WO2008142111A1 - Verwendung von hydrophobinen als hilfsmittel bei der kristallisation von feststoffen - Google Patents

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WO2008142111A1
WO2008142111A1 PCT/EP2008/056263 EP2008056263W WO2008142111A1 WO 2008142111 A1 WO2008142111 A1 WO 2008142111A1 EP 2008056263 W EP2008056263 W EP 2008056263W WO 2008142111 A1 WO2008142111 A1 WO 2008142111A1
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hydrophobins
hydrophobin
aqueous phase
fusion
crystallization
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Ulf Baus
Thorsten Montag
Stefan Becker
Stephan Nied
Claus Bollschweiler
Thomas Subkowski
Marvin Karos
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Basf Se
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Definitions

  • hydrophobins as an aid in the crystallization of solids
  • the present invention relates to the use of hydrophobins as aids in the crystallization of solids, in particular the use for the production of gypsum from aqueous phase.
  • the properties of finely divided solids are largely determined by the size and habit of the crystallites that make up the solid. Size and habit significantly influence the rheological properties of solid suspensions, the separability of the solids from aqueous suspensions, for example by filtration, the handling of the dried products and the properties of the solids themselves. By way of example, attention is drawn to the color intensity or the dispersibility of color pigments, which are significantly dependent on Size and habit of each crystallite dependent.
  • Hydrophobins are small proteins of about 100 to 150 amino acids, which occur in filamentous fungi, for example Schizophyllum commune. They usually have 8 cysteine units. Hydrophobins can be isolated from natural sources, but can also be obtained by genetic engineering, as disclosed, for example, by WO 2006/082251 or WO 2006/131564.
  • hydrophobins for various applications has been proposed in the prior art.
  • WO 96/41882 proposes the use of hydrophobins as emulsifiers, thickeners, surface-active substances, for hydrophilicizing hydrophobic surfaces, for improving the water resistance of hydrophilic substrates, for producing oil-in-water emulsions or for water-in-oil emulsions.
  • pharmaceutical applications such as the production of ointments or creams as well as cosmetic applications such as skin protection or the production of hair shampoos or hair rinses are proposed.
  • EP 1 252 516 discloses the coating of various substrates with a solution containing hydrophobins at a temperature of from 30 to 80 ° C.
  • hydrophobins as a crystallization aid is not yet known.
  • the object of the invention was to make novel aids for influencing the crystallization available.
  • hydrophobins Accordingly, the use of hydrophobins has been found to assist in the crystallization of solids.
  • a process for producing solids by crystallization from aqueous phase and separation of the solid formed from the aqueous phase has been found, wherein the aqueous phase at least one soluble in the aqueous phase assistant in an amount of 0.001 to 1 % By weight, based on the total amount of aqueous phase, of which at least one of the auxiliaries is a hydrophobin.
  • a process for the production of gypsum is a process for the production of gypsum. This is particularly preferably a process step of a process for flue gas desulfurization.
  • hydrophobins are to be understood below to mean polypeptides of the general structural formula (I)
  • the radicals X may be the same or different.
  • the indices standing at X each represent the number of amino acids in the respective subsequence X
  • C stands for cysteine, alanine, serine, glycine, methionine or threonine, at least four of the radicals named C being cysteine
  • the indices n and m independently represent natural numbers between 0 and 500, preferably between 15 and 300.
  • the polypetides according to the formula (I) are further characterized by the property that at room temperature after coating a glass surface, they increase the contact angle of a water droplet of at least 20 °, preferably at least 25 ° and particularly preferably 30 °, in each case compared with the contact angle an equally large drop of water with the uncoated glass surface.
  • the amino acids designated C to C 8 are preferably cysteines; but they can also be replaced by other amino acids of similar space filling, preferably by alanine, serine, threonine, methionine or glycine. However, at least four, preferably at least 5, particularly preferably at least 6 and in particular at least 7 of the positions C to C 8 should consist of cysteines. Cysteines can either be reduced in the proteins according to the invention or can form disulfide bridges with one another. Particularly preferred is the intramolecular formation of CC bridges, in particular those having at least one, preferably 2, more preferably 3 and most preferably 4 intramolecular disulfide bridges. In the exchange of cysteines described above by amino acids of similar space filling, it is advantageous to exchange in pairs those C positions which are capable of forming intramolecular disulfide bridges with one another.
  • cysteines, serines, alanines, glycines, methionines or threonines are also used in the positions indicated by X, the numbering of the individual C positions in the general formulas may change accordingly.
  • the proteins continue through the characterized above contact angle change, and it continues with at least at least 6 of the residues named C are cysteine. Most preferably, all of the C radicals are cysteine.
  • the proteins are further characterized by the abovementioned contact angle change, and at least 6 of the C named residues are cysteine. Most preferably, all of the C radicals are cysteine.
  • radicals X n and X m may be peptide sequences, growing naturally linked to a hydrophobin. However, one or both of the residues may be peptide sequences that are not naturally linked to a hydrophobin. Including such radicals X N and / or X m are to be understood, in which a naturally occurring in a hydrophobin peptide sequence is extended by a non-naturally occurring in a hydrophobin peptide sequence.
  • X n and / or X m are naturally non-hydrophobin-linked peptide sequences, such sequences are generally at least 20, preferably at least 35 amino acids long. They may, for example, be sequences from 20 to 500, preferably 30 to 400 and particularly preferably 35 to 100 amino acids.
  • Such a residue, which is not naturally linked to a hydrophobin will also be referred to below as a fusion partner.
  • the proteins may consist of at least one hydrophobin part and one fusion partner part which in nature do not coexist in this form. Fusion-hydrophobins from fusion partner and hydrophobin part have been disclosed for example in WO 2006/082251, WO 2006/082253 and WO 2006/131564.
  • the fusion partner portion can be selected from a variety of proteins. Only a single fusion partner can be linked to the hydrophobin moiety, or several fusion partners can also be linked to a hydrophobin moiety, for example at the amino terminus (X n ) and at the carboxy terminus (X m ) of the hydrophobic moiety. However, it is also possible, for example, to link two fusion partners with a position (X n or X m ) of the protein according to the invention.
  • fusion partners are proteins that occur naturally in microorganisms, in particular in E. coli or Bacillus subtilis.
  • Fusion partners are the sequences yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251), yaae (SEQ ID NO: 18 in WO 2006/082251) and thioredoxin.
  • fragments or derivatives of said sequences which comprise only a part, for example 70 to 99%, preferably 5 to 50%, and particularly preferably 10 to 40% of the said sequences, or in which individual amino acids, or Nucleotides are changed from the said sequence, wherein the percentages in each case refers to the number of amino acids.
  • the fusion hydrophobin in addition to said fusion partner as one of the groups X n or X m or as a terminal component of such a group on a so-called affinity domain (affinity tag / affinity tail) on.
  • affinity domains include (His) k, (Arg) k, (Asp) k, (Phe) k or (Cys) k groups, where k is generally a natural number from 1 to 10. It may preferably be a (His) k group, where k is 4 to 6.
  • the group X n and / or m X may consist exclusively of such an affinity domain or a naturally or non-naturally to a hydrophobin comparable knüpfter radical X n and X m is extended by a terminal affinity domain.
  • proteins used according to the invention as hydrophobins or derivatives thereof may also be modified in their polypeptide sequence, for example by glycosylation, acetylation or else by chemical crosslinking, for example with glutaric dialdehyde.
  • a characteristic of the hydrophobins or their derivatives used according to the invention is the change of surface properties when the surfaces are coated with the proteins.
  • the change in the surface properties can be experimentally determined, for example, by measuring the contact angle of a water drop before and after coating the surface with the protein and determining the difference between the two measurements.
  • contact angle measurements is known in principle to the person skilled in the art.
  • the measurements refer to room temperature and water drops of 5 ⁇ l and the use of glass slides as substrate.
  • the exact experimental conditions for an exemplary method for measuring the contact angle are shown in the experimental part.
  • the fusion proteins used according to the invention have the property of increasing the contact angle by at least 20 °, preferably at least 25 °, particularly preferably at least 30 ° in each case compared to the contact angle of a water droplet of the same size with the uncoated glass surface.
  • hydrophobins for practicing the present invention are the dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2 hydrophobins. These hydrophobins including their sequences are disclosed, for example, in WO 2006/82251. Unless stated otherwise, the sequences given below refer to sequences disclosed in WO 2006/82251. An overview table with the SEQ-I D numbers can be found in WO 2006/82251 on page 20.
  • fusion proteins yaad-Xa-dewA-his SEQ ID NO: 20
  • yaad-Xa-rodA-his SEQ ID NO: 22
  • yaad-Xa-basfl-his SEQ ID NO: 24
  • proteins which, starting from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO. 20, 22 or 24 shown by exchange, insertion or deletion of at least one, up to 10, preferably 5, more preferably 5% of all amino acids, and still have at least 50% of the biological property of the starting proteins particularly preferred embodiments.
  • the biological property of the proteins is hereby understood as the change in the contact angle already described by at least 20 °.
  • Particularly suitable derivatives for carrying out the present invention are from yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) derivatives derived from truncation of the yaad fusion partner.
  • yaad-Xa-dewA-his SEQ ID NO: 20
  • yaad-Xa-rodA-his SEQ ID NO: 22
  • yaad-Xa-basf1-his SEQ ID NO: 24
  • the truncated residue should comprise at least 20, preferably at least 35, amino acids.
  • a truncated radical having 20 to 293, preferably 25 to 250, particularly preferably 35 to 150 and for example 35 to 100 amino acids can be used.
  • An example of such a protein is yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 26 in PCT / EP2006 / 064720), which has a 40 amino acid truncated yaad residue.
  • a cleavage site between the hydrophobin and the fusion partner or the fusion partners can be used to cleave off the fusion partner and to release the pure hydrophobin in underivatized form (for example by BrCN cleavage on methionine, factor Xa, enterokinase, thrombin, TEV Cleavage etc.).
  • the hydrophobins used according to the invention as auxiliaries for the crystallization can be prepared chemically by known methods of peptide synthesis, such as, for example, by Merrifield solid-phase synthesis.
  • Naturally occurring hydrophobins can be isolated from natural sources by suitable methods. As an example, let Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) or WO 96/41882.
  • fusion proteins can preferably be carried out by genetic engineering methods in which a nucleic acid sequence coding for the fusion partner and a hydrophobin part, in particular DNA sequence, are combined in such a way that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence.
  • a production method for example, is disclosed by WO 2006/082251 or WO 2006/082253.
  • the fusion partners greatly facilitate the production of hydrophobins. Fusion hydrophobins are produced in genetically engineered processes with significantly better yields than hydrophobins without fusion partners.
  • the fusion hydrophobins produced by the host organisms by the genetic engineering process can be worked up in a manner known in principle and purified by known chromatographic methods.
  • the simplified work-up and purification process disclosed in WO 2006/082253, pages 1 1/12 can be used.
  • the fermented cells are first separated from the Fermetationsbrühe, digested and the cell debris of the inclusion bodies (inclusion bo) this separated. The latter can be done advantageously by centrifuging.
  • the inclusion bodies for example by acids, bases and / or detergents can be digested in a manner known in principle in order to liberate the fusion hydrophobins.
  • the inclusion bodies with the fusion hydrophobins used according to the invention can generally be completely dissolved within about 1 h already using 0.1 M NaOH.
  • the solutions obtained can be used without further purification for carrying out this invention.
  • the fusion hydrophobins can also be isolated from the solutions as a solid.
  • the isolation can preferably be effected by spray drying, as described in WO 2006/082253, page 12.
  • the products obtained by the simplified work-up and purification process comprise, in addition to residues of cell debris, usually about 80 to 90% by weight of proteins.
  • the amount of fusion Depending on the fusion construct and fermentation conditions, hydrophobins are generally from 30 to 80% by weight, based on the amount of all proteins.
  • the isolated products containing fusion hydrophobins can be stored as solids and dissolved for use in the respective desired media.
  • the fusion hydrophobins can be used as such or else after cleavage and separation of the fusion partner as "pure" hydrophobins for carrying out this invention .
  • a splitting is advantageously carried out after isolation of the inclusion bodies and their dissolution.
  • the hydrophobins are used as aids in the crystallization of solids by carrying out the crystallization in the presence of hydrophobins.
  • the liquid phases comprise one or more solvents, dissolved solids and / or starting materials for their preparation, the hydrophobins and optionally further components, such as, for example, further auxiliaries.
  • the choice of solvent or solvent mixtures is in principle not limited, provided that the solids to be crystallized and the hydrophobins have sufficient solubility therein. The person skilled in the art makes a suitable choice depending on the solid to be crystallized.
  • the liquid phases are preferably aqueous phases.
  • aqueous phase is intended to mean that the solvents used are at least 50% by weight of water, based on the total amount of all solvents used, preferably at least 70% by weight of water, more preferably at least 90% by weight % Water.
  • Possible cosolvents which can be used are water-miscible solvents, for example alcohols, such as methanol, ethanol or propanol.
  • the solvent is most preferably exclusively water.
  • the pH of the aqueous phase can be selected by the person skilled in the art, depending on the type of solid to be crystallized and the desired solid properties.
  • the hydrophobins preferably fusion hydrophobins, can advantageously be used at a pH> 4, in particular from 4 to 13. It is preferably pH values from 5 to 13, particularly preferably 6 to 12 and very particularly preferably 7 to 11.
  • the amount of hydrophobins to be used can be selected by the skilled person depending on the nature of the solid to be crystallized and the desired solid properties become. In general, an amount of less than 1% by weight with respect to the sum of all constituents of the aqueous phase has proven successful.
  • the hydrophobins can preferably be used in an amount of 0.001% by weight to 1% by weight, particularly preferably 0.001 to 0.2% by weight.
  • crystallization processes from liquid phases. They may, for example, be crystallization processes in which a saturated solution of the solid is used and the crystallization of the solid is triggered by evaporation of the solvent, cooling or admixing of a further solvent in which the solid is not soluble. It may also be a reaction precipitation, in which the solid is formed only in the aqueous phase by reaction of soluble components with each other.
  • the above-mentioned fusion hydrophobins can be used as hydrophobins.
  • yaad-Xa-dewA-his SEQ ID NO: 20
  • products with a shortened yaad residue such as yaad40-Xa-dewA-his.
  • the products prepared according to the simplified cleaning method described above can be used.
  • the hydrophobins are useful both as auxiliaries for the crystallization of inorganic as well as organic solids from liquid phases. Particularly well the hydrophobins can be used as an aid to the crystallization of gypsum (CaSO4 * 2H2O) can be used. Instead of acicular crystallites, more compact crystallites are obtained with a significantly smaller length / thickness ratio, which can be more easily separated from the aqueous phase.
  • hydrophobins are particularly suitable for crystallizing calcium carbonate.
  • the hydrophobins can be used in a process for the production of solids by crystallization from aqueous phase and separation of the solid formed from the aqueous phase. Most preferably, it may be a process for separating gypsum.
  • the step of crystallization and preferred conditions have already been described above.
  • the separation of the solids preferably the gypsum, can be carried out by methods known to those skilled in the art, for example by filtration or by a combination of different measures for the separation of liquids from solids.
  • the moist solid can be dried and processed further.
  • the method according to the invention may in particular be a method step of a method for flue gas desulfurization.
  • gaseous SO2 is reacted with an aqueous CaCO3 suspension to CaSO3 and the CaS ⁇ 3 oxidized with O2 to CaSO 4 , which crystallized as CaSO 4 * 2 H2O.
  • the hydrophobins are added to the process water used in the concentrations indicated above.
  • hydrophobin A a fusion hydrophobin with the complete fusion partner yaad was used (yaad-Xa-dewA-his, hereinafter called hydrophobin A) and a fusion hydrophobin with a reduced to 40 amino acids fusion partner yaad40-Xa-dewA-his (hydrophobin B ).
  • hydrophobin B a fusion hydrophobin with a reduced to 40 amino acids fusion partner yaad40-Xa-dewA-his
  • Substrate glass (window glass, Süd Weg Glas, Mannheim)
  • the samples are air-dried and the contact angle (in degrees) of a drop of 5 ⁇ l of water at room temperature is determined.
  • the contact angle measurement was performed on a device Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). The measurement was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • Untreated glass gave a contact angle of 15 ° to 30 ° ⁇ 5 °.
  • Coating with the fusion hydrophobin yaad-Xa-dewA-his ⁇ gave a contact angle increase of more than 30 °; a coating with the fusion hydrophobin yaad40-Xa-dewA-his also gave a contact angle increase of more than 30 °.
  • a saturated solution of CaSO 4 .2H 2 O in demineralized water was prepared (concentration about 2 g / l). Hydrophobin A or hydrophobin B were added to each of the solutions so that the gypsum solution had a concentration of about 0.1 g / l of the spray-dried product. The pH of the solution was adjusted with HCl or NaOH. The aqueous solutions / dispersions were filtered through a folded filter (about 10 ⁇ m). About 25 ml of the solution were then added to a petri filled and allowed to evaporate the water at room temperature in about 24 hours. A solution was left for comparison without hydrophobin addition.
  • FIGs 1 to 6 show that hydrophobins can influence the crystal form of gypsum.
  • Gypsum precipitated at a pH of 8 without auxiliary means consists of needles with a length / thickness ratio of at least 10 (Fig. 1).
  • Fig. 2 with addition of hydrophobin A (Fig. 2) or hydrophobin B (Fig. 3) precipitated gypsum no longer consists of needles, but relatively compact prisms with a length / thickness ratio of approx 2 to 3 received.
  • the needle length is significantly shortened compared to the experiment without Hydrophobinzusatz. Such compact particles can be filtered better.
  • the needle length is shortened by the hydrophobins at all pH values (Fig. 4 to 6). This effect is most pronounced in the alkaline pH range ( Figures 1 to 3 and 6), in which almost exclusively prisms and no needles are obtained.

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Abstract

Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel bei der Kristallisation von Feststoffen, insbesondere die Verwendung zur Herstellung von Gips aus wässriger Phase.

Description

Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel bei der Kristallisation von Feststoffen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel bei der Kristallisation von Feststoffen, insbesondere die Verwendung zur Herstellung von Gips aus wässriger Phase.
Die Eigenschaften von feinteiligen Feststoffen werden ganz maßgeblich von der Größe und vom Habitus der Kristallite, aus denen der Feststoff besteht, bestimmt. Größe und Habitus beeinflussen maßgeblich die rheologischen Eigenschaften von Feststoffsuspensionen, die Abtrennbarkeit der Feststoffe aus wässrigen Suspensionen, beispielsweise durch Filtration, die Handhabung der getrockneten Produkte und die Eigenschaften der Feststoffe selbst. Beispielhaft sei auf die Farbstärke oder die Dispergierbarkeit von Farbpigmenten hingewiesen, welche maßgeblich von Größe und Habitus der einzelnen Kristallite abhängten.
Es ist prinzipiell bekannt, beim Ausfällen bzw. Kristallisieren aus Lösungen die Größe und den Habitus der sich bildenden Kristalle durch geeignete anorganische oder orga- nische Zusatzstoffe zu beeinflussen. Hierzu sei beispielsweise auf „Crystallization and Precipitation - 4.4 „Crystal Habit Modification" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 7th Edtition 2006, Electronic Release, Wiley-VCH, Weinheim, New York 2006, verwiesen.
Ein häufig untersuchter Prozess ist die Beeinflussung von Größe und Habitus der Kristalle von Gips (siehe z.B. G.A. Bertoldi, Zement-Kalk-Gips, Nr. 12, 1978). Wässrige Suspensionen von Gips fallen heutzutage in großen Mengen bei der Rauchgasentschwefelung an. Zur weiteren Verwertung muss der Gips von der wässrigen Phase getrennt werden. Gips kristallisiert üblicherweise in Form von Nadeln. US 4,183,908 und US 5,246,677 offenbaren Verfahren zum Kristallisieren von Gips in Form kompakter Kristalle durch Zusatz von Polyphosphaten, organischen Phosphaten oder Phosphonaten, um die Abtrennung des Gips von der wässrigen Phase zu erleichtern.
Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, welche in fila- mentösen Pilzen, beispielsweise Schizophyllum commune, vorkommen. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf. Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden, können aber auch mittels gentechnischer Verfahren gewonnen werden, wie beispielsweise von WO 2006/082251 oder WO 2006/131564 offenbart.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen vorgeschlagen worden. WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-inWasser-Emulsionen oder von Wasser-in-ÖI-Emulsionen vor. Weiterhin werden phar- mazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen.
EP 1 252 516 offenbart die Beschichtung verschiedener Substrate mit einer Hydropho- bine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 800C.
Weiterhin wurde beispielsweise die Verwendung als Demulgator (WO 2006/103251 ), als Verdunstungsverzögerer (WO 2006/128877) oder Verschmutzungsinhibitor (WO 2006/103215) vorgeschlagen.
Die Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel zur Kristallisation ist bislang nicht bekannt.
Aufgabe der Erfindung war es, neuartige Hilfsmittel zur Beeinflussung der Kristallisati- on zur Verfügung zu stellen.
Dementsprechend wurde die Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel bei der Kristallisation von Feststoffen gefunden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde ein Verfahren zum Herstellen von Feststoffen durch Kristallisieren aus wässriger Phase und Abtrennen des gebildeten Feststoffes von der wässrigen Phase gefunden, bei dem man der wässrigen Phase mindestens ein in der wässrigen Phase lösliches Hilfsmittel in einer Menge von 0,001 bis 1 Gew. % bezogen auf die Gesamtmenge der wässrigen Phase zusetzt, wo- bei es sich bei mindestens einem der Hilfsmittel um ein Hydrophobin handelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung von Gips. Besonders bevorzugt handelt es sich hierbei um einen Verfahrensschritt eines Verfahrens zur Rauchgasentschwefelung.
Zu der Erfindung ist im Einzelnen das Folgende auszuführen:
Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)
Xn-C1-Xi-5o-C2-Xo-5-C3-Xi-ioo-C4-Xi-ioo-C5-Xi-5o-C6-Xo-5-C7-Xi-5o-C8-Xm (I) verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können die Reste X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren in der jeweiligen Teilsequenz X dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300.
Die Polypetide gemäß der Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasober- fläche.
Die mit C bis C8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C bis C8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Di- sulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevor- zugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-Positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.
Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)
Xn-C1-X3-25-C2-Xθ-2-C3-X5-5O-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-Xθ-2-C7-X3-35-C8-Xm (I I)
zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwi- sehen 0 und 350, bevorzugt 15 bis 300 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindes- tens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.
Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)
Xn-C1-X5-9-C2-C3-Xi1-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm
eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.
Bei den Resten Xn und Xm kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicher- weise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder bei beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste Xn und/oder Xm zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz verlängert ist.
Falls es sich bei Xn und/oder Xm um natürlicherweise nicht mit Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren lang. Es kann sich beispielsweise um Se- quenzen aus 20 bis 500, bevorzugt 30 bis 400 und besonders bevorzugt 35 bis 100 Aminosäuren handeln. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen. Fusions-Hydrophobine aus Fusionspartner und Hydrophobinteil sind beispielsweise in WO 2006/082251 , WO 2006/082253 und WO 2006/131564 offenbart worden.
Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es kann nur ein einziger Fusionspartner mit dem Hydrophobinteil verknüpft sein, oder es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (Xn) und am Carboxyterminus (Xm) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (Xn oder Xm) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden.
Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251), yaae (SEQ ID NO: 18 in WO 2006/082251 ) und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, beispielsweise 70 bis 99 %, bevorzugt 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt 10 bis 40 % der genann- ten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren bezieht.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem genannten Fusionspartner als eine der Gruppen Xn oder Xm oder als terminaler Bestandteil einer solchen Gruppe noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affinity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirken können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)k- , (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe)k- oder (Cys)k- Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His)k-Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht. Hierbei kann die Gruppe Xn und/oder Xm ausschließlich aus einer derartigen Affinitätsdomäne bestehen oder aber ein natürlicherweise oder nicht natürlicherweise mit einem Hydrophobin ver- knüpfter Rest Xn bzw. Xmwird um eine terminal angeordnete Affinitätsdomäne verlängert.
Die erfindungsgemäß als Hydrophobine oder Derivate davon verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.
Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine bzw. deren Derivaten ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell beispielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 μl und die Verwendung von Glasplättchen als Substrat. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Fusionsproteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl , basf2. Diese Hydrophobine inklusive ihrer Sequenzen sind beispielsweise in WO 2006/82251 offenbart. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die nachfolgend angegebenen Sequenzen auf in WO 2006/82251 offenbarten Sequenzen. Eine Übersichtstabelle mit den SEQ-I D-Nummern befindet sich in WO 2006/82251 auf Seite 20.
Erfindungsgemäß insbesondere geeignet sind die Fusionsproteine yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Besonders bevorzugt kann yaad-Xa-dewA-his
(SEQ ID NO: 20) eingesetzt werden. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Aus- gangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.
Besonders zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad- Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Derivate. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürzter yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis 150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden. Ein Beispiel für ein derartiges Protein ist yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 26 in PCT/EP2006/064720), welches einen auf 40 Aminosäuren verkürzten yaad-Rest aufweist.
Eine Spaltstelle zwischen dem Hydrophobin und dem Fusionspartner bzw. den Fusionspartnern kann dazu genutzt werden, den Fusionspartner abzuspalten und das reine Hydrophobin in underivatisierter Form freizusetzen (beispielsweise durch BrCN-Spal- tung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin-, TEV-Spaltung etc.). Die erfindungsgemäß als Hilfsmittel zur Kristallisation verwendeten Hydrophobine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, wie beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.
Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.
Ein gentechnisches Herstellverfahren für Hydrophobine ohne Fusionspartner aus TaIa- romyces thermophilus ist von US 2006/0040349 beschrieben.
Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren beispielsweise ist von WO 2006/082251 oder WO 2006/082253 offenbart. Die Fusionspartner erleichtern die Herstellung der Hydrophobine erheblich. Fusions-Hydrophobine werden bei den gentechnischen Verfahren mit deutlich besseren Ausbeuten produziert als Hydrophobine ohne Fusionspartner.
Die nach dem gentechnischen Verfahren von den Wirtsorganismen produzierten Fusions-Hydrophobine können in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgearbeitet und mittels bekannter chromatographischer Methoden gereinigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das in WO 2006/082253, Seiten 1 1/12 offenbarte, vereinfachte Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren eingesetzt werden. Hierzu werden die fermentierten Zellen zunächst aus der Fermetationsbrühe abgetrennt, aufgeschlossen und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern (inclusion bo- dies) getrennt. Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Einschlusskörper, beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergen- tien in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Fusions- Hydrophobine freizusetzen. Die Einschlusskörper mit den erfindungsgemäß verwendeten Fusion-Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0,1 m NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden.
Die erhaltenen Lösungen können ohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden. Die Fusions-Hydrophobine können aus den Lösungen aber auch als Feststoff isoliert werden. Bevorzugt kann die Isolierung mittels Sprühtrocknen erfolgen, wie in WO 2006/082253, Seite 12 beschrieben. Die nach dem vereinfachten Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren erhaltenen Produkte umfassen neben Resten von Zelltrümmern in der Regel ca. 80 bis 90 Gew. % Proteine. Die Menge an Fusions- Hydrophobinen beträgt je nach Fusionskonstrukt und Fermentationsbedingungen in der Regel 30 bis 80 Gew. % bezüglich der Menge aller Proteine.
Die isolierten, Fusions-Hydrophobine enthaltenden Produkte können als Feststoffe gelagert werden und zum Einsatz in den jeweils gewünschten Medien gelöst werden.
Die Fusions-Hydrophobine können als solche oder auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine zur Ausführung dieser Erfindung verwendet werden. Eine Spaltung nimmt man vorteilhaft nach der Isolierung der Ein- Schlusskörper und deren Auflösung vor.
Erfindungsgemäß werden die Hydrophobine als Hilfsmittel bei der Kristallisation von Feststoffen verwendet, indem man die Kristallisation in Gegenwart von Hydrophobinen vornimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann es sich um eine Kristallisation von Feststoffen aus flüssigen Phasen handeln. Die flüssigen Phasen umfassen eines oder mehrere Lösungsmittel, gelösten Feststoff und/oder Ausgangsprodukte zu deren Herstellung, die Hydrophobine sowie optional weitere Komponenten, wie bei- spielsweise weitere Hilfsstoffe. Die Auswahl der Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelmischungen ist prinzipiell nicht beschränkt, vorausausgesetzt, die zu kristallisierenden Feststoffe und die Hydrophobine weisen darin eine ausreichende Löslichkeit auf. Der Fachmann trifft je nach dem zu kristallisierenden Feststoff eine geeignete Auswahl.
Bei den flüssigen Phasen handelt es sich bevorzugt um wässrige Phasen. Der Begriff „wässrige Phase" soll bedeuten, dass es sich bei den eingesetzten Lösemitteln um mindestens 50 Gew. % Wasser, bezogen auf die Gesamtmenge aller eingesetzten Lösemittel handelt. Bevorzugt handelt es sich um mindestens 70 Gew. % Wasser, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew. % Wasser. Als mögliche Colösemittel kommen mit Wasser mischbare Lösemittel in Frage, beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Propanol. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich beim dem Lösungsmittel ausschließlich um Wasser.
Der pH-Wert der wässrigen Phase kann vom Fachmann je nach der Art des zu kristal- lisierenden Feststoffes und den gewünschten Feststoffeigenschaften gewählt werden. Erfindungsgemäß können die Hydrophobine, bevorzugt Fusions-Hydrophobine vorteilhaft bei einem pH-Wert > 4, insbesondere 4 bis 13 eingesetzt werden. Bevorzugt handelt es sich um pH-Werte von 5 bis 13, besonders bevorzugt 6 bis 12 und ganz besonders bevorzugt 7 bis 1 1.
Die Menge der einzusetzenden Hydrophobine kann vom Fachmann je nach der Art des zu kristallisierenden Feststoffes und den gewünschten Feststoffeigenschaften gewählt werden. In der Regel bewährt hat sich eine Menge von weniger als 1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile der wässrigen Phase. Bevorzugt können die Hydrophobine in einer Menge von 0,001 Gew. % bis 1 Gew. %, besonders bevorzugt 0,001 bis 0,2 Gew. % eingesetzt werden.
Es kann sich hierbei prinzipiell um alle Arten von Kristallisationsprozessen aus flüssigen Phasen handeln. Es kann sich beispielsweise um Kristallisationsprozesse handeln, bei denen eine gesättigte Lösung des Feststoffes eingesetzt wird und die Kristallisation des Feststoffes durch Verdampfen des Lösungsmittels, Abkühlen oder Zumischen ei- nes weiteren Lösungsmittels, in dem der Feststoff nicht löslich ist, ausgelöst wird. Es kann sich auch um eine Reaktionsfällung handeln, bei dem der Feststoff erst in der wässrigen Phase durch Reaktion löslicher Komponenten miteinander gebildet wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können als Hydropho- bine die oben erwähnten Fusions-Hydrophobine eingesetzt werden. Beispielsweise kann yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20) eingesetzt werden, sowie insbesondere Produkte mit verkürztem yaad-Rest, wie beispielsweise yaad40-Xa-dewA-his. Vorteilhaft können die nach dem oben beschriebenen, vereinfachten Reinigungsverfahren hergestellten Produkte eingesetzt werden.
Die Hydrophobine eignen sich sowohl als Hilfsmittel zur Kristallisation von anorganischen wie von organischen Feststoffen aus flüssigen Phasen. Besonders gut können die Hydrophobine als Hilfsmittel zur Kristallisation von Gips (CaSO4 * 2H2O) eingesetzt werden. Anstelle von nadeiförmigen Kristalliten werden kompaktere Kristallite mit deut- lieh kleinerem Länge/Dicke-Verhältnis erhalten, welche sich leichter aus der wässrigen Phase abscheiden lassen.
Weiterhin eignen sich die Hydrophobine besonders gut zum Kristallisieren von Calciumcarbonat.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Hydrophobine in einem Verfahren zur Herstellung von Feststoffen durch Kristallisieren aus wässriger Phase und Abtrennen des gebildeten Feststoffes von der wässrigen Phase eingesetzt werden. Besonders bevorzugt kann es sich um ein Verfahren zur Abtrennung von Gips handeln.
Der Schritt des Kristallisierens und bevorzugte Bedingungen wurden bereits oben beschrieben. Die Abtrennung der Feststoffe, bevorzugt des Gips', kann mittels dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen werden, beispielsweise durch Filtration oder durch eine Kombination verschiedener Maßnahmen zur Trennung von Flüssigkeiten von Feststoffen. Nach der Abtrennung kann der feuchte Feststoff getrocknet und weiter verarbeitet werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann es sich insbesondere um einen Verfahrensschritt eines Verfahrens zur Rauchgasentschwefelung handeln. Hierbei wird in einer ersten Stufe in den Fachmann bekannten Wäschern im Rauchgas enthaltenes, gasförmiges SO2 mit einer wässrigen CaCO3 Suspension zu CaSOß umgesetzt und das CaSθ3 mit O2 zu CaSO4 oxidiert, welcher als CaSO4 * 2 H2O auskristallisiert. In der wässrigen Phase wird also kontinuierlich Gips durch Reaktion gebildet. Zur Steuerung der Kristallform werden die Hydrophobine dem verwendeten Prozesswasser in den oben angegebenen Konzentrationen zugesetzt.
Verfahren zur Rauchgasentschwefelung sind dem Fachmann bekannt. Die Umsetzung von SO2 und CaCO3 kann beispielsweise im Gegenstrom vorgenommen werden. Die gebildeten Gips-Kristalle können zunächst in einem Hydrozyklon als konzentrierte Gips-Suspension abgetrennt und anschließend mittels Filtration, Waschen und Trocknen als Feststoff gewonnen werden. Für weitere Einzelheiten sei auf „Calcium Sulfate - 3.2 „Flue Gas Desulphurization (FDG) Gypsum" in Ullmann's Encyclopedia of Indus- trial Chemistry, 7th Edtition 2006, Electronic Release, Wiley-VCH, Weinheim, New York 2006, sowie die dort zitierte Literatur verwiesen. Der gebildete Gips kann anschließend gebrannt (Anhydrid) und beispielsweise in bekannter Art und Weise in der Baustoffindustrie verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Bereitstellung der Hydrophobine
Für die Beispiele wurde ein Fusions-Hydrophobin mit dem vollständigen Fusionspartner yaad eingesetzt (yaad-Xa-dewA-his; nachfolgend Hydrophobin A genannt) sowie ein Fusions-Hydrophobin mit einem auf 40 Aminosäuren verkürzten Fusionspartner yaad40-Xa-dewA-his (Hydrophobin B). Die Herstellung erfolgte gemäß der in WO 2006/082253 beschriebenen Prozedur.
Die Produkte wurden nach dem vereinfachten Reinigungsverfahren gemäß Beispiel 9 von WO 2006/82253 aufgearbeitet und gemäß Beispiel 10 derselben Schrift sprühgetrocknet. Der Gesamtproteingehalt der erhaltenen, getrockneten Produkte betrug jeweils ca. 70 bis 95 Gew. %, der Gehalt an Hydrophobinen betrug ca. 40 bis 90 Gew. % bezüglich des Gesamtproteingehaltes. Die Produkte wurden als solche für die Versuche eingesetzt. Anwendungstechnische Prüfung: Charakterisierung der Fusions-Hydrophobine durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat: Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim)
Für die Tests wurden die sprühgetrockneten, Fusions-Hydrophobine enthaltenden Produkte in Wasser unter Zusatz von 5O mM Na-Acetat pH 4 und 0,1 Gew. % Polyoxye- thylen(20)-sorbitanmonolaureat (Tween® 20) gelöst. Konzentration des Produktes: 100 μg/mL in wässriger Lösung.
Vorgehensweise:
Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur 800C), danach Beschich- tung waschen in destilliertem Wasser, danach Inkubation 10min / 800C / 1 % Natrium-Dodecylsulfat (SDS) -Lösung in dest. Wasser,
Waschen in dest. Wasser
Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bei Raumtemperatur bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 15° bis 30° ± 5°. Eine Beschich- tung mit dem Fusions-Hydrophobin yaad-Xa-dewA-hisβ ergab eine Kontaktwinkelvergrößerung von mehr als 30°; eine Beschichtung mit dem Fusions-Hydrophobin yaad40-Xa-dewA-his ergab ebenfalls eine Kontaktwinkelvergrößerung von mehr als 30°.
Versuche zur Kristallisation von Gips
Allgemeine Arbeitsvorschrift
Es wurde eine gesättigte Lösung von CaSO4 x 2 H2O in vollentsalztem Wasser hergestellt (Konzentration ca. 2 g/l). Den Lösungen wurde jeweils Hydrophobin A bzw. Hy- drophobin B zugesetzt, so dass die Gips-Lösung eine Konzentration von ca. 0,1 g/l des sprühgetrockneten Produktes aufwies. Der pH-Wert der Lösung wurde mit HCl bzw. NaOH eingestellt. Die wässrigen Lösungen/Dispersionen wurden über einen Faltenfilter (ca. 10 μm) filtriert. Danach wurden jeweils ca. 25 ml der Lösung in eine Petri- schale gefüllt und das Wasser bei Raumtemperatur in ca. 24 Stunden verdunsten gelassen. Eine Lösung wurde zu Vergleichzwecken ohne Hydrophobinzusatz belassen.
Die Formen der gebildeten Gipskristalle wurden mit einem Mikroskop BH-2 der Fa. Olympus verglichen. In den Abbildungen 1 bis 6 sind jeweils Aufnahmen der erhaltenen Kristalle zusammengestellt (40-fache Vergrößerung, Teilchengröße jeweils ca. 0,01 - 0,1 mm).
Verzeichnis der Abbildungen:
Abbildung 1 pH 8, ohne Zusatz von Hydrophobin
Abbildung 2 pH 8, Zusatz von Hydrophobin A
Abbildung 3 pH 8, Zusatz von Hydrophobin B
Abbildung 4 pH 4, Zusatz von Hydrophobin B Abbildung 5 pH 6, Zusatz von Hydrophobin B
Abbildung 6 pH 10, Zusatz von Hydrophobin B
Diskussion
Die Abbildungen 1 bis 6 zeigen, dass sich durch Hydrophobine die Kristallform von Gips beeinflussen lässt. Bei einem pH-Wert von 8 ohne Hilfsmittel gefällter Gips besteht aus Nadeln mit einem Länge/Dicke-Verhältnis von mindestens 10 (Abb. 1). Bei einem pH-Wert von 8 unter Zusatz von Hydrophobin A (Abb 2.) oder Hydrophobin B (Abb.3) gefällter Gips besteht nicht mehr aus Nadeln, sondern es werden relative kom- pakten Prismen mit einen Länge/Dicke-Verhältnis von ca. 2 bis 3 erhalten. Die Nadellänge ist hierbei gegenüber dem Versuch ohne Hydrophobinzusatz deutlich verkürzt. Derartige kompakte Teilchen lassen sich besser filtern.
Die Nadellänge wird durch die Hydrophobine bei allen pH-Werten verkürzt (Abb. 4 bis 6). An stärksten ausgeprägt ist dieser Effekt im alkalischen pH-Bereich (Abb. 1 bis 3 und 6), in dem fast ausschließlich Prismen und keine Nadeln mehr erhalten werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel bei der Kristallisation von Feststoffen.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass es sich um eine Kristallisation aus flüssigen Phasen handelt.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hydrophobine in einer Menge von 0,001 bis 1 Gew. % bezüglich der Gesamtmenge der flüssigen Phase einsetzt.
4. Verwendung gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der flüssigen Phase um eine wässrige Phase handelt.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der wässrigen Phase 7 bis 1 1 beträgt.
6. Verwendung gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Feststoff um Gips handelt.
7. Verwendung gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Feststoff um Calciumcarbonat handelt.
8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Hydrophobin um ein Fusions-Hydrophobin handelt.
9. Verfahren zum Herstellen von Feststoffen durch Kristallisieren aus wässriger
Phase und Abtrennen des gebildeten Feststoffes von der wässrigen Phase, bei dem man der wässrigen Phase mindestens ein in der wässrigen Phase lösliches
Hilfsmittel in einer Menge von 0,001 bis 1 Gew. % bezogen auf die Gesamtmenge der wässrigen Phase zusetzt, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei mindestens einem der Hilfsmittel um ein Hydrophobin handelt.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der wässrigen Phase 7 bis 1 1 beträgt.
1 1. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Feststoff um Gips handelt.
12. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Feststoff um Calciumcarbonat handelt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Verfahrensschritt eines Verfahrens zur Rauchgasentschwefelung handelt.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Hydrophobin um ein Fusions-Hydrophobin handelt.
PCT/EP2008/056263 2007-05-24 2008-05-21 Verwendung von hydrophobinen als hilfsmittel bei der kristallisation von feststoffen WO2008142111A1 (de)

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