JP2003521367A - ハイドロホビン含有溶液による物体表面の処理法 - Google Patents

ハイドロホビン含有溶液による物体表面の処理法

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JP2003521367A JP2001556325A JP2001556325A JP2003521367A JP 2003521367 A JP2003521367 A JP 2003521367A JP 2001556325 A JP2001556325 A JP 2001556325A JP 2001556325 A JP2001556325 A JP 2001556325A JP 2003521367 A JP2003521367 A JP 2003521367A
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アベル ベルナルト ウォステン，ヘルマン
ヘラルト ヒューベルト ウェッセルズ，ヨセフ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、表面にハイドロホビンのコーティングを提供するための、ハイドロホビン含有溶液を用いて物体の表面を処理する方法であり、前記物体が、窓、コンタクトレンズ、バイオセンサー、医療用装置、検査または貯蔵を行なうための容器、船の船体かまたは自動車の車枠または車体、および固体粒子から成る群より選ばれ、前記物体の表面がこれによりハイドロホビンでコートされた後に少なくとも３０℃の温度で処理されることを特徴とする方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、表面にハイドロホビンのコーティングを供給するための、ハイドロ
ホビン含有溶液を用いた物体表面の処理法に関する。
【０００２】 ハイドロホビンは、物体の表面に水に不溶性のコーティングを形成することが
できることで知られるタンパク質である。接着は非常に強力であるため、コーテ
ィングは２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中での煮沸により除去されるこ
とは不可能である。実際に、たとえばバイオセンサーの表面を、前記表面の疎水
性／親水性の性質を修飾するべく、ハイドロホビンを用いてコートすることが提
案されている。
【０００３】 ハイドロホビンの主張された強力な接着にもかかわらず、本出願人はこのこと
が確かに、常に事実というわけではないこと、またハイドロホビンはコートされ
た表面から比較的穏やかな条件下において遊離され得るものであり、特にこのこ
とは物体の企図された、および正常な使用の間にも起こり得ることを発見した。
【０００４】 本発明の目的は、前提項に従った方法であって、広範囲の条件下に前記表面に
堅固に結合したまま残るハイドロホビンでコートされた表面をもたらす方法を提
供することである。
【０００５】 この目的のため、本発明による方法は、物体が窓、コンタクトレンズ、バイオ
センサー、医療用装置、検査または貯蔵を行なうための容器、船の船体かまたは
自動車の車枠または車体、および固形粒子から成る群より選ばれ、前記物体の表
面がこれによりハイドロホビンでコートされた後に少なくとも３０℃の温度で処
理されることを特徴とする。
【０００６】 驚いたことに、温度処理は物体の表面からハイドロホビンが放出される可能性
を減じることが見出されている。いかなる理論にも縛られることなく、本出願人
は、この変化が永久的であると思われるという理由から、この挙動が構造上の変
化を含むという見解である。
【０００７】 本願においては、「窓」という用語は、車両のフロントガラス、建築物の窓、
または眼鏡レンズといった、枠にはめられたプラスティックまたはガラスの窓で
あることを意味する。貯蔵のための容器は、たとえば生物学的起源の物質のため
の、瓶などの容器である。該用語はまた、イムノアッセイなどの検定を行なうた
めのマイクロタイタープレートを含む。「医療用装置」という用語は、カテーテ
ルか、またはトロカール、内視鏡、クリップ、切断用具、または縫合ワイヤとい
った外科的装置などの、（生きた）動物の組織または体液と接触するための装置
として定義される。固形粒子は塗料粒子か、または球状金またはラテックス粒子
などの、分析用の目的のために用いられる粒子であってよく、これらの粒子は分
析の技術において、また特にイムノアッセイにおいて周知である。
【０００８】 ハイドロホビンは、疎水性−親水性界面において自己集合することの可能なよ
く定義された部類のタンパク質であり（参考文献１）、保存された配列、 Ｘn−Ｃ−Ｘ5〜9−Ｃ−Ｃ−Ｘ11〜39−Ｃ−Ｘ8〜23−Ｃ−Ｘ5〜9−Ｃ−Ｃ−Ｘ6
〜18−Ｃ−Ｘm ［式中、Ｘはもちろんいずれかのアミノ酸を表し、ｎおよびｍはもちろん独立し
て整数を表す］を有する。一般に、ハイドロホビンは１２５アミノ酸までの長さ
を有する。保存配列におけるシステイン残基（Ｃ）は、ジスルフィド架橋の部分
である。本発明においては、「ハイドロホビン」という用語は、機能上同等のタ
ンパク質を含むべくより広い意味を有しており、なお疎水性−親水性界面におけ
る自己集合の性質を示し、結果としてタンパク質フィルムを生じる、 Ｘn−Ｃ−Ｘ1〜50−Ｃ−Ｘ0〜5−Ｃ−Ｘ1〜100−Ｃ−Ｘ1〜100−Ｃ−Ｘ1〜50−
Ｃ−Ｘ0〜5−Ｃ−Ｘ1〜50−Ｃ−Ｘm の配列およびそれらの部分を含んでいるタンパク質の一群を含む。本発明の定義
によれば、自己集合は、タンパク質をテフロン（Teflon）に吸着することにより
、また二次構造（一般的にはα−ヘリックス）を確認するための円二色性の使用
により、検出されることが可能である（参考文献２）。フィルムの形成は、テフ
ロンシートをタンパク質溶液中でインキュベートすること、それに続く少なくと
も３回の水または緩衝液で洗浄により、容易に確認されることが可能である（参
考文献３）。タンパク質フィルムは、この技術において充分確立されているよう
な、蛍光性の化合物により標識すること、または蛍光性抗体の使用によるなどの
、任意の方法によって可視化されることが可能である。ｍおよびｎは、１から２
０００までの範囲の値を有してよい。定義に含められるのは、ハイドロホビンと
他のタンパク質との融合タンパク質である。
【０００９】 本発明は、フロントガラスまたは容器といった、物体が界面活性剤と接触する
か、または接触し得る例において特に適している。
【００１０】 いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本出願者は、円二色性
などの分光分析技術を用いて測定されることが可能であることから（参考文献２
）、二次構造における変化はα−ヘリックス状からβ−シート状への変化である
という見解である。不可逆的な変化を誘導するための適切な温度を決定するべく
、当業者は実行しやすい慣例的な実験に依存することが可能である。表面は所望
のハイドロホビンでコートされており、該表面は一定の温度において、１０分間
ほどの任意の時間をかけて処理される。その後、表面は周囲の温度において、０
．１％ツイーン（Tween）２０を含んでいる溶液ですすがれる。すすぎの後、ハ
イドロホビンの存在は、任意の適当な方法を用いて検出される。適当な方法とは
、たとえばハイドロホビンに対する（標識された）抗体の使用である。別法とし
て、表面をコートするために用いられるハイドロホビンは、蛍光性に、または放
射性に標識されたハイドロホビンである。
【００１１】 好ましくは、処理は、界面活性剤の存在下に、少なくとも３０℃の温度におい
て行なわれる。
【００１２】 界面活性剤は、周囲の温度においてハイドロホビンを溶出し得るが、少なくと
も３５℃といった高められた温度においては二次構造に変化をもたらし、界面活
性剤の存在下であってもハイドロホビンを不溶性にする。この変化は永久的であ
り、すなわち、コートされた表面が周囲の温度に戻された後でさえもである。処
理は溶液中のハイドロホビンの存在下に行なわれてもよい。
【００１３】 一般的には、界面活性剤は少なくとも０．００１（重量／体積）％、好ましく
は少なくとも０．０１重量／体積％、さらに好ましくは０．１重量／体積％、さ
らに最も好ましくは少なくとも１重量／体積％の濃度で存在する。
【００１４】 より高い濃度においては、二次構造における変化はさらに迅速に起る。
【００１５】 熱可塑性物質などの、温度感受性物質から成る物体については、温度は好まし
くは９０℃、好ましくは８０℃、さらに好ましくは６５℃を越えない。
【００１６】 このことは、エネルギーの節約につながり、適用可能な場合には、コートされ
るべき物体の変形を防止する。さらに低い温度で、より長い時間をかけた処理を
必要としてもよい。加えて、非特異的な結合を考慮して必要とされる標準に合致
するハイドロホビンを選ぶことは、完全に当業者の能力の範囲内にある。この態
様は、特にＥＬＩＳＡなどの検定に用いられるような、マイクロタイタープレー
トなどの容器のコーティングを可能にするが、この容器はしばしば、比較的低い
融点をもつ熱可塑性物質を材料として作られている。ＥＬＩＳＡなどの種々の検
定において、また種々の被検体に対して、洗剤が使用されるため、本発明の方法
なしにハイドロホビンを用いることは不可能であろう。
【００１７】 本発明は、以下の実施例を用いて、また図面を参照して次に説明されよう。 方法 Ａ） ハイドロホビンＳＣ３の精製 ハイドロホビンＳＣ３は、スキゾフィルム・コミューン（Schizophylum commu
ne）（ＣＢＳ３４０．８１）の株４〜４０の培養液から、記述されたように（１
，４）精製された。使用に先立ち、凍結乾燥されたＳＣ３は純粋なＴＦＡととも
に分解され、窒素流下に乾燥された。モノマー状のタンパク質は次いでＢ）のも
とに定義されるような緩衝液か、または水に溶解される。
【００１８】 Ｂ） 二次構造の測定 ＳＣ３の二次構造は、円二色性（ＣＤ）を用いて調べられた。ＣＤスペクトル
は、Ａｖｉｖ６２Ａ ＤＳ ＣＤスペクトロメーター（アビブ・アソウシエイツ
（Aviv Associates）、米国、ニュージャージー州、レイクウッズ）で、１９０
〜２５０ｎｍの波長領域にかけて、１ｍｍのクォーツキュベットを用いて記録さ
れた。試料の分画は、Ｎ2ガスとともに連続的に瀉水され、温度は種々に保たれ
、バンド幅１ｎｍ、ステップ幅１ｎｍ、およびポイントあたり１秒の平均化を用
いて、１０スキャンが平均化された。スペクトルは、タンパク質のない参考溶液
を用いて修正された。典型的には、５０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０中の１０μＭの
タンパク質濃度が用いられた。疎水性支持体に結合されたＳＣ３のスペクトルに
ついては、既知の方法（２）に続き、水中の１３０ｎｍの非安定化コロイド状テ
フロン球（デュポン・ド・ヌムール（Dupont de Nemours）、スイス、ジュネー
ブ）が溶液に添加された。
【００１９】 Ｃ） テフロンの結合 ＳＣ３によるテフロンのコーティングは、本質的にはWostenら（３）により記
述されたように査定された。完全に清浄化された（参考文献３）テフロンシート
（ノートン・フルオルプラスト（Norton Fluorplast）Ｂ．Ｖ．オランダ、レイ
アムスドンクスビア（Raamsdonksveer））は、水中の２０μｇ／ｍｌの35Ｓ−標
識ＳＣ３内で１６時間インキュベートされ、水を用いた各１０分間の３回の洗浄
が続けられた。35Ｓ−標識されたタンパク質の量は、シンチレーションカウンテ
ィングにより測定された。
【００２０】 実施例１ ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の５０μｇ／ｍｌのＳＣ３は、１３０
ｎｍの未安定化コロイド状テフロン球（デュポン・ド・ヌムール、スイス、ジュ
ネーブ）と２５℃において混合された。ＳＣ３は該テフロンの表面に吸着され、
α−ヘリックス状に達した（算出された適用表面９％）。
【００２１】 ＳＣ３でコートされたテフロン球の試料は、洗剤の存在下、または非存在下に
、徐々に８５℃まで加熱され（１℃／分）、さらにＣＤ−シグナルが続けられた
。 ＣＤ−シグナルはノーマライズされ、温度に対してプロットされた（図）。
【００２２】 洗剤の非存在下では、ＳＣ３はα−ヘリックス状態にとどまることが観察され
た。しかしながら、０．１％ツイーン８０の存在下では、５０％のＳＣ３が、±
５３℃においてモノマー状態から、集合したβ−シート状に変化した。完全な移
行は約７０℃において得られた。同様の効果が、０．１％ツイーン２０の存在下
の観察された。しかしながら、ＳＣ３の５０％は±３９℃においてその構造を変
化させており、完全な移行は６３℃において観察された。
【００２３】 試料を８５℃に加熱した後、試料は２５℃に冷却された。加熱されなかった試
料（前文参照）とは対照的にＳＣ３は脱離しなかったが、むしろβ−シート構造
に付着して残った。洗剤がない場合には、ＳＣ３はα−ヘリックス状に付着して
残った。０．１％ツイーン−２０についての７５℃より上での急降下は、球の沈
殿によって引き起こされたアーチファクトであった。
【００２４】 実験から、上記の実験条件下では、ツイーン−２０およびツイーン−８０の双
方はβ−シートへの構造変化の引き金を引き、また異なる温度においてそれを行
なう（０．１％ツイーン２０では６３℃において、０．１％ツイーン８０では７
０℃において）ことが結論づけられる。
【００２５】 驚いたことに、この構造変化が疎水性表面への強力な結合を得るために必要と
されることが見出されている。
【００２６】 実施例２ テフロンシート（２ｃｍ2、厚さ０．２５ｍｍ）は、２０μｇ／ｍｌの35Ｓ−
標識されたＳＣ３中で、室温において一晩インキュベートされた。続いて、ＳＣ
３コーティングシートを室温にて水で洗浄した。次いでシートは２％ツイーン２
０（ｐＨ７．０）または水（対照）により、室温または１００℃（対照）のいず
れかにおいて、３０分間にわたり処理された。テフロンシートから放出された放
射性ＳＣ３の量が測定された。パーセントは、もともとシートに結合された放射
能の量に対する相対値である。
【００２７】 放出されたＳＣ３の％ 室温 １００℃ ２％ツイーン２０ ７８％ ６％ 水（対照） ６％ ７％
【００２８】 シート（室温か、または１００℃において、ツイーン２０の非存在下または存
在下に処理）は、ひき続き、各々の洗浄溶液とともに、室温において３０分間イ
ンキュベートされた場合、表面からの何ら付加的なＳＣ３の脱離はない。この実
験から、熱および界面活性剤による処理の後、吸着されたハイドロホビンはもは
や界面活性剤では溶出され得ず、上記の物体のためのコーティングとしてより適
しているであろうと結論されることが可能である。
【００２９】 実施例３ ３５μｇのＳＣ３と０．２３ｍ2のコロイド状テフロンとを含んでいる３５０
μｌは、キュベット内において、以下の表に示されたように、一定の温度におい
てインキュベートされた。円二色性スペクトルは、１９０ｎｍと２５０ｎｍの間
で測定された。このことは、表に示されたすべての温度で、典型的なα−ヘリッ
クス状のスペクトルを示した。次いで、表に示された濃度まで界面活性剤が添加
された。ＣＤスペクトルは時間を追って追跡され、β−シートに達するまでの各
々の時間が表に示されている。
【００３０】
【表１】 結論： − より高い濃度のツイーン８０では、速度が増す。 − より高い温度では、速度が増す。
【００３１】 実施例４ テフロンシート（２ｃｍ2、厚さ０．２５ｍｍ）は、水中の１０μｇ／ｍｌの
標識（35Ｓ）されたＳＣ３内で、室温（ＲＴ）においてインキュベートされ、続
いて水で充分洗浄された。シートは引き続き、示された温度において、水中にて
３０分間インキュベートされた。
【００３２】 テフロンシートに固く結合して残っているＳＣ３のパーセントを測定するべく
、それらの半分は水中の０．１％ツイーン−２０を用いて３０分間抽出されたの
に対し、他の半分は各々の対照として使用された。残っているＳＣ３のパーセン
ト（各々の対照に対して）は、図２にプロットされている。この図から、３０℃
を越える温度でのインキュベーションは、表面に対する結合の強度を増すと結論
される。また、３０分間に及ぶ約６０℃の温度は、良好な結合のために充分であ
ることも理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 テフロン表面におけるＳＣ３の安定なβ−シート形の誘導に対するツイーン−
および温度の効果を示している。
【図２】 テフロン表面に結合して残存するＳＣ３の量を描いている。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年１月１１日（２００２．１．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】 この目的のため、本発明による方法は、物体が窓、コンタクトレンズ、バイオ
センサー、医療用装置、検査または貯蔵を行なうための容器、船の船体かまたは
自動車の車枠または車体、および固形粒子から成る群より選ばれ、前記物体の表
面がこれによりハイドロホビンでコートされた後に少なくとも３０℃の温度で処
理され、前記温度は８０℃を越えないことを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】 驚いたことに、温度処理は物体の表面からハイドロホビンが放出される可能性
を減じることが見出されている。いかなる理論にも縛られることなく、本出願人
は、この変化が永久的であると思われるという理由から、この挙動が構造上の変
化を含むという見解である。 Martin G.G.ら（Biopolymers 49, 621 - 633頁（1999））は、固体表面、特に
パラフィルム（Parafilm（登録商標））および雲母に対する、分泌された真菌成
分（ハイドロホビンおよびシゾフィラン）の分析を記述している。雲母シートは
、９０℃において、２％ＳＤＳで処理される。水の接触角のデータは、シゾフィ
ランおよびハイドロホビンが、雲母上にＳＤＳ抵抗性のコーティングを形成する
ことを示すことが結論される。未処理のハイドロホビンが穏やかな条件下に溶出
可能であることは、言及されていない。 De Vocht, M.L.ら、（Biophysical Journal, 74, 2059 - 2068頁（1998））は
、ハイドロホビンＳＤＳでコートされたテフロン表面の、２％ＳＤＳによる１０
０℃での処理について同様に記述している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】 熱可塑性物質などの、温度感受性物質から成る物体については、温度は好まし
くは６５℃を越えない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 スティヒティング フォール デ テヒニ ーセ ウェーテンスハッペン Ｓｔｉｃｈｔｉｎｇ ｖｏｏｒ ｄｅ Ｔ ｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｗｅｔｅｎｓｃｈａ ｐｐｅｎ オランダ国 ユトレヒト ファン フォレ ンホーフェンラーン 661 Ｖａｎ Ｖｏｌｌｅｎｈｏｖｅｎｌａａｎ 661，Ｕｔｒｅｃｈｔ，ｔｈｅ Ｎｅｔ ｈｅｒｌａｎｄｓ (72)発明者 デ フォヒト，マルセル レオ オランダ国 ヴールデン ベーランネン 61 (72)発明者 ウォステン，ヘルマン アベル ベルナル ト オランダ国 ゼイスト コンスタンチン フイヘンスラーン 19 (72)発明者 ウェッセルズ，ヨセフ ヘラルト ヒュー ベルト オランダ国 ミットラーレン トルハイス ウェフ 34 Ｆターム(参考） 4D075 BB24Z CA13 CA38 DA01 DA06 DA11 DA17 DA23 DB13 DB31 DB39 DC02 DC08 DC12 DC24 DC30 DC41 EB60 EC35 【要約の続き】

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 表面にハイドロホビンのコーティングを提供するため、ハイド
    ロホビン含有溶液で物体表面を処理する方法において、前記物体が、窓、コンタ
    クトレンズ、バイオセンサー、医療用装置、検査または貯蔵を行なうための容器
    、船の船体かまたは自動車の車枠または車体、および固形粒子から成る群より選
    ばれ、前記物体の表面がハイドロホビンでコートされた後に少なくとも３０℃の
    温度で処理されることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 少なくとも３０℃の温度における処理が、界面活性剤の存在下
    におこなわれることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記界面活性剤が少なくとも０．００１重量／体積％、好まし
    くは少なくとも０．０１重量／体積％、さらに好ましくは０．１体積／重量％、
    最も好ましくは少なくとも１重量／体積％の濃度で存在することを特徴とする、
    請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記温度が９０℃、好ましくは８０℃、さらに好ましくは６５
    ℃を越えないことを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
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