BRPI0614703A2 - uso de proteìnas não enzimáticas ativas na interface, composição de lavagem para a lavagem de têxteis, e, processo para lavar materiais têxteis - Google Patents

Abstract

<B>USO DE PROTEìNAS NãO ENZIMATICAS ATIVAS NA INTERFACE,COMPOSIçãO DE LAVAGEM PARA A LAVAGEM DE TêXTEIS, E, PROCESSO PARA LAVAR MATERIAIS TêXTEIS<D>O uso de proteínas não enzimáticas ativas na interface para a lavagem de têxteis. As composições de lavagem para a lavagem de têxteis que compreendem proteínas não enzimáticas ativas na interface e processos para lavar usando tais proteínas.

Description

"USO DE PROTEÍNAS NÃO ENZIMÁTICAS ATIVAS NA INTERFACE,COMPOSIÇÃO DE LAVAGEM PARA A LAVAGEM DE TÊXTEIS, E,PROCESSO PARA LAVAR MATERIAIS TÊXTEIS"

A presente invenção refere-se ao uso de proteínas nãoenzimáticas ativas na interface para lavagem de têxteis. Refere-se também àscomposições de lavagem para lavagens de têxteis que contêm proteínas nãoenzimáticas ativas na interface e para um processo para lavagem utilizandotais proteínas.

A remoção de sujeiras, especialmente de manchashidrofóbicas, na lavagem de têxteis ocorre atualmente em um grau satisfatóriosomente em temperaturas relativamente elevadas. Em temperaturasmoderadas e especialmente à temperatura ambiente, há também uma demandaconsiderável por uma melhora do desempenho de lavagem. De acordo com aarte anterior, a remoção de manchas hidrofóbicas é realizada em particularcom tensoativos e enzimas lipolíticas.

O uso das proteínas enzimáticas como um aditivo paracomposições de lavagem é conhecido em princípio. Especialmente, proteasessão utilizadas nas composições de lavagem, mas o uso de amilases, celulasesou lipases é também conhecido. Maiores detalhes são dados, por exemplo, em"Waschmittel-Enzyme" em Rõmpp Chemie-Lexikon, Edição Online, Versão2,6, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart, New York, Fev. 2005.

Sabe-se também que proteínas podem ser usadas a fim de fixaros auxiliares de lavagem, por exemplo: agentes fixadores, protetores de UV,substâncias perfumantes ou auxiliares de remoção de sujeira, para a fibra.Para esse fim, WO 98/00500 descreve o uso de celulase, derivados de celulaseou proteínas de tipo de celulase, e WO 01/46357 descreve para este fim umaproteína de fusão com um sítio de ligação para celulose e um sítio de ligaçãopara outros compostos.

Proteínas ativas na interface são conhecidas em princípio. Umaclasse de proteínas com atividade na interface particularmente forte que é daschamadas "hidrofobinas". Hidrofobinas têm uma afinidade marcante parasuperfícies e são conseqüentemente apropriadas para interfaces derevestimento. Por exemplo, Teflon pode ser hidrofilizado por revestimento da interface de Teflon com hidrofobinas.

Hidrofobinas são proteínas pequenas de cerca de 100 a 150aminoácidos, que são características do fungo filamentoso, por exemploSchizophyllum commune. Elas geralmente têm 8 unidades de cisteína.

Hidrofobinas podem primeiramente ser isoladas de fontes naturais. Entretanto, elas podem também ser obtidas por meio de métodos deengenharia genética. O pedido anterior dos requerentes PCT/EP2006/050719descreve um tal processo de preparação para hidrofobinas.

A arte anterior propôs o uso de hidrofobinas para váriasaplicações.

WO 96/41882 propõe o uso de hidrofobinas comoemulsificadores, espessadores, substâncias tensoativas, hidrofilizar interfaceshidrofóbicas, para melhorar a resistência à água dos substratos hidrofílicos,para preparação emulsões de óleo-em-água ou emulsões de água-em-óleo.Emadição, aplicações farmacêuticas tais como a produção de ungüentos ou cremes e aplicações de cosméticos tais como proteção de pele ou produção dexampu ou enxágües de cabelo são propostas.

EP 1 252 516 descreve o revestimento de janelas, lentes decontato, biossensores, equipamento médico, recipientes para testes dedesempenho ou para armazenamento, cascos de navios, partículas sólidas ou estruturas ou chassis de veículos de passageiros com uma solução incluindohidrofobinas a uma temperatura de 30 a 80°C.

WO 03/53383 descreve o uso de hidrofobina para tratamentode materiais de queratina em aplicações cosméticas.

WO 03/10331 descreve um sensor revestido com hidrofobina,por exemplo um eletrodo de teste ao qual outras substâncias, por exemplosubstâncias eletroativas, anticorpos ou enzimas, são ligados em uma maneiranão covalente.

O uso de proteínas não enzimáticas ativas na interface,especialmente de hidrofobinas, como um aditivo para remover sujeiras paracomposições de lavagem não foi descrito até o momento.

É um objeto da invenção prover composições de lavagemmelhoradas e processos melhorados para a lavagem de têxteis. Ela seráespecialmente notável para uma melhora do desempenho de lavagem no casode lavagem em baixas temperaturas.

Conseqüentemente, o uso de proteínas não enzimáticas ativasna interface para lavagem de têxteis foi encontrado.

Em um segundo aspecto da invenção, composições de lavagemque incluem proteínas não enzimáticas ativas na interface foram encontradas.

Em um terceiro aspecto da invenção, um processo de lavagemem que uma licor de lavagem que inclui proteínas não enzimáticas ativas nainterface foi encontrado. Em uma forma de realização particular do processo,a lavagem é realizada a uma temperatura de não mais do que 60°C.

Em uma forma de realização particularmente preferida dainvenção, as proteínas não enzimáticas ativas na interface são em cada casohidrofobinas.

Verificou-se que, surpreendentemente, a adição de proteínasnão enzimáticas ativas na interface para o licor de lavagem dá origem a umamelhora significativa na ação de lavagem. Foi particularmente surpreendenteque esse efeito é encontrado mesmo a temperaturas de lavagem baixas etambém mesmo no caso do uso de quantidades extremamente pequenas dasproteínas. Por exemplo, mesmo a uma concentração de somenteaproximadamente 2,5 ppm da proteína na licor de lavagem em combinaçãocom uma composição de lavagem convencional a uma temperatura delavagem de somente 25°C, uma melhora na ação de lavagem de até 8% foiverificada.

Além de uma melhora da ação de remoção de sujeira, umaação de inibição do acinzentamento é também observada para manchasoleosas coloridas. Manchas hidrofóbicas que podem ser separadas dos tecidosno curso da lavagem podem ser depositadas de volta sobre a roupa de lavarem uma forma finamente dividida e assim levar ao acinzentamento oudescoloração. Pela sua natureza, esse efeito é particularmente marcante emtecidos brancos ou de cores esmaecidas. Esse problema ocorre especialmentequando os tensoativos e o sistema reforçador estão em uma baixa dosagem. Aadição inventiva de proteínas não enzimáticas ativas na interface reduz essareposição e assim melhora a brancura do tecido lavado comparado comtecidos que foram lavados sem a adição de tais proteínas.

Os detalhes específicos da invenção são como à seguir:

Para realizar a invenção, proteínas não enzimáticas ativas nainterface foram usadas. O termo "não enzimática é destinado a significar queas proteínas preferivelmente não têm ou não têm pelo menos uma açãoenzimática significante.

O termo "ativo na interface" destina-se a significar que asproteínas usadas possuem a capacidade de influenciar as propriedades dasinterfaces. As interfaces em questão podem ser interfaces: sólida-sólida,sólida-líquida, sólida-gasosa, líquida-líquida ou líquida-gasosa. Em particular,elas podem ser interfaces sólida-líquida ou líquida-líquida.

No caso de uma interface sólida-líquida, a propriedade pode,por exemplo, ser a hidrofilicidade ou a hidrofobicidade da superfície dosólido, que muda sob a influência da proteína usada. A mudança nahidrofilicidade ou hidrofobicidade pode ser avaliada em um modo conhecidopor medição do ângulo de contato de uma gotícula de água em uma superfícierevestida ou não. Uma outra propriedade da interface é a mudança na tensãosuperficial de um líquido, que pode ser medida por métodos conhecidos.

Para realizar a invenção, preferência é dada ao uso deproteínas que são ativas na interface mesmo em baixas concentrações. Asproteínas apropriadas são especialmente aquelas que têm significantespropriedades ativas na interface mesmo em concentrações de 0,05 a 50 ppm.

Em uma forma de realização preferida da invenção, asproteínas usadas são aquelas que apresentam a propriedade de causar umaumento no ângulo de contato de uma gotícula de água (5 μΐ) de pelo menos20° após a aplicação a uma superfície de vidro a temperatura ambiente,comparado ao ângulo de contato de uma gotícula de água igualmente grandecom a superfície de vidro não revestida. Preferência é dada às proteínas cujoaumento do ângulo de contato é de pelo menos 25°, mais preferivelmente depelo menos 30°. O desempenho das medidas de ângulos de contatos éconhecido em princípio pelos versados na arte. As condições experimentaisexatas para um método apropriado a título de exemplo para medir o ângulocontato são detalhadas na parte experimental.

Em uma forma de realização particularmente preferida dainvenção, as proteínas usadas são hidrofobinas.

No contexto da presente invenção, o termo "hidrofobinas"deve ser entendido a seguir para significar polipeptídeos da fórmula estruturalgeral (I)

Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)onde X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturais (Phe, Leu, Ser,Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Thr, Asn, Lys, Vai, Ala, Asp, Glu,Gly). Na fórmula os radicais X podem ser iguais ou diferentes em cada caso.Os índices ao lado de X são cada qual o número de aminoácidos na parte-seqüência X particular, C é cisteína, alanina, serina, glicina, metionina outreonina, onde pelo menos quatro dos resíduos marcados com C são cisteína, eos índices nem são cada independentemente números naturais entre 0 e 500,preferivelmente entre 15 e 300.

Os polipeptídeos da fórmula (I) são também caracterizadospela propriedade que eles provocam um aumento no ângulo de contato deuma gotícula de água de pelo menos 20°, preferivelmente de pelo menos 25°e mais preferivelmente de 30° a temperatura ambiente após revestir umasuperfície de vidro, comparada em cada caso com o ângulo de contato de umagotícula de água igualmente grande com a superfície de vidro não revestida.

Os aminoácidos designados com C1 a C8 são preferencialmentecisteínas; entretanto, eles podem também ser substituídos por outrosaminoácidos com preenchimento de espaço similar, preferencialmente poralanina, serina, treonina, metionina ou glicina. No entanto, pelo menos quatro,preferivelmente pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 6 e emparticular pelo menos 7 destas posições, C1 a C8 deve consistir de cisteínas.

Nas proteínas inventivas, cisteínas podem também estar presentes na formareduzida ou forma de pontes de dissulfeto um com outra. Particularpreferência é dada para a formação intramolecular de pontes C-C,especialmente com pelo menos uma ponte de dissulfeto intramolecular,preferivelmente 2, mais preferivelmente 3 e mais preferivelmente 4 pontes dedissulfeto intramoleculares. No caso da troca descrita acima de cisteínas poraminoácidos com preenchimento de espaço similar, tais posições de C sãovantajosamente permutadas em pares que podem formar pontes de dissulfetointramoleculares uma com a outro.

Se cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas outreoninas são também usadas nas posições designadas com X, a numeração deposições individuais de C na fórmula geral podem mudarcorrespondentemente.

Preferência é dada ao uso de hidrofobinas da fórmula geral (II)Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (H)para realizar a presente invenção, onde X, C e os índices ao lado XeC sãocada como definidos acima, os índices nem são, cada, números entre 0 e350, preferivelmente de 15 a 300, as proteínas adicionalmente caracterizam amudança no ângulo de contato acima ilustrado, e, além disso, pelo menos 6dos resíduos designados com C são cisteína. Mais preferivelmente, todos osresíduos de C são cisteína.

Particular preferência é dada ao uso de hidrofobinas dafórmula geral (III)

<formula>formula see original document page 8</formula>

onde X, C e os índices ao lado de X são como definidos acima, os índices η em são, cada, números entre 0 e 200, e as proteínas adicionalmentecaracterizam a mudança no ângulo de contato acima ilustrada, e pelo menos 6dos resíduos designados C são cisteína. Mais preferivelmente, todos osresíduos de C são cisteína.

Os resíduos Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeos quenaturalmente são também unidas a uma hidrofobina. Entretanto, um ou ambosos resíduos podem também ser seqüências de peptídeo que não sãonaturalmente combinadas a uma hidrofobina. Também deve ser entendidosignificar os resíduos Xn e/ou Xm em que uma seqüência de peptídeos queocorre naturalmente em uma hidrofobina é alongada por uma seqüência depeptídeos que não ocorre naturalmente em uma hidrofobina.

Se Xn e/ou Xm são seqüências de peptídeo que não sãonaturalmente ligadas a hidrofobinas, tais seqüências são pelo menos 20,preferivelmente pelo menos 35, mais preferivelmente de pelo menos 50 e, porexemplo, pelo 100 aminoácidos em comprimento. As seqüências podem, porexemplo, ser ciências de 20 a 500, preferivelmente de 30 a 400 e maispreferivelmente de 35 a 100 aminoácidos. Tal resíduo que não é naturalmenteligado a uma hidrofobina será também referido em seguida como um parceirode fusão. Isto se destina a expressar que as proteínas podem consistir de pelomenos uma porção de hidrofobina e uma porção de parceiro de fusão que nãoocorrem juntas nesta forma na natureza.

A porção de parceiro de fusão pode ser selecionada de umamultitude de proteínas. Também é possível que apenas um parceiro de fusãosimples seja adicionado a uma porção de hidrofobina, ou também é possívelque uma pluralidade de parceiros de fusão seja adicionada a uma porção dehidrofobina, por exemplo, no término de amina (Xn) e no término de carboxila(Xm) da porção de hidrofobina. Entretanto, é também possível, por exemplo,que dois parceiros de fusão sejam adicionados a uma posição (Xn ou Xm) daproteína inventiva.

Os parceiros de fusão particularmente apropriados são os queocorrem em microorganismos, especialmente em E. coli ou Bacillus subtilis.Exemplos de tais parceiros de fusão são as seqüências yaad (SEQ ID NO: 15e 16), yaae (SEQ ID NO: 17 e 18), e tioredoxina. Também muito apropriadossão fragmentos ou derivados destas seqüências que incluem apenas algumas,por exemplo, de 70 a 99%, preferencialmente de 5 a 50% e maispreferivelmente de 10 a 40% das seqüências mencionadas, ou em queaminoácidos individuais ou nucleotídeos foram alterados em comparação coma seqüência mencionada, caso em que as porcentagens são cada baseadas nonúmero de aminoácidos.

Em outra forma de realização preferida, a hidrofobina defusão, bem como o parceiro de fusão mencionado, como um grupo Xn ou Xmou como um constituinte terminal de tal grupo, também tem um assimchamado domínio de afinidade (etiqueta de afinidade/ cauda de afinidade).Em um modo conhecido em princípio, isso compreende grupos de âncora quepodem reagir com grupos complementares particulares e podem servir parafacilitar o trabalho e purificação das proteínas. Exemplos de tais domínios deafinidade compreendem grupos (His)k, (Arg)k, (Asp)k, (Phe)k ou (Cys)k, ondek é geralmente um número natural de 1 a 10. Pode preferencialmente ser umgrupo (His)k, onde k é de 4 a 6. Neste caso, o grupo Xn e/ou Xm pode consistirexclusivamente de tal domínio de afinidade, ou outro radical Xn ou Xm que énaturalmente ligado ou não é naturalmente ligado a uma hidrofobina éestendido por um domínio de afinidade terminal.

As proteínas, usadas de acordo com a invenção comohidrofobinas ou derivados destas podem também ser modificadas em suaseqüência de peptídeo, por exemplo por glicosilação, acetilação ou então porreticulação química, por exemplo, com glutaraldeído.

Uma propriedade das hidrofobinas,ou derivados das mesmas,usadas de acordo com a invenção, é a mudança nas propriedades de superfíciequando as superfícies são revestidas com as proteínas. A mudança naspropriedades de superfície podem ser determinadas experimentalmente, porexemplo, pela medição do ângulo de contato de uma gotícula de água antes edepois do revestimento da superfície com a proteína e determinando adiferença das duas medições.

O desempenho das medições do ângulo de contato é conhecidoem princípio pelos versados na arte. As medições são baseadas na temperaturaambiente e gotículas de água de 5 μl e o uso de placas de vidro comosubstratos. As condições experimentais exatas para um exemplo de métodoapropriado de medição do ângulo de contato são dadas na seção experimental.Sob as condições mencionadas aqui, as proteínas de fusão usadas de acordocom a invenção têm a propriedade de aumentar o ângulo de contato em pelomenos 20°, preferivelmente pelo menos 25°, mais preferivelmente pelo menos30°, comparado em cada caso com o ângulo de contato de uma gotícula deágua igualmente grande com a superfície de vidro não revestida.

As hidrofobinas particularmente preferidas para realizar apresente invenção são as hidrofobinas do tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3,basfl, basf2, que são caracterizadas estruturalmente na lista de seqüência aseguir. Elas podem também apenas ser partes ou derivados destas. Também, épossível que uma pluralidade das porções de hidrofobina, preferivelmente 2ou 3, da estrutura idêntica ou diferente seja ligada a uma outra e ligada a umaseqüência de polipeptídeo correspondente apropriada que não é ligada a umahidrofobina na natureza.

Também particularmente apropriadas, de acordo com ainvenção, são as proteínas de fusão yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20),yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24),com as seqüências de polipeptídio especificadas em parênteses e asseqüências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas, especialmenteseqüências de acordo com SEQ ID NO: 19, 21, 23; mais preferivelmente, épossível o uso de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20). Proteínas que,derivando de seqüências de polipeptídio mostradas na SEQ ED NO. 20, 22 ou24, surgem através da troca, inserção ou deleção de pelo menos um até 10,preferivelmente 5 aminoácidos, mais preferivelmente de 5% de todosaminoácidos, e que ainda têm a propriedade biológica de proteínas de partidapara uma extensão de pelo menos 50%, também são formas de realizaçõesparticularmente preferidas. Uma propriedade biológica das proteínas éentendida aqui para significar a mudança no ângulo de contato em pelo menos20°, o que já foi descrito.

Derivados particularmente apropriados para realizar ainvenção são resíduos derivados de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20),yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24)por truncagem de parceiro de fusão de yaad. Em vez de um parceiro de fusãoyaad completo (SEQ ID NO: 16) com 294 aminoácidos, pode ser vantajosousar um resíduo de yaad truncado. O resíduo truncado deve, assim, incluirpelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 35 aminoácidos. Porexemplo, um radical truncado tendo de 20 a 293, preferivelmente de 25 a 250,mais preferivelmente de 35 a 150 e, por exemplo, de 35 a 100 aminoácidospode ser usado. Um exemplo de tal proteína é yaad40-Xa-dewA-his (SEQ IDNO: 26), que tem um resíduo de yaad truncado para 40 aminoácidos.Um sítio de clivagem entre a hidrofobina e o parceiro de fusãoou os parceiros de fusão pode ser utilizado para liberar a hidrofobina pura emforma não derivatizada (por exemplo por clivagem de BrCN em metionina,clivagem de fator Xa, clivagem de enteroquinase, clivagem de trombina,Clivagem de TEV, etc.).

Também é possível gerar proteínas de fusão em sucessão deum parceiro de fusão, por exemplo yaad ou yaae, e uma pluralidade dehidrofobinas, mesmo de seqüência diferente, por exemplo DewA-RodA ouSc3-DewA, Sc3-RodA. E igualmente possível usar fragmentos de hidrofobina(por exemplo truncagens N- ou C-terminais) ou muteína que tem até 70% dehomologia. As construções ótimas são em cada caso selecionadas em relaçãoao uso particular, em geral as fases do líquido a serem separadas.

As hidrofoninas usadas de acordo com a invenção utilizadaspara lavagem de têxteis podem ser quimicamente preparadas por método desíntese de peptídeos conhecidos, por exemplo por síntese de fase sólida deMerrifield.

As hidrofobinas de ocorrência natural podem ser isoladas defontes naturais por meio de métodos apropriados. Referência é feita a título deexemplo a Wõsten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) ou WO96/41882.

Um método de produção por engenharia genética parahidrofoninas sem parceiros de fusão de Talaromyces thermophilus é descritopor US 2006/0040349.

Proteínas de fusão podem ser preparadas preferivelmente pormétodos de engenharia genética, em que uma seqüência de ácido nucleico,especialmente seqüência de DNA, codificando o parceiro de fusão e umacodificando a porção de hidrofobina são combinadas de tal forma que aproteína desejada é gerada em um organismo hospedeiro como um resultadoda expressão do gene da seqüência de ácido nucleico combinada. Tal processode preparação é descrito, por exemplo, em PCT/EP2006/050719.

Os organismos hospedeiros apropriados (organismos deprodução) para o método de preparação mencionado podem ser procarióticos(incluindo o Archaea) ou eucarióticos, particularmente bactérias incluindohalobactérias e metanococcias, fungos, células de insetos, células de plantas ecélulas de mamíferos, mais preferivelmente de Escherichia coli, Bacillussubtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacilli, Hansenulapolimorpha, Trichoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas) dentre outros.

A invenção também provê para o uso de construções deexpressão compreendendo, sob o controle genético das seqüências de ácidonucleico regulatórias, uma seqüência de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo usado de acordo com a invenção, e também vetores incluindopelo menos uma dessas construções de expressão.

Construções usadas preferivelmente incluem, 5' a montante deuma particular seqüência de codificação, um promotor e, 3' a jusante, umfinalizador de seqüência e se apropriado, outros elementos reguladores usuais,em cada caso vinculado operativamente a seqüência codificada.

No contexto da presente invenção, uma "ligação operativa" éentendida para significar um arranjo seqüencial de promotor, seqüênciacodificada, terminador e se apropriado outros elementos regulatórios de talforma que cada um dos elementos regulátorios possam desempenhar as suasfunções como previsto na expressão da seqüência de codificação.

Exemplos de seqüências operativamente ligadas sãoseqüências de marcação, e também melhoradores, sinais de poliadenilação eoutros. Outros elementos regulatórios compreendem marcadoresselecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e outros.Apropriadas seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas em Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,San Diego, CA (1990).

Em adição a essas seqüência regulatórias, a regulação naturaldestas seqüências pode ainda estar presente a montante dos genes estruturaisreais, se apropriado, tenham sido geneticamente modificados, de modo adesligar a regulação natural e aumentar a expressão dos genes.

Uma construção do ácido nucleico preferida tambémvantajosamente inclui uma ou mais das chamadas seqüências de"melhorador", unidos funcionalmente ao promotor, que permitem umaaumentada expressão da seqüência de ácido nucleico. Também naextremidade 3' das seqüências de DNA, é possível que outras seqüênciasvantajosas serem inseridas, como outros elementos regulatórios outerminadores.

Os ácidos nucleicos podem estar presentes na construção emuma ou mais cópias. E também possível para outros marcadores tais comoresistências a antibiótico ou genes que complementam auxotrofias paraestarem presentes na construção, se apropriado para a seleção para aconstrução.

As seqüências de regulação vantajosas para a preparação estãopresentes, por exemplo, nos promotores tais como o cos, tac, trp, tet, trp-tet,Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6,promotor lambda-PR ou imlambda-P,que vantajosamente têm utilidade embactérias Gram-negativas. Outras seqüências de regulação vantajosas estãopresentes, por exemplo, nos promotores Gram-positivos amy e SP02, e nalevedura ou promotores fungicos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1,GAPDH, TEF, rp28, ADH.

E também possível o uso de promotores sintéticos para aregulação.

Para a expressão em um organismo hospedeiro, a construçãodo ácido nucleico é vantajosamente inserida dentro do vetor, por exemplo umplasmídeo ou um fago que possibilita a expressão ótima dos genes nohospedeiro. Além dos plasmídeos e fagos, vetores também são entendidospara significar todos os outros vetores conhecidos dos versados na arte, porexemplo vírus tais como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transposons,elementos IS, fasmídeos, cosmídeos, e DNA linear ou circular e tambémsistema de Agrobactérias.

Esses vetores podem ser replicados autonomamente noorganismo hospedeiro ou replicados cromossomicamente. Apropriadosplasmídeos são, por exemplo, em E. coli pLG338, pACYC184, pBR322,pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19,2, pHS2,pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, ρΙΝ-ΠΓ'3-Bl, tgtll ou pBdCI, emStreptomyces plJl0l, pIJ364, plJ702 ou plJ361, em Bacillus pUBll0, pC194ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALSl,plL2 ou pBBl 16, em leveduras 2alfa, pAG-1, YEp6, YEp 13 ou pEMBLYe23ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Osplasmídeos mencionados constituem uma pequena seleção dos possíveisplasmídeos. Outros plasmídeos são conhecidos dos versados na arte e podeser obtidos, por exemplo, do livro Cloning Vectors (Eds. Pouwels Ρ. H. et al.Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

Vantajosamente, a construção do ácido nucleico, paraexpressão de outros genes presentes, adicionalmente também incluiseqüências regulatórias 3'- e/ou 5'- terminais para otimizar a expressão, quesão selecionadas para expressão ótima dependendo do organismo hospedeiroe gene ou genes selecionados.

Estas seqüências regulatórias são destinadas a possibilitar aexpressão controlada dos genes e da expressão de proteína. Dependendo doorganismo hospedeiro, isso pode significar, por exemplo, que o gene éexpressado ou superexpressado apenas após indução, ou que é expressado e/ousuperexpressado imediatamente.As seqüências regulatórias ou fatores podem preferivelmenteinfluenciar positivamente e deste modo aumentar a expressão genética dosgenes introduzidos. Deste modo, uma amplificação dos elementos reguladorespode vantajosamente ser efetuada ao nível de transcrição por utilização desinais de transcrição fortes tais como promotores e/ou melhoradores. Alémdisso, também é possível otimizar a tradução, por exemplo, melhorando aestabilidade do mRNA.

Em outra forma de realização do vetor, o vetorcompreendendo a construção do ácido nucleico ou o ácido nucleico podetambém ser introduzido dentro de microorganismos vantajosamente na formade um DNA linear e ser integrado dentro de um genoma do organismohospedeiro por meio de recombinação homóloga ou heteróloga. Esse DNAlinear pode consistir de um vetor linearízado tal como um plasmídeo ouapenas da construção do ácido nucleico ou o ácido nucleico.

Para uma expressão ótima dos genes heterólogos nosorganismos, é vantajoso alterar as seqüências de ácido nucleico de acordocom o específico "uso de códon " utilizado no organismo. O "uso de codons"pode ser determinado facilmente com referência a avaliações de computadorde outros genes conhecidos do organismo em questão.

Uma cassete de expressão é preparado por fusão de umpromotor apropriado com uma seqüência de nucleotídeo de codificaçãoapropriada e um sinal de terminador ou sinal de poliadenilação. Para esse fim,técnicas de recombinação e de clonagem comuns são usadas, como descrito,por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY (1989) e em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W. Enquist, Experimentswith Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987).Para a expressão em um organismo hospedeiro apropriado, aconstrução do ácido nucleico recombinante ou construção de gene évantajosamente inserida dentro de um vetor específico do hospedeiro quepossibilita uma expressão ótima dos genes no hospedeiro. Vetores são bemconhecidos dos versados na arte e pode ser obtidos, por exemplo, de "Cloningvectors" (Pouwels Ρ. H. et al., eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford,1985).

Com ajuda dos vetores, é possível preparar microorganismosrecombinantes que foram transformados, por exemplo, com pelo menos umvetor e podem ser usados para a produção de hidrofobinas ou derivados dasmesmas usados de acordo com a invenção. Vantajosamente, as construçõesrecombinantes acima descritas são inseridas dentro de um sistema hospedeiroapropriado e expressadas. Preferência é dada ao uso de métodos de clonageme de transfecção familiares para os versados na arte, por exemplo co-precipitação, fusão de protoplastos, eletroporação, transfecção retroviral eoutros, a fim de ocasionar a expressão dos ácidos nucleicos mencionados nosistema de expressão particulares. Apropriados sistemas são descritos, porexemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed.,Wiley Interscience, New York 1997, ou Sambrook et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Também é possível preparar microorganismo recombinadoshomologamente. Para este fim, um vetor é preparado, o qual compreende pelomenos uma seção do gene a ser usado ou uma seqüência de codificação, emque, se apropriado, pelo menos uma deleção, adição ou substituição doaminoácido foi introduzida a fim de mudar, por exemplo, para romperfuncionalmente a seqüência (vetor "nocaute"). A seqüência introduzida pode,por exemplo, também ser uma homóloga de um microorganismo relacionadoou ser derivada de uma fonte de mamífero, levedura ou de inseto. O vetorusado para a recombinação homóloga pode alternativamente ser configuradotal que o gene endógeno no caso da recombinação homóloga foi mudada oualterado de outra maneira, mais ainda codifica a proteína funcional (porexemplo, a região regulatória a montante pode ser mudada tal que a expressãoda proteínas endógena é mudada). A seção mudada do gene usado de acordocom a invenção é um vetor de recombinação homóloga. A construção dosvetores apropriados para recombinação homóloga é descrita, por exemplo, emThomas, K. R. e Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

A princípio, todos organismos procarióticos e eucarióticos são úteis como organismos hospedeiros recombinantes para tais ácidos nucleicosou tais construções de ácidos nucleicos. Vantajosamente, os organismoshospedeiros usados são microorganismos tais como bactérias fungos ouleveduras. Vantajosamente, Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas sãousadas, preferivelmente bactéria das famílias de Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae ou Nocardiaceae, maispreferivelmente de bactéria dos gêneros: Escherichia, Pseudomonas,Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium ouRhodococcus.

Os organismos usados no processo de preparação paraproteínas de fusão descritos acima são, dependendo do organismo hospedeiro,cultivados ou cultivados de forma conhecida para os versados na arte.Microorganismos são geralmente cultivados em um meio líquido quecompreende uma fonte de carbono, geralmente na forma de açúcares, umafonte de nitrogênio, geralmente na forma de fontes de nitrogênio orgânico tal como extrato de leveduras ou sais tais como sulfato de amônio,oligoelementos tais como ferro, manganês e sais de magnésio, e também, seapropriado, vitaminas, a temperaturas entre 0 e 100°C, preferivelmente entre10 a 60°C, com pulverização de oxigênio. O pH do líquido nutriente pode sermantido a um valor fixado, em geral é regulado ou não durante o crescimento.O crescimento pode ser efetuado em modo em batelada, em modo de semi-batelada, ou continuamente. Nutrientes podem ser introduzidos no início dafermentação ou ser abastecidos semicontinuamente ou continuamente. Asenzimas podem ser isoladas dos organismos pelo processo descrito nosexemplos ou usadas para a reação como um extrato bruto.

As hidrofobinas usadas de acordo com a invenção, oufragmentos biologicamente ativos funcionais das mesmas podem serpreparadas por meio de um processo para a preparação recombinante, em queum microorganismo produtor de polipeptídeo é cultivado, a expressão dasproteínas é induzida se apropriado e eles são isolados da cultura. As proteínaspodem também ser produzidas desta forma em uma escala industrial se fordesejado. O microorganismo recombinante pode ser cultivado e fermentadopor processos conhecidos. Bactérias podem ser propagadas, por exemplo, emmeio TB ou LB e a uma temperatura de 20 a 40°C e um pH de 6 a 9. Ascondições de cultivo apropriadas são descritas especificamente, por exemplo,em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989).

Os parceiros de fusão facilitam a preparação das hidrofobinasconsideravelmente. Hidrofobinas de fusão são produzidas com umrendimento significantemente melhor que as hidrofobinas sem parceiro defusão.

Se as proteínas não forem secretadas dentro do meio decultura, as células são então separadas e o produto é obtido do lisado pelosprocessos de isolamento de proteína conhecidos. Como desejado, as célulaspodem ser separadas por ultra-som de alta freqüência, por alta pressão, porexemplo uma célula de pressão French, por osmólise, por ação de detergentes,enzimas líticas ou solventes orgânicos, por homogenizadores ou pelacombinação da pluralidade dos processos listados.As proteínas podem ser purificadas por processos conhecidosde cromatografia, tal como cromatografia de peneira molecular (filtração degel) tal como cromatografia de Q Sefarose, cromatografia de troca iônica ecromatografia hidrofóbica, e também outros processos comuns, tais como:ultrafiltração, cristalização, salificação, diálise e eletroforese de gel natural.Processos apropriados são descritos, por exemplo, em Cooper, F. G.,Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Techniques], Verlag Walter deGruyter, Berlin, New York, ou em Scopes, R., Protein Purification, SpringerVerlag, New York, Heidelberg, Berlin.

Pode ser particularmente vantajoso para facilitar o isolamentoe a purificação das hidrofobinas de fusão prover as mesmas com grupos deâncora específicos que podem ligar a grupos elementares correspondentes emsuportes sólidos, especialmente polímeros apropriados. Tais suportes sólidospodem, por exemplo, ser usados como um recheio para colunas decromatografia, e a eficiência da separação pode geralmente ser aumentadasignificantemente desta maneira. Tais processos de preparação são tambémconhecidos como cromatografia por afinidade. Para a incorporação dosgrupos de âncora, é possível usar, na preparação das proteínas, sistemas devetor ou oligonucleotídeos que ampliam o cDNA por seqüência denucleotídeo particular e então codificam proteínas alteradas ou proteínas defusão. Para facilitar a purificação, proteínas modificadas incluem as chamados"etiquetas" que funcionam como âncoras, por exemplo, a modificaçãoconhecida como âncora de hexa-histidina. Hidrofobinas de fusão modificadascom âncoras de histidina podem ser purificadas cromatograficamente, porexemplo, utilizando níquel-Sefarose como o recheio da coluna. A hidrofobinade fusão pode subseqüentemente ser eluída de novo da coluna por meios deagentes apropriados para eluição, por exemplo, uma solução de imidazol.

Em um processo de purificação simplificado, é possíveldispensar a purificação cromatográfica. Para este fim, as células são primeiroremovidas do caldo de fermentação por meios de um método apropriado, porexemplo, por microfiltração ou por centrifugação. Subseqüentemente, ascélulas podem ser separadas por meio de métodos apropriados, por exemplopor meio dos métodos já mencionados acima, e os resíduos de células podemser separados dos corpos de inclusão. O último pode vantajosamente serefetuado por centrifugação. Finalmente, os corpos de inclusão podem serseparados em uma maneira já conhecida, a fim de liberar as hidrofobinas defusão. Isso pode ser feito, por exemplo, por meios de ácidos, bases, e/oudetergentes. Os corpos de inclusão com as hidrofobinas de fusão usadas deacordo com a invenção podem geralmente ser dissolvidos completamentemesmo utilizando 0,1 M de NaOH no período de aproximadamente 1 h. Apureza das hidrofobinas de fusão obtidas por esse processo simplificado égeralmente de 60 a 80% do peso com base na quantidade de todas asproteínas.

As soluções obtidas por esse processo de purificaçãosimplificado descrito podem ser usadas para realizar a invenção sem outrapurificação. Entretanto, as hidrofobinas de fusão podem também ser isoladascomo um sólido das soluções. Isso pode, por exemplo, ser feito de um modoconhecido em princípio por secagem por congelamento ou secagem porpulverização.

Em uma forma de realização preferida da invenção, oisolamento pode ser efetuado por meio de secagem por pulverização. Asecagem por pulverização pode ser realizada com a solução purificadacromatograficamente, mas também é possível preferivelmente usar assoluções obtidas após o processo de purificação simplificado por preparaçãodos corpos de inclusão.

Para realizar a secagem por pulverização, as soluções podemser neutralizadas se apropriado. Uma faixa de pH de 7 a 9 foi verificada comosendo particularmente vantajosa.Geralmente também é aconselhável concentrar as soluçõesiniciais ligeiramente. Um sólido de concentração utilizável na solução inicialfoi verificado como sendo de até 30% do peso. Um teor em sólidos de > 5%geralmente leva a um produto em pó de boa qualidade. Subseqüentemente, asolução pode ser secada por pulverização em um modo conhecido emprincípio. Instrumento apropriado de secagem por pulverização écomercialmente disponível. As condições ideais de secagem por pulverizaçãovariam com o tipo de unidade e produção desejada. Temperaturas de entradade 130 a 180°C e temperaturas de saída de 50 a 80°C foram verificadas comosendo favoráveis para soluções de hidrofobinas. Opcionalmente, é possívelutilizar auxiliares, por exemplo: açúcares, manitol, dextrano ou maltodextrina,para a secagem por pulverização.Uma quantidade utilizável foi verificadacomo sendo de 0 a 30% do peso, preferivelmente de 5 a 20% do peso, de taisauxiliares com base em hidrofobina.

As hidrofobinas preparadas como descrito podem serdiretamente as proteínas de fusão ou, após retirada e remoção do parceiro defusão, como hidrofobinas "puras".

Quando uma remoção do parceiro de fusão é planejada, éaconselhável incorporar um sítio de clivagem potencial (sítio dereconhecimento específico para proteases) dentro da proteína de fusão entre aporção de hidrofobina e porção de parceiro de fusão. Locais de clivagemapropriados são especialmente os das seqüências de peptídeo que de outraforma não ocorrem nem na porção de hidrofobina, nem na porção de parceirode fusão, que podem ser determinadas facilmente com ferramentas debioinformática. Exemplos particularmente apropriados são clivagem de BrCNem metionina, ou clivagem mediada por protease com clivagem de fator Xa,clivagem de enteroquinase, clivagem de trombina ou clivagem de TEV(protease do vírus de ataque ao tabaco).

Para o uso inventivo para lavagem de têxteis, as proteínas nãoenzimáticas ativas na interface pode ser usadas primeiramente como umcomponente de uma composição de lavagem e serem adicionadas desta formaao licor de lavagem. Entretanto, também é possível adicionar a proteína ativasna interface não enzimática para o licor de lavagem separadamente, usar umacomposição de lavagem que é livre de proteínas não enzimáticas ativas nainterface. A adição separada pode ser efetuada pela adição da proteína naforma sólida, como uma solução ou como uma formulação apropriada. Seránotado que dois métodos de adição podem também ser combinados.

A quantidade da proteína não enzimática ativas na interface nolicor de lavagem é determinada pelo versado na arte de acordo com o efeitodesejado. Uma quantidade útil foi geralmente verificada a partir de 0,05 a 50ppm, preferivelmente de 0,1 a 30 ppm, mais preferivelmente de 0,2 a 20 ppm,ainda mais preferivelmente de 0,5 a 10 ppm e, por exemplo, de 1 a 6 ppm.

As composições de lavagem da invenção incluem pelo menosuma substância ativa na lavagem e pelo menos uma proteína não enzimáticaativas na interface.

Pelo menos uma proteína não enzimática ativas na interface épreferivelmente uma proteína que causa a mudança no ângulo de contatomencionado no início, mais preferivelmente de pelo menos uma hidrofobina.Será apreciado que também é possível usar misturas de proteínas diferentes.

Se hidrofobinas são usadas, elas podem ser usadas como umahidrofobina "pura" ou então na forma das proteínas de fusão acimamencionadas. Exemplos úteis de realização da presente invenção foramencontrados como sendo de proteínas de fusão de tipo yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO: 20), tipo yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou tipo yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24). Um par foi verificado como sendo yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20) com parceiro de fusão completo de yaad ou entãocom um parceiro de fusão truncado, por exemplo yaad40-Xa-dewA-his (SEQID NO: 26).O termo "composição de lavagem para lavagem de têxteis" éauto explicatório e restritivo ao mesmo tempo. Composições de lavagem paralavagem de têxteis são usadas, por exemplo, na forma de pós, grânulos,pílulas, pastas, comprimido, géis ou líquidos, geralmente em solução aquosa(licor de lavagem). A sua ação consiste em uma interação relativamentecomplexa de processos químicos e organolépticos. Composições de lavagemincluem pelo menos uma substância ativa na lavagem, mas geralmente umapluralidade de diferentes substâncias ativas na lavagem que interagem parafornecer uma resultado de lavagem ideal. Significantes componentes ativos nalavagem das composições de lavagem são especialmente tensoativos, etambém reforçadores, co-reforçadores, sistemas alvejantes e enzimas dacomposição de lavagem. É adicionalmente possível usar aditivos típicos, porexemplo: fragrâncias, inibidores de corrosão, inibidores de transferência decorantes, inibidores de espuma ou abrilhantadores ópticos como componentesdas composições de lavagem.

Os tensoativos podem ser tensoativos aniônicos, nãoaniônicos, catiônicos ou anfotéricos.

Apropriados tensoativos não aniônicos são em particular:álcoois-C8-C22 alcoxilatos, tais como alcoxilatos de álcooisgraxos, alcoxilatos de oxo álcoois e etoxilatos álcoois de Guerbet: aalcoxilação pode ser efetuada com óxido de etileno, óxido de propileno e/ouóxido de butileno. Copolímeros em bloco ou copolímeros aleatórios podemestar presentes. Por Mol de álcool, eles tipicamente compreendem de 2 a 50mols, preferivelmente de 3 a 20 mols, de pelo menos um óxido de alquileno.Um óxido de alquileno preferido é óxido de etileno. Os álcooispreferivelmente tem de 10 a 18 átomos de carbono.

alcoxilatos de alquilfenol, em particular etoxilatos dealquilfenol, que incluem cadeias de C6-Ci4-alquila e de 5 a 30 mols de óxidode alquileno/mol.poliglucosídeos de alquila que incluem cadeias de C8-C22-,preferivelmente C10-C18-alquila geralmente de 1 a 20, preferivelmente de 1,1 a5, unidades de glucosídeos.

N-alquilglucamidas, alcoxilatos ácidos graxos de amida,alcoxilatos ácidos graxos de alcanolamida, e copolímeros em bloco de óxidode etileno, óxido de propileno e/ou óxido de butileno.

Apropriados tensoativos aniônicos são, por exemplo:

sulfatos de álcoois (graxos) possuindo de 8 a 22,preferivelmente de 10 a 18, átomos de carbono, em particular sulfatos deálcool C9 -C11, sulfatos de álcool C12 -C14, sulfatos de álcool C12-C18-, sulfatode laurila, sulfato de cetila, sulfato de miristila, sulfato de palmitila, sulfato deestearila e sulfato de álcoois graxos de sebo.

alcoxilatos de álcoois C8-C22- sulfatados (sulfatos de éterde alquila): compostos desse tipo são preparados, por exemplo, primeiroalcoxilando um álcool C8-C22-, preferivelmente um C1o-C18, por exemploálcool graxo, e então sulfatando o produto de alcoxilação. Para a alcoxilação,preferência é dada ao uso de óxido de etileno.

C8-C20-alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS),preferivelmente C9-C13-alquilbenzenossulfonatos lineares e C9-C13-alquiltoluenossulfonatos.

alcanossulfonatos, em particular C8-C24-, preferivelmenteC10-C18-alcanossulfonatos.

sais de ácido graxo, tais como sais de sódio e potássio deC8-C24-ácidos carboxílicos.

Os tensoativos aniônicos são adicionados à composição delavagem preferivelmente na forma de sais. Sais apropriados são, por exemplo,sais de metais alcalinos tais como sais de sódio, potássio e lítio, e sais deamônio tais como sais de hidroxietilamônio, di(hidroxietil)-amônio etri(hidroxietil) amônio.Apropriados tensoativos catiônicos incluem:C7-C25-alquilaminas;

sais de amônio de N,N-dimetil-N-(C2-C4-hidróxi alquil)(C7-C25-alquila);

compostos de mono- e di(C7-C25-alquil)dimetilamônioquaternizados com agentes de alquilação;

quaternários de éster, em particular de mono-, di- etrialcanolaminas quaternárias esterificadas, que foram esterificadas com C8-C22-ácidos carboxílicos;

quaternários de imidazolina, em particular sais de 1-alquilimidazolínio da fórmula II ou III

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em que as variáveis são definidas à seguir:

R3 e C1-C25-alquila ou C2-C25-alquenila;

R4 é C1-C4-alquila ou Mdroxi-C1-C4-alquila;

R5 é C1-C4-alquila, hidróxi-C1-C4-alquila ou um radical R1-(CO)-X-(CH2)m-

(X: -O- ou -NH-; m: 2 ou 3),

onde pelo menos um radical R é C7-C22-alquila.

Os tensoativos anfotéricos apropriados são, por exemplo,betaínas de alquila, betaínas de alquilamida, aminopropionatos,aminoglicinatos e compostos de imidazólio anfotéricos.

No processo de lavagem, reforçadores (também conhecidoscomo reforçadores inorgânicos heterogêneos, HIBs) servem para amaciar aágua. Eles suportam a ação de lavagem por sua alcalinidade e lixiviação dosíons cálcio e magnésio para fora da sujeira e pontes das fibras, e promovem adispersão da sujeira pigmentária no licor de lavagem.

Reforçadores inorgânicos apropriados são em particular:

alumossilicatos cristalinos e amorfos possuindopropriedades de troca iônica, em particular zeólitos: vários tipos de zeólitossão apropriados, especialmente os zeólitos A, Χ, Β, P, MAP e HS em suaforma de Na ou em forma em que Na foi parcialmente trocado por outroscátions, como Li, K, Ca, Mg ou amônio

silicatos cristalinos, especialmente dissilicatos e silicatosem folha, por exemplo δ- e P-Na2Si2O5. Os silicatos podem ser usados naforma dos seus metais alcalinos, metais alcalinos terrosos ou sais de amônio;preferência é dada aos silicatos de sódio, lítio e magnésio.

silicatos amorfos, tais metassilicato de sódio e dissilicatoamorfo.

carbonatos e hidrogenocarbonatos: esses podem ser usadosna forma de seus metais alcalinos, metais alcalinos terrosos ou sais deamônio. Preferência é dada aos carbonatos de sódio, lítio e magnésio ehidrogenocarbonatos, especialmente carbonato de sódio e/ouhidrogenocarbonato de sódio.

polifosfatos, tais como trifosfato de pentassódio.

Co-reforçadores trabalham sinergisticamente com osreforçadores, por exemplo por, como um tipo de armazenamento, absorvendoíons de cálcio ou magnésio mais rapidamente que os reforçadores e entãopassando-os aos reforçadores. Além disso, eles que podem impedir o seucrescimento por adsorção em sementes de cristal.

Os co-reforçadores orgânicos apropriados são em particular:ácidos carboxílicos de baixo peso molecular tais comoácido cítrico, ácido cítrico modificado hidrofobicamente, por exemplo, ácidoagárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido glucônico, ácido glutárico, ácidosuccínico, ácido imidodissuccínico, ácido oxidissuccínico, ácidopropanotricarboxílico, ácido butanotetracarboxílico, ácidocilopentanotetracarboxílico, ácidos alquil- e alquenilsuccínicos e ácidosaminopolicarboxílicos, por exemplo, ácido nitrilotriacético, ácidoβ-alaninadiacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido serinadiacético,isoácido serinadiacético, ácido N-(2-hidroxietil)iminoacético, ácidoetilenodiaminadissuccínico e ácido metil-e etilglicinadiacético.

ácidos carboxílicos oligoméricos e poliméricos tais comohomopolímeros de ácido acrílico e ácido aspártico, ácidos oligomaleicos,copolímeros de ácido maleico com ácido acrílico, ácido metacrílico ou C2-C22-olefinas, por exemplo, isobuteno ou α-olefinas de cadeia longa, viniléteres de C1-C8-alquila de vinila, acetato de vinila, proprionato de vinila,ésteres de (met) acrílico de C1-C8-álcoois e estireno. Preferência é dada aoshomopolímeros de ácido acrílico e copolímeros de ácido acrílico com ácidomaleico. Os ácidos carboxílicos oligoméricos e poliméricos são usados naforma ácida ou como um sal de sódio.

Alvejantes apropriados são, por exemplo, adutos do peróxidode hidrogênio para sais inorgânicos, tais como perborato de sódiomonoidratado, de perborato de sódio tetraidratado e carbonato de sódioperidratado, e perácidos carboxílicos tais como ácido ftalimidopercapróico.

Os ativadores alvejantes apropriados são, por exemplo,Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraacetiletilenodiamina (TAED), sódio p-nonanoiloxibenzenossulfonato e N-metilmorfolinioacetonitrila metilsulfato.

Enzimas usadas com preferência nas composições de lavagemsão proteases, lipases, amilases, celulases, oxidases e peroxidases.

Os inibidores de transferência de corante apropriados sãohomopolímeros, copolímeros e polímeros de enxerto de 1-vinilpirrolidona, 1-vinilimidazol, 4-vinilpiridina N-óxido, ou homo- e copolímeros de 4-vinilpiridina que foram reagidos com ácido cloroacético.

O tipo e a quantidade dos componentes usados sãodeterminados pelo versado na arte de acordo com o uso final desejado dacomposição de lavagem. Por exemplo, alvejantes são tipicamente usados emcomposições de lavagem de carga pesada, mas não em composições delavagem de carga leve. Maiores detalhes sobre a composição das composiçõesde lavagem e componentes das composições de lavagem podem serencontrados, por exemplo, em "Waschmittel" [Washing Compositions] emRõmpp Chemie-Lexikon, Edição Online, Versão 2,6, Georg-Thieme-Verlag,Stuttgart, New York, February 2005, ou em "Detergents" em Ullmann'sEncyclopedia of Industrial Chemistry, 6a. ed., 2000, Electronic Release,Wiley-VCH-Verlag, Weinheim, 2000.

Tensoativos preferidos para realizar a presente invenção sãotensoativos aniônicos e/ou tensoativos não aniônicos.

As proteínas não enzimáticas ativas na interface usadas deacordo com a invenção, especialmente hidrofobinas, podem ser usadasparticularmente vantajosamente com uma combinação dealquilbenzenossulfonatos lineares ou sulfatos de álcoois graxos com sulfatosde éter de alquila ou alcoxilatos de alquila.

É particularmente vantajosamente possível usar tensoativosaniônicos e/ou não aniônicos baseados em C8-Ci8-álcoois e/ou seus produtosde alcoxilação, opcionalmente em uma mistura com outros tensoativos. Osradicais alcóxi são preferencialmente aqueles que incluem essencialmenteunidades de óxido de etileno e/ou unidades de óxido de propileno,preferivelmente unidades de óxido de etileno. Eles podem, por exemplo, serradicais de 1 a 25 unidades de óxido de etileno, preferivelmente de 3 a 20 emais preferivelmente de 5 a 15 unidades, ou radicais incluindo unidades deóxido de etileno e óxido de propileno, caso em que este último deverácompreender, em cada caso, pelo menos, 50 mols %, preferivelmente 60mols%, de unidades óxido de etileno, com base no número total de todos asunidade de alcóxi.Exemplos de tensoativos preferidos incluem C8-C18-álcooisalcoxilados, tais como alcoxilatos de álcoois graxos, alcoxilatos de oxoálcoois, alcoxilatos de álcoois de Guerbet, sulfatos de C8-C18-álcoois,alcoxilatos de C8-C18-álcoois sulfatados (sulfatos de éter de alquila) ou Cg-Cig-alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS), preferivelmente C9-C13-alquilbenzenossulfonatos lineares e C9-C13-alquiltoluenossulfonatos lineares.

Particular preferência é dada aos produtos de alcoxilação de 2-propilheptanol e tridecanol e sulfatos dos mesmos.

A quantidade de proteínas não enzimáticas ativas na interfacena composição de lavagem é julgada por um indivíduo versado na arte deacordo com as propriedades desejadas da composição de lavagem. Nestecontexto, a quantidade é vantajosamente selecionada tal que, no caso dedosagem da composição de lavagem de acordo com as instruções, asconcentrações acima especificadas das proteínas ativas na interface nãoenzimáticas sejam obtidas.

Uma quantidade utilizável foi verificada como sendo de 0,002a 2,5% em peso das proteínas não enzimáticas ativas na interface baseadasobre a quantidade total de todos os componentes da composição de lavagem.A quantidade é preferivelmente de 0,01 a 1,5% em peso, mais preferivelmentede 0,025 a 1,0% em peso, ainda mais preferivelmente de 0,05 a 0,5% em pesoe, por exemplo, de 0,1 a 0,3% em peso.

Em uma forma de realização preferida, as composições delavagem do inventivo compreendem

de 0,01 a 1,5% em peso de proteínas não enzimáticas ativas nainterface,

de 0,5 a 40% em peso dos tensoativos, preferivelmentetensoativos aniônicos e/ou não aniônicos,

de 59 a 99,45% em peso de outros aditivos ativos na lavagemou auxiliares de formulação.Os componentes (c) usados podem preferivelmente ser lipasese/ou polímeros anfifílicos, por exemplo, copolímeros de bloco óxido deetileno-óxido de propileno.

As composições de lavagem da invenção podem serproduzidas por métodos conhecidos à princípio pelos versados na arte.Detalhes dos processos de produção para composições de lavagem são dados,por exemplo, nas referências citadas acima: "Rõmpp Chemie-Lexikon" ou"Ullmann's".

As proteínas não enzimáticas ativas na interface podem serusadas para produzir a composição de lavagem como uma solução ou comoum sólido. Proteínas sólidas podem ser obtidas a partir das soluções dasproteínas por meio de métodos conhecidos dos versados na arte, por exemplo,secagem por pulverização ou secagem por congelamento.

Na produção da composição de lavagem, deve ser asseguradoque o estresse térmico sobre as proteínas não enzimáticas ativas na interfacenão seja tão alto. O limite é naturalmente guiado pelo tipo de proteína. Nocaso do uso de hidrofobinas, foi verificado como sendo útil não exceder umatemperatura de produto de 120°C. A temperatura de processo, em geral, porexemplo, a temperatura da corrente de gás em um secador por pulverização,pode, evidentemente, ser mais elevada desde que a temperatura não ultrapasseo limite crítico.

Técnicas para uma incorporação suave dos componentesdentro das composições de lavagem são conhecidas dos versados na arte.Composições de lavagem pulverulentas podem ser produzidas, por exemplo,por, em uma primeira etapa, produzindo um produto bruto a partir desuspensões aquosas de componentes estáveis termicamente da composição delavagem por meio de secagem por pulverização, e misturando esse produtobruto em uma segunda etapa com componentes susceptíveis termicamente sobcondições suaves. E geralmente aconselhável introduzir as proteínas nãoenzimáticas ativas na interface usadas de acordo com a invenção nestasegunda etapa, sem qualquer intenção que a invenção seja restrita a isso.

O processo de acordo com a invenção para lavagem demateriais têxteis compreende pelo menos as etapas de:

encher um aparelho de lavagem com os materiais têxteis aserem lavados e um licor de lavagem aquoso,

aplicar energia mecânica à mistura dos materiais têxteis e licorde lavagem,

remover o licor de lavagem aquoso e opcionalmente enxaguaros materiais têxteis, e secar os materiais têxteis.

O aparelho de lavagem usado pode ser qualquer tipo demáquina de lavar. Entretanto, o termo deve também incluir recipientes quesão tipicamente usados na lavagem à mão, por exemplo, tinas de lavagem oubacias de lavagem. Na etapa (a), o aparelho de lavar primeiramente enchidocom os tecidos e um licor de lavagem aquoso, sendo a seqüência irrelevante.

O licor de lavagem inclui, em um modo conhecido emprincípio, pelo menos um substância ativa na lavagem. De acordo com ainvenção, o licor aquoso de lavagem ainda inclui pelo menos uma proteínanão enzimática ativa na interface. Proteínas preferidas já foram mencionadas.A adição das proteínas não enzimáticas ativas na interface pode ser realizadavia a composição de lavagem, ou então isso pode ser efetuado separadamente.E preferivelmente efetuado no início do ciclo de lavagem, mas pode,naturalmente, ser realizado mais tarde.

A operação de lavagem na etapa do processo (b) é promovidaem um modo conhecido pela ação da energia mecânica sobre a mistura dosmateriais têxteis e licor de lavagem. Energia mecânica pode ser introduzidapor máquinas de lavar, por exemplo, por meio de tambores de rotação, ou, nocaso de lavagem à mão, pelas mãos e/ou outros auxiliares.

A temperatura no decurso da operação de lavagem éselecionada pelo versado na arte de acordo com as circunstâncias. Porexemplo, a temperatura pode ser 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100°C. As vantagens particulares da invençãosão manifestadas muito particularmente no caso de lavagem em temperaturasmoderadas ou baixas. Em uma forma de realização preferida da invenção, aoperação de lavagem é realizada a uma temperatura de no máximo 60°C,especialmente a não muito maior que 50°C. Uma faixa de temperaturasparticularmente vantajosa para realizar os processos de lavagem de acordocom a invenção é de 5 a 45°C, muito particularmente preferivelmente de 15 a35°C e, por exemplo, de 20 a 30°C.

A concentração das proteínas não enzimáticas ativas nainterface no decurso da operação de lavagem é selecionada pelo versado naarte. Faixas de concentração preferidas já foram mencionadas acima.

Se a adição for efetuada via composições de lavagem dainvenção, elas são usadas tipicamente em uma quantidade de 0,05 a 25 g/l,preferivelmente de 0,25 a 15 g/l, mais preferivelmente de 0,5 a 10 g/l, aindamais preferivelmente de 1 a 6 g/l e, por exemplo, de 1,5 a 4 g/l, com base emcada caso no licor de lavagem.

Após a operação de lavagem real, o licor de lavagem éremovido em um modo conhecido em princípio. Em geral, os materiais têxteissão subseqüentemente enxaguados por uma ou mais operações de enxágüe efinalmente secados (etapas do processo (d) e (e)). No decurso do enxágüe,amaciantes podem ser usados como um aditivo.

O processo de acordo com a invenção é apropriado paralavagem de todos os tipos de materiais têxteis. Estes podem ser fibras têxteis,tecidos acabados ou semiacabados e vestuários acabados produzidos a partirdos mesmos. Estes podem ser têxteis comuns para vestuário, ou então têxteisdomésticos, por exemplo: tapetes, cortinas, toalhas de mesa e estruturastêxteis que servem para fins técnicos. Estes também incluem estruturas nãoconformadas, por exemplo lãs obtidas de tosquias, estruturas lineares taiscomo barbante, linhas de coser, fios, linhas, cordas, cordões, tecidos demalha, cordame, e também estruturas tridimensionais, por exemplo feltros,tecidos, não tecidos e estofos. Materiais têxteis podem consistir de material deorigem natural, por exemplo algodão, lã ou fibra de linho, ou de materiaissintéticos tais como poliacrilonitrila, poliamida ou poliéster. Será estimadoque eles podem também ser tecidos mistos, por exemplo algodão/poliéster oualgodão/poliamida.

Os exemplos a seguir são destinados a ajudar a ilustrar ainvenção:

Parte A:

Preparação e teste das hidrofobinas usadas de acordo com a invenção

Exemplo 1

Preparações para a clonagem de yaad-His6 / yaaE-His6

Uma reação da cadeia de polimerase foi efetuada com auxíliodos oligonucleotídeos Hal570 e Hal571 (Hal 572/ Hal 573). O DNA gabaritousado foi DNA genômico da bactéria Bacillus subtilis. O fragmento de PCRresultante compreendia a seqüência de codificação de gene de Bacillussubtilis yaaD / yaaE, e um sítio de clivagem de restrição NcoI e BglIIrespectivamente em cada extremidade. O fragmento PCR foi purificado ecortado com as endonucleases de restrição NcoI e BglII. Esse fragmento deDNA foi usado como um inserto e clonado dentro do vetor pQE60 de Qiagen,que foram linearizados anteriormente com as endonucleases de restrição NcoIe BglII. Os vetores pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 assim formados podemser usados para expressar proteínas consistindo de YAAD::HIS6 ouYAAE: IHIS6.

Hal5 70: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

Exemplo 2

Clonagem de yaad hidrofobina DewA-His6

Um reação da cadeia de polimerase foi efetuada com auxílio de oligonucleotídeos KaM 416 e KaM 417. O DNA gabarito usado foi o DNAgenômico do mofo Aspergillus nidulans. O fragmento PCR resultantecompreendia a seqüência de codificação da hidrofobina gene dewA e um sítiode clivagem de proteinase fator Xa N-terminal. O fragmento PCR foipurificado e cortado com a endonuclease de restrição BamHL Esse fragmento de DNA foi usado como um inserto e clonado dentro do vetorpQE60YAAD#2 que foi linearizado anteriormente com a endonuclease derestrição Bg1II.

O vetor #508 assim formado pode ser usado para expressaruma proteína de fusão consistindo de YAAD::Xa::dewA::HIS6. KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

Exemplo 3

Clonagem de yaad hidrofobina RodA-His6

O plasmídeo #513 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 utilizando os oligonucleotídeos KaM 434 e KaM 435.KaM434:

GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Exemplo 4

Clonagem de yaad hidrofobina HypA-His6Clonagem de HypA em pQE60 (#522)

Os oligonucleotídeos KaM449/KaM450 foram utilizados pararealizar um PCR. O DNA gabarito usado foi o plasmídeo HypA in pCR2.1,produzido por Nadicom. O fragmento resultante compreendia a seqüência decodificação do gene hidrofobina HypA sem códon de partida e parada. Ofragmento de PCR foi purificados por meio de eletroforese de gel e cortadocom as endonucleases de restrição NcoI e BamHL Esse fragmento foi usadocomo inserto e ligado no vetor pQE60 que tinha sido cortado anteriormentecom NcoI e BglII.

KaM449: GTTACCCCATGGCGATCTCTCGCGTCCTTGTCGCTKaM450: GCCTGAGGATCCGAGGTTGACATTGACAGGAGAGC

<formula>formula see original document page 36</formula>

Clonagem de HypA em pQE60+YAAD (#523)

Os oligonucleotídeos KaM451/KaM452 foram usados pararealizar um PCR. O DNA gabarito usado foi o plasmídeo HypA em pCR2,l,produzido por Nadicom. O fragmento resultante compreendia a seqüência decodificação de Gene hidrofobina HypA sem códon de partida e parada. Ofragmento de PCR foi purificado por meio de eletroforese de gel e cortadocom endonucleases de restrição BglII e BamHL Esse fragmento foi utilizadocomo inserto e ligado no vetor pQE60+YAAD que tinha sido cortadoanteriormente com BglII.

KaM451: CGTAGTAGATCTATGATCTCTCGCGTCCTTGTCGCTGCKaM452: CGACTAGGATCCGAGGTTGACATTGACAGGAGAGC<formula>formula see original document page 37</formula>

Exemplo 5

Clonagem de yaad hidrofobina HypA-His6

Clonagem de HypB em pQE60 (#524)

Os oligonucleotídeos KaM453/KaM454 foram usados pararealizar um PCR. O DNA gabarito usado foi o plasmídeo HypB em puC19,produzido por Nadicom. O fragmento resultante compreendia a seqüência decodificação de gene hidrofobina HypB sem códon de partida e parada. Ofragmento de PCR foi purificado por meio de eletroforese em gel e cortadocom endonucleases de restrição NcoI e BamHL Esse fragmento foi usadocomo inserto e ligado dentro do vetor pQE60 que tinha sido cortadoanteriormente com NcoI e Bg1II.

KaM453: GCTTATCCATGGCGGTCAGCACGTTCATCACTGTCGKaM454: GCTATAGGATCCCACATTGGCATTAATGGGAGTGC<figure> figure see original document page 38 </figure>

Legenda Elemento de operador pT5/lac

Clonagem de HypB em pQE60+YAAD (#525)

Os oligonucleotídeos KaM455/KaM456 foram usados pararealizar um PCR. O DNA gabarito usado foi o plasmídeo HypB em puC19,produzido por Nadicom. O fragmento resultante compreendia a seqüência decodificação de gene hidrofobina HypB sem códon de partida e parada. Ofragmento de PCR foi purificado por meio de eletroforese de gel e cortadocom as endonucleases de restrição BglII e BamHL Esse fragmento foi usadocomo inserto e ligado dentro do vetor pQE60+YAAD que tinha sido cortadoanteriormente com BglII.

<figure> figure see original document page 38 </figure>

YAAD (114-1002)

6x His-tag

_Bíjm(ggS>

hypB (1006-1359)Exemplo 6

Clonagem de yaad hidrofobina BASFl-His6

O plasmídeo #507 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 utilizando os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

O DNA gabarito usado foi uma seqüência de DNA sintético -hidrofobina BASFl (ver apêndice).

KaM417.CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Exemplo 7

Clonagem de yaad hidrofobina BASF2-His6

O plasmídeo #506 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 utilizando os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

O DNA gabarito usado foi uma seqüência de DNA sintético -hidrofobina BASF2 (ver apêndice).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGG ATCC ATTGAAGGCCGC ATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Exemplo 8

Clonagem de yaad hidrofobina SC3-His6

O plasmídeo #526 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 utilizando os oligonucleotídeos KaM464 e KaM465.

O DNA gabarito usado foi cDNA de Schyzophyllumcommune (ver apêndice).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Exemplo 9

Fermentação da cepa recombinante de E. coli yaad hidrofobina DewA-His6Inoculação de 3 ml de meio líquido de LB com uma cepa de E.coli expressando yaad hidrofobina DewA-His6 em 15 ml de tubos de Greiner.Incubação por 8 h a 37°C em um agitador a 200 rpm. Em cada caso, doisfrascos de Erlenmeyer de 1 1 com anteparos e 250 ml de meio LB (+ 100μg/ml de ampicilina) são inoculados com 1 ml em cada caso de culturapreliminar e incubados por 9 h a 37°C em um agitador a 180 rpm.

Inocular 13,5 1 de meio LB (+ 100 μg/ml de ampicilina) com0,5 1 de cultura preliminar (OD600nm 1:10, medido contra H2O) em umfermentador de 20 1. Em um OD6Onm de ~ 3,5, adicionar 140 ml de 100 mMIPTG. Após 3 h, fermentar à frio a 10°C e centrifugar o caldo de fermentação.Utilizar a pelota de célula para outra purificação.Exemplo 10

Purificação de proteína de fusão de hidrofobina recombinante

(Purificação de proteínas de fusão de hidrofobina que têm uma etiqueta His6C-terminal)

100 g de pelotas de células (100 - 500 mg de hidrofobina) sãolevadas até o volume total de 200 ml com 50 mM tampão de fosfato de sódio,pH 7,5, e recolocadas em suspensão. A suspensão é tratada com umUltraturrax tipo T25 (Janke e Kunkel; IKA-Labortechnik) por 10 minutos esubseqüentemente incubada com 500 unidades de Benzonase (Merck,Darmstadt; Pedido no. 1,01697,0001) em temperatura ambiente durante 1hora para degradar os ácidos nucleicos. Antes da ruptura da célula, filtração éefetuada com um cartucho de vidro (PI). Para a ruptura da célula e para acisão do DNA genômico restante, dois ciclos no homogenizador foramrealizados a 1500 bars (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Ohomogenado é centrifugado (Sorvall RC-5B, rotor GSA, recipiente decentrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12 000 rpm, 23 000 g), o sobrenadantefoi colocado no gelo e a pelota foi recolocada em suspensão em 100 ml detampão de fosfato de sódio, pH 7,5. Centrifugação e recolocação emsuspensão são repetidas três vezes, o tampão de fosfato de sódiocompreendendo 1% SDS na terceira repetição. Após a recolocação emsuspensão, a mistura é agitada por uma hora e uma centrifugação final éefetuada (Sorvall RC-5B, Rotor GSA5 recipiente de centrífuga de 250 ml, 60minutos, 4°C, 12 000 rpm, 23 000 g). De acordo com a análise SDS-PAGE, ahidrofobina está presente no sobrenadante após a centrifugação (figura 1). Osexperimentos mostram que as hidrofobinas estão provavelmente presentes naforma de corpos de inclusão nas células de E. coli correspondentes. 50 ml dahidrofobina incluindo sobrenadante são aplicados a 50 ml de uma coluna dedesempenho elevado 17-5268-02 de Sefarose - níquel (Amersham) que foiequilibrada com 50 mM de tampão de Tris-Cl pH 8,0. A coluna é lavada com50 mM de tampão de Tris-Cl pH 8,0 e a hidrofobina é subseqüente eluídacom 50 mM de tampão de Tris-Cl pH 8,0 que inclui 200 mM de imidazol.Para remover o imidazol, a solução é dialisada contra 50 mM de tampão deTris-Cl pH 8,0.

Figura 1 mostra a purificação da hidrofobina preparada:

Trilha 1: Aplicação para a coluna de Sefarose - níquel (diluição de 1:10)

Trilha 2: Fluxo transpassante = eluado da etapa de lavagem

Trilhas 3 - 5: Máximos de OD 280 das frações de eluição

A hidrofobina da figura 1 tem um peso molecular deaproximadamente 53 kD. Algumas das bandas menores representam produtosde degradação da hidrofobina.

Exemplo 11

Teste de desempenho; caracterização da hidrofobina por mudança no ângulode contato de uma gotícula de água no vidro

Substrato:

Vidro (vidro de janela, Süddeutsche Glas, Mannheim)

A hidrofobina de fusão do Exemplo 10 foi usada.

Concentração de hidrofobina: 100 μg/ml em solução aquosa;aditivo: 50 mM de acetato de sódio pH 4 + 0,1% de monolaurato depolioxietileno sorbitano de (20)(Tween® 20).

- Incubação de placas de vidro durante a noite (temperatura80°C), em seguida lavar o revestimento em água destilada,

então incubação 10 min / 80°C / 1% solução dedodecilsulfato de sódio (SDS) em água destilada,

lavagem em água destiladaAs amostras foram secadas sob ar e o ângulo de contato (emgraus) da gotícula de 5 μΐ de água é determinada em temperatura ambiente.

O ângulo de contato foi medido em um sistema de ângulo decontato Dataphysics OCA 15+, Software SCA 20,2,0. (Novembro 2002). Asmedidas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

Vidro não tratado forneceu um ângulo de contato de 30 ± 5o;um revestimento com uma hidrofobina funcional de acordo com o Exemplo 8(yaad-dewA-his6) deu ângulos de contato de 75 ± 5o.Parte B:

Uso de proteínas não enzimáticas ativas na interface para lavagem de têxteisDescrição de teste geral:

Para testar a ação, testes de lavagem foram realizados em umaparelho de teste disponível comercialmente (Launder-o-meter, de Atlas,USA). Testes foram realizados em cada caso com ou sem adição das proteínaspara a substância de lavagem.

Para os testes, tecido de teste comercialmente disponível etecido de teste produzido na empresa foram usados.

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>

Desempenho dos testes de lavagem:

Pedaços de 30 χ 30 mm foram, cada, cortados dos tecidos deteste mencionados e costurados em algodão alvejado não tingido de malha.

No caso de um tecido de teste comercial, em cada caso 2 tiras (50 mm χ 200 mm) foram lavadas sob as condições dadas com 5 g de tecidomisto de algodão/poliéster branco com em cada caso 4 (para tecidos 1-4) ouem cada caso 2 (no caso de tecidos 5 e 6) tecidos de teste costuradosdiferentes.

No caso do tecido do teste auto-produzido, 2 manchas em cada caso de 0,1 g de gordura ou óleo tingidos foram gotejadas na faixa de algodão(50 mm χ 200 mm de algodão alvejado não tingido de malha) e tratadas a50°C durante 30 min. Vermelho sudan foi usado para o tingimento.

Após lavagem,o tecido foi enxaguado em 250 ml de água debica durante 5 min e então secado.

A ação de lavagem foi avaliada por medidas de refletância a420 nm antes e depois da lavagem.

Um teste em cada caso foi realizado com a adição de proteínasnão enzimáticas ativas na interface e, sob condições comparativas, um testesem tal aditivo mas por outro lado sob condições exatamente idênticas foirealizado.As porcentagens listadas nas tabelas de resultados reportam oaumento na ação de lavagem no teste com adição de proteína comparado aoteste sem adição de proteína, calculada de acordo com a seguinte fórmula:Aumento na ação de lavagem [%] = (lE-IoE)/(Ibranco-lA)*100

le aqui em cada caso significa a refletância do tecido de testeapós a lavagem de teste, Ia a refletância antes de realizar a lavagem de teste. 0indica o teste comparativo a adição de proteínas da invenção. Ibranco indica arefletância do tecido limpo sem manchas.

A reposição de sujeira foi conseqüentemente avaliada porcomparação da refletância do tecido branco limpo sem manchas antes dalavagem e depois da lavagem, em cada caso para o teste com e sem adição dasproteínas.Exemplo 12:

<table>table see original document page 44</column></row><table>

A proteína foi adicionada como uma solução aquosa diluída. Alavagem de teste foi realizada e avaliada de acordo com a descrição geraldada acima. Os resultados estão resumidos na Tabela 1.

Exemplo 13:

Parâmetros de teste:

<table>table see original document page 45</column></row><table>

A lavagem de teste foi realizada e avaliada de acordo com adescrição geral dada acima. Os resultados estão resumidos na tabela 1:

Tabela 1: Resultados do teste de lavagem

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Em todos os teste, um aumento significante na ação delavagem foi alcançado.

Exemplo 14:

Para o teste de lavagem a seguir, uma formulação de modelopara uma composição de lavagem composta de um tensoativo aniônico, umtensoativo não aniônico e um reforçador foi usada em cada caso.

Parâmetros de teste:

Proteína usada

Concentração da proteína:

Tensoativo aniônicoCo-tensoativo não aniônico

Reforçador

Quantidade de licor de lavagemRelação de licorDureza da águaTemperatura de lavagemTempo de lavagem

Proteína de fusão de hidrofobina yaad40-Xa-dew A-his(SEQ ID NO: 26)Ver tabela 2

400 ppm de Ci2/i4~sulfato de álcool graxo de sódioem cada caso 30 ppm de um etoxilato de oxo álcoolC13/15, Ver tabela 2 para tipo de radical alcoxilato250 ppm de carbonato de sódio

250 ml por lata20:1

2,5 mmol/1 (relação molar Ca: Mg = 3:1)25°C

30 minutos

O lavagem de teste foi realizado e avaliado de acordo com adescrição geral fornecida acima. Os resultados estão resumidos na Tabela 2.Tabela 2: Resultados da lavagem de teste

<table>table see original document page 46</column></row><table>

EO = óxido de etileno, PO = óxido de propileno

Exemplo 15:

Para o seguinte teste de lavagem, uma formulação de modelopara uma composição de lavagem composta de um tensoativo aniônico, umtensoativo não aniônico e um reforçador foi usada em cada caso.Parâmetros de teste:<table>table see original document page 47</column></row><table>

A lavagem de teste foi realizada e avaliada de acordo com adescrição geral dada acima. Os resultados estão resumidos na Tabela 3.

Tabela 3: Resultados de lavagem de teste

<table>table see original document page 47</column></row><table>

EO = óxido de etileno, PO = óxido de propileno

Em todos os testes, um aumento da ação de lavagem foialcançado em cada caso. A hidrofobina de fusão com um parceiro de fusãotruncado de yaad (B) (40 aminoácidos) alcançou os melhores resultados emcada caso que a hidrofobina de fusão (A) com um parceiro de fusão de yaadcompleto (294 aminoácidos).

Designação de nomes de seqüência para seqüências de DNA epolipeptídeos na Listagem de Seqüência<table>table see original document page 48</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Aktiengesellschaft

<120> Uso de proteínas enzimáticas inativas na interface para a lavagemde têxteis

<130> PF 56973

<150> DE 10 2005 036 586.8

<151> 01/08/2005

<160> 26

<170> PatentIn versão 3.1

<210> SEQ ID NO:1

<211> 405

<212> DNA

<213> Aspergillus nidulans

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(405)

<223>

<400> 1

atg cgc ttc ate gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48

Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gea aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96Thr Ala Leu Pro 20 Ala Ser Ala Ala Lys 25 Asn Ala Lys Leu Ala 30 Thr Ser gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144Ala Ala Phe 35 Ala Lys Gln Ala Glu 40 Gly Thr Thr Cys Asn 45 Val Gly Ser ate gct tgc tgc aac tcc CCC gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192Ile Ala 50 Cys Cys Asn Ser Pro 55 Ala Glu Thr Asn Asn 60 Asp Ser Leu Leu age ggt ctg ctc ggt gct ggc Ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80 ggc age gcc tgc gcc aag gcg age ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288Gly Ser Ala Cys Ala 85 Lys Ala Ser Leu Ile 90 Asp Gln Leu Gly Leu 95 Leu gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc CCC gtc tgc aag aac ate gtc 336Ala Leu Val Asp 100 His Thr Glu Glu Gly 105 Pro Val Cys Lys Asn 110 Ile Val gct tgc tgc CCt gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384Ala Cys Cys 115 Pro Glu Gly Thr Thr 120 Asn Cys Val Ala Val 125 Asp Asn Ala

ggc gct ggt acc aag gct gag 405

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu

130 135

<210> SEQ ID NO:2

<211> 135

<212> PRT

<213> Aspergillus nidulans

<400> 2

Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala1 5 10 15

Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30 Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45 Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr65 70

Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala85

Ala Leu Val Asp His Thr Glu100

Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr115

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu130 135

<210> SEQ ID NO:3<211> 471<212> DNA

<213> Aspergillus nidulans

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(471)

<223>

<400> 3

atg aag ttc tcc att gct gccMet Lys Phe Ser Ile Ala Ala1 5

gcg gcc ctc cct cct gcc catAla Ala Leu Pro Pro Ala His20

ggc aac aag ggc aac age aacGly Asn Lys Gly Asn Ser Asn35

acc gtc aag cag gcc tcc gacThr Val Lys Gln Ala Ser Asp

Ser

Glu

Thr120

75 80

Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu

90 95

Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val105 110

Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala125

50

55

tgc tgc aac aag gcc acg tacCys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr

65

70

ggt ctt ctg tet ggt gcc ctcGly Leu Leu Ser Gly Ala Leu85

gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttcAla Glu Gly Leu Gly Leu Phe100

gtc ctc att ggc ate caa gatVal Leu Ile Gly Ile Gln Asp115

att gcc tgc tgc cag aac tccIle Ala Cys Cys Gln Asn Ser

130

135

ggt gtc ggt ctc cct tgc gttGly Val Gly Leu Pro Cys Val145 150

<210> SEQ ID NO:4<211> 157<212> PRT

<213> Aspergillus nidulans<400> 4

Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala1 5

Ala Ala Leu Pro Pro Ala His20

Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn35

Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp

50 55

Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr65 70

gctAla

gatAsp

gtc

Val

40

aag

Lys

gccAla

ageSer

gatAsp

cttLeu120CCC

Pro

gccAla

gtc gttVal Val10tcc cagSer Gln25

aag ttcLys Phe

tgc ggtCys Gly

ggt gacGly Asp

ggc ctcGly Leu

90cag tgcGln Cys105

gtc aacVal Asn

gct ttcAla Phe

ttc gctPhe Ala

cct gtcPro Val

gac cagAsp Gln60

acc acaThr Thr75

ate ggcIle Gly

tcc aagSer Lys

cag aagGln Lys

gcc gcc tcc gtcAla Ala Ser Val15

ggc aat ggt gttGly Asn Gly Val30

ccc gaa aac gtgPro Glu Asn Val45

gcc cag ctc tetAla Gln Leu Ser

tcc age gcg gatSer Ser Ala Asp140

ctt ggc tcc ateLeu Gly Ser Ile155

acc gttThr Val

gcc gggAla Gly

ctt gatLeu Asp110tgc aagCys Lys125

ggc aacGly Asn

ctcLeu

gat gagAsp Glu80tet ggtSer Gly95

gtt gctVal Ala

caa aacGln Asn

ctt attLeu Ile

Ala

Asp

Val

40

Lys

Ala

Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val

10 15

Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val25 30

Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val45

Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser60

Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu75 80

48

96

144

192

240

288

336

384

432

471Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly

85 90 95

Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala

100 105 110

Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn

115 120 125

Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile

130 135 140

Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu145 150 155

<210> SEQ ID NO:5<211> 336<212> DNA

<213> Agaricus bisporus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<223>

<400> 5

atg ate tet cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt 48

Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu1 5 10 15

gtt act gea act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc age agt cag tgc 96

Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys

20 25 30

gac gtc ggt gaa ate cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144

Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His

35 40 45

acc age gcc gcc gcg tet ggt ttg ctt ggt gtt ccc ate aac ctt ggt 192

Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly

50 55 60

gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt 240

Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly65 70 75 80

ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc 288

Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe

85 90 95

acc gea ttg att aac gct ctt gac tgc tet cct gtc aat gtc aac ctc 336

Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu

100 105 110

<210> SEQ ID N0:6<211> 112<212> PRT

<213> Agaricus bisporus<400> 6

Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu1 5 10 15

Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys

20 25 30

Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His

35 40 45

Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly

50 55 60

Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly65 70 75 80

Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe

85 90 95

Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu

100 105 110

<210> SEQ ID NO:7<211> 357<212> DNA

<213> Agaricus bisporus<220>

<221> CDS

<222> (1)..(357)

<223>

<400> 7

atg gtc age acg ttc ate act gtc gea aag acc Ctt CtC gtc gcg CtCMet Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu1 5 10 15 CtC ttc gtc aat ate aat ate gtc gtt ggt act gea act acc ggc aagLeu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys 20 25 30 cat tgt age acc ggt cct ate gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tetHis Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser 35 40 45 aag age CCt cag gct acg gag Ctt Ctt acg aag aat ggc Ctt ggc ctgLys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu 50 55 60 ggt gtc Ctt gct ggc gtg aag ggt Ctt gtt ggc gcg aat tgc age CCtGly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro65 70 75 80ate acg gea att ggt att ggc tcc ggc age caa tgc tet ggc cag accIle Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr 85 90 95 gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgcVal Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys 100 105 110 act CCC att aat gcc aat gtg Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val 115 <210> SEQ ID NO: 8 <211> 119 <212> PRT <213> Agaricus bisporus <400> 8 Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu1 5 10 15 Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys 20 25 30 His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser 35 40 45 Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu 50 55 60 Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro65 70 75 80Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr 85 90 95 Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys 100 105 110 Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val 115 <210> SEQ ID NO: 9 <211> 408 <212> DNA <213> Schizophyllum communae <220> <221> CDS <222> (1)..ι [408) <223> <400> 9 atg ttc gcc cgt CtC CCC gtc gtg ttc CtC tac gcc ttc gtc gcg ttcMet Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe1 5 10 15 ggc gee CtC gtc gct gcc CtC cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acgGly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr

20 25 30

ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc tcg acg acg 144

Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr

35 40 45

acc ate gcc gcc ggt ggc acg tgt act acg ggg tcg ctc tet tgc tgc 192

Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys

50 55 60

aac cag gtt caa tcg gcg age age age cct gtt acc gcc ctc ctc ggc 240

Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly65 70 75 80

ctg ctc ggc att gtc ctc age gac ctc aac gtt ctc gtt ggc ate age 288

Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser

85 90 95

tgc tet ccc ctc act gtc ate ggt gtc gga ggc age ggc tgt tcg gcg 336

Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala

100 105 110

cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg ate aac ate 384

Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile

115 120 125

ggt tgc acc ccc ate aac ate ctc 408

Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu

130 135

<210> SEQ ID NO:10<211> 136<212> PRT

<213> Schizophyllum communae<4 00> 10

Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe1 5 10 15

Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr

20 25 30

Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr

35 40 45

Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys

50 55 60

Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly65 70 75 80

Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser

85 90 95

Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala

100 105 110

Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile

115 120 125

Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu

130 135

<210> SEQ ID NO:11<211> 483<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(483)

<223> Seqüência artificial

de hidrofobina com padrão cisteina característico<4 00> 11

atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val15 10 15

gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val

20 25 30

ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144Gly Asn Lys Phe Pro Val35

gac aag tgc ggc gac cagAsp Lys Cys Gly Asp Gln50

tac gcc ggc gac gtc ctcTyr Ala Gly Asp Val Leu65 70

ctc ctc aag aac ctc ateLeu Leu Lys Asn Leu Ile85

ctc ttc gac cag tgc gtcLeu Phe Asp Gln Cys Val100

ate cct ate cag gac ctcIle Pro Ile Gln Asp Leu115

aac ate gcc tgc tgc cagAsn Ile Ala Cys Cys Gln130

gtc aac ctc ggc ctc ggcVal Asn Leu Gly Leu Gly145 150

atgMet

Pro Asp Asp Val Thr Val40

gcc cag ctc tcc tgc tgcAla Gln Leu Ser Cys Cys55 60

acc gac ate gac gag ggcThr Asp Ile Asp Glu Gly75

ggc ggc ggc tcc ggc tccGly Gly Gly Ser Gly Ser90

aag ctc gac ctc cag ateLys Leu Asp Leu Gln Ile105

ctc aac cag gtc aac aagLeu Asn Gln Val Asn Lys120

aac tcc cct tcc gac gccAsn Ser Pro Ser Asp Ala135 140

aac cct tgc ate cct gtcAsn Pro Cys Ile Pro Val155

Lys Gln Ala Thr45

aac aag gcc acc 192

Asn Lys Ala Thr

ate ctc gcc ggc 240

Ile Leu Ala Gly80

gag ggc ctc ggc 288

Glu Gly Leu Gly95

tcc gtc ate ggc 336

Ser Val Ile Gly110

cag tgc aag cag 384

Gln Cys Lys Gln

125

acc ggc tcc ctc 432

Thr Gly Ser Leu

tcc ctc ctc cat 480

Ser Leu Leu His160

483

<210> SEQ ID NO:12<211> 161<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência artificial

de hidrofobina com padrão cisteina característico<400> 12

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val1 5 10 15 Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30 Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr 35 40 45 Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 60 Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly65 70 75 80Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly 85 90 95 Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly 100 105 110 Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln 115 120 125 Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu 130 135 140 Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His145 150 155 160

Met

<210> SEQ ID NO:13<211> 465<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(465)<223> Seqüência artificialde hidrofobina com padrão cisteina característico

<400> 13atg aag ttcMet Lys Phe1

gcc gcc ctcAla Ala Leu

ggcGly

gacAsp

tac

Tyr

65

ctc

Leu

aac aagAsn Lys

35aag tgcLys Cys50

gcc ggcAla Gly

aag aacLys Asn

tccSer

cctPro20ttcPhe

ggcGly

gacAsp

ctcLeu

gtc tcc gcc gccVal Ser Ala Ala5

cag cac gac tccGln His Asp Ser

ttc gac cag tgcPhe Asp Gln Cys100

cct ate cag gacPro Ile Gln Asp115

tgc cag aac tccCys Gln Asn Ser130

aac cct tgc ateAsn Pro Cys Ile145

<210> SEQ ID NO:<211> 155<212> PRT<213> Seqüência<220>

<223> Seqüênciade hidrofobina

cct gtc cct gacPro Val Pro Asp40

gac cag gcc cagAsp Gln Ala Gln55

gtc acc gac ateVal Thr Asp Ile70

ate ggc ggc ggcIle Gly Gly Gly85

gtc aag ctc gacVal Lys Leu Asp

ctc ctcLeu Leu

cct tccPro Ser

cct gtcPro Val150

14

aacAsn

gacAsp135tccSer

cagGln120gccAla

ctcLeu

gtcVal

gcc

Ala

25

gac

Asp

ctcLeu

gacAsp

tccSer

ctcLeu105cagGln

accThr

ctcLeu

ctc gccLeu Ala10

gcc ggcAla Gly

gtc accVal Thr

tcc tgcSer Cys

gag ggcGlu Gly

75ggc tccGly Ser90

cag ateGln Ile

tgc aagCys Lys

ggc tccGly Ser

cat atgHis Met155

ttc gcc gcc tcc gtcPhe Ala Ala Ser Val15

aac ggc aac ggc gtcAsn Gly Asn Gly Val30

gtc aag cag gcc accVal Lys Gln Ala Thr45

tgc aac aag gcc accCys Asn Lys Ala Thr60ateIle

ctc gcc ggcLeu Ala Gly

gagGlu

tccSer

cagGln

ctcLeu140

ggc ctcGly Leu

gtc ateVal Ile110aac ateAsn Ile125

gtc aacVal Asn

ggc

Gly

95

ggc

Gly

gccAla

ctcLeu

ctcLeu80ctcLeu

ateIle

tgcCys

ggcGly

artificial

artificial

com padrão cisteina

48

96

144

192

240

288

336

384

432

465

característico

<4 00> 14

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val1 5 10 15 Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30 Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr 35 40 45 Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 60 Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu65 70 75 80Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu 85 90 95 Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile 100 105 110 Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 115 120 125 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 130 135 140 Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met

145

150

155

\<210> SEQ ID NO:15<211> 882<212> DNA

<213> Bacillus subtilis<220><221> CDS<222> (1)..(882)<223><4 00> 15

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met15 10 15

caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 30

ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val

35 40 45

cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro

50 55 60

aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tet ate ccg gta atg gca 240

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala65 70 75 80

aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met

85 90 95

ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu

100 105 110

gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly

115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tet 4 32

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser

130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 - 155 160

gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala

165 170 175

atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro

180 185 190

tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val

195 200 205

aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met

210 215 220

atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tet ggt att ttt aaa 720

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240

tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr

245 250 255

cac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly

260 265 270

act gca atg aaa ggg att gaa ate tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg275 280 285atg caa gaa cgc ggc tgg 882

Met Gln Glu Arg Gly Trp290

<210> SEQ ID NO:16<211> 294<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<400> 16

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met1 5 10 15

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala65 70 75 80Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys- Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp

290

<210> SEQ ID NO:17<211> 591<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(591)

<223>

<400> 17

atg gga tta aca ata ggt gta cta gga ctt caa gga gca gtt aga gag 48

Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu1 5 10 15

cac ate cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct. ggt ctt gtc gta aaa 96

His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys

20 25 30

cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt 144

Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly35 40 45

gag age acg acg atg cgc cgt ttg ate gat acg tat caa ttc atg gag 192

Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu

50 55 60

ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt 240

Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys65 70 75 80

gcc gga tta att ata tta gea aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288

Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro

85 90 95

cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336

His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg

100 105 110

cag gtt gac age ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384

Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu

115 120 125

cct ttt act ggg gta ttc ate cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt 432

Pro Phe ThrGly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly

130 135 140

gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt cgt att gta gcc gcg 480

Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala145 150 155 160

aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tca ttc cat ccg gag ctg aca gaa 528

Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu

165 170 175

gat cac cga gtg acg cag ctg ttt gtt gaa atg gtt gag gaa tat aag 576

Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys

180 185 190

caa aag gea ctt gta 591

Gln Lys Ala Leu Val195

<210> SEQ ID NO:18<211> 197<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<4 00> 18

Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu1 5 .10 15

His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys

20 25 30

Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly

35 40 45

Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu

50 55 60

Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys65 70 75 80

Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro

85 90 95

His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg

100 105 110

Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu

115 120 125

Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly

130 135 140

Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala145 150 155 160

Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu

165 170 175

Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys

180 185 190

Gln Lys Ala Leu Val195

<210> SEQ ID NO:19<211> 1329<212> DNA<213> Seqüência<220> CDS<221> CDS<222> (1)..(132<223> proteína<400> 19atg gct caa acaMet Ala Gln Thr1

caa aaa ggc ggcGln Lys Gly Gly20

ate gct gaa gaaIle Ala Glu Glu

artificial

9)

de fusão

ggt act gaaGly Thr Glu5

gtc ate atgVal Ile Met

gct gga gctAla Gly Ala

35

cca gea gat attPro Ala Asp Ile50

aca ate gtg gaaThr Ile Val Glu65

aaa gcg cgt ateLys Ala Arg Ile

ggt gttGly Val

gaa tttGlu Phe

tgcCys

atgMet145gttVal

atgMet

tacTyr

aacAsn

atgMet225tcaSer

cgtArg130cttLeu

cgcArg

agtSer

gagGlu

tttPhe210cagGln

gacAsp

catHis115gatAsp

tatTyr100ttaLeu

cttLeu

cgcArg

gaaGlu

gga

Gly

85

att

Ile

gcg gctAla Ala

55gta atgVal Met70

cat attHis Ile

gat gaaAsp Glu

cgtArg

gacAsp

gtc

Val

40

gga

Gly

gtaVal

gtc

Val

25

gct

Ala

aaaLys10ateIle

gtaVal

gga gttGly Val

aat gea gtaAsn Ala Val

aat aaa aatAsn Lys Asn

cgc acaArg Thr

cat atgHis Met

gagGlu

cttLeu195gccAla

gatAsp180cttLeu

gctAla

ggtGly

aaaLys

cgtArg165gagGlu

gaaGlu

ggtGly150aaaLys

geaAla135gagGlu

gttVal

gttVal

agtSer

gaaGlu120acaThr

gaaGlu

gaaGlu105tacTyr

gcg

Ala

90

gtt

Val

acaThr

cgc gga atgArg Gly Met

aat gcg gaaAsn Ala Glu

atg gcg ctaMet Ala Leu45

gcc cgt atgAla Arg Met60

tet ate ccgSer Ile Pro75

cgt gtg cttArg Val Leu

ctg acg ccgLeu Thr Pro

cgc cgtArg Arg

cct gga acaPro Gly Thr

cta atgLeu Met

ctt caa attLeu Gln Ile

ggc ggcGly Gly

ctt ggtLeu Gly

gac aac cctAsp Asn Pro

cac ttt act gatHis Phe Thr Asp260

act gea atg aaaThr Ala Met Lys275

atg caa gaa cgc

gctAla

gctAla245tacTyr

gacAsp230aaaLys

aaaLys

gtaVal215ggaGly

tttPhe

ttaLeu

aacAsn

acaThr

aaaLys200geaAla

gctAla

gaaGlu185aaaLys

caaGln170gcgAla

gacAsp

gtt cctVal Pro

att gcgIle Ala140ggt aatGly Asn155

gtg cgcVal Arg

tttPhe125gaaGlu

attIle

aaaLys

gea gaa atgAla Glu Met15

caa gcg aaaGln Ala Lys30

gaa cgt gtgGlu Arg Val

gct gac cctAla Asp Pro

gta atg geaVal Met Ala80

gaa gct atgGlu Ala Met95

gct gac gaaAla Asp Glu110

gtc tgt ggcVal Cys Gly

ggt gct tetGly Ala Ser

aaa aac ctaLys Asn Leu

act ccaThr Pro

gta ttt gttVal Phe Val

ggg att gaaGly Ile Glu

ggc tgg aga

gcg aaaAla Lys

ate gctIle Ala265ate tcaIle Ser280

tcc att

geaAla250gagGlu

aacAsn

gaa

ggc aagGly Lys

gct gatAla Asp220ggt tetGly Ser235

att gtgIle Val

cttLeu205gctAla

ggtGly

gaaGlu

gtt gagVal Glu

gta gttVal Val175ggt gctGly Ala190

cct gtcPro Val

gctAla160gcgAla

cctPro

gttVal

gct ctc atgAla Leu Met

ttg tca aaaLeu Ser Lys

tta ctt ccaLeu Leu Pro285

ggc cgc atg

attIle

geaAla

gagGlu270gaaGlu

tttPhe

acaThr255cttLeu

aaaLys240actThr

ggtGly

cag cgtGln Arg

cgc ttc ate

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816

864

912Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser

290 295

gtc tct ctc ctc gcc ttc act gccVal Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala305 310

gcc tct gcc gca aag aac gcg aagAla Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys325

aag cag gct gaa ggc acc acc tgcLys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys340

aac tcc ccc gct gag acc aac aacAsn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn355 360

ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctcGly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu

370 375

gcc aag gcg age ttg att gac cagAla Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln385 390

cac act gag gaa ggc ccc gtc tgcHis Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys405

gag gga acc acc aac tgt gtt gccGlu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala420

aag gct gag gga tct cat cac catLys Ala Glu Gly Ser His His His435 440

<210> SEQ ID NO:20<211> 443<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> proteína de fusão<400> 20

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg1 5

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp20

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val

35 40

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly

50 55

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn65 70

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val85

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser100

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu115 120

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr

130 135

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro145 150

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn165

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr180

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys195 200

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala

Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile300

gcgAla

ctgLeu

aatAsn345gacAsp

tcgSer

ctgLeu

aagLys

gtcVal425cacHis

gccAla

gccAla330gtcVal

agtSer

ggcGly

ggtGly

aacAsn410gacAsp

catHis

acc gcg acc gccThr Ala Thr Ala315

acc tcg gcg gccThr Ser Ala Ala

ggc tcgGly Ser

ctg ttgLeu Leu

aacAsn

ctgLeu395ateIle

actThr380ctcLeu

gtcVal

ate gctIle Ala350age ggtSer Gly365

ggc ageGly Ser

gct ctcAla Leu

gct tgcAla Cys

aac gct ggc gctAsn Ala Gly Ala430

cacHis

ctc ccgLeu Pro320ttc gccPhe Ala335

tgc tgcCys Cys

ctg ctcLeu Leu

gcc tgcAla Cys

gtc gacVal Asp400tgc cctCys Pro415

ggt accGly Thr

Val Lys10

Val Ile25

Ala Val

Gly Val

Ala Val

Glu Ala90

Glu Val105

Tyr Thr

Arg Arg

Gly Thr

Ala Gln170Glu Ala185

Lys Asp

Arg Gly Met AlaAsn AlaMet Ala

Ala Arg60

Ser Ile75

Arg Val

Leu Thr

Val Pro

Ile Ala140Gly Asn155

Val Arg

Glu Gln

30Leu Glu45

Met Ala

Lys AsnGly LysThr Pro Ala Asp

Pro Val

Leu Glu

Pro Ala110Phe Val125

Glu Gly

Ile Val

Lys Val

Leu Gly190Leu Pro205

Ala Ala

Glu

15

Ala

Arg

Asp

Met

Ala

95

Asp

Cys

Ala

Glu

Val175Ala

Val

Leu

Met

Lys

Val

Pro

Ala80Met

Glu

Gly

Ser

Ala160Ala

Pro

Val

Met

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1329

\210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr

245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly

260 265 270

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg

275 280 285

Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile

290 295 300

Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro305 310 315 320

Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala

325 330 335

Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys

340 345 350

Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu

355 360 365

Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys

370 375 380

Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp385 390 395 400

His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro

405 410 415

Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr

420 425 430

Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His

435 440

<210> SEQ ID NO:21<211> 1395<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(1395)

<223> proteína de fusão

<400> 21

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met15 10 15

caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 30

ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val

35 40 45

cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro

50 55 60

aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tet ate ccg gta atg gca 240

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala65 70 75 80

aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met

85 90 95

ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu

100 105 110

gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly

115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tet 432

\Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser

130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160

gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala

165 170 175

atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro

180 185 190

tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val

195 200 205

aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met

210 215 220

atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240

tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr

245 250 255

cac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly

260 265 270

act gca atg aaa ggg att gaa ate tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg

275 280 285

atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912

Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser

290 295 300

att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc gcg gcc ctc cct 960

Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro305 310 315 320

cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt ggc aac aag ggc 1008

Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly

325 330 335

aac age aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc aag cag 1056

Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln

340 345 350

gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc aac aag 1104

Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys

355 360 365

gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt ctg tct 1152

Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser

370 375 380

ggt gcc ctc age ggc ctc ate ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa ggt ctt 1200

Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu385 390 395 400

ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc att ggc 1248

Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly

405 410 415

ate caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc 1296

Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys

420 425 430

cag aac tcc ccc tcc age gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt ctc 1344

Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu

435 440 445

cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc ate ctc gga tct cat cac cat cac cat 1392

Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His

450 455 460

cac 1395His465

<210> SEQ ID NO:22

<211> 465

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> proteína de fusão

<400> 22

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met1 5 10 15

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys20 25 30

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val35 40 45

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro50 55 60

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala65 70 75 80

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met85 90 95

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu100 105 110

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly115 120 125

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser130 135 140

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala165 170 175

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro180 185 190

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val195 200 205

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly260 265 270

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg275 280 285

Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser290 295 300

Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro305 310 315 320

Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly325 330 335

Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln340 345 350

Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys355 360 365

Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser370 375 380

Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu385 390 395 400

Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly405 410 415

Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu

435 440 445

Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His450 455 460

His465

<210> SEQ ID NO:23<211> 1407<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(1407)

<223> proteína de fusão

<400> 23

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gea. gaa atg 4 8

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met1 5 10 15

caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 30

ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val

35 40 45

cca gea gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro

50 55 60

aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gea gta tet ate ccg gta atg gea 240

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala65 70 75 80

aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met

85 90 95

ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu

100 105 110

gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac àca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly

115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gea aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tet 4 32

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser

130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160

gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala

165 170 175

atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro

180 185 190

tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val

195 200 205

aac ttt gcc gct ggc ggc gta gea act cca gct gat gct gct ctc atg 672

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met

210 215 220

atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tet ggt att ttt aaa 720

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240

tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gea att gtg gaa gea aca act 768

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr245 250 255cac ttt act gat tac aaa tta ateHis Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile260

act gea atg aaa ggg att gaa ateThr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile275 280

atg caa gaa cgc ggc tgg aga tetMet Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser

290 295

gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttcVal Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe305 310

cag cac gac tcc gcc gcc ggc aacGln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn325

cct gtc cct gac gac gtc acc gtcPro Val Pro Asp Asp Val Thr Val340

gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgcAsp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys355 360

gtc ctc acc gac ate gac gag ggcVal Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly

370 375

ctc ate ggc ggc ggc tcc ggc tccLeu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser385 390

tgc gtc aag ctc gac ctc cag ateCys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile405

gac ctc ctc aac cag gtc aac aagAsp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys420

tgc cag aac tcc cct tcc gac gccCys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala435 440

ctc ggc aac cct tgc ate cct gtcLeu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val

450 455

cac cat cac cat cacHis His His His His465

<210> SEQ ID NO:24<211> 469<212> PRT

<213> seqüência artificial<220>

<223> proteína de fusão<400> 24

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys15 10

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile

20 25

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val

35 40

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val

50 55

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val65 70

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala

85 90

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val100 105

gct gag ttg tcaAla Glu Leu Ser265

tca aac tta cttSer Asn Leu Leu

att gaaIle Glu

gcc gccAla Ala

ggc aacGly Asn330

aag cag gcc accLys Gln Ala Thr345

aac aag gcc accAsn Lys Ala Thr

ggc cgcGly Arg300tcc gtcSer Val315

ggc gtcGly Val

aaaLys

ccaPro285atgMet

gagGlu270gaaGlu

aagLys

ateIle

gagGlu

tccSer

cagGln425accThr

ctc gccLeu Ala

ggc ctcGly Leu395gtc ateVal Ile410

tgc aagCys Lys

ggcGly380ggcGly

ggcGly

cagGln

gcc gccAla Ala

ggc aacGly Asn

gac aagAsp Lys350tac gccTyr Ala365

ctc ctcLeu Leu

ctt ggtLeu Gly

cag cgtGln Arg

ttc tccPhe Ser

ctc cctLeu Pro320aag ttcLys Phe335

tgc ggcCys Gly

ggc gacGly Asp

aag aacLys Asn

ctc ttc gacLeu Phe Asp

ggc tcc ctcGly Ser Leu

tcc ctc ctc catSer Leu Leu His460

ateIle

aacAsn

gtcVal445atgMet

cctPro

ateIle430aacAsn

ateIle415gccAla

ctcLeu

gga tetGly Ser

cagGln400cagGln

tgcCys

ggcGly

catHis

Arg Gly Met AlaAsn AlaMet Ala

Ala Arg60

Ser Ile75

Arg ValLeu Thr

Glu Gln

30Leu Glu45

Met Ala

Pro Val

Leu Glu

Pro Ala110

Glu Met15

Ala Lys

Arg Val

Asp Pro

Met Ala80Ala Met95

Asp Glu

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

1392

1407Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro305 310 315 320Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335 Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly 340 345 350 Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365 Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380 Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln385 390 395 400Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln 405 410 415 Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 420 425 430 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445 Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460 His His His His His

465

<210> SEQ ID NO:25<211> 561<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220> CDS

<221> CDS

<222> (1)..(561)

<223> proteína de fusão

<400> 25

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met1 5 10 15

caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 30

ate gct gaa gaa gct gga gct gtc att gaa ggc cgc atg cgc ttc ate 144

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile35 40 45gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg acc gcc ctc ccg 192Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro50 55 60gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg gcg gcc ttc gcc 240Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala65 70 75 80aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg ate gct tgc tgc 288Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys85 90 95aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg age ggt ctg ctc 336Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu100 105 110ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act ggc age gcc tgc 384Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys115 120 125gcc aag gcg age ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc gct ctc gtc gac 432Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp130 135 140cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc gct tgc tgc cct 480His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro145 150 155 160gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct ggc gct ggt acc 528Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr165 170 175aag gct gag gga tct cat cac cat cac cat cac 561Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His180 185

<210> SEQ ID NO:26<211> 187<212> PRT<213> seqüência artificial<220><223> proteína de fusão<400> 26

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met1 5 10 15

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys20 25 30

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile35 40 45

Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro50 55 60

Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala65 70 75 80

Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys85 90 95

Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu100 105 110

Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys115 120 125

Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp130 135 140

His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro145 150 155 160

Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr165 170 175

Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His180 185

Claims (26)

1. Uso de proteínas não enzimáticas ativas na interface,caracterizado pelo fato de ser para a lavagem de têxteis.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as proteínas são caracterizadas pela propriedade de ocasionar umaumento no ângulo de contato de uma gotícula de água de pelo menos 20°após a aplicação a uma superfície de vidro em temperatura ambiente,comparado com o ângulo de contato de uma gotícula d'água igualmentegrande com a superfície de vidro não revestida.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a proteína é uma hidrofobina.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a proteína é uma hidrofobina de fusão, o parceiro de fusãocompreendendo de 20 a 500 aminoácidos.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a hidrofobina é pelo menos uma selecionada dentre o grupo deyaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ouyaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), com a condição que yaad pode, em cadacaso, também ser um parceiro de fusão de yaad trancado tendo de 20 a 293 aminoácidos.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a proteína é usada em uma concentração de0,05 a 50 ppm no licor de lavagem.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as proteínas são usadas na combinação comtensoativos aniônicos e/ou não iônicos, que compreendem uma combinaçãode alquilbenzenossufonatos lineares ou sulfatos de álcool graxo com étersulfatos de alquila ou alcoxilatos de alquila.

8. Composição de lavagem para a lavagem de têxteis,compreendendo pelo menos uma substância ativa na lavagem, caracterizadapelo fato de que a composição de lavagem ainda compreende pelo menos umaproteína não enzimática ativa na interface.

9. Composição de lavagem de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que as proteínas são caracterizadas pela propriedadede ocasionar um aumento no ângulo de contato de uma gotícula de água depelo menos 20° após a aplicação a uma superfície de vidro em temperaturaambiente, comparado com o ângulo de contato de uma gotícula d'águaigualmente grande com a superfície de vidro não revestida.

10. Composição de lavagem de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a proteína é uma hidrofobina.

11. Composição de lavagem de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que a proteína é uma hidrofobina de fusão, oparceiro de fusão compreendendo de 20 a 500 aminoácidos.

12. Composição de lavagem de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que a hidrofobina é pelo menos uma selecionadadentre o grupo de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), com a condiçãoque yaad pode, em cada caso, também ser um parceiro de fusão de yaadtruncado tendo de 20 a 293 aminoácidos.

13. Composição de lavagem de acordo com qualquer uma dasreivindicações 8 a 12, caracterizada pelo fato de que a quantidade dasproteínas não enzimáticas ativas na interface é de 0,002 a 2,5 % em peso combase em todos os componentes da composição de lavagem.

14. Composição de lavagem de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de compreender(a) de 0,01 a 1,5 % em peso de proteínas não enzimáticasativas na interface,(b) de 0,5 a 40 % em peso de tensoativo, e(c) de 59 a 99,45 % em peso de outros aditivos ativos nalavagem ou auxiliares de formulação.

15. Composição de lavagem de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de que os tensoativos são tensoativos aniônicos e/ounão iônicos.

16. Composição de lavagem de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que os tensoativos são uma combinação dealquilbenzenossufonatos lineares ou sulfatos de álcool graxocom éter sulfatos de alquila ou alcoxilatos de alquila.

17. Processo para lavar materiais têxteis compreendendo pelomenos as seguintes etapas:(a) encher um aparelho de lavagem com os materiais têxteis aserem lavados e um licor de lavagem aquoso,(b) aplicar energia mecânica à mistura de materiais têxteis elicor de lavagem,(c) remover o licor de lavagem aquoso e opcionalmenteenxaguar os materiais têxteis, e(d) secar os materiais têxteis,caracterizado pelo fato de que o licor de lavagem aquosocompreende pelo menos uma proteína não enzimática ativa na interface.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que as proteínas são caracterizadas pela propriedade de ocasionarum aumento no ângulo de contato de uma gotícula de água de pelo menos 20°após a aplicação a uma superfície de vidro em temperatura ambiente,comparado com o ângulo de contato de uma gotícula d'água igualmentegrande com a superfície de vidro não revestida.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a proteína é uma hidrofobina.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a proteína é uma hidrofobina de fusão, o parceiro de fusãocompreendendo de 20 a 500 aminoácidos.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a hidrofobina é pelo menos uma selecionada dentre o grupode yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22)ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), com a condição que yaad pode, emcada caso, também ser um parceiro de fusão de yaad truncado tendo de 20 a-293 aminoácidos.

22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-17 a 21, caracterizado pelo fato de que as proteínas são usadas na combinaçãocom tensoativos aniônicos e/ou não iônicos, que compreendem umacombinação de alquilbenzenossufonatos lineares ou sulfatos de álcool graxocom éter sulfatos de alquila ou alcoxilatos de alquila.

23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-17 a 22, caracterizado pelo fato de que a operação de lavagem é realizada auma temperatura de não mais que 60°C.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-17a 22, caracterizado pelo fato de que a operação de lavagem é realizada auma temperatura de 5 a 45°C.

25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-17 a 22, caracterizado pelo fato de que a operação de lavagem é realizada auma temperatura de 15 a 3 50°C.

26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-17 a 15, caracterizado pelo fato de que a proteína é usada em umaconcentração de 0,05 a 50 ppm no licor de lavagem.