ou usadas na reação como um extrato bruto.

Também são vantajosos processos para preparar recombinantemente polipeptídeos ou fragmentos biologicamente ativos funcionais dos mesmos, com um microorganismo produtor de polipeptídeo que está sendo cultivado, sendo que a expressão dos polipeptídeos é induzida, se desejado, e referidos polipeptídeos são isolados da cultura. Polipeptídeos também podem ser produzidos desta maneira numa escala industrial, se isto for desejado. O microorganismo recombinante pode ser cultivado e fermentado por meio de métodos conhecidos. Bactérias podem ser preparadas, por exemplo, em meio TB ou meio LB e a uma temperatura de 20 a 40°C e um pH de 6 a 9. Condições de cultura vantajosas são descritas detalhadamente, por exemplo, em T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Se os polipeptídeos não forem secretados no meio de cultura, as células serão então rompidas e o produto obtido do lisado por meio de processos conhecidos de isolamento de proteínas. As células podem ser disrompidas, conforme desejado, por meio de ultrassom de alta freqüência, por meio de pressão elevada, como, por exemplo, em uma célula de pressão Francesa, por meio de osmólise, pela ação de detergentes, enzimas líticas ou solventes orgânicos, por meio de homogeneizadores ou por meio de uma combinação de dois ou mais dos processos listados.

Polipeptídeos podem ser purificados usando-se métodos cromatográficos conhecidos, como cromatografia com peneiras moleculares (filtração em gel), como cromatografia em Q Sepharose, cromatografia de troca de íon e cromatografia hidrofóbica, e também usando-se outros métodos usuais, como ultrafiltração, cristalização, dessalinização, diálise e eletroforese em gel nativa. Processos vantajosos são descritos, por exemplo, em Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York ou em Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelber g, Berlin.

Pode ser vantajoso isolar a proteína recombinante por meio do uso de sistemas de vetor ou oligonucleotídeos que estendem o cDNA por meio de seqüências de nucleotídeos particulares e, com isso, codificam para proteínas de fusão ou polipeptídeo alterados que são usados, por exemplo, para simplificar a purificação. Exemplos de modificações vantajosas deste tipo são marcadores que atuam como âncoras, como a modificação conhecida como a âncora hexa-histidina, ou epitopos que podem ser reconhecidos como antígenos por parte de anticorpos (como descrito, por exemplo, em Harlow, E. e Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Outros marcadores vantajosos são, por exemplo, HA, calmodulina-BD, GST, MBD; quitina-BD, etapatavidina-BD-avi-tag, Flag- tag, T7 etc. Estas âncoras podem ser usadas para ligar as proteínas a um suporte sólido, como uma matriz de polímero, por exemplo, que pode ser empacotada, por exemplo, em uma coluna de cromatografia, ou pode ser usada em uma placa de microtitulação ou sobre outro suporte. Os protocolos de purificação correspondentes podem ser obtidos de fornecedores de marcadores de afinidade comerciais.

As proteínas preparadas como descrito podem ser usadas diretamente como proteínas de fusão ou, após remoção por clivagem e remoção da porção de parceiro de fusão, como hidrofobinas "puras".

Quando se pretende a remoção da porção de parceiro de fusão é aconselhável incorporar um sítio de clivagem potencial (sítio de reconhecimento específico para proteases) na proteína de fusão entre a porção hidrofobina e a porção de parceiro de fusão. Referidos sítios de clivagem vantajosos incluem, em particular, aquelas seqüências de peptídeos que, de outra forma, não ocorrem na porção hidrofobina nem na porção de parceiro de fusão, como é facilmente determinado por meio de ferramentas da bioinformática. São particularmente vantajosos, por exemplo, a clivagem de BrCN na metionina ou clivagem mediada-com-protease com fator Xa, clivagem de enteroquinase, trombina, clivagem com TEV (protease do vírus da cicatriz do tabaco). As superfícies que, de acordo com a presente invenção, devem ser tratadas com hidrofobinas compreendem a superfície de um material selecionado do grupo de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica. Referidas superfícies são encontradas, em particular, no setor de construção de edificações, tanto em interiores e em exteriores.

Materiais construtivos minerais endurecidos para os fins desta invenção são massas similares a rocha obteníveis por meio de misturação de materiais construtivos essencialmente inorgânicos com água e cura subseqüente devido a reações químicas e/ou físicas. Os materiais de partida são materiais construtivos de cura hidráulica que curam tanto ao ar como na água, ou materiais construtivos de cura ao ar, que só se curam ao ar. Os materiais construtivos podem compreender adicionalmente materiais construtivos de cura com vapor, por exemplo.

Exemplos de referidos materiais construtivos curados compreendem, em particular, concreto ou argamassa, cada um obteníveis de cimentos, como cimento Portland, cimento de alumina ou cimento Puzzolano e suas misturas com agregados brutos, como areia, brita ou materiais expandidos, e também água. Eles podem compreender, de maneira conhecida, outros materiais auxiliares inorgânicos e/ou orgânicos, como superplastificantes de concreto, por exemplo. Exemplos adicionais de materiais construtivos curados compreendem gesso, cal ou adornos para aplicações em interiores e exteriores.

Pedra natural compreende rocha naturalmente ocorrente, como arenito, granito, gnaisse, ardósia, cal ou mármore. Estes tipos de rocha podem ser usados não só como rocha fragmentada em uma forma irregular, mas também em forma de componentes estruturais moldados, por exemplo, como pedra para construções, batentes, degraus, parapeitos, marcos de porta, placas para acabamento de superfície, placas para piso, placas para telhados, elementos decorativos ou esculturas.

Pedra artificial compreende componentes estruturais que podem ser usados de maneira análoga à pedra natural, mas que não provêm de fontes naturais, mas que geralmente são fabricados industrialmente. Exemplos compreendem azulejos, clínquer, tijolo de areia e cal, bloco de concreto, bloco de concreto aerado ou bloco de argila expandido.

O termo "cerâmica" é conhecido, em princípio, por alguém com prática na arte. Cerâmica é uma designação coletiva para artigos preparados de compostos inorgânicos não-metálicos e normalmente tornados de pronto emprego mediante operações a alta temperatura.

Cerâmicas podem ser materiais cerâmicos de argila, apresentando pelo menos 20 % em peso de mineral de argila na mistura bruta, e materiais cerâmicos de especialidade, que são isentos de mineral de argila ou que só apresentam um baixo teor de mineral de argila. Cerâmicas podem ser finas ou brutas, porosas ou densas. Materiais de cerâmica, como em princípio se saberá, podem apresentar vitrificados. Os vitrificados podem ser coloridos e também incolores.

Exemplos de materiais cerâmicos de argila compreendem artigos cerâmicos estruturais, como clínquer ou tijolo para paredes de alvenaria, manilhas de argila, tijolo chamota, telhas, produtos de cerâmica, produtos de barro, produtos de calcáreo, produtos de feldspato, produtos de pedra, porcelana dura, porcelana mole ou telhas, que também podem ser vitrificados.

Exemplos de artigos cerâmicos de especialidade compreendem rocha de sílica, carbeto de silício ligado a argila, pedra artificial fundida, isoladores de óxido cerâmico, filtros de cerâmica, materiais de cerâmica- carbeto, eletrocerâmicas, magneto-cerâmicas ou cerâmicas dentais.

Detalhes adicionais referentes a cerâmicas podem ser encontrados, por exemplo, em Büchner et al., "Industrielle Anorganische Chemie VCH Verlag, Weinheim, New York 1986, páginas de 431 a 476.

As superfícies podem ser constituídas de vários materiais diferentes. Um exemplo é uma parede azulejada compreendendo uma superfície constituída de azulejos cerâmicos e argamassa para azulejos. As superfícies podem compreender adicionalmente tipos diferentes de materiais, por exemplo, partes de metal embutidas.

É possível usar hidrofobinas em substância quando elas são usadas de acordo com a presente invenção para tratar as superfícies mencionadas. De preferência, contudo, as hidrofobinas são usadas como formulações ou composições em pelo menos um solvente vantajoso.

A escolha de hidrofobinas para concretizar a invenção não é restrita. E possível usar uma hidrofobina ou então uma pluralidade de hidrofobinas diferentes. Uma pessoa versada na arte será capaz de realizar uma escolha apropriada. Por exemplo, é possível usar proteínas de fusão, como, por exemplo, yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) ou yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21), sendo que neste caso o parceiro de fusão yaad também pode encontrar-se em um estado encurtado.

Os solventes para formulações podem compreender água e/ou solventes orgânicos. Também é possível usar misturas de solventes. A identidade do solvente depende, por exemplo, da hidrofobina, da identidade da superfície a ser tratada e também do uso, e é selecionada apropriadamente por alguém versado na arte.

O solvente compreende, de preferência, água ou misturas de água e solventes orgânicos miscíveis em água. Exemplos de referidos solventes orgânicos compreendem alcoóis poliídricos ou monoídricos miscíveis em água, por exemplo, metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, etileno glicol, propileno glicol ou glicerol. Alcoóis de éter também são uma possibilidade. Exemplos compreendem éteres de monoalquila de (poli)etileno ou (poli)propileno glicóis, como monobutil éter de etileno glicol. A identidade e a quantidade dos solventes orgânicos solúveis em água podem ser selecionadas por alguém versado na arte.

Para preparar a composição usada de acordo com a presente invenção, pode ser preferível empregar as soluções aquosas de hidrofobina como sintetizadas, como isoladas e/ou como purificadas. Estas ainda podem compreender, dependendo de sua pureza, resíduos de auxiliares da síntese. Mas também é possível isolar as hidrofobinas inicialmente como substância, por exemplo, por meio de secagem por congelamento, e formulá-las apenas em uma segunda etapa.

A quantidade de hidrofobina na formulação pode ser determinada por alguém versado na arte de acordo com a identidade da superfície e/ou o uso planejado. No entanto, até mesmo quantidades relativamente pequenas são suficientes para proporcionar um efeito repelente de sujeira. Verificou-se que uma quantidade de 0,0001 % a 1 % em peso baseada na soma total de todos os constituintes da formulação é satisfatória sem restringir a invenção a esta faixa. A quantidade situa-se, de preferência, na faixa de 0,0005 % a 0,5 % em peso e, mais preferivelmente, na faixa de 0,001 % a 0,1 % em peso.

Opcionalmente a formulação pode compreender adicionalmente componentes, por exemplo, materiais de mistura e/ou auxiliares. Exemplos de referidos componentes compreendem em particular tensoativos, por exemplo, tensoativos aniônicos, não-iônicos, anfóteros e/ou catiônicos. Exemplos de materiais de mistura adicionais compreendem ácidos ou bases, por exemplo, ácidos carboxílicos ou amônia, sistemas tamponadores, polímeros, partículas inorgânicas, como SiO2 ou silicatos, corantes ou biocidas.

De acordo com a presente invenção, a superfície é tratada por meio de contato da superfície com hidrofobina ou com uma composição compreendendo pelo menos uma hidrofobina e também pelo menos um solvente.

O contato pode ser efetuado, por exemplo, por meio de pulverização, escovamento ou calandragem ou, então, por meio de imersão de todo o artigo na formulação. Naturalmente, este último só é possível com artigos que não foram instalados. O tempo de tratamento é decidido por alguém versado na arte. Ele pode durar de alguns segundos até várias horas. Após tratamento, a superfície pode ser enxaguada, com água por exemplo, para remover o excesso de solução de tratamento.

O tratamento também pode ser efetuado em combinação com uma limpeza da superfície. Isto é realizado usando-se a composição limpadora compreendendo pelo menos uma hidrofobina, pelo menos um tensoativo e também pelo menos um solvente.

O tratamento pode ser realizado a temperaturas abaixo da temperatura ambiente, à temperatura ambiente ou temperaturas elevadas, por exemplo, a de 20 a 100°C, de preferência, de 20 a 60°C.

Após tratamento com a composição, a superfície tratada é secada. A secagem da superfície tratada pode ocorrer quase por si só à temperatura ambiente, ou a secagem também pode ser realizada a temperaturas elevadas.

O tratamento e também, se apropriado, a secagem da superfície pode ser seguida de um pós-tratamento térmico da superfície a temperaturas elevadas, por exemplo, a temperaturas de até 120°C. O pós- tratamento térmico também pode ser realizado combinado com a secagem. As temperaturas de pós-tratamento térmico encontram-se, de preferência, na faixa de 30 a 100°C, mais preferivelmente na faixa de 40 a 80°C e, por exemplo, na faixa de 50 a 70°C. O tempo de tratamento é decidido por alguém versado na arte, ele pode situar-se na faixa de 1 min a 10 h, por exemplo. O pós-tratamento térmico pode ser efetuado, dependendo da natureza do tratamento, por exemplo, por meio de irradiação da superfície com um radiador de IR ou sopragem com fluxos de ar quente.

O processo da presente invenção proporciona uma superfície selecionada do grupo que consiste de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmicas que compreende um evestimento compreendendo pelo menos uma hidrofobina. O revestimento compreende geralmente pelo menos uma camada monomolecular de hidrofobina sobre a superfície.

O tratamento de acordo com a presente invenção proporciona pelo menos um efeito repelente de sujeira e/ou hidrofobizante e/ou conservante. No caso geral, obtém-se pelo menos dois dos benefícios, em particular hidrofobização combinada e repelência de sujeira. As hidrofobinas apresentam um efeito distinto mesmo em quantidades pequenas. No caso geral, tratamento com uma composição compreendendo apenas 0,01 % em peso de hidrofobinas levará a uma alteração efetiva na superfície.

O efeito repelente de sujeira pode ser determinado por meio de métodos conhecidos em princípio, por exemplo, comparando-se a capacidade de desprendimento de sujeira por meio de enxágüe com água, no caso de uma superfície não tratada contra uma superfície tratada com hidrofobinas. O grau de hidrofobização pode ser determinado de uma maneira conhecida medindo- se o ângulo de contato.

O tratamento de acordo com a presente invenção é particularmente útil para superfícies cerâmicas, como azulejos, por exemplo, em que se obtém tanto um efeito repelente de sujeira como também um efeito hidrofobizante. Esta é uma vantagem significativa, particularmente em recintos úmidos, como banheiros, por exemplo.

Os exemplos a seguir ilustram a invenção:

Parte A:

Preparação e teste de hidrofobinas usadas de acordo com invenção Exemplo 1

Trabalho preliminar para a clonagem de yaad-His J yaaE-His^ Realizou-se uma reação em cadeia de polimerase com o auxílio dos oligonucleotídeos Hal570 e Hal571 (Hal 572/ Hal 573). O modelo de DNA usado foi DNA genômico da bactéria Bacillus subtilis. O fragmento de PCR obtida compreendeu a seqüência codificante do gene de Bacillus subtilis yaaD / yaaE e, em suas pontas, em cada caso um sítio de clivagem de restrição NcoI e, respectivamente, BgIII. O fragmento de PCR foi purificado e cortado com as endonucleases de restrição NcoI e BgIII. Este fragmento de DNA foi usado como inserto e clonado no vetor pQE60 da Qiagen, que havia sido linearizado previamente com as endonucleases de restrição NcoI e BgIII. Os vetores assim obtidos, pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5, podem ser usados para expressar proteínas que consistem de YAAD::HIS6 e YAAErrHISô, respectivamente.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

Exemplo 2

Clonagem de DewA-His^de hidrofobina yaad

Realizou-se uma reação em cadeia de polimerase com o oligonucleotídeo KaM 416 e KaM 417. O modelo de DNA usado foi DNA genômico do mofo Aspergillus nidulans. O fragmento de PCR obtido compreendeu a seqüência codificante do gene de hidrofobina dewA e um sítio de clivagem de proteinase de fator Xa N-terminal. O fragmento de PCR foi purificado e cortado com a endonuclease de restrição BamHL Este fragmento de DNA foi usado como inserto e clonado no vetor pQE60YAAD#2 previamente linearizado com a endonuclease de restrição BglII.

O vetor assim obtido, #508, pode ser usado para expressão de uma proteína de fusão consistindo de YAAD::Xa::dewA::HIS6. KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT CCGC

Exemplo 3

Clonagem de RodA-His^ de hidrofobina yaad O plasmídeo #513 foi clonada analogamente ao plasmídeo #508, usando-se os oligonucleotídeos KaM 434 e KaM 435. KaM434:

GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM43 5: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Exemplo 4

Clonagem de BASFl-His^de hidrofobina yaad O plasmídeo #507 foi clonada analogamente ao plasmídeo #508, usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418. O modelo de DNA empregado foi uma seqüência de DNA sintetizada artificialmente - hidrofobina BASFl (ver apêndice). KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAG TTCTCCGTCTCCGC KaM418:

CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Exemplo 5

Clonagem de BASF2-His^de hidrofobina yaad O plasmídeo #506 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508, usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418. O modelo de DNA empregado foi uma seqüência de DNA sintetizada artificialmente - hidrofobina BASF2 (ver apêndice). KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAG TTCTCCGTCTCCGC

KaM418:

CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Exemplo 6

Clonagem de SC3-His6de hidrofobina yaad

O plasmídeo #526 foi clonada analogamente ao plasmídeo #508, usando-se os oligonucleotídeos KaM464 e KaM465. O modelo de DNA empregado foi cDNA de Schyzophyllum commune (ver apêndice).

KaM464:

CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC

KaM465:

GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Exemplo 7

Fermentação do DewA-His6 de hidrofobina yaad da cepa de E. coli recombinante

Inoculação de 3 ml de meio LB líquido com uma cepa de E. coli expressando DewA-His6 de hidrofobina yaad em tubos Greiner de 15 ml. Incubação em um agitador a 200 rpm a 37°C durante 8 h. Em cada caso, 2 frascos de Erlenmeyer com volume de 1 1 com defletores e 250 ml de meio LB (+ 100 μg/ml de ampicilina) foram inoculados com 1 ml de pré-cultura e incubadas em um agitador a 180 rpm a 37°C durante 9 h. Inocular 13,5 1 de meio LB (+100 μg/ml de ampicilina) com 0,5 1 de pré-cultura (OD600nm 1:10 medida contra H2O) em um fermentador de 20 1. A adição de 140 ml de 100 mM de IPTG a uma OD6Onm de -3,5. Após 3 h, resfriar o fermentador a 10°C e remover o caldo de fermentação por meio de centrifugação. Usar pellet de células para purificação adicional.

Exemplo 8 Purificação da proteína de fusão de hidrofobina recombinante (purificação de proteínas de fusão de hidrofobina apresentando um marcador His6 C-terminal)

100 g de pellet de células (100 - 500 mg de hidrofobina) foram constituídos com 50 mM tamponador de fosfato de sódio, pH 7,5, a um volume total de 200 ml e ressuspensos. A suspensão foi tratada com um Ultraturrax tipo T25 (Janke e Kunkel; IKA-Labortechnik) durante 10 minutos e subseqüentemente, para os fins de degradação dos ácidos nucleicos, incubada com 500 unidades de benzonase (Merck, Darmstadt; número de ordem 1.01697.0001) à temperatura ambiente durante 1 hora. Antes da disrupção de células, realizou-se uma filtração usando-se um cartucho de vidro (PI). Para os fins de disrupção das células e de cisalhamento do DNA genômico remanescente, realizou-se duas operações em homogeneizador a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). O homogeneizado foi centrifugado (Sorvall RC-5B, GSA Rotor, béquer de centrifiigação de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g), o sobrenadante foi colocado sobre gelo e o pellet foi ressuspenso em 100 ml de tamponador de fosfato de sódio, pH 7,5. Centrifugação e ressuspensão foram repetidos três vezes, o tamponador de fosfato de sódio compreendendo 1 % SDS na terceira repetição. Após ressuspensão, a solução foi agitada durante uma hora, seguido de uma centrifugação final (Sorvall RC-5B, GSA Rotor, béquer de centrifugação de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g). De acordo com análise SDS-PAGE, a hidrofobina está presente no sobrenadante após a centrifugação final (Figura 1). Os experimentos mostram que a hidrofobina está presente nas células de E. coli correspondentes, provavelmente em forma de corpos de inclusão. 50 ml do sobrenadante contendo hidrofobina foram aplicados em uma coluna de 50 ml de níquel-Sepharose High Performance 17-5268-02 (Amersham) equilibrada com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0. A coluna foi lavada com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0, e a hidrofobina foi eluída subseqüentemente com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0, compreendendo 200 mM de imidazol. Com o objetivo de remover o imidazol, a solução foi dialisada contra 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0.

Figura 1 ilustra a purificação da hidrofobina preparada:

Faixa 1: solução aplicada em coluna de níquel- Sepharose (diluição a 1:10)

Faixa 2: perfluxo = eluído da etapa de lavagem

Faixas 3-5: picos a OD 280 de frações de eluição A hidrofobina da Figura 1 tem um peso molecular de aprox. 53 kD. Algumas das bandas menores representam produtos de degradação de hidrofobina.

Exemplo 9

Teste de desempenho; caracterização da hidrofobina por meio de alteração do ângulo de contato de uma gotícula de água sobre vidro Substrato:

Vidro (vidro de janela, Süddeutsche Glas, Mannheim, Alemanha):

Concentração de hidrofobina: 100 μg/ml

Incubação de lâminas de vidro de um dia para o outro (temperatura 80°C) em 50 mM acetato de sódio (pH 4) + 0,1 % em peso de Tween 20 seguido de lavagem das lâminas de vidro com revestimento de hidrofobina em água destilada seguido de incubação: 10 min / 80°C / 1 % em peso de solução aquosa de n-dodecil sulfato de sódio (SDS) em água destilada lavagem em água destilada

As amostras são secadas ao ar (temperatura ambiente) e submetidas à temperatura ambiente para uma determinação do ângulo de contato (em graus) de uma gotícula de 5 μl de água.

O ângulo de contato medição foi determinado em um sistema Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0, (novembro de 2002). A medição foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

Vidro não tratado deu um ângulo de contato de 30 ± 5o; um revestimento com a hidrofobina funcional do Exemplo 8 (yaad-dewA-his6) deu um ângulo de contato de 75 ± 5o.

Parte B:

Uso de hidrofobinas para revestimento repelente de sujeira sobre superfícies de cerâmica

Solução usada:

Os testes de desempenho foram realizados empregando-se uma solução-em-água da proteína de fusão yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) preparada de acordo com Exemplo 8. Concentração da hidrofobina em solução: 100 μg/ml (0,01 % em peso).

Superfície dura empregada:

Azulejo de cerâmica, branco brilhante, 10 cm χ 15 cm (da Novocker), limpado com etanol e água.

Sujeira usada:

Os testes foram realizados empregando sujeira de lastro IKW (de acordo com Seifen, Fette, Õle, Wachse (SÕFW) -Journal, Volume 124, 14/98, página 1029)

Método de tratamento

Um azulejo continha 2 g da solução aquosa de hidrofobina mencionada acima apresentando uma concentração de 100 μg/ml aplicada por gotejamento sobre o mesmo (1,3 μπι de hidrofobina/cm ) e distribuída cuidadosamente com um pano para cobrir toda a superfície. O azulejo foi deixado descansar para secar ao ar durante 24 h.

Em seguida, o azulejo foi enxaguado com água e colocado durante 3x10 min em um béquer de vidro com água. Usou-se água fresca em cada enxágüe. Em seguida, o azulejo foi deixado de pé para secar ao ar.

Medição do ângulo de contato e efeito repelente de sujeira O azulejo tratado deu uma medição de ângulo de contato contra uma gotícula de água de 56° (média de 10 medições). Para comparação, um azulejo não tratado apresenta um ângulo de contato de 20°. Assim, o azulejo fôra hidrofobizado nitidamente.

O azulejo tratado e, em comparação, um azulejo não tratado, foram manchados individualmente com 50, 100 e 200 μg de sujeira de lastro IKW empregando-se uma pipeta de transferência e deixados secar à temperatura ambiente durante uma hora.

Os azulejos foram então enxaguados 3 vezes com 500 ml de água a cada vez. Embora isto não tenha desprendido a sujeira da superfície não tratada, observou-se desprendimento parcial da sujeira da superfície não tratada no caso do azulejo previamente tratado com hidrofobina.

Assim, o pré-tratamento com hidrofobina levou a uma reduzida adesão da sujeira sobre a superfície do azulejo.

Designação de nomes de seqüências para DNA e seqüências de polipeptídeos na listagem de seqüências <table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Aktiengesellschaft

<120> USO DE HIDROFOBINAS ' PARA TRATAMENTO DE SUPERFÍCIE DE MATERIAIS CONSTRUTIVOS MINERAIS ENDURECIDOS, ROCHA NATURAL, PEDRA ARTIFICIAL E CERÂMICAS

<130> PF 56486

<160> 24

<170> PatentIn versão 3.1 <210> 1 <211> 405 <212> DNA <213> basf-dewA <220>

<221> CDS <222> (1)..(405) <223> <4 00> 1

atg cgc ttc ate gtc tet ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48

Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 15 10 15

acc gcc ctc ccg gcc tet gcc gea aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96

Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30

gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144

Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45

ate gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192

Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60

age ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240

Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80

ggc age gcc tgc gcc aag gcg age ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288

Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu 85 90 95

gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc 336

Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val 100 105 110

gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384

Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125 ggc gct ggt acc aag gct gag 405

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> basf-dewA

<400> 2

Met Arg Phe Ile 1

Thr Ala Leu Pro 20

Ala Ala Phe Ala 35

Ile Ala Cys Cys 50

Ser Gly Leu Leu 65

Gly Ser Ala Cys

Ala Leu Val Asp 100

Ala Cys Cys Pro 115

Gly Ala Gly Thr 130

<210> 3

<211> 471

<212> DNA

<213> basf-rodA

<220>

<221> CDS <222> (1)..(471) <223> <4 00> 3

atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48

Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 15 10 15

Val Ser Leu Leu Ala Phe 5 10

Ala Ser Ala Ala Lys Asn 25

Lys Gln Ala Glu Gly Thr 40

Asn Ser Pro Ala Glu Thr 55

Gly Ala Gly Leu Leu Asn 70

Ala Lys Ala Ser Leu Ile 85 90

His Thr Glu Glu Gly Pro 105

Glu Gly Thr Thr Asn 120

Lys Ala Glu

Thr Ala Ala Ala Thr Ala 15

Ala Lys Leu Ala Thr Ser 30

Thr Cys Asn Val Gly Ser 45

Asn Asn Asp Ser Leu Leu 60

Gly Leu Ser Gly Asn Thr 75 80

Asp Gln Leu Gly Leu Leu 95

Val Cys Lys Asn Ile Val 110

Val Ala Val Asp Asn Ala 125 gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96

Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30

ggc aac aag ggc aac age aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144

Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45

acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tet 192

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<211> 157

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<211> 119

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 13

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<400> 15

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Met Gln Glu Arg Gly Trp 290

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<212> DNA

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<221> CDS <222> (1) .. (591) <223> <400> 17

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Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr 180

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys 195 200

Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 185 190

Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285

Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300

Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320

Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335

Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly 340 345 350

Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365

Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380

Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln 385 390 395 400

Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln 405 410 415

Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 420 425 430

Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445

Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460

His His His His His 465

Claims (9)

1. Uso de hidrofobinas, caracterizado pelo fato de que é para tratar superfícies de um material selecionado do grupo que consiste de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido tratamento é realizada usando-se uma composição compreendendo um solvente e também pelo menos uma hidrofobina.

3. Processo para tratar superfícies compreendendo contactar referida superfície com pelo menos uma hidrofobina, caracterizado pelo fato de que referida superfície compreende a superfície de um material selecionado do grupo que consiste de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmicas.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que referido tratamento é realizada usando-se uma composição compreendendo um solvente e também pelo menos uma hidrofobina.

5. Processo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que referido solvente compreende água.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de -3 a 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade de hidrofobina em referida composição situa-se na faixa de 0,0001 % a 1 % em peso com base na soma total de todos os constituintes de referida formulação.

7. Superfície revestida com pelo menos uma hidrofobina, caracterizada pelo fato de que referida superfície compreende a superfície de um material selecionado do grupo de materiais construtivos minerais endurecidos, pedra natural, pedra artificial ou cerâmica.

8. Superfície revestida de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é repelente à sujeira.

9. Superfície revestida de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que é hidrofobizada.