KR20080004555A

KR20080004555A - 접착 촉진제로서의 폴리펩티드의 용도

Info

Publication number: KR20080004555A
Application number: KR1020077025221A
Authority: KR
Inventors: 헤르만 자이퍼; 칼-하인츠 슈마허; 한스-게오르크 르메르; 울프 바우스; 토마스 수브코브스키; 마핀 카로스; 클라우스 볼슈바일러; 토마스 하이덴펠더
Original assignee: 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2008-01-09
Also published as: WO2006103225A1; JP2008537701A; BRPI0607594A2; US8859106B2; JP4772110B2; EP1866150B1; MX2007012021A; EP1866150A1; US20090233110A1

Abstract

본 발명은, 복합체의 적어도 2개의 인접 층 사이 또는 코팅과 기재 사이의 접착 촉진제로서 40 중량% 이상이 펩티드 결합을 통해 연결된 알파-아미노산으로 구성되는 화합물("폴리펩티드"라 약칭함)을 포함하는 다층 복합체 또는 코팅된 기재에 관한 것이다.

Description

접착 촉진제로서의 폴리펩티드의 용도{USE OF POLYPEPTIDES IN THE FORM OF ADHESIVE AGENTS}

본 발명은, 복합체의 2개 이상의 인접 층 사이 또는 코팅과 기재 사이의 접착 촉진제로서 40 중량% 이상이 펩티드 결합을 통해 연결된 알파-아미노산으로 구성되는 화합물(이하, "폴리펩티드"라 약칭함)을 포함하는, 다층 복합체 또는 코팅된 기재에 관한 것이다. 더 상세하게는 본 발명은 접착 촉진제로서의 하이드로포빈의 용도에 관한 것이다.

하이드로포빈은 필라멘트형 진균류, 예를 들어 스키조필럼 커뮨(Schizophyllum commune)의 특징인 약 100개 내지 150개의 아미노산으로 이루어진 소형 단백질이다. 이 단백질은 일반적으로 8개의 시스테인 단위를 포함한다.

하이드로포빈은 계면에 대해 현저한 친화력을 보유하며, 따라서 표면의 코팅에 적합하다. 따라서, 예를 들어, 테플론(Teflon)을 하이드로포빈으로 코팅하여 친수성 표면을 얻을 수 있다.

하이드로포빈은 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 본 출원인의 이전 출원 DE　10 2005 007 480.4는 하이드로포빈의 제조 방법을 개시한다.

선행 기술에서는 다양한 분야에 있어서의 하이드로포빈의 용도가 제안되었 다.

WO　96/41882는 소수성 표면에 친수성을 제공하기 위해, 친수성 기재의 방수성을 향상시키기 위해, 수중유 에멀션 또는 유중수 에멀션을 제조하기 위해, 하이드로포빈을 유화제, 증점제 또는 계면활성제로서 사용하는 용도를 제안한다. 그 밖에도, 약학 분야, 예컨대 연고 또는 크림의 제조, 또, 미용 분야, 예컨대 피부 보호, 또는 헤어 샴푸 또는 헤어 린스의 제조에 있어서의 용도도 제안되었다.

EP　1　252　516은 30∼80℃에서 창문, 콘텍트 렌즈, 바이오센서, 의료 장치, 실험 수행용 또는 저장용 용기, 선각, 고체 입자 또는 승용차의 차대 또는 차체를 하이드로포빈 함유 용액으로 코팅하는 방법을 개시한다.

WO　03/53383은 미용 분야에서 케라틴 물질을 처리하기 위한 하이드로포빈의 용도를 개시한다.

WO　03/10331은 추가 물질, 예를 들어 전기 활성 물질, 항체 또는 효소가 비공유 결합으로 결합되어 있는 하이드로포빈 코팅 센서(예를 들어 측정용 전극)를 개시한다.

종래에, 예를 들어 매우 다양한 기재에의 코팅의 접착력을 향상시키기 위해 매우 다양한 접착 촉진제가 사용되어 왔다. Roempp Chemie Lexikon(1990년 판)에 따르면, 티타네이트, 실란, 불포화 카르복실산의 크롬 착물이 적합하다. 특히, 에틸렌/아크릴아미드 공중합체, 중합체 이소시아네이트 또는 반응성 유기 규소 화합물이 접착제용 접착 촉진제로서 언급되어 있다.

폴리우레탄 및 폴리에틸렌이민 역시 공지된 접착 촉진제이다.

본 발명의 목적은 매우 우수한 응용 특성을 가지며, 특히 다층 복합체의 개개의 층 또는 기재에 코팅을 잘 접착시키는 대안의 접착 촉진제를 제공하는 것이다.

그에 따라, 명세서 도입부에 정의된 바와 같은 다층 복합체 또는 코팅된 기재를 발견하였다.

접착 촉진제

다층 복합체 또는 코팅된 기재는 도입부에서 접착 촉진제로서 정의된 폴리펩티드를 포함한다.

상기 폴리펩티드는 40 중량% 이상, 바람직하게는 70 중량% 이상, 특히 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 특히 바람직하게는 95 중량% 또는 99 중량% 이상의, 펩티드 결합을 통해 연결된 알파-아미노산으로 구성된다.

특정 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 연결된 알파-아미노산으로만 구성된다.

특히 적합한 알파-아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 티로신, 프롤린, 히드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신 및 히스티딘이다.

상기 폴리펩티드는 다른 알파-아미노산과의 혼합물로 알파-아미노산 시스테인을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 폴리펩티드는 특히 바람직하게는 0.1 중량% 이상, 특히 바람직하게는 0.5 중량% 이상, 매우 특히 바람직하게는 1 중량% 이상의 시스테인으로 구성된다. 상기 폴리펩티드 내 시스테인 함량은 일반적으로 15 중량%, 특히 10 중량%, 매우 특히 바람직하게는 7 중량%를 초과하지 않는다.

특정 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하이드로포빈이다.

본 발명에 따르면, 이하에서 "하이드로포빈(hydrophobin)"이란 용어는 하기 일반 구조식 (I)의 단백질을 의미한다.

X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m (I)

상기 식에서, X는 20개의 천연 아미노산(Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) 중 어느 하나일 수 있다. 또한 X는 각 경우에 동일하거나 상이할 수 있다. X 다음에 표시된 지수는 각 경우에 아미노산의 수를 나타내며, C는 시스테인, 알라닌, 세린, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이고, C로 표시되는 잔기 중 적어도 4개는 시스테인이며, 지수 n 및 m은 서로 독립적으로 0∼500, 바람직하게는 15∼300의 자연수이다.

일반식 (I)에 따른 폴리펩티드는 또한, 유리 표면의 코팅 후 각 경우에 비코팅 유리 표면 상에 유사한 크기의 물방울에 의해 형성된 접촉각에 비해, 실온에서 물방울의 접촉각을 20˚ 이상, 바람직하게는 25˚이상, 특히 바람직하게는 30˚ 증가시키는 특성을 갖는 것이 특징이다.

C¹ 내지 C⁸로 표시되는 아미노산은 시스테인인 것이 바람직하나; 이들은 또한 유사한 공간 치수의 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 글리신으로 치환될 수도 있다. 그러나, C¹ 내지 C⁸ 위치 중 4개 이상, 바람직하게는 5개 이상, 특히 바람직하게는 6개 이상, 특히 7개 이상이 시스테인으로 구성되어야 한다. 시스테인은 환원 상태로 존재하거나 서로 디설파이드 가교 결합을 형성할 수 있다. 특히 1개 이상, 바람직하게는 2개, 특히 바람직하게는 3개, 가장 바람직하게는 4개의 분자내 디설파이드 가교 결합을 포함하는, C-C 가교 결합의 분자내 형성이 특히 바람직하다. 전술한 바와 같이 시스테인을 유사한 공간 치수의 아미노산으로 치환하는 것은, 서로 분자내 디설파이드 가교 결합을 형성할 수 있는 C 위치의 쌍대 치환을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 시스테인, 세린, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이 X로 표시된 위치에 이용될 경우, 상기 일반식에 있어서 개개의 C 위치의 넘버링은 그에 따라 변경될 수 있다.

본 발명을 수행하기 위해, 하기 일반식 (II)의 하이드로포빈을 이용하는 것이 바람직하다.

X_n-C¹-X_3-25-C²-X_0-2-C³-X_5-50-C⁴-X_2-35-C⁵-X_2-15-C⁶-X_0-2-C⁷-X_3-35-C⁸-X_m (II)

상기 식에서, X, C와, X 및 C 다음에 표시된 지수는 상기에 정의된 바와 같고, 지수 n 및 m은 0∼300 범위의 수를 나타내며, 상기 단백질은 또한 전술한 접촉각 변화가 특징이다.

하기 일반식 (III)의 하이드로포빈을 이용하는 것이 특히 바람직하다.

X_n-C¹-X_5-9-C²-C³-X_11-39-C⁴-X_2-23-C⁵-X_5-9-C⁶-C⁷-X_6-18-C⁸-X_m (III)

상기 식에서, X, C와, X 및 C 다음에 표시된 지수는 상기에 정의된 바와 같고, 지수 n 및 m은 0∼200 범위의 수를 나타내며, 상기 단백질은 또한 전술한 접촉각 변화가 특징이고, C로 표시된 잔기 중 적어도 6개는 시스테인이다. 잔기 C 모두가 시스테인인 것이 특히 바람직하다.

잔기 X_n 및 X_m은 하이드로포빈에 자연적으로 연결될 수 있는 펩티드 서열일 수 있다. 그러나, 잔기 X_n 및 X_m 중 어느 하나 또는 둘 다 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 펩티드 서열일 수도 있다. 이것은 또한, 하이드로포빈에 자연적으로 존재하는 펩티드 서열이 하이드로포빈에 자연적으로 존재하지 않는 펩티드 서열에 의해 연장된 X_n 및/또는 X_m 잔기를 포함한다.

X_n 및/또는 X_m이 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 펩티드 서열일 경우, 그러한 서열의 길이는 일반적으로 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 35개 이상의 아미노산, 특히 바람직하게는 50개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 100개 이상의 아미노산이다. 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 이러한 유형의 잔기는 이하에서 융합 파트너로 칭해지기도 한다. 이것은 상기 단백질이 자연에서는 이러한 형태로 함께 존재하지 않는 융합 파트너와 하이드로포빈 부분 1개로 구성될 수 있다는 사실을 표현하기 위한 것이다.

상기 융합 파트너는 다수의 단백질로부터 선택될 수 있다. 다수의 융합 파트너를 하나의 하이드로포빈 부분에, 예를 들어 상기 하이드로포빈 부분의 아미노 말단(X_n) 또는 카르복시 말단(X_m)에 연결시키는 것도 가능하다. 그러나, 예를 들어, 2개의 융합 파트너 부분을 본 발명 단백질의 한 위치(X_n 또는 X_m)에 연결시키는 것도 가능하다.

특히 적합한 융합 파트너 부분은 미생물, 특히 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에 자연적으로 존재하는 폴리펩티드이다. 그러한 융합 파트너 부분의 예로는 서열 yaad(서열 번호 15 및 16), yaae(서열 번호 17 및 18) 및 티오레독신이 있다. 상기 서열의 단지 일부분, 바람직하게는 70%∼99%, 특히 바람직하게는 80%∼98%를 포함하거나, 상기 서열과 비교하여 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 변경된, 상기 서열의 단편 또는 유도체 역시 매우 적합하며, 상기 백분율은 각각의 경우에 아미노산의 수와 관련된다.

또한, 본 발명에 따라 사용되는 단백질의 폴리펩티드 서열은, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 또는 예를 들어 글루타르알데히드에 의한 화학적 가교 결합에 의해 변형시킬 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 단백질의 특성 중 하나는 표면을 상기 단백질로 코팅할 경우 표면 특성이 변화된다는 것이다. 표면 특성에 있어서의 변화는 표면을 단백질로 코팅하기 전과 후에 물방울의 접촉각을 측정하고 두 측정값 간의 차이를 측정하여 실험적으로 측정할 수 있다.

접촉각 측정 방법은 기본적으로 당업자에게 알려져 있다. 접촉각 측정은 실온 및 5 ㎕의 물방울에 기초한 것이다. 예를 들어 접촉각 측정에 적합한 방법의 정확한 실험 조건은 실험 부분에서 기술한다. 그 부분에 기재된 조건 하에, 본 발명에 따라 사용되는 단백질은, 각 경우에 비코팅 유리 표면 상에 유사한 크기의 물방울에 의해 형성된 접촉각에 비해, 접촉각을 20˚ 이상, 바람직하게는 25˚ 이상, 특히 바람직하게는 30˚ 이상 증가시키는 특성을 보유한다.

지금까지 알려진 하이드로포빈의 하이드로포빈 부분에 있어서의 극성 및 비극성 아미노산의 위치는 보존되어 있어서, 특징적인 소수성 플롯을 형성한다. 생물물리학적 특성 및 소수성에 있어서의 차이에 기인하여, 지금까지 알려진 하이드로포빈은 두 가지 부류, 즉 I형 및 II형으로 분류되어 있다(Wessels et al., Ann. Rev. Phytopathol., 1994, 32, 413-437).

I형 하이드로포빈의 조립된 막은 고온에서 1% 소듐 n-도데실 설페이트(SDS)에서도 상당히 불용성을 나타내며, 진한 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 포름산을 사용해야만 다시 해리시킬 수 있다. 이와는 달리, II형 하이드로포빈의 조립형은 안정성이 더 적다. 이들은 60% 농도의 에탄올 또는 1% SDS(실온에서)를 사용해서 다시 용해시킬 수 있다.

아미노산 서열의 비교는 시스테인 C³과 시스테인 C⁴ 사이의 영역의 길이가 I형 하이드로포빈에서보다 II형 하이드로포빈에서 확실히 더 짧다는 사실을 보여준다. 또한, II형 하이드로포빈은 I형 하이드로포빈보다 하전된 아미노산을 더 많이 보유한다.

본 발명을 수행하는 데 있어서 특히 바람직한 하이드로포빈은 유형 dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2의 것이며, 이들은 하기 서열 목록에서 구조적 특징이 제시된다. 이들은 상기 유형의 단지 일부분 또는 유도체일 수도 있다. 동일하거나 상이한 구조의 다수의 하이드로포빈 부분, 바람직하게는 2개 또는 3개의 하이드로포빈 부분을 서로, 또, 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 적절한 해당 폴리펩티드 서열에 연결하는 것도 가능하다.

그 밖에도 본 발명을 실시함에 있어서 특히 적합한 것은 서열 번호 20, 22, 24에 제시된 폴리펩티드 서열을 가지는 융합 단백질과, 또한 이것을 코딩하는 핵산 서열, 구체적으로 서열 번호 19, 21, 23에 따른 서열이다. 또한, 특히 바람직한 실시형태는, 서열 번호 22, 22 또는 24에 제시된 폴리펩티드 서열로부터 출발하여, 전체 아미노산 중 1개 이상, 최대 10개, 바람직하게는 5개, 특히 바람직하게는 5%가 치환, 삽입 또는 결실되어 있으나 여전히 출발 단백질의 생물학적 특성의 50% 이상을 보유하는 단백질이다. 본 명세서에서 단백질의 생물학적 특성은 상기 접촉각이 20˚ 이상 증가하는 것을 의미한다.

본 발명에 따라 사용되는 단백질은 공지된 펩티드 합성법, 예를 들어 메리필드(Merrifield) 고상 합성법으로 화학적으로 제조할 수 있다.

천연 하이드로포빈은 적절한 방법을 이용하여 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 이에 관해서는 예를 들어 문헌[Woesten et al., Eur. J. Cell Bio. 63, 122-129 (1994)] 또는 WO 96/41882를 참조할 수 있다.

바람직하게는 융합 단백질은, 융합 파트너를 코딩하는 1개의 핵산 서열, 특히 DNA 서열과, 하이드로포빈 부분을 코딩하는 1개의 핵산 서열, 특히 DNA 서열을 조합하여, 조합된 핵산 서열의 유전자 발현에 의해 숙주 유기체에서 원하는 단백질이 생성되도록 하는 유전 공학 기법으로 제조할 수 있다. 이러한 유형의 제조 방법은 본 출원인의 선행 출원 DE 102005007480.4에 개시되어 있다.

여기서 전술한 제조 방법에 적합하게 이용될 수 있는 숙주 유기체(생산 유기체)로는 원핵 생물(고세균 포함) 또는 진핵 생물, 특히 호염성 박테리아 및 메탄 생성균(methanococci)을 비롯한 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포, 특히 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스, 바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium), 아스퍼질러스 오리지(Aspergillus oryzea), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 락토바실러스(lactobacilli), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), SF9(또는 관련 세포) 등을 들 수 있다.

본 발명은 또한, 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에, 본 발명에 따라 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하도록 구성된 발현 구성체의 용도와, 또, 상기 발현 구성체 중 적어도 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

사용된 구성체는 특정 코딩 서열의 5'쪽 상류의 프로모터와 특정 코딩 서열의 3'쪽 하류의 종결 서열과, 또한 경우에 따라, 각각의 경우에 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 통상적인 추가 조절 요소를 포함하는 것이 바람직하다.

"작동 가능한 연결(operative linkage)"이란 각각의 조절 요소가 코딩 서열을 발현하는 데 필요한 기능을 충족할 수 있도록, 프로모터, 코딩 서열, 종결 서열과, 경우에 따라, 추가 조절 요소가 순차적으로 배열되어 있는 것을 의미한다.

작동 가능하게 연결할 수 있는 서열의 예로는 표적화 서열과, 또 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등이 있다. 그 밖의 조절 요소는 선별 마커, 증폭 신호, 복제 기점 등을 포함한다. 적절한 조절 서열에 관해서는, 예를 들어 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.

상기 조절 서열 이외에도, 실제적 구조 유전자의 상류에 상기 서열의 천연 조절 요소가 존재할 수도 있으며, 경우에 따라, 천연 조절 요소가 차단되어 유전자의 발현이 증대될 수 있도록 천연 조절 요소를 유전적으로 변형시킬 수 있다.

바람직한 핵산 구성체는 또한 프로모터에 기능적으로 연결되어 있고 핵산 서열의 발현을 증대시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 전술한 인핸서 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 추가적인 조절 요소 또는 종결 서열 등의 유용한 추가 서열을 DNA 서열의 3' 말단에 삽입시킬 수도 있다.

핵산 서열은 1 카피 이상이 구성체 내에 존재할 수 있다. 상기 구성체는 또한, 경우에 따라 상기 구성체의 선별을 목적으로, 추가적인 마커, 예컨대 항생제 내성 또는 영양 요구성 보완 유전자를 포함할 수 있다.

본 방법에 유용한 조절 서열은, 예를 들어 cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, 람다-PR 또는 람다-P 프로모터 등의 프로모터에 존재하며, 상기 프로모터는 그램 음성 박테리아에 유용하게 사용된다. 그 밖의 유용한 조절 서열은, 예를 들어 그램 양성 프로모터 amy 및 SP02, 효모 또는 진균류 프로모터 ADC1, MF알파, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH에 존재한다.

조절을 위해 인공 프로모터를 사용하는 것도 가능하다.

숙주 유기체에서 핵산 구성체를 발현시키기 위해, 숙주에서의 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 파지에 핵산 구성체를 삽입시키는 것이 바람직하다. 벡터는, 플라스미드 및 파지뿐 아니라 당업자에게 공지되어 있는 다른 모든 벡터, 예를 들어 SV40, CMV, 배큘로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스, 트랜스포존, IS 엘리먼트, 파지미드, 코스미드 및 선형 또는 원형 DNA와, 또한 아그로박테리아 시스템을 의미한다.

이러한 벡터는 숙주 유기체에서 자율적으로 또는 염색체를 통해 복제할 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명의 추가 실시형태를 구성한다. 적절한 플라스미드의 예로는 이. 콜라이용 플라스미드, 즉 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-B1, tgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스용 플라스미드, 즉 plJ101, plJ364, plJ702 또는 plJ361, 바실러스용 플라스미드, 즉 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리아용 플라스미드, 즉 pSA77 또는 pAJ667, 진균류용 플라스미드, 즉 pALS1, plL2 또는 pBB116, 효모용 플라스미드, 즉 2알파, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23, 또는 식물용 플라스미드, 즉 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이 있다. 상기 플라스미드는 가능한 플라스미드 중 선택된 일부에 해당된다. 그 밖의 플라스미드도 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN　0 444 904018)]에서 찾아볼 수 있다.

핵산 구성체는, 존재하는 다른 유전자를 발현시키기 위해, 숙주 유기체 및 유전자(들)의 선택에 따라 최적 발현을 위해 선택되는, 발현 증대를 위한 3' 말단 및/또는 5' 말단의 조절 서열을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

이러한 조절 서열들은 유전자 및 단백질 발현이 특이적으로 일어나도록 하기 위한 것이다. 숙주 유기체에 따라, 이것은, 예를 들어 유전자가 유도 후에만 발현 또는 과발현되는 것, 또는 유전자가 즉시 발현 및/또는 과발현되는 것을 의미할 수 있다.

이와 관련하여, 조절 서열 또는 인자는 도입된 유전자의 발현에 긍정적으로 영향을 미침으로써 그 발현을 증대시킬 수 있는 것이 바람직하다. 따라서 조절 요소는 프로모터 및/또는 인핸서 등의 강력한 전사 신호를 이용하여 전사 수준을 증대시킬 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 이 외에도, 예를 들어 mRNA의 안정성을 향상시킴으로써 번역을 증대시키는 것도 가능하다.

벡터의 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 핵산 구성체 또는 핵산을 포함하는 벡터를 선형 DNA의 형태로 미생물에 도입하여 이종성 또는 상동성 재조합에 의해 숙주 유기체의 게놈으로 통합되도록 하는 것이 바람직할 수도 있다. 상기 선형 DNA는 플라스미드와 같은 선형화된 벡터로 구성되거나 핵산 구성체 또는 핵산으로만 구성될 수 있다.

유기체에서의 이종성 유전자의 최적 발현을 위해서는, 그 유기체에서 이용되는 특정 코돈 이용 방식에 따라 핵산 서열을 변형시키는 것이 바람직하다. 코돈 이용 방식은 해당 유기체의 다른 공지 유전자의 컴퓨터 분석을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다.

적절한 코딩 뉴클레오티드 서열 및 종결 또는 폴리아데닐화 신호에 적절한 프로모터를 융합하여 발현 카세트를 제조한다. 예를 들어 문헌[T. Maniatis, E.　F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], 문헌[T. J. Silhavy, M.　L.　Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 문헌[Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기재된 바와 같은 통상적인 재조합 및 클로닝 기법을 상기 목적에 이용한다.

적절한 숙주 유기체에서의 발현을 위해서는, 재조합 핵산 구성체 또는 유전자 구성체를, 그 숙주에서의 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 숙주 특이적 벡터에 삽입시키는 것이 바람직하다. 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Eds, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]으로부터 정보를 입수할 수 있다.

벡터를 이용하여, 예를 들어 적어도 하나의 벡터로 형질전환되고 본 발명에 따라 사용되는 단백질의 제조에 이용될 수 있는 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 본 발명의 전술한 재조합 구성체는 적절한 숙주 시스템에 도입하여 발현시키는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 상기 핵산이 특정 발현 시스템에서 발현되도록 하기 위해, 당업자에게 공지된 통상의 클로닝법 및 형질감염법, 예를 들어 공침전법, 원형질 융합법, 전기천공법, 레트로바이러스 형질감염법 등을 이용하는 것이 바람직하다. 적절한 시스템은, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.　Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997] 또는 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다.

상동성 재조합 미생물을 제조하는 것도 가능하다. 이를 위해, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 유전자의 적어도 일부분, 또는 서열을 변형시키기 위해, 예를 들어 기능을 파괴하기 위해(넉아웃 벡터), 경우에 따라 하나 이상의 아미노산 결실, 아미노산 추가 또는 아미노산 치환이 도입된 코딩 서열의 적어도 일부분을 포함하는 벡터를 제조한다. 도입된 서열은, 예를 들어 관련 미생물 유래의 상동체이거나, 포유동물, 효모 또는 곤충 기원에서 유래된 것일 수도 있다. 대안으로, 상동성 재조합에 사용되는 벡터는, 상동성 재조합의 경우, 내인성 유전자가 돌연변이되거나 다른 방식으로 변경되지만, 여전히 기능성 단백질을 코딩하도록 디자인될 수 있다(예를 들어, 내인성 단백질의 발현이 변화되도록 상류 조절 영역을 변경할 수 있다). 본 발명에 따라 사용되는 유전자의 변경된 부분은 상동성 재조합 벡터 내에 존재한다. 상동성 재조합에 적합한 벡터의 구성에 대해서는, 예를 들어 문헌[Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503]에 기재되어 있다.

본 발명에 따라 사용되는 핵산 또는 핵산 구성체에 적합한 재조합 숙주 유기체는 기본적으로 어떠한 원핵 또는 진핵 유기체도 될 수 있다. 박테리아, 진균류 또는 효모 등의 미생물이 숙주 유기체로서 사용되는 것이 바람직하다. 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아, 바람직하게는 장내세균(Enterobacteriaceae) 과, 슈도모나스과(Pseudomonadaceae) 과, 리조비아(Rhizobiaceae) 과, 스트렙토마이세스(Streptomycetaceae) 과 또는 노카디아(Nocardiaceae) 과 박테리아를 사용하는 것이 바람직하고, 에스케리키아 속, 슈도모나스 속, 스트렙토마이세스 속, 노카디아 속, 부르크홀더리아(Burkholderia) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 아그로박테리아(Agrobacterium) 속 또는 로도코쿠스(Rhodococcus) 속의 박테리아를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

융합 단백질의 제조 방법에 사용되는 유기체는, 숙주 유기체에 따라, 당업자에게 공지된 방법으로 생육 또는 배양한다. 미생물은 통상, 일반적으로 당 형태의 탄소원, 일반적으로 유기 질소원 형태의 질소원, 예컨대 효모 추출물 또는 염(예컨대, 황산암모늄염, 미량 원소의 염, 예컨대 철염, 망간염 및 마그네슘염)과, 경우에 따라 비타민을 포함하는 액상 배지에서, 산소를 공급하면서, 0℃∼100℃, 바람직하게는 10℃∼60℃의 온도에서 배양한다. 이와 관련하여, 영양 배지액의 pH는 고정값으로 유지할 수도 있고 유지하지 않을 수도 있으며, 즉, 배양 도중에 조절할 수 있고 조절하지 않을 수도 있다. 배양은 회분식, 반회분식 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 영양분은 발효 초반부에 초기에 공급하거나 반연속식 또는 연속식으로 추후에 공급할 수 있다. 효소는 실시예에 기재된 방법으로 유기체로부터 분리하거나, 미정제 추출물로서 반응에 사용할 수 있다.

단백질 생산 미생물을 배양하고, 경우에 따라 단백질의 발현을 유도하며, 상기 단백질을 배양액으로부터 분리하여, 본 발명에 따라 사용되는 단백질 또는 생물학적 활성을 갖는 이의 기능성 단편을 재조합 방식으로 제조할 수 있다. 단백질은 상기 방식으로 경우에 따라 산업적 규모로 제조할 수도 있다. 재조합 미생물은 공지의 방법으로 배양하고 발효시킬 수 있다. 박테리아는, 예를 들어 TB 배지 또는 LB 배지에서 온도 20∼40℃ 및 pH 6∼9에서 증폭시킬 수 있다. 적절한 배양 조건에 대해서는, 예를 들어 문헌[T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 상세히 기재되어 있다.

본 발명에 따라 사용되는 단백질이 배양 배지로 분비되지 않는다면, 세포를 파괴하고, 공지된 단백질 분리 방법으로 용해물로부터 생성물을 얻는다. 세포는, 경우에 따라 고주파 초음파를 이용하거나, 예를 들어 프렌치(French) 압력 셀에서와 같이 고압을 이용하거나, 삼투압 분해를 이용하거나, 계면활성제, 용해성 효소 또는 유기 용매의 작용에 의하거나, 균질화기를 이용하거나, 또는 상기 방법 중 2 이상의 방법을 병용하여 파괴할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 단백질은 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 예컨대 Q 세파로스 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피 등의 공지된 크로마토그래피법을 이용하고, 또한, 한외 여과, 결정화, 염석, 투석 및 네이티브(native) 겔 전기영동 등의 다른 통상적인 방법을 이용하여 정제할 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들어 문헌[Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York] 또는 문헌[Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기재되어 있다.

cDNA를 특정 뉴클레오티드 서열만큼 연장함으로써, 변경된 단백질 또는 융합 단백질(이것은 예를 들어 정제를 간소화하는 데 이용됨)을 코딩하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 재조합 단백질을 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 유형의 적절한 변형의 예로는 앵커로서 작용하는 "태그", 예컨대 6-히스티딘 앵커로서 알려진 변형, 또는 항체에 의해 항원으로서 인식될 수 있는 에피토프가 있다[참고 문헌: Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor(N.Y.) Press]. 적절한 다른 태그로는, 예를 들어 HA, 칼모듈린-BD, GST, MBD; 키틴-BD, 스트렙타비딘-BD-아비-태그, 플래그(Flag)-태그, T7 등이 있다. 이러한 앵커들은, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼에 패킹될 수 있거나 미량적정 평판 또는 다른 지지체 상에서 이용될 수 있는, 중합체 매트릭스 등의 고체 지지체에 단백질을 부착시키는 데 이용될 수 있다. 해당 정제 프로토콜은 시판되는 친화성 태그 공급업자로부터 입수할 수 있다.

전술한 바와 같이 제조된 단백질은 융합 단백질로서 바로 이용할 수 있거나, 또는 융합 파트너를 절단 및 제거한 후, "순수한" 하이드로포빈으로서 이용할 수 있다.

융합 파트너를 제거하고자 한다면, 하이드로포빈 부분과 융합 파트너 부분 간의 융합 단백질에 잠재적 절단 부위(프로테아제에 대한 특이적 인식 부위)를 포함시키는 것이 바람직하다. 적절한 절단 부위로는 특히, 생물정보학 도구를 이용하여 쉽게 결정할 수 있는 것과 같은, 하이드로포빈 부분에도 융합 파트너 부분에도 존재하지 않는 펩티드 서열이 있다. 예를 들어, 메티오닌에 대한 BrCN 절단, 또는 Xa 인자, 엔테로키나제 절단, 트롬빈, TEV(담배 식각 바이러스 프로테아제) 절단을 이용한 프로테아제 매개 절단이 특히 적절하다.

DNA 및 폴리펩티드 서열의 서열명을 표시한 서열 목록

dewA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 1
dewA 폴리펩티드 서열	서열 번호 2
rodA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 3
rodA 폴리펩티드 서열	서열 번호 4
hypA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 5
hypA 폴리펩티드 서열	서열 번호 6
hypB DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 7
hypB 폴리펩티드 서열	서열 번호 8
sc3 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 9
sc3 폴리펩티드 서열	서열 번호 10
basf1 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 11
basf1 폴리펩티드 서열	서열 번호 12
basf2 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 13
basf2 폴리펩티드 서열	서열 번호 14
yaad DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 15
yaad 폴리펩티드 서열	서열 번호 16
yaae DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 17
yaae 폴리펩티드 서열	서열 번호 18
yaad-Xa-dewA-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 19
yaad-Xa-dewA-his 폴리펩티드 서열	서열 번호 20
yaad-Xa-rodA-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 21
yaad-Xa-rodA-his 폴리펩티드 서열	서열 번호 22
yaad-Xa-basf1-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 23
yaad-Xa-basf1-his 폴리펩티드 서열	서열 번호 24

다층 복합체

다층 복합체는 다양한 목적으로, 예를 들어 포장 수단(특히 복합 필름) 또는 자체 접착성 물품(적어도 지지체와 접착제층을 포함하는 다층 복합체)으로서 이용된다.

상기 다층 복합체는 적어도 2층, 바람직하게는 2∼5층을 포함하며, 개개의 층은 그 두께가 예를 들어 0.01∼5 mm일 수 있다. 개개의 층은 천연 또는 합성 중합체 또는 다른 금속으로 구성될 수 있다. 상기 층은 구체적으로 중합체 필름, 종이, 금속 호일, 금속 처리된 중합체 필름 등이다.

상기 폴리펩티드는 다층 복합체의 2 이상의 인접 층 사이의 접착 촉진제로서 이용된다. 바람직하게는, 상기 인접 층 중 적어도 하나는 천연 또는 합성 중합체로 된 층이다. 적절한 중합체로는 구체적으로 중축합물, 예컨대 폴리에스테르, 중부가생성물, 예컨대 폴리우레탄, 폴리아미드, 폴리카르보네이트 또는 폴리페닐렌 에테르 또는 폴리페닐렌 설파이드 또는 에틸렌계 불포화 화합물의 자유 라디칼 또는 이온 중합으로 얻을 수 있는 중합체(자유 라디칼 중합체로 약칭함)가 있다. 상기 자유 라디칼 중합체는 바람직하게는 60 중량% 이상, 특히 바람직하게는 80 중량% 이상의, C₁-C₂₀ 알킬(메트)아크릴레이트, 최대 20개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산의 비닐 에스테르, 탄소 원자수가 최대 20개인 비닐 방향족 화합물, 에틸렌계 불포화 니트릴, 비닐 할라이드, 탄소 원자수가 1∼10개인 알코올의 비닐 에테르, 탄소 원자수가 2∼8개이고 1개 또는 2개의 이중 결합을 갖는 지방족 탄화수소, 특히 에틸렌 및 프로필렌으로부터 선택된 "주 단량체"로 구성된다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 특히 비극성 중합체를 위한 접착 촉진제로서 적합하며, 따라서, 인접한 층들 중 적어도 하나는 비극성 중합체로 구성되는 것이 바람직하다.

중합체 극성의 척도는 공기 중에서의(21℃) 표면 장력이다. 표면 장력이 작을수록 중합체의 극성이 커진다.

따라서, 인접한 층들 중 적어도 하나는 표면 장력이 50 mN/m(밀리뉴턴/미터) 미만, 특히 40 mN/m 미만인 비극성 중합체로 구성되는 것이 바람직하다. 상기 유형의 비극성 중합체의 예로는 폴리아미드 66(42.5 mN/m), 폴리스티렌(43.5 mN/m), PVC(38.4 mN/m), 폴리에틸렌(36.1 mN/m), 폴리프로필렌(29 mN/m) 또는 폴리테트라플루오로에탄(22.5 mN/m)이 있다.

인접한 두 층이 상기 비극성 중합체로 구성되는 것이 특히 바람직하다.

접착 촉진에 필요한 폴리펩티드의 양은 일반적으로 0.01∼1,000 mg(밀리그램/m²(평방 미터))이며, 특히 0.01∼100 mg/m²이고, 특히 바람직하게는 0.1∼10 mg/m²이다.

상기 폴리펩티드는 두 개의 인접 층 중 어느 하나에 도포할 수 있으며, 대안으로, 두 층이 미리 형성되었다면 두 층에 도포할 수도 있다.

상기 폴리펩티드는 수용액 형태인 것이 바람직하며, 상기 용액의 폴리펩티드 함량은 물 100 중량부를 기준으로 폴리펩티드 0.01∼5 중량부인 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 사용하기 위해서는, 상기 용액을 물 100 ㎖당 1∼10,000 ㎍, 특히 물 100 ㎖당 10∼1,000 ㎍의 농도로 추가 희석하는 것이 바람직하다.

따라서 도포에 이어 먼저 건조 공정을 수행하여 물을 제거할 수 있다.

이어서, 두 개의 인접 층을 통상의 방법으로, 예를 들어 적층법으로 접합시킬 수 있다.

특히 상기 폴리펩티드를 특히 인접 층 중 하나(제1 층)에 도포하고, 그 후 중합체 분산액, 중합체 용액 또는 무용매 중합체를, 접착 촉진체가 제공된 제1 층에 도포한 뒤 필름 형성 및/또는 열 또는 광화학적 경화를 수행함으로써, 다른 한 쪽의 인접 층(제2 층)을 제조할 수 있다. 이를 위해, 상기 중합체는 특히 수분산액 또는 수용액 형태이며, 특히 바람직하게는 에멀션 중합체의 수분산액, 바람직하게는 상기 자유 라디칼 중합체 중 어느 하나의 수분산액이다. 중합체를 도포한 후, 필요에 따라 건조 공정을 수행한다.

코팅된 기재

기재는 매우 다양한 목적을 위해 코팅된다. 특히 장식 코팅 또는 보호 코팅(일반명: 코팅) 또는 기타 접착 코팅을 들 수 있으며, 상기 접착제는 그 자체로 기재에 도포하거나, 예를 들어 자체 접착성 물품(라벨 또는 접착 테이프)의 형태로 기재에 접합할 수 있다.

기재 또는 기재 표면은 임의의 재료로 구성될 수 있다. 마찬가지로, 코팅 또는 코팅의 기재측 표면 역시 임의의 재료로 구성될 수 있다.

바람직하게는, 상기 기재 표면 또는 코팅, 또는 코팅의 기재측 표면은 천연 또는 합성 중합체로 구성된다.

적절한 중합체로는 구체적으로 중축합물, 예컨대 폴리에스테르, 중부가생성물, 예컨대 폴리우레탄, 폴리아미드, 폴리카르보네이트 또는 폴리페닐렌 에테르 또는 폴리페닐렌 설파이드, 또는 에틸렌계 불포화 화합물의 자유 라디칼 또는 이온 중합으로 얻을 수 있는 중합체(자유 라디칼 중합체로 약칭함)가 있다.

자유 라디칼 중합체의 구조 및 이들의 주 단량체 함량에 대해서는 전술한 설명이 적용된다.

본 발명의 폴리펩티드는 특히 비극성 중합체를 위한 접착 촉진제로서도 적합하다. 따라서, 적어도 기재 표면 또는 코팅의 기재측 표면은 비극성 중합체로 구성되는 것이 바람직하다.

극성의 척도로서의 접촉각에 대해서는, 역시 전술한 설명이 적용된다.

기재 표면과 코팅의 기재측 표면 둘 다 상기 비극성 중합체로 구성되는 것이 특히 바람직하다.

접착 촉진에 필요한 폴리펩티드의 양은 전술한 양에 상당하는 양이다.

상기 폴리펩티드는 기재 표면, 코팅의 기재측 표면 또는 둘 다에 도포될 수 있다. 상기 코팅이 사전 형성되었다면, 즉, 단순한 필름 또는 다층 복합체(상기 참조)를 기재에 도포할 것이라면, 코팅의 기재측 표면에의 도포도 가능하다.

상기 폴리펩티드는 수용액 형태인 것이 바람직하고, 상기 용액의 함량은 전술한 바와 같다.

따라서, 도포 후, 먼저 건조 공정을 수행하여 물을 제거할 수 있다.

상기 코팅은 통상의 방법으로 기재에 도포할 수 있으며, 그 위에, 예를 들어 필름 또는 다층 복합체를 적층할 수 있다.

특히, 상기 코팅은 중합체 분산액, 중합체 용액 또는 무용매 중합체를 접착 촉진제가 제공된 기재측 표면에 도포하고, 이어서 필름 형성 및/또는 열 또는 광화학적 경화를 수행하여 제조할 수 있다. 이를 위해, 상기 중합체는 특히 수분산액 또는 수용액 형태이며, 특히 바람직하게는 에멀션 중합체, 바람직하게는 전술한 자유 라디칼 중합체 중 어느 하나의 수분산액 형태이다. 중합체를 도포한 후, 필요에 따라 건조 공정을 수행한다.

본 발명의 다층 복합체 및 코팅된 기재는 현저히 증가된 강도를 갖는다. 상기 폴리펩티드를 접착 촉진제로서 사용하면, 기재에 대한 코팅의 접착력이 더 강해지고, 다층 복합체의 개개의 층들의 서로에 대한 접착력이 우수하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 기재는 금속이다. 원칙적으로, 상기 기재는 임의의 금속일 수 있다. 그 예로는 철, 강철, 아연, 주석, 알루미늄, 구리 및 상기 금속끼리의 합금 및 상기 금속과 다른 금속의 합금을 들 수 있다. 이것들은 특히 강철, 아연 도금 강철, 아연 합금, 알루미늄 또는 알루미늄 합금일 수 있다. 아연 또는 아연 합금 또는 이것들이 도금된 기재, 예를 들어 아연 도금 강철이 특히 바람직하다.

Zn 또는 Al 합금은 당업자에게 알려져 있다. 당업자라면 원하는 사용 목적에 따라 합금 성분의 종류 및 양을 선택할 수 있다. 아연 합금의 대표적인 성분으로는 구체적으로 Al, Pb, Si, Mg, Sn, Cu 또는 Cd를 들 수 있다. 알루미늄 합금의 대표적인 성분으로는 구체적으로 Mg, Mn, Si, Zn, Cr, Zr, Cu 또는 Ti를 들 수 있다. 상기 합금은 또한 거의 동일한 양의 Al 및 Zn을 포함하는 Al/Zn 합금일 수 있다. 상기 종류의 합금으로 도금된 강철은 시판된다.

상기 금속은 임의의 형상일 수 있으나, 금속 호일, 금속 스트립 또는 금속 시트가 바람직하다. 상기 금속은 또한 금속 표면을 갖는 복합 재료일 수 있다. 이것은, 예를 들어 중합체 필름과 금속의 복합체일 수 있다.

금속 표면은, 접착 촉진제로서, 본 발명에 따라 사용되는 폴리펩티드, 바람직하게는 하이드로포빈으로 코팅된다. 이것은 상기 폴리펩티드의 수용액을 사용하여 수행할 수 있다. 코팅법에 관한 상세 사항은 이미 앞서 기술하였다.

상기 코팅은 구체적으로 금속 표면의 코팅을 위한 전형적인 페인트 또는 페인트 시스템일 수 있다. 이것들은 열 경화, 광화학적 경화 또는 다른 방식으로 경화되는 페인트일 수 있다.

금속 표면 코팅용의 전형적 페인트는 1종 이상의 결합제와 가교성 성분을 포함한다. 상기 가교성 성분은 결합제에 더하여 이용되는 가교제일 수 있거나 또는 결합제에 연결된 가교성 기일 수 있다. 상기 결합제는 물론 가교성 기를 보유할 수 있으며, 가교제가 추가로 이용될 수 있다. 이 경우, 가능한 다양한 조합이 고려될 수 있다. 예를 들어, 결합제 및 가교제는 서로 독립적으로 이용될 수 있다. 이 경우 상기 결합제는 가교제 내의 상보성이며 반응성인 작용기와 반응할 수 있는 반응성 작용기를 포함한다. 대안으로, 그 종류의 기와("서로") 또는 동일한 중합체 상의 상보성이며 반응성인 작용기와 가교 결합을 수행할 수 있는 반응성 작용기를 포함하는 자체 가교성 결합제를 이용할 수 있다. 가교제가 그들끼리만 반응하는 것도 가능하다.

적합한 결합제의 예로는 (메트)아크릴레이트 (공)중합체, 부분 가수분해 폴리비닐 에테르, 폴리에스테르, 알키드 수지, 폴리락톤, 폴리카르보네이트, 폴리에테르, 에폭시드 수지-아민 부가생성물, 폴리우레아, 폴리아미드, 폴리이미드 또는 폴리우레탄을 포함한다. 물론, 다양한 중합체의 혼합물도, 이 혼합물이 임의의 원치 않는 효과를 발생시키지 않는다면, 사용할 수 있다.

가교 성분은 열 가교기 또는 광화학적 가교기를 보유할 수 있다. 적합한 열 가교제의 예로는 에폭시드, 멜라민 또는 블록형 이소시아네이트에 기초한 가교제가 있다. 광화학적 가교에 적합한 가교제로는 특히 다중 에틸렌계 불포화기를 갖는 화합물, 특히 이작용성 또는 다작용성 아크릴레이트가 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드, 바람직하게는 하이드로포빈의 사용은 기재에의 페인트의 접착력을 유리하게 향상시킨다. 부식 방지 테스트에서 페인트 층이 크리프 변형하는 것에 대한 저항성 역시 향상된다.

하기 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명하기 위한 것이다.

파트 A) 하이드로포빈의 제조

실시예 1

yaad-His ₆ /yaaE-His ₆ 의 클로닝을 위한 예비 작업

올리고뉴클레오티드 Hal570 및 Hal571(Hal 572/Hal 573)을 이용하여 폴리머 라제 연쇄 반응을 수행하였다. 이용된 주형 DNA는 박테리아 바실러스 섭틸리스의 게놈 DNA였다. 얻어진 PCR 단편은 바실러스 섭틸리스 yaaD/yaaE 유전자의 코딩 서열과, 각각의 경우에 그 말단에 위치한 NcoI 및 BglII 제한 절단 부위를 포함하였다. 상기 PCR 단편을 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BglII로 절단하였다. 이 DNA 단편을 삽입체로 사용하여, 퀴아젠으로부터 입수하여 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BglII로 미리 선형화한 벡터 pQE60으로 클로닝하였다. 이와 같이 하여 얻은 벡터 pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5를 각각 YAAD::HIS₆ 및 YAAE::HIS₆로 구성된 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

실시예 2

yaad 하이드로포빈 DewA-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 416 및 KaM 417을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 이용된 주형 DNA는 사상균 아스퍼질러스 니둘란스의 게놈 DNA였다. 얻어진 PCR 단편은 하이드로포빈 유전자 dewA의 코딩 서열 및 N-말단의 Xa 인자 프로테인아제 절단 부위를 포함하였다. 이 PCR 단편을 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 절단하였다. 이 DNA 단편을 삽입체로 사용하여, 제한 엔도뉴클레아제 BglII로 미리 선형화한 pQE60YAAD#2 벡터로 클로닝하였다.

이와 같이 하여 얻은 벡터 #508은 YAAD::Xa::dewA::HIS₆로 구성된 융합 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

실시예 3

yaad 하이드로포빈 RodA-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 434 및 KaM 435를 이용하여, 플라스미드 #513을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC

KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

실시예 4

yaad 하이드로포빈 BASF1-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 이용하여, 플라스미드 #507을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 이용된 주형 DNA는 인공적으로 합성된 DNA 서열 - 하이드로포빈 BASF1(첨부물 참조)이었다.

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

실시예 5

yaad 하이드로포빈 BASF2-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 이용하여, 플라스미드 #506을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 이용된 주형 DNA는 인공적으로 합성된 DNA 서열 - 하이드로포빈 BASF2(첨부물 참조)였다.

KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

실시예 6

yaad 하이드로포빈 SC3-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM464 및 KaM465를 이용하여, 플라스미드 #526을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.

이용된 주형 DNA는 스키조필럼 커뮨 cDNA(첨부물 참조)였다.

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC

KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

실시예 7

재조합 이. 콜라이 균주 yaad 하이드로포빈 DewA-His ₆ 의 발효

15 ㎖ 그라이너 튜브에서, LB 액상 배지 3 ㎖에, yaad 하이드로포빈 DewA-His₆를 발현하는 이. 콜라이 균주를 접종하였다. 37℃, 200 rpm의 진탕기에서 8 시간 동안 배양하였다. 각 경우, 배플이 구비되어 있고 LB 배지(100 ㎍/㎖의 암피실 린 함유) 250 ㎖를 포함한 2개의 1 ℓ 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에, 사전 배양물 1 ㎖를 접종하여, 37℃, 180 rpm의 진탕기에서 9 시간 동안 배양하였다. 20 ℓ 용량의 발효기에서, LB 배지(100 ㎍/㎖의 암피실린 함유) 13.5 ℓ에, 사전 배양물 0.5 ℓ(OD_{600 nm} 1:10, H₂O에 대하여 측정)를 접종하였다. OD_{60 nm} 약 3.5에서 100 mM IPTG 140 ㎖를 첨가하였다. 3 시간 후, 발효기를 10℃로 냉각시키고, 원심분리로 발효액을 제거하였다. 세포 펠릿을 추가 정제에 사용하였다.

실시예 8

재조합 하이드로포빈 융합 단백질의 정제(C-말단 His ₆ 태그를 보유하는 하이드로포빈 융합 단백질의 정제)

세포 펠릿 100 g(하이드로포빈 100∼500 mg)에, 총 부피 200 ㎖가 되도록 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5)을 첨가하여 재현탁시켰다. 이 현탁액을 울트라투락스(Ultraturrax) 타입 T25(Janke and Kunkel; IKA-Labortechnik)로 10분 동안 처리하고, 이어서 핵산의 분해를 위해, 벤조나제(Merck, Darmstadt; 주문 번호 1.01697.0001) 500 유닛과 함께 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 파괴하기 전에, 유리 카트리지(P1)를 사용하여 여과를 행하였다. 세포 파괴와 잔류 게놈 DNA의 전단을 위해, 1500　바에서 균질화기를 이용한 처리를 2회 행하였다(Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). 균질물을 원심분리하고(Sorvall RC-5B, GSA 로터, 250 ㎖ 원심분리용 비커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000　g), 상청액을 얼음 위에 놓고, 펠릿을 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 100 ㎖에 재현탁시켰다. 원심분리 및 재현탁은 3회 반복하였으며, 3 회차에 사용된 인산나트륨 완충액은 1% SDS를 포함하였다. 재현탁 후, 상기 용액을 1 시간 동안 교반하고, 이어서 최종 원심분리(Sorvall RC-5B, GSA 로터, 250 ㎖ 원심분리용 비커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000 g)를 행하였다. SDS-PAGE 분석에 의하면, 하이드로포빈은 최종 원심분리 후 상청액에 존재하였다(도 1). 이 실험은 하이드로포빈이 해당 이. 콜라이 세포 내에 아마도 봉입체 형태로 존재함을 보여준다. 하이드로포빈 함유 상청액 50 ㎖를, 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 평형화시킨 50　㎖ 니켈-세파로스 고성능 17-5268-02 컬럼(Amersham)에 적용하였다. 이 컬럼을 50　mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 세척하고, 그 후 하이드로포빈을 200 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 용출시켰다. 이미다졸의 제거를 위해, 용액을 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)에 대해 투석하였다.

도 1은 제조된 하이드로포빈의 정제 상태를 도시한다:

레인 1: 니켈-세파로스 컬럼에 적용된 용액(1:10 희석)

레인 2: 통과액(flow-through) = 세척 단계의 용출액

레인 3∼5: 용출 분획의 OD₂₈₀ 피크

도 1의 하이드로포빈은 분자량이 약 53 kD이었다. 작은 밴드 중 몇 개는 하이드로포빈의 분해 생성물을 나타낸다.

실시예 9

성능 테스트: 유리 위 물방울의 접촉각 변화에 의한 하이드로포빈의 특성 분 석

기재:

유리(창문 유리, 독일 만하임 소재의 Sueddeutsche Glas):

하이드로포빈 농도: 100 ㎍/㎖

50 mM 아세트산나트륨(pH 4) + 0.1% Tween 20 중에서, 유리 슬라이드를 밤새 항온처리하고(온도 80℃), 이어서 코팅을 증류수로 세척하고, 이어서 80℃에서 증류수 중 1% SDS 용액 중에서 10분 동안 항온처리한 후 증류수로 세척하였다.

시험편을 공기 건조시키고, 5 ㎕ 물방울의 접촉각(단위: ˚)을 측정하였다.

접촉각 측정은 Dataphysics Contact Angle System OCA 15+ 장치에서 소프트웨어 SCA 20.2.0.(2002년 11월)을 사용하여 행하였다. 측정은 제조업자의 설명서에 따라 행하였다.

미처리 유리의 경우 접촉각이 30±5˚였고, 실시예 8의 기능성 하이드로포빈(yaad-dewA-his₆)으로 코팅된 유리의 경우 접촉각이 75±5˚였다.

파트 B) 접착 촉진제로서의 하이드로포빈의 용도

실시예 10

폴리에틸렌 기재

사용된 재료:

사용된 용액:

성능 실험에, 실시예 8에 따라 제조된 융합 단백질의 수용액, 즉 yaad-Xa-dewA-his(서열 번호 19)의 수용액을 이용하였다. 용액 중 하이드로포빈의 농도는 100　㎍/㎖(0.01 중량%)였다.

기재: 폴리에틸렌의 성형체(소형 플레이트)

코팅:

폴리에스테르 필름을 BASF로부터 입수한, 시판되는 감압 접착제용 수성 폴리아크릴레이트 분산물 Acronal A240으로 코팅하고, 건조시키고, 폭 2.5 cm의 스트립으로 절단하였다. 얻어진 접착제 스트립을 소형 PE 플레이트의 코팅에 사용하였다.

절차:

폴리펩티드 용액을 폴리에틸렌 플레이트에 도포하고 건조시켰다(전처리된 폴리에틸렌 플레이트).

그 후, 전처리된 플레이트와, 비교를 위한, 미처리 폴리에틸렌 플레이트에 접착제 스트립을 접착시키고, 접착제 스트립을 분리하는 데 필요한 힘을 측정하였다[박리 강도(N)].

접착 촉진제로서 폴리펩티드를 이용한 경우의 박리 강도: 4.7 N

접착 촉진제로서 폴리펩티드를 이용하지 않은 경우의 박리 강도: 2.6 N

실시예 11

금속 기재

성능 실험에, 실시예 8에 따라 제조된 융합 단백질의 수용액, 즉 yaad-Xa-dewA-his(서열 번호 19)의 수용액을 이용하였다. 용액 중 하이드로포빈의 농도는 100　㎍/㎖(0.01 중량%)였다. pH에 대한 정보가 있는가? 완충액을 추가로 첨가하지 않았다면, pH가 8∼8.5가 되어야 한다.

하기 테스트 시트를 금속 기재로서 이용하였다.

번호	기재
실시예 11-1	강철 (타입 ST2(재료 번호 1.0330))
실시예 11-2	아연 도금 강철 (sendzimir 아연 도금 강철 시트 GARDOBOND OE HDG/2(Chemetall))
실시예 11-3	알루미늄 (AlMgSi AA6016 GARDOBOND 미처리(Chemmetal))

사용된 페인트는 알키드 멜라민을 주성분으로 하는 베이킹 톱코트였다(이것이 페인트의 특성을 충분히 설명하는가?).

실험에 관한 설명

알루미늄 시트를 알칼리 세정 침지 배스(60 g/ℓ의 NaOH, 60℃, 1분)에서 피클링(pickling)하고 증류수로 헹구었다. 그 후 이 시트를 HNO₃/H₂O(1:1)로 실온에서 15초 동안 산성 디스케일링 배스에서 디스케일링하고, 증류수로 헹구고, 가압 공기로 송풍 건조시켰다.

아연 도금 강철 시트 및 강철 시트를 고온의 흐르는 물로 헹구고, 그 후 증류수로 헹구어, 가압 공기로 송풍 건조시켰다.

이 시트를 각각의 경우에 실온에서 전술한 용액에 침지하여 하이드로포빈으로 코팅하였다. 알루미늄 시트는 16 시간 동안 침지하였으며, 아연 도금 강철 시트 및 강철 시트는 4 시간 동안 침지하였다. 그 후, 이 시트를 증류수로 헹구고 가압 공기로 송풍 건조시켰다.

하이드로포빈을 접착 촉진제로 하여 코팅한 후, 상기 시트를 플라스틱 용기 내의 알키드 멜라민을 주성분으로 하는 베이킹 톱코트에 15초 동안 침지하고, 공기 중에서 약 1 시간 동안 예비 건조시켰다. 이에 이어, 상기 시트를 190℃의 건조 오븐에서 30분 동안 건조시키고 경화시켰다.

비교를 위해, 각각의 경우에, 하이드로포빈 접착 촉진제 없이 상기 페인트를 사용하여 동일한 방식으로 추가 시험편을 제조하였다.

성능 테스트

시트의 성능은 EN ISO 2409(크로스컷), EN ISO 4628-8(크리프) 및 DIN 53156(에릭슨 커핑)으로 평가하였다.

크로스컷 테스트는 표면으로 크로스컷을 절단한 후 소정의 표준 물질을 기준으로 페인트 표면의 외관을 평가한다. 이 테스트는 크로스컷의 형성으로 인해 페인트가 표면으로부터 박리되는 정도를 평가하는 것을 포함한다. 이 평가는 0∼5의 등급을 이용하여 공지된 방식으로 수행하며, 등급 0은 최상의 점수이고 등급 5는 최하의 점수이다.

페인트 층의 크리프는 시트의 표준 부식 테스트[염 분사 챔버에서 노출(SS DIN 50021)]로 측정한다. 각각의 경우에 소정의 표준 물질을 기준으로 하고 0∼5의 등급을 이용하여(등급 0은 최상의 점수이고 등급 5는 최하의 점수임), 알루미늄 시트의 크리프는 298 시간 후에, 강철 시트의 크리프는 50 시간 후에, 아연 도금 강철 시트의 크리프는 190 시간 후에 평가하였다.

에릭슨 커핑은 시험편의 뒷면에 볼을 가압하여 함몰부를 형성하는 것을 포함 한다. 소정의 표준 물질을 기준으로 마크에서의 페인트의 외관을 평가하며, 이 경우 등급 5는 최상의 점수이고 등급 0은 최하의 점수이다.

성능 테스트의 결과는 하기에 요약하였다.

실시예 11-1: 강철 기재

하이드로포빈을 접착 촉진제로서 사용한 경우, 하이드로포빈 비함유 시험편과 비교하여 크리프에 변화가 없었다(등급 5). 각각의 경우에, 크로스컷 테스트(작은 값) 및 에릭슨 커핑 테스트(큰 값)는 우수한 결과를 산출하였다.

실시예 11-2: 아연 도금 강철 기재

아연 도금 강철에 접착 촉진제로서 하이드로포빈을 사용한 경우, 3 경우 모두에서 접착 촉진제를 사용하지 않은 경우에 비해 우수한 값을 산출하였다(크로스컷 및 크리프의 경우 작은 값, 에릭슨 커핑의 경우 큰 값). 부식 방지 보전성(크리프)도 확실히 개선되었다(접착 촉진제를 사용한 경우 등급 1, 이에 반해 접착 촉진제를 사용하지 않은 경우 등급 4).

실시예 11-3: 알루미늄 기재

알루미늄 시트의 경우, 접착 촉진제를 사용하지 않은 경우에도 크로스컷 및 크리프가 우수하였다. 에릭슨 커핑은 약간 개선되었다.

SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Recombinant preparation of hydrophobins <130> AE 20040837 <160> 24 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 405 <212> DNA <213> basf-dewA <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <223> <400> 1 atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48 Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96 Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30 gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144 Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45 atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192 Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60 agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80 ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt 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100 105 110 Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125 Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135 <210> 3 <211> 471 <212> DNA <213> basf-rodA <220> <221> CDS <222> (1)..(471) <223> <400> 3 atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48 Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96 Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30 ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144 Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45 acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct 192 Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser 50 55 60 tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240 Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80 ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt 288 Gly Leu 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Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile 290 295 300 Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro 305 310 315 320 Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala 325 330 335 Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys 340 345 350 Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 355 360 365 Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys 370 375 380 Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp 385 390 395 400 His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro 405 410 415 Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr 420 425 430 Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His 435 440 <210> 21 <211> 1395 <212> DNA <213> basf-yaad-Xa-rodA-his <220> <221> CDS <222> (1)..(1395) <223> <400> 21 atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg 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432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc gcg gcc ctc cct 960 Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt ggc aac aag ggc 1008 Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335 aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc aag cag 1056 Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln 340 345 350 gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc aac aag 1104 Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365 gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt ctg tct 1152 Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380 ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa ggt ctt 1200 Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400 ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc att ggc 1248 Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly 405 410 415 atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc 1296 Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430 cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt ctc 1344 Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445 cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc gga tct cat cac cat cac cat 1392 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460 cac 1395 His 465 <210> 22 <211> 465 <212> PRT <213> basf-yaad-Xa-rodA-his <400> 22 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335 Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln 340 345 350 Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365 Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380 Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400 Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly 405 410 415 Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430 Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460 His 465 <210> 23 <211> 1407 <212> DNA <213> basf-yaad-Xa-BASF1-his <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <223> <400> 23 atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct 960 Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc 1008 Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335 cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc 1056 Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly 340 345 350 gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc gac 1104 Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365 gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc ctc aag aac 1152 Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380 ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc ttc gac cag 1200 Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln 385 390 395 400 tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc cct atc cag 1248 Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln 405 410 415 gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc 1296 Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 420 425 430 tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 1344 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445 ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tct cat 1392 Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460 cac cat cac cat cac 1407 His His His His His 465 <210> 24 <211> 469 <212> PRT <213> basf-yaad-Xa-BASF1-his <400> 24 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335 Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly 340 345 350 Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365 Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380 Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln 385 390 395 400 Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln 405 410 415 Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 420 425 430 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445 Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460 His His His His His 465

Claims

복합체의 2개 이상의 인접 층 사이 또는 코팅과 기재 사이의 접착 촉진제로서 40 중량% 이상이 펩티드 결합을 통해 연결된 알파-아미노산으로 구성되는 화합물(이하, "폴리펩티드"라 약칭함)을 포함하는 다층 복합체 또는 코팅된 기재.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 80 중량% 이상이 알파-아미노산으로 구성되는 것인 다층 복합체 또는 코팅된 기재.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 시스테인을 성분으로서 포함하는 것인 다층 복합체 또는 코팅된 기재.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 0.5 중량% 이상의 시스테인으로 구성되는 것인 다층 복합체 또는 코팅된 기재.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 하기 일반식 (I)의 하이드로포빈인 다층 복합체 또는 코팅된 기재:

X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m (I)

(상기 식에서, X는 각 경우에 동일하거나 상이할 수 있고 20개의 천연 아미 노산(Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) 중 어느 하나일 수 있으며, X 다음에 표시된 지수는 각 경우에 아미노산의 수를 나타내고, C는 시스테인, 알라닌, 세린, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이며, C로 표시되는 잔기 중 적어도 4개는 시스테인이고, 또한 지수 n 및 m은 서로 독립적으로 0∼500, 바람직하게는 15∼300의 자연수임).
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 층 중 적어도 하나는 천연 또는 합성 중합체로 구성되는 것인 다층 복합체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 층 중 적어도 하나는 표면 장력이 50 mN/m 미만인 (비극성) 합성 중합체로 구성되는 것인 다층 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인접한 두 층이 천연 또는 합성 중합체로 구성되는 것인 다층 복합체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 층 중 하나는 금속 또는 합금으로 구성되는 것인 다층 복합체 또는 코팅된 기재.
제9항에 있어서, 인접 층이 페인트 층인 다층 복합체.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 금속은 강철, 아연 도금 강철, 아연 합금, 알루미늄 또는 알루미늄 합금으로 구성된 군에서 선택되거나 알루미늄 또는 알루미늄 합금인 다층 복합체.
- 인접 층 중 하나에 폴리펩티드를 도포하고,

- 상기 폴리펩티드를 수용액 형태로 도포하였을 경우, 필요에 따라 건조 공정을 수행하고,

- 그 후, 다른 한 쪽의 인접 층을 그 위에 적층하거나, 천연 또는 합성 중합체 필름의 형성을 통해 제조하는 것인 다층 복합체의 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 다른 한 쪽 층의 천연 또는 합성 중합체는 수용액 또는 수분산액 형태이고, 필름이 형성된 후에 건조 공정을 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재 표면 또는 상기 코팅의 기재측 표면은 천연 또는 합성 중합체로 구성되는 것인 코팅된 기재.
제1항 내지 제5항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재 표면 또는 상기 코팅의 기재측 표면은 표면 장력이 50 mN/m 미만인 (비극성) 합성 중합체로 구성되는 것인 코팅된 기재.
제1항 내지 제5항, 제14항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재 표면 또는 상기 코팅의 기재측 표면은 천연 또는 합성 중합체로 구성되는 것인 코팅된 기재.
제1항 내지 제5항 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 코팅된 기재의 제조 방법으로서,

- 폴리펩티드를 기재 표면 또는 코팅제의 기재측 표면에 도포하고,

- 상기 폴리펩티드를 수용액 형태로 도포하였을 경우, 필요에 따라 건조 공정을 수행하고,

- 그 후, 상기 코팅제를 상기 기재에 도포하는 것인 방법.
제17항에 따른 코팅된 기재의 제조 방법으로서,

- 폴리펩티드를 기재 표면에 도포하고,

- 상기 폴리펩티드를 수용액 형태로 도포하였을 경우, 필요에 따라 건조 공정을 수행하고,

- 그 후, 상기 기재 표면에 천연 또는 합성 중합체의 필름을 형성함으로써 상기 코팅을 제조하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 천연 또는 합성 중합체는 수용액 또는 수분산액 형태이고, 필름이 형성된 후에 건조 공정을 수행하는 것인 방법.
제13항 또는 제19항에 있어서, 상기 수용액 또는 수분산액은 에멀션 중합체의 수분산액인 방법.
다층 복합체의 2개 이상의 인접 층 사이 또는 코팅과 코팅된 기재의 기재 사이의 접착 촉진제로서의, 40 중량% 이상이 펩티드 결합을 통해 연결된 알파-아미노산으로 구성되는 화합물("폴리펩티드"라 약칭함)의 용도.