ES2345627T3

ES2345627T3 - Uso de hidrofinas para el tratamiento superficial de materiales minerales de construccion endurecidos, piedra natural, piedra artificial y ceramicas.

Info

Publication number: ES2345627T3
Application number: ES06725356T
Authority: ES
Inventors: Heike Becker; Claus Bollschweiler; Thomas Subkowski; Ulf Baus; Hans-Georg Lemaire; Marvin Karos
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2010-09-28
Anticipated expiration: 2026-03-28
Also published as: ATE468926T1; CA2602158A1; JP2008534419A; EP1866106A1; KR20080009689A; DE502006007035D1; KR101250105B1; WO2006103230A1; BRPI0609545A2; MX2007012018A; JP4964227B2; EP1866106B1; US20090297884A1

Abstract

Uso de hidrofobinas para el tratamiento de superficies, caracterizado porque las superficies son superficies de un material seleccionado del grupo de materiales de construcción minerales endurecidos, piedra natural, piedra artificial o cerámica.

Description

Uso de hidrofobinas para el tratamiento superficial de materiales minerales de construcción endurecidos, piedra natural, piedra artificial y cerámicas.

La presente invención se refiere al uso de hidrofobinas para el tratamiento de la superficie de materiales minerales endurecidos para la construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámica, un método para el tratamiento de superficies de este tipo así como superficies de materiales minerales endurecidos para construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámica que tienen un recubrimiento que comprende hidrofobinas.

Es conocido proveer superficies con recubrimientos en la zona interior y exterior que deben mejorar la durabilidad y/o la apariencia de la superficie. Revestimientos de este tipo deben actuar, por ejemplo, de manera conservante, repeler humedad, impedir contaminaciones o hacer posible una limpieza más fácil de la superficie.

En este caso se trata de recubrimientos permanentes, como por ejemplo recubrimientos inspirados en el efecto del loto, tal como se divulga en EP-A 933 388.

También puede tratarse de una protección temporal. Un efecto repelente de suciedad, temporal, de este tipo, puede lograrse mediante sustancias en una formulación de limpieza las cuales se aplican al limpiar las superficies. Aquí puede tratarse, por ejemplo, de limpiadores para baldosas.

WO 03/002620 divulga el uso de ésteres dialquilaminoalquilo de ácido (met)acrílico como polímeros de soil-release (despegar suciedad) para superficies duras, por ejemplo pisos de piedra fina o superficies de acero inoxidable. Las formulaciones divulgadas contienen 0,1 a 5% en peso del polímero.

DE-A 100 61 897 divulga agentes de limpieza que contienen partículas hidrófilas con contenido de silicato, los cuales conducen a un desprendimiento mejorado de la mugre junto con una disminución simultánea del re-ensuciamiento. Las partículas se almacenan sobre la superficie de los materiales a limpiar y modifican así las propiedades de la superficie.

Las hidrofobinas son pequeñas proteínas de aproximadamente 100 a 150 aminoácidos, las cuales son características para hongos filamentosos como, por ejemplo, schizophyllum commune. Regularmente tienen 8 unidades de cisteína.

Las hidrofobinas tienen una afinidad sobresaliente hacia las áreas de interfase y son adecuadas por esto para el recubrimiento de superficies. De esta manera es posible, por ejemplo, recubrir teflón mediante hidrofobinas y se obtiene una superficie hidrófila.

Las hidrofobinas pueden aislarse de fuentes naturales. Aunque también pueden aislarse hidrofobinas que no tienen procedencia natural mediante procesos de producción químicos o biotecnológicos. Nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4 divulga un proceso de producción para hidrofobinas que no existen en la naturaleza.

En el estado de la técnica se propone el uso de hidrofobinas para diversas aplicaciones.

WO 96/41882 propone el uso de hidrofobinas como emulsionantes, espesantes, sustancias tensioactivas, para hidrofilizar superficies hidrófobas, para el mejoramiento de la resistencia al agua de sustratos hidrófilos, para la producción de emulsiones aceite-en-agua o de emulsiones agua-en-aceite. Adicionalmente se proponen aplicaciones farmacéuticas como la producción de ungüentos o cremas, así como aplicaciones cosméticas como protección de la piel o la producción de champús para el pelo o enjuagues para el cabello.

EP-A 1 252 516 divulga el recubrimiento de ventanas, lentes de contacto, biosensores, dispositivos médicos, recipientes para realizar experimentos o para el almacenamiento, cascos de barcos, partículas sólidas o marcos o carrocerías de vehículos de pasajeros con una solución que contiene hidrofobinas a una temperatura de 30 a 80ºC.

WO 03/53383 divulga el uso de hidrofobina para tratar materiales de queratina en aplicaciones cosméticas.

WO 03/10331 divulga un sensor recubierto con hidrofobina, por ejemplo un electrodo de medición al cual están enlazadas otras sustancias, por ejemplo sustancias electro-activas, anticuerpos o enzimas.

Ninguno de los documentos citados divulga el tratamiento de superficie de materiales minerales de construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámicas.

Era objetivo de la invención suministrar técnicas novedosas para el tratamiento de superficies de este tipo, con las cuales puede lograrse al menos un efecto repelente de suciedad y/o hidrofobizante y/o conservante.

En correspondencia con esto se ha encontrado el uso de hidrofobinas para el tratamiento de superficies y las superficies son las superficies de un material seleccionado del grupo de materiales minerales endurecidos de construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámica. En una modalidad preferida para esto se usa una formulación de una hidrofobina y al menos un solvente.

En un segundo aspecto se ha encontrado un método para tratar superficies en el que se pone en contacto la superficie con al menos una hidrofobina, y la superficie es la superficie de un material seleccionado del grupo de materiales minerales, endurecidos, de construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámicas.

En un tercer aspecto de la invención se han encontrado superficies de materiales minerales endurecidos de construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámica, recubiertos con al menos una hidrofobina.

De manera sorprendente se encontró que cantidades extremadamente pequeñas de hidrofobinas son ya suficientes para un tratamiento efectivo repelente de mugre y/o hidrofobizante y/o conservante de las superficies de materiales minerales endurecidos para construcción, piedras o cerámicas. En detalle, para la invención debe realizarse lo siguiente:

Según la invención, para el tratamiento de la superficie de materiales minerales endurecidos para construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámicas, se usa al menos una hidrofobina. Obviamente también puede emplearse una mezcla de varias hidrofobinas diversas.

Por el término "hidrofobinas" en el sentido de esta invención en lo sucesivo deben entenderse polipéptidos de la fórmula estructural general (I)

(I)X_{n}-C^{1}-X_{1-50}-C^{2}-X_{0-5}-C^{3}-X_{1-100}-C^{4}-X_{1-100}-C^{5}-X_{1-50}-C^{6}-X_{0-5}-C^{7}-X_{1-50}-C^{8}-X_{m}

Donde X puede representar cada uno de los 20 aminoácidos existentes en la naturaleza (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gin, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly). En este caso, X pueden ser respectivamente iguales o diferentes. Aquí, los índices que se encuentran en X representan respectivamente el número de los aminoácidos, C representa cisteína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, y al menos cuatro de los aminoácidos nombrados con C representan cisteína, y los índices n y m representan independientemente uno de otro números naturales de 0 y 500, preferible de 15 a 300.

Los polipéptidos según la fórmula (I) se caracterizan adicionalmente por la propiedad de que a temperatura ambiente, después de recubrir una superficie de vidrio provocan un aumento del ángulo de contacto de una gota de agua de al menos 20º, preferible de al menos 25º, particularmente preferible de al menos 30º, y muy particularmente preferible de al menos 35º, respectivamente comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua de igual tamaño con la superficie sin recubrir.

Los aminoácidos nombrados con C^{1} a C^{8} son preferiblemente cisteínas; aunque también pueden reemplazarse por otros aminoácidos de volumen similar, preferible por alanina, serina, treonina, metionina o glicina. Sin embargo, al menos cuatro, preferible al menos 5, particularmente preferible al menos 6 y especialmente al menos 7 de las posiciones C^{1} a C^{8} deben consistir en cisteínas. Las cisteínas en las proteínas según la invención pueden estar presentes en forma reducida o pueden formar, unas con otras, puentes de disulfuro. Particularmente se prefiere la formación intramolecular de puentes C-C, especialmente aquella con al menos uno, preferible 2, particularmente preferible 3 y muy particularmente preferible 4 puentes intramoleculares de disulfuro. En el intercambio descrito arriba de cisteínas por aminoácidos de volumen similar, se intercambian en pares ventajosamente aquellas posiciones de C que pueden formar, unas con otras, puentes intramoleculares de disulfuro.

Cuando también se usan cisteínas, serinas, alaninas, glicina, metioninas o treoninas en las posiciones designadas con X, la numeración de las posiciones C individuales en las fórmulas generales puede cambiar de manera correspondiente.

Para la realización de la presente invención se prefiere usar hidrofobinas de la fórmula general (II)

(II)X_{n}-C^{1}-X_{3-25}-C^{2}-X_{0-2}-C^{3}-X_{5-50}-C^{4}-X_{2-35}-C^{5}-X_{2-15}-C^{6}-X_{0-2}-C^{7}-X_{3-35}-C^{8}-X_{m}

donde X, C y los índices ubicados en X tienen el significado de arriba, los índices n y m representan números entre 0 y 300, y las proteínas se distinguen adicionalmente por la modificación de ángulo de contacto arriba mencionada.

\vskip1.000000\baselineskip

Particularmente se prefiere emplear hidrofobinas de la fórmula general (III)

(III)X_{n}-C^{1}-X_{5-9}-C^{2}-C^{3}-X_{11-39}-C^{4}-X_{2-23}-C^{5}-X_{5-9}-C^{6}-C^{7}-X_{6-18}-C^{8}-X_{m}

donde X, C y los índices ubicados en X tienen el significado de arriba, los índices n y m representan números entre 0 y 200, y las proteínas se distinguen además por la modificación de ángulo de contacto arriba mencionada y, además, al menos 6 de los aminoácidos nombrados con C son cisteína.

\vskip1.000000\baselineskip

Particularmente se prefiere que todos los aminoácidos C sean cisteína.

Los residuos X_{n} y X_{m} pueden ser secuencias de péptidos que también están enlazadas de manera natural con una hidrofobina. Uno o ambos residuos también pueden ser secuencias de péptidos que no están conectados de manera natural con una hidrofobina. Por éstos también deben entenderse aquellos residuos X_{n} y/o X_{m} en los que una secuencia de péptidos que tiene lugar de manera natural en una hidrofobina se alarga mediante una secuencia que tiene lugar de una manera no natural en una hidrofobina.

Si X_{n} y/o X_{m} son secuencias de péptidos que tienen lugar de manera no natural en hidrofobinas, la longitud de secuencias de tal tipo son regularmente de al menos 20, preferible de al menos 35, particularmente preferible de al menos 50 y muy particularmente preferible de al menos 100 aminoácidos. Un residuo de este tipo, no enlazado con una hidrofobina de manera natural también debe denominarse en lo sucesivo como contraparte de fusión. Con esto debe expresarse que las proteínas se componen de una parte de hidrofobina y una parte de la contraparte de fusión, que no tie-
nen lugar juntas en esta forma en la naturaleza. Proteínas de este tipo también deben denominarse proteínas de fusión.

La parte de la contraparte de fusión puede seleccionarse de un gran número de proteínas. Varias contrapartes de fusión también pueden enlazarse con una parte de hidrofobina, por ejemplo en el extremo amino (X_{n}) y en el extremo carboxilo (X_{m}) de la parte de hidrofobina. Pero también pueden enlazarse, por ejemplo, dos contrapartes de fusión con una posición (X_{n} o X_{m}) de la proteína según la invención.

Contrapartes de fusión particularmente adecuados son polipéptidos que tienen lugar de manera natural en microorganismos, especialmente en E. coli o Bacillus subtilis. Ejemplos de tales contrapartes de fusión son las secuencias yaad (SEQ ID NO: 15 y 16), yaae (SEQ ID NO: 17 y 18) y tioredoxina. También son bien adecuados fragmentos o derivados de estas secuencias nombradas que comprenden solo una parte, preferida 70-99%, particularmente preferida 80-98% de las secuencias nombradas, o en las que se modifican aminoácidos individuales, o nucleótidos frente a la secuencia nombrada.

Las proteínas usadas según la invención también pueden modificarse aún en su secuencia de polipéptidos, por ejemplo mediante glicosilación, acetilación o también por entrelazamiento transversal químico, por ejemplo con glutardialdehído.

Una propiedad de las proteínas usadas según la invención es la modificación de propiedades superficiales cuando las superficies se recubren con las proteínas. La modificación de las propiedades de superficie puede determinarse experimentalmente midiendo el ángulo de contacto de una gota de agua antes y después del recubrimiento de una superficie con la proteína y estableciendo la diferencia de ambas mediciones.

La realización de las mediciones de ángulo de contacto son conocidas en principio para la persona técnica en la materia. Las condiciones experimentales exactas se representan en la parte experimental. Entre las condiciones allí nombradas, las proteínas usadas según la invención poseen la propiedad de aumentar el ángulo de contacto de una gota de agua sobre una superficie de vidrio en al menos 20º, preferido al menos en 25º, particularmente preferido al menos en 30º.

En la parte de hidrofobina de las hidrofobinas conocidas hasta ahora se conservan las posiciones de los aminoácidos polares y apolares, lo cual se manifiesta en una trama de hidrofobicidad característica. Las diferencias en las propiedades biofísicas y en la hidrofobicidad condujeron la clasificación de las hidrofobinas hasta ahora conocidas en dos clases, I y II (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).

Las membranas ensambladas de hidrofobinas clase I son insolubles en alto grado (solo en un 1% en SDS a temperatura elevada) y solo pueden disociarse mediante ácido trifluoroacético concentrado (TFA) o ácido fórmico. En contraste con éstos, las formas ensambladas de hidrofobinas de clase II son menos estables. Se disuelven ya por etanol al 60% o 1% de SDS (a temperatura ambiente).

Una comparación de las secuencias de aminoácidos muestra que la longitud de la región entre cisteínas C^{3} y C^{4} es distintivamente más corta en hidrofobinas de clase II que en hidrofobinas de clase I. Las hidrofobinas de clase II tienen adicionalmente más aminoácidos cargados que las de clase I.

Hidrofobinas particularmente preferidas para la realización de la presente invención son las hidrofobinas del tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, que se caracterizan estructuralmente en el protocolo de secuencias que se sucede abajo. Puede tratarse también solamente de partes o derivados de las mismas. También es posible enlazar varias hidrofobinas, preferible 2 ó 3, de estructura igual o diferente, unas con otras y con una secuencia de polipéptidos adecuada correspondiente, que no se encuentra enlazada con una hidrofobina de manera natural.

Particularmente adecuadas para la realización de la presente invención adicionalmente son las proteínas de fusión con las secuencias de polipéptidos representadas en SEQ ID NO: 20, 22, 24, así como con las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para éstas, especialmente las secuencias según SEQ ID NO: 19, 21, 23. Formas de realización particularmente preferidas también son proteínas que resultan a partir de las secuencias de polipéptidos representadas en SEQ ID NO. 20, 22 ó 24 mediante intercambio, inserción o deleción de al menos uno hasta incluso 10, preferible 5, particularmente preferible 5%, de todos los aminoácidos, y que aún poseen la propiedad biológica de las proteínas de partida en al menos 50%. Por propiedad biológica de las proteínas se entiende aquí la modificación ya descrita del ángulo de contacto en al menos 20º.

Los polipéptidos usados según la invención pueden producirse químicamente por medio de métodos conocidos de la síntesis de péptidos, por ejemplo mediante la síntesis de fases sólidas según Merrifield.

Pueden aislarse hidrofobinas que tienen lugar de manera natural a partir de fuentes naturales por medio de métodos adecuados. A manera de ejemplo refiérase a Wösten et al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO 96/41882.

La producción de proteínas de fusión que tienen lugar de una manera no natural pueden efectuarse de manera preferida mediante métodos de ingeniería genética en los que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la contraparte de fusión y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la parte de hidrofobina, especialmente una secuencia de ADN, se combinan de tal manera que se genera la proteína deseada en un organismo huésped mediante expresión génica de la secuencia combinada de ácidos nucleicos. Un método de producción de tal tipo se divulga en nuestra solicitud anterior de patente DE 102005007480.4.

Organismos huéspedes, adecuados (organismos de producción) para el proceso de producción nombrado, pueden ser en tal caso procariotas (incluyendo las Archaea) o eucariotas, particularmente bacterias, inclusive halobacterias y metanococcus, hongos, células de insectos, células vegetales, células de mamíferos, particularmente preferible Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacilos, Hansenula polymorpha, Trichoma reesei, SF9 (o células relacionadas) entre otras.

En el marco de la presente invención pueden emplearse constructos de expresión, obtenidos bajo el control genético de secuencias de ácidos nucleicos regulatorias, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido usado según la invención y vectores que comprenden al menos uno de estos constructos de expresión para la producción de hidrofobinas.

Los constructos usados comprenden preferiblemente un promotor 5'-arriba de la secuencia respectiva codificante y una secuencia de terminador 3'-debajo de la secuencia respectiva codificante así como opcionalmente otros elementos regulatorios usuales, cada uno enlazado de manera operativa a la secuencia codificante.

Por "enlace operativo" se entiende la disposición secuencial de promotor, secuencia codificante, terminador y opcionalmente otros elementos regulatorios de tal modo que cada uno de los elementos regulatorios puede cumplir su función en la expresión de la secuencia codificante según lo prescrito.

Ejemplos de secuencias enlazables de manera operativa son secuencias de reconocimiento (targeting) así como intensificadores (enhancer), señales de poliadenilación y similares. Otros elementos regulatorios comprenden marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de replicación y similares. Secuencias regulatorias adecuadas se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Adicional a estas secuencias de regulación, la regulación natural de estas secuencias aún puede estar presente antes de los genes estructurales propios puede y opcionalmente pueden haberse modificado genéticamente de modo que la regulación natural se haya desconectado y se haya elevado la expresión de los genes.

Un constructo de ácidos nucleicos preferidos también contiene ventajosamente una o varias de las ya mencionadas secuencias "enhancer" (intensificadoras), conectadas funcionalmente con el promotor, las cuales hacen posible una expresión elevada de la secuencia de ácidos nucleicos. También en el extremo 3' de las secuencias de ADN puede insertarse secuencias adicionales ventajosas como otros elementos regulatorios o terminadores.

Los ácidos nucleicos pueden estar contenidos en una o más copias en el constructo. En el constructo pueden estar contenidos además otros marcadores como resistencias a antibióticos o genes que complementan auxotrofía, opcionalmente para la selección del constructo.

Secuencias de regulación ventajosas para el método están contenidas, por ejemplo, en promotores como promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp-, lac-, Ipp-lac, laclq-T7-, T5-, T3-, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR o imlambda-P, los cuales encuentran aplicación de manera ventajosa en bacterias gram-negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas se encuentran contenidas, por ejemplo, en los promotores gram-positivos amy y SP02, en los promotores de levaduras u hongos ADC1,MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. También es posible usar promotores artificiales para la regulación.

Para la expresión en un organismo huésped se inserta ventajosamente el constructo de ácido nucleico en un vector, como por ejemplo un plásmido o un fago, el cual hace posible una expresión óptima del gen en el huésped. Por vectores también deben entenderse, aparte de plásmidos y fagos, todos los otros vectores conocidos para el técnico en la materia, es decir por ejemplo virus como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fasmidos, cosmidos y ADN lineales o circulares, así como el sistema agrobacteria.

Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma o cromosomalmente en el organismo huésped. Estos vectores representan otra modalidad de la invención. Plásmidos adecuados están, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III''3-B1, tgt11 o pBdCI, en Streptomyces plJ101, plJ364,plJ702 oplJ361, en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, plL2 o pBB116, en levaduras 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en vegetales pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos nombrados representan una pequeña selección de los plásmidos posibles. Otros plásmidos son conocidos por el técnico en la materia y pueden tomarse, por ejemplo, del libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

El constructo de ácido nucleico para la expresión de los otros genes contenidos contiene adicionalmente secuencias regulatorias terminales 3' y/o 5'para el incremento de la expresión los cuales se seleccionan para una expresión óptima de según el organismo huésped seleccionado y el gen o los genes.

Estas secuencias regulatorias deben hacer posible la expresión dirigida de los genes y de la expresión de proteínas. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que solo después de la inducción se expresa o se sobre-expresa el gen, o se expresa y/o se sobre expresa inmediatamente.

Las secuencias regulatorias o los factores pueden influenciar en tal caso preferentemente la expresión génica de los genes introducidos y de esta manera elevarlos. Así puede efectuarse un refuerzo de los elementos regulatorios ventajosamente al nivel de transcripción usando señales de transcripción fuertes como promotores y/o "enhancer" (intensificadores). Además, también es posible un refuerzo de la traducción ("translation") mejorando la estabilidad del ARNm, por ejemplo.

En otra forma de configuración del vector, el vector que contiene el constructo de ácido nucleico o el ácido nucleico también puede introducirse de manera ventajosa a los microorganismos en forma de un ADN lineal e integrarse al genoma del organismo huésped por recombinación heteróloga u homologa. Este ADN lineal puede componerse de un vector linealizado tal como un plásmido o solo de un constructo de ácido nucleico o del ácido nucleico.

Para una expresión óptima de los genes heterólogos en organismos es ventajoso modificar las secuencias de ácidos nucleicos de manera correspondiente con el uso de codón ("codon usage") específico empleado. El "codon usage" (uso de codón) puede establecerse fácilmente por medio de análisis en ordenador de otros genes del organismo en cuestión.

La producción de un casete de expresión se efectúa por medio de fusión de un promotor adecuado con una secuencia codificante adecuada y una señal terminadora o de poliadenilación. Para esto se usan técnicas corrientes de recombinación y de clonación, tal como se describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y en T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience (1987).

El constructo recombinante de ácido nucleico o el constructo génico, para la expresión en un organismo huésped adecuado se inserta ventajosamente en un vector específico de huésped que hace posible una expresión óptima del gen en el huésped. Los vectores son bien conocidos para la persona técnica en la materia y pueden inferirse de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., editorial Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

Con ayuda de los vectores son producibles los microorganismos que se transforman, por ejemplo con al menos un vector y pueden usarse para la producción de los polipéptidos usados según la invención. De manera ventajosa los constructos recombinantes arriba descritos se introducen a un sistema huésped y se expresan. En este caso se usan los métodos corrientes de clonación y transfección conocidos para la persona técnica en la materia, como por ejemplo co-precipitación, fusión de protoplastos, electroporación, transfección retroviral y similares con el fin de hacer que se expresen los ácidos nucleicos nombrados en el sistema respectivo de expresión. Se describen sistemas adecuados, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., editorial, Wiley Interscience, New York 1997, o Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

También son producibles microorganismos recombinados de manera homóloga. Para esto se produce un vector que contiene al menos un segmento de un gen usado según la invención o de una secuencia codificante donde opcionalmente se ha introducido al menos una deleción, adición o sustitución de aminoácido para modificar la secuencia, por ejemplo para desbaratarla funcionalmente (vector "knockout"). La secuencia introducida también puede, por ejemplo, ser un homólogo de un microorganismo de la familia o derivarse de una fuente de mamífero, de levadura o de insectos. El vector usado para la recombinación homóloga puede configurarse de manera alternativa para que el gen endógeno mute en la recombinación homóloga o se modifique de alguna otra manera, aunque aún codifique la proteína funcional (por ejemplo, la región regulatoria puesta arriba puede estar modificada de tal forma que se modifique la expresión de la proteína endógena). El segmento modificado del gen usado según la invención está en el vector de recombinación homólogo. La construcción de vectores adecuados para la recombinación homóloga se describe, por ejemplo en Thomas, K. R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Como organismos huésped recombinantes para el ácido nucleico usado según la invención o el constructo de ácidos nucleicos se toman en consideración en principio todos los organismos procariótidos o eucoariótidos. Como organismos huéspedes se usan ventajosamente microorganismos como bacterias, hongos o levaduras. Ventajosamente se usan bacterias gran-positivas o gran-negativas, preferible bacterias de las familias de Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, particularmente preferible vacterias de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus.

Los organismos usados en el proceso de preparar proteínas de fusión se hacen crecer o se cultivan, dependiendo del organismo huésped, de una manera conocida por la persona técnica en la materia. Los organismos se hacen crecer usualmente en un medio líquido que comprende una fuente de carbono, usualmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, usualmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánicas tales como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, microelementos (elementos en trazas) tales como sales de hierro, sales de manganeso y sales de magnesio y, opcionalmente, vitaminas, a temperaturas de entre 0 y 100ºC, preferible entre 10 a 60ºC, con suministro de oxígeno. Aquí el valor de pH del líquido nutriente puede mantenerse en un valor fijo, es decir que puede regularse o puede no regularse durante el cultivo. El cultivo puede efectuarse por lotes ("batch"), de manera semi-continua o continua. Los nutrientes pueden introducirse al inicio de la fermentación o alimentarse después de manera semi-continua o continua. Las enzimas pueden aislarse según el método descrito en los ejemplos o usarse para la reacción como un extracto crudo.

Los polipéptidos usados según la invención, o los fragmentos funcionales, biológicamente activos de los mismos, pueden producirse por medio de un método recombinante en el que se cultiva un microorganismo que produce polipéptidos, opcionalmente induce la expresión de los polipéptidos y los aísla del cultivo. Los polipéptidos también pueden producirse a gran escala industrial, si se desea. El microorganismo recombinante puede cultivarse y fermentarse según métodos conocidos. Las bacterias pueden cultivarse, por ejemplo, en medio TB o LB y a una temperatura de 20 a 40ºC y un valor pH de 6 a 9. Condiciones de cultivo adecuadas se describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Si los polipéptidos no se secretan al medio de cultivo, entonces se desintegran las células y se obtiene el producto a partir del lisado mediante procesos conocidos para aislamiento de proteínas. Las células pueden desintegrarse a voluntad por medio de ultrasonido de alta frecuencia, por medio de alta presión, como por ejemplo en una celda de presión French, por osmólisis, por efecto de detergentes, enzimas líticas o solventes orgánicos, mediante homogenizadores o por combinación de varios de los métodos listados.

Una purificación de los polipéptidos puede lograrse con métodos cromatográficos conocidos, como cromatografía de tamices moleculares (filtración de gel), como cromatografía de Q-sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica, así como con otros métodos usuales como ultrafiltración, cristalización, salificación, diálisis y electroforesis con gel nativo. Métodos adecuados se describen, por ejemplo, en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden (Métodos bioquímicos de trabajo), Editorial Water de Gruyter, Berlín, New York o en Scopes, R., Protein Purification, Editorial Springer, New York, Heidelberg, Berlín.

Para el aislamiento de la proteína recombinante también puede ser ventajoso usar el sistema de vectores o los oligonucleótidos que alargan el ADNc en determinadas secuencias de nucleótidos y con esto codifican para polipéptidos modificados o proteínas de fusión que sirven para una purificación más sencilla, por ejemplo. Modificaciones adecuadas de este tipo comprenden los llamados "tags" (etiquetas) que fungen como anclas, como por ejemplo la modificación conocida como ancla hexa-histidina, o epítopes, que pueden reconocerse como antígenos de los anticuerpos (descritos, por ejemplo, en Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Otros tags (etiquetas) adecuados son, por ejemplo, HA, calmodulina-BD, GST, MBD; quitina-BD, esteptavidina-BD-avi-tag, Flag-tag, T7, etc. Estas anclas pueden servir para adherir las proteínas a un soporte sólido tal como una matriz polimérica, por ejemplo, que puede, por ejemplo, empacarse en una columna cromatográfica o puede usarse en una placa de microtitulación o en otro soporte. Los protocolos de purificación correspondientes pueden obtenerse de los proveedores comerciales de etiquetas de afinidad.

Las proteínas preparadas tal como se describe pueden usarse ya sea directamente como proteínas de fusión o, después de la disociación y de la remoción de la porción de la contraparte de fusión, como hidrofobinas "puras".

Cuando se ha previsto una remoción de la contraparte de fusión, se recomienda incorporar un sitio potencial de escisión (sitio de reconocimiento específico para proteasas) a la proteína de fusión entre la porción de hidrofobina y la porción de contraparte de fusión. Como sitio de escisión son especialmente adecuadas aquellas secuencias de péptidos que de otra manera no existen ni en la parte de hidrofobina ni en la parte de la contraparte de fusión, lo cual puede establecerse fácilmente con herramientas informáticas. Particularmente adecuadas son, por ejemplo, la escisión de BrCN en metionina o la escisión mediada por proteasa con factor Xa, la escisión de enterocinasa, de trombina, de TEV (proteasa de virus de tobacco etch (de ataque al tabaco)).

Las superficies a tratar con hidrofobinas según la invención son las superficies de un material seleccionado del grupo de materiales minerales endurecidos para construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámica. Superficies de este tipo pueden encontrarse especialmente en el campo de la construcción, tanto en las zonas interiores como en las exteriores.

\newpage

Por "materiales de construcción minerales endurecidos" en el sentido de esta invención deben entenderse las composiciones del tipo piedra que pueden obtenerse mediante mezcla de materias de construcción, esencialmente inorgánicos, con agua seguida de curado o endurecimiento debido a reacciones químicas y/o físicas. Los materiales de partida pueden ser materiales de construcción de curado hidráulico que curan tanto al aire como en agua, o materiales de construcción de curado al aire que solo curan al aire. Adicionalmente pueden ser, por ejemplo, materiales de construcción curados al vapor.

Ejemplos de materiales de construcción curados de este tipo comprenden especialmente concreto o mortero que pueden obtenerse de cementos tales como cemento Portland, cemento de arcilla o cemento puzolánicos y sus mezclas con agregados gruesos como arena, grava, gravilla o materiales expandidos, así como agua. De una manera conocida y de un tipo conocido pueden comprender además materiales auxiliares inorgánicos y/u orgánicos adicionales, como por ejemplo agentes de licuefacción de concreto. Otros ejemplos de materiales de construcción comprenden yeso, cal o enlucidos para la zona interior y exterior.

Piedras naturales son piedras de procedencia natural como gres, granito, gneis, pizarra, cal o mármol. Estas pueden emplearse tanto como piedra de cantera en forma irregular pero también en forma de piezas de construcción formadas, por ejemplo como piedras de muro, alféizares de ventanas, peldaños de escaleras, balaustradas, largueros de marcos de puerta, losas para revestimientos, losas para pisos, losas para techos, elementos decorativos o esculturas.

Piedras artificiales son piezas de construcción que pueden usarse de manera análoga a las piedras naturales pero que no proceden de fuentes naturales sino que se fabrican regularmente en la industria. Los ejemplos comprenden ladrillos, clinker (ladrillo refractario), ladrillos de cal y arena, bloques de concreto, bloques de concreto gaseado o bloques de arcilla expandida.

El término "cerámica" es conocido en principio por la persona técnica en la materia. Se trata de una denominación colectiva para productos hechos de compuestos inorgánicos, no metálicos y hechos, listos para su uso, normalmente mediante procesos a altas temperaturas.

Las cerámicas pueden ser materiales cerámicos de arcilla que presentan al menos 20% en peso de mineral de arcilla en la mezcla cruda así como materiales cerámicos especiales que son libres de mineral arcilloso o tienen solo un contenido bajo de mineral arcillosos. Puede tratarse de materiales cerámicos finos o cerámicos gruesos, así como de materiales porosos o densos. Los materiales cerámicos pueden tener vidriados de manera conocida en principio. Los vidriados también pueden ser de colores.

Ejemplos de materiales cerámicos de arcilla comprenden productos cerámicos de construcción como ladrillos o clinker, tubos de arcilla, ladrillos de chamote, ladrillos para techado, productos de alfarería, productos de arcilla, porcelana dura, porcelana blanda o losas que pueden vidriarse.

Ejemplos de productos cerámicos especiales comprenden piedras de silicato, carburo de silicio enlazado a arcilla, piedras moldeadas por fundición, materiales de aislamiento cerámicos de óxidos, filtros cerámicos, materiales cerámicos de carburo, electrocerámica, magnetocerámica o cerámica dental.

Detalles adicionales sobre cerámicas pueden tomarse, por ejemplo, de Büchner et al., "Industrielle Anorganische Chemie" (Química inorgánica industrial), editorial VCH Verlag, Weinheim, New York 1986, páginas 431 a 476.

Obviamente, las superficies pueden componerse de varios materiales diferentes. Como ejemplo se hace referencia a una pared hecha de losas que comprende una superficie de losas de cerámica y mortero en las juntas. Las superficies también pueden comprender materiales de otros tipos, como por ejemplo partes metálicas metidas.

Para usar hidrofobinas según la invención para el tratamiento de las superficies dichas pueden usarse las hidrofobinas en sustancia. Sin embargo, preferiblemente se usan las hidrofobinas como formulaciones o composiciones en al menos un solvente.

La elección de las hidrofobinas para realizar la invención no se limita. Pueden emplearse una o también varias diferentes hidrofobinas. La persona técnica en la materia hará una elección adecuada. Por ejemplo, pueden emplearse proteínas de fusión como, por ejemplo, yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) o yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21), en cuyo caso la contraparte de fusión yaad también puede estar abreviada.

Los solventes para formulaciones pueden comprender agua y/o solventes orgánicos. Obviamente, también pueden usarse mezclas de solventes. El tipo del solvente depende, por ejemplo, de la hidrofobina, del tipo de la superficie a tratarse y también del uso; y se selecciona de manera correspondiente por la persona técnica en la materia.

Preferiblemente, al hablar de solventes se trata de agua o mezclas de agua y solventes orgánicos miscibles con agua. Ejemplos de solvente orgánicos de este tipo comprenden alcoholes monohídricos o polihídricos miscibles con agua, como por ejemplo metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, etilenglicol, propilenglicol o glicerina. Adicionalmente también puede tratarse de alcoholes de éter. Los ejemplos comprenden éteres monoalquilo de (poli) etilen- o (poli)propilenglicoles como éteres butílicos de etilenglicol. El tipo y la cantidad de los solventes orgánicos solubles en agua se seleccionan por parte de la persona técnica en la materia.

Para la producción de la composición usada según la invención pueden emplearse preferiblemente las soluciones acuosas de las hidrofobinas obtenidas durante la síntesis, el aislamiento y/o la purificación de las hidrofobinas. Según la pureza, éstas aún pueden contener residuos de materiales auxiliares de la síntesis. Obviamente, las hidrofobinas también pueden aislarse primero como sustancia, por ejemplo mediante secamiento helado y formularse sólo en un segundo paso.

La cantidad de las hidrofobinas en la formulación puede determinarse por parte de la persona técnica según el tipo de la superficie y/o de la aplicación. Sin embargo, cantidades relativamente pequeñas ya son suficientes para lograr un efecto, es decir una modificación de las propiedades de la superficie. Se ha mostrado buena una cantidad de 0,0001 a 1% en peso respecto de la suma de todos los componentes de la formulación sin que la invención deba limitarse a este rango. Preferiblemente, la cantidad alcanza 0,0005 a 0,5% en peso y particularmente preferible 0,001 a 0,1% en peso.

La formulación puede comprender además, opcionalmente componentes adicionales, por ejemplo aditivos y/o adyuvantes. Ejemplos de componentes de este tipo comprenden especialmente surfactantes como, por ejemplo, surfactantes aniónicos, no iónicos, anfotéricos y/o catiónicos. Ejemplos de otros aditivos comprenden ácidos o bases, por ejemplo ácidos carboxílicos o amoniaco, sistemas búfer, polímeros, partículas inorgánicas como SiO_{2} o silicatos, colorantes o biocidas.

Según la invención, el tratamiento de las superficies se efectúa poniendo en contacto la superficie con hidrofobina o una composición que comprende al menos una hidrofobina así como al menos un solvente.

La "puesta en contacto" puede efectuarse mediante aspersión, untura o apisonamiento, por ejemplo, o también mediante inmersión del objeto entero en la formulación. Esto último sol es posible en el caso de objetos que no estén instalados. La duración del procedimiento se establece por parte de la persona técnica en la materia. Puede durar uno segundos hasta varias horas. Después del tratamiento la superficie puede enjuagarse, por ejemplo con agua, para retirar solución del tratamiento en exceso.

El tratamiento también puede efectuarse en combinación con una limpieza de la superficie. Para esto se emplea un agente de limpieza que comprende al menos una hidrofobina, al menos un surfactante así como al menos un solvente.

El tratamiento puede llevarse a cabo a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente, a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas, por ejemplo a 20 a 100ºC, preferible 20 a 60ºC.

Después del tratamiento con la composición se seca la superficie tratada. El secamiento de la superficie tratada puede efectuarse casi por sí mismo a temperatura ambiente o también puede secarse a temperatura elevada.

Después del tratamiento y de, opcionalmente, el secamiento de la superficie puede seguir un post-tratamiento térmico de la superficie a temperaturas elevadas, por ejemplo a temperaturas de hasta 120ºC. El post-tratamiento también puede combinarse naturalmente con el secamiento. Las temperaturas en un post-tratamiento térmico alcanzan 30 a 100ºC, particularmente preferible 40 a 80ºC y por ejemplo 50 a 70ºC. La duración del tratamiento se establece por la persona técnica en la materia; pueden ser, por ejemplo, de 1 min a 10 h. El post-tratamiento térmico puede efectuarse dependiendo del tipo del tratamiento, por ejemplo mediante irradiación de la superficie con un radiador de IR o soplando con corrientes de aire caliente.

Mediante el método según la invención puede obtenerse una superficie seleccionada del grupo de materiales de construcción minerales endurecidos, piedra natural, piedra artificial o cerámicas, que tiene un recubrimiento que comprende al menos una hidrofobina. El recubrimiento es al menos una capa monomolecular de hidrofobina sobre la superficie.

Mediante el tratamiento según la invención se logra al menos un efecto repelente de mugre y/o hidrofobizante y/o conservante. Por lo regular se logran al menos dos de las ventajas, especialmente una hidrofobización y una repelencia de mugre combinadas. Las hidrofobinas presentan ya en pequeñas cantidades un efecto distintivo. Por lo regular, ya con una composición que contiene 0,01% en peso de hidrofobinas el tratamiento conduce a una modificación efectiva de la superficie.

El efecto repelente de mugre puede determinarse por medio de método conocidos en principio, por ejemplo, comparando la capacidad para despegar la mugre mediante lavado con agua de una superficie no tratada y una tratada con hidrofobinas. La hidrofobización puede determinarse de manera conocida midiendo el ángulo de contacto.

El tratamiento según la invención es adecuado de manera particularmente ventajosa para superficies cerámicas, como por ejemplo baldosas sobre las que se logra un efecto tanto repelente de mugre como hidrofobizante. Este es especialmente una ventaja esencial en habitaciones húmedas, como por ejemplo los cuartos de baño. Los siguientes ejemplos deben ilustrar la invención con mayor detalle:

\newpage

Parte A

Preparación y ensayo de las hidrofobinas usadas según la invención Ejemplo 1 Trabajo previo para la clonación de yaad-His_{6}/yaaE-His_{6}

Con ayuda de los oligonucleótidos Hal570 y Hal571 (Hal 572/Hal 573) se realizó una reacción en cadena de polimerasa. Como ADN patrón (template) se usó ADN genómico de la bacteria Bacillus subtilis. El fragmento obtenido de PCR contenía la secuencia codificante del gen yaaD/yaaE de Bacillus subtilis, y en los extremos de a una escisión de restricción NcoI o BgIII. El fragmento PCR se purificó y se cortó con las endonucleasas de restricción NcoI y BgIII. Este fragmento de ADN se usó como inserto y se clonó al vector pQE60 de la empresa Qiagen que había sido previamente linealizada con las endonucleasas de restricción NcoI y BgIII. Los vectores generados de esta manera pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 pueden usarse para la expresión de proteínas que se componen de YAAD::HIS6 o YAAE::HIS6.

Hal570:: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571:: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572:: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573:: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Clonación de yaad-hidrofobina DewA-His_{6}

Con ayuda de los oligonucleótidos KaM 416 y KaM 417 se realizó una reacción en cadena de polimerasa. Como ADN patrón se usó ADN genómico del moho Aspergillus nidulans. El fragmento PCR obtenido contenía la secuencia codificante del gen de hidrofobina dewA y un sitio de escisión de proteinasa factor Xa N-terminal. El fragmento PCR se purificó y se cortó con la endonucleasa de restricción BamHI. Este fragmento de ADN se usó como inserto y se clonó al vector pQE60YAAD#2 linealizado previamente con la nucleasa de restricción BgIII.

El vector #508 generado de esta manera puede usarse para la expresión de una proteína de fusión que se compone de YAAD::Xa::dewA::HIS_{6}.

1

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Clonación de yaad-hidrofobina RodA-His_{6}

La clonación del plásmido #513 se efectuó de manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM 434 y KaM 435.

2

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Clonación de yaad-hidrofobina BASF1-His_{6}

La clonación del plásmido #507 se efectuó de manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. Como ADN patrón se empleó una secuencia de ADN sintetizada artificialmente - hidrofobina BASF1 (véase apéndice).

3

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Clonación de yaad-hidrofobina BASF2-His_{6}

La clonación del plásmido #506 se efectuó de manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. Como ADN patrón se empleó una secuencia de ADN sintetizada artificialmente - hidrofobina BASF2 (véase apéndice).

4

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Clonación de yaad-hidrofobina SC3-His6

La clonación del plásmido #526 se efectuó de manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM464 y KaM465. Como ADN patrón se empleó ADNc de Schyzophyllum commune (véase apéndice).

5

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Fermentación de la cepa E. coli recombinante yaad-hidrofobina DewA-His_{6}

Inoculación de 3 ml de medio líquido LB con una cepa de E. coli que expresa yaad-hidrofobina DewA-His_{6} en tubitos de Greiner de 15 ml. Incubación por 8 h a 37ºC en un agitador con 200 rpm. De a 2 matraces Erlenmeyer de 1 L con deflectores y 250 ml de medio LB (+ 100 \mug/ml de ampicilina) fueron inoculados con 1 ml del precultico respectivamente y se incubaron por 9 h a 37ºC sobre un agitador con 180 rpm. Inocular 13.5 L de medio LB (+100 \mug/ml ampicilina) en un fermentador de 20 L con 0,5 L de precultivo (OD_{600 \ nm} 1:10 medida frente a H_{2}O). A una OD_{60 \ nm} de -3.5 adición de 140 ml de IPTG a 100 mM. Después de fermentar 3 h enfriar a 10ºC y centrifugar caldo de fermentación. Usar el comprimido de célula para purificación adicional.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Purificación de la hidrofobina recombinante - proteína de fusión (purificación de hidrofobina - proteínas de fusión que poseen una etiqueta (tag) His_{6} C-terminal)

100 g de comprimido de célula (100 - 500 mg de hidrofobina) se completan a 200 mL de volumen total con búfer de fosfato de sodio de 50 mM, pH 7,5 y se resuspenden. La suspensión se trata con un Ultraturrax tipo T25 (Janke y Kunkel; IKA-Labortechnik) por 10 minutos y a continuación se incuba por 1 hora a temperatura ambiente con 500 unidades de benzonasa (Merck, Darmstadt; No. de orden 1.01697.0001) para la degradación de los ácidos nucleicos. Antes de la ruptura de las células se filtra con un cartucho de vidrio (P1). Para la ruptura de las células y para el corte del ADN genómico residual se realizan dos rondas de homogenizador a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Se centrifuga el homogenizado se centrifuga (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, vasos de centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4ºC, 12.000 rpm, 23.000 g), se pone el sobrenadante sobre hielo y el comprimido se resuspende en 100 ml de búfer de fosfato de sodio, pH 7,5. Se repiten tres veces centrifugación y resuspensión, y el búfer de fosfato de sodio contiene en el tercera repetición 1% de SDS. Después de la resuspension se revuelve por una hora y se realiza a continuación una centrifugación (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, vasos de centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4ºC, 12.000 rpm, 23.000 g). Según el análisis SDS-PAGE, después de la centrifugación posterior la hidrofobina se encuentra contenida en el sobrenadante (figura 1). Los experimentos muestran que la hidrofobina probablemente se encuentra contenida en forma de cuerpos de inclusión en las células correspondientes de E. coli. 50 ml del sobrenadante que contiene hidrofobina se aplican sobre una columna 17-5268-02 de 50 ml níquel - sefarosa High Performance (de alto9 rendimiento) (Amersham), que se equilibró con búfer de tris-Cl de 50 mM, pH 8,0. La columna se lava con búfer tris-Cl de 50 mM, pH 8,0 y se eluye la hidrofobina a continuación con búfer tris-Cl de 50 mM, pH 8,0 que contiene imidazol de 200 mM. Para retirar el imidazol se somete a diálisis la solución frente a búfer de tris-Cl de 50 mM, pH 8,0.

La figura 1 muestra la purificación de la hidrofobina producida:

Pista 1:: aplicación a columna de níquel - sefarosa (dilución 1:10)

Pista 2:: pasada = eluido etapa de lavado

Pistas 3-5:: OD 280 máximos de las fracciones de elución

La hidrofobina de la figura 1 posee un peso molecular de aproximadamente 53 kD. Las franjas más pequeñas representan en parte los productos de degradación de la hidrofobina.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Ensayo industrial; caracterización de la hidrofobina mediante modificación del ángulo de contacto de una gota de agua sobre vidrio.

\vskip1.000000\baselineskip

Sustrato

Vidrio (vidrio de ventana, Süddeutsche Glas, Mannheim):

Concentración de hidrofobina: 100 \mug/mL

Incubación de plaquetas de vidrio por una noche (temperatura 80ºC) en acetato de Na de 50 mM, pH 4 + Tween 20 de 0,1%

Después se lavan las plaquetas de vidrio con revestimiento de hidrofobina en agua destilada, después incubación por 10 min/80ºC/solución de SDS al 1% en agua destilada

Las muestras se secan al aire y se determina el ángulo de contacto (en grados) de una gota de 5 \muL de agua.

La medición del ángulo de contacto se determinó en un instrumento Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, software SCA 20.2.0. (Noviembre 2002). La medición se efectuó según las indicaciones del fabricante.

Vidrio no tratado dio como resultado un ángulo de contacto de 30\pm 5º; un recubrimiento con la hidrofobina funcional según el ejemplo 8 (yaad-dewA-hiS_{6}) dio como resultado un ángulo de contacto de 75 \pm 5º.

\vskip1.000000\baselineskip

Parte B

Uso de las hidrofobinas para el recubrimiento repelente de mugre de las superficies cerámicas

\vskip1.000000\baselineskip

Solución usada

Para los experimentos de aplicación industrial se empleó una solución en agua de la proteína de fusión preparada según el ejemplo 8 yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19). Concentración de la hidrofobina en solución: 100 \mug/ml (0,01% en peso).

\vskip1.000000\baselineskip

Superficies cerámicas usadas

Baldosas cerámicas, blanco brillante, 10 cm x 15 cm (empresa Novocker), enjuagadas con etanol y agua.

\vskip1.000000\baselineskip

Mugre usada

Para los ensayos se usó mugre de fibra IKW (según la revista Seifen, Fette, Öle, Wachse (SÖFW) - Journal, 124 año, 14/98, página 1029).

\vskip1.000000\baselineskip

Realización del tratamiento

Sobre una baldosa se aplicaron en gotas 2 g de la solución acuosa de hidrofobina arriba mencionada con una concentración de 100 \mug/ml (1,3 \mum de hidrofobina/cm^{2}) y se extendió ligeramente con un paño de modo que se cubrió la superficie entera. La baldosa se dejó secar a continuación por 24 h. Después la baldosa se lavó con agua y se puso durante 3x10 min en un vaso de vidrio con agua. Para cada lavada se usó agua fresca. La baldosa se secó luego al aire.

\vskip1.000000\baselineskip

Medición del ángulo de contacto y efecto repelente de mugre

Sobre la baldosa tratada en una gota de agua se midió un ángulo de contacto 56º (promedio de 10 mediones). Una baldosa no tratada en comparación muestra un ángulo de contacto de 20º. La baldosa se hidrofobizó claramente.

Sobre la baldosa tratada y en comparación también sobre una no tratada se aplicaron con una pipeta de transferencia 50, 100 y 200 \mug de mugre de fibra IKW en cada vez de manera puntual y se secó a temperatura ambiente durante 1 h.

Las baldosas se lavaron luego 3 x cada vez con 500 ml agua. Mientras que la mugre no se despegó de la superficie no tratada, de la baldosa pre-tratada con la hidrofobina pudo observarse parcialmente una solución de mugre.

El pre-tratamiento de la baldosa con hidrofobina condujo de esta manera a una adherencia muy pequeña de la mugre y a una hidrofobización de la superficie cerámica.

\vskip1.000000\baselineskip

Asignación de nombres de secuencia a secuencias de ADN y de polipéptidos en el protocolo de secuencias

6

<110> BASF Aktiengesellschaft

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Uso de hidrofobinas para el tratamiento de materiales minerales endurecidos para construcción, piedra natural, piedra artificial y cerámicas

\vskip0.400000\baselineskip

<130> PF 56487

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 405

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-dewA

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(405)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-dewA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 471

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-rodA

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(471)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-rodA

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-HypA

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(336)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-HypA

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-HypB

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(357)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-HypB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 408

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-sc3

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(408)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-sc3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 483

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-BASF1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(483)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-BASF1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-BASF2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(465)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-BASF2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 882

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaad

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(882)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaad

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 591

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaae

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(591)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaad-Xa-dewA-his

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1329)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 443

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaad-Xa-dewA-his

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1395

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaad-Xa-rodA-his

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1395)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaad-Xa-rodA-his

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1407

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaad-Xa-BASF1-his

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1907)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 469

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> basf-yaad-Xa-BASF1-his

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

Claims

1. Uso de hidrofobinas para el tratamiento de superficies, caracterizado porque las superficies son superficies de un material seleccionado del grupo de materiales de construcción minerales endurecidos, piedra natural, piedra artificial o cerámica.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque para el tratamiento se emplea una composición que comprende al menos una hidrofobina y un solvente.

3. Método para el tratamiento de superficies, en el que se pone en contacto la superficie con al menos una hidrofobina, caracterizado porque la superficie es la superficie de un material seleccionado del grupo de materiales minerales endurecidos para construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámicas.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque para el tratamiento se emplea una composición que comprende al menos una hidrofobina y un solvente.

5. Método según la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque el solvente es agua.

6. Método según una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque la cantidad de las hidrofobinas en la composición es de 0,0001 a 1% en peso respecto de la suma de todos los componentes de la formulación.

7. Una superficie recubierta con al menos una hidrofobina, caracterizada porque la superficie es la superficie de un material seleccionada del grupo de materiales minerales endurecidos para construcción, piedra natural, piedra artificial o cerámica.

8. Superficies recubiertas según la reivindicación 7, caracterizado porque la superficie es repelente de mugre.

9. Superficies recubiertas según la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la superficie se hidrofobiza.