JP2008534554A - 乳化破壊剤としての蛋白質の使用 - Google Patents

Abstract

発明は少なくとも２種の液相を含む組成物中の相分離を改善するための少なくとも1種の蛋白質、具体的には少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体の使用と、少なくとも２種の液相を有する組成物中の少なくとも２種の液相の分離法と、燃料、可燃物、原油または水溶性または油溶性ポリマー溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物と、少なくとも1種の蛋白質、具体的には少なくとも1種のハイドロフォビンまたはその誘導体を含む配合物とに関する。
【選択図】なし

Description

本発明は少なくとも２種の液相を含む組成物中の相分離を改善するための、少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体の使用方法と、少なくとも２種の液相を含む組成物中で少なくとも２種の液相を相分離する方法と、燃料、可燃物、原油または水溶性または油溶性ポリマー溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物と、少なくとも1種のハイドロフォビンまたはその誘導体とを含む配合物に関する。

ハイドロフォビンは約１００〜１５０アミノ酸の小さな蛋白質であり、例えばＳｃｈｉｚｏｐｈｉｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ等の糸状菌に特徴的である。一般にそれらの蛋白質は８個のシステイン単位を有する。

ハイドロフォビンは界面に対し著しい親和性を示し、従って両親媒性膜を形成することにより界面の性質を変化させるために表面を被覆するために適している。従って、例えばテフロン（登録商標）をハイドロフォビンで被覆し、親水性表面を得ることができる。ハイドロフォビンは天然源から単離することができる。ハイドロフォビンおよびその誘導体を調製する方法もまた公知である。例えば、ＤＥ １０ ２００５ ００７ ４８０．４はハイドロフォビンおよびその誘導体を調製する方法を開示している。

従来技術は、様々な用途のためにハイドロフォビンを使用することを提案している。

ＷＯ９６／４１８８２は疎水性表面の親水化、親水性基質の耐水性の改善または水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョンの調製のために、ハイドロフォビンを乳化剤、増粘剤、または清浄剤として使用することを提案している。この文献はまた、軟膏またはクリームの調製等の医薬品としての応用、および皮膚の保護またはヘアーシャンプーまたはヘアーリンスの調整等の化粧品への応用を提案している。これに加えて、ＷＯ９６／４１８２２は組成物、具体的にはハイドロフォビンを含む医薬用途の組成物を特許請求している。

ＥＰ−Ａ１２５２５１６は窓、コンタクトレンズ、バイオセンサー、医療器具、実験用または保存用の受器、シップホールド、固体粒子、フレームまたは乗用車ボディーを３０〜８０℃の温度でハイドロフォビンを含む溶液によって被覆することを開示している。

ＷＯ０３／５３３８３は化粧品用途への応用においてケラチンを処理するためにハイドロフォビンを使用することを開示している。

ＷＯ０３／１０３３１はハイドロフォビンが界面活性を示すことを開示している。従って、この文献は例えばハイドロフォビンで被覆され、例えば電気活性物質、抗体または酵素等の他の物質が共有結合した測定電極等のセンサーを開示している。

ＷＯ２００４／０００８８０はまた、ハイドロフォビンまたはハイドロフォビン様物質による表面被覆を開示している。さらに、ハイドロフォビンを添加することにより水中油または油中水エマルジョンが安定化できることを開示している。

ハイドロフォビン様蛋白質に関連するＷＯ０１／７４８６４はまた、これらの蛋白質を分散物およびエマルジョンの安定化に使用し得ることを開示している。

蛋白質を相分離のために使用することは原理的に公知である。

ＧＢ１９５，８７６はコロイドを用いる油中水エマルジョンの破壊法を開示している。例として挙げたコロイドはゼラチン、カゼインおよびアルブミン等の蛋白質、またはアラビアゴムまたはトラガカントゴム等の多糖類である。

ＪＰ−Ａ１１−１６９１７７はリパーゼ活性を有する蛋白質をエマルジョン破壊のための使用方法を開示している。

ＷＯ０６／６０９１６は少なくとも1種の水溶性蛋白質、少なくとも1種の水溶性多糖およびポリエチレンオキサイド等の少なくとも1種の水溶性ポリマーからなり、原油の乳化破壊も含む異なる用途のための洗浄剤を含まない混合物を開示している。

引用した文献のいずれも、相分離のためのハイドロフォビンの使用方法を開示していない。

蛋白質の使用はそれらが天然起源の物質であり、生分解性であり、従って永久的な環境汚染を生じないという利点を有する。

多くの大規模工業用途、例えば原油／水エマルジョンを分離する場合は、相をできるだけ早く分離することが重要である。本発明の目的は、蛋白質を用いる相分離の改良法を提供することである。

本発明によれば、少なくとも２種の液相を有する組成物中に、相分離を改善するための少なくとも1種のハイドロフォビンを使用することにより、その目的が達成される。

これに関連して、本発明によれば少なくとも２種の液相を有する組成物中で相分離が改善される限り、原理的にハイドロフォビンを任意の量で用いることができる。

本発明の文脈において、「相分離を改善する」とは混合物にある物質とを添加した場合、２つの液相の分離がその物質を添加しない同じ混合物中よりより早く行われる、またはその物質を添加することにより２つの液相の分離がはじめて可能になることを意味すると理解される。

本発明の文脈の中では、ハイドロフォビンはまた、その誘導体または修飾ハイドロフォビンであると理解される。例えば、修飾または誘導体化ハイドロフォビンは、ハイドロフォビン融合蛋白質、またはハイドロフォビンの配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは９５％の同一性を示し、かつ５０％程度、例えば６０％程度、特に７０％程度、特に好ましくは８０％程度のハイドロフォビンの生物学的性質を満たすアミノ酸配列を有する蛋白質である。具体的には、ガラス表面を蛋白質で被覆する前後の水滴の接触角が少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、特に好ましくは少なくとも３０°増加する様に、これらの蛋白質で被覆することにより表面の性質が変化する。

驚くべきことに、ハイドロフォビンまたはその誘導体は少なくとも２種の液相の分離を改善することが見出された。

相分離を迅速に行わなければならない場合、またはエマルジョンの生成を阻止しなければならない場合、このことは特に有利である。これに関してごく少量でも有効である。既に存在するエマルジョンを破壊しなければならない場合も、この性質を同様に利用することができる。エマルジョンを破壊する化合物は乳化破壊剤とも呼ばれる。

従って、本発明は上記のような少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体の使用に関し、少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体が乳化破壊剤として用いられる。

これに関連して、ハイドロフォビンの配列特異性でなく、構造的特異性がハイドロフォビンを定義するために決定的に重要である。天然のハイドロフォビンのアミノ酸配列はきわめて多様であるが、それらは８個の保存性システイン残基のきわめて特徴的なパターンを有する。これらの残基は４個の分子内ジスルフィド架橋を形成する。

Ｎ末端とＣ末端は比較的広い範囲で可変である。１０〜５００個のアミノ酸の長さを有し、例えば当業者に公知の分子生物学的技術により見出される融合パートナーをこれらの末端に加えることができる。

これに加えて、類似の構造と同等の機能を有する蛋白質を、本発明の趣旨の範囲でハイドロフォビンおよびその誘導体であると理解しなければならない。

本発明の趣旨の範囲で、用語「ハイドロフォビン」は以下の一般構造式（Ｉ）のポリペプチドを指すと理解される。

Ｘ_n−Ｃ¹−Ｘ_1-50−Ｃ²−Ｘ_0-5−Ｃ³−Ｘ_1-100−Ｃ⁴−Ｘ_1-100−Ｃ⁵−Ｘ_1-50−Ｃ⁶−Ｘ_0-5−Ｃ⁷−Ｘ_1-50−Ｃ⁸−Ｘ_m （Ｉ）
ここでＸは任意の２０個の天然起源アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｙ）である。それぞれ、Ｘは同一であるか異なってもよい。式中、Ｘの指数はそれぞれアミノ酸数であり、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはトレオニンであり、Ｃで表される基の少なくとも４個はシステインであり、指数ｎおよびｍはそれぞれ独立に０〜５００、好ましくは１５〜３００の間の４つの自然数である。

式（Ｉ）によるポリペプチドはさらに、ガラス表面を被覆後、同じサイズの水滴が被覆されないガラス表面で形成する接触角と比較して、それぞれ室温で水滴の接触角を少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、特に好ましくは３０°増加させる性質を特徴とする。

Ｃ¹〜Ｃ⁸と名付けられたアミノ酸はシステインであることが好ましいが、同様な空間占有を示す他のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、トレオニン、メチオニンまたはグリシンで置き換えることができる。しかしながら、Ｃ¹〜Ｃ⁸位の少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも６個、特に好ましくは少なくとも７個がシステインを含む必要がある。本発明の蛋白質では、システインは還元状態で存在するか、または相互にジスルフィド架橋を形成し得る。

分子内Ｃ−Ｃ架橋の形成、特に１個、好ましくは２個、特に好ましくは３個、きわめて好ましくは４個の分子内ジスルフィド架橋の形成が特に好ましい。上記のシステインを類似の空間占有を有するアミノ酸に置換することに関連して、相互に分子内ジスルフィド架橋を形成し得るＣの位置は、対で置換することが有利である。

システイン、セリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはトレオニンがＸで表された位置に用いられる場合、一般式中の個々のＣ位置の番号付けをそれに対応して変えることができる。

式（ＩＩ）のハイドロフォビンを使用することが好ましい。

Ｘ_n−Ｃ¹−Ｘ_3-25−Ｃ²−Ｘ_0-2−Ｃ³−Ｘ_5-50−Ｃ⁴−Ｘ_2-35−Ｃ⁵−Ｘ_2-15−Ｃ⁶−Ｘ_0-2−Ｃ⁷−Ｘ_3-35−Ｃ⁸−Ｘ_m （ＩＩ）
ここで本発明を実施するために、Ｘ、ＣおよびＸおよびＣの指数は上記の意味を有し、指数ｎおよびｍは０〜３００の間の数であり、その蛋白質はさらに上記の接触角の変化を特徴とし、Ｃと名付けられた残基の少なくとも６個はシステインである。全てのＣ残基がシステインであることが特に好ましい。

式（ＩＩＩ）のハイドロフォビンを使用することが特に好ましい。

Ｘ_n−Ｃ¹−Ｘ_5-9−Ｃ²−Ｃ³−Ｘ_11-39−Ｃ⁴−Ｘ_2-23−Ｃ⁵−Ｘ_5-9−Ｃ⁶−Ｃ⁷−Ｘ_6-18−Ｃ⁸−Ｘ_m （ＩＩＩ）
ここでＸ、ＣおよびＸの指数は上記の意味を有し、指数ｎおよびｍは０〜２００の間の数であり、蛋白質はさらに上記の接触角の変化を特徴とし、Ｃと名付けられた残基の少なくとも６個はシステインである。全てのＣ残基がしステインであることが特に好ましい。

残基Ｘ_nおよびＸ_mは、天然でハイドロフォビンに結合するペプチド配列であり得る。しかしながら、１つまたは双方の残基がハイドロフォビンに天然で結合しないペプチド配列であってもよい。これは、ハイドロフォビン中で天然に存在するペプチド配列が、ハイドロフォビン中で天然に存在しないペプチド配列で延長されるＸ_nおよび／またはＸ_m残基を含むと理解すべきである。

Ｘ_nおよび／またはＸ_mがハイドロフォビン中において天然で結合しないペプチド配列である場合、これらの配列は一般に少なくとも２０、好ましくは少なくとも３５、特に好ましくは少なくとも５０、きわめて好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸の長さである。ハイドロフォビンに天然では結合しないこのような残基は、以下に述べる融合パートナーとも呼ばれる。従って、これは少なくとも1種のハイドロフォビン部分と、この形では天然に共存しない融合パートナー部分とで蛋白質を構成し得るという事実を表すことが意図されている。

融合パートナー部分は多数の蛋白質から選ぶことができる。いくつかの融合パートナーを１個のハイドロフォビン部分に結合する、例えばハイドロフォビン部分のアミノ末端（Ｘ_n）および炭素末端（Ｘ_m）に結合することも可能である。しかしながら、例えば２個の融合パートナーを本発明に記載の蛋白質の１つの位置（Ｘ_nまたはＸ_m）に結合することも可能である。

微生物、特に大腸菌または枯草菌に天然起源である蛋白質は、特に適した融合パートナーである。これらの融合パートナーの例は配列ｙａａｄ（配列番号１５および１６）、ｙａａｅ（配列番号１７および１８）およびチオレドキシンである。一部分のみ、例えば上記配列の７０〜９９％、好ましくは５〜５０％、特に好ましくは１０〜４０％を含む、または上記配列と比較して個々のアミノ酸またはヌクレオチドが変化している上記配列の断片または誘導体もきわめて適しており、ここでそれぞれの場合の百分率はアミノ酸の数を指す。

また別の好ましい実施形態では、グループＸ_nまたはＸ_mとしての融合パートナーに加えて、ハイドロフォビンの融合は親和性ドメイン（親和性タグ／親和性テール）と呼ばれるパートナーを示す。親和性ドメインは原理的に公知の方法で所与の相補性グループと相互作用可能で、蛋白質の仕上げと精製を簡単にするために使用し得るアンカリンググループである。このような親和性ドメインの例には（Ｈｉｓ）_k、（Ａｒｇ_k）_k、（Ａｓｐ）_k、（Ｐｈｅ）_kおよび（Ｃｙｓ）_kグループが含まれるが、ｋは一般に１〜１０の自然数である。親和性ドメインはｋが４〜６である（Ｈｉｓ）_kグループであることが好ましい。

本発明によるハイドロフォビンまたはその誘導体として使用される蛋白質のポリペプチド配列を、例えばグリコシル化またはアセチル化、または例えばグルタルアルデヒドを用いる化学架橋等により修飾することができる。

本発明により使用されるハイドロフォビンまたはその誘導体の性質の１つは、表面をその蛋白質で被覆した場合の表面の性質の変化である。例えば表面を蛋白質で被覆する前後の水滴の接触角を測定し、２つの測定の差を求めることにより、表面の性質の変化を実験的に求めることができる。

接触角の測定の原理的は当業者に公知である。測定は室温の５μｌの水滴に基づき、ガラス板を基板として使用する。例えば接触角を測定するために適した正確な実験条件は、実験の項に記載される。実験の項で特定した条件下で、本発明に従って用いられる融合蛋白質は、同じサイズの水滴が被覆されないガラス表面で生じるそれぞれの接触角と比較して、接触角を少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、特に好ましくは少なくとも３０°増加させる性質を有する。

本発明を実施するに特に好ましいハイドロフォビンは、以下の配列表に示す構造を特徴とするｄｅｗＡ、ｒｏｄＡ、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｓｃ３、ｂａｓｆ１、ｂａｓｆ２型のハイドロフォビンである。しかしながら、ハイドロフォビンはこれらのハイドロフォビンの一部のみ、またはそれらの誘導体であってもよい。同一または異なった構造のいくつかのハイドロフォビンの部分、好ましくは２個または３個の部分が相互に結合する、または天然ではハイドロフォビンと組関連付けられない対応する適切なポリペプチドと結合することも可能である。

括弧内に与えられるポリペプチド配列を有する融合蛋白質ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）またはｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ−ｈｉｓ（配列番号２４）の他、それらをコードする核酸配列、特に配列番号１９、２１および２３で示される配列も、本発明により特に適している。全てのアミノ酸の少なくとも１０個まで、好ましくは５個、特に好ましくは５％の置換、挿入または欠失による、配列番号２０、２２または２４で表されるポリペプチド配列由来であり、かつ出発蛋白質の少なくとも５０％の生物学的性質を残す蛋白質も、特に好ましい実施形態である。これと関連して、既に述べた様に蛋白質の生物学的性質が接触角で少なくとも２０°変化したものと理解される。

本発明の実施に特に適した誘導体は、ｙａａｄ融合パートナーを切り詰めることによるｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）またはｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）由来の残基である。２９４個のアミノ酸を含む完全なｙａａｄ融合パートナーの代わりに、切断ｙａａｄ残基を使用することが有利である可能性がある。しかしながら、切断残基は少なくとも２０、好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸を含む必要がある。例えば、２０〜２９３個、好ましくは２５〜２５０個、特に好ましくは３５〜１５０個、例えば３５〜１００個のアミノ酸を有する切断残基を使用し得る。

ハイドロフォビンと融合パートナーとの間、または融合パートナー間の開裂部位を、誘導体化されない形の純粋なハイドロフォビンを放出するために使用し得る（例えばメチオニン部位におけるＢｒＣＮ開裂、Ｘａ因子開裂、エンテロキナーゼ開裂、トロンビン開裂、ＴＥＶ開裂等により）。

１個の融合パートナー、例えばｙａａｄまたはｙａａｅから融合蛋白質、および異なった配列（例えばＤｅｗＡ−ＲｏｄＡ、Ｓｃ３−ＤｅｗＡ、Ｓｃ３−ＲｏｄＡ）を含む数個のハイドロフォビンを順次生成することも可能である。同様に、ハイドロフォビン断片（例えばＮ−またはＣ−末端切断）または７０％までの相同性を示す変質蛋白質を使用することも可能である。ある所与の使用、すなわち分離すべき液相に関連して、それぞれの場合で最適のコンストラクトが選ばれる。

本発明により使用されるハイドロフォビン、または本発明による配合物中に存在するハイドロフォビンを、例えばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相合成等の公知のペプチド合成法を用いて化学的に調製し得る。

天然起源のハイドロフォビンを適切な方法を用いて天然材料から単離することもできる。例えばＷｏｓｔｅｎ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．６３，１２２−１２９（１９９４）またはＷＯ９６／４１８８２を参照のこと。

融合パートナーをコードする核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列と、ハイドロフォビン部分をコードする核酸配列とを組み合わせて、発現された、組み合わせられた核酸配列の結果として宿主生物中に所望の蛋白質を生成する組み換え法により融合蛋白質を調製することが選択的に可能である。このような調製法は例えばＤＥ１０ ２００５ ００７ ４８０．４に開示されている。

これに関連して、前記調製法に対する適切な宿主生物（生産生物）は原核生物（Ａｒｃｈａｅａを含む）または真核生物、具体的にはハロバクテリアおよびｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｉを含むバクテリア、真菌類、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞であり、特に好ましくは大腸菌、枯草菌、巨大菌、コウジカビ、偽巣性コウジ菌、クロカビ、ピキア・パストリス、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕ種、乳酸菌、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、ＳＦ９（または関連する細胞）およびその他である。

本発明はまた、調節核酸配列の遺伝的制御下に本発明により使用される、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現コンストラクトと、少なくとも1種のこれらの発現コンストラクトとを有するベクターの使用方法に関する。

使用するコンストラクトは、所与のコード配列の５’側上流にプロモーターと３’側の下流にターミネーター配列を有する他、適切であればその他の通常の調節要素を有し、そのそれぞれがコード配列に作動的に結合していることが好ましい。

本発明の文脈の範囲では、「作動的に結合」とは発現されるコード配列に関して調節要素のそれぞれが意図する用途の、従ってその機能を満たし得るような、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび適切な場合はその他の調節要素の連鎖配列を意味すると理解される。

作動的に結合し得る配列の例は標的配列の他、エンハンサー、ポリアデニル化信号等である。他の調節要素には選択性マーカー、増幅信号、複製開始点等が含まれる。適切な調節配列は例えばＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。

これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節も実際の構造遺伝子の上流に存在し、適切な場合は自然調節がスイッチオフされ、遺伝子の発現が増加している様に遺伝的に変更されている。

好ましい核酸コンストラクトはまた、プロモーターに機能的に結合し、核酸配列の発現を増加し得る１つ以上のエンハンサー配列を有することが有利である。さらに調節要素またはターミネーター等のさらなる有利な配列も、ＤＮＡ配列の３’末端に挿入することができる。

核酸は１つ以上のコピー中のコンストラクト中に存在し得る。コンストラクトが抗生物質耐性または栄養要求性を補償する遺伝子等のさらなるマーカーを、コンストラクトを選択するために適切であれば有することも可能である。

調製に有利な調節配列は、例えばｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃｌｑ−Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）、ＳＰ６、ｌａｍｂｄａ−ＰＲまたはｉｍｌａｍｂｄａ−Ｐプロモーター中に存在し、そのプロモーターはグラム陰性バクテリア中で有利に使用し得る。他の有利な調節配列はグラム陽性プロモーターａｍｙおよびＳＰ０２、および酵母または真菌プロモーターであるＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８およびＡｄｈ中に存在する。

調節のために人工プロモーターを使用することも可能である。

宿主生物中で発現する目的で、遺伝子を宿主中で最適に発現することができるプラスミドまたはファージ等のベクター中に核酸コンストラクトを挿入することが有利である。プラスミドおよびファージ以外に、ベクターは当業者に公知の任意の他のベクター、すなわち例えばｓｖＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルス等のウイルス、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミド、コスミド、直鎖または環状ＤＮＡの他、アグロバクテリウム系であると理解する必要がある。

これらのベクターを宿主生物中で自律的に、または染色体性に複製することができる。適切なプラスミドの例は大腸菌中のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐｌＮ−ＩＩＩ”３−Ｂ１、ｔｇｔ１１およびｐＢｄＣｌ、ストレプトマイセス中のｐｌＪ１０１、ｐｌＪ３６４、ｐｌＪ７０２およびｐｌＪ３６１、バチルス中のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４およびｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム中のｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７、真菌類中のｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２およびｐＢＢ１１６、酵母中の２ａｌｐｈａ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３およびｐＥＭＢＬＹｅ２３、および植物中のｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４およびｐＤＨ５１である。これらのプラスミッドは可能なプラスミッドから選択されたごく一部である。その他のプラスミドも当業者に公知であり、参考文献Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ０ ４４４ ９０４０１８）中に見られる。

存在するその他に遺伝子を発現するためには、核酸コンストラクトが発現を増加するための３’末端および／または５’末端調節配列を含むことも有利であり、その配列は選ばれた宿主生物および遺伝子に従って最適発現のために選ばれる。

これらの調節配列は、遺伝子および蛋白質が選択的に発現し得ることを意図している。宿主生物によっては、このことは例えば遺伝子が誘導後にのみ発現または過剰発現する、または遺伝子が即座に発現および／または過剰発現することを意味し得る。

これに関連して、制御配列または因子が積極的に影響し、その結果挿入された遺伝子の発現を増加し得ることが好ましい。従って、プロモーターおよび／またはエンハンサー等の強い転写信号を用いることにより、調節因子が転写レベルで増大し得ることが有利である。しかしながら、それ以外に例えばｍＲＮＡの安定性を改善することにより翻訳を増大することも可能である。

ベクターの他の実施形態では、核酸コンストラクトまたは核酸を含むベクターを直鎖ＤＮＡの形で導入し、異種または同種組換えにより宿主生物のゲノム中に組み込むことにより、微生物中導入することも有利である。この直鎖ＤＮＡはプラスミド等の直線化ベクターを含むか、または核酸の核酸コンストラクトのみを含み得る。

生物中で異種遺伝子が最適発現するためには、核酸配列が生物中でに取り込まれる特定のコドンに合わせて変更されることが有利である。コドンの使用を、関連する生物からの他の公知の遺伝子のコンピューター解析により容易に決定することができる。

適切なプロモーターを適切なコードヌクレオチド配列およびターミネーター信号またはポリアデニル化信号に融合することにより、発現カセットを調製できる。例えＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓｈａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載される通常の組み換えおよびクローニング技術がこの目的で使用される。

適切な宿主生物中で発現するために、組み換え核酸コンストラクトまたは遺伝子コンストラクトを、遺伝子を宿主中で最適発現し得る宿主特異性ベクター中に挿入することが有利である。ベクターは当業者に公知であり、例えば「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｅｌｓｅｖｉｒｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５に見られる。

ベクターを用いて、例えば少なくとも1種のベクターで形質転換した組み換え微生物を調製することが可能であり、その微生物を本発明により用いられるハイドロフォビンまたはその誘導体の製造に用いることができる。上記の組み換えコンストラクトを適切な宿主系中へ導入し、発現することが有利である。これに関連して、前記核酸を所与の発現系で発現するために共沈殿、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルス感染等の当業者に公知の通常のクローニングおよび感染法を用いることが好ましい。適切な系は例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ． ａｌ．Ｅｄｓ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ． ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｎｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。

相同組み換え微生物を調製することも可能である。これには使用する遺伝子またはコード配列の少なくとも1種のセグメントを有するベクターの調製が含まれ、配列を変化させる、例えば配列を機能的に崩壊させる（ノックアウトベクター）ために、その中には適当であれば少なくとも1種のアミノ酸の欠失、付加または置換が導入されている。例えば、導入された配列は関連する微生物からのホモログであるか、または哺乳動物、酵母または昆虫由来である。また、内因性遺伝子がある別な方法で突然変異または変化するが、同種組み換えに関連して、なお機能性蛋白質をコードする様に（例えば内因性蛋白質の発現が変化する様に、上流調節領域を変化させる）、同種組み換えのために用いられるベクターを設計することもできる。本発明で用いられる遺伝子の変化したセグメントは、同種組み換えベクター中にある。同種組み換えに適したベクターの構築は、例えばＴｈｏｍａｓ、Ｋ．Ｒ． ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３に記載されている。

原理的に、任意の原核または真核生物がこれらの核酸または核酸コンストラクトに対する組み換え宿主として使用するのに適している。バクテリア、真菌類または酵母等の微生物を宿主生物として使用することが有利である。グラム陽性またはグラム陰性バクテリア、好ましくは腸内細菌科、シュードモナス科、リゾビウム、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅまたはＮｏｒｃａｒｄｉａｃｅａｅ科のバクテリア、特に好ましくは大腸菌類、Ｐシュードモナス、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｎｏｒｃａｄｉａ、バークホルデリア、サルモネラ、アグロバクテリウムおよびロドコッカス属が有利に用いられる。
上記の融合蛋白質の調製法で用いられる生物を、当業者に公知の方法で宿主生物に依存して生長させる、または培養する。一般に通常は糖の形の炭素源、通常は酵母抽出液等の有機窒素源または硫酸アンモニウム等の塩等の形の窒素源、鉄、マンガンおよびマグネシウム塩等の微量元素、および適当であればビタミンを含む液体培地中、０〜１００℃、好ましくは１０〜６０℃で酸素を吹き込みながら微生物を生長させる。これに関連して、栄養液のｐＨを一定に保つことができるが、生長中にｐＨは制御してもしなくてもよい。生育をバッチ式、半バッチ式または連続で行うことができる。栄養物質を発酵の最初にまず導入するか、または半連続または連続で逐次供給する。酵素を実験の項に記載の方法を用いて単離するか、または粗抽出物として反応のために使用し得る。

本発明により使用されるハイドロフォビン、またはその機能性生物活性フラグメントを組み換え調製法により調製し得るが、蛋白質の発現が適切に誘導される場合、ポリペプチド生産微生物を培養し、これらの蛋白質を培養液から単離する。所望であれば、蛋白質をこの方法で工業スケールで生産することもできる。公知の方法を用いて組み替え微生物を培養し、発酵することができる。例えば２０〜４０℃の温度、６〜９のｐＨでＴＢまたはＬＢ倍地中でバクテリアを繁殖させることができる。適切な培養条件は例えばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に詳細に記載されている。

蛋白質が培地中へ分泌されない場合、細胞を破壊し、公知の蛋白質単離法を用いて生成物が溶菌液から得られる。所望であれば高周波超音波処理、フレンチ加圧セル等の高圧、浸透圧溶菌、清浄剤の作用、溶菌酵素または有機溶剤により、ホモジェナイザーを用いて、または上記方法のいくつかの組み合わせを用いて細胞を破壊することができる。

分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、例えばＱセファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィー等の公知のクロマトグラフィー法の他、超濾過、結晶化、塩析、透析および無変性ゲル電気泳動を用いて蛋白質を精製することができる。適切な方法は例えばクーパー（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。

単離と精製を促進するために、固体支持体、具体的には適切なポリマー上に対応する相補性グループを結合し得る特別なアンカリンググループを有するハイドロフォビン融合体を調製することが特に有利である。これらの固体支持体を例えばクロマトグラフィーカラムの充填剤として用いることができ、一般にこの方法で分離効率をかなり増加させることができる。このような分離法はアフィニティークロマトグラフィーとして知られる。蛋白質を調製する場合、特定の塩基配列によりｃＤＮＡを延長し、そのために変化した蛋白質または融合蛋白質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが可能である。精製を容易にするために修飾された蛋白質は、アンカーとして作用するいわゆる「タグ」、例えばヘキサヒスチジンアンカーとして知られる修飾を有する。ヒスチジンアンカーで修飾されたハイドロフォビン融合体を、例えばカラム充填剤としてのニッケル−セファロースを用いてクロマトグラフィーで精製することができる。次に溶離に適した手段、例えばイミダゾール溶液を用いて、ハイドロフォビン融合蛋白質をカラムから再度溶離することができる。

簡便化した精製法では、クロマトグラフィー精製で分取することが可能である。このために、適切な方法を用いて、例えばミクロ濾過または遠心分離により、まず最初に細胞を発酵ブロスから全て分離する。ついで適切な方法、例えば先に既に述べた方法を用いて細胞を破壊し、細胞断片を封入体から分離する。後者の工程を遠心分離により行うことが有利である。最後に、ハイドロフォビン融合体を放出するため、原理的に公知の方法で封入体を破壊する。これは、例えば酸、塩基および／または清浄剤を用いて行うことができる。一般に、本発明で用いられるハイドロフォビン融合体を含む封入体を、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて約１時間以内に完全に溶解することができる。この簡便法を用いて得られるハイドロフォビン融合体の精製物は、一般に全蛋白量に対して６０〜８０％である。記載された簡易精製法を用いて得られる溶液を、それ以上精製せずに本発明の実施に使用することができる。

上記の様に調製したハイドロフォビンを融合蛋白質として直接使用するか、または融合パートナーを切り離して除去した後に「純」ハイドロフォビンとして使用することができる。

融合パートナーの除去を考える場合、ハイドロフォビン部分と融合パートナー部分との間の潜在的開裂部位（プロテアーゼに対する特異的認識部位）を、融合蛋白質中に加えることが薦められる。特に、適切な開裂部位は他の場合はハイドロフォビン部分または融合パートナー部分のいずれにも生じないペプチド配列であり、生物情報手段を用いて容易に決定し得るものである。例えば、メチオニンでのＢｒＣＮ開裂、またはＸａ因子、エンテロキナーゼ、トロンビンまたはＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼを用いるプロテアーゼ修飾開裂が特に適している。

本発明によれば、ハイドロフォビンまたはその誘導体を、少なくとも２種の液相を有する組成物の相分離の改善に用いることができる。これに関連して、組成物は少なくとも２種の液相を有する限り任意の組成物でよい。

具体的には、少なくとも１種のハイドロフォビンまたはその誘導体を加える前には、組成物はエマルジョンの形で存在する。

これに関連して、本発明の関連では組成物は少なくとも２種の液相に加えてさらに別な相を有することもできる。

少なくとも２種の液相とは、例えば異なった密度の２種の液相、例えば油と水、異なった密度の２種の水溶液、異なった密度の２種の有機溶液、燃料と水、可燃物と水、または溶媒と水である。これに関連して、別な溶剤と組み合わせることが適切な場合は、本発明の記述では水溶液は水を含む溶液を意味すると理解される。これに関連して、本発明の関連ではそれぞれの液相はさらに別な物質を含む。

本発明によれば、油は原油であることが好ましい。

適切な溶媒は水と２相混合物を形成する任意の液体であり、具体的には有機溶剤、例えばエーテル、トルエンまたはベンゼン等の芳香族化合物、アルコール、アルカン、アルケン、シクロアルカン、シクロアルケン、エステル、ケトン、ナフテンまたはハロゲン化炭化水素である。

他の実施形態によれば、本発明は従って先に述べたように少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体の使用に関するが、少なくとも２種の液相を含む組成物は以下からなる群から選ばれる。

−油、好ましくは原油と水とを含む組成物；
−燃料または可燃物と水とを含む組成物；および
−少なくとも２種の液相を含む反応混合物。

本発明の文脈において、組成物はさらなる相、例えば固相または液相、特に固相を含むこともできる。

この文脈内で、ハイドロフォビンまたはその誘導体を当業者に公知の任意の用途に用いることが可能である。本発明の文脈では、ガソリン／水混合物中の乳化破壊剤および他の燃料または可燃物／水混合物における乳化破壊剤としての使用、化学反応に関連する、特に大規模工業プロセスに関連する相分離、原油抽出または原油生産に関連する原油と水との間のエマルジョン破壊の他、原油を水で抽出する原油の脱塩、次いで得られたエマルジョンの破壊に特に言及する必要がある。適切な大規模工業的化学プロセスとは、相分離を生じさせる必要がある全てのプロセス、例えばコバルト触媒を用いるポリイソブテンのヒドロホルミル化であって、水性条件下に触媒が分離されるプロセスである。

本発明により、少なくとも２種の液相を含み、反応過程中に生じる、すなわち反応過程中に生成するか、溶媒またはある成分の添加により生じる組成物の相分離を改善するためにハイドロフォビンまたはその誘導体が用いられる。本発明によれば、ハイドロフォビンまたはその誘導体の使用は相分離時間を短くし、価値のある生成物の損失を減少させることができる。

本発明によれば、密度の異なる２つの水相を含む組成物の相分離であって、水相とは水を含む相であると理解され、適切であれば他の溶剤と組み合わされた組成物の相分離を改善することも同様に可能である。本発明によれば、例えば水系におけるポリマーの分別に関連する相分離を改善するために、ハイドロフォビンまたはその誘導体を使用することができる。具体的には水溶性ポリマーがこれに関連して分別される。

一般的な方法では、当業者に公知の全ての水溶性および油溶性ポリマー、具体的には調製により決定される１．１を超える分子量分布または多分散性で得られるポリアクリル酸およびそのコポリマーが言及される。

乳化破壊剤を添加することにより、エマルジョンを破壊することができる。従って、例えば抽出された鉱油は一般に、堆積物の性質に応じて９０重量％までの水を含み得る比較的安定な油中水エマルジョンとして存在する。原油を仕上げて精製する場合、水の主要な部分が分離された後、なお約２〜３重量％の水を含む原油が生じる。この水は油と安定なエマルジョンを形成し、そのエマルジョンは遠心分離し通常の乳化破壊剤を添加しても完全に分離することはできない。このことは、まず第１に水が高い含有量の塩を含み、腐食効果を有する限り問題を生じ、第２に残存する水が輸送および貯蔵すべき体積を増加し、これによりコストが増大することになる。本発明によれば、ハイドロフォビンまたはその誘導体をこのような組成物における相分離を改善するために特に有利に使用されることが見出された。非常に早い分離が達成される。

これに関連して、最適効果を得るためには乳化破壊剤が乳化した油脂の性質に適合すると共に、存在し得る任意の乳化剤および洗浄剤に適合する必要がある。エマルジョンの破壊は高温で、例えば０〜１００℃の温度、例えば１０〜８０℃の温度、特に２０〜６０℃の温度でさらに支援される。

本発明による他の応用の例には、合板および繊維的産業における含浸エマルジョンの抗乳化、および薬剤エマルジョンの抗乳化が含まれる。他の応用は、有機溶剤で処理された排液の抗乳化、例えば工業および商業排液、具体的には油／水エマルジョンを生じる金属加工排液、例えば金属加工由来の切削液、製革排液、原油精製排液および家庭排液等である。このような排液は例えば石油精製工場および石油化学プラントにおける鉱物油に関連して生じる。これらの排液が浄化プラントに導かれる前に、しばしばエマルジョンの形で存在する油残渣を分離することが必要である。

本発明によるまた別な応用は、水中油または油中水混合物、例えば切削液として使用され、循環する必要のあるエマルジョンの抗乳化である。水／油混合物は例えば航海中の船上の船底汚水で生じる。これに関連して、水を分離し、廃棄すべき溶媒の量を減少するために、エマルジョンを分離することが必要である。

使用されるハイドロフォビンまたはその誘導体の量は広い範囲で変化し、その量は組成物自体の量、適切な場合は組成物中に存在する他の成分の量に一致することが有利である。

例えば、組成物がある物質、例えば少なくとも２種の液相の分離を遅らせるか阻害する洗浄剤または乳化剤を含む場合、大量のハイドロフォビンまたはその誘導体を用いることが有利である。

油、特に原油は多くの化合物の混合物で構成されるので、油および水および塩分の異なった化学組成物の他、温度、乳化破壊の持続、配合の性質および混合物の他の成分との相互作用等の乳化破壊の具体的な条件のために、乳化破壊剤が特定の条件に一致することが必要である。

驚くべきことに、ハイドロフォビンまたはその誘導体が少量でも相分離の改善がもたらされる。

本発明によれば、少なくとも1種のハイドロフォビンまたはその誘導体を任意の適切な量で使用し得る。一般に、少なくとも1種のハイドロフォビンまたはその誘導体は全組成物に対して０．０００１〜１０００ｐｐｍの量で使用され、好ましくは０．００１〜５００ｐｐｍ、特に好ましくは０．０１〜２００ｐｐｍまたは０．０１〜１００ｐｐｍ、きわめて好ましくは０．１〜５０ｐｐｍの量で使用される。

本発明の文脈では、ｐｐｍはｍｇ／ｋｇを指す。

他の実施形態によれば、本発明は先に述べた使用に関連し、少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体を、全組成物に対して０．０００１〜１０００ｐｐｍの量で使用する。用いる濃度は、乳化破壊すべき組成物の性質によって当業者が指定する。

組成物が燃料と可燃物と水とを含む組成物である場合、一般にハイドロフォビンまたはその誘導体は０．００１〜１０ｐｐｍ、好ましくは０．００５〜２ｐｐｍ、特に０．０１〜１ｐｐｍ、特に好ましくは０．０５〜０．５ｐｐｍ、より好ましくは０．０１〜０．１ｐｐｍの量で用いられる。

組成物が原油と水を含む組成物である場合、一般にハイドロフォビンまたはその誘導体は１〜１０００ｐｐｍ、好ましくは１〜８００ｐｐｍ、特に５〜５００ｐｐｍ、特に好ましくは１０〜２００ｐｐｍ、より好ましくは１５〜１００ｐｐｍ、例えば２０〜５０ｐｐｍの量で用いられる。

組成物が異なった密度の２つの水相を含む場合、それらの相は例えば水溶性ポリマーに関連して生成し、ハイドロフォビンまたはその誘導体を一般に１〜１０００ｐｐｍ、好ましくは1〜５００ｐｐｍ、特に５〜２５０ｐｐｍ、特に好ましくは１０〜２００ｐｐｍ、より好ましくは１５〜１００ｐｐｍの量で用いられる。

本発明によれば、少なくとも1種のハイドロフォビンまたはその誘導体に加えて、組成物が相分離を改善するさらなる化合物を含むことも可能である。これに関連して、その化合物はこの種の用途に対して当業者が公知の任意の化合物である。相分離を改善するためのさらなる化合物として使用する、特に原油生産に関連する乳化破壊剤としての用途に適した化合物の例はオキシアルキル化フェノールホルムアルデヒド樹脂、ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー、架橋ジエポキシド、ポリアミドまたはそのアルコキシレート、スルホン酸塩、エトキシ化脂肪酸アミン、コハク酸、およびこの種の用途に対するＤＥ１０ ２００５ ００６ ０３０．７に指定される化合物である。

他の実施形態によれば、本発明は先に述べた使用に関連し、少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体に加えて、相分離を改善する少なくとも1種のさらなる化合物が用いられる。

さらなる態様によれば、本発明はまた少なくとも２種の液相を含む組成物中の少なくとも２種の液相を分離する方法に関し、その方法は少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体を組成物に加えことを有する。

これに関連して、その組成物は少なくとも２種の液相を有する先に述べた組成物である。

好ましい実施形態によれば、本発明はこの種の方法に関連し、少なくとも２種の液相を含む組成物は以下からなる群から選ばれる。

−油、好ましくは原油と水とを含む組成物；
−燃料または可燃物と水とを含む組成物；および
−少なくとも２つの液相を含む反応混合物。

原理的に、本発明に関連して相分離が改善されるならば、ハイドロフォビンまたはその誘導体を任意の量で用いることができる。全組成物に対し、０．０００１〜１０００ｐｐｍの量のハイドロフォビンまたはその誘導体の使用が特に適している。

同様に、本発明は先に述べた方法に関し、少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体が全組成物に対し０．０００１〜１０００ｐｐｍの量で用いられる。個々の系に対する好ましい量はすでに述べられている。

本発明による方法はさらなる工程、例えば相分離またはエマルジョンの破壊を改善する工程を有することができる。これに関連して、その工程は例えば温度上昇または遠心分離でもよい。このような工程を少なくとも1種のハイドロフォビンまたはその誘導体の添加前、添加中または添加後に行うことができる。

他の実施形態によれば、本発明は先に述べた方法に関連し、その方法は少なくとも1種のハイドロフォビンまたは少なくとも1種のその誘導体の添加前または後に、少なくとも２種の液相を有する組成物の温度を上昇させる工程を有する。

本発明によれば、ハイドロフォビンまたはその誘導体を、例えば燃料または可燃物を含む配合物に添加することができる。これにより、配合物が水と接触した場合に迅速な分離を行うことがでるか、またはエマルジョンの生成を阻止することができる。例えば貯蔵タンク中のエマルジョンの生成により、配合物を複雑な精製工程に供することが必要になる。

同様に、例えばエマルジョン生成を阻止するためにハイドロフォビンまたはその誘導体を原油に加えることが有利である。

これに関連して、燃料または可燃物を含む配合物は、本発明の文脈の範囲でこの種の配合物中に通常存在する別な添加物を含有ことができる。

適切な添加物は例えばＷＯ２００４／０８７８０８に指定されている。

従って、本発明はまた、燃料、可燃物、原油または水溶性または油溶性ポリマー溶液からなる群から選ばれた少なくとも1種の化合物と、少なくとも1種のハイドロフォビンまたはその誘導体を含む配合物に関する。

配合物が水と接触する場合の相分離の改善が保障される限り、使用するハイドロフォビンまたはその誘導体の量は、添加する他の物質によって変わり得る。

本発明によれば、ハイドロフォビンまたはその誘導体の量は好ましくは０．０００１〜１０００ｐｐｍの範囲、好ましくは０．００１〜５００ｐｐｍの範囲、特に好ましくは０．０１〜１００ｐｐｍの範囲である。

従って、本発明はまた先に述べたような配合物に関し、ハイドロフォビンまたはその誘導体が全配合物に対し０．０００１〜１０００ｐｐｍの量で配合物中に存在する。

配合物が原油を含む混合物である場合、一般にハイドロフォビンまたはその誘導体が１〜１０００ｐｐｍ、好ましくは１０〜８００ｐｐｍ、特に１０〜５００ｐｐｍの量でこの配合物に添加される。

配合物が燃料または可燃物を含む混合物である場合、一般にハイドロフォビンまたはその誘導体が０．００１〜０．５ｐｐｍ、好ましくは０．００５〜０．３ｐｐｍ、特に０．１〜０．２ｐｐｍの量でこの配合物に添加される。

従って、またさらなる実施形態によれば、本発明は前に述べた配合物に関連し、その配合物は少なくとも1種の燃料または可燃物と、全配合物に対し０．００１〜０．５ｐｐｍの量で存在するハイドロフォビンまたはその誘導体を含む。

本発明の文脈では、可燃物は例えば軽燃料油、中燃料油または重燃料油であると理解される。

本発明の文脈では、燃料は例えばガソリン、ディーゼル油またはタービン油であると理解され、好ましくはガソリンである。

燃料はさらなる添加剤を含み得る。当業者は原理的に通常の添加剤をよく知っている。適切な添加剤および溶媒は例えばＷＯ２００４／０８７８０８に指定されている。

本発明によれば、界面活性効果またはバルブシート磨耗阻害効果を有する添加剤（以下の点で界面活性添加剤と呼ばれる）は、例えばさらなる添加剤成分として使用するのに適している。この界面活性添加剤は、８５〜２０，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量Ｍｎを有する少なくとも1種の疎水性炭化水素残基と、以下から選ばれる少なくとも1種の極性基を有する。

（ａ）６個までの窒素原子であって、少なくとも1種の窒素原子は塩基性を有するモノアミノまたはポリアミノ基；
（ｂ）適切であればヒドロキシル基と組み合わせたニトロ基;
（ｃ）モノアミノまたはポリアミノ基と組み合わせた、少なくとも1種の窒素原子は塩基性を有するヒドロキシル基；
（ｄ）カルボキシル基またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩；
（ｅ）スルホン酸基またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩；
（ｆ）ヒドロキシル基、少なくとも1種の窒素原子が塩基性有するモノアミノまたはポリアミノ基、またはカルバメート基で終結されるポリオキシＣ２〜Ｃ４アルキレン基；
（ｇ）カルボキシルエステル基；
（ｈ）ヒドロキシルおよび／またはアミノおよび／またはアミドおよび／またはイミド基を有するコハク酸無水物由来の基；および／または
（ｉ）置換フェノールとアルデヒドおよびモノアミンまたはポリアミンとＭａｎｎｉｃｈ反応で生成する基。

燃料中の適切な溶解度に寄与する上記界面活性添加剤中の疎水性炭化水素残基は、８５〜２０，０００、特に１１３〜１０，０００、特に３００〜５００の数平均分子量を有する。それぞれ３００〜５，０００、特に５００〜２，５００、特に７００〜２，３００のＭｎを有するポリプロペニル、ポリブテニルおよびポリイソブテニル残基が、特に極性基（ａ）、（ｃ）、（ｈ）および（ｉ）と組み合わせて典型的な疎水性炭化水素残基として考慮される。

界面活性添加剤の上記の基として以下が挙げられる。

モノアミノまたはポリアミノ基（ａ）を含む添加剤は、３００〜５，０００のＭｎを有するポリプロピレンまたは通常の（すなわち主として中央に位置する二重結合を有する）ポリブテンまたはポリイソブテンに基づいたポリアルケンモノアミン又はポリアルケンポリアミンであることが好ましい。主として中央に位置する（通常ベータおよびガンマ位）二重結合を有するポリブテンまたはポリイソブテンが添加剤を調製するための出発原料として使用され、塩素化、次いでアミノ化、または二重結合を空気またはオゾンで酸化することによる調製ルートにより、カルボニルまたはカルボキシル化合物が得られ、次いで還元性（水素化）条件下のアミノ化が適当である。この場合、アンモニア、モノアミンまたはジメチルアミノプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミンまたはテトラエチレンペンタミン等のポリアミン等のアミンがアミノ化に用いられる。具体的にはポリプロピレン系添加剤はＷＯ９４／２４２３１に記載されている。

モノアミノ基を有する他の好ましい添加剤（ａ）は、ＷＯ９７／０３９４６に具体的に記載される様に、平均重合度Ｐ＝５〜１００を有するポリイソブテンと、酸化窒素または酸化窒素と酸素の混合物との反応で生じる生成物の水素化生成物である。

モノアミノ基を有する他の好ましい添加剤（ａ）は、ＤＥ−Ａ１９６ ２０ ２６２に具体的に記載される様に、アミンとの反応、続いて脱水素およびアミノアルコールの還元によりポリイソブテンエポキシドから得られる化合物である。

適切であればヒドロキシル基と組み合わせたニトロ基を有する添加物（ｂ）は、ＷＯ９６／０３３６７およびＷＯ９６／０３４７９に具体的に記載される様に、平均重合度Ｐ＝５〜１００または１０〜１００を有するポリイソブテンと、酸化窒素または酸化窒素と酸素の混合物との反応由来の生成物であることが好ましい。これらの反応生成物は一般に純ニトロポリイソブテン（例えばアルファ、ベータ−ジニトロポリイソブテン）と混合ヒドロキシニトロポリイソブテン（例えばα−ニトロ−β−ヒドロキシポリイソブテン）との混合物である。

モノアミノまたはポリアミノ基と組み合わせたヒドロキシル基を有する添加剤（ｃ）は、ＥＰ−Ａ０ ４７６ ４８５に記載される様に具体的にはアンモニアまたはモノアミンまたはポリアミンを用いる、ポリイソブテンから得られ、主として末端である二重結合を有し、Ｍｎ＝３００〜５０００を有するポリイソブテンエポシキドの反応生成物である。

カルボキシル基またはそのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を有する化合物（ｄ）は、全分子量５００〜２０，０００を有するＣ２−Ｃ４０オレフィンと無水マレイン酸とのコポリマーであることが好ましく、そのカルボキシル基は完全または部分的に反応してアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を生成し、残りのカルボキシル基はアルコールまたはアミンと反応する。具体的には、これらの添加剤はＥＰ−Ａ０ ３０７ ８１５に開示されている。この種の添加剤は主としてバルブシートの磨耗を阻止するために用いられ、ＷＯ８７／０１１２６に記載される様に、ポリ（イソ）ブテンアミンまたはポリエーテルアミン等の通常の燃料界面活性剤と組み合わせて使用すると有利である。

例えばＥＰ−Ａ０ ６３９ ６３２に記載される様に、スルホン酸基またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を含む添加剤（ｅ）は、アルキルスルホコハク酸のアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩であることが好ましい。

この種の添加剤は主としてバルブシート磨耗を阻止するために使用され、ポリ（イソ）ブテンアミンまたはポリエーテルアミン等の通常の燃料清浄剤と組み合わせて用いると有利である。

ポリオキシ−Ｃ２−Ｃ４−アルキレン基（ｆ）は、Ｃ２−Ｃ６０アルカノール、Ｃ６−Ｃ３０アルカンジオール、モノまたはジ−Ｃ２−Ｃ３０アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ３０アルキルシクロヘキサノールまたはＣ１−Ｃ３０アルキルフェノールと、ヒドロキシル基またはアミノ基あたり１〜３０モルのエチレンオキシドおよび／またはプロピレンオキシドおよび／またはブチレンオキシドとの反応で得られるポリエーテルまたはポリエーテルアミンであることが好ましく、ポリエーテルアミンの場合はそれに続くアンモニア、モノアミンまたはポリアミンとの還元的アミノ化で得られる。具体的にはこの種の生成物はＥＰ−Ａ０ ３１０ ８７５、ＥＰＡ−Ａ０ ３５６ ７２５、ＥＰ−Ａ０ ７００ ９８５およびＵＳ４，８７７，４１６に記載され、ポリエーテルの場合はこれらの生成物は浮上油の品質を満足する。これに関する典型例はトリデカノールまたはイソトリデカノールブトキシレート、イソノニルフェノールブトキシレート、およびポリイソブテノールブトキシレートおよびプロポキシレートの他、アンモニアとの反応の対応する生成物である。

カルボン酸エステル基を含む添加剤（ｇ）は、長鎖アルカノールまたはポリオールを有するモノ−、ジ−またはトリカルボン酸のエステルであることは好ましく、具体的にはＤＥ−Ａ３８ ３８ ９１８に記載されるような１００℃で最小粘度２ｍｍ²／ｓを有するものである。使用し得るモノ−、ジ−またはトリカルボン酸は脂肪族または芳香族であり、適切なエステルアルコールまたはポリオールは、具体的に例えば６〜２４個のＣ原子を有する長鎖のエステルアルコールまたはポリオールである。イソオクタノール、イソノナノール、イソデカノールおよびイソトリデカノールのアジピン酸エステル、フタル酸エステル、イソフタル酸エステル、テレフタル酸エステルおよびトリメリット酸エステルが典型的なエステルの代表例である。この種の生成物は浮上油の品質を満足する。

ヒドロキシル、および／またはアミノおよび／またはアミドおよび／またはイミド基を有する無水コハク酸由来の基を含む添加剤（ｈ）は、加熱によるか、または塩素化ポリイソブテンを用いて、Ｍｎ＝３００〜５０００を有する通常または反応性の高いポリイソブテンと、マレイン酸無水物との反応で得られるポリイソブテニルコハク酸無水物の対応する誘導体である。これに関連して特に興味のあることは、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミンまたはテトラエチレンペンタミン等の脂肪族ポリアミンによる誘導体である。具体的には、この種のガソリン添加剤はＵＳ４，８４９，５７２に記載されている。

置換フェノールとアルデヒドおよびモノアミンまたはポリアミンとの反応のマンニッヒ反応で生成する基を含む添加剤（ｉ）は、ポリイソブテン置換フェノールとホルムアルデヒドおよびエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミンまたはジメチルアミノプロピルアミン等のモノアミンまたはポリアミンとの反応の生成物であることが好ましい。ポリイソブテニル置換フェノールを、Ｍｎ＝３００〜５０００を有する通常または反応性の高いポリイソブテンから誘導することができる。具体的には、この種の「ポリイソブテンマンニッヒ塩基」はＥＰ−Ａ０ ８３１ １４１に記載されている。

列挙された個々のガソリン添加剤をより正確に規定する目的で、上記従来技術の文献の開示は本明細書に参照によって組み込まれる。

これに関連して、上記添加剤を所与の用途に対して当業者が適当であると思われる量で使用する。

これに加えて、本発明により配合物を通常の成分と添加剤と組み合わせることもできる。何らの顕著な清浄剤効果のない浮上油を本明細書で例として挙げる。

適切な浮上鉱物油は、ブライトストック、例えばＳＮ５００〜２０００クラスの粘度を有するベースオイル、および芳香族炭化水素、パラフィン炭化水素およびアルコキシアルカノール等の鉱物油処理に関連して生じる溜分である。生成鉱物油に関連して生じ、水素化分解油（３６０〜５００℃の沸点範囲を有し、天然鉱物油から得られ、高圧下に触媒水素化され異性化され、脱パラフィン化された真空蒸留溜分）として知られる溜分も、同様に本発明に適している。上記浮上鉱物油の混合物も適している。

本発明により使用し得る合成浮上油の例はポリオレフィン（ポリアルファオレフィンまたはポリ内部オレフィン）、（ポリ）エステル、（ポリ）アルコキシレート、ポリエーテル、脂肪族ポリエーテルアミン、アルキルフェノール由来ポリエーテル、アルキルフェノール由来ポリエーテルアミンおよび長鎖アルカノールのカルボン酸エステルから選ばれる。

適切なポリオレフィンの例はＭｎ＝４００〜８００を有するオレフィンポリマー、具体的にはポリブテンまたはポリイソブテン系オレフィンポリマー（水素添加または水素添加なし）である。

適切なポリエーテルまたはポリエーテルアミンの例は、好ましくはポリオキシ−Ｃ２−Ｃ４アルキレン基を含み、Ｃ２−Ｃ６０アルカノール、Ｃ６−Ｃ３０アルカンジオール、モノ−またはジ−Ｃ２−Ｃ３０アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ３０アルキルシクロヘキサノールまたはＣ１−Ｃ３０アルキルフェノールと、ヒドロキシル基またはアミノ基あたり１〜３０モルのエチレンオキシドおよび／またはプロピレンオキシドおよび／またはブチレンオキシドとを反応させて得られる化合物であり、ポリエーテルアミンの場合は引き続きアンモニア、モノアミンまたはポリアミンとの還元的アミノ化で得られる化合物である。具体的には、この種の生成物はＥＰ−Ａ０ ３１０ ８７５、ＥＰ−Ａ０ ３５６ ７２５、ＥＰ−Ａ０ ７００ ９８５およびＵＳ４，８７７，４１６に記載されている。使用し得るポリエーテルアミンの例は、ポリ−Ｃ２−Ｃ６アルキレンオキシドアミン、またはその官能性誘導体である。この典型的な例はトリデカノールまたはイソトリデカノールブトキシレート、イソノニルフェノールブトキシレート、およびポリイソブテノールブトキシレートおよびプロポキシレートの他、アンモニアとの対応する反応生成物である。

長鎖アルカノールのカルボン酸エステルの例は、具体的にはＤＥ−Ａ３８ ３８ ９１８に記載されるようなモノ−、ジ−またはトリカルボン酸と長鎖アルカノールまたはポリオールとのエステルである。使用し得るモノ−、ジ−またはトリカルボン酸は脂肪族または芳香族カルボン酸であり、適切なエステルアルコールまたはポリオールは具体的には例えば６〜２４の炭素原子を有する長鎖アルコールが代表例である。エステルの典型的な代表例はイソオクタノール、イソノナノール、イソデカノールおよびイソトリデカノールのアジピン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸およびトリメリット酸エステルであり、例えばジ（ｎ−またはイソトリデシル）フタレートである。

他の適切な浮上油系の例は、ＤＥ−Ａ３８ ２６ ６０８、ＤＥ−Ａ４１ ４２ ２４１、ＤＥ−Ａ４３ ０９ ０７４、ＥＰ−Ａ０ ４５２ ３２８およびＥＰ−Ａ０ ５４８ ６１７に記載され、本明細書に参照によって組み込まれる。

特に適した合成浮上油の例は、約５〜３５、例えば約５〜３０のＣ３−Ｃ６アルキレンオキシド単位を有するアルコール原料ポリエーテルであり、例えばプロピレンオキシド、ｎ−ブチレンオキシドおよびｉ−ブチレンオキシド単位またはそれらの混合物から選ばれる。適切な出発アルコールの非限定例は長鎖アルカノールまたは長鎖アルキル置換フェノールであり、具体的には長鎖アルキル基は直鎖または分枝Ｃ６−Ｃ８アルキル基である。

トリデカノールおよびノニルフェノールが好ましい例として挙げられる。

さらに適切な合成浮上油は、ＤＥ−Ａ１０ １０２ ９１３．６に記載される様にアルコキシル化アルキルフェノールである。

これに関連して、前記浮上油は所与の用途に対し当業者が適当と思われる量で使用される。

他の通常の添加剤は腐食阻害剤、例えばフィルムを形成し易い有機カルボン酸のアンモニウム塩系、または非鉄金属腐食保護の場合は複素環芳香族化合物系の腐食阻害剤；抗酸化剤または安定化剤、例えばｐ−フェニレンジアミン、ジシクロヘキシルアミンまたはその誘導体系、または２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−フェノールまたは３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニルプロピオン酸等のフェノール系抗酸化剤または安定化剤；さらに通常の乳化破壊剤；静電防止剤；フェロセン等のメタロセン；メチルシクロペンタジエニルマンガントリカルボニル；ある種の脂肪酸、アルケニルコハク酸エステル、ビス（ヒドロキシアルキル）脂肪族アミン、ヒドロキシアセタミドまたはヒマシ油等の潤滑添加剤；および染料（マーカー）である。適当であれば、燃料のｐＨを低下する目的でアミンが添加される。

極性基（ａ）〜（ｉ）を含む前記清浄添加剤は通常、１０〜５０００重量ｐｐｍ、具体的には５０〜１０００重量ｐｐｍの量で燃料に添加される。所望であれば、その他の成分および添加剤はこの目的に普通である量で添加される。

本発明により適当である燃料および可燃物は当業者に公知の任意の燃料および可燃物であり、例えばＵｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ，ｅｄｔｈ．１９９０，Ｖｏｌｕｍｅ Ａ１６，ｐｐ．７１９ｆｆに記載されるガソリンである。ディーゼル燃料、ケロセンおよびジェット燃料も、本発明による適切な燃料である。

具体的には、芳香族含有量が最大６０容量％、例えば最大４３容量％、および硫黄含有量が最大２０００重量ｐｐｍ、例えば最大１５０重量ｐｐｍを有するガソリンが適当である。

ガソリンの芳香族化合物含有量は例えば１０〜５０、例えば３０〜４２容量％であり、具体的には３２〜４０容量％である。ガソリンの硫黄含有量は例えば２〜５００重量ｐｐｍ、５〜１５０重量ｐｐｍ、または１０〜１００重量ｐｐｍである。

さらに、適切なガソリンはオレフィン含有量が例えば５０容量％まで、例えば６〜２１容量％、具体的には７〜１８容量％であり、ベンゼン含有量が５容量％まで、例えば０．５〜１．０容量％、具体的には０．６〜０．９容量％であり、および／または酸素含有量が２５重量％まで、例えば１０重量％まで、または１．０〜２．７重量％、具体的には１．２〜２．０重量％である。

具体的には、例として芳香族含有量が最大３８容量％、オレフィン含有量が最大２１容量％、硫黄含有量が最大５０重量ｐｐｍ、ベンゼン含有量が最大１．０容量％および酸素含有量が１．０〜２．７重量％を同時に有するガソリンが挙げられる。

ガソリン中のアルコールおよびエーテルの含有量は広い範囲で変わり得る。典型的な最大含有量の例はメタノールの場合で１５容量％、エタノールの場合で６５容量％、イソプロパノールの場合で２０容量％、ｔｅｒｔ−ブタノールの場合で１５容量％、イソブタノールの場合で２０容量％、分子内に５個以上の炭素原子を有するエーテルの場合で３０容量％である。

本発明に適したガソリンのゾンマー（Ｓｏｍｍｅｒ）蒸気圧は通常最大７０ｋＰａ、具体的には６０ｐＫａである（それぞれ３７℃）。

一般に、ガソリンのＲＯＮは７５〜１０５である。対応するＭＯＮの通常の範囲は６５〜９５である。

前記仕様は通常の方法を用いて決定される（ＤＩＮ ＥＮ２２８）。

本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

［実施例１］
ｙａａｄ−Ｈｉｓ₆／ｖａａＥ−Ｈｉｓ₆クローニングの予備実験
オリゴヌクレオチドＨａｌ５７０およびＨａｌ５７１（Ｈａｌ５７２／Ｈａｌ５７３）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。バクテリア枯草菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いた。得られたＰＣＲフラグメントはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｙａａＤ／ｙａａＥ遺伝子のコード配列と、それぞれの場合にＮｃｏｌおよびＢｇｌｌｌ制限開裂部位をそれぞれの末端に含んだ。ＰＣＲフラグメントを精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌおよびＢｇｌｌｌで切断した。このＤＮＡフラグメントをインサートとして使用し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌおよびＢｇｌｌｌで先に直線化したキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ベクターｐＱＥ６０中にクローニングした。この方法で得られたベクター、すなわちｐＱＥ６０ＹＡＡ＃２／−ｐＱＥ６０ＹａａＥ＃５をＹＡＡＤ：：ＨＩＳ₆およびＹＡＡＥ：：ＨＩＳ₆をそれぞれ含む発現蛋白質に用いることができる。

Ｈａｌ５７０：ｇｃｇｃｇｃｃｃａｔｇｇｃｔｃａａａｃａｇｇｔａｃｔｇａ
Ｈａｌ５７１：ｇｃａｇａｔｃｔｃｃａｇｃｃｇｃｇｔｔｃｔｔｇｃａｔａ
Ｈａｌ５７２：ｇｇｃｃａｔｇｇｇａｔｔａａｃａａｔａｇｇｔｇｔａｃｔａｇｇ
Ｈａｌ５７３：ｇｃａｇａｔｃｔｔａｃａａｇｔｇｃｃｔｔｔｇｃｔｔａｔａｔｔｃｃ

［実施例２］
ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ₆のクローニング
オリゴヌクレオチドＫａＭ４１６およびＫａＭ４１７を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。カビ偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いた。得られたＰＣＲフラグメントはハイドロフォビン遺伝子ｄｅｗＡのコード配列とＮ−末端因子Ｘａプロテアーゼ開裂部位とを含んだ。ＰＣＲフラグメントを精製し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡフラグメントをインサートとして使用し、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌｌｌで先に直線化したベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２中にクローニングした。

この方法で得られたベクター＃５０８を、ＹＡＡＤ：：Ｘａ：：ｄｅｗＡ：：Ｈｉｓ₆を含む融合蛋白質を発現するために用いることができる。

ＫａＭ４１６：ＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＧＣ
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ

［実施例３］
ｙａａｄ−ハイドロフォビンＲｏｄＡ−Ｈｉｓ₆のクローニング
オリゴヌクレオチドＫａＭ４３４およびＫａＭ４３５を用いてプラスミド＃５１３をプラスミド＃５０８と同様にクローニングした。

ＫａＭ４３４：ＧＣＴＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣ
ＫａＭ４３５：ＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧ

［実施例４］
ＢＡＳＦ１−Ｈｉｓ₆のクローニング
オリゴヌクレオチドＫａＭ４１６およびＫａＭ４１８を用いてプラスミド＃５０７をプラスミド＃５０８と同様にクローニングした。

人工合成したＤＮＡ配列、すなわちハイドロフォビンＢＡＳＦ１を鋳型ＤＮＡとして用いた（付録配列番号１１および１２参照）。

ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ

［実施例５］
ｙａａｄ−ハイドロフォビンＢＡＳＦ２Ｈｉｓ₆のクローニング
オリゴヌクレオチドＫａＭ４１７およびＫａＭ４１８を用いてプラスミド＃５０６をプラスミド＃５０８と同様にクローニングした。

人工合成したＤＮＡ配列、すなわちハイドロフォビンＢＡＳＦ２を鋳型ＤＮＡとして用いた（付録配列番号１３および１４参照）。

Ｋａｍ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ

［実施例６］
ｙａａｄ−ハイドロフォビンＳＣ３−Ｈｉｓ₆のクローニング
オリゴヌクレオチドＫａＭ４６４およびＫａＭ４６５を用い、プラスミド＃５０８と同様にプラスミド＃５２６をクローニングした。

ＳｃｈｙｚｏｐｈｙｌｌｕｍコミューンｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして使用した（付録配列番号９および１０参照）。

ＫａＭ４６４：ＣＧＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣ
ＫａＭ４６５：ＧＣＴＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴ

［実施例７］
組み換え大腸菌株ｙａａｄ−ハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ₆の発酵
３ｍＬのＬＢ液体培地とｙａａｄ−ハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ₆発現大腸菌株との１５ｍＬグレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）チューブ中での播種。２００ｒｐｍのシェーカー上で３７℃、８時間のインキュベーション。各場合、バッフルを有し２５０ｍＬのＬＢ培地（＋アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）を含む２１Ｌのエレンマイヤーフラスコに、それぞれ１ｍＬの予備培養物を接種し、１８０ｒｐｍのシェーカー上で３７℃、９時間インキュベーションした。

２０Ｌの発酵槽中の１３．５ＬのＬＢ培地（＋アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）に０．５Ｌの予備培養物（水を対照に測定してＯＤ_600nm１：１０）を接種した。ＯＤ_600nm約３．５で１４０ｍＬの１００ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。３時間後、発酵槽を１０℃に冷却し、発酵ブロスを遠心分離した。細胞ペレットをその後の精製に用いた。

［実施例８］
組み換えハイドロフォビン融合蛋白質の精製
（Ｃ−末端Ｈｉｓ₆タグを有するハイドロフォビン融合蛋白質の精製）
１００ｇの細胞ペレット（１００〜５００ｍｇのハイドロフォビン）を５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５で全容量２００ｍＬに調整し、再懸濁した。懸濁液をウルトラツラックス（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）タイプＴ２５（Ｊａｎｋｅ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ）；ＩＫＡ−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ）で１０分間処理し、核酸を切断するために５００ユニットのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ；注文番号１．０１６９７．０００１）で室温、１時間インキュベーションした。細胞破壊の前に、ガラスカートリッジを用いて濾過を行った（Ｐ１）。細胞を破壊し、残存ゲノムＤＮＡを剪断するために、１５００バーにおける２回のホモジェナイザー処理（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ Ｍ−１１０ＥＨ；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏ．）を行った。ホモジェネートを遠心分離し（ソルバル（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ−５Ｂ、ＧＳＡローター。遠心カップ２５０ｍＬ、６０分、４℃、１２，０００ｒｐｍ、２３，０００ｇ）、上澄を氷の上に置き、ペレットを１００ｍＬの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁した。遠心分離と再懸濁を３回繰り返したが、３回目は燐酸ナトリウム緩衝液は１％ＳＤＳを含んだ。再懸濁後、混合物を１時間攪拌し、最終遠心分離を行った（ソルバルＲＣ−５Ｂ、ＧＳＡローター、遠心カップ２５０ｍＬ、６０分、４℃、１２，０００ｒｐｍ、２３，０００ｇ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、最終遠心分離後にハイドロフォビンが上澄中にあることが示された（図１）。実験から、ハイドロフォビンが対応する大腸菌細胞中に封入体の形で存在する可能性があることが示された。５０ｍＬのハイドロフォビン含有上澄を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡した５０ｍＬのニッケル−セファロース高性能１７−５２６８−０２カラム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に負荷した。カラムを５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、ハイドロフォビンを２００ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶離した。イミダゾールを除去するため、溶液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対し透析した。

図１は調製したハイドロフォビンの精製を示す。

レーンＡ：ニッケル−セファロースカラムに負荷した原料（希釈１：１０）
レーンＢ：フロースルー＝洗浄工程からの溶離液
レーンＣ〜Ｅ：溶離フラクションにＯＤ２８０最高点
レーンＦは添加したマーカーを示す。

図１のハイドロフォビンは約５３ｋＤの分子量を有する。より小さなバンドのいくつかはハイドロフォビンの切断生成物である。

［実施例９］
応用試験；ガラス上の水滴の接触角の変化によるハイドロフォビンのキャラクタリゼーション
基板：ガラス（窓ガラス、シュードイッチェグラス（Ｓｕｄｄｅｕｔｃｈｅ Ｇｌａｓ）、マンハイム）
実施例８に記載の通りに精製したハイドロフォビンを使用した。

−溶液中のハイドロフォビンの濃度：１００μｇ／ｍＬ、溶液はさらに５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液と０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０、登録商標）を含んだ。溶液のｐＨ＝４
−ガラス板をこの溶液に終夜浸漬した（温度８０℃）
−その後、ハイドロフォビン被覆ガラス板を溶液から取り出し、蒸留水中で洗浄した。

−その後１０分／８０℃／蒸留水中１％ＳＤＳ溶液でインキュベーション
−蒸留水を入れ替えて洗浄
−その後、１０分／８０℃／蒸留水中１％ＳＤＳ溶液でインキュベーション
−蒸留水中で再度洗浄
試料を空気中で乾燥し、５μＬの水滴と被覆ガラス表面との接触角（°）を室温で測定する。

接触角の測定をデータフィジックス（Ｄａｔａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）接触角システムＯＣＡ１５＋、ソフトウエアＳＣＡ２０．２．０(２００２年１１月)上で行った。測定を製造業者の指示書に従って行った。

未処理ガラスでは接触角３０±５°が得られた。

実施例８によるハイドロフォビン（ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ₆）で被覆したガラス板では、接触角７５±５°が得られた。

⇒ 接触角の増加：４５°

［実施例１０］
燃料添加物としてのハイドロフォビン（ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ₆）濃縮物の使用
実験の原理
最近の燃料はいくつかの添加物（添加物パッケージと呼ばれる）を含む。その生産または販売ルート中に燃料が水と接触した場合、これらの添加物は乳化効果を示し、望ましくない燃料−水エマルジョンを形成する結果となる。これを避けるため、通常燃料に乳化破壊剤が添加される。

実施例８に記載のハイドロフォビン濃縮物（配列番号１９および２０）を用いて乳化破壊実験を行った。

ハイドロフォビン濃縮物をエタノールで希釈し、高性能添加物パッケージＡ７２５ｍｇ／ｋｇを既に含む市販ユーロスーパー（Ｅｕｒｏｓｕｐｅｒ）燃料（ＥＮ２２８による）に加えた。この添加物パッケージは原則としてポリイソブテンアミンケロコム（Ｋｅｒｏｃｏｍ）ＰＩＢＡ、浮上油混合物、溶剤、腐食防止剤および摩擦改質剤を含む。

０．０１、０．０３、０．０５、０．０７、０．１４および０．２８ｍｇ／ｋｇのハイドロフォビンを含む燃料試料を調製した。Ａのみを添加した燃料、およびハイドロフォビンを添加しない燃料が参照試料となる（１０−Ｖ１）。他の比較実験（１０−Ｖ２）では、フェノール樹脂（ＡＤＸ６０６、ルブリゾール（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ）製）１．４５ｍｇ／ｋｇの市販乳化破壊剤Ｄを使用した。

各燃料試料を用いて、ＤＩＮ５１４１５に従って乳化試験を行った。これに関連して、それぞれの場合に８０ｍｌの燃料と２０ｍｌの水をよく混合した。その後、時間依存脱混合プロセスを観察した。脱混合が良好な場合は１回静置、脱混合が悪い場合は数回の静置で、基準となる標準法を用いて分析を行った。詳細は参照したＤＩＮ基準に含まれる。

表１に実験で得られた結果をまとめる。１分、５分、３０分および６０分後のそれぞれの結果である相分離層の評価が表に列記される。一般に、５分後のａ１または１ｂ評価が必要である。

コメント：
乳化破壊剤を添加しない場合はきわめて遅い乳化破壊のみが観察される。４回の評価は満足できない；安定なエマルジョンが生成する。

極端に低い量で存在する場合でも、ハイドロフォビンはきわめて良好な乳化破壊効果を示す。０．００１ｐｐｍのハイドロフォビンが、満足できる結果が１分以内に得るために十分である。０．０７ｍｇ／ｋｇのハイドロフォビンで得られたものと同様の結果を得るためには、１．４５ｍｇのフェノール樹脂系市販乳化破壊剤をｋｇあたりの燃料に添加しなければならなかった。従って、ハイドロフォビンを使用した場合、同じ効果を得るために従来の乳化破壊剤の約１／２０のみのハイドロフォビンが必要であった。

［比較例１１］
燃料中の添加剤として他の蛋白質の使用
非ハイドロフォビンタンパク質を実施例１０と同様にして、燃料中での使用に対して試験を行った。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とカゼインを使用して実験を行った。これらの蛋白質は市販されている。配列番号１５および１６に示されるｙａａｄ、すなわちそれ自体ハイドロフォビンと結合していない融合パートナーも使用した。

それぞれの蛋白質を、１０００ｍｇ／ｋｇの上記性能添加剤パッケージＡを含む０．０７ｍｇ／ｋｇの濃度で市販ユーロスーパー燃料（ＥＮ２２８による）に添加した。Ａのみを添加し、蛋白質を添加しない燃料を参照とした。

上記ＤＩＮ５１４１５に従って乳化試験をそれぞれ行った。

コメント：
乳化破壊剤を添加しないと、エマルジョンの分離の進行は実施例１０とまったく同様に遅くなる。４回の評価は満足できない；安定なエマルジョンが生成する。使用した蛋白質は乳化破壊効果を有するが、乳化破壊速度はハイドロフォビンを使用する場合より遅い。

［実施例１２］
ハイドロフォビン濃縮物（Ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ₆）の原油に対する乳化破壊剤としての使用
実施例８に記載のハイドロフォビン濃縮物（配列番号１９および２０）を用いて実験を行った。

行った実験では、５０ｍＬの原油（試料の出所；Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ ＡＧ）、Ｅｍｉｌｃｈｈｅｉｍ、油井３０１；通常の乳化破壊剤使用後の残留水分含有量約３％）に様々な量のハイドロフォビン濃縮物を添加した。原油中のハイドロフォビン含有量は１ｐｐｍ、１０ｍおよび４０ｐｐｍであった。均一化後、混合物を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。結果を表３に示す。

コメント：
１０および４０ｐｐｍのハイドロフォビン濃縮物を添加後、遊離水相が主要成分となった。

［実施例１３］
ポリマー分別のためのハイドロフォビン濃縮物（Ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ₆）の使用
実施例８に記載のハイドロフォビン濃縮物（配列番号１９および２０）を使用して実験を行った。

それぞれ、１５０ｇのナトリウム塩型ポリアクリル酸（Ｓｏｋａｌａｎ、登録商標）ＣＰ １０ Ｓ；Ｍｗ；４０００ｇ／ｍｏｌ、ＤＥ１９９ ５０ ９４１ Ａ１による）を最初にガラスビーカーに導入し、その後７５ｇのイソプロパノールをそれぞれ添加した。混合物を５分間攪拌し、その後１４６ｇのイソプロパノール／水（比率１／１）を加え、混合物を５分間攪拌した。

５０ｐｐｍのハイドロフォビン（１．６４Ｍ、１１．３ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカーＡに加え、混合物を５分間攪拌した。ハイドロフォビンは透明な溶液中に白い筋を形成し、その筋は５分後に完全に溶解した。１９．７５ｇの５０％ＮａＯＨを双方のガラスビーカーに添加し、混合物を１５分間攪拌した。

ハイドロフォビンが存在する場合はミルク状の溶液が生成したが、ハイドロフォビンを添加しない場合は非常に不透明な溶液となった。攪拌時間１５分後、ガラスビーカーの内容物をそれぞれ５００ｍＬの分液ロートに移し、その後ロートを短時間振盪し、相分離を生じるまでの時間を測定した。

ハイドロフォビンを含む試料の場合は、１０分後に明瞭な相分離が見られたが、ハイドロフォビンがない場合は泡立った「中間層」が最初に生じ、明瞭な相境界が生成しなかった。ハイドロフォビンを添加しない場合は、４０分後に明瞭な相境界がはじめて形成された。

明確な相境界が現れるまでの分離時間
−ハイドロフォビンあり：１２分
−ハイドロフォビンなし：４０分

［実施例１４、比較例１５］
５５℃での油−水エマルジョンに対する乳化破壊剤としてのハイドロフォビン融合体（Ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ₆）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の使用
実施例８に記載のハイドロフォビン濃縮物（配列番号１９および２０）を使用する他、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の市販溶液を使用して実験を行った。

乳化破壊能を以下の様に試験した。
使用した油は油圧油であった。
４０ｍＬの蒸留水を最初に１００ｍＬの計量シリンダーに入れ、関連する蛋白質を水に対して５ｐｐｍ、または全試料に対して２．５ｐｐｍの量で加えた。次いで４０ｍＬの油圧油を加え、系を水浴中５５℃で平衡させた。温度平衡時間は２０分であった。その後、ブレードミキサーを用いて油と水とを１５００ｒｐｍで５分間乳化した。これは水相中の油を乳化する。その後、相分離を観察した。それぞれの場合の、ｍＬ単位の水相の量を再度分離した。

１つの実験シリーズで、２つの蛋白質の水溶液を変えずに使用した。結果をグラフ１に示す。

第２の実験シリーズでは、最初に２つの蛋白質の溶液を室温でＨＣｌを用いてｐＨ１に調節し、次いでｐＨ１で２４時間放置した。その後、それぞれの溶液をＮａＯＨを用いてｐＨ７に再度調節した。結果をグラフ２に示す。

コメント：
乳化破壊剤のない試料と比較して、ＢＳＡは油−水エマルジョンの乳化破壊速度をわずかしか改善しなかった。一方、ハイドロフォビンを加えた場合は乳化破壊の非常に顕著な促進が観測された。

図１は調製したハイドロフォビンの精製を示す。

Claims (23)

1. 少なくとも２種の液相を含む組成物中の相分離改善のために、少なくとも1種のハイドロフォビンを使用する方法。
2. 少なくとも1種のハイドロフォビンを乳化破壊剤として使用する、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも1種のハイドロフォビンがハイドロフォビン融合体である、請求項１または２に記載の方法。
4. ハイドロフォビン融合体がｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）およびｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）の群から選ばれた少なくとも1種であり、ｙａａｄが２０〜２９３個のアミノ酸を有する切断融合パートナーｙａａｄ’でもある、請求項３に記載の方法。
5. 少なくとも２種の液相を含む組成物が以下からなる群、
   −水と油とを含む組成物；
   −燃料または可燃物と水とを含む組成物；および
   −少なくとも２種の液相を含む反応混合物、
   から選ばれる、請求項１〜４に記載の方法。
6. 少なくとも1種のハイドロフォビンが全組成物に対し０．０００１〜１０００ｐｐｍの量で用いられる、請求項１〜５に記載の方法。
7. 組成物が原油−水組成物であり、少なくとも1種のハイドロフォビンが全組成物に対し１〜８００ｐｐｍの量で用いられる、請求項６に記載の方法。
8. 組成物が燃料／可燃物−水組成物であり、少なくとも1種のハイドロフォビンが全組成物に対し０．００１〜１０ｐｐｍの量で用いられる、請求項６に記載の方法。
9. 相分離を改善する少なくとも１つのさらなる化合物が、少なくとも1種のハイドロフォビンの他に用いられる、請求項１〜８に記載の方法。
10. 組成物中に少なくとも1種のハイドロフォビンを添加することを含む、少なくとも２種の液相を含む組成物中の少なくとも２種の液相の分離法。
11. 少なくとも1種のハイドロフォビンがハイドロフォビン融合体またはその誘導体である、請求項１０に記載の方法。
12. ハイドロフォビン融合体がｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）およびｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）の群から選ばれた少なくとも1種であり、ｙａａｄが２０〜２９３個のアミノ酸を有する切断融合パートナーｙａａｄ’でもある、請求項１１に記載の方法。
13. 少なくとも２種の液相を含む組成物が以下からなる群、
    −油と水とを含む組成物；
    −燃料または可燃物と水とを含む組成物；および
    −少なくとも２種の液相を含む反応混合物、
    から選ばれる、請求項１０〜１２に記載の方法。
14. 少なくとも1種のハイドロフォビンが全組成物に対し０．０００１〜１０００ｐｐｍの量で用いられる、請求項１０〜１３に記載の方法。
15. 組成物が原油−水組成物であり、少なくとも1種のハイドロフォビンが全組成物に対し１〜８００ｐｐｍの量で用いられる、請求項１４に記載の方法。
16. 組成物が燃料／可燃物−水組成物であり、少なくとも1種のハイドロフォビンが全組成物に対し０．００１〜１０ｐｐｍの量で用いられる、請求項１４に記載の方法。
17. 前記方法が、少なくとも1種のハイドロフォビンを添加する前または後に少なくとも２種の液相を含む組成物の温度を上昇させることを含む、請求項１０〜１６に記載の方法。
18. 燃料、可燃物、原油または水溶性または油溶性ポリマー溶液でなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物と、少なくとも1種のハイドロフォビンとを含む配合物。
19. 全配合物に対しハイドロフォビンが配合物中に０．０００１〜１０００ｐｐｍの量で含まれる、請求項１８に記載の配合物。
20. 配合物が少なくとも1種の燃料、可燃物を含み、ハイドロフォビンまたはその誘導体が全配合物に対し配合物中に０．００１〜０．５ｐｐｍの量で存在する、請求項１８または１９に記載の配合物。
21. 燃料または可燃物がガソリン、ディーゼル燃料およびタービン燃料の群から選ばれる、請求項２０に記載の配合物。
22. 少なくとも1種の蛋白質がハイドロフォビン融合体またはその誘導体である、請求項１８〜２１に記載の配合物。
23. ハイドロフォビン融合体がｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（配列番号２０）、ｙａａｄ−Ｘａ−ｒｏｄＡ−ｈｉｓ（配列番号２２）およびｙａａｄ−Ｘａ−ｂａｓｆ１−ｈｉｓ（配列番号２４）の群から選ばれた少なくとも1種であり、ｙａａｄが２０〜２９３個のアミノ酸を有する切断融合パートナーｙａａｄ’でもある請求項２２に記載の配合物。