DE102005014844A1

DE102005014844A1 - Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen

Info

Publication number: DE102005014844A1
Application number: DE200510014844
Authority: DE
Inventors: Heike Dr. Becker; Claus Dr. Bollschweiler; Thomas Dr. Subkowski; Ulf Dr. Baus; Hans-Georg Dr. Lemaire; Marvin Dr. Karos
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2006-10-19
Also published as: CN101151359B; ES2353904T3; CN101151359A

Abstract

Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen, insbesondere in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche, Verfahren zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen, Reinigungsmittel für harte Oberflächen sowie harte Oberflächen mit einer schmutzabweisenden, Hydrophobine umfassenden Beschichtung.

Description

Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen, insbesondere in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche, ein Verfahren zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen, Reinigungsmittel für harte Oberflächen sowie harte Oberflächen mit einer schmutzabweisenden, Hydrophobine umfassenden Beschichtung.
Es ist bekannt, harte Oberflächen, wie beispielsweise Glas, Keramik oder Fußböden mit schmutzabweisenden Beschichtungen zu versehen. Diese Ausrüstungen sollen die Schmutzhaftung vermindern, die Verschmutzung von Oberflächen zumindest erschweren und nachfolgende Reinigungen erleichtern. So sollen beispielsweise Fette, Öle oder Kalkrückstände leichter ablösbar sein, oder es soll das Auftreten eingetrockneter Wasserspuren beim Ablaufen von Wasser vermieden werden.
Hierbei kann es sich um permanente, schmutzabweisende Beschichtungen, beispielsweise um dem Lotuseffekt nachempfundene Beschichtungen handeln.
Es kann sich aber auch um einen temporären Schutz handeln. Ein derartiger, temporärer schmutzabweisender Effekt kann beispielsweise durch Substanzen in einer Reinigerformulierung erreicht werden, welche beim Reinigen der Oberfläche aufgetragen werden. Wesentliche Anwendungsgebiete derartiger Reiniger sind Haushaltsanwendungen, wie Reiniger für den Küchen- oder Sanitärbereich, aber auch industrielle Anwendungen, wie beispielsweise Reiniger für die Autowäsche.
EP-A 467 472 offenbart eine Zusammensetzung zur Erhöhung der Hydrophilie von harten Oberflächen, beispielsweise Oberflächen im Haushalt, um ein erleichtertes Reinigen in nachfolgenden Reinigungsschritten zu erreichen. Die Formulierung enthält ein wasserlösliches, ionisches oder nichtionisches Polymer, beispielsweise ein kationisches Polymer mit quaternisierten Ammoniumalkylmethacrylat-Einheiten. Die offenbarten Reinigerformulierungen enthalten 0,02 bis 5 Gew. % des Polymeren.
WO 03/002620 offenbart die Verwendung von (Meth)acrylsäuredialkylaminoalkylestern als Soil-Release-Polymere für harte Oberflächen, beispielsweise Feinsteinböden oder Edelstahloberflächen. Die offenbarten Reinigerformulierungen enthalten 0,1 bis 5 Gew. % des Polymeren.
DE-A 100 61 897 offenbart Reinigungsmittel, die hydrophile, silikathaltige Partikel enthalten, die zu einer verbesserten Schmutzablösung bei gleichzeitiger Verringerung der Wiederanschmutzung führen. Die Partikel lagern sich auf der Oberfläche der zu reinigenden Substanzen an und verändern so die Oberflächeneigenschaften.
Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteristisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf.
Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.
Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Es können aber auch natürlich nicht vorkommende Hydrophobine mittels chemischer und/oder biotechnologischer Herstellverfahren synthetisiert werden. Unsere ältere Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart ein Herstellverfahren für Hydrophobine, die nicht in der Natur vorkommen.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen vorgeschlagen worden.
WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-in-Wasser-Emulsionen oder von Wasser-in-Öl-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen.
EP-A 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiffrümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 80°C.
WO 03/53383 offenbart die Verwendung von Hydrophobin zum Behandeln von Keratin-Materialien in kosmetischen Anwendungen.
WO 03/10331 offenbart einen mit Hydrophobin beschichteten Sensor, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z.B. elektroaktive Substanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.
Keine der zitierten Schriften offenbart die Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen.

Aufgabe der Erfindung war es, neuartige Techniken zur Schmutzabweisung bereit zu stellen.

Dementsprechend wurde die Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen gefunden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die schmutzabweisende Behandlung in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche vorgenommen.

In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen, bei dem man die Oberfläche mit einer Zusammensetzung umfassend mindestens ein Hydrophobin sowie mindestens ein Lösemittel in Kontakt bringt.

In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Reinigungsmittel für harte Oberflächen, welches mindestens ein Hydrophobin, mindestens ein Tensid sowie mindestens ein Lösemittel umfasst.

In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung harte Oberflächen, welche eine Hydrophobine umfassende, schmutzabweisende Beschichtung aufweisen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass schon äußerst geringe Mengen von Hydrophobinen zu einer wirksamen, schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen ausreichend sind.

Zu der Erfindung ist im Einzelnen das Folgende auszuführen:
Der Begriff „harte Oberflächen" ist dem Fachmann bekannt. Es handelt sich um nicht oder nur in geringem Maße kompressible Oberflächen, insbesondere um glatte Oberflächen, zum Beispiel Oberflächen aus Glas, Keramik, Metallen, wie beispielsweise Edelstahl oder Messing, Emaille, Kunststoff und/oder um lackierte Oberflächen. Beispiele lackierter Oberflächen umfassen die Oberfläche von lackierten Automobilkarosserien oder die Oberfläche von Haushaltsgeräten. Bei den harten Oberflächen kann es sich insbesondere um typische, im Haushalt vorkommende Oberflächen handeln, wie beispielsweise die Oberfläche von Fliesen, Fußböden, Armaturen, Waschbecken, Duschwannen, Badwannen, Toiletten, Duschkabinen, Badezimmermöbeln, Küchenmöbeln wie Tischen, Stühlen, Schränken, Arbeitsflächen oder sonstigen Möbeln, Spiegeln, Fenstern, Geschirr, Besteck, Gläsern, Porzellangegenständen oder die Oberflächen von Haushaltsgeräten wie Waschmaschinen, Geschirrspülmaschinen, Herde oder Dunstabzugshauben.

Der Begriff „schmutzabweisend" ist dem Fachmann bekannt. Mittels einer schmutzabweisenden Behandlung einer Oberfläche wird deren Verschmutzung verhindert oder zumindest erschwert und/oder die Ablösung von Schmutz von der Oberfläche erleichtert. Bei Schmutz handelt es sich in bekannter Art und Weise um alle Arten unerwünschter Kontamination von harten Oberflächen mit festen und/oder flüssigen Stoffen. Beispiele von Schmutz umfassen Fette, Öle, Eiweiße, Speisereste, Staub oder Erde. Bei Verschmutzungen kann es sich auch um Kalkablagerungen wie beispielsweise eingetrocknete Wasserspuren handeln, die sich aufgrund der Wasserhärte bilden. Weitere Beispiele umfassen Reste von Reinigungs- und Pflegemitteln zur Körperpflege oder auch unlösliche Kalkseifen, die sich aus derartigen Reinigungs- und Pflegemitteln in Verbindung mit Wasserhärte bilden können, und die sich auf harten Oberflächen wie beispielsweise Waschbecken, Duschverkleidungen oder Badewannen niederschlagen können.

Erfindungsgemäß wird zur schmutzabweisenden Behandlung der harten Oberflächen mindestens ein Hydrophobin verwendet. Es kann nur ein Hydrophobin oder ein Gemisch mehrerer, verschiedener Hydrophobine eingesetzt werden.

Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne dieser Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I) X_n-C¹-X_1–50-C²-X_0–5-C³-X_1–100-C⁴-X_1–100-C⁵-X_1–50-C⁶-X_0–5-C⁷-X_1–50-C⁸-X_m (I)verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) stehen kann. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300.

Die Polypetide sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken.

Die mit C¹ bis C⁸ benannten Cysteine können entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken.

Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II) X_n-C¹-X_3–25-C²-X_0–2-C³-X_5–50-C⁴-X_2–35-C⁵-X_2–15-C⁶-X_0–2-C⁷-X_3–35-C⁸-X_m (II) zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 300 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.

Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III) X_n-C¹-X_5–9-C²-C³-X_11–39-C⁴-X_2–23-C⁵-X_5–9-C⁶-C⁷-X_6–18-C⁸-X_m (III)eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.

Bei den Resten X_n und X_m kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. darunter sind auch solche Reste X_n und/oder X_m zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz verlängert ist.

Falls es sich bei X_n und/oder X_m um natürlicherweise nicht in Hydrophobinen vorkommende Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.

Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (X_n) und am Carboxyterminus (X_m) des Hydrophobinteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (X_n oder X_m) des erfindungsgemässen Proteins verknüpft werden.

Besonders geeignete Fusionspartner sind Polypeptide, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 15 und 16), yaae (SEQ ID NO: 17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 70–99%, besonders bevor zugt 80–98% der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind.

Die erfindungsgemäß verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.

Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Proteine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung einer Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.

Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die genauen experimentellen Bedingungen zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Proteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel eines Wassertropfens auf einer Glasoberfläche um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern.

Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hydrophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und II (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413–437).

Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1 % SDS bei erhöhter Temperatur) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA), bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse II Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60%iges Ethanol, bzw. 1 % SDS (bei Raumtemperatur) wieder aufgelöst werden.

Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C³ und C⁴ bei Klasse II Hydrophobinen deutlich kürzer ist, als bei Hydrophobinen der Klasse I. Klasse II Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.

Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobine, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.

Besonders geeignet zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Fusionsproteine mit den in SEQ ID NO: 20, 22, 24 dargestellten Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 19, 21, 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 22, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10. bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.

Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122–129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.

Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist in unserer älteren Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart.

Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfahren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschliesslich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, um fassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Techno-logy: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer"-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.

Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR- oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.

Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden. Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium-System zu verstehen.

Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III''3-B1, tgt11 oder pBdCl, in StreptomycespIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams- terdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'-und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen wer-den.

Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäß zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockout"-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden grampositive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.

Die im Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch"-weise, "semi-batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon können mittels eines rekombinanten Verfahrens hergestellt werden, bei dem man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die beispielsweise einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Weitere geeignete Tags sind z.B. HA, Calmodulin-BD, GST, MBD; Chitin-BD, Steptavidin-BD-Avi-Tag, Flag-Tag, T7 etc. Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. Die entsprechenden Reinigungsprotokolle sind von den kommerziellen Affinitäts-Tag-Anbietern erhältlich.

Die wie beschrieben hergestellten Proteine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.

Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen geeignet, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltlung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacca etch virus Protease).

Zur erfindungsgemäßen Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen können die Hydrophobine auch in Substanz verwendet werden. Bevorzugt werden die Hydrophobine aber als Formulierungen bzw. Zusammensetzungen in mindestens einem geeigneten Lösemittel eingesetzt.

Die Auswahl der Hydrophobine zur Ausführung der Erfindung ist nicht beschränkt. Es können ein Hydrophobin oder auch mehrere verschiedene eingesetzt werden. Der Fachmann trifft eine geeignete Auswahl. Beispielsweise können Fusionsproteine, wie beispielsweise yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) oder yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21) eingesetzt werden.

Bei den Lösemitteln für Formulierungen kann es sich um Wasser und/oder organische Lösemittel handeln. Selbstverständlich können auch Lösemittelgemische eingesetzt werden. Die Art des Lösemittels richtet sich nach dem Hydrophobin, der Art der zu behandelnden Oberfläche sowie der Anwendung und wird vom Fachmann entsprechend gewählt. Für Haushaltsanwendungen werden im Allgemeinen Wasser oder wässrige Formulierungen bevorzugt. Bei Industrieanwendungen kommen sowohl wässrige wie auch nichtwässrige Formulierungen in Frage.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Lösemittel um Wasser oder Gemische aus Wasser und mit Wasser mischbaren, organischen Lösemitteln. Beispiele derartiger organischer Lösemittel umfassen mit Wasser mischbare einwertige oder mehrwertige Alkohole, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Glycerin. Weiterhin kann es sich auch um Etheralkohole handeln. Beispiele umfassen Monoalkylether von (Poly)ethylen- oder (Poly)propylenglykolen wie Ethylenglykolmonobutylether. Art und Menge der wasserlöslichen, organischen Lösemittel werden vom Fachmann gewählt.

Zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Zusammensetzung können bevorzugt die bei der Synthese, Isolierung und/oder Reinigung der Hydrophobine erhaltenen wässrigen Lösungen der Hydrophobine eingesetzt werden. Diese können je nach Reinheit noch Reste von Hilfsstoffen aus der Synthese enthalten. Selbstverständlich können die Hydrophobine aber auch zunächst als Substanz isoliert werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen, und erst in einem zweiten Schritt formuliert werden.

Die Menge der Hydrophobine in der Formulierung kann vom Fachmann je nach der Art der Oberfläche und/oder der Anwendung bestimmt werden. Es sind aber schon relativ kleine Mengen ausreichend, um eine schmutzabweisende Wirkung zu erzielen. Bewährt hat sich eine Menge von 0,0001 bis 1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile der Formulierung, ohne dass die Erfindung damit auf diesen Bereich beschränkt sein soll. Bevorzugt beträgt die Menge von 0,0005 bis 0,5 Gew. % und besonders bevorzugt 0,001 bis 0,1 Gew. %.

Bevorzugt handelt es sich bei der verwendeten Zusammensetzung um ein Reinigungsmittel, wie beispielsweise Glasreiniger, Fußbodenreiniger, Allzweckreiniger, Badreiniger, Klarspüler, Geschirrspülmittel zur Hand- oder Maschinenreinigung von Geschirr, Maschinenreiniger, Metallentfetter, Hochdruckreiniger, alkalische Reiniger, saure Reiniger, Spitzenentfetter oder Molkereireiniger. Das erfindungsgemäße Reinigungsmittelumfasst neben einem Lösemittel und mindestens einem Hydrophobin in prinzipiell bekannter Art und Weise eines oder mehrere Tenside in wirksamen Mengen.

Bei den Zusammensetzungen kann es sich auch um Vor- oder Nachbehandlungsmittel für harte Oberflächen, insbesondere für Glas, Keramik oder Fußböden handeln.

Bei den Tensiden kann es sich um anionische, nichtionische, amphotere und/oder kationische Tenside handeln. Derartige Tenside sowie deren jeweils bevorzugter Einsatzweck sind dem Fachmann prinzipiell bekannt.

Beispiele anionischer Tenside umfassen Fettalkoholsulfate, Alkylethersulfate, Alkansulfonate, Alkylbenzolsulfonate oder Alkylphosphate. Es können die freien Säuren oder Salze davon eingesetzt werden.

Beispiele nichtionischer Tenside umfassen alkoxylierte C₈-C₂₂-Alkohole wie Fettalkoholalkoxylate oder Oxoalkoholalkoxylate, Alkylphenolethoxylate mit C₆-C₁₄-Alkylketten und 5 bis 30 Mol Ethylenoxideinheiten, Alkylpolyglucoside mit 8 bis 22 in der Alkylkette, Alkylaminalkoxylate oder Alkylamidethoxylate.

Beispiele amphoterer Tenside umfassen Alkylbetaine, Alkylamidbetaine, Aminopropionate, Aminoglycinate oder amphotere Imidazoliumverbindungen.

Beispiele kationischer Tenside umfassen substituierte oder unsubstituierte, geradkettige oder verzweigte quartäre Ammoniumsalze, z.B. C_8–6-Dialkyldimethylammoniumhalogenide, Dialkoxydimethylammoniumlialogenide oder Imidazoliumsalze mit langkettigem Alkylrest.

Weitere Beispiele von Tensiden sind in DE-A 101 60 993, Abschnitten [0056] bis [0073] aufgeführt.

Der Fachmann trifft hinsichtlich von Art und Menge der Tensiden eine geeignete Auswahl. Bewährt hat sich eine Menge von 0,01 bis 30 Gew. % Tenside bezüglich der Summe aller Komponenten der Formulierung.

Die Formulierung kann optional darüber hinaus noch weitere Komponenten, beispielsweise Zusatzstoffe und/oder Hilfsmittel umfassen. Beispiele derartiger Komponenten umfassen Säuren oder Basen, beispielsweise Carbonäuren oder Ammoniak, Puffersysteme, Polymere, anorganische Partikel wie SiO₂ oder Silikate, Farbstoffe, Duftstoffe oder Biozide. Weitere Beispiele von Zusatzstoffen sind in DE-A 101 60 993, insbesondere Abschnitte [0074] bis [0131] aufgeführt. Der Fachmann trifft hinsichtlich der Art und Menge zusätzlicher Komponenten je nach der Anwendung eine geeignete Auswahl.

Erfindungsgemäß wird die schmutzabweisende Behandlung harter Oberflächen vorgenommen, indem man die harte Oberfläche mit einer Zusammensetzung umfassend mindestens ein Hydrophobin sowie mindestens ein Lösemittel in Kontakt bringt.

Das „In-Kontakt-Bringen" richtet sich nach der Art des Gegenstandes. Es kann beispielsweise durch Besprühen, Spülen oder Wischen der Oberfläche mit der Zusammensetzung erfolgen oder auch durch Eintauchen des gesamten Gegenstandes in die Formulierung. Letzteres ist naturgemäß nur bei nicht eingebauten Gegenständen möglich. Die Behandlungsdauer wird vom Fachmann festgelegt. Sie kann wenige Sekunden bis zu mehreren Stunden dauern. Die Oberfläche kann nach der Behandlung zur Entfernung überschüssiger Behandlungslösung nachgespült werden, beispielsweise mit Wasser.

Die schmutzabweisende Behandlung kann besonders vorteilhaft in Kombination mit einer Reinigung, d.h. im Zuge des eigentlichen Reinigungsvorganges selbst erfolgen. Hierzu wird ein Reinigungsmittel eingesetzt, welches wie oben beschrieben mindestens ein Hydrophobin, mindestens ein Tensid sowie mindestens ein Lösemittel umfasst.

Die Behandlung kann bei Temperaturen unterhalb von Raumtemperatur, bei Raumtemperatur oder bei erhöhten Temperaturen vorgenommen werden, beispielsweise bei 20 bis 100°C, bevorzugt 20 bis 60°C. Bevorzugt wird die Behandlung bei Temperaturen von nicht mehr als 30°C vorgenommen, insbesondere 20 bis 30°C.

Nach dem Behandeln mit der Zusammensetzung wird die behandelte Oberfläche getrocknet. Das Trocknen der behandelten Oberfläche kann, quasi von selbst, bei Raumtemperatur erfolgen, oder es kann auch bei erhöhten Temperaturen getrocknet werden.

An die Behandlung sowie ggf. das Trocknen der Oberfläche kann sich eine thermische Nachbehandlung der Oberfläche bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise bei Temperaturen von bis zu 120°C anschließen. Die thermische Nachbehandlung kann natürlich auch kombiniert mit der Trocknung vorgenommen werden. Bevorzugt betragen die Temperaturen bei einer thermischen Nachbehandlung 30 bis 100°C, besonders bevorzugt 40 bis 80°C und beispielsweise 50 bis 70°C. Die Behandlungsdauer wird vom Fachmann festgelegt, sie kann beispielsweise von 1 min bis 10 h betragen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist eine harte Oberfläche erhältlich, die eine schmutzabweisende, mindestens ein Hydrophobin umfassende Beschichtung aufweist. Bei der Beschichtung handelt es sich in der Regel mindestens um eine monomolekulare Schicht des Hydrophobins auf der Oberfläche.

Die schmutzabweisende Wirkung kann mittels prinzipiell bekannter Methoden bestimmt werden, beispielsweise, indem man die Ablösbarkeit von Schmutz durch Abspülen mit Wasser von einer unbehandelten und einer mit Hydrophobinen behandelten Oberfläche vergleicht.

Die Hydrophobine weisen bereits in geringen Mengen eine deutliche Wirkung auf. Bereits die Behandlung mit einer nur 0,01 Gew. % Hydrophobine enthaltenden Zusammensetzung führt zu einer deutlich verbesserten Schmutzablösung.

Die erfindungsgemäße, schmutzabweisende Behandlung eignet sich besonders vorteilhaft für keramische Oberflächen, wie beispielsweise für Fliesen. Hier kann über die schmutzabweisende Wirkung hinaus durch die Behandlung auch noch eine deutliche Hydrophobierung der Oberfläche erreicht werden. Dies ist insbesondere in Feuchträumen, wie beispielsweise Badezimmern ein weiterer Vorteil.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

Teil A:

Herstellung und Test der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine

Beispiel 1
Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-His₆/yaaE-His₆
Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (Hal 572/Hal 573) wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD/yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine NcoI bzw. BglII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BglII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BglII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS₆ bzw. YAAE::HIS₆ verwendet werden.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
Beispiel 2
Klonierung von yaad-Hydrophobin DewA-His₆
Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BglII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 kloniert.
Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS₆ verwendet werden.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC
Beispiel 3
Klonierung von yaad-Hydrophobin RodA-His₆
Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Beispiel 4
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF1-His₆
Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz – Hydrophobin BASF1 – eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 5
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF2-His₆
Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz – Hydrophobin BASF2 – eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 6
Klonierung von yaad-Hydrophobin SC3-His₆
Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.
Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Beispiel 7
Fermentation des rekombinanten E. coli Stammes yaad-Hydrophobin DewA-His₆
Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His₆ exprimierenden E. coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 1l Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1 ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.
13.5l LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 20l Fermenter mit 0,5l Vorkultur (OD_600nm 1:10 gegen H₂O gemessen) animpfen. Bei einer OD_60nm von ~3.5 Zugabe von 140ml 100mM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
Beispiel 8
Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins (Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminates His6-tag besitzen)
100 g Zellpellet (100–500 mg Hydrophobin) werden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum Zellaufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E. coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
1 zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins:

Spur 1: Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1:10 Verdünnung)

Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt

Spuren 3–5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen
Das Hydrophobin der 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.
Beispiel 9
Technische Prüfung; Charakterisierung des Hydrophobins durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat:

Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim): Konzentration Hydrophobin: 100 μg/mL
Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur 80°C) in 50mM Na-Acetat pH 4 + 0,1 % Tween 20 danach Beschichtung waschen in destilliertem Wasser danach Inkubation 10min/80°C/1 % SDS-Lösung in dest. Wasser
Waschen in dest. Wasser

Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5μl Wasser bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; eine Beschichtung mit dem funktionellen Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his₆) ergab Kontaktwinkel von 75 ± 5°.
Teil B:
Verwendung der Hydrophobine zur schmutzabweisenden Beschichtung von harten Oberflächen
Verwendete Lösung:
Für die anwendungstechnischen Versuche wurde eine Lösung des gemäß Beispiel 8 hergestellten Fusionsproteines yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) in Wasser eingesetzt. Konzentration des Hydrophobins in Lösung: 100 μg/ml (0,01 Gew. %).
Verwendete harte Oberfläche:
Keramikfliese, weiss glänzend, 10 cm × 15 cm (Fa. Novocker), mit Ethanol und Wasser abgewischt.
Verwendeter Schmutz:
Für die Tests wurde IKW-Ballastschmutz verwendet (gemäß Seifen, Fette, Öle, Wachse (SÖFW)-Journal, 124. Jg., 14/98, S. 1029)
Durchführung der Behandlung
Auf eine Fliese wurden 2 g der oben erwähnten, wässrigen Hydrophobinlösung mit einer Konzentration von 100 μg/ml aufgetropft (1,3 μm Hydrophobin/cm²) und mit einem Tuch leicht verrieben, so dass die gesamte Oberfläche bedeckt war. Die Fliese wurde daraufhin liegend für 24 h an Luft getrocknet.
Anschließend wurde die Fliese mit Wasser abgespült und für 3 × 10 min in ein Becherglas mit Wasser gestellt. Für jedes Spülen wurde frisches Wasser verwendet. Die Fliese wurde dann stehend an Luft getrocknet.
Kontaktwinkelmessung und schmutzabweisende Wirkung
Auf der behandelten Fliese wurde mit einem Wassertropfen ein Kontaktwinkel von 56° gemessen (Mittelwert aus 10 Messungen). Eine unbehandelte Fliese im Vergleich zeigt einen Kontaktwinkel von 20°. Die Fliese wurde also deutlich hydrophobiert.
Auf die behandelte Fliese und zum Vergleich auch auf eine unbehandelte wurden mit einer Transferpipette jeweils 50, 100 und 200 μg IKW-Ballastschmutz punktförmig aufgetragen und für eine h bei Raumtemperatur getrocknet.
Die Fliesen wurden dann 3 x mit jeweils 500 ml Wasser gespült. Während sich von der unbehandelten Oberfläche der Schmutz dabei nicht ablöste, konnte von der mit Hydrophobin vorbehandelten Kachel eine teilweise Schmutzablösung beobachtet werden.
Die Vorbehandlung mit Hydrophobin führte somit zu einer geringeren Schmutzhaftung.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die schmutzabweisende Behandlung in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche vorgenommen wird.
Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Behandlung ein Reinigungsmittel umfassend mindestens ein Hydrophobin, ein Tensid sowie ein Lösemittel einsetzt.
Verfahren zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oberfläche mit einer Zusammensetzung umfassend mindestens ein Hydrophobin sowie ein Lösemittel in Kontakt bringt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zusammensetzung um ein Reinigungsmittel umfassend mindestens ein Hydrophobin, ein Tensid sowie ein Lösemittel handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Hydrophobine in der Zusammensetzung 0,0001 bis 1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile der Zusammensetzung beträgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung bei Temperaturen unterhalb von 30°C vornimmt.
Reinigungsmittel für harte Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass das Reinigungsmittel mindestens ein Hydrophobin, mindestens ein Tensid sowie ein Lösemittelumfasst.
Reinigungsmittel gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei mindestens einem der Lösemittel um Wasser handelt.
Reinigungsmittel gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Hydrophobine 0,0001 bis 1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile des Reinigungsmittels beträgt.
Reinigungsmittel gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Hydrophobine 0,001 bis 0,1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile des Reinigungsmittels beträgt.