ES2352970T3

ES2352970T3 - Empleo de proteínas no enzimáticas superficialmente activas para el lavado de textiles.

Info

Publication number: ES2352970T3
Application number: ES06792583T
Authority: ES
Inventors: Volker Schwendemann; Marvin Karos; Thomas Subkowski; Claus Bollschweiler; Hans-Georg Lemaire; Dieter Boeckh; Thorsten Montag; Ulf Baus
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-08-01
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2011-02-24
Anticipated expiration: 2026-07-27
Also published as: ATE485359T1; AU2006274836B2; DE502006008140D1; ZA200801881B; EP1913123A1; JP2009503280A; CN101233220B; BRPI0614703A2; KR20080041228A; EP1913123B1; US20090101167A1; CN101233220A; WO2007014897A1; JP5105441B2; MX2008001056A; CA2617092A1; AU2006274836A1

Abstract

El empleo para el lavado de textiles de proteínas no enzimáticas, superficialmente activas, caracterizado porque las proteínas se caracterizan por la propiedad de que después de la aplicación sobre una superficie de vidrio a temperatura ambiente, causan un aumento de por lo menos 20° en el ángulo de contacto de una gota de agua, comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño con la superficie no tratada, donde las proteínas son hidrofobinas.

Description

La presente invención se refiere al empleo de proteínas no enzimáticas superficialmente activas para el lavado de textiles. Ella se refiere además a detergentes para el lavado de textiles, los cuales contienen hidrofobina como proteína no enzimática superficialmente activa así como método para el lavado mediante el empleo de tales proteínas: La eliminación del mugre, en particular de la suciedad hidrofóbica en los textiles sucios es válida hoy en día en medida satisfactoria sólo a altas temperaturas. A moderadas temperaturas y en particular a temperatura ambiente existe aún necesidad importante de un mejoramiento en el rendimiento del lavado. Según el estado de la técnica, se alcanza la eliminación de ligero ensuciamiento hidrofóbico sobre todo con surfactantes y enzimas y lipolíticas. En principio, se conoce el empleo de proteínas que tienen efecto enzimático como adición a los detergentes. En los detergentes se emplean en particular proteasas, y se usan también amilasas, celulasas o lipasas conocidas. Por ejemplo, se presentan más detalles en "Waschmittel-Enzyme" en Römpp Chèmie-Lexikon, edición en línea, versión 2.6, editorial Georg-Thieme, Stuttgart, Nueva York, Febr. 2005. También se conoce el empleo de proteínas para fijar sobre las fibras agentes auxiliares de lavado como por ejemplo agentes fijadores, agentes protectores contra UV, sustancias perfumantes o sustancias auxiliares que desprenden la mugre. La WO 98/00500 manifiesta el empleo con este objeto de celulasas, derivados de celulasas o proteínas similares a la celulasa, y WO 01/46357 manifiesta una proteína de fusión con este objeto, con un sitio de unión para la celulasa así como un sitio de unión para otros compuestos. En principio se conocen proteínas superficialmente activas. Una categoría de proteínas con actividad superficial particularmente fuerte son las denominadas "hidrofobinas". Las hidrofobinas exhiben una pronunciada afinidad a las superficies límite y de allí que son adecuadas para el revestimiento de superficies. De este modo, por ejemplo se transforma el teflón en hidrofílico, en lo cual se reviste la superficie de teflón con hidrofobinas. Las hidrofobinas son pequeñas proteínas con aproximadamente 100 a 150 aminoácidos, los cuales son comunes para los hongos filamentosos como por ejemplo Schizophyllum commune. Por regla ellas exhiben 8 unidades de cisteina. Por un lado, las hidrofobinas pueden ser aisladas de fuentes naturales. Ellas pueden también ser obtenidas por medio de métodos de técnica genética. Nuestra antigua inscripción WO2006082251 manifiesta tal método de producción para las hidrofobinas. En el estado de la técnica se propone el empleo de hidrofobinas para diferentes aplicaciones. WO 96/41882 propone el empleo de hidrofobinas como emulsificantes, espesantes, sustancias superficialmente activas, para transformar en hidrofílicas las superficies hidrofóbicas, para mejorar la estabilidad al agua de sustratos hidrofílicos, para la producción de emulsiones aceite en agua o de emulsiones agua en aceite. Además se proponen aplicaciones farmacéuticas como la producción de pomadas o cremas así como aplicaciones cosméticas como protección de la piel o la producción de champús para el cabello o enjuagues para el cabello. [0010] EP 1 252 516 manifiesta el revestimiento de ventanas, lentes de contacto, biosensores, dispositivos medicinales, recipientes para la ejecución de pruebas o para el almacenamiento, cascos de barco, partes fijas o marcos o carrocerías de automóviles para personas, con una solución que contiene hidrofobina a una temperatura de 30 a 80°C. WO 03/53383 manifiesta el empleo de hidrofobinas para el tratamiento de materiales de queratina en aplicaciones cosméticas. WO 03/10331 manifiesta un sensor revestido con hidrofobinas, por ejemplo un electrodo de medida, al cual se enlazan de modo no covalente otras sustancias, por ejemplo sustancias electroactivas, anticuerpos o enzimas. En el estado de la técnica se describieron además diferentes mezclas de detergentes o combinaciones superficialmente activas eficaces para limpieza. DE 199 42 539 manifiesta detergentes en forma de polvo, los cuales contienen surfactantes aniónicos, no iónicos y/o anfóteros, proteínas no enzimáticas y/o sus derivados y fosfatos. WO01/38476 describe tabletas de detergentes que contienen granulados surfactantes, las cuales se obtienen mediante granulación y compactación de proteínas y/o granulados de proteínas, dado el caso junto con surfactantes aniónicos y/o no aniónicos en presencia de agentes desintegradores. WO02/46342 manifiesta una mezcla superficialmente activa, que incluye una combinación de por lo menos una proteína o péptido anfolíticos y una sustancia natural polimérica aniónica y/o no iónica. Hasta ahora no se ha descrito el empleo de proteínas no enzimáticas superficialmente activas, en particular de hidrofobinas, como adición a los detergentes para remover la suciedad. Fue objetivo de la invención poner a disposición detergentes mejorados así como métodos mejorados para el lavado de textiles. Ellos deberían distinguirse en particular por una capacidad mejorada de lavado a bajas temperaturas. De acuerdo con ello, se encontró el empleo de proteínas no enzimáticas superficialmente activas, para el lavado de textiles. En un segundo aspecto de la invención se hallaron detergentes que incluyen proteínas no enzimáticas superficialmente activas. En un tercer aspecto de la invención se encontró un método para el lavado en el cual se emplea un líquido de lavado, que incluye proteínas no enzimáticas superficialmente activas. En una forma particular de operar el método se ejecuta el lavado una temperatura no superior a 60°C. Las proteínas no enzimáticas superficialmente activas son en cada caso hidrofobinas. De modo sorprendente se encontró que mediante la adición de proteínas no enzimáticas superficialmente activas al licor de lavado se obtenían una elevación significativa del efecto de lavado. Fue particularmente sorprendente que este efecto se encuentra ya a bajas temperaturas de lavado y además ya en el empleo de cantidades extraordinariamente pequeñas de proteína. Así, ya a una concentración de solo aproximadamente 2,5 ppm de proteína en el líquido de lavado, en combinación con un detergente común en el mercado a una temperatura de lavado de solo 25°C, se encontró una elevación del efecto de lavado de hasta 8 %. Aparte de la elevación del efecto de remoción de la mugre se observa también un efecto inhibidor del engrisamiento por ensuciamiento oleoso coloreado. El ensuciamiento hidrofóbico, el cual puede ser removido durante el lavado de los textiles, se deposita nuevamente en forma finamente distribuida sobre la pieza que se lava, y conduce por ello a un engrisamiento o decoloración. Este efecto es naturalmente pronunciado en tejidos blancos o débilmente coloreados. Este problema tiene lugar en particular cuando el surfactante y el sistema amplificador del poder de lavado tienen baja dosificación. La adición acorde con la invención de proteínas no enzimáticas superficialmente activas reduce esta redeposición y mejora con ello el grado de blancura del tejido lavado en comparación con tejidos que fueron lavados sin adición de tales proteínas.

Para la invención es de enumerar en detalle lo siguiente: Para la ejecución de la invención se emplean proteínas no enzimáticas superficialmente activas. El concepto "no enzimáticas" debería significar que preferiblemente las proteínas no exhiben ningún efecto enzimático o por lo menos un ninguno esencialmente enzimático. El concepto "superficialmente activas" debería significar que la proteína empleada posee la capacidad de influir sobre las propiedades de las superficies de separación. Las superficies que se consideran de separación pueden ser sólido-sólido, sólido-líquido, sólido-en forma de gas, líquido-líquido o líquido-forma de gas. En particular pueden ser superficies de separación sólido-líquido o líquido-líquido. En el caso de una superficie límite líquido-sólido, la propiedad puede ser por ejemplo la hidrofilia o hidrofobia de la superficie sólida, la cual puede cambiar bajo la influencia en la proteína empleada. El cambio de la hidrofilia o hidrofobia puede ser medida en el tipo y forma conocidos mediante la medición del ángulo de contacto de una gota de agua sobre la superficie recubierta y no recubierta. Otra propiedad de la superficie límite es el cambio de la tensión superficial de un líquido, la cual puede ser medida por métodos conocidos. Para la ejecución de la invención se emplean preferiblemente proteínas, que ya a pequeñas concentraciones tienen efecto de actividad superficial. Son en particular adecuadas aquellas proteínas que en solución acuosa ya a concentraciones de 0,05 a 50 ppm exhiben significativas propiedades de actividad superficial. En la invención se emplean aquellas proteínas que se distinguen por la propiedad de que después de la aplicación sobre una superficie de vidrio a temperatura ambiente, provocan un aumento del ángulo de contacto de una gota de agua (5 µl) de por lo menos 20°, comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no recubierta. Preferiblemente se emplean proteínas en las cuales el aumento del ángulo de contacto es de por lo menos 25°, particularmente preferido por lo menos 30°. La ejecución de la medición del ángulo de contacto es conocida en principio por los expertos. En la parte experimental se representan las condiciones experimentales exactas para un método adecuado de ejemplo para la medición del ángulo de contacto. Las proteínas empleadas son hidrofobinas. [0032] En el sentido de la presente invención, bajo el concepto de "hidrofobinas" deberían entenderse en lo que sigue los polipéptidos de la fórmula estructural general (I)

Xn-C1-X1-50C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I) donde X puede representar cada uno de los 20 aminoácidos que se encuentran de modo natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly). En ello, los radicales X pueden ser en cada caso iguales o diferentes. Aquí los índices que están con las X representan en cada caso el número de aminoácidos en la respectiva secuencia parcial X, C representa cisteina, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, donde por lo menos cuatro de los radicales nombrados con C representan cisteina, y los índices n y m representan independientemente uno de otro números naturales entre 0 y 500, preferiblemente entre 15 y 300. Los polipéptidos según la fórmula (I) se caracterizan además por la propiedad según la cual a temperatura ambiente después de revestir una superficie de vidrio causan un aumento del ángulo de contacto de una gota de agua de por lo menos 20°, preferiblemente por lo menos 25° y particularmente preferido 30°, comparado en cada caso con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no revestida. Los aminoácidos nombrados con C1 a C8 son preferiblemente cisteinas; ellos pueden ser reemplazados también por otros aminoácidos de similar ocupación de volumen, preferiblemente por alanina, serina, treonina, metionina o glicina. Sin embargo deberían por lo menos cuatro, preferiblemente por lo menos 5, particularmente preferido por lo menos 6 y en particular por lo menos 7 de las posiciones C1 a C8 consistir en cisteinas. Las cisteinas pueden estar presentes en las proteínas acordes con la invención en forma reducida o formar mutuamente puentes disulfuro. Se prefiere particularmente la formación de puentes intramoleculares de C-C, en particular con por lo menos uno, preferiblemente 2, particularmente preferido 3 y muy particularmente preferido 4 puentes disulfuro intramoleculares. En el intercambio arriba descrito de cisteinas por aminoácidos de similar ocupación de volumen se intercambian de modo ventajoso las posiciones C pareadas que pueden formar unas con otras puentes intramoleculares disulfuro. En el caso de que en las posiciones descritas con X se empleen también cisteina, serina, alanina, glicina, metionina o treonina, puede cambiarse de modo correspondiente la enumeración de las posiciones individuales C en las fórmulas generales. Para la ejecución de la presente invención se emplea preferiblemente hidrofobinas de la fórmula general (II)

Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II) donde X, C y los índices que están ante X y C tienen el significado dado arriba, los índices n y m representan números entre 0 y 350, preferiblemente 15 a 300, se distinguen las proteínas además por el cambio del ángulo del contacto arriba mencionado, y además en por lo menos 6 de los radicales nombrados con C son cisteina. De modo particularmente preferido, todos los radicales C son cisteina. De modo particularmente preferido se emplean hidrofobinas de la fórmula general (III)

Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III) donde X, C y los índices que tienen X tienen el significado dado arriba, los índices n y m representan números entre 0 y 200, las proteínas además se distinguen por el cambio de ángulos de contacto mencionado arriba, y por lo menos 6 de los radicales nombrados con C son cisteina. De modo particularmente preferido todos los radicales C son cisteina. Los radicales Xn y Xm pueden ser secuencias de péptidos que están enlazados de modo natural con una hidrofobina. Uno o los dos radicales pueden ser también secuencias de péptidos, que están enlazados de modo natural con una hidrofobina. Entre ellos se entienden también aquellos radicales Xn y/o Xm, en los cuales una secuencia de péptidos que ocurre de modo natural en una hidrofobina es alargada mediante una secuencia de péptidos que ocurre de modo no natural en una hidrofobina. En el caso de que Xn y/o Xm sean secuencias de péptidos enlazadas de modo no natural con hidrofobinas, tales secuencias tienen por regla general por lo menos 20, preferiblemente por lo menos 35 y particularmente preferido por lo menos 50 aminoácidos y por ejemplo por lo menos 100 aminoácidos de largo. Pueden ser por ejemplo secuencias de 20 a 500, preferiblemente 30 a 400 y particularmente preferido 35 a 100 aminoácidos. Uno de tales radicales enlazados de un modo no natural con una hidrofobina debería ser descrito en lo que sigue también como asociado de fusión. Con ello debería explicarse que las proteínas pueden consistir en por lo menos una parte de hidrofobina y una parte del asociado de fusión, los cuales no se encuentran juntos en esta forma en la naturaleza. La parte del asociado de fusión puede ser elegida de entre una multiplicidad de proteínas. Puede estar enlazado sólo un único asociado de fusión con la parte de hidrofobina, o pueden también enlazarse varios asociados de fusión con una parte de hidrofobina, por ejemplo en el extremo amino (Xn) y en el extremo carboxi (Xm) de la parte de la hidrofobina. Pueden también enlazarse por ejemplo dos asociados de fusión con una posición (Xn o Xm) de la proteína acorde con la invención. Son asociados de fusión particularmente adecuados las proteínas que ocurren de modo natural en microorganismos, en particular en E. coli o Bacillus subtilis. Son ejemplos de tales asociados de fusión las secuencias yaad (SEC ID NO: 15 y 16), yaae (SEC ID NO: 17 y 18), y tioredoxina. Son también bien adecuados los fragmentos o derivados de estas secuencias mencionadas, que incluyen sólo una parte, por ejemplo 70 a 99 %, preferiblemente 5 a 50 %, y particularmente preferido 10 a 40 % de las mencionadas secuencias, o con los cuales se han cambiado aminoácidos o bien nucleótidos individuales respecto a la mencionada secuencia, donde la información porcentual en cada caso se refiere al número de aminoácidos. [0042] En otra forma preferida de operar la hidrofobina de fusión exhibe, aparte del mencionado asociado de fusión, como uno de los grupos Xn o Xm o como componente terminal de uno de tales grupos, aún un denominado dominio de afinidad (marca de afinidad /cola de afinidad). Aquí son grupos ancla de categorías y formas conocidos en principio, los cuales pueden interactuar con grupos complementarios determinados y los cuales sirven para el más fácil acondicionamiento y limpieza de la proteína. Ejemplos de tales dominios de afinidad abarcan grupos (His)k-, (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe) k-o (Cys)k, donde k representa en general un número natural de 1 a 10. Preferiblemente puede ser un grupo (His)k, donde k representa 4 a 6. Con esto los grupos Xn y/o Xm pueden consistir exclusivamente en tal dominio de afinidad o un radical Xn o bien Xm, enlazado de modo natural o no natural con una hidrofobina, es prolongado en un dominio de afinidad dispuesto de modo terminal. Las proteínas empleadas acordes con la invención como hidrofobinas o derivados de ellas puede ser también modificadas en su secuencia de polipéptidos, por ejemplo mediante glicosilación, acetilación

: o también mediante entrelazamiento químico transversal por ejemplo con glutardialdehído. Una propiedad de las hidrofobinas o bien sus derivados empleados acorde con la invención es la modificación de las propiedades superficiales, cuando en las superficies son revestidas con las proteínas. La modificación de las propiedades superficiales se determina por ejemplo de modo experimental mediante la medición del ángulo de contacto de una gota de agua antes y después del revestimiento de la superficie con la proteína y el cálculo de la diferencia de ambas medidas. La ejecución de la medida del ángulo del contacto es conocida en principio por los expertos. Las mediciones se relacionan a temperatura ambiente así como gotas de agua de 5 µl y el empleo de laminillas de vidrio como sustrato. Estas condiciones experimentales exactas para un método adecuado de ejemplo para la medición del ángulo de contacto, son ilustrados en la parte experimental. Bajo las condiciones allí mencionadas, la proteína de fusión empleada de acuerdo con la invención posee la propiedad de aumentar el ángulo de contacto en por lo menos 20°, preferiblemente por lo menos 25°, parte menos 30°, comparado en cada caso con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no revestida. De modo particularmente preferido, las hidrofobinas para la ejecución de la presente invención son las hidrofobinas del tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, las cuales son caracterizados estructuralmente en el subsiguiente protocolo de secuencia. Pueden ser también sólo una parte o derivado de ellas. También pueden enlazarse varias, preferiblemente 2 o 3, partes de hidrofobina de estructura igual o diferente mutuamente enlazadas y con una correspondiente secuencia adecuada de polipéptidos, la cual está unida de modo no natural con una hidrofobina. De acuerdo con la invención, son en particular adecuadas además las proteínas de fusión yaad-XadewA-his (SEC ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEC ID NO: 22) o yaad-Xa-basf1-his (SEC ID NO: 24) con las secuencias de polipéptidos indicadas en los paréntesis así como las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para ello, en particular las secuencias según SEC ID NO: 19, 21, 23, de modo particularmente preferido pueden emplearse yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 20). También son formas de operar particularmente preferidas proteínas que resultan partiendo de las secuencias de polipéptidos representadas en SEC ID NO. 20, 22 o 24 mediante intercambio, inserción o borrado de

por lo menos uno, hasta 10, preferiblemente 5, particularmente preferido 5% de todos los aminoácidos y que poseen la propiedad biológica de la proteína de partida hasta por lo menos 50%. Se entiende aquí por propiedad biológica de la proteína el cambio ya descrito del ángulo de contacto en por lo menos 20°. Son derivados particularmente adecuados para la ejecución de la invención, los radicales derivados de yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEC ID NO: 22) o yaad-Xa-basf1-his (SEC ID NO: 24), mediante acortamiento del asociado de fusión yaad. En lugar del asociado de fusión yaad completo (SEC ID NO: 16) con 294 aminoácidos pueden emplearse de modo ventajoso un radical yaad acortado. El radical acortado debería incluir por lo menos 20, preferiblemente por lo menos 35 aminoácidos. Por ejemplo puede emplearse un radical acortado con 20 a 293, preferiblemente 25 a 250, particularmente preferido 35 a 150 y por ejemplo 35 a 100 aminoácidos. Un ejemplo de una proteína así es yaad40-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 26), la cual exhibe un radical yaad acortado a 40 aminoácidos. Para ello puede usarse un punto de escisión entre la hidrofobina y el asociado de fusión o bien los asociados de fusión, el cual libere hidrofobina pura en forma no derivatizada (por ejemplo mediante escisión con BrCN en la metionina, escisión con factor Xa, con enteroquinasa, trombina, TEV, etc.). Además es posible generar sucesivamente proteína de fusión a partir de un asociado de fusión, por ejemplo yaad o yaae, y varias hidrofobinas, también de diferente secuencia, por ejemplo DewA-RodA

: o Sc3-DewA, Sc3-RodA. También pueden emplearse fragmentos de hidrofobina (por ejemplo acortamientos terminales en N o en C) o muteina, los cuales exhiben una homología de hasta 70%. La elección de la estructura óptima ocurre en cada caso en relación con la respectiva aplicación, es decir las fases líquidas que van a ser separadas. Las hidrofobinas empleadas para el lavado de textiles acordes con la invención se producen químicamente mediante métodos conocidos de síntesis de péptidos, como por ejemplo mediante síntesis en fase sólida según Merrifield. Las hidrofobinas que ocurren de modo natural se aíslan a partir de fuentes naturales por medio de métodos adecuados. Por ejemplo se remite a Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO 96/41882. En US 2006/0040349 se describe un método de producción de técnica genética para hidrofobinas sin asociado de fusión a partir de Talaromyces thermophilus. La producción de proteínas de fusión puede ocurrir preferiblemente por métodos de técnica genética, en los cuales se combinan uno de los asociados de fusión y una secuencias de ácido nucleico que codifica para la parte de hidrofobina, en particular secuencia de ADN, de modo que en un organismo hospedante se genera la proteína deseada mediante la expresión de gen de la secuencia de ácido nucleico combinado. Por ejemplo en WO2006082251 se manifiesta tal método de producción. En ello, para el método de producción mencionado pueden ser organismos hospedantes adecuados (organismos de producción) bacterias procarióticas (incluyendo la Archaea) o eucarióticas, en particular incluyendo halobacterias y metanococos, hongos, células de insectos, células vegetales y células de mamíferos, particularmente preferido Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (ó bien células emparentadas) entre otros. Para poner a disposición las hidrofobinas acordes con la invención pueden emplearse preferiblemente estructuras de expresión, presentes en los controles genéticos de secuencias reguladoras de ácido

nucleico, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido empleado de acuerdo con la invención, así como vectores que incluyen por lo menos una de estas estructuras de expresión. Preferiblemente las estructuras empleadas incluyen un promotor 5´ corriente arriba de la respectiva secuencia que codifica y una secuencia de terminación 3´ corriente abajo así como dado el caso otros elementos reguladores comunes, y concretamente enlazados en cada caso de modo operativo con la secuencia que codifica. En el marco de la presente invención, se entiende por "enlazado de modo operativo" la disposición secuencial de producto, secuencia que codifica, terminador y dado el caso otros elementos reguladores de modo que cada uno de los elementos reguladores puede cumplir su función en la expresión de la secuencia que codifica, de acuerdo con lo esperado. Son ejemplos de secuencias que pueden enlazarse de modo operativo las secuencias que tienen objetivo así como potenciadores, señales de poliadenilación. Otros elementos reguladores incluyen marcadores que pueden seleccionarse, señales de amplificación, fuentes de replicación y similares. Por ejemplo, se describen secuencias reguladoras adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Adicionalmente a estas secuencias de regulación, antes de los propios genes de estructura pueden estar presentes las regulaciones naturales de estas secuencias y dado el caso haber sido cambiados genéticamente, de modo que se haya interrumpido la regulación natural y se haya aumentado la expresión de los genes. Una estructura preferida de ácido nucleico contiene modo ventajoso también una o varias de las denominadas secuencias "potenciadoras" enlazadas funcionalmente al promotor, lo cual hace posible una expresión aumentada de la secuencia de ácido nucleico. También en el extremo 3’ de las secuencias de ADN pueden insertarse adicionalmente de modo ventajoso secuencias, como otros elementos reguladores o terminadores. En la estructura pueden estar presentes los ácidos nucleicos en una o varias copias. En la estructura pueden también estar presentes otros marcadores, como resistencia a los antibióticos o genes que complementan auxotrofías, dado el caso para la selección en la estructura. De modo ventajoso secuencias de regulación para la producción están presentes por ejemplo en promotores como promotores cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD)SP6, lambda-PR o imlambda-P, los cuales encuentran aplicación de modo ventajoso en bacterias gram-negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas están presentes por ejemplo en los promotores gram-positivos amy y SP02, en los promotores de hongos o levaduras ADC1, MFalfa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Para la regulación pueden emplearse también promotores artificiales. Para la expresión en un organismo hospedante, puede insertarse la estructura de ácido nucleico de modo ventajoso en un vector, como por ejemplo un plásmido o un fago, lo cual hace posible una óptima expresión del gen en el hospedante. Se entienden por vectores, aparte de los plásmidos y fagos, también todos los otros vectores conocidos por los expertos, por consiguiente por ejemplo virus como SV40, CMV, Baculovirus y Adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, cósmidos, y ADN lineal o circular así como el sistema agrobacterium. Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en organismos hospedantes o ser replicados de manera cromosómica. Son plásmidos adecuados por ejemplo en E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,pIN-III"3-B1, tgt11 o pBdCI, en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, pIL2

: o pBB116, en levaduras 2alfa, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos mencionados representan una pequeña elección de los plásmidos posibles. Otros plásmidos son conocidos por los expertos y pueden ser tomados por ejemplo del Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). De modo ventajoso para la expresión de los otros genes presentes, la estructura de ácido nucleico contiene para el aumento de la expresión adicionalmente secuencias reguladoras terminadas en 3’ y/o 5’, las cuales son elegidas para una óptima expresión dependiendo del organismo hospedante y gen o genes elegidos. Estas secuencias reguladoras deberían hacer posible la expresión objetivo del gen y la expresión de la proteína. Esto puede significar por ejemplo, dependiendo del organismo hospedante, que no sea expresado o sobreexpresado hasta después de la inducción, o que es expresado y/o sobreexpresado inmediatamente. En ello, las secuencias o bien factores reguladores pueden influir positivamente y con ello aumentar preferiblemente la expresión del gen de los genes introducidos. De este modo puede ocurrir de modo ventajoso un fortalecimiento de los elementos regulatorios en los planos de transcripción, en lo cual se emplean como promotores y/o "potenciadores" fuertes señales de transcripción. Además es posible también un fortalecimiento de la traducción, en lo cual se mejora por ejemplo la estabilidad del mARN. En otra forma de configuración del vector puede introducirse en los microorganismos también ventajosamente la estructura de ácido nucleico o el vector que contiene el ácido nucleico, en forma de un ADN lineal y se integra mediante una recombinación heteróloga u homóloga en el genoma del organismo hospedante. Este ADN lineal puede consistir en un vector transformado en lineal, como un plásmido o consistir sólo en la estructura de ácido nucleico o en el ácido nucleico. Para una óptima expresión de los genes heterólogos en organismos es ventajoso cambiar las secuencias de ácido nucleico correspondientes al "uso de codón" específico empleado en el organismo. El "uso de codón" permite, mediante evaluaciones por computador, descubrir otros genes conocidos del organismo en cuestión. La producción de una cinta de expresión ocurre mediante la fusión de un promotor adecuado con una secuencia de nucleótido adecuado que codifica así como con una señal de terminación o de poliadenilación. Para ello se emplean técnicas comunes de recombinación o clonación, como se describen por ejemplo en T. Maniatis, E. F.Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) así como en T. J. Silhavy,

M.: L. Berman y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols en Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987). Para la expresión en un organismo hospedante adecuado, la estructura de ácido nucleico recombinante

: o estructura de gen es insertada de modo ventajoso en un vector específico de hospedaje, lo cual hace posible una expresión óptima del gen en el hospedante. Los vectores son bien conocidos por los expertos y pueden ser tomados por ejemplo de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Con ayuda de los vectores pueden producirse microorganismos recombinantes, los cuales por ejemplo se transforman con por lo menos un vector y pueden ser usados para la producción de las hidrofobinas

: o derivados de ellas empleados de acuerdo con la invención. De modo ventajoso, se introducen y expresan en un sistema hospedante adecuado las estructuras recombinantes arriba descritas. En ello se

emplean preferiblemente métodos de clonación y transfección comunes conocidos por los expertos, como por ejemplo co-precipitación, fusión de protoplastos, electropermeabilización, transfección retroviral y similares, para llevar hasta la expresión los mencionados ácidos nucleicos en los respectivos sistemas de expresión. Por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, o Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 se describen sistemas adecuados. [0075] También se pueden producir microorganismos recombinantes homólogos. Para ello se produce un vector que contiene por lo menos un corte de un gen que se va a emplear o de una secuencia que codifica, donde dado el caso se incorpora por lo menos un borrado, adición o sustitución de aminoácido, para modificar la secuencia como por ejemplo romper la funcionalidad (vector "Knockout"). La secuencia introducida puede por ejemplo ser un homólogo de un microorganismo pariente o derivarse de una fuente de mamífero, levadura o insecto. De modo alternativo el vector empleado para la recombinación homóloga puede ser acondicionado de tal modo que el gen endógeno muta por recombinación homóloga o cambia de otro modo, aunque aún codifica funcionalmente la proteína (por ejemplo puede cambiar el sector regulador localizado corriente arriba de tal modo que mediante ello cambia la expresión de la proteína endógena). El sector modificado del gen empleado acorde con la invención está en el vector homólogo de recombinación. La construcción de vectores adecuados para la recombinación homóloga es descrita por ejemplo en Thomas, K. R. y Capecchi, M.

R. (1987) Cell 51 : 503. Como organismos hospedantes recombinante para tales ácidos nucleicos o tales estructuras de ácidos nucleicos entran en consideración en principio todos los organismos procarióticos o eucarióticos. De modo ventajoso se emplean como organismos hospedantes microorganismos como bacterias, hongos

o levaduras. De modo ventajoso se emplean bacterias gram-positivas o gram negativas, preferiblemente en las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, particularmente preferido bacterias de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus. Los organismos empleados en los métodos de producción para las proteínas de fusión descritos justo aquí son criados o cultivados dependiendo del organismo hospedante en formas conocidas por los expertos. Los microorganismos son cultivados por regla general en un medio líquido, el cual contiene la mayoría de las veces una fuente de carbono en forma de azúcares, la mayoría de las veces una fuente de nitrógeno en forma de fuentes de nitrógeno orgánico como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, elementos traza como sales de hierro, manganeso y magnesio así como dado el caso vitaminas, a temperaturas entre 0 y 100 °C, preferiblemente entre 10 a 60 °C bajo aplicación de gas oxígeno. En ello, el valor de pH del líquido nutritivo es mantenido en un valor fijo, es decir es regulado o no durante la propagación. La propagación puede ocurrir en forma de "lote", "semicontinua" o continua. Los nutrientes pueden estar presentes en el comienzo de la fermentación o pueden ser alimentados de manera semicontinua o continua. Las enzimas pueden ser aisladas de los organismos según el método descrito en los ejemplos o ser empleadas como extracto crudo para la reacción. Las hidrofobinas o fragmentos de ellas biológicamente activos y funcionales empleados de acuerdo con la invención pueden ser producidas por medio de un método para la producción recombinante, donde se cultiva un microorganismo que produce polipéptidos, dado el caso se induce la expresión de la proteína y ésta se aísla del cultivo. En caso de que así se desee, las proteínas pueden de este modo también ser producidas a gran escala técnica. El microorganismo recombinante puede ser cultivado y fermentado según métodos conocidos. Por ejemplo, las bacterias pueden multiplicarse en medio TB-o LB y a una temperatura de 20 a 40°C y un valor de pH de 6 a 9. Las condiciones adecuadas de cultivo son descritos en detalle por ejemplo en T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Los asociados de fusión facilitan de modo sustancial la producción de las hidrofobinas. Las hidrofobinas de fusión son producidas con rendimiento claramente mejorado como hidrofobinas sin asociado de fusión. En caso de que las proteínas no sean segregadas en el medio de cultivo, las células son entonces solubilizadas y el producto es recuperado del lisado según métodos de aislamiento de proteína conocidos. A elección, las células pueden ser solubilizadas mediante ultrasonido de alta frecuencia, mediante alta presión como por ejemplo en una celda de presión, mediante osmólisis, mediante el efecto de detergentes, enzimas líticas o solventes orgánicos, mediante homogenizadores o mediante combinación de varios de los métodos enumerados. Puede alcanzarse una purificación de las proteínas con métodos cromatográficos conocidos, como cromatografía en tamiz molecular (filtración en gel), como cromatografía en Q-sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica, así como con otros métodos comunes como ultrafiltración, cristalización, separación por saturación con sal, diálisis y electroforesis nativa en gel. Por ejemplo en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, editorial Water de Gruyter, Berlín, New York o en Scopes, R., Protein Purification, editorial Springer, New York, Heidelberg, Berlin se describen métodos adecuados. Puede ser particularmente ventajoso, para facilitar el aislamiento y purificación, dotar las hidrofobinas de fusión con grupos ancla especiales, los cuales se ligan sobre grupos complementarios correspondientes en soportes sólidos, en particular polímeros adecuados. Tales soportes sólidos pueden emplearse por ejemplo como rellenos para columnas cromatográficas, y de este modo y forma por regla general puede aumentarse claramente la eficiencia de la separación. Tales métodos de separación son conocidos como cromatografía de afinidad. Para la incorporación de los grupos ancla pueden emplearse en la producción de las proteínas, sistemas de lectores u oligonucleótidos, los cuales alargan el cADN en determinadas secuencias de nucleótidos y con ello codifican proteínas o proteínas de fusión cambiadas. Para la purificación más fácil, las proteínas modificadas abarcan los denominados "Tags" que funcionan como anclas, como por ejemplo la modificación conocida como ancla hexa-histidina. Las hidrofobinas de fusión modificadas con anclas de histidina se purifican por ejemplo mediante el empleo de níquel-sefarosa como relleno de la columna cromatográfica. La hidrofobina de fusión puede a continuación ser nuevamente eluída de la columna con un medio de elución adecuado, como por ejemplo una solución de imidazol. [0083] En un método de purificación simplificado puede obviarse la purificación cromatográfica. Para ello primero que todo se separan las células del caldo de fermentación por medio de un método adecuado, por ejemplo mediante microfiltración o mediante centrifugación. A continuación pueden solubilizarse las células por medio de métodos adecuados, por ejemplo por medio de los métodos ya mencionados arriba, y separar los residuos celulares de los cuerpos de inclusión. Esto último puede ocurrir ventajosamente mediante centrifugación. Finalmente pueden solubilizarse los cuerpos de inclusión en formas y modos conocidos en principio, para liberar las hidrofobinas de fusión. Esto puede ocurrir por ejemplo mediante ácidos, bases y/o detergentes. Por regla general los cuerpos de inclusión con las hidrofobinas de fusión empleadas de acuerdo con la invención pueden ser disueltos completamente mediante el empleo de NaOH 0,1 m dentro de un plazo de aproximadamente 1 h. La pureza de la hidrofobina de fusión obtenida según este método simplificado está por regla general en 60 a 80 % en peso respecto a la cantidad de todas las proteínas. Para la realización de esta invención, las soluciones obtenidas según el método de purificación simplificado descrito pueden ser empleadas sin otra purificación. Las hidrofobinas de fusión pueden ser aisladas de las soluciones también como materia sólida. Esto puede ocurrir por ejemplo de modo y forma conocidos en principio mediante congelación o secado por atomización. En una forma preferida de operar la invención, el aislamiento puede ocurrir mediante secado por atomización. El secado por atomización puede ser hecho con la solución purificada por cromatografía, preferiblemente pueden emplearse también las soluciones obtenidas mediante el método de purificación simplificado por acondicionamiento de los cuerpos de inclusión (inclusion bodies). Para la realización del secado por atomización pueden, dado el caso neutralizarse las soluciones. Se ha enfatizado como particularmente ventajoso un rango de pH de 7 a 9. Además se recomienda por regla general concentrar en algún grado la solución de partida. Se ha establecido en la solución de partida una concentración de materia seca de hasta 30 % en peso. Una fracción de materia seca de > 5% conduce en general a un producto finamente pulverulento. A continuación puede secarse por atomización la solución como se conoce generalmente. Los equipos adecuados para el secado por atomización son obtenibles comercialmente. Las condiciones óptimas para el secado por atomización varían con la categoría de equipo y la capacidad de proceso objetivo. Han probado ser favorables temperaturas de entrada de 130 a 180°C y temperaturas de salida de 50 a 80°C para las soluciones de hidrofobina. De modo opcional, para el secado por atomización pueden emplearse sustancias auxiliares como por ejemplo azúcar, manitol, dextrano o maltodextrina. Se ha probado una cantidad de 0 a 30 % en peso, preferiblemente 5 a 20 % en peso de tales sustancias auxiliares respecto a la hidrofobina. Las hidrofobinas producidas como se ha descrito pueden ser empleadas tanto de modo directo como proteínas de fusión como también después de la escisión y separación del asociado de fusión como hidrofobinas "puras". Cuando se prevé una separación del asociado de fusión, se recomienda incorporar un potencial sitio de escisión (posición de reconocimiento específico para las proteasas) en la proteína de fusión entre la parte de hidrofobina y la parte del asociado de fusión. Como sitio de escisión son adecuadas en particular aquellas secuencias de péptidos, aparte de la fracción de hidrofobina ocurre ya en la parte del asociado, lo que puede ser determinado fácilmente con herramientas de bioinformática. Por ejemplo son particularmente adecuados la escisión con BrCN en la metionina, o escisión facilitada mediante proteasas con escisión de factor Xa, enteroquinasa, trombina o TEV (proteasa del virus de grabado de tabaco). Para el empleo acorde con la invención en el lavado de textiles pueden emplearse proteínas no enzimáticas superficialmente activas por un lado como componente de un detergente y ser añadidas en esta forma al licor de lavado. También es posible añadir por separado al licor de lavado la proteína no enzimática superficialmente activa, y emplear un detergente el cual está libre de proteínas no enzimáticas superficialmente activas. La adición separada puede ocurrir mediante la adición de la proteína en forma sólida, como solución o como formulación adecuada. Evidentemente pueden combinarse ambos métodos de adición. La cantidad de proteína no enzimática superficialmente activa en el licor de lavado es determinada por el experto dependiendo del efecto deseado. En caso general se ha establecido una cantidad de 0,05 a 50 ppm, preferiblemente 0,1 a 30 ppm, particularmente preferido 0,2 a 20 ppm, muy particularmente preferido 0,5 a 10 ppm y por ejemplo 1 a 6 ppm.

Además son objetivos de la invención detergentes para el lavado de textiles. El concepto "detergentes para el lavado de textiles" es autoexplicativo y al mismo tiempo limitado. De acuerdo con la invención se emplean los detergentes para el lavado de textiles en forma de polvos, granulados, perlas, pastas, tabletas, geles o líquidos por regla general en solución acuosa (licor de lavado). Los detergentes acordes con la invención incluyen por lo menos una sustancia activa en el lavado así como por lo menos una proteína no enzimática superficialmente activa. La por lo menos una proteína no enzimática superficialmente activa es una proteína que se caracteriza por la propiedad de que después de la aplicación sobre una superficie de vidrio a temperatura ambiente, causa un aumento de por lo menos 20° en el ángulo de contacto de una gota de agua, comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño en la superficie de vidrio no recubierta, donde la proteína es una hidrofobina. Evidentemente pueden emplearse también mezclas de diferentes hidrofobinas. Las hidrofobinas pueden emplearse como hidrofobina "pura" o en forma de las arriba mencionadas proteínas de fusión. Para la ejecución de la presente invención se han probado proteínas de fusión por ejemplo del tipo yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his SEC ID NO: 22) o yaad-Xabasf1-his (SEC ID NO: 24). Se han probado particularmente yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 20) con asociado total de fusión yaad o también con asociado de fusión acortado, como por ejemplo yaad40Xa-dewA-his (SEC ID NO: 26). La acción de los detergentes consiste en un proceso de interacción química así como físico-química relativamente complejo. Los detergentes incluyen por lo menos una, por regla general varias diferentes sustancias activas al lavado, que cooperan para un óptimo resultado de lavado. Como componentes de los detergentes esencialmente activos al lavado son de mencionar en particular surfactantes, así como además sustancias estructurales (rellenos), amplificadores del poder de lavado, sistemas de blanqueo y enzimas para detergente. Además como componentes de los detergentes pueden emplearse aditivos típicos como por ejemplo esencias, inhibidores de corrosión, inhibidores de transferencia de color, inhibidores de espuma o aclaradores ópticos. Los surfactantes pueden ser aniónicos, no iónicos, catiónicos o anfóteros. Los detergentes acordes con la invención incluyen por lo menos una sustancia activa al lavado, la cual es elegida de entre el grupo de los surfactantes, amplificadores del poder de lavado, co-amplificadores del poder de lavado, sistemas blanqueadores y enzimas para detergentes. De acuerdo con la invención, los detergentes contienen surfactantes aniónicos y/o no iónicos. En ello, ante todo como surfactantes no iónicos son adecuados:

-alcoholes C8-C22 alcoxilados, como alcoxilatos de alcoholes grasos, alcoxilatos de oxoalcoholes y etoxilatos de alcoholes Guerbet: la adición del grupo alcoxilo puede ocurrir con óxido de etileno, óxido de propileno y/u óxido de butileno. Pueden estar presentes copolimerizados de bloque o copolímeros aleatorios. Por mol de alcohol, contienen ellos comúnmente 2 a 50 mol, preferiblemente 3 a 20 mol, de por lo menos un óxido de alquileno. El óxido de alquileno preferido es óxido de etileno. Los alcoholes tienen preferiblemente 10 a 18 átomos de carbono. -Alcoxilatos de alquilfenol, en particular etoxilatos de alquilfenol, los cuales contienen cadenas de alquilo C6-C14 y 5 a 30 mol de óxido de alquileno/mol. -Alquilpoliglucósidos, los cuales contienen cadenas de alquilo C6-C22, preferiblemente C10C18 y por regla general 1 a 20, preferiblemente 1,1 a 5, unidades de glucósido. -N-Alquilglucamidas, alcoxilatos de amida. Alcoxilatos de alcanolamida así como copolímeros de bloque de óxido de etileno. Óxido de propileno y/u óxido de butileno.

13 Son por ejemplo surfactantes aniónicos adecuados: -sulfatos de alcoholes (grasos) con 8 a 22, preferiblemente 10 a 18, átomos de carbono, en particular sulfatos de alcohol C9C11, sulfatos de alcohol C12C14, sulfatos de alcohol C12-C18, sulfato de laurilo, sulfato de cetilo, sulfato de miristilo, sulfato de palmitilo, sulfato de 5 estearilo y sulfato de alcohol de sebo. -Alcoholes sulfatados alcoxilados C8-C22 (sulfatos de alquiléter): los compuestos de esta categoría pueden ser producidos por ejemplo mediante la adición primero que todo de un grupo alcoxilo C8-C22, preferiblemente un alcohol C10-C18, por ejemplo un alcohol graso o un oxoalcohol, y a continuación adición de un grupo sulfato a este producto alcoxilado. Para la 10 adición del grupo alcoxilo se emplea preferiblemente óxido de etileno. -Alquilbencenosulfonatos lineales C8-C20 (LAS), preferiblemente alquilbencenosulfonatos C9-C13 y alquiltoluenosulfonatos C9-C13. -Alcanosulfonatos, en particular alcanosulfonatos C8-C24, preferiblemente C10-C18. -Jabones como las sales de Na y K de los ácidos carboxílicos C8-C24. 15 Los surfactantes aniónicos son añadidos a los detergentes preferiblemente en forma de sales. En ello son sales adecuadas por ejemplo las sales de metales alcalinos, como sales de sodio, potasio y litio, y sales de amonio como sales de hidroxietilamonio, di(hidroxietil) amonio y tri(hidroxietil) amonio. Son ejemplos de surfactantes catiónicos: -Alquilaminas C7-C25; 20 -sales de N,N-dimetil-N-((C2-C4-hidroxialquil)(C7-C25-alquil) amonio; -compuestos de mono-y di-(C7-C25-alquil)dimetilamonio cuaternizados con agentes que añaden grupos alquilo; -Esterquats, en particular mono-, di-y trialcanolaminas cuaternarias esterificadas, ácido esterificadas con ácidos carboxílicos C8-C22; 25 -Imidazolinquats, en particular sales de 1-alquilimidazolinio de las fórmulas II o III

imagen1

en las cuales las variables tienen el siguiente significado: R3 alquilo C1-C25 o alquenilo C2-C25; R4 alquilo C1-C4 o hidroxialquilo C1-C4;

30 R5 alquilo C1-C4, hidroxialquilo C1-C4 o un radical R1-(CO)-X-(CH2)m-(X:-0-o -NH-; m: 2 o

3), donde por lo menos un radical R3 es alquilo C7-C22. Son ejemplos de surfactantes anfóteros por ejemplo alquilbetaínas, alquilamidobetaínas, aminopropionatos, aminoglicinatos y compuestos anfóteros de imidazolio.

35 Las sustancias estructurales (se mencionan amplificadores del poder de lavado, también amplificadores del poder de lavado inorgánicos heterogéneos, HAB) actúan en el proceso de lavado para el ablandamiento del agua. Ellos apoyan el efecto de lavado así como la disolución de iones Ca y Mg de los puentes de suciedad o bien de la fibra y dispersión del pigmento de suciedad en el licor de lavado, mediante su alcalinidad.

40 Como amplificadores del poder de lavado inorgánicos son adecuados en particular: -Aluminosilicatos cristalinos y amorfos con propiedades de intercambio iónico, como sobre

todo zeolitas: son adecuados diferentes tipos de zeolitas, en particular las zeolitas A, X, B, P,

MAP y HS en su forma de Na o por formas en las cuales el Na es intercambiado parcialmente

por otros cationes como Li, K, Ca, Mg o amonio.

-Silicatos cristalinos, como en particular disilicatos y silicatos en capas como por ejemplo δ

o β-Na2Si2O5. Los silicatos pueden emplearse en forma de sus sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos o sales de amonio, se prefieren los silicatos de Na, Li y Mg. -Silicatos amorfos, como metasilicato de sodio y disilicato amorfo. -Carbonatos e hidrogenocarbonatos: éstos pueden ser empleados en forma de sus sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos o amonio. Se prefieren carbonatos e hidrogenocarbonatos de Na, Li y Mg, en particular carbonato de sodio y/o hidrogenocarbonato de sodio. -Polifosfatos, como trifosfato de pentasodio.

Los co-amplificadores del poder de lavado colaboran como adyuvantes con los amplificadores del

poder de lavado por ejemplo, en lo cual ellos como una especie de reservorio absorben iones Ca o Mg

más rápido que los amplificadores del poder de lavado y después los pasan a estos. Además, mediante

adsorción ellos pueden impedir su crecimiento en núcleos de cristales.

Como amplificadores orgánicos del poder de lavado son adecuados, sobre todo: -ácidos carboxílicos de molécula pequeña, como ácido cítrico, ácido cíclicos modificados para ser hidrofóbicos, por ejemplo ácido agárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido glucónico, ácido glutárico, ácido succínico, ácido imidodisuccínico, ácido oxidisuccínico, ácido propanotricarboxílico, ácido butanotetracarboxílico, ácido ciclopentanotetracarboxílico, ácidos alquil-y alquenilsuccínico y ácidos aminopolicarboxílicos, como por ejemplo ácido nitrilotriacético, ácido β-alanindiacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido serindiacético, ácido isoserindiacético, ácido N-(2-hidroxietil)imino-acético, ácido etilendiaminodisuccínico y ácido metil-y etilglicindiacético. -Ácidos carboxílicos oligoméricos y poliméricos, como homo polímeros de ácido acrílico y ácido asparagínico, ácidos oligomaleicos, copolímeros del ácido maleico con ácido acrílico, ácido metacrilico u olefinas C2-C22, por ejemplo isobuteno o α-olefinas de cadena larga, vinil-C1-C8-alquiléteres, acetato de vinilo. Propionato de vinilo, ésteres del ácido (met) acrílico con alcoholes C1-C8 y estireno. Se prefieren los homopolímeros del ácido acrílico y copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico. Los ácidos carboxílicos oligoméricos y poliméricos son empleados en la forma de ácido o como sal de sodio.

Son por ejemplo agentes blanqueadores adecuados los productos de adición de peróxido de hidrógeno sobre sales inorgánicas como monohidrato de perborato de sodio, tetrahidrato de perborato de sodio y perhidrato de carbonato de sodio y ácidos percarboxílicos, como el ácido ftalimidopercaprónico. Como activadores de blanqueo son adecuados por ejemplo N,N,N’,N’-tetraacetiletilendiamina (TAED), p-nonanoiloxibencenosulfonato de sodio y N-metilmorfoliniumacetonitrilmetilsulfato. Las enzimas empleadas en los detergentes son preferiblemente proteasas, lipasas, amilasas, celulasas, oxidasas y peroxidasas. Como inhibidores de la transmisión de color son adecuados por ejemplo homopolímeros, copolímeros y polímeros injertos de 1-vinilpirrolidona, 1-vinilimidazol, N-óxido de 4-vinilpiridina, u homo-y copolímeros de 4-vinilpiridina que reaccionaron con ácido cloroacético. El tipo y cantidad de los componentes empleados es determinada por el experto dependiendo del objetivo deseado de uso del detergente. De este modo se emplean comúnmente por ejemplo agentes blanqueadores en detergentes de lavado completo, pero no en detergentes para ropa de color. Mayores detalles de la composición de los detergentes y componentes de los detergentes se encuentran por ejemplo en "Waschmittel" en Römpp Chemie-Lexikon, entrega en línea, versión 2.6, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Nueva York, Febr. 2005 o en "Detergents" en Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Edt., 2000, entrega electrónica, editorial Wiley-VCH-Verlag, Weinheim, 2000. Los surfactantes preferidos para la ejecución de la presente invención son surfactantes aniónicos y/o surfactantes no iónicos. Las hidrofobinas empleadas de acuerdo con la invención como proteínas no enzimáticas superficialmente activas, se emplean de modo particularmente ventajoso con una combinación de alquilbencenosulfonatos lineales o sulfatos de alcohol graso con sulfatos de alquiléter o alcoxilatos de alquilo. De modo particularmente preferido se emplean surfactantes aniónicos y/o no iónicos a base de alcoholes C8-C18 y/o sus productos de alcoxilación, de modo opcional en mezcla con otros surfactantes. Preferiblemente los radicales alcoxi son aquellos que esencialmente incluyen unidades de óxido de etileno y/o unidades de óxido de propileno, preferiblemente unidades de óxido de etileno. Pueden ser por ejemplo radicales de 1 a 25 unidades de óxido de etileno, preferiblemente 3 a 20, particularmente preferido 5 a 15 unidades o por radicales que incluyen unidades de óxido de etileno y óxido de propileno, donde este último debería incluir en cada caso por lo menos 50 mol %, preferiblemente 60 mol % de unidades de óxido de etileno referido al número total de unidades alcoxi. Ejemplos de surfactantes preferidos incluyen alcoholes C8-C18 alcoxilados, como alcoxilatos de alcohol graso, alcoxilatos de oxoalcohol, alcoxilatos de alcohol Guerbet, sulfatos de alcoholes C8-C18, alcoholes C8-C18 sulfatados alcoxilados (sulfatos de alquiléter) o C8-C18-alquilbencenosulfonatos lineales (LAS), preferiblemente C9-C13-alquilbencenosulfonatos lineales y C9-C13alquiltoluenosulfonatos. Son particularmente preferidos los productos de adición del grupo alcoxilo de 2-propilheptanol y tridecanol y sus sulfatos. La cantidad de las proteínas no enzimáticas superficialmente activas en los detergentes es medida por los expertos dependiendo de las propiedades deseadas del detergente. La cantidad es elegida aquí de modo ventajoso, de manera que en la dosificación adecuada del detergente, se obtienen las concentraciones arriba indicadas de la proteína no enzimática superficialmente activa. Se ha probado una cantidad de 0,002 a 2,5 % en peso de la proteína no enzimática superficialmente activa, referida a la cantidad total de todos los componentes del detergente. Preferiblemente la cantidad es de 0,01 a 1,5 % en peso, particularmente preferido 0,025 a 1,0 % en peso, muy particularmente preferido 0,05 a 0,5 % en peso y por ejemplo 0,1 a 0,3 % en peso. Los agentes acordes con la invención incluyen 0,01 a 1,5 % en peso de hidrofobinas, 0,5 a 40 % en peso de surfactantes aniónicos y/o no iónicos, así como 59 a 99,45 % en peso de otros aditivos activos al lavado o agentes auxiliares de formulación. Como componente (c) se emplean preferiblemente lipasas y/o polímeros anfófilos, por ejemplo copolímeros de bloque de óxido de etileno-óxido de propileno. Los detergentes acordes con la invención pueden ser producidos según métodos conocidos en principio por los expertos. En la literatura arriba citada en "Römpp Chemie-Lexikon" o "Ullmann’s" se representan por ejemplo detalles sobre el método de producción de detergentes. Para la producción del detergente, las proteínas no enzimáticas superficialmente activas pueden ser empleadas como solución o como materia seca. Las proteínas sólidas pueden ser obtenidas partiendo de soluciones de la proteína, por medio de métodos conocidos por los expertos, como por ejemplo secado por atomización o liofilización. En la producción de los detergentes debería para ello respetarse que no sea muy alta la exposición a la temperatura de las proteínas no enzimáticas superficialmente activas. Evidentemente, el límite se fija dependiendo del tipo de proteína. En el caso del empleo de hidrofobinas se ha probado no superar una temperatura de producto de 120°C. La temperatura de proceso, por consiguiente por ejemplo la temperatura de la corriente de gas en un secador por atomización, puede evidentemente también ser más alta, en tanto la temperatura del producto no supere el límite crítico. Los expertos conocen técnicas para la incorporación indulgente de componentes en los detergentes. La producción de detergentes en polvo puede ocurrir por ejemplo, en lo cual en una primera etapa por medio el secado por atomización se fabrica un producto crudo a partir de una pasta acuosa de los componentes térmicamente estables del detergente, y en una segunda etapa se mezcla este producto crudo bajo condiciones suaves con los componentes térmicamente sensibles. Por regla general es recomendable incorporar en esta segunda etapa las proteínas no enzimáticas superficialmente activas empleadas de acuerdo con la invención, sin que por ello debiera limitarse la invención. El método acorde con la invención para el lavado de materiales textiles incluye por lo menos las etapas:

Llenado de un dispositivo de lavado con los materiales textiles que van a ser lavados así

como con el licor de lavado acuoso,

acción de energía mecánica sobre mezcla de materiales textiles y el licor de lavado,

eliminación del licor acuoso de lavado y de modo opcional enjuague de los materiales

textiles, así como

secado de los materiales textiles. El dispositivo de lavado empleado puede ser cualquier tipo de máquina de lavado. El concepto debería abarcar también recipientes que típicamente son empleados en el lavado manual, como por ejemplo tinas o boles de lavado. En la etapa (a) primero que todo se llena el dispositivo de lavado con los textiles y un licor acuoso de lavado, donde no se depende de la secuencia. El licor de lavado incluye en forma conocida en principio, por lo menos una sustancia activa al lavado. De acuerdo con la invención, el licor acuoso de lavado incluye por lo menos una proteína no enzimática superficialmente activa la cual se caracteriza por la propiedad de que después de la aplicación sobre una superficie de vidrio a temperatura ambiente causa un aumento de por lo menos 20° del ángulo de contacto de una gota de agua, comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no tratada, donde la proteína es una hidrofobina. Las proteínas preferidas fueron ya mencionadas. La adición de la proteína no enzimática superficialmente activa puede ser realizada al detergente, o ella puede ocurrir también en forma separada. Ella ocurre preferiblemente al comienzo del curso del lavado, pero evidentemente ella puede también ser realizada en un momento posterior. El procedimiento de lavado es mantenido en la etapa (b) del método, de manera conocida mediante la acción de la energía mecánica sobre la mezcla de los materiales textiles y el licor de lavado. La energía mecánica puede ser aplicada mediante la máquina de lavado, por ejemplo mediante tambores rotatorios, o en el caso del lavado manual mediante las manos y/o diferentes agentes. En el curso del procedimiento de lavado, la temperatura es elegida por el experto dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, la temperatura puede ser 5,10,15,20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100°C. Las ventajas particulares de la invención tienen efecto de modo muy particular en el lavado a temperaturas medias o bajas. En una forma preferida de operar la invención se realiza el procedimiento de lavado una temperatura no superior a 60°C, en particular a no más de 50°C. Un rango de temperatura particularmente ventajoso para la ejecución del método de lavado acorde con la invención es 5 a 45°C, son muy particularmente preferidos 15 a 35°C y por ejemplo 20 a 30°C. La concentración de las proteínas no enzimáticas superficialmente activas en el curso del procedimiento de lavado es elegida por el experto. El rango de concentración preferido fue ya mencionado arriba. En caso de que la adición ocurra sobre los detergentes acordes con la invención, se emplean éstos comúnmente en una cantidad de 0,05 a 25 g/l, preferiblemente 0,25 a 15 g/l, particularmente preferido

0.5 a 10 g/l, muy particularmente preferido 1 a 6 g/l y por ejemplo 1,5 a 4 g/l, referido en cada caso al licor de lavado. Después del verdadero procedimiento de lavado se elimina el licor de lavado de manera en principio conocida. Por regla general los materiales textiles son enjuagados a continuación mediante uno o varios procedimientos de enjuague y son secados a continuación (etapas (d) y (e) del método). En el enjuague pueden emplearse como adición, suavizantes. El método acorde con la invención es adecuado para la limpieza de todos los tipos de materiales textiles. Ellos pueden ser fibras textiles, telas listas y semiterminadas y piezas listas producidas a partir de ellos. Ellos pueden ser textiles comunes para vestuario, pero también textiles para el hogar como por ejemplo alfombras, cortinas. Manteles así como objetos textiles que sirven para fines técnicos. A ellos pertenecen también objetos no formados como por ejemplo copos, objetos de forma lineal como cuerdas, hebras, hilos, linos, cordeles, sogas, hilos retorcidos así como objetos para el cuerpo como por ejemplo fieltros, tejidos, géneros de malla, tela no tejida y algodón en rama. Los materiales pueden consistir en materiales de origen natural, como por ejemplo algodón, lana o linos o en materiales sintéticos como poliacrilonitrilo, poliamida o poliéster. Evidentemente pueden ser también tejidos mixtos, como por ejemplo algodón/poliéster o algodón/poliamida. Los siguientes ejemplos deben ilustrar la invención en más detalle: Parte A: Producción y prueba de hidrofobinas producidas de acuerdo con la invención Ejemplo 1 Trabajo preliminar para la clonación de yaad-His6/yaaE-His6 Con ayuda de los oligonucleótidos Hal570 y Hal571 (Hal 572/Hal 573) se realizó una reacción en cadena de polimerasa. Como ADN patrón se empleó ADN genómico de la bacteria Bacillus subtilis. El fragmento PCR obtenido contenía la secuencia que codifica el gen yaaD/yaaE de Bacillus subtilis, y en cada uno de los extremos una posición de corte de restricción NcoI o bien BglII. El fragmento PCR fue purificado y cortado con las endonucleasas de restricción NcoI y BglII. Este fragmento de ADN fue empleado como inserto, y clonado en el vector pQE60 de la compañía Qiagen que antes fue transformado en lineal con las endonucleasas de restricción NcoI y BglII. Los vectores pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 formados de este modo pueden ser empleados para la expresión de proteínas que consisten en YAAD::HIS6 o bien YAAE::HIS6. Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

Ejemplo 2 Clonación de hidrofobina yaad DewA-His6 Se ejecutó la reacción en cadena de polimerasa con ayuda de oligonucleótidos KaM 416 y KaM 417. Como patrón de ADN se empleó ADN genómico del moho Aspergillus nidulans. El fragmento PCR obtenido contenía la secuencia que codifica el gen de la hidrofobina dewA y una posición de corte por

5 proteinasa con factor Xa N-terminal. Se purificó el fragmento PCR y se cortó con la endonucleasa de restricción BamHI. Este fragmento de ADN fue empleado como inserto, y clonado en el vector pQE60YAAD#2 que antes fue transformado en lineal con la endonucleasa de restricción BglII. El vector #508 así formado puede ser empleado para la expresión de una proteína de fusión que consiste en YAAD::Xa::dewA::HIS6.

10 KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC

imagen1

Ejemplo 3 Clonación de hidrofobina yaad RodA-His6 La clonación del plásmido #513 ocurrió de manera análoga a la del plásmido #508 mediante el empleo

15 de los oligonucleotidos KaM 434 y KaM 435. KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

Ejemplo 4

20 Clonación de hidrofobina yaad HypA-His6 Clonación HypA en pQE60 (#522) Se realizó un PCR con los oligonucleótidos KaM449/KaM450. Como patrón de ADN se empleó el plásmido HypA en PCR2.1, producido por la compañía Nadicom. El fragmento obtenido contenía la secuencia que codifica el gen de la hidrofobina HypA Gens sin codón de inicio y parada. Se purificó

25 el fragmento PCR por electroforesis en gel y se cortó con las endonucleasas de restricción NcoI y BamHI. Se empleó este fragmento como inserto y se ligó en el vector pQE60 que antes había sido cortado con NcoI y Bglil. KaM449: GTTACCCCATGGCGATCTCTCGCGTCCTTGTCGCT KaM450: GCCTGAGGATCCGAGGTTGACATTGACAGGAGAGC

imagen1

30

Clonación de HypA en pQE60+YAAD (#523) Se realizó un PCR con los oligonucleótidos KaM451/KaM452. Como patrón de ADN se empleó el plásmido HypA en pCR2.1, producido por la compañía Nadicom. El fragmento obtenido contenía la secuencia que codifica el gen de la hidrofobina HypA sin codon de inicio y parada. El fragmento PCR

35 fue purificado por electroforesis de gel y cortado con las endonucleasas de restricción BglII y BamHI. Este fragmento fue empleado como inserto y ligado al vector pQE60+YAAD antes cortado con BglII.

19 KaM451: CGTAGTAGATCTATGATCTCTCGCGTCCTTGTCGCTGC KaM452: CGACTAGGATCCGAGGTTGACATTGACAGGAGAGC

imagen1

Ejemplo 5

5 Clonación de hidrofobina yaad HypA-His6 Clonación de HypB en pQE60 (#524) Se realizó un PCR con los oligonucleótidos KaM453/KaM454. Como patrón de ADN se empleó el plásmido HypB en puC19, producido por la compañía Nadicom. El fragmento obtenido contenía la secuencia que codifica el gen de la hidrofobina HypB sin codon de inicio y parada. El fragmento PCR

10 fue purificado por electroforesis de gel y cortado con las endonucleasas de restricción NcoI y BamHI. Este fragmento fue empleado como inserto y ligado al vector pQE60 antes cortado con NcoI y BglII. KaM453: GCTTATCCATGGCGGTCAGCACGTTCATCACTGTCG KaM454: GCTATAGGATCCCACATTGGCATTAATGGGAGTGC

imagen1

15 Clonación de HypB en pQE60+YAAD (#525) Se realizó un PCR con los oligonucleótidos KaM455/KaM456. Como patrón de ADN se empleó el plásmido HypB en puC19, producido por la compañía Nadicom. El fragmento obtenido contenía la secuencia que codifica el gen de la hidrofobina HypB sin codon de inicio y parada. El fragmento PCR fue purificado por electroforesis de gel y cortado con las endonucleasas de restricción BglII y BamHI.

20 Este fragmento fue empleado como inserto y ligado al vector pQE60+YAAD antes cortado con BglII. KaM455: GCTAACAGATCTATGGTCAGCACGTTCATCACTGTC KaM456: CTATGAGGATCCCACATTGGCATTAATGGGAGTGC Ejemplo 6 Clonación de hidrofobina yaad BASF1-His6 La clonación del plásmido #507 ocurrió de manera análoga al plásmido #508 empleando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. Como patrón de ADN se empleó una secuencia de ADN sintetizada artificialmente -hidrofobina BASF1 (ver apéndice). KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

imagen1

Ejemplo 7 Clonación de hidrofobina yaad BASF2-His6 La clonación del plásmido #506 ocurrió de manera análoga al plásmido #508 empleando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. Como patrón de ADN se empleó una secuencia de ADN sintetizada artificialmente -hidrofobina BASF2 (ver apéndice). KäM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Ejemplo 8 Clonación de hidrofobina yaad SC3-His6 La clonación del plásmido #526 ocurrió de manera análoga al plásmido #508 empleando los oligonucleótidos KaM464 y KaM465. Como patrón de ADN se empleó cDNA de Schyzophyllum commune (ver apéndice). KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Ejemplo 9 Fermentación de la cepa de E.coli recombinante hidrofobina yaad DewA-His6 [0148] Inoculación de 3ml de medio líquido LB con una cepa de E. coli que expresa hidrofobina yaad DewA-His6 en tubos Greiner de 15ml. Incubación por 8h a 37°C en un agitador con 200 rpm. En cada uno de 2 matraces erlenmeyer de 1 litro con tubuladuras y 250ml de medio LB (+ 100µg/ml de ampicilina) se inocularon 1 ml del precultivo y se incubó por 9h a 37°C en un agitador con 180 rpm. Inocular 13.5 litros de medio LB (+100µg/ml de ampicilina) en un fermentador de 20 litros con 0,5 litros del precultivo (OD 600nm 1:10 medidos contra H2O). A una OD60nm de ~3.5 adición de 140ml de IPTG 100mM. Después de 3h de fermentación a 10°C enfriar y separar por centrifugación el caldo de fermentación. Emplear pellas celulares para una purificación ulterior.

Ejemplo 10 Purificación de la proteína de fusión recombinante de hidrohobina (purificación de la proteína de fusión de hidrofobina, que posee un tag His6 C-terminal) Se llevan hasta un volumen total de 200 ml, 100 g de pella celular (100 -500 mg de hidrofobina) con tampón de fosfato de sodio 50 mM y pH 7,5 y se resuspenden. Se trata la suspensión con un Ultraturrax tipo T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) por 10 minutos y a continuación se incuba por 1 hora a temperatura ambiente con 500 unidades de Benzonase (Merck, Darmstadt; número de pedido 1.01697.0001) para la degradación de los ácidos nucleicos. Antes de la degradación celular se filtra con un cartucho de vidrio (P1). Para la degradación celular y para el corte del ADN genómico residual se ejecutaron dos pasos por el homogeneizador a 1.500 bar (microfluidizador M110EH; Microfluidics Corp.). Se centrifuga el homogenizado (Sorvall RC-5B, rotor GSA, tubos de centrifuga de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g), se coloca el sobrenadante en hielo y se resuspenden las pellas en 100 ml de tampón de fosfato de sodio de pH 7,5. Se repiten tres veces la centrifugación y resuspensión, donde en la tercera repetición el tampón de fosfato de sodio contiene 1 % de SDS. Después de la resuspensión se agita por una hora se realiza una centrifugación final (Sorvall RC-5B, rotor GSA, tubos de centrifuga de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g). Según análisis SDS-PAGE, después de la centrifugación final la hidrofobina está presente en el sobrenadante (ilustración 1). La prueba muestra que probablemente la hidrofobina está presente en forma de cuerpos ocluidos en las correspondientes células de E.coli. Se aplican 50 ml del sobrenadante que contiene hidrofobina en una columna de alta resolución de 50 ml níquel-sefarosa 175268-02 (Amersham), la cual había sido equilibrada con tampón de Tris-Cl 50 mM pH 8,0. Se lava la columna con tampón de Tris-CI 50 mM pH 8,0 y a continuación se eluye la hidrofobina con tampón de Tris-Cl 50 mM pH 8,0, el cual contiene imidazol 200 mM. Para la eliminación del imidazol se hace diálisis a la solución contra tampón de Tris-Cl 50 mM pH 8,0. La ilustración 1 muestra la purificación de la hidrofobina producida:

Pista 1: aplicación en columna níquel-sefarosa (dilución 1:10)

Pista 2: paso = Eluato de etapa de lavado

Pistas 3 -5: OD 280 máximo de las fracciones de elución La hidrofobina de la ilustración 1 posee un peso molecular de aproximadamente 53 kD. Las bandas pequeñas representan productos de degradación parcial de la hidrofobina. Ejemplo 11 Prueba de aplicación técnica A; caracterización de la hidrofobina por el cambio del ángulo de contacto de una gota de agua sobre vidrio: Sustrato: vidrio (vidrio de ventana, Süddeutsche Glas, Mannheim) Se empleó la hidrofobina de fusión del ejemplo 10. Concentración de hidrofobina: 100 µg/mL en solución acuosa; adición: 50 mM de acetato de Na, pH 4

+ 0,1 % monolaurato de polioxietilensorbitano (20)-(Tween® 20). -incubación de las placas de vidrio durante la noche (temperatura 80°C), después de lavado el revestimiento en agua destilada, -luego incubación por 10 min/80°C / 1% dodecilsulfato de sodio (SDS) -solución en agua destilada, -lavado en agua destilada Las muestras fueron secadas al aire y se determinó el ángulo de contacto (en grados) de una gota de 5 µl de agua a temperatura ambiente.

22 [0155] La medición del ángulo de contacto fue determinada en un equipo Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (noviembre 2002). La medición ocurrió de acuerdo a los datos de producción. El vidrio no tratado dio un ángulo de contacto de 30 ± 5°; un revestimiento con la hidrofobina 5 funcional de acuerdo con el ejemplo 8 (yaad-dewA-his6) dio un ángulo de contacto de 75 ± 5°. Parte B: Empleo de proteínas no enzimáticas superficialmente activas para el lavado de textiles Descripción general de la prueba: Para la evaluación del efecto se realizó una prueba de lavado en un dispositivo de prueba disponible 10 comercialmente (Laundero-meter, compañía Atlas, USA). Se realizaron en cada caso pruebas con y sin adición de la proteína al licor de lavado. Para las evaluaciones se emplearon tejidos de prueba comercialmente disponibles y auto-producidos.

Número: Tipo Descripción Fuente

1: WFK 10 D Suciedad del pigmento de sebo sobre algodón WfK Testgewebe GmbH, Brüggen-Bracht, Alemania

2: WFK 10 PF Suciedad del pigmento de grasa vegetal sobre algodón WfK Testgewebe GmbH, Brüggen-Bracht, Alemania

3: CFT-CS 32 Suciedad de sebo sobre algodón Center for Testmaterials B.V., Vlaardingen, Holanda

4: EPMA 118 Suciedad del pigmento de sebo sobre algodón EMPA Testmaterials, St. Gallen, Suiza

5: CFTCS10 Grasa de mantequilla coloreada sobre algodón Center for Testmaterials, B.V. Vlaardingen, Holanda

6: CFTCS62 Manteca de ser coloreada sobre algodón Center for Testmaterials, B.V. Vlaardingen, Holanda

7: - Trioleina coloreada sobre algodón Producción propia

8: - Aceite de oliva coloreado sobre algodón Producción propia

15 Realización de la prueba de lavado: Se cortaron piezas de los tejidos de prueba, en cada caso de 30 x 30 mm, y se cosieron sobre algodón tejido blanqueado no coloreado. En el caso de los tejidos de prueba que se compraron, se lavaron respectivamente 2 tiras (50 mm x 200 mm) cosidas con en cada caso 4 (en tejidos 1-4) o bien en cada caso 2 (para los tejidos 5 y 6)

20 diferentes tejidos de prueba, conjuntamente con 5 g de tejido mixto blanco de algodón /poliéster, bajo las condiciones indicadas abajo. En el caso de los tejidos de prueba auto-producidos se hicieron en cada caso 2 manchas con 0,1 g de grasa o bien aceite coloreado sobre una tira de algodón (50 mm x 200 mm de algodón tejido blanqueado no coloreado) y se trataron por 30 min a 50°C. Para el coloreado se empleó rojo Sudán.

25 Después del lavado se enjuagó el tejido en 250 ml de agua del grifo por 5 minutos y a continuación se secó. La valoración del efecto de lavado ocurrió mediante mediciones de reflexión difusa a 420 nm antes y después del lavado.

Se realizó en cada caso una prueba con adición de proteínas no enzimáticas superficialmente activas, y a condiciones de comparación una prueba sin una de tales adiciones pero por otro lado bajo condiciones exactamente iguales. Los porcentajes representados en las tablas de resultados representan la elevación del efecto de lavado en la prueba con adición de proteínas en comparación con la prueba sin adición de proteína, calculados de acuerdo con la siguiente fórmula:

Elevación del efecto de lavado [%]=(IE-I0E)/(Iblanco-IA)*100 IE significa aquí en cada caso la reflexión difusa del tejido de prueba, IA la remisión difusa de la ejecución del lavado de prueba. 0 caracteriza la prueba de comparación sin adición acorde con la invención de proteínas. Iblanco caracterizan la reflexión difusa del tejido limpio sin suciedad. La redeposición de suciedad fue juzgada de modo correspondiente mediante la comparación de la reflexión difusa del tejido blanco limpio sin suciedad antes del lavado y después del lavado, en cada caso para la prueba sin adición y con adición de la proteína.

Ejemplo 12:

Parámetros de prueba:

Proteína empleada: Proteína de fusión-hidrofobina yaad-Xa-dew A-his (SEC

ID NO: 19)

Concentración de la proteína:: Ver tabla 1

Detergente
Detergente: en polvo obtenible comercialmente (White

Cat, China, 2003)

Cantidad de licor de lavado: 250 ml por lata

Dosificación del detergente: 2,0 g/l

Relación de licor de lavado: 20:1

Dureza del agua: 2,5 mmol/l (relación molar Ca:Mg = 3:1)

Temperatura de lavado: 25°C

Duración del lavado: 30 minutos

La proteína fue añadida como solución acuosa diluida. En el lavado de prueba fue ejecutado y evaluado según la descripción general dada arriba. Los resultados son resumidos en la tabla 1: Ejemplo 13:

Parámetros de prueba: Proteína empleada Proteína de fusión-hidrofobina yaad-Xa-dew A-his (SEC

ID NO: 19) Concentración de la proteína: Ver tabla 1 Detergente Detergente en polvo obtenible comercialmente (Ariel,

China, 2004, compañía Procter & Gamble) Cantidad de licor de lavado 250 ml por lata Dosificación del detergente 2,0 g/l Relación de licor de lavado 20:1 Dureza del agua 2,5 mmol/l (relación molar Ca: Mg = 3:1) Temperatura de lavado 25°C Duración de lavado 30 minutos

El lavado de prueba fue ejecutado y evaluado según la descripción general dada arriba. En la tabla 1 se resumen los resultados: En todas las pruebas se logró un claro aumento del efecto de lavado.

Ejemplo: Tejido de prueba Nr. Dosificación de proteína [mg/l] Elevación del efecto de lavado [%]

12-1: 1 2,3 1,2

12-2: 1 5,3 3,8

12-3: 2 2,3 4,9

12-4: 2 5,3 0,9

12-5: 3 2,3 1,2

12-6: 3 5,3 2,0

12-7: 4 2,3 2,7

12-8: 4 5,3 1,5

13-1: 1 2,5 2,9

13-2: 1 5,0 5,5

13-3: 2 2,5 4,9

13-4: 2 5,0 4,8

13-5: 3 2,5 1,6

13-6: 3 5,0 0,9

13-7: 4 2,5 2,2

13-8: 4 5,0 2,2

5 Ejemplo 14: Para los siguientes lavados se empleó en cada caso una formulación modelo para un detergente a partir de un surfactante aniónico, un surfactante no iónico así como amplificador de poder de lavado. Parámetros de prueba:

Proteína empleada Proteína de fusión de hidrofobina yaad40-Xa-dew A-his

10 (SEC ID NO: 26) Concentración de proteína: Ver tabla 2 Surfactante aniónico 400 ppm de sulfato de Na de alcohol graso C12/14 Cosurfactante no iónico en cada caso 30 ppm de un oxoalcoholetoxilato C13/15 Tipo del radical alcoxilato ver tabla 2

15 Relleno 250 ppm de carbonato de sodio Cantidad de licor de lavado 250 ml por lata Relación de licor de lavado 20:1 Dureza del agua 2,5 mmol/l (relación molar Ca: Mg = 3:1) Temperatura de lavado 25°C

20 Duración del lavado 30 minutos

Las pruebas de lavado fueron ejecutadas y evaluadas de acuerdo con la descripción general dada arriba. Los resultados son resumidos en la tabla 2. Tabla 2: Resultados de la prueba de lavado

imagen2

prueba -Nr.: proteína [ppm] poder de lavado

14-1: 5 Oxoalcoholetoxilato C13/15 con 7 EO 5,0 0,6 %

14-2: 6 Oxoalcoholetoxilato C13/15 con 7 EO 5,0 1,1 %

14-3: 5 Oxoalcoholetoxilato C13/15 con 14 EO 5,0 4,1 %

14-4: 6 Oxoalcoholetoxilato C13/15 con 14 EO 5,0 1,7 %

EO = óxido de etileno, PO = óxido de propileno

Ejemplo 15: Para las siguientes pruebas de lavado se empleó en cada caso una formulación modelo para un detergente a partir de un surfactante aniónico, un surfactante no iónico así como amplificador de poder

5 de lavado. Parámetros de prueba:

Proteína empleada Proteína A: Proteína de fusión-hidrofobina yaad-Xa-dew A-his (SEC ID NO: 19)

10 Proteína B: Proteína de fusión-hidrofobina yaad40-Xa-dew A-his (SEC ID NO: 26)

Concentración de la proteína: Ver tabla 3 Surfactante aniónico 400 ppm n-dodecilbencenosulfonato de Na

15 Cosurfactante en cada caso 30 ppm, tipo ver tabla 3 Relleno 250 ppm de carbonato de sodio Cantidad de licor de lavado 250 ml por lata Relación de licor de lavado 20:1 Dureza del agua 2,5 mmol/l (relación de lavado Ca: Mg = 3:1)

20 Temperatura de lavado 25°C Duración de lavado 30 minutos

El lavado de prueba fue realizado y evaluado de acuerdo a la descripción general dada arriba. Los resultados se resumen en la tabla 3. 25 Tabla 3: Resultados de la prueba de lavado.

Ejemplo: Tejido de Cosurfactante Proteína Elevación del efecto de lavado Reducción de la redeposición

prueba Nr.: Tipo Cantidad [ppm]

15-1: 7 Oxoalcoholetoxilato C13/15 con 7 EO A 5 1,5 % 15%

15-2: 7 Alquiletersulfato: Oxoalcoholetoxilato C13/15 con 7 EO, sal B 5 2,1 % 54 %

de Na sulfatada

15-3: 8 Oxoalcoholetoxilato C13/15 con 7 EO A 5 0,9 % 0 %

15-4: 8 Alquiletersulfato: Oxoalcoholetoxilato C13/15 con 7 EO, sal de Na sulfatada B 5 3,6 % 40 %

EO = óxido de etileno, PO = óxido de propileno

En todas las pruebas se logró en cada caso una elevación del efecto de lavado. La hidrofobina de fusión (B) con un asociado de fusión acortado yaad (40 aminoácidos) alcanzó en cada caso mejores resultados que en la hidrofobina de fusión (A) con un asociado total de fusión yaad (294 aminoácidos). Asignación de los nombres de secuencias secuencias de ADN y de polipéptidos en el protocolo de secuencias

Secuencia de polipéptido dewA y ADN: SEC ID NO: 1

Secuencia de polipéptido dewA: SEC ID NO: 2

Secuencia de polipéptido rodA y ADN: SEC ID NO: 3

Secuencia de polipéptido rodA: SEC ID NO: 4

Secuencia de polipéptido hypA y ADN: SEC ID NO: 5

Secuencia de polipéptido hypA: SEC ID NO: 6

Secuencia de polipéptido hypB y ADN: SEC ID NO: 7

Secuencia de polipéptido hypB: SEC ID NO: 8

Secuencia de polipéptido sc3 y ADN: SEC ID NO: 9

Secuencia de polipéptido sc3: SEC ID NO: 10

basf1 ADN y Secuencia de polipéptido: SEC ID NO: 11

Secuencia de polipéptido basf1: SEC ID NO: 12

Secuencia de polipéptido basf2 y ADN: SEC ID NO: 13

Secuencia de polipéptido basf2: SEC ID NO: 14

Secuencia de polipéptido yaad y ADN: SEC ID NO: 15

Secuencia de polipéptido yaad: SEC ID NO: 16

Secuencia de polipéptido yaae y ADN: SEC ID NO: 17

Secuencia de polipéptido yaae: SEC ID NO: 18

Secuencia de polipéptido yaad-Xa-dewA-his y ADN: SEC ID NO: 19

Secuencia de polipéptido yaad-Xa-dewA-his: SEC ID NO: 20

Secuencia de polipéptido yaad-Xa-rodA-his y ADN: SEC ID NO: 21

Secuencia de polipéptido yaad-Xa-rodA-his: SEC ID NO: 22

Secuencia de polipéptido yaad-Xa-basf1-his y ADN: SEC ID NO: 23

Secuencia de polipéptido yaad-Xa-basf1-his: SEC ID NO: 24

Secuencia de polipéptido yaad40-Xa-dewA-his y ADN: SEC ID NO: 25

Secuencia de polipéptido yaad40-Xa-dewA-his: SEC ID NO: 26

27

Claims

1.: El empleo para el lavado de textiles de proteínas no enzimáticas, superficialmente activas, caracterizado porque las proteínas se caracterizan por la propiedad de que después de la aplicación sobre una superficie de vidrio a temperatura ambiente, causan un aumento de por lo menos 20° en el ángulo de contacto de una gota de agua, comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño con la superficie no tratada, donde las proteínas son hidrofobinas.

2.: Empleo según la reivindicación 1, caracterizado porque las proteínas son hidrofobinas de fusión, donde el asociado de fusión incluye 20 a 500 aminoácidos.

3.: Empleo según la reivindicación 2, caracterizado porque por lo menos una de las hidrofobinas es elegida de entre el grupo compuesto por yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEC ID NO: 22) o yaad-Xabasf1-his (SEC ID NO: 24), con la condición de que yaad en cada caso también puede ser un asociado de fusión yaad acortado, con 20 a 293 aminoácidos.

4.: Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las hidrofobinas son empleadas en una concentración de 0,05 a 50 ppm en el licor de lavado.

5.: Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las proteínas son empleadas en combinación con surfactantes aniónicos y/o no iónicos, donde es una combinación de alquilbencenosulfonatos lineales o sulfatos de alcohol graso con sulfatos de alquiléter o alcoxilatos de alquilo.

6.: Detergente para el lavado de textiles en forma de polvos, granulados, perlas, pastas, tabletas, geles o líquidos, que incluye por lo menos una sustancia activa al lavado elegida de entre el grupo de surfactantes, amplificadores del poder de lavado, co-amplificadores del poder de lavado, sistemas de blanqueo y enzimas para detergentes, caracterizado porque el detergente además incluye por lo menos una proteína no enzimática superficialmente activa la cual se caracteriza por la propiedad de que después de la aplicación sobre una superficie de vidrio a temperatura ambiente, causa un aumento de por lo menos 20° en el ángulo de contacto de una gota de agua, comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no tratada, donde la proteína es una hidrofobina, con la condición de que el detergente contiene

(a): 0,01 a 1,5 % en peso de hidrofobinas,

(b): 0,5 a 40 % en peso de un surfactante aniónico y/o no iónico, así como

(c): 59 a 99,45 % en peso de otras adiciones activas al lavado o ayudas de formulación.

7.: Detergente según la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína es una hidrofobina de fusión, donde el asociado de fusión incluye 20 a 500 aminoácidos.

8.: Detergente según la reivindicación 7, caracterizado porque la por lo menos una hidrofobina es elegida de entre el grupo compuesto por yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEC ID NO: 22) o yaad-Xabasf1-his (SEC ID NO: 24), con la condición de que yaad puede ser en cada caso por lo menos también un asociado de fusión yaad acortado, con 20 a 293 aminoácidos.

9.: Detergente según la reivindicación 6, donde los surfactantes son una combinación de alquilbencenosulfonatos lineales o sulfatos de alcohol graso con sulfatos de alquiléter o alcoxilatos de alquilo.

10.: Método para el lavado de materiales textiles que incluye por lo menos los siguientes pasos:

(a): llenado de un dispositivo de lavado con materiales textiles que van a ser lavados así como con un licor acuoso de lavado,

(b): aplicar energía mecánica sobre la mezcla de materiales textiles y licor de lavado,

(c): eliminar el licor acuoso de lavado y de modo opcional enjuagar los materiales textiles, así como

(d) secar los materiales textiles, caracterizado porque el licor acuoso de lavado incluye por lo menos una proteína no enzimática, superficialmente activa, la cual se caracteriza por la propiedad de que después de la aplicación sobre una superficie de vidrio a temperatura ambiente, causa un aumento de por lo menos 20° del ángulo de contacto de una gota de agua comparado con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño sobre la superficie no tratada, donde la proteína es una hidrofobina.

11.: Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína es una hidrofobina de fusión, donde el asociado de fusión incluye 20 a 500 aminoácidos.

12.: Método según la reivindicación 11, caracterizado porque por lo menos una de las hidrofobinas es elegida de entre el grupo compuesto por yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEC ID NO: 22) o yaad-Xabasf1-his (SEC ID NO: 24), con la condición de que yaad puede ser en cada caso también un asociado de fusión yaad con 20 a 293 aminoácidos.

13.: Método según una de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque se emplea la proteína en combinación con surfactantes aniónicos y/o no iónicos, donde es una combinación de alquilbencenosulfonatos lineales o sulfatos de alcohol graso con sulfatos de alquiléter o alcoxilatos de alquilo.

14.: Método según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el procedimiento de lavado se hace a una temperatura no superior a 60°C.

15.: Método según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el procedimiento de lavado se hace una temperatura de 5 a 45°C.

16.: Método según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el procedimiento de lavado se hace a una temperatura de 15 a 35°C.

17.: Método según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque la proteína es empleada en una concentración de 0,05 a 50 ppm en el licor de lavado.