ES2353904T3 - Utilización de hidrofobinas para el tratamiento repelente de suciedad de superficies sólidas. - Google Patents

Abstract

Uso de hidrofobinas para el tratamiento repelente de suciedad de superficies duras.

Description

La presente invención se refiere al uso de hidrofobinas para el tratamiento repelente de suciedad de superficies duras, en particular en combinación con una limpieza de la superficie, a un método para el tratamiento repelente de suciedad de superficies duras, a productos de limpieza para superficies duras, 5 así como a superficies duras con un recubrimiento que comprende hidrofobinas, repelente de suciedad.

Es conocido proveer a las superficies duras, tales como vidrio, cerámica o pisos, por ejemplo, con recubrimientos repelentes de suciedad. Estos acabados deben disminuir la adherencia de suciedad, al menos dificultar el ensuciamiento de superficies y facilitar las limpiezas posteriores. Así, las grasas, 10 aceites o residuos de cal deben ser más fáciles de despegar, o cuando el agua se escurre debe evitarse la aparición de huellas secas de agua.

Los recubrimientos pueden ser permanentes, repelentes de agua, por ejemplo recubrimientos inspirados en el efecto del loto.

También pueden ser una protección temporal. Puede lograrse un efecto de este tipo, repelente de 15 suciedad de forma temporal, por ejemplo, mediante sustancias en una formulación limpiadora, la cual se aplica al limpiar la superficie. Son campos de aplicación esenciales de los limpiadores de este tipo las aplicaciones domésticas, tales como limpiadores para la zona de cocina y sanitaria, pero también las aplicaciones industriales como, por ejemplo, los lavaderos de coches.

EP-A-467 472 divulga una composición para incrementar la capacidad hidrófila de las superficies 20 duras, por ejemplo de superficies en el hogar, con el fin de lograr una limpieza más fácil en los pasos de limpieza posteriores. La formulación comprende un polímero soluble en agua, iónico o no iónico, por ejemplo un polímero catiónico con unidades cuaternarias de metacrilato de alquil amonio. Las formulaciones limpiadoras divulgadas contienen 0,02 a 5 % en peso del polímero.

WO 03/002620 divulga el uso de ésteres de alquilo amino dialquilo de ácido (met)acrílico como 25 polímeros de soil-release (de liberación de suciedad) para superficies duras, por ejemplo pisos de piedra fina o superficies de acero inoxidable. Las formulaciones limpiadoras divulgadas contienen 0,1 a 5 % en peso del polímero.

DE-A-100 61 897 divulga productos de limpieza que contienen partículas hidrófilas, con contenido de silicatos, que conducen a un desprendimiento mejorado de suciedad y a una reducción simultánea del 30 re-ensuciamiento. Las partículas se adsorben sobre la superficie de los sustratos a limpiarse y modifican así las propiedades de la superficie. Las hidrofobinas son proteínas pequeñas de alrededor de 100 a 150 aminoácidos que son característicos para hongos filamentosos, por ejemplo Schizophyllum commune. Por lo regular tienen 8 unidades de cisteína.

Las hidrofobinas tienen una afinidad pronunciada hacia las interfaces y son adecuadas por lo tanto 35 para el revestimiento de superficies. De esta manera, por ejemplo, puede revestirse el teflón por medio de hidrofobinas con la obtención de una superficie hidrófila.

Las hidrofobinas pueden aislarse a partir de fuentes naturales. Pero también pueden sintetizarse hidrofobinas que no tienen procedencia natural por medio de métodos de preparación químicos y/o biotecnológicos. Nuestra solicitud más antigua DE 102005007480.4 divulga un método de 40 preparación para hidrofobinas que no existen en la naturaleza.

En el estado de la técnica se ha propuesto el uso de hidrofobinas para diversas aplicaciones.

WO 96/41882 propone el uso de hidrofobinas como emulsionantes, espesantes, sustancias tensioactivas, para hidrofilizar superficies hidrófobas, para mejorar la resistencia al agua de sustratos hidrófilos, para preparar emulsiones aceite-en-agua o emulsiones agua-en-aceite. Además, se 45

proponen aplicaciones farmacéuticas como la preparación de ungüentos o cremas así como aplicaciones cosméticas como la protección de la piel o la preparación de champús para el cabello o enjuagues acondicionadores para el cabello.

WO 01/57066 divulga el recubrimiento de teflón con hidrofobinas. Se describen métodos para estabilizar soluciones de hidrofobinas y el recubrimiento de superficies con las mismas. 5

EP-A-1 252 516 divulga el recubrimiento de ventanas, lentes de contacto, biosensores, dispositivos médicos, contenedores para realizar ensayos o para el almacenamiento, cascos de barcos, partículas sólidas o marcos o carrocerías de vehículos para pasajeros con una solución que contiene hidrofobina a una temperatura de 30 a 80 °C.

WO 03/53383 divulga el uso de hidrofobinas para tratar materiales de queratina en aplicaciones 10 cosméticas.

WO 03/10331 divulga un sensor recubierto con hidrofobina, por ejemplo un electrodo de medición al cual están ligadas de manera no covalente otras sustancias, por ejemplo sustancias electroactivas, anticuerpos o enzimas.

WO 05/068087 divulga que no solo las altas temperaturas impiden el auto-ensamblaje de 15 hidrofobinas, sino que a bajas temperaturas los valores de pH y la adición de detergentes también afectan de manera positiva la estabilidad del recubrimiento. La adición de detergentes impide el auto-ensamblaje de hidrofobinas en el medio de cultivo celular al cual se secretan las hidrofobinas de un organismo huésped y el cual se emplea como tal para recubrir superficies.

Ninguna de las referencias divulga el uso de hidrofobinas para el tratamiento repelente de suciedad de 20 superficies sólidas.

El objetivo de la invención era proporcionar mecanismos novedosos para repeler suciedad.

De manera correspondiente, se ha encontrado el uso de hidrofobinas para el tratamiento repelente de suciedad de superficies duras. En una forma preferida de realización de la invención, el tratamiento repelente de suciedad se efectúa en combinación con una limpieza de la superficie. 25

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para tratar superficies duras de manera repelente al suciedad, en el cual la superficie se pone en contacto con una composición que comprende al menos una hidrofobina así como al menos un solvente.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un producto para limpieza de superficies duras el cual comprende al menos una hidrofobina obtenida mediante métodos de aislamiento de proteína del 30 lisado, al menos un surfactante así como al menos un solvente.

En un cuarto aspecto la invención se refiere a superficies duras según la reivindicación 16, las cuales comprenden un recubrimiento repelente de suciedad que comprende hidrofobinas.

De manera sorprendente se ha encontrado que ya cantidades extremadamente bajas de hidrofobinas son suficientes para un efectivo tratamiento repelente de suciedad de superficies duras. 35

Para la invención puede llevarse a cabo lo siguiente en detalle:

El concepto "superficies duras" es conocido para la persona técnica en la materia. Se trata de superficies no compresibles o compresibles solo en escasa medida, en particular de superficies lisas, por ejemplo superficies de vidrio, cerámica, metales, como por ejemplo acero inoxidable o latón, metal esmaltado, plástico y/o de superficies lacadas. Ejemplos de superficies lacadas comprenden la 40 superficie de carrocerías lacadas de automóviles o la superficie de aparatos domésticos. Superficies duras pueden ser particularmente superficies típicas que se encuentran en el hogar, como por ejemplo pisos, griferías, lavabos, pozos de duchas, bañeras, inodoros, cabinas de ducha, muebles del baño, muebles de cocina como mesas, sillas, armarios, superficies de trabajo u otros muebles, espejos,

ventanas, vajilla, cubertería, cristalería, las superficies de aparatos domésticos como máquinas lavadoras, máquinas lavaplatos, estufas o campanas extractoras.

El concepto "repelente de suciedad" es conocido para la persona técnica en la materia. Por medio de un tratamiento repelente de suciedad de una superficie se impide su ensuciamiento o al menos se dificulta y/o se facilita el desprendimiento de suciedad de la superficie. "Suciedad" es todos los tipos 5 de contaminación indeseada de forma y manera conocidas de superficies duras con sustancias sólidas y/o líquidas. Ejemplos de suciedad comprenden grasas, aceites, proteínas, residuos de comida, polvo o tierra. Ensuciamientos también pueden ser depósitos de cal tales como, por ejemplo, señales secas de agua que se forman debido a la dureza del agua. Otros ejemplos comprenden residuos de productos para limpieza y productos para el cuidado del cuerpo o también jabones insolubles de cal que pueden 10 formarse a partir de productos para limpieza y cuidado en conexión con la dureza dl agua y que pueden depositarse sobre superficies duras, como por ejemplo lavabos, revestimientos de duchas o bañeras.

De acuerdo con la invención, para el tratamiento de las superficies duras de manera que repelan suciedad se usa al menos una hidrofobina. Puede emplearse solo una hidrofobina o una mezcla de 15 varias hidrofobinas diferentes.

En el contexto de de esta invención, por el término "hidrofobinas" en los ucesivo se entienden polipéptidos de la siguiente fórmula estructural (I)

Xn-C1-X1-50-C2-X0.5-C3-X1-100-C4-X1.50-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)

donde X puede representar cada uno de los 20 aminoácidos existentes naturalmente (Phe, Leu, Ser, 20 Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly). En este caso, X puede ser respectivamente igual o distinto. Los índices ubicados en X representan respectivamente la cantidad de aminoácidos, C representa cisteína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, en cuyo caso al menos cuatro de los aminoácidos nombrados con C representan cisteína, y los índices n y m representan, independientemente uno de otro, números naturales desde 0 a 500, preferible de 15 a 300. 25

Los polipéptidos según la fórmula (I) se caracterizan además por la propiedad de que a temperatura ambiente, después de recubrir una superficie de vidrio provocan un aumento del ángulo de contacto de una gota de agua de al menos 20°, preferible de al menos 25°, particularmente preferible de al menos 30°, y muy particularmente preferible de al menos 35°, respectivamente comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua igualmente grande con la superficie sin recubrir. 30

Los aminoácidos nombrados con C1 a C8 son preferiblemente cisteínas; pero también pueden reemplazarse por otros aminoácidos de llenado espacial similar, preferible por alanina, serina, treonina, metionina o glicina. Sin embargo, al menos cuatro, preferible al menos 5, particularmente preferible al menos 6 y en especial al menos 7 de las posiciones C1 a C8 deben componerse de cisteínas. En las proteínas de acuerdo con la invención las cisteínas pueden presentarse o bien en 35 forma reducida, o bien formar puentes de disulfuro unas con otras. Particularmente se prefiere la formación intramolecular de puentes C-C, en particular aquellas con al menos uno, preferible 2, particularmente 3 y muy particularmente preferible 4 puentes intramoleculares de disulfuro. En el caso del intercambio arriba descrito de cisteínas por aminoácidos de estructura espacial similar se intercambian ventajosamente aquellas C-posiciones en forma de pares, las cuales pueden formar, unas 40 con otras, puentes intramoleculares de disulfuro.

Si en las posiciones denominadas con X también se usan cisteína, serina, alanina, glicina, metionina o treonina, la numeración de las C-posiciones individuales en las fórmulas general puede modificarse de manera correspondiente.

Se prefiere emplear hidrofobinas de la fórmula general (II) 45

Xn-C1-X3-25-C2-X0-2C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X2-35-C8Xm (II)

para realizar la presente invención, en cuyo caso X, C y los índices ubicados en X tienen el significado de arriba, los índices n y m representan números entre 0 y 300 y las proteínas se caracterizan además por la modificación mencionada del ángulo de contacto.

Particularmente se prefiere emplear hidrofobinas de la fórmula general (III) 5

Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III),

en cuyo caso X, C y los índices ubicados junto a X tienen el significado de arriba, los índices n y m representan números entre 0 y 200, las proteínas también se distinguen por la modificación de ángulo de contacto mencionado arriba y en la cual, además, al menos 6 de los aminoácidos nombrados con C son cisteína. De manera particularmente preferida todos los aminoácidos C son cisteína. 10

Los residuos Xn y Xm pueden ser secuencias de péptidos que también están conectadas de manera natural con una hidrofobina. Uno o ambos residuos también pueden ser secuencias de péptidos que no estén conectadas de manera natural con una hidrofobina, por las cuales también pueden entenderse aquellos residuos Xn y/o Xm en los que una secuencia de péptidos que se da de manera natural en una hidrofobina se alarga mediante una secuencia de péptidos que no se da de manera natural en una 15 hidrofobina.

Si Xn y/o Xm son secuencias de péptidos que no se dan de manera natural en hidrofobinas, secuencias de este tipo son regularmente de al menos 20, preferible de al menos 35, particularmente preferible de al menos 50 y muy particularmente preferible de al menos 100 aminoácidos de longitud. Un residuo de este tipo, no conectado de manera natural con una hidrofobina, en lo sucesivo también debe 20 denominarse como contraparte de fusión. Para esto debe expresarse que las proteínas se componen de una parte de hidrofobina y una contraparte de fusión que no se dan juntas en la naturaleza en esta forma.

La contraparte de fusión puede seleccionarse de una gran número de proteínas. También pueden conectarse varias contrapartes de fusión con una parte de hidrofobina, por ejemplo en el extremo 25 amino (Xn) y en el extremo carboxilo (Xm) de la parte de hidrofobina. Pero también pueden estar conectadas, por ejemplo, dos contrapartes de fusión con una posición (Xn o Xm) de la proteína de la invención.

Contrapartes de fusión particularmente adecuadas son polipéptidos que se dan de manera natural en microorganismos, en particular en E. coli o Bacillus subtilis. Ejemplos de tales contrapares de fusión 30 son las secuencias yaad (SEQ ID NO: 15 y 16), yaae (SEQ ID NO: 17 y 18), y Thioredoxin. También son bien adecuados fragmentos o derivados de estas secuencias mencionadas que comprenden solo una parte, preferible 70-99 %, particularmente preferible 80-98 % de las secuencias mencionadas o en las que se han modificado aminoácidos individuales o nucleótidos en comparación con la secuencia nombrada. 35

Las proteínas usadas de acuerdo con la invención también pueden estar modificadas en su secuencia de polipéptidos, por ejemplo mediante glicosilación, acetilación, o tambióen mediante reticulación química con glutardialdehído, por ejemplo.

Una propiedad de las proteínas usadas de acuerdo con la invención es la modificación de las propiedades de superficie si las superficies se recubren con las proteínas. La modificación de las 40 propiedades de superficie puede determinarse experimentalmente midiendo el ángulo de contacto de una gota de agua antes y después del recubrimiento de una superficie con la proteína y se calcula la diferencia de ambas mediciones.

La realización de mediciones de ángulo de contacto es conocida por principio para la persona técnica en la materia. Las condiciones experimentales exactas para la medición del ángulo de contacto se 45

representan en la parte experimental. Entre las condiciones allí mencionadas, las proteínas usadas de acuerdo con la invención poseen la propiedad de aumentar el ángulo de contacto de una gota de agua sobre una superficie de vidrio en al menos 20°, preferible en al menos 25°, particularmente preferible en al menos 30°.

En la parte de hidrofobina de las hidrofobinas conocidas hasta ahora se conservan las posiciones de 5 los aminoácidos polares y apolares lo cual se expresa en un gráfico de hidrofobicidad característico. Las diferencias en las propiedades biofísicas y en la hidrofobicidad condujeron a la clasificación de las hidrofobinas conocidas hasta ahora en dos clases, I y II (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).

Las membranas ensambladas de hidrofobinas clase I son insolubles en alto grado (únicamente frente a 10 SDS de 1 % a temperatura elevada) y pueden disociarse nuevamente solo por ácido trifluoroacético (TFA) concentrado, o bien por ácido fórmico. En contraposición a esto, las formas ensambladas de hidrofobinas clase II son menos estables. Pueden volver a disolverse ya en etanol al 60% o SDS de 1% (a temperatura ambiente).

Una comparación de las secuencias de aminoácidos muestra que la longitud de la región entre cisteína 15 C3 y C4 en las hidrofobinas de clase II es distintivamente más corta que en la hidrofobinas de la clase I. Las hidrofobinas de clase II también tienen más aminoácidos cargados que las de clase I.

Hidrofobinas particularmente preferidas para la realización de la presente invención son las hidrofobinas del tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, que están caracterizadas estructuralmente en el siguiente protocolo de secuencia. También puede tratarse solamente de partes o 20 derivados de las mismas. También pueden conectarse varias hidrofobinas unas con otras, preferible 2 ó 3, de estructura igual o diferente y con una secuencia de polipéptidos adecuada correspondiente, que no está enlazada de manera natural con una hidrofobina.

Particularmente adecuadas para la realización de la presente invención son además las proteínas de fusión con las secuencias de polipéptidos representadas en SEQ ID NO: 20, 22, 24 así como con las 25 secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las mismas, en particular las secuencias según SEQ ID NO: 19, 21, 23. También son modalidades particularmente preferidas de realización proteínas que resultan a partir de las secuencias de polipéptidos representadas en SEQ ID NO. 20, 22 o 24 mediante intercambio, inserción o deleción de al menos uno hasta 10, preferible 5, particularmente preferible 5 % de todos los aminoácidos y que aún poseen la propiedad biológica de las proteínas de partida en al 30 menos 50 %. Por propiedad biológica de las proteínas se entiende aquí la modificación ya descrita del ángulo de contacto en al menos 20°.

Los polipéptidos usados según la invención pueden prepararse químicamente mediante métodos conocidos de la síntesis de péptidos, por ejemplo mediante síntesis en fase sólida según Merrifield.

Hidrofobinas que se dan naturalmente pueden aislarse de fuentes naturales por medio de métodos 35 adecuados. A manera de ejemplo puede hacerse referencia a Wösten et al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO 96/41882.

La preparación de proteínas de fusión puede efectuarse preferiblemente mediante métodos de ingeniería genética en los que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la contraparte de fusión y una que codifica para la parte de hidrofobina, en particular secuencias de ADN, se combinan 40 de tal manera que la proteína deseada se genera en un organismo huésped mediante expresión génica de la secuencia combinada de ácidos nucleicos. Un método de preparación de este tipo se divulga en nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4 (WO 2006/082251).

Organismos huéspedes adecuados (organismos de producción) para el proceso de preparación mencionado puede ser en este caso procariotas (incluyendo arqueas) o eucariotas, particularmente 45

bacterias, incluyendo halobacterias y metanococos, hongos, células de insectos, células vegetales y células de mamíferos, particularmente se prefieren Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacilos, Hansenula polymorpha, Trichoma reesei, SF9 (o bien células relacionadas), entre otras. 5

En el contexto de las presentes invenciones pueden emplearse constructos de expresión obtenidos bajo control genético de secuencias regulatorias de ácidos nucleicos, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un polipéptido usado de acuerdo con la invención, así como vectores que comprenden al menos uno de estos constructos de expresión para la preparación de hidrofobinas.

Los constructos empleados comprenden preferiblemente un promotor 5’-corriente arriba de la 10 secuencia codificante respectiva y una secuencia de terminador 3’-corriente abajo así como opcionalmente otros elementos regulatorios usuales cada uno enlazado de manera operativa a la secuencia codificante.

Por una "conexión operativa" se entiende la disposición secuencial del promotor, secuencia codificante, terminador y, opcionalmente, otros elementos regulatorios de tal tipo que cada uno de los 15 elementos regulatorios pueda cumplir su función tal como se requiere durante la expresión de la secuencia codificante.

Ejemplos de secuencias conectables de manera operativa son secuencias de direccionamiento así como potenciadoras (enhancer), señales de poliadenilación y similares. Otros elementos regulatorios comprenden marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de replicación y similares. 20 Se describen secuencias regulatorias adecuadas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Adicionalmente a estas secuencias de regulación aún puede estar presente la regulación natural de estas secuencias antes de los genes estructurales propios y, opcionalmente, puede haberse modificado genéticamente de tal modo que la regulación natural se desconecte y se haya elevado la expresión de 25 los genes.

Un constructo preferido de ácido nucleico también contiene ventajosamente una o varias de las ya mencionadas secuencias "enhancer" (potenciadoras), conectadas funcionalmente con el promotor, las cuales hacen posible una expresión elevada de la secuencia de ácidos nucleicos. En el extremo 3’ de las secuencias de ADN también pueden insertarse secuencias ventajosas adicionales, tales como otros 30 elementos regulatorios o terminadores

Los ácidos nucleicos pueden estar contenidos en una o varias copias en el constructo. En el constructo también pueden estar contenidos otros marcadores como resistencias a antibióticos o genes que complementan auxotrofias, opcionalmente para la selección del constructo.

Secuencias de regulación ventajosas para el método están contenidas, por ejemplo, en promotores 35 tales como cos, tac, trp, tet-trp, tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara , rhaP (rhaPBAD) SP6, lambda-PR o en el promotor lambda-P, los cuales hallan ventajosamente aplicación en bacterias gran-negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas están contenidas, por ejemplo, en los promotores gran-positivos amy y SP02, en promotores levadura u hongos ADC1, MFalpha. AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. 40

También pueden usarse promotores artificiales para la regulación.

Para expresar el constructo de ácido nucleico en un organismo huésped se inserta ventajosamente a un vector , por ejemplo un plásmido o un fago, que hace posible una expresión óptima de los genes en el huésped. Por vectores, además de plásmidos y fagos, también pueden entenderse todos los otros vectores conocidos para la persona técnica en la materia, es decir, por ejemplo, virus como SV40, 45

CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, IS-elementos, fásmidos, cósmidos y ADN lineales o circulares, así como el sistema agrobacterium.

Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo huésped o de manera cromosómica. Estos vectores representan otra modalidad de la invención. Plásmidos adecuados están, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, 5 pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-B1, tgt11 o pBdCI, en streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, pIL2 o pBB116, en levaduras 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos mencionados representan una pequeña selección de los plásmidos posibles. Otros 10 plásmidos son conocidos para la persona técnica en la materia y pueden inferirse de l libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

Para la expresión de los otros genes contenidos el constructo de ácido nucleico contiene ventajosamente de manera adicional secuencias regulatorias 3’- y/o 5’-terminales para incrementar la 15 expresión, las cuales se seleccionan para una expresión óptima según el organismo huésped seleccionado y el gen o los genes.

Estas secuencias regulatorias deben hacer posible la expresión dirigida de los genes y de la expresión de proteína. Esto puede significar, por ejemplo, según el organismo huésped que el gen sólo se expresa o sobre-expresa después de la inducción, o que se expresa y/o sobre-expresa inmediatamente. 20

Las secuencias regulatorias o factores pueden influir ventajosamente en este caso la expresión génica de los genes introducidos y de esta manera incrementarla. Así puede efectuarse un refuerzo de los elementos regulatorios de manera ventajosa al nivel de transcripción usando señales fuertes de transcripción como promotores y/o "enhancers". Además, también es posible un refuerzo de la traducción (translation), mejorando por ejemplo la estabilidad del ARNm. 25

En otra modalidad del vector, el vector que contiene el constructo de ácido nucleico o el ácido nucleico también puede introducirse ventajosamente en forma de un ADN lineal a los microorganismos e integrarse por recombinación heteróloga u homóloga al genoma del organismo huésped. Este ADN lineal puede componerse de un vector linealizado como un plásmido o solo del constructo de ácido nucleico o del ácido nucleico. 30

Para una expresión óptima de los genes heterólogos en organismos es ventajoso modificar las secuencias de ácidos nucleicos de manera correspondiente al "codon usage" usado específicamente en el organismo. El "codon usage" puede determinarse por medio de análisis en ordenador de otros genes del organismo en cuestión.

La preparación de un casete de expresión se efectúa por fusión de un promotor adecuado con una 35 secuencia codificante adecuada así como con un terminador o una señal de poliadenilación. Para esto se usan técnicas corrientes de recombinación y clonación, tal como se describen, por ejemplo en T. Maniatis, E. F.Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y 40 en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience (1987).

El constructo recombinante de ácido nucleico o constructo génico en un organismo huésped adecuado para la expresión se inserta a un vector específico de huésped, que hace posible una expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores son bien conocidos para el experto en la materia y pueden 45

tomarse, por ejemplo, de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

Con ayuda de los vectores pueden producirse microorgasnimos recombinantes que se transforman, por ejemplo, con al menos un vector y pueden emplearse para la producción de los polipéptidos usados de acuerdo con la invención. Los constructos recombinantes descritos arriba se introducen de manera 5 ventajosa a un sistema huésped adecuado y se expresan. En tal caso se usan ventajosamente métodos corrientes de clonación y transfección, conocidos para el experto en la materia, como por ejemplo co-precipitación, fusión de protoplastos, electroporación, transfección retroviral y similares, con el fin de provocar la expresión de los ácidos nucleicos nombrados en el respectivo sistema de expresión. Sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel 10 et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, o Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

También pueden producirse microorganismos recombinados de manera homóloga. Para esto se produce un vector que contiene al menos un segmento de un gen a usar de acuerdo con la invención o 15 de una secuencia codificante, donde opcionalmente se ha introducido al menos una deleción, adición o sustitución de aminoácido para modificar la secuencia, por ejemplo para desbaratar funcionalmente (vector "knockout"). La secuencia introducida también puede ser, por ejemplo, un homólogo de un microorganismo relacionado o puede derivarse de una fuente de mamífero, de levadura o de insecto. El vector usado para la recombinación homóloga puede configurarse alternativamente de tal manera 20 que el gen endógeno muta con en la recombinación homóloga o se modifica de alguna otra manera aunque codifica aún la proteína funcional (por ejemplo, la región regulatoria ubicada corriente arriba puede modificarse de tal manera que se modifica así la expresión de la proteína endógena). El segmento modificado del gen usado de acuerdo con la invención está en el vector homólogo de recombinación. La construcción de vectores adecuados para la recombinación homóloga se describe, 25 por ejemplo, en Thomas, K. R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Como organismos huéspedes recombinantes para el ácido nucleico, o constructo de ácido nucleico, usado de acuerdo con la invención se consideran en principio todos los organismos procariotas o eucariotas. Como organismos huéspedes se usan ventajosamente microorganismos como bacterias, hongos o levaduras. Se prefieren ventajosamente bacterias gran-positivas o gran-negativas de las 30 familias Enterobactenaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, particularmente se prefiere usar bacterias de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus.

Los organismos usados en el proceso de producción de proteínas de fusión se hacen crecer o se cultivan de una manera conocida para el experto en la materia, dependiendo del organismo huésped. 35 Regularmente se cultivan microorganismos en un medio líquido que contiene una fuente de carbohidrato, la mayoría de las veces en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, la mayoría de las veces en forma de fuentes orgánicas de nitrógeno tales como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, microelementos como sales de hierro, manganeso y magnesio, así como opcionalmente vitaminas, a temperaturas entre 0 y 100 °C, preferible entre 10 a 60 °C mientras se suministra 40 oxígeno. En este caso el valor de pH del líquido nutriente puede mantenerse a un valor fijo, lo que significa que durante el cultivo puede regularse o no. El cultivo puede efectuarse a manera de "batch" (lote), "semibatch" o continuamente. Los nutrientes pueden introducirse inicialmente al comienzo de la fermentación o alimentarse posteriormente de manera semi-continua o continua. Las enzimas

pueden aislarse según los métodos descritos en los ejemplos a partir de los organismos o usarse como extracto crudo para la reacción.

Los polipéptidos usados según la invención o los fragmentos funcionales, biológicamente activos de los mismos pueden producirse mediante un método recombinante en el que se cultiva un microorganismo que produce polipéptidos, opcionalmente se induce la expresión de los polipéptidos y 5 se aíslan éstos del cultivo. Así, si se desea, los polipéptidos también pueden producirse a gran escala industrial. El microroganismo recombinantes puede cultivarse y fermentarse de acuerdo con métodos conocidos. Pueden reproducirse bacterias en medio TB o LB, por ejemplo y a una temperatura de 20 a 40 °C y a un valor de pH de 6 a 9. Condiciones adecuadas de cultivo se describen en detalle, por ejemplo, en T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 10 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Las células se rompen si los polipéptidos no se secretan al medio de cultivo y el producto se obtiene del lisado según métodos conocidos para el aislamiento de proteína. Las células pueden romperse de manera opcional mediante ultrasonido de alta frecuencia, mediante presión alta, como por ejemplo en una celda de presión francesa, mediante osmólisis, por la acción de detergentes, enzimas líticas o 15 solventes orgánicos, por homogenizadores o mediante combinación de varios de los métodos listados.

Puede lograrse una purificación de los polipéptidos con métodos cromatográficos conocidos, como cromatografía con tamices moleculares (filtración de gel), como la cromatografía de Q-sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrófoba, así como con otros métodos usuales tales como ultrafiltración, cristalización, precipitación por adición de sal, diálisis y electroforesis 20 nativa de gel. Se describen métodos adecuados, por ejemplo, en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden (Métodos bioquímicos de trabajo), Verlag Walter de Gruyter (editorial), Berlin, New York o en Scopes, R., Protein Purification, editorial Springer, New York, Heidelberg, Berlin.

Puede ser ventajoso usar sistemas de vectores u oligonucleótidos para aislar la proteína recombinante, los cuales alargan el ADNc en determinadas secuencias de nucleótido y con esto codifican para 25 polipéptidos modificados o proteínas de fusión que sirven, por ejemplo, para una purificación más sencilla. Modificaciones adecuadas de este tipo comprenden a los llamados "tags" (etiquetas) que fungen como anclas, como por ejemplo la modificación o epítope conocida como ancla-hexahistidina, las cuales pueden ser reconocidas como antígenos de anticuerpos (descrito por ejemplo en Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Otros tags 30 adecuados son, por ejemplo, HA, calmodulin-BD, GST, MBD; quitina-BD, esteptavidin-BD-Avi-tag, Flag-Tag, T7 etc. Estas anclas pueden servir para pegar las proteínas a un soporte sólido, como por ejemplo una matriz polimérica, la cual puede estar empacada, por ejemplo, en una columna cromatográfica, o puede usarse en una placa de microtitulación o en otro soporte. Los protocolos correspondientes de purificación pueden obtenerse de los proveedores comerciales de tag de afinidad. 35

Las proteínas producidas tal como se describe pueden usarse tanto de manera directa como proteínas de fusión, como también después de la disociación y separación de la contraparte de fusión, como hidrofobinas "puras".

Si está prevista una separación de la contraparte de fusión se recomienda incorporar un sitio potencial de escisión (sitio específico de reconocimiento para proteasas) a la proteína de fusión entre la parte de 40 hidrofobina y la contraparte de fusión. Como sitio de escisión son particularmente adecuadas aquellas secuencias de péptidos que de otra manera no tienen lugar en la parte de hidrofobina ni en la contraparte de fusión, lo cual puede determinarse fácilmente con herramientas bioinformáticas. Particularmente adecuadas son, por ejemplo, la escisión BrCN en metionina, o escisión mediada por

proteasa con escisión de factor Xa, de enteroquinasa, de trombina, de TEV (proteasa de tobacco etch virus).

Para el uso de acuerdo con la invención de hidrofobinas para el tratamiento repelente de suciedad de superficies duras, las hidrofobinas también pueden usarse en sustancia. Sin embargo, se prefieren las hidrofobinas como formulaciones o composiciones en al menos un solvente adecuado. 5

La selección de las hidrofobinas para realizar la invención no se limita. Pueden emplearse una o también varias hidrofobinas diferentes. El experto en la materia hará una selección adecuada. Por ejemplo, pueden emplearse proteínas de fusión, como por ejemplo yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) o yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO. 21).

Los solventes para formulaciones pueden ser agua y/o solventes orgánicos. Obviamente también 10 pueden emplearse mezclas de solventes. El tipo del solvente depende la hidrofobina, del tipo de la superficie a tratar así como de la aplicación y se selecciona de manera correspondiente por parte del experto en la materia. Para aplicaciones domésticas se prefieren en general agua o formulaciones acuosas. En las aplicaciones industriales se toman en cuenta tanto las formulaciones acuosas como también las formulaciones no acuosas. 15

El solvente es preferiblemente agua o mezclas de agua y solventes orgánicos miscibles con agua. Ejemplos de solventes orgánicos de este tipo comprenden alcoholes monohídricos o polihídricos miscibles con agua, como por ejemplo metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, etilenglicol, propilenglicol o glicerina. Además, también pueden ser hidroxi-éteres. Ejemplos comprenden éteres monoalquílicos de (poli)etilen- o (poli)propilenglicoles, tales como éter de etilenglicolmonabutilo. El 20 tipo y la cantidad de los solventes orgánicos, solubles en agua se seleccionan por el experto en la materia.

Para producir la composición usada de acuerdo con la invención pueden emplearse preferiblemente las soluciones acuosas de las hidrofobinas obtenidas durante la síntesis, aislamiento y/o purificación de las hidrofobinas. Dependiendo de su pureza, estas soluciones pueden contener aún residuos de 25 sustancias auxiliares de la síntesis. Obviamente las hidrofobinas también pueden aislarse primero como sustancia, por ejemplo mediante secamiento por congelación (liofilización), y formularse sólo en un segundo paso.

La cantidad de las hidrofobinas en la formulación puede determinarse por parte del experto en la materia dependiendo del tipo de la superficie y/o de la aplicación. Sin embargo, ya cantidades 30 relativamente pequeñas son suficientes para lograr una acción repelente de suciedad. Una cantidad de 0,0001 a 1 % en peso respecto de la suma de todos los componentes de la formulación ha demostrado ser satisfactoria sin que con esto se deba restringir la invención a este rango. Preferiblemente, la cantidad es de 0,0005 a 0,5 % en peso y particularmente preferible 0,001 a 0,1 % en peso.

La composición usada es preferiblemente un producto de limpieza como, por ejemplo, un limpiador 35 de vidrios, limpiador de pisos, limpiador todo-propósito, limpiador de baño, auxiliar de enjuague, producto para lavar platos a mano o en máquina, limpiador de máquinas, desengrasante de metales, limpiador a presión alta, limpiadores alcalinos, limpiadores ácidos, desengrasantes de puntas o limpiadores de lecherías. El producto de limpieza de acuerdo con la invención comprende además de un solvente y de al menos una hidrofobina obtenida del lisado mediante métodos de aislamiento de 40 proteína de una manera y modo conocidas en principio uno o más surfactantes en cantidades efectivas.

Las composiciones pueden ser productos para el pre- o pos-tratamiento de superficies duras, en particular vidrio, cerámica o pisos.

Los surfactantes pueden ser surfactantes aniónicos, no iónicos, anfóteros y/o catiónicos. Surfactantes de este tipo así como su respectivo propósito de uso son conocidos para el experto en la materia. 45

Ejemplos de surfactantes aniónicos comprenden sulfatos de alcohol graso, sulfatos de éter alquílico, sulfonatos de alcano, sulfonatos de alquilbenceno o fosfatos de alquilo. Pueden emplearse los ácidos libres o sales de los mismos.

Ejemplos de surfactantes no iónicos comprenden alcoholes de C8-C22 alcoxilados, tales como alcoxilados de alcohol graso o alcoxilados de oxoalcohol, etoxilados de alquilfenol con cadenas de 5 alquilo de C6-C14 y 5 a 30 moles de unidades de óxido de etileno, alquilpoliglucósidos con 8 a 22 en la cadena de alquilo, alcoxilados de alquilamino o etoxilados de alquilamida.

Ejemplos de surfactantes anfóteros comprenden betaínas de alquilo, betaínas de alquilamida, aminopropionatos, aminoglicinatos o compuestos anfóteros de imidazolio.

Ejemplos de surfactantes catiónicos comprenden sales de amonio cuaternario sustituidos o sin 10 sustituir, de cadena recta o ramificados, por ejemplo haluros de dialquil(de C8-6)dimetilamonio, haluros de dialcoxidimetilamonio o sales de imidazolio con residuo de alquilo de cadena larga.

Otros ejemplos de suerfactantes se listan en DE-A 101 60 993, párrafos [0056] a [0073].

El experto en la materia hará una elección adecuada respecto del tipo y la cantidad de los surfactantes. Una cantidad de 0,01 a 30 % en peso de los surfactantes respecto de la suma de todos los componentes 15 de la formulación ha demostrado ser satisfactoria.

La formulación puede comprender opcionalmente además otros componentes, por ejemplo aditivos y/o auxiliares. Ejemplos de componentes de este tipo comprenden ácidos o bases, por ejemplo ácidos carboxílicos o amoniaco, sistemas amortiguadores (búfer), polímeros, partículas inorgánicas como SiO2 o silicatos, colorantes, perfumes o biocidas. Otros ejemplos de aditivos se listan en DE-A 101 60 20 993, en particular párrafos [0074] a [0131]. El experto en la materia hará una elección adecuada respecto del tipo y la cantidad de los componentes adicionales dependiendo de la aplicación.

De acuerdo con la invención, el tratamiento repelente de suciedad de superficies duras se realiza poniendo en contacto la superficie dura con una composición que comprende al menos una hidrofobina así como al menos un solvente. 25

La "puesta en contacto" depende del tipo del objeto. Puede efectuarse mediante aspersión, enjuague o frotación de la superficie con la composición o también mediante inmersión del objeto entero en la formulación. Esto último es posible naturalmente solo en el caso de objetos que no estén incorporados a una construcción. La duración del tratamiento se fija por parte del experto en la materia. Puede durar desde algunos segundos hasta varias horas. La superficie puede enjuagarse posteriormente después del 30 tratamiento, por ejemplo con agua, para remover exceso de solución de tratamiento.

El tratamiento repelente de agua puede efectuarse de manera particularmente ventajosa en combinación con una limpieza; es decir, como consecuencia de la propia misma operación de limpieza. Para esto se emplea un producto de limpieza que, tal como se describe arriba, comprende al menos una hidrofobina, al menos un surfactante así como al menos un solvente. 35

El procedimiento puede efectuarse a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente o a temperaturas elevadas, por ejemplo a 20 hasta 100 °C, preferible 20 hasta 60 °C. El tratamiento se efectúa preferiblemente a temperaturas no mayores de 30 °C, en particular 20 a 30 °C.

Después de tratarse con la composición se seca la superficie tratada. El secamiento de las superficies tratadas puede efectuarse a temperatura ambiente casi por sí mismas, o también puede secarse a 40 temperaturas elevadas.

Después del tratamiento, y opcionalmente del secado de la superficie, puede seguir un pos-tratamiento térmico de la superficie a temperaturas elevadas, por ejemplo a temperaturas de hasta 12º °C. Por supuesto, el pos-tratamiento térmico también puede efectuarse de manera combinada con el secamiento. En un pos-tratamiento térmico, las temperaturas alcanzan preferiblemente de 30 a 100 °C, 45

particularmente preferible de 40 a 80 °C y, por ejemplo, de 50 a 70 °C. La duración de tratamiento se establece por parte del experto en la materia, puede ser, por ejemplo, de 1 minuto a 10 horas.

Mediante el método de acuerdo con la invención puede obtenerse una superficie dura que presenta un recubrimiento repelente de suciedad que comprende al menos una hidrofobina. El recubrimiento es regularmente al menos una capa monomolecular de la hidrofobina sobre la superficie. 5

El efecto repelente de suciedad puede determinarse por medio de métodos conocidos en principio, por ejemplo comparando la capacidad de desprenderse del suciedad mediante enjuague con agua de una superficie no tratada y de una superficie tratada con hidrofobinas.

Las hidrofobinas tienen un efecto distintivo ya en cantidades pequeñas. El procedimiento con una composición que contiene solo 0.01 % en peso de hidrofobina conduce ya a un desprendimiento de 10 suciedad distintivamente mejorado.

Además del tratamiento repelente de suciedad según la invención puede lograrse también una hidrofobización distintiva de la superficie. En espacios húmedos, como por ejemplo en los cuartos de baño, esto es una ventaja adicional.

Los siguientes ejemplos deben aclarar la invención en más detalle: 15

Parte A:

Preparación y ensayo de las hidrofobinas usadas de acuerdo con la invención

Ejemplo 1

Trabajo preliminar para la clonación de yaad-His6/ yaaE-His6

Con ayuda de los oligonucleótidos Hal570 y Hal571 (Hal572 / Hal573) se llevó a cabo una reacción 20 en cadena de polimerasa. Como ADN matriz (template) se usó ADN genómico de la bacteria Bacillus subtilis. El fragmento PCR obtenido contenía la secuencia codificante del gen yaaD / yaaE de Bacillus subtilis, y en los extremos respectivamente un sitio de corte de restricción Ncol o bien Bglll. El fragmento PCR se purificó y se cortó con endonucleasas de restricción Ncol y Bglll. Este fragmento de ADN se usó como inserto y se clonó al vector pQE60 de la empresa Qiagen, linealizado 25 previamente con las endonucleasas de restricción NcoI y Bglll. Los vectores pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 así generados pueden usarse para la expresión de proteínas compuestas de YAAD::HIS6 o bien YAAE::HIS6.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac 30

Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

Ejemplo 2

Clonación de yaad-hidrofobina DewA-His6

Con ayuda de los oligonucleótidos KaM416 y KaM417 se realizó una reacción en cadena de 35 polimerasa. Como ADN matriz (template) se usó ADN genómico del moho Aspergillus nidulans. El fragmento PCR obtenido contenía la secuencia codificante del gen hidrofobina dewA y un sitio de corte de proteinasa factor Xa N-terminal. El fragmento PCR se purificó y se cortó con la endonucleasa de restricción BamHI. Este fragmento de ADN se usó como inserto y se clonó al vector pQE60YAAD#2 linealizadopreviamente con la endonucleasa de restricción Bglll.. 40

El vector #508 generado de esta manera puede usarse para la expresión de una proteína de fusión que se compone de YAAD: Xa: dewA : HIS6.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC

Ejemplo 3 45

Clonación de yaad-Hidrofobina RodA-His6

La clonación del plásmido #513 se efectuó de manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM434 y KaM435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC

KaM435: GCAATGGGGATCCGAGGATGGAGGCAAGGG 5

Ejemplo 4

Clonación de vaad-hidrofobina BASF1-His6

La clonación del plásmido #507 se efectuó de manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM417 y KaM418.

Como ADN matriz (template) se empleó una secuencia de ADN - hidrofobina BASF1 - sintetizada 10 artificialmente (véase apéndice).

KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Ejemplo 5

Clonación de yaad-hidrofobina BASF2-His6 15

La clonación del plásmido #506 se efectuó de manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM417 y KaM418.

Como ADN matriz (template) se empleó una secuencia de ADN - hidrofobina BASF2 – sintetizada artificialmente (véase apéndice).

KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGGCGGATGAAGTTCTCCGTCTCCG C 20

KaM418 CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Ejemplo 6

Clonación de yaad-hidrofobina SC3-His6

La clonación del plásmido #526 se efectuó de manera análoga al plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM464 y KaM465. 25

Como ADN matriz (template) se empleó ADNc de Schyzophyllum commune (véase apéndice).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC

KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Ejemplo 7

Fermentación de la cepa de E.coli recombinante yaad-hidrofobina DewA-His6 30

Inoculación de 3 ml de medio líquido LB con una cepa de E. coli que expresa yaad-hidrofobina DewA-His6 en tubitos de Greiner de 15 ml. Incubación por 8 h a 37°C sobre un agitador con 200 rpm. Se inoculan 2 matraces de Erlenmeyer de 1 L con deflectores y 250 ml de medio LB (+100 g/ml de ampicilina) respectivamente con 1 ml del pre-cultivo y se incuban 9 h a 37°C sobre un agitador con 180 rpm. Se inoculan 13.5 L de medio LB (+100 g/ml de ampicilina) en un fermentador de 20 L con 35 0,5 L de pre-cultivo (OD600nm 1:10 medida en contraste con H2O). A una OD600nm de -3.5 se adicionan 140 ml de IPTG de 100 mM. Después de 3 h se enfría el fermentador a 10°C y se separa por centrifugación el caldo de fermentación. Se usan comprimidos de células para purificación adicional.

Ejemplo 8

Purificación de la proteína de fusión – hidrofobina recombinante 40

(Purificación de hidrofobina-proteínas de fusión que poseen una etiqueta (tag) His6 C-terminal)

100 g de comprimido de células (100-500 mg de hidrofobina) se llevan a un volumen de 200 ml de volumen total con búfer de fosfato de sodio de 50 mM, pH 7,5 y se resuspenden. La suspensión se trata con un Ultraturrax Tipo T25 (Janke y Kunkel, IKA-Labortechnik) por 10 min behandelt y a continuación se incuba por 1 h a temperatura ambiente con 500 unidades de benzonasa (Merck, 45

Darmstadt; No. de orden 1.01697.0001) para la degradación de ácidos nucleicos. Antes de romper las células se filtra con un cartucho de vidrio (P1) filtriert. Para la ruptura de células y para el ciomogenizador a 1.500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). El homogenizado se centrifuga (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, vaso de centrifuga de 250 ml, 60 min, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g), el sobrenadante se pone sobre hielo y la pastilla (pelet) se vuelve a suspender en 100 ml de 5 búfer de fosfato de sodio, pH 7,5. La centrifugación y re-suspensión se repiten tres veces, en cuyo caso el búfer de fosfato de sodio contiene 1 % de SDS en la tercera repetición. Después de la re-suspensión se revuelve por una hora y se realiza una centrifugación final (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, vaso de centrifuga de 250 ml, 60 min, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g). Según análisis SDS-PAGE la hidrofobina está presente en el sobrenadante después de la centrifugación final (fig. 1). Los ensayos 10 mostraron que la hidrofobina está presente en las células correspondientes de E. coli probablemente en forma de cuerpos de inclusión. 50 ml del sobrenadante que contiene hidrofobina se aplicaron sobre una columna de sefarosa – níquel de alto desempeño (High Performance) de 50 ml 17-5268-02 (Amersham), la cual se había equilibrado con búfer Tris-Cl de 50 mM, pH 8,0. La columna se lava con búfer de tris-Cl de 50 mM, pH 8,0, y a continuación la hidrofobina se eluyó con búfer de Tris-Cl 15 de 50 mM, pH 8,0 que contiene imidazol de 200 mM. Para remover el imidazol, la solución se dializó frente a búfer de tris-Cl de 50 mM pH 8,0.

La figura 1 muestra la purificación de la hidrofobina producida:

Pista 1. Solución aplicada a columna de sefarosa – níquel (dilución 1:10)

Pista 2: paso de caudal = eluato del paso de lavado 20

Pistas 3-5: OD280 máximos de las fracciones de elución

La hidrofobina de la figura 1 posee un peso molecular de cerca de 53 kD. Las bandas pequeñas representan en parte los productos de degradación de la hidrofobina.

Ejemplo 9

Ensayo técnico: caracterización de la hidrofobina mediante modificación de ángulo de contacto de una 25 gota de agua sobre vidrio

Substrato:

Vidrio (vidrio de ventana, marca Suddeutsche Gas, Mannheim, Alemania):

Concentración de hidrofobina: 100 g/mL

Incubación de plaquetas de vidrio por una noche (temperatura 80 °C) en acetato de Na de 50 mM pH 30 4 + Tween 20 al 0,1%, después lavar el recubrimiento en agua destilada y después incubación por 10 min / 80 °C /1%de solución de SDS en agua destilada. Lavar en agua destilada

Las muestras se secan al aire y se determina el ángulo de contacto (en grados) de una gota de 5 L de agua.

La medición del ángulo de contacto se determinó en un aparato Dataphysics Contact Angle System 35 OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (Noviembre 2002). La medición se efectuó según los datos del fabricante.

El vidrio no tratado dio un ángulo de contacto de 30± 5°, un recubrimiento con la hidrofobina funcional según el Ejemplo 8 (yaad-dewA-his6) dio ángulo de contacto de 75±5°.

Parte B: 40

Uso de hidrofobinas para el recubrimiento repelente de suciedad de superficies duras

Solución usada:

Para los ensayos de aplicación industrial se empleó una solución en agua de la proteína de fusión preparada según el ejemplo 8 yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19). Concentración de la hidrofobina en solución: 100 g/ml (0,01 % en peso).

Superficie dura usada:

Baldosa de cerámica, blanca brillante, 10 cm x 15 cm (empresa Novocker), restregada con etanol y 5 agua.

Suciedad usada:

Para los ensayos se usó suciedad de carga IKW (según la revista Jabones, grasas, aceites, ceras (SÖFW), 124, 14/98, página 1029)

Realización del tratamiento 10

Sobre una baldosa se aplicaron en gotas 2 g de la solución acuosa de hidrofobina con una concentración de 100 g/ml (1,3 m de hidrofobina/cm2) y y se frotó ligeramente con un paño, de manera que quedó cubierta toda la superficie. Acto seguido, la baldosa se secó inmóvil al aire por 24 horas.

A continuación la baldosa se lavó con agua y se puso por 3x 10 min en un vaso de vidrio. Por cada 15 lavada se secó luego al aire.

Medición de ángulo de contacto y efecto repelente de suciedad

Sobre la baldosa tratada se midió un ángulo de contacto de 56° con una gota de agua (Valor medio de 10 mediciones). Una baldosa no tratada en comparación muestra un ángulo de contacto de 20°. Es decir que la baldosa fue hidrofobizada de manera distintiva. 20

Sobre la baldosa tratada y en comparación también se aplicaron en forma de puntos sobre una baldosa no tratada respectivamente 50, 100 y 200 g de suciedad de carga IKW con una pipeta de transferencia y se secaron por 1 h a temperatura ambiente.

Las baldosas se lavaron luego 3x respectivamente con 500 ml de agua. Mientras que el suciedad no se separó de la superficie no tratada, pudo observarse un desprendimiento parcial de suciedad del 25 baldosín pretratado con hidrofobina.

El pretratamiento con hidrofobina condujo de este modo a una adherencia más bja del suciedad.

LISTADO DE SECUENCIAS

<210> SEQ ID NO:1

<211> 405 30

<212> ADN

<213> Aspergillus nidulans

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(405) 35

<223>

<400> 1

<210> SEQ ID NO:2

<211> 135 5

<212> PRT

<213> Aspergillus nidulans

<400> 2

<210> SEQ ID NO:3

<211> 471

<212> ADN 5

<213> Aspergillus nidulans

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(471)

<223> 10

<400> 3

<210> SEQ ID NO:4

<211> 157

<212> PRT

<213> Aspergillus nidulans 5

<400> 4

<210> SEQ ID NO:5

<211> 336

<212> ADN

<213> desconocida 5

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<223> secuencia de hidrofobina con patrón característico de cisteína

<400> 5 10

<210> SEQ ID NO:6

<211> 112

<212> PRT

<213> desconocida 5

<220>

·

<223> Secuencia de hidrofobina con patrón característico de cisteína

<400> 6

10

<210> SEQ ID NO:7

<211> 357

<212> ADN

<213> desconocida

<220> CDS 5

<221> CDS

<222> (1)..(357)

<223> <220>

<223> secuencia de hidrofobina con patrón característico de cisteína

<400> 7 10

<210> SEQ ID NO:8

<211> 119

<212> PRT 15

<213> desconocida

<220>

<223> secuencia de hidrofobina con patrón característico de cisteína

<400> 8

<210> SEQ ID NO:9

<211> 408

<212> ADN

<213> Schizophyllum communae 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(408)

<223>

<400> 9 10

<210> SEQ ID NO:10

<211> 136

<212> PRT 5

<213> Schizophyllum communae

<400> 10

<210> SEQ ID NO:11

<211> 483

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(483)

<223> Secuencia artificial de hidrofobina con patrón característico de cisteína

<400> 11 10

<210> SEQ ID NO:12

<211> 161

<212> PRT 5

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia Artificial de hidrofobina con patrón característico de cisteína

<400> 12

<210> SEQ ID NO:13

<211> 465

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(465)

<223> Secuencia Artificial de hidrofobina con patrón característico de cisteína

<400> 13 10

<210> SEQ ID NO:15

<211> 882

<212> ADN 5

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(882)

<223> 10

<400> 15

<210> SEQ ID NO:14

<211> 155

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Secuencia Artificial de hidrofobina con patrón característico de cisteína

<400> 14

<210> SEQ ID NO:16

<211> 294

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 16

<210> SEQ ID NO:17

<211> 591

<212> ADN 5

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(591)

<223> 10

<400> 17

<210> SEQ ID NO:18

<211> 197

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis 5

<400> 18

<210> SEQ ID NO:19

<211> 1329

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(1329)

<223> proteína de fusión

<400> 19 10

<210> SEQ ID NO:20

<211> 443

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> proteína de fusión

<400> 20

10

<210> SEQ ID NO:21

<211> 1395

<212> ADN 5

<213> Secuencia Artificial

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(1395)

<223> proteína de fusión 10

<400> 21

<210> SEQ ID NO:22

<211> 465

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> proteína de fusión

<400> 22

5

<210> SEQ ID NO:23

<211> 1407

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(1407)

<223> proteína de fusión

<400> 23 10

<210> SEQ ID NO:24

<211> 469

<212> PRT 5

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> proteína de fusión

<400> 24

10

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso de hidrofobinas para el tratamiento repelente de suciedad de superficies duras.
2. 2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento repelente de suciedad se efectúa en combinación con una limpieza de la superficie.
3. 3. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque para el tratamiento se emplea un producto de 5 limpieza que comprende al menos una hidrofobina, un surfactante y un solvente.
4. 4. Método para el tratamiento repelente de suciedad de superficies duras, caracterizado porque se pone en contacto la superficie con una composición que comprende al menos una hidrofobina y un solvente.
5. 5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque la composición es un producto para 10 limpieza que comprende al menos una hidrofobina, un surfactante y un solvente.
6. 6. Método según la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque la cantidad de las hidrofobinas en la composición es de 0,0001 a 1 % en peso respecto de la suma de todos los componentes de la composición.
7. 7. Método según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el tratamiento se efeectúa a 15 temperaturas por debajo de 30°C.
8. 8. Método según una de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque las hidrofobinas son al menos una hidrofobina de fusión.
9. 9. Método según una de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque la superficie son superficies que están presentes en el hogar. 20
10. 10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la superficie dura se selecciona del grupo de las superficies de pisos, accesorios como grifería, pozos de lavado, pilas de ducha, inodoros, cabinas de ducha, muebles de cuartos de baño, muebles, espejos, platos, cubertería, vasos o las superficies de aparatos domésticos.
11. 11. Producto de limpieza para superficies duras caracterizado porque el producto de limpieza 25 comprende al menos una hidrofobina obtenida del lisado mediante métodos de aislamiento de proteína, al menos un surfactante y un solvente.
12. 12. Producto de limpieza según la reivindicación 11, caracterizado porque al menos uno de los solventes es agua.
13. 13. Producto de limpieza según la reivindicación 11 o 12, caracterizado porque la cantidad de las 30 hidrofobinas es de 0,0001 a 1 % en peso respecto de la suma de todos los componentes del producto de limpieza.
14. 14. Producto de limpieza según la reivindicación 11 o 12, caracterizado porque la cantidad de las hidrofobinas es de 0,001 a 0,1 % en peso respecto de la suma de todos los componentes del producto de limpieza. 35
15. 15. Producto de limpieza según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque las hidrofobinas obtenidas del lisado mediante métodos de aislamiento de proteína son al menos una hidrofobina de fusión.
16. 16. Superficie dura que comprende un recubrimiento repelente de suciedad caracterizada porque el recubrimiento comprende al menos una hidrofobina y porque la superficie dura se selecciona del 40 grupo de superficies de pisos, accesorios como grifería, pozos para lavar, pilas para ducha, bañeras, inodoros, cabinas de ducha, muebles de cuarto de baño, muebles, espejos, platos, cubertería, vasos o las superficies de los aparatos domésticos.
17. 17. Superficie dura según la reivindicación 16, caracterizada porque la superficie puede obtenerse mediante un método según una de las reivindicaciones 4 a 9. 45