ES2345627T3 - Uso de hidrofinas para el tratamiento superficial de materiales minerales de construccion endurecidos, piedra natural, piedra artificial y ceramicas. - Google Patents
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Abstract
Uso de hidrofobinas para el tratamiento de superficies, caracterizado porque las superficies son superficies de un material seleccionado del grupo de materiales de construcción minerales endurecidos, piedra natural, piedra artificial o cerámica.
Description
Uso de hidrofobinas para el tratamiento
superficial de materiales minerales de construcción endurecidos,
piedra natural, piedra artificial y cerámicas.
La presente invención se refiere al uso de
hidrofobinas para el tratamiento de la superficie de materiales
minerales endurecidos para la construcción, piedra natural, piedra
artificial o cerámica, un método para el tratamiento de superficies
de este tipo así como superficies de materiales minerales
endurecidos para construcción, piedra natural, piedra artificial o
cerámica que tienen un recubrimiento que comprende hidrofobinas.
Es conocido proveer superficies con
recubrimientos en la zona interior y exterior que deben mejorar la
durabilidad y/o la apariencia de la superficie. Revestimientos de
este tipo deben actuar, por ejemplo, de manera conservante, repeler
humedad, impedir contaminaciones o hacer posible una limpieza más
fácil de la superficie.
En este caso se trata de recubrimientos
permanentes, como por ejemplo recubrimientos inspirados en el efecto
del loto, tal como se divulga en EP-A 933 388.
También puede tratarse de una protección
temporal. Un efecto repelente de suciedad, temporal, de este tipo,
puede lograrse mediante sustancias en una formulación de limpieza
las cuales se aplican al limpiar las superficies. Aquí puede
tratarse, por ejemplo, de limpiadores para baldosas.
WO 03/002620 divulga el uso de ésteres
dialquilaminoalquilo de ácido (met)acrílico como polímeros de
soil-release (despegar suciedad) para superficies
duras, por ejemplo pisos de piedra fina o superficies de acero
inoxidable. Las formulaciones divulgadas contienen 0,1 a 5% en peso
del polímero.
DE-A 100 61 897 divulga agentes
de limpieza que contienen partículas hidrófilas con contenido de
silicato, los cuales conducen a un desprendimiento mejorado de la
mugre junto con una disminución simultánea del
re-ensuciamiento. Las partículas se almacenan sobre
la superficie de los materiales a limpiar y modifican así las
propiedades de la superficie.
Las hidrofobinas son pequeñas proteínas de
aproximadamente 100 a 150 aminoácidos, las cuales son
características para hongos filamentosos como, por ejemplo,
schizophyllum commune. Regularmente tienen 8 unidades de
cisteína.
Las hidrofobinas tienen una afinidad
sobresaliente hacia las áreas de interfase y son adecuadas por esto
para el recubrimiento de superficies. De esta manera es posible, por
ejemplo, recubrir teflón mediante hidrofobinas y se obtiene una
superficie hidrófila.
Las hidrofobinas pueden aislarse de fuentes
naturales. Aunque también pueden aislarse hidrofobinas que no tienen
procedencia natural mediante procesos de producción químicos o
biotecnológicos. Nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4
divulga un proceso de producción para hidrofobinas que no existen en
la naturaleza.
En el estado de la técnica se propone el uso de
hidrofobinas para diversas aplicaciones.
WO 96/41882 propone el uso de hidrofobinas como
emulsionantes, espesantes, sustancias tensioactivas, para
hidrofilizar superficies hidrófobas, para el mejoramiento de la
resistencia al agua de sustratos hidrófilos, para la producción de
emulsiones aceite-en-agua o de
emulsiones agua-en-aceite.
Adicionalmente se proponen aplicaciones farmacéuticas como la
producción de ungüentos o cremas, así como aplicaciones cosméticas
como protección de la piel o la producción de champús para el pelo
o enjuagues para el cabello.
EP-A 1 252 516 divulga el
recubrimiento de ventanas, lentes de contacto, biosensores,
dispositivos médicos, recipientes para realizar experimentos o para
el almacenamiento, cascos de barcos, partículas sólidas o marcos o
carrocerías de vehículos de pasajeros con una solución que contiene
hidrofobinas a una temperatura de 30 a 80ºC.
WO 03/53383 divulga el uso de hidrofobina para
tratar materiales de queratina en aplicaciones cosméticas.
WO 03/10331 divulga un sensor recubierto con
hidrofobina, por ejemplo un electrodo de medición al cual están
enlazadas otras sustancias, por ejemplo sustancias
electro-activas, anticuerpos o enzimas.
Ninguno de los documentos citados divulga el
tratamiento de superficie de materiales minerales de construcción,
piedra natural, piedra artificial o cerámicas.
Era objetivo de la invención suministrar
técnicas novedosas para el tratamiento de superficies de este tipo,
con las cuales puede lograrse al menos un efecto repelente de
suciedad y/o hidrofobizante y/o conservante.
En correspondencia con esto se ha encontrado el
uso de hidrofobinas para el tratamiento de superficies y las
superficies son las superficies de un material seleccionado del
grupo de materiales minerales endurecidos de construcción, piedra
natural, piedra artificial o cerámica. En una modalidad preferida
para esto se usa una formulación de una hidrofobina y al menos un
solvente.
En un segundo aspecto se ha encontrado un método
para tratar superficies en el que se pone en contacto la superficie
con al menos una hidrofobina, y la superficie es la superficie de un
material seleccionado del grupo de materiales minerales,
endurecidos, de construcción, piedra natural, piedra artificial o
cerámicas.
En un tercer aspecto de la invención se han
encontrado superficies de materiales minerales endurecidos de
construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámica,
recubiertos con al menos una hidrofobina.
De manera sorprendente se encontró que
cantidades extremadamente pequeñas de hidrofobinas son ya
suficientes para un tratamiento efectivo repelente de mugre y/o
hidrofobizante y/o conservante de las superficies de materiales
minerales endurecidos para construcción, piedras o cerámicas. En
detalle, para la invención debe realizarse lo siguiente:
Según la invención, para el tratamiento de la
superficie de materiales minerales endurecidos para construcción,
piedra natural, piedra artificial o cerámicas, se usa al menos una
hidrofobina. Obviamente también puede emplearse una mezcla de varias
hidrofobinas diversas.
Por el término "hidrofobinas" en el sentido
de esta invención en lo sucesivo deben entenderse polipéptidos de la
fórmula estructural general (I)
(I)X_{n}-C^{1}-X_{1-50}-C^{2}-X_{0-5}-C^{3}-X_{1-100}-C^{4}-X_{1-100}-C^{5}-X_{1-50}-C^{6}-X_{0-5}-C^{7}-X_{1-50}-C^{8}-X_{m}
Donde X puede representar cada uno de los 20
aminoácidos existentes en la naturaleza (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys,
Trp, Pro, His, Gin, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu,
Gly). En este caso, X pueden ser respectivamente iguales o
diferentes. Aquí, los índices que se encuentran en X representan
respectivamente el número de los aminoácidos, C representa
cisteína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, y al
menos cuatro de los aminoácidos nombrados con C representan
cisteína, y los índices n y m representan independientemente uno de
otro números naturales de 0 y 500, preferible de 15 a 300.
Los polipéptidos según la fórmula (I) se
caracterizan adicionalmente por la propiedad de que a temperatura
ambiente, después de recubrir una superficie de vidrio provocan un
aumento del ángulo de contacto de una gota de agua de al menos 20º,
preferible de al menos 25º, particularmente preferible de al menos
30º, y muy particularmente preferible de al menos 35º,
respectivamente comparado con el ángulo de contacto de una gota de
agua de igual tamaño con la superficie sin recubrir.
Los aminoácidos nombrados con C^{1} a C^{8}
son preferiblemente cisteínas; aunque también pueden reemplazarse
por otros aminoácidos de volumen similar, preferible por alanina,
serina, treonina, metionina o glicina. Sin embargo, al menos
cuatro, preferible al menos 5, particularmente preferible al menos 6
y especialmente al menos 7 de las posiciones C^{1} a C^{8}
deben consistir en cisteínas. Las cisteínas en las proteínas según
la invención pueden estar presentes en forma reducida o pueden
formar, unas con otras, puentes de disulfuro. Particularmente se
prefiere la formación intramolecular de puentes C-C,
especialmente aquella con al menos uno, preferible 2,
particularmente preferible 3 y muy particularmente preferible 4
puentes intramoleculares de disulfuro. En el intercambio descrito
arriba de cisteínas por aminoácidos de volumen similar, se
intercambian en pares ventajosamente aquellas posiciones de C que
pueden formar, unas con otras, puentes intramoleculares de
disulfuro.
Cuando también se usan cisteínas, serinas,
alaninas, glicina, metioninas o treoninas en las posiciones
designadas con X, la numeración de las posiciones C individuales en
las fórmulas generales puede cambiar de manera correspondiente.
Para la realización de la presente invención se
prefiere usar hidrofobinas de la fórmula general (II)
(II)X_{n}-C^{1}-X_{3-25}-C^{2}-X_{0-2}-C^{3}-X_{5-50}-C^{4}-X_{2-35}-C^{5}-X_{2-15}-C^{6}-X_{0-2}-C^{7}-X_{3-35}-C^{8}-X_{m}
donde X, C y los índices ubicados
en X tienen el significado de arriba, los índices n y m representan
números entre 0 y 300, y las proteínas se distinguen adicionalmente
por la modificación de ángulo de contacto arriba
mencionada.
\vskip1.000000\baselineskip
Particularmente se prefiere emplear hidrofobinas
de la fórmula general (III)
(III)X_{n}-C^{1}-X_{5-9}-C^{2}-C^{3}-X_{11-39}-C^{4}-X_{2-23}-C^{5}-X_{5-9}-C^{6}-C^{7}-X_{6-18}-C^{8}-X_{m}
donde X, C y los índices ubicados
en X tienen el significado de arriba, los índices n y m representan
números entre 0 y 200, y las proteínas se distinguen además por la
modificación de ángulo de contacto arriba mencionada y, además, al
menos 6 de los aminoácidos nombrados con C son
cisteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Particularmente se prefiere que todos los
aminoácidos C sean cisteína.
Los residuos X_{n} y X_{m} pueden ser
secuencias de péptidos que también están enlazadas de manera natural
con una hidrofobina. Uno o ambos residuos también pueden ser
secuencias de péptidos que no están conectados de manera natural
con una hidrofobina. Por éstos también deben entenderse aquellos
residuos X_{n} y/o X_{m} en los que una secuencia de péptidos
que tiene lugar de manera natural en una hidrofobina se alarga
mediante una secuencia que tiene lugar de una manera no natural en
una hidrofobina.
Si X_{n} y/o X_{m} son secuencias de
péptidos que tienen lugar de manera no natural en hidrofobinas, la
longitud de secuencias de tal tipo son regularmente de al menos 20,
preferible de al menos 35, particularmente preferible de al menos
50 y muy particularmente preferible de al menos 100 aminoácidos. Un
residuo de este tipo, no enlazado con una hidrofobina de manera
natural también debe denominarse en lo sucesivo como contraparte de
fusión. Con esto debe expresarse que las proteínas se componen de
una parte de hidrofobina y una parte de la contraparte de fusión,
que no tie-
nen lugar juntas en esta forma en la naturaleza. Proteínas de este tipo también deben denominarse proteínas de fusión.
nen lugar juntas en esta forma en la naturaleza. Proteínas de este tipo también deben denominarse proteínas de fusión.
La parte de la contraparte de fusión puede
seleccionarse de un gran número de proteínas. Varias contrapartes
de fusión también pueden enlazarse con una parte de hidrofobina, por
ejemplo en el extremo amino (X_{n}) y en el extremo carboxilo
(X_{m}) de la parte de hidrofobina. Pero también pueden enlazarse,
por ejemplo, dos contrapartes de fusión con una posición (X_{n} o
X_{m}) de la proteína según la invención.
Contrapartes de fusión particularmente adecuados
son polipéptidos que tienen lugar de manera natural en
microorganismos, especialmente en E. coli o Bacillus
subtilis. Ejemplos de tales contrapartes de fusión son las
secuencias yaad (SEQ ID NO: 15 y 16), yaae (SEQ ID NO: 17 y 18) y
tioredoxina. También son bien adecuados fragmentos o derivados de
estas secuencias nombradas que comprenden solo una parte, preferida
70-99%, particularmente preferida
80-98% de las secuencias nombradas, o en las que se
modifican aminoácidos individuales, o nucleótidos frente a la
secuencia nombrada.
Las proteínas usadas según la invención también
pueden modificarse aún en su secuencia de polipéptidos, por ejemplo
mediante glicosilación, acetilación o también por entrelazamiento
transversal químico, por ejemplo con glutardialdehído.
Una propiedad de las proteínas usadas según la
invención es la modificación de propiedades superficiales cuando
las superficies se recubren con las proteínas. La modificación de
las propiedades de superficie puede determinarse experimentalmente
midiendo el ángulo de contacto de una gota de agua antes y después
del recubrimiento de una superficie con la proteína y estableciendo
la diferencia de ambas mediciones.
La realización de las mediciones de ángulo de
contacto son conocidas en principio para la persona técnica en la
materia. Las condiciones experimentales exactas se representan en la
parte experimental. Entre las condiciones allí nombradas, las
proteínas usadas según la invención poseen la propiedad de aumentar
el ángulo de contacto de una gota de agua sobre una superficie de
vidrio en al menos 20º, preferido al menos en 25º, particularmente
preferido al menos en 30º.
En la parte de hidrofobina de las hidrofobinas
conocidas hasta ahora se conservan las posiciones de los aminoácidos
polares y apolares, lo cual se manifiesta en una trama de
hidrofobicidad característica. Las diferencias en las propiedades
biofísicas y en la hidrofobicidad condujeron la clasificación de las
hidrofobinas hasta ahora conocidas en dos clases, I y II (Wessels
et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32,
413-437).
Las membranas ensambladas de hidrofobinas clase
I son insolubles en alto grado (solo en un 1% en SDS a temperatura
elevada) y solo pueden disociarse mediante ácido trifluoroacético
concentrado (TFA) o ácido fórmico. En contraste con éstos, las
formas ensambladas de hidrofobinas de clase II son menos estables.
Se disuelven ya por etanol al 60% o 1% de SDS (a temperatura
ambiente).
Una comparación de las secuencias de aminoácidos
muestra que la longitud de la región entre cisteínas C^{3} y
C^{4} es distintivamente más corta en hidrofobinas de clase II que
en hidrofobinas de clase I. Las hidrofobinas de clase II tienen
adicionalmente más aminoácidos cargados que las de clase I.
Hidrofobinas particularmente preferidas para la
realización de la presente invención son las hidrofobinas del tipo
dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, que se caracterizan
estructuralmente en el protocolo de secuencias que se sucede abajo.
Puede tratarse también solamente de partes o derivados de las
mismas. También es posible enlazar varias hidrofobinas, preferible
2 ó 3, de estructura igual o diferente, unas con otras y con una
secuencia de polipéptidos adecuada correspondiente, que no se
encuentra enlazada con una hidrofobina de manera natural.
Particularmente adecuadas para la realización de
la presente invención adicionalmente son las proteínas de fusión
con las secuencias de polipéptidos representadas en SEQ ID NO: 20,
22, 24, así como con las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican para éstas, especialmente las secuencias según SEQ ID NO:
19, 21, 23. Formas de realización particularmente preferidas
también son proteínas que resultan a partir de las secuencias de
polipéptidos representadas en SEQ ID NO. 20, 22 ó 24 mediante
intercambio, inserción o deleción de al menos uno hasta incluso 10,
preferible 5, particularmente preferible 5%, de todos los
aminoácidos, y que aún poseen la propiedad biológica de las
proteínas de partida en al menos 50%. Por propiedad biológica de las
proteínas se entiende aquí la modificación ya descrita del ángulo de
contacto en al menos 20º.
Los polipéptidos usados según la invención
pueden producirse químicamente por medio de métodos conocidos de la
síntesis de péptidos, por ejemplo mediante la síntesis de fases
sólidas según Merrifield.
Pueden aislarse hidrofobinas que tienen lugar de
manera natural a partir de fuentes naturales por medio de métodos
adecuados. A manera de ejemplo refiérase a Wösten et al.,
Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO
96/41882.
La producción de proteínas de fusión que tienen
lugar de una manera no natural pueden efectuarse de manera
preferida mediante métodos de ingeniería genética en los que una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la contraparte de
fusión y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la
parte de hidrofobina, especialmente una secuencia de ADN, se
combinan de tal manera que se genera la proteína deseada en un
organismo huésped mediante expresión génica de la secuencia
combinada de ácidos nucleicos. Un método de producción de tal tipo
se divulga en nuestra solicitud anterior de patente DE
102005007480.4.
Organismos huéspedes, adecuados (organismos de
producción) para el proceso de producción nombrado, pueden ser en
tal caso procariotas (incluyendo las Archaea) o eucariotas,
particularmente bacterias, inclusive halobacterias y metanococcus,
hongos, células de insectos, células vegetales, células de
mamíferos, particularmente preferible Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus
nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec.,
lactobacilos, Hansenula polymorpha, Trichoma reesei, SF9 (o
células relacionadas) entre otras.
En el marco de la presente invención pueden
emplearse constructos de expresión, obtenidos bajo el control
genético de secuencias de ácidos nucleicos regulatorias, una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido usado
según la invención y vectores que comprenden al menos uno de estos
constructos de expresión para la producción de hidrofobinas.
Los constructos usados comprenden
preferiblemente un promotor 5'-arriba de la
secuencia respectiva codificante y una secuencia de terminador
3'-debajo de la secuencia respectiva codificante así
como opcionalmente otros elementos regulatorios usuales, cada uno
enlazado de manera operativa a la secuencia codificante.
Por "enlace operativo" se entiende la
disposición secuencial de promotor, secuencia codificante,
terminador y opcionalmente otros elementos regulatorios de tal modo
que cada uno de los elementos regulatorios puede cumplir su
función en la expresión de la secuencia codificante según lo
prescrito.
Ejemplos de secuencias enlazables de manera
operativa son secuencias de reconocimiento (targeting) así como
intensificadores (enhancer), señales de poliadenilación y similares.
Otros elementos regulatorios comprenden marcadores seleccionables,
señales de amplificación, orígenes de replicación y similares.
Secuencias regulatorias adecuadas se describen, por ejemplo, en
Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,
Academic Press, San Diego, CA (1990).
Adicional a estas secuencias de regulación, la
regulación natural de estas secuencias aún puede estar presente
antes de los genes estructurales propios puede y opcionalmente
pueden haberse modificado genéticamente de modo que la regulación
natural se haya desconectado y se haya elevado la expresión de los
genes.
Un constructo de ácidos nucleicos preferidos
también contiene ventajosamente una o varias de las ya mencionadas
secuencias "enhancer" (intensificadoras), conectadas
funcionalmente con el promotor, las cuales hacen posible una
expresión elevada de la secuencia de ácidos nucleicos. También en el
extremo 3' de las secuencias de ADN puede insertarse secuencias
adicionales ventajosas como otros elementos regulatorios o
terminadores.
Los ácidos nucleicos pueden estar contenidos en
una o más copias en el constructo. En el constructo pueden estar
contenidos además otros marcadores como resistencias a antibióticos
o genes que complementan auxotrofía, opcionalmente para la selección
del constructo.
Secuencias de regulación ventajosas para el
método están contenidas, por ejemplo, en promotores como promotor
cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp-, lac-,
Ipp-lac, laclq-T7-, T5-, T3-, gal,
trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR o
imlambda-P, los cuales encuentran aplicación de
manera ventajosa en bacterias gram-negativas. Otras
secuencias de regulación ventajosas se encuentran contenidas, por
ejemplo, en los promotores gram-positivos amy y
SP02, en los promotores de levaduras u hongos ADC1,MFalpha, AC,
P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. También es
posible usar promotores artificiales para la regulación.
Para la expresión en un organismo huésped se
inserta ventajosamente el constructo de ácido nucleico en un
vector, como por ejemplo un plásmido o un fago, el cual hace posible
una expresión óptima del gen en el huésped. Por vectores también
deben entenderse, aparte de plásmidos y fagos, todos los otros
vectores conocidos para el técnico en la materia, es decir por
ejemplo virus como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus,
transposones, elementos IS, fasmidos, cosmidos y ADN lineales o
circulares, así como el sistema agrobacteria.
Estos vectores pueden replicarse de manera
autónoma o cromosomalmente en el organismo huésped. Estos vectores
representan otra modalidad de la invención. Plásmidos adecuados
están, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, pBR322,
pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2,
pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,
pIN-III''3-B1, tgt11 o pBdCI, en
Streptomyces plJ101, plJ364,plJ702 oplJ361, en Bacillus pUB110,
pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1,
plL2 o pBB116, en levaduras 2alpha, pAG-1, YEp6,
YEp13 o pEMBLYe23 o en vegetales pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o
pDH51. Los plásmidos nombrados representan una pequeña selección de
los plásmidos posibles. Otros plásmidos son conocidos por el
técnico en la materia y pueden tomarse, por ejemplo, del libro
Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier,
Amsterdam-New York-Oxford, 1985,
ISBN 0 444 904018).
El constructo de ácido nucleico para la
expresión de los otros genes contenidos contiene adicionalmente
secuencias regulatorias terminales 3' y/o 5'para el incremento de
la expresión los cuales se seleccionan para una expresión óptima de
según el organismo huésped seleccionado y el gen o los genes.
Estas secuencias regulatorias deben hacer
posible la expresión dirigida de los genes y de la expresión de
proteínas. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar,
por ejemplo, que solo después de la inducción se expresa o se
sobre-expresa el gen, o se expresa y/o se sobre
expresa inmediatamente.
Las secuencias regulatorias o los factores
pueden influenciar en tal caso preferentemente la expresión génica
de los genes introducidos y de esta manera elevarlos. Así puede
efectuarse un refuerzo de los elementos regulatorios ventajosamente
al nivel de transcripción usando señales de transcripción fuertes
como promotores y/o "enhancer" (intensificadores). Además,
también es posible un refuerzo de la traducción ("translation")
mejorando la estabilidad del ARNm, por ejemplo.
En otra forma de configuración del vector, el
vector que contiene el constructo de ácido nucleico o el ácido
nucleico también puede introducirse de manera ventajosa a los
microorganismos en forma de un ADN lineal e integrarse al genoma
del organismo huésped por recombinación heteróloga u homologa. Este
ADN lineal puede componerse de un vector linealizado tal como un
plásmido o solo de un constructo de ácido nucleico o del ácido
nucleico.
Para una expresión óptima de los genes
heterólogos en organismos es ventajoso modificar las secuencias de
ácidos nucleicos de manera correspondiente con el uso de codón
("codon usage") específico empleado. El "codon usage"
(uso de codón) puede establecerse fácilmente por medio de análisis
en ordenador de otros genes del organismo en cuestión.
La producción de un casete de expresión se
efectúa por medio de fusión de un promotor adecuado con una
secuencia codificante adecuada y una señal terminadora o de
poliadenilación. Para esto se usan técnicas corrientes de
recombinación y de clonación, tal como se describen, por ejemplo, en
T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1989) y en T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquist,
Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley
Interscience (1987).
El constructo recombinante de ácido nucleico o
el constructo génico, para la expresión en un organismo huésped
adecuado se inserta ventajosamente en un vector específico de
huésped que hace posible una expresión óptima del gen en el
huésped. Los vectores son bien conocidos para la persona técnica en
la materia y pueden inferirse de "Cloning Vectors" (Pouwels P.
H. et al., editorial Elsevier, Amsterdam-New
York-Oxford, 1985).
Con ayuda de los vectores son producibles los
microorganismos que se transforman, por ejemplo con al menos un
vector y pueden usarse para la producción de los polipéptidos usados
según la invención. De manera ventajosa los constructos
recombinantes arriba descritos se introducen a un sistema huésped y
se expresan. En este caso se usan los métodos corrientes de
clonación y transfección conocidos para la persona técnica en la
materia, como por ejemplo co-precipitación, fusión
de protoplastos, electroporación, transfección retroviral y
similares con el fin de hacer que se expresen los ácidos nucleicos
nombrados en el sistema respectivo de expresión. Se describen
sistemas adecuados, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular
Biology, F. Ausubel et al., editorial, Wiley Interscience,
New York 1997, o Sambrook et al. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
También son producibles microorganismos
recombinados de manera homóloga. Para esto se produce un vector que
contiene al menos un segmento de un gen usado según la invención o
de una secuencia codificante donde opcionalmente se ha introducido
al menos una deleción, adición o sustitución de aminoácido para
modificar la secuencia, por ejemplo para desbaratarla
funcionalmente (vector "knockout"). La secuencia introducida
también puede, por ejemplo, ser un homólogo de un microorganismo de
la familia o derivarse de una fuente de mamífero, de levadura o de
insectos. El vector usado para la recombinación homóloga puede
configurarse de manera alternativa para que el gen endógeno mute en
la recombinación homóloga o se modifique de alguna otra manera,
aunque aún codifique la proteína funcional (por ejemplo, la región
regulatoria puesta arriba puede estar modificada de tal forma que
se modifique la expresión de la proteína endógena). El segmento
modificado del gen usado según la invención está en el vector de
recombinación homólogo. La construcción de vectores adecuados para
la recombinación homóloga se describe, por ejemplo en Thomas, K. R.
y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.
Como organismos huésped recombinantes para el
ácido nucleico usado según la invención o el constructo de ácidos
nucleicos se toman en consideración en principio todos los
organismos procariótidos o eucoariótidos. Como organismos huéspedes
se usan ventajosamente microorganismos como bacterias, hongos o
levaduras. Ventajosamente se usan bacterias
gran-positivas o gran-negativas,
preferible bacterias de las familias de Enterobacteriaceae,
Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae,
particularmente preferible vacterias de los géneros Escherichia,
Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella,
Agrobacterium o Rhodococcus.
Los organismos usados en el proceso de preparar
proteínas de fusión se hacen crecer o se cultivan, dependiendo del
organismo huésped, de una manera conocida por la persona técnica en
la materia. Los organismos se hacen crecer usualmente en un medio
líquido que comprende una fuente de carbono, usualmente en forma de
azúcares, una fuente de nitrógeno, usualmente en forma de fuentes
de nitrógeno orgánicas tales como extracto de levadura o sales como
sulfato de amonio, microelementos (elementos en trazas) tales como
sales de hierro, sales de manganeso y sales de magnesio y,
opcionalmente, vitaminas, a temperaturas de entre 0 y 100ºC,
preferible entre 10 a 60ºC, con suministro de oxígeno. Aquí el
valor de pH del líquido nutriente puede mantenerse en un valor
fijo, es decir que puede regularse o puede no regularse durante el
cultivo. El cultivo puede efectuarse por lotes ("batch"), de
manera semi-continua o continua. Los nutrientes
pueden introducirse al inicio de la fermentación o alimentarse
después de manera semi-continua o continua. Las
enzimas pueden aislarse según el método descrito en los ejemplos o
usarse para la reacción como un extracto crudo.
Los polipéptidos usados según la invención, o
los fragmentos funcionales, biológicamente activos de los mismos,
pueden producirse por medio de un método recombinante en el que se
cultiva un microorganismo que produce polipéptidos, opcionalmente
induce la expresión de los polipéptidos y los aísla del cultivo. Los
polipéptidos también pueden producirse a gran escala industrial, si
se desea. El microorganismo recombinante puede cultivarse y
fermentarse según métodos conocidos. Las bacterias pueden
cultivarse, por ejemplo, en medio TB o LB y a una temperatura de 20
a 40ºC y un valor pH de 6 a 9. Condiciones de cultivo adecuadas se
describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E. F. Fritsch and J.
Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Si los polipéptidos no se secretan al medio de
cultivo, entonces se desintegran las células y se obtiene el
producto a partir del lisado mediante procesos conocidos para
aislamiento de proteínas. Las células pueden desintegrarse a
voluntad por medio de ultrasonido de alta frecuencia, por medio de
alta presión, como por ejemplo en una celda de presión French, por
osmólisis, por efecto de detergentes, enzimas líticas o solventes
orgánicos, mediante homogenizadores o por combinación de varios de
los métodos listados.
Una purificación de los polipéptidos puede
lograrse con métodos cromatográficos conocidos, como cromatografía
de tamices moleculares (filtración de gel), como cromatografía de
Q-sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y
cromatografía hidrofóbica, así como con otros métodos usuales como
ultrafiltración, cristalización, salificación, diálisis y
electroforesis con gel nativo. Métodos adecuados se describen, por
ejemplo, en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden (Métodos
bioquímicos de trabajo), Editorial Water de Gruyter, Berlín, New
York o en Scopes, R., Protein Purification, Editorial Springer, New
York, Heidelberg, Berlín.
Para el aislamiento de la proteína recombinante
también puede ser ventajoso usar el sistema de vectores o los
oligonucleótidos que alargan el ADNc en determinadas secuencias de
nucleótidos y con esto codifican para polipéptidos modificados o
proteínas de fusión que sirven para una purificación más sencilla,
por ejemplo. Modificaciones adecuadas de este tipo comprenden los
llamados "tags" (etiquetas) que fungen como anclas, como por
ejemplo la modificación conocida como ancla
hexa-histidina, o epítopes, que pueden reconocerse
como antígenos de los anticuerpos (descritos, por ejemplo, en
Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Otros tags (etiquetas) adecuados
son, por ejemplo, HA, calmodulina-BD, GST, MBD;
quitina-BD,
esteptavidina-BD-avi-tag,
Flag-tag, T7, etc. Estas anclas pueden servir para
adherir las proteínas a un soporte sólido tal como una matriz
polimérica, por ejemplo, que puede, por ejemplo, empacarse en una
columna cromatográfica o puede usarse en una placa de
microtitulación o en otro soporte. Los protocolos de purificación
correspondientes pueden obtenerse de los proveedores comerciales de
etiquetas de afinidad.
Las proteínas preparadas tal como se describe
pueden usarse ya sea directamente como proteínas de fusión o,
después de la disociación y de la remoción de la porción de la
contraparte de fusión, como hidrofobinas "puras".
Cuando se ha previsto una remoción de la
contraparte de fusión, se recomienda incorporar un sitio potencial
de escisión (sitio de reconocimiento específico para proteasas) a la
proteína de fusión entre la porción de hidrofobina y la porción de
contraparte de fusión. Como sitio de escisión son especialmente
adecuadas aquellas secuencias de péptidos que de otra manera no
existen ni en la parte de hidrofobina ni en la parte de la
contraparte de fusión, lo cual puede establecerse fácilmente con
herramientas informáticas. Particularmente adecuadas son, por
ejemplo, la escisión de BrCN en metionina o la escisión mediada por
proteasa con factor Xa, la escisión de enterocinasa, de trombina,
de TEV (proteasa de virus de tobacco etch (de ataque al
tabaco)).
Las superficies a tratar con hidrofobinas según
la invención son las superficies de un material seleccionado del
grupo de materiales minerales endurecidos para construcción, piedra
natural, piedra artificial o cerámica. Superficies de este tipo
pueden encontrarse especialmente en el campo de la construcción,
tanto en las zonas interiores como en las exteriores.
\newpage
Por "materiales de construcción minerales
endurecidos" en el sentido de esta invención deben entenderse las
composiciones del tipo piedra que pueden obtenerse mediante mezcla
de materias de construcción, esencialmente inorgánicos, con agua
seguida de curado o endurecimiento debido a reacciones químicas y/o
físicas. Los materiales de partida pueden ser materiales de
construcción de curado hidráulico que curan tanto al aire como en
agua, o materiales de construcción de curado al aire que solo curan
al aire. Adicionalmente pueden ser, por ejemplo, materiales de
construcción curados al vapor.
Ejemplos de materiales de construcción curados
de este tipo comprenden especialmente concreto o mortero que pueden
obtenerse de cementos tales como cemento Portland, cemento de
arcilla o cemento puzolánicos y sus mezclas con agregados gruesos
como arena, grava, gravilla o materiales expandidos, así como agua.
De una manera conocida y de un tipo conocido pueden comprender
además materiales auxiliares inorgánicos y/u orgánicos adicionales,
como por ejemplo agentes de licuefacción de concreto. Otros ejemplos
de materiales de construcción comprenden yeso, cal o enlucidos para
la zona interior y exterior.
Piedras naturales son piedras de procedencia
natural como gres, granito, gneis, pizarra, cal o mármol. Estas
pueden emplearse tanto como piedra de cantera en forma irregular
pero también en forma de piezas de construcción formadas, por
ejemplo como piedras de muro, alféizares de ventanas, peldaños de
escaleras, balaustradas, largueros de marcos de puerta, losas para
revestimientos, losas para pisos, losas para techos, elementos
decorativos o esculturas.
Piedras artificiales son piezas de construcción
que pueden usarse de manera análoga a las piedras naturales pero
que no proceden de fuentes naturales sino que se fabrican
regularmente en la industria. Los ejemplos comprenden ladrillos,
clinker (ladrillo refractario), ladrillos de cal y arena, bloques de
concreto, bloques de concreto gaseado o bloques de arcilla
expandida.
El término "cerámica" es conocido en
principio por la persona técnica en la materia. Se trata de una
denominación colectiva para productos hechos de compuestos
inorgánicos, no metálicos y hechos, listos para su uso, normalmente
mediante procesos a altas temperaturas.
Las cerámicas pueden ser materiales cerámicos de
arcilla que presentan al menos 20% en peso de mineral de arcilla en
la mezcla cruda así como materiales cerámicos especiales que son
libres de mineral arcilloso o tienen solo un contenido bajo de
mineral arcillosos. Puede tratarse de materiales cerámicos finos o
cerámicos gruesos, así como de materiales porosos o densos. Los
materiales cerámicos pueden tener vidriados de manera conocida en
principio. Los vidriados también pueden ser de colores.
Ejemplos de materiales cerámicos de arcilla
comprenden productos cerámicos de construcción como ladrillos o
clinker, tubos de arcilla, ladrillos de chamote, ladrillos para
techado, productos de alfarería, productos de arcilla, porcelana
dura, porcelana blanda o losas que pueden vidriarse.
Ejemplos de productos cerámicos especiales
comprenden piedras de silicato, carburo de silicio enlazado a
arcilla, piedras moldeadas por fundición, materiales de aislamiento
cerámicos de óxidos, filtros cerámicos, materiales cerámicos de
carburo, electrocerámica, magnetocerámica o cerámica dental.
Detalles adicionales sobre cerámicas pueden
tomarse, por ejemplo, de Büchner et al., "Industrielle
Anorganische Chemie" (Química inorgánica industrial), editorial
VCH Verlag, Weinheim, New York 1986, páginas 431 a 476.
Obviamente, las superficies pueden componerse de
varios materiales diferentes. Como ejemplo se hace referencia a una
pared hecha de losas que comprende una superficie de losas de
cerámica y mortero en las juntas. Las superficies también pueden
comprender materiales de otros tipos, como por ejemplo partes
metálicas metidas.
Para usar hidrofobinas según la invención para
el tratamiento de las superficies dichas pueden usarse las
hidrofobinas en sustancia. Sin embargo, preferiblemente se usan las
hidrofobinas como formulaciones o composiciones en al menos un
solvente.
La elección de las hidrofobinas para realizar la
invención no se limita. Pueden emplearse una o también varias
diferentes hidrofobinas. La persona técnica en la materia hará una
elección adecuada. Por ejemplo, pueden emplearse proteínas de
fusión como, por ejemplo,
yaad-Xa-dewA-his
(SEQ ID NO: 19) o
yaad-Xa-rodA-his
(SEQ ID NO: 21), en cuyo caso la contraparte de fusión yaad también
puede estar abreviada.
Los solventes para formulaciones pueden
comprender agua y/o solventes orgánicos. Obviamente, también pueden
usarse mezclas de solventes. El tipo del solvente depende, por
ejemplo, de la hidrofobina, del tipo de la superficie a tratarse y
también del uso; y se selecciona de manera correspondiente por la
persona técnica en la materia.
Preferiblemente, al hablar de solventes se trata
de agua o mezclas de agua y solventes orgánicos miscibles con agua.
Ejemplos de solvente orgánicos de este tipo comprenden alcoholes
monohídricos o polihídricos miscibles con agua, como por ejemplo
metanol, etanol, n-propanol,
i-propanol, etilenglicol, propilenglicol o
glicerina. Adicionalmente también puede tratarse de alcoholes de
éter. Los ejemplos comprenden éteres monoalquilo de (poli) etilen-
o (poli)propilenglicoles como éteres butílicos de
etilenglicol. El tipo y la cantidad de los solventes orgánicos
solubles en agua se seleccionan por parte de la persona técnica en
la materia.
Para la producción de la composición usada según
la invención pueden emplearse preferiblemente las soluciones
acuosas de las hidrofobinas obtenidas durante la síntesis, el
aislamiento y/o la purificación de las hidrofobinas. Según la
pureza, éstas aún pueden contener residuos de materiales auxiliares
de la síntesis. Obviamente, las hidrofobinas también pueden
aislarse primero como sustancia, por ejemplo mediante secamiento
helado y formularse sólo en un segundo paso.
La cantidad de las hidrofobinas en la
formulación puede determinarse por parte de la persona técnica según
el tipo de la superficie y/o de la aplicación. Sin embargo,
cantidades relativamente pequeñas ya son suficientes para lograr un
efecto, es decir una modificación de las propiedades de la
superficie. Se ha mostrado buena una cantidad de 0,0001 a 1% en
peso respecto de la suma de todos los componentes de la formulación
sin que la invención deba limitarse a este rango. Preferiblemente,
la cantidad alcanza 0,0005 a 0,5% en peso y particularmente
preferible 0,001 a 0,1% en peso.
La formulación puede comprender además,
opcionalmente componentes adicionales, por ejemplo aditivos y/o
adyuvantes. Ejemplos de componentes de este tipo comprenden
especialmente surfactantes como, por ejemplo, surfactantes
aniónicos, no iónicos, anfotéricos y/o catiónicos. Ejemplos de otros
aditivos comprenden ácidos o bases, por ejemplo ácidos carboxílicos
o amoniaco, sistemas búfer, polímeros, partículas inorgánicas como
SiO_{2} o silicatos, colorantes o biocidas.
Según la invención, el tratamiento de las
superficies se efectúa poniendo en contacto la superficie con
hidrofobina o una composición que comprende al menos una hidrofobina
así como al menos un solvente.
La "puesta en contacto" puede efectuarse
mediante aspersión, untura o apisonamiento, por ejemplo, o también
mediante inmersión del objeto entero en la formulación. Esto último
sol es posible en el caso de objetos que no estén instalados. La
duración del procedimiento se establece por parte de la persona
técnica en la materia. Puede durar uno segundos hasta varias horas.
Después del tratamiento la superficie puede enjuagarse, por ejemplo
con agua, para retirar solución del tratamiento en exceso.
El tratamiento también puede efectuarse en
combinación con una limpieza de la superficie. Para esto se emplea
un agente de limpieza que comprende al menos una hidrofobina, al
menos un surfactante así como al menos un solvente.
El tratamiento puede llevarse a cabo a
temperaturas por debajo de la temperatura ambiente, a temperatura
ambiente o a temperaturas elevadas, por ejemplo a 20 a 100ºC,
preferible 20 a 60ºC.
Después del tratamiento con la composición se
seca la superficie tratada. El secamiento de la superficie tratada
puede efectuarse casi por sí mismo a temperatura ambiente o también
puede secarse a temperatura elevada.
Después del tratamiento y de, opcionalmente, el
secamiento de la superficie puede seguir un
post-tratamiento térmico de la superficie a
temperaturas elevadas, por ejemplo a temperaturas de hasta 120ºC. El
post-tratamiento también puede combinarse
naturalmente con el secamiento. Las temperaturas en un
post-tratamiento térmico alcanzan 30 a 100ºC,
particularmente preferible 40 a 80ºC y por ejemplo 50 a 70ºC. La
duración del tratamiento se establece por la persona técnica en la
materia; pueden ser, por ejemplo, de 1 min a 10 h. El
post-tratamiento térmico puede efectuarse
dependiendo del tipo del tratamiento, por ejemplo mediante
irradiación de la superficie con un radiador de IR o soplando con
corrientes de aire caliente.
Mediante el método según la invención puede
obtenerse una superficie seleccionada del grupo de materiales de
construcción minerales endurecidos, piedra natural, piedra
artificial o cerámicas, que tiene un recubrimiento que comprende al
menos una hidrofobina. El recubrimiento es al menos una capa
monomolecular de hidrofobina sobre la superficie.
Mediante el tratamiento según la invención se
logra al menos un efecto repelente de mugre y/o hidrofobizante y/o
conservante. Por lo regular se logran al menos dos de las ventajas,
especialmente una hidrofobización y una repelencia de mugre
combinadas. Las hidrofobinas presentan ya en pequeñas cantidades un
efecto distintivo. Por lo regular, ya con una composición que
contiene 0,01% en peso de hidrofobinas el tratamiento conduce a una
modificación efectiva de la superficie.
El efecto repelente de mugre puede determinarse
por medio de método conocidos en principio, por ejemplo, comparando
la capacidad para despegar la mugre mediante lavado con agua de una
superficie no tratada y una tratada con hidrofobinas. La
hidrofobización puede determinarse de manera conocida midiendo el
ángulo de contacto.
El tratamiento según la invención es adecuado de
manera particularmente ventajosa para superficies cerámicas, como
por ejemplo baldosas sobre las que se logra un efecto tanto
repelente de mugre como hidrofobizante. Este es especialmente una
ventaja esencial en habitaciones húmedas, como por ejemplo los
cuartos de baño. Los siguientes ejemplos deben ilustrar la invención
con mayor detalle:
\newpage
Parte
A
Con ayuda de los oligonucleótidos Hal570 y
Hal571 (Hal 572/Hal 573) se realizó una reacción en cadena de
polimerasa. Como ADN patrón (template) se usó ADN genómico de la
bacteria Bacillus subtilis. El fragmento obtenido de PCR contenía la
secuencia codificante del gen yaaD/yaaE de Bacillus subtilis, y en
los extremos de a una escisión de restricción NcoI o BgIII. El
fragmento PCR se purificó y se cortó con las endonucleasas de
restricción NcoI y BgIII. Este fragmento de ADN se usó como inserto
y se clonó al vector pQE60 de la empresa Qiagen que había sido
previamente linealizada con las endonucleasas de restricción NcoI y
BgIII. Los vectores generados de esta manera pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5
pueden usarse para la expresión de proteínas que se componen de
YAAD::HIS6 o YAAE::HIS6.
- Hal570:
- gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
- Hal571:
- gcagatctccagccgcgttcttgcatac
- Hal572:
- ggccatgggattaacaataggtgtactagg
- Hal573:
- gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
\vskip1.000000\baselineskip
Con ayuda de los oligonucleótidos KaM 416 y KaM
417 se realizó una reacción en cadena de polimerasa. Como ADN patrón
se usó ADN genómico del moho Aspergillus nidulans. El fragmento PCR
obtenido contenía la secuencia codificante del gen de hidrofobina
dewA y un sitio de escisión de proteinasa factor Xa
N-terminal. El fragmento PCR se purificó y se cortó
con la endonucleasa de restricción BamHI. Este fragmento de ADN se
usó como inserto y se clonó al vector pQE60YAAD#2 linealizado
previamente con la nucleasa de restricción BgIII.
El vector #508 generado de esta manera puede
usarse para la expresión de una proteína de fusión que se compone de
YAAD::Xa::dewA::HIS_{6}.
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación del plásmido #513 se efectuó de
manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM 434
y KaM 435.
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación del plásmido #507 se efectuó de
manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM 417
y KaM 418. Como ADN patrón se empleó una secuencia de ADN
sintetizada artificialmente - hidrofobina BASF1 (véase
apéndice).
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación del plásmido #506 se efectuó de
manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM 417
y KaM 418. Como ADN patrón se empleó una secuencia de ADN
sintetizada artificialmente - hidrofobina BASF2 (véase
apéndice).
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación del plásmido #526 se efectuó de
manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM464 y
KaM465. Como ADN patrón se empleó ADNc de Schyzophyllum
commune (véase apéndice).
\vskip1.000000\baselineskip
Inoculación de 3 ml de medio líquido LB con una
cepa de E. coli que expresa yaad-hidrofobina
DewA-His_{6} en tubitos de Greiner de 15 ml.
Incubación por 8 h a 37ºC en un agitador con 200 rpm. De a 2
matraces Erlenmeyer de 1 L con deflectores y 250 ml de medio LB (+
100 \mug/ml de ampicilina) fueron inoculados con 1 ml del
precultico respectivamente y se incubaron por 9 h a 37ºC sobre un
agitador con 180 rpm. Inocular 13.5 L de medio LB (+100 \mug/ml
ampicilina) en un fermentador de 20 L con 0,5 L de precultivo
(OD_{600 \ nm} 1:10 medida frente a H_{2}O). A una OD_{60 \
nm} de -3.5 adición de 140 ml de IPTG a 100 mM. Después de
fermentar 3 h enfriar a 10ºC y centrifugar caldo de fermentación.
Usar el comprimido de célula para purificación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
100 g de comprimido de célula (100 - 500 mg de
hidrofobina) se completan a 200 mL de volumen total con búfer de
fosfato de sodio de 50 mM, pH 7,5 y se resuspenden. La suspensión se
trata con un Ultraturrax tipo T25 (Janke y Kunkel;
IKA-Labortechnik) por 10 minutos y a continuación se
incuba por 1 hora a temperatura ambiente con 500 unidades de
benzonasa (Merck, Darmstadt; No. de orden 1.01697.0001) para la
degradación de los ácidos nucleicos. Antes de la ruptura de las
células se filtra con un cartucho de vidrio (P1). Para la ruptura de
las células y para el corte del ADN genómico residual se realizan
dos rondas de homogenizador a 1500 bar (Microfluidizer
M-110EH; Microfluidics Corp.). Se centrifuga el
homogenizado se centrifuga (Sorvall RC-5B,
GSA-Rotor, vasos de centrífuga de 250 ml, 60
minutos, 4ºC, 12.000 rpm, 23.000 g), se pone el sobrenadante sobre
hielo y el comprimido se resuspende en 100 ml de búfer de fosfato de
sodio, pH 7,5. Se repiten tres veces centrifugación y resuspensión,
y el búfer de fosfato de sodio contiene en el tercera repetición 1%
de SDS. Después de la resuspension se revuelve por una hora y se
realiza a continuación una centrifugación (Sorvall
RC-5B, GSA-Rotor, vasos de
centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4ºC, 12.000 rpm, 23.000 g). Según
el análisis SDS-PAGE, después de la centrifugación
posterior la hidrofobina se encuentra contenida en el sobrenadante
(figura 1). Los experimentos muestran que la hidrofobina
probablemente se encuentra contenida en forma de cuerpos de
inclusión en las células correspondientes de E. coli. 50 ml
del sobrenadante que contiene hidrofobina se aplican sobre una
columna 17-5268-02 de 50 ml níquel -
sefarosa High Performance (de alto9 rendimiento) (Amersham), que se
equilibró con búfer de tris-Cl de 50 mM, pH 8,0. La
columna se lava con búfer tris-Cl de 50 mM, pH 8,0 y
se eluye la hidrofobina a continuación con búfer
tris-Cl de 50 mM, pH 8,0 que contiene imidazol de
200 mM. Para retirar el imidazol se somete a diálisis la solución
frente a búfer de tris-Cl de 50 mM, pH 8,0.
La figura 1 muestra la purificación de la
hidrofobina producida:
- Pista 1:
- aplicación a columna de níquel - sefarosa (dilución 1:10)
- Pista 2:
- pasada = eluido etapa de lavado
- Pistas 3-5:
- OD 280 máximos de las fracciones de elución
La hidrofobina de la figura 1 posee un peso
molecular de aproximadamente 53 kD. Las franjas más pequeñas
representan en parte los productos de degradación de la
hidrofobina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo industrial;
caracterización de la hidrofobina mediante modificación del ángulo
de contacto de una gota de agua sobre
vidrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Vidrio (vidrio de ventana, Süddeutsche Glas,
Mannheim):
Concentración de hidrofobina: 100 \mug/mL
Incubación de plaquetas de vidrio por una noche
(temperatura 80ºC) en acetato de Na de 50 mM, pH 4 + Tween 20 de
0,1%
Después se lavan las plaquetas de vidrio con
revestimiento de hidrofobina en agua destilada, después incubación
por 10 min/80ºC/solución de SDS al 1% en agua destilada
Las muestras se secan al aire y se determina el
ángulo de contacto (en grados) de una gota de 5 \muL de agua.
La medición del ángulo de contacto se determinó
en un instrumento Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, software
SCA 20.2.0. (Noviembre 2002). La medición se efectuó según las
indicaciones del fabricante.
Vidrio no tratado dio como resultado un ángulo
de contacto de 30\pm 5º; un recubrimiento con la hidrofobina
funcional según el ejemplo 8
(yaad-dewA-hiS_{6}) dio como
resultado un ángulo de contacto de 75 \pm 5º.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
B
\vskip1.000000\baselineskip
Para los experimentos de aplicación industrial
se empleó una solución en agua de la proteína de fusión preparada
según el ejemplo 8
yaad-Xa-dewA-his
(SEQ ID NO: 19). Concentración de la hidrofobina en solución: 100
\mug/ml (0,01% en peso).
\vskip1.000000\baselineskip
Baldosas cerámicas, blanco brillante, 10 cm x 15
cm (empresa Novocker), enjuagadas con etanol y agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los ensayos se usó mugre de fibra IKW
(según la revista Seifen, Fette, Öle, Wachse (SÖFW) - Journal, 124
año, 14/98, página 1029).
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre una baldosa se aplicaron en gotas 2 g de
la solución acuosa de hidrofobina arriba mencionada con una
concentración de 100 \mug/ml (1,3 \mum de hidrofobina/cm^{2})
y se extendió ligeramente con un paño de modo que se cubrió la
superficie entera. La baldosa se dejó secar a continuación por 24 h.
Después la baldosa se lavó con agua y se puso durante 3x10 min en un
vaso de vidrio con agua. Para cada lavada se usó agua fresca. La
baldosa se secó luego al aire.
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre la baldosa tratada en una gota de agua se
midió un ángulo de contacto 56º (promedio de 10 mediones). Una
baldosa no tratada en comparación muestra un ángulo de contacto de
20º. La baldosa se hidrofobizó claramente.
Sobre la baldosa tratada y en comparación
también sobre una no tratada se aplicaron con una pipeta de
transferencia 50, 100 y 200 \mug de mugre de fibra IKW en cada vez
de manera puntual y se secó a temperatura ambiente durante 1 h.
Las baldosas se lavaron luego 3 x cada vez con
500 ml agua. Mientras que la mugre no se despegó de la superficie no
tratada, de la baldosa pre-tratada con la
hidrofobina pudo observarse parcialmente una solución de mugre.
El pre-tratamiento de la baldosa
con hidrofobina condujo de esta manera a una adherencia muy pequeña
de la mugre y a una hidrofobización de la superficie cerámica.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> BASF Aktiengesellschaft
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de hidrofobinas para el
tratamiento de materiales minerales endurecidos para construcción,
piedra natural, piedra artificial y cerámicas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PF 56487
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-dewA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(405)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-dewA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-rodA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(471)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-rodA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-HypA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(336)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-HypA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-HypB
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(357)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-HypB
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 408
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-sc3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(408)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-sc3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 483
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-BASF1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(483)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-BASF1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-BASF2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(465)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-BASF2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-yaad
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(882)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-yaad
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-yaae
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(591)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> basf-yaae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
basf-yaad-Xa-dewA-his
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1329)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
basf-yaad-Xa-dewA-his
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
basf-yaad-Xa-rodA-his
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1395)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
basf-yaad-Xa-rodA-his
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
basf-yaad-Xa-BASF1-his
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1907)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
basf-yaad-Xa-BASF1-his
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Uso de hidrofobinas para el tratamiento de
superficies, caracterizado porque las superficies son
superficies de un material seleccionado del grupo de materiales de
construcción minerales endurecidos, piedra natural, piedra
artificial o cerámica.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque para el tratamiento se emplea una
composición que comprende al menos una hidrofobina y un
solvente.
3. Método para el tratamiento de superficies, en
el que se pone en contacto la superficie con al menos una
hidrofobina, caracterizado porque la superficie es la
superficie de un material seleccionado del grupo de materiales
minerales endurecidos para construcción, piedra natural, piedra
artificial o cerámicas.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado porque para el tratamiento se emplea una
composición que comprende al menos una hidrofobina y un
solvente.
5. Método según la reivindicación 3 o 4,
caracterizado porque el solvente es agua.
6. Método según una de las reivindicaciones 3 a
5, caracterizado porque la cantidad de las hidrofobinas en la
composición es de 0,0001 a 1% en peso respecto de la suma de todos
los componentes de la formulación.
7. Una superficie recubierta con al menos una
hidrofobina, caracterizada porque la superficie es la
superficie de un material seleccionada del grupo de materiales
minerales endurecidos para construcción, piedra natural, piedra
artificial o cerámica.
8. Superficies recubiertas según la
reivindicación 7, caracterizado porque la superficie es
repelente de mugre.
9. Superficies recubiertas según la
reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la superficie se
hidrofobiza.
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