MX2007012023A - Uso de hidrofobina para tratamiento repelente a suciedad de superficies duras. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de hidrofobina para proveer superficies duras con una propiedad repelente a suciedad, en particular en combinacion con limpieza a superficies, a un metodo para tratamiento repelente a suciedad de superficie dura, a un agente limpiador de superficie dura y a superficies duras provistas con un revestimiento repelente a suciedad que contiene hidrofobina.

Description

USO DE HIDROFOBINA PARA TRATAMIENTO REPELENTE A SUCIEDAD DE SUPERFICIES DURAS La presente invención se refiere al uso de hidrofobinas para el tratamiento repelente a suciedad de superficies duras, en particular en combinación con una limpieza de la superficie, procesos para tratamiento repelente a suciedad de superficies duras, agentes limpiadores para superficies duras y también superficies duras con un revestimiento repelente a suciedad que comprende hidrofobinas. Se sabe proveer superficies duras, por ejemplo, vidrio, cerámica o pisos, con revestimientos repelentes a suciedad. Estos acabados deben reducir la adhesión de suciedad, controlar la suciedad de superficies y facilitar la limpieza posterior. Por ejemplo, grasas, aceites y residuos de cal deben ser más fáciles de quitar, o se debe evitar la incidencia de rastros secos de agua conforme escurre el agua. Los revestimientos pueden ser revestimientos repelentes a suciedad permanentes, por ejemplo, revestimientos inspirados por el efecto loto. Los revestimientos también pueden ser revestimientos temporales. Dicho efecto repelente a suciedad temporal se puede lograr, por ejemplo, vía sustancias en una formulación limpiadora que se aplican mientras se limpia la superficie. Campos significativos de uso para dichos limpiadores son aplicaciones domésticas, tales como limpiadores para la cocina o baños, pero también aplicaciones industriales, por ejemplo, limpiadores para lavado de autos. EP-A 467 472 describe una composición para elevar la hidrofilicidad de superficies dur£|S, por ejemplo, superficies domésticas, a fin de que se pueda lograr limpieza más fácil en pasos de limpieza posteriores. La formulación comprende un polímero soluble en agua, iónico o no iónico, por ejemplo, un polímero catiónico teniendo unidades de alquil metacrilato de amonio cuaternizado. Las formulaciones limpiadoras descritas comprenden 0.02% a 5% en peso del polímero. WO 03/002620 describe el uso de dialquilaminoalquil (met)acrilatos como polímeros de liberación de suciedad para superficies duras, por ejemplo, pisos de piedra fina o superficies de acero inoxidable. Las formulaciones limpiadoras descritas comprenden 0.1% a 5% en peso del polímero. DE-A 100 61 897 describe composiciones de limpieza comprendiendo partículas hidrofílicas con silicato que conducen a desprendimiento de suciedad mejorado acoplado con reensuciamiento reducido. Las partículas son tomadas por la superficie de los sustratos a ser limpiados y por consiguiente afectan las propiedades de la superficie. Las hidrofobinas son proteínas pequeñas de aproximadamente 100 a 150 aminoácidos que son característicos de hongos filamentosos, por ejemplo Schizophyllum commune. Por lo general tienen 8 unidades de cisteína. Las hidrofobinas tienen una afinidad marcada por ¡nterfaces y por tanto son útiles para revestir superficies. Por ejemplo, Teflón se puede revestir con hidrofobinas para obtener una superficie hidrofílica. Las hidrofobinas se pueden aislar de recursos naturales. Pero también es posible sintetizar hidrofobinas que no ocurren de manera natural por medio de métodos químicos y/o biotecnológicos de producción. Nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4 describe un proceso para producir hidrofobinas que no ocurren en naturaleza.

Hay técnica anterior proponiendo el uso de hidrofobinas para varias aplicaciones. WO 96/41882 propone el uso de hidrofobinas como emulsores, espesantes o agentes tensioactivos, para dar propiedades hidrofílicas a superficies hidrofóbícas, para mejorar la resistencia a agua de sustratos hidrofílicos, para preparar emulsiones de aceite en agua o emulsiones de agua en aceite. Otras propuestas incluyen aplicaciones farmacéuticas tal como la preparación de ungüentos o cremas y también aplicaciones cosméticas tal como protección de la piel o la producción de champús o acondicionadores. EP-A 1 252 516 describe el revestimiento de ventanas, lentes de contacto, biosensores, dispositivos médicos, contenedores para realizar ensayos o para almacenamiento, cascos de buque, partículas sólidas o marco o cuerpo de automóviles con una solución conteniendo hidrofobina a 30 a 80°C. WO 03/53383 describe el uso de hidrofobina para tratar materiales de keratina en aplicaciones cosméticas.

WO 03/10331 describe un sensor revestido con hidrofobina (un electrodo de medición, por ejemplo) al que otras sustancias, por ejemplo sustancias electro-activas, anticuerpo o enzimas, se unen no covalentemente. Ninguna de las referencias citadas describe el uso de hidrofobinas para el tratamiento repelente a suciedad de superficies duras. Un objeto de la presente invención es proveer técnicas novedosas para repeler suciedad. Se ha descubierto que este objeto se logra por el uso de una hidrofobina para tratamiento repelente a suciedad de superficies duras. En una modalidad preferida de la presente invención, el tratamiento repelente a suciedad se realiza en combinación con una limpieza de la superficie. En un segundo aspecto, la presente invención provee un proceso para tratamiento repelente a suciedad de superficies duras que comprende contactar la superficie con una composición que comprende al menos una hidrofobina y también por lo menos un solvente. En un tercer aspecto, la presente invención provee un agente limpiador para superficies duras que comprende al menos una hidrofobina, por lo menos un agente tensioactivo y también al menos un solvente. En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a superficies duras que comprenden un revestimiento repelente a suciedad que comprende hidrofobinas. De manera sorprendente se descubrió que, incluso cantidades extremadamente pequeñas de hidrofobinas, son suficientes para un tratamiento repelente a suciedad efectivo de superficies duras. Una descripción detallada de la presente invención sigue: El término "superficies duras" es conocido a un experto en la técnica. Superficies duras son superficies que son sólo compresibles al mínimo, si acaso, en particular superficies lisas, por ejemplo, superficies de vidrio, cerámica, metales, por ejemplo acero inoxidable o latón, barniz, plástico y/o superficies laqueadas. Ejemplos de superficies laqueadas comprenden la superficie de carrocerías automotrices laqueadas o la superficie de aparatos domésticos. Las superficies duras pueden comprender en particular superficies del hogar típicas, por ejemplo, la superficie de azulejos, pisos, ajustes, lavabos, regaderas, tinas, tazas de baño, bañeras, muebles de baño, muebles de cocina tales como mesas, sillas, despensas, superficies de trabajo u otros muebles, espejos, ventanas, platos, cubiertos, vasos, artículos de porcelana o las superficies de aparatos domésticos tales como lavadoras, lavatrastes, ollas o campanas de extracción. El término "repelente a suciedad" es conocido a un experto en la técnica. Un tratamiento repelente a suciedad de una superficie controla su suciedad y/o facilita el desprendimiento de suciedad de la superficie. La suciedad comprende en una manera conocida cualquier clase de contaminación no deseada de superficies duras con entidades sólidas y/o líquidas. Ejemplos de suciedad comprenden grasas, aceites, proteínas, desperdicios de comida, polvo o mugre. La suciedad también puede comprender depósitos de cal tales como, por ejemplo, huellas secas de agua que se forman debido a dureza de agua. Otros ejemplos comprenden residuos de agentes de limpieza y cuidado de cuidado personal o jabones de cal insolubles que se pueden formar de dichos agentes de limpieza y cuidado junto con dureza de agua y que se pueden depositar en superficies duras tales como, por ejemplo, lavabos, regaderas o tinas. De acuerdo con la presente invención, por lo menos una hidrofobina se usa para el tratamiento repelente a suciedad de superficies duras. Justo una hidrofobina se puede usar o se puede usar una mezcla de una pluralidad de hidrofobinas diferentes. El término "hidrofobinas" como se usa en la presente se debe referir más adelante a polipéptidos de la fórmula general estructural (I) Xn-C -X?_50-C -X0-5-C -X1-100-C -X1-100-C -X1-50-C -X0-5-C -X1-50-C -Xm (I) en donde X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, He, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly). Cada X puede ser la misma o diferente. Los índices junto a X indican en cada caso el número de aminoácidos, C representa cisteína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina sujeto a la condición de que por lo menos cuatro de los aminoácidos identificados por C son cisteina, y los índices n y m son independientemente números naturales en la escala de 0 a 500 y de preferencia en la escala de 15 a 300. Los polipéptidos de la fórmula (I) se caracterizan además por la propiedad (después de revestir una superficie de vidrio) de aumentar el ángulo de contacto de una gota de agua por al menos 20°, de preferencia al menos 25°, más preferible al menos 30° y muy preferible al menos 35°, en comparación con el ángulo de contacto formado por una gota de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no revestida, cada medición siendo llevada a cabo a temperatura ambiente. Los aminoácidos indicados C1 a C8 son de preferencia cisteínas; pero también pueden ser reemplazados por otros aminoácidos de volumen similar, de preferencia por alanina, serina, treonina, metionina o glicina. Sin embargo, por lo menos cuatro, de preferencia al menos 5, más preferible al menos 6 y en especial por lo menos 7 de las posiciones C a C8 deben consistir de cisteínas. Las cisteínas en proteínas usadas de conformidad con la presente invención pueden estar presentes en forma reducida o formar puentes de disulfuro entre sí. Se da particular preferencia a formación intramolecular de puentes C-C, en particular involucrando al menos uno, de preferencia 2, más preferible 3 y muy preferible 4 puentes de disulfuro intramoleculares. En el caso del intercambio antes descrito de cisteínas para aminoácidos de volumen similar, es ventajoso para dichas posiciones C estar involucradas en un intercambio en forma de par ya que son capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares entre sí. Cuando se usan cisteínas, serínas, alaninas, glicinas, metioninas o treoninas en las posiciones designadas X, la numeración de las posiciones C individuales en las fórmulas generales puede cambiar por consiguiente. Se da preferencia a usar hidrofobinas de la fórmula general (II) Xn-C -X3_25-C -Xo-2~ -X5.50-C -X2-35-C -X2-15-C -X0-2-C -X3-35-C -X, (ll) en donde X, C y los índices junto a X son cada uno como se definió antes, los índices n y m representan números en la escala de 0 a 300, y las proteínas se distinguen además por el cambio de ángulo de contacto mencionado antes. Se da preferencia a usar hidrofobinas de la fórmula general (lll) (lll) en donde X, C y los índices junto a X son cada uno como se definió antes, los índices n y m representan números en la escala de 0 a 200, las proteínas se distinguen además por el cambio de ángulo de contacto antes mencionado y además al menos seis de los aminoácidos indicados C son cisteína. Es particularmente preferible para todos los aminoácidos indicados C ser cisteína. Los residuos Xn y Xm pueden ser secuencias de péptido que se ligan naturalmente a una hidrofobina. Sin embargo, uno o ambos de los residuos Xn y Xm pueden ser secuencias de péptido que no se ligan naturalmente a una hidrofobina. Esto también incluye residuos de Xn y/o Xm en donde una secuencia de péptido que ocurre de manera natural en una hidrofobina se extiende por una secuencia de péptido no ocurriendo de manera natural en una hidrofobina. Cuando Xn y/o Xm son secuencias de péptido que no ocurren de manera natural en hidrofobinas, la longitud de dichas secuencias por lo general es al menos 20 aminoácidos, de preferencia por lo menos 35 aminoácidos, más preferible al menos 50 aminoácidos y muy preferible por lo menos 100 aminoácidos. Un residuo de esta clase, que no está ligado de manera natural a una hidrofobina, también será referido como una porción de pareja de fusión más adelante. Esto es para articular el hecho de que las proteínas consisten de una porción de hidrofobina y una porción de pareja de fusión que no ocurren juntas en esta forma en naturaleza. La porción de pareja de fusión se puede seleccionar a partir de una multiplicidad de proteínas. También es posible para una pluralidad de porciones de pareja de fusión ligarse a una porción de hidrofobina, por ejemplo, a la terminal de aminoácido (Xn) o a la terminal carboxi (Xm) de la porción de hidrofobina. Pero también es posible, por ejemplo, ligar dos porciones de pareja de fusión a una posición (Xn o Xm) de la proteína usada de conformidad con la preseníe invención. Las porciones de pareja de fusión paríicularmeníe adecuadas son polipépíidos que ocurren de manera nalural en microorganismos, en particular en E. coli o Bacillus subtilis. Ejemplos de dichas porciones de pareja de fusión son las secuencias yaad (SEC ID NO: 15 y 16), yaae (SEC ID NO: 17 y 18) y tioredoxina. También allamenle adecuados son fragmenlos o derivados de las secuencias aníes mencionadas que comprenden sólo una porción, de preferencia 70% a 99% y más preferible 80% a 98% de dichas secuencias, o en donde aminoácidos individuales o nucleóíidos se han alíerado en comparación con la secuencia mencionada. Las proleínas usadas de conformidad con la preseníe invención se pueden modificar adicionalmenle en su secuencia de polipéplido, por ejemplo, medíanle glicosilación, acelilación o ya sea por entrelazamiento químico, por ejemplo con glutaraldehído. Una propiedad de las proteínas usadas de conformidad con la presente invención es el cambio en propiedades de superficie cuando las superficies se revisten con las proteínas. El cambio en propiedades de superficie se puede determinar experimentalmente al medir el ángulo de contacío de una goía de agua anles y después de reveslir la superficie con la proleína y deíerminar la diferencia enlre las dos mediciones. Un experío en la íécnica conocerá en principio cómo realizar mediciones de ángulo de conlaclo. Las condiciones experimenlales precisas para medir el ángulo de contacto se describen en la porción experimental. Bajo las condiciones mencionadas aquí, las proteínas usadas de conformidad con la presente invención tienen la propiedad de aumentar el ángulo de contacto de una gota de agua en una superficie de vidrio por al menos 20°, de preferencia por lo menos 25° y más preferible por lo menos 30°. Las posiciones de los aminoácidos polares y apolares en la porción de hidrofobina de las hidrofobinas conocidas a la fecha se conservan, resultando en un gráfico de hidrofobicidad característica. Las diferencias en propiedades biofísicas e hidrofobicidad condujeron a las hidrofobinas conocidas a la fecha a clasificarse en dos clases, I y II (Wessels et al., Ann. Rev. Phytopathol., 1994, 32, 413-437). Las membranas ensambladas de hidrofobinas de clase I son altamente insolubles (incluso en una solución acuosa de 1% en peso de n-dodecil sulfato de sodio (SDS) a una temperalura elevada y sólo se puede desasociar una vez más por medio de ácido írifluoroacético concentrado (TFA) o ácido fórmico). En contraste, las formas ensambladas de hidrofobinas de clase II son menos estables. Se pueden disolver una vez más por medio de juslo 60% en peso de etanol o 1% en peso de SDS (a temperalura ambienle). La comparación de las secuencias de aminoácidos revela que la longitud de la región entre cisteína C3 y cisteína C4 es distintamente más corta en hidrofobinas de clase II que en hidrofobinas de clase I. Las hidrofobinas de clase II tienen además más aminoácidos cargados que la clase I.

Las hidrofobinas particularmente preferidas para mostrar la presente invención son aquellas del tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, que se caracterizan estrucluralmente en el listado de secuencia más adelante. También sólo pueden ser partes o derivados de las mismas. También es posible ligar una pluralidad de hidrofobina, de preferencia 2 ó 3, de la misma o diferente estruclura y a una secuencia de polipéptido adecuada correspondiente que no se conecta de manera natural a una hidrofobina. De particular idoneidad para la práctica de la presente invención son además las proteínas de fusión teniendo las secuencias de polipéplido indicadas en SEC ID NO: 20, 22, 24 y íambién las secuencias de ácido nucleico codificando para las mismas, en particular las secuencias que codifican a SEC ID NO: 19, 21, 23. Las modalidades particularmente preferidas incluyen además proteínas que, partiendo de las secuencias de polipéptido indicadas en SEC ID NO: 20, 22 ó 24, resultan de la sustilución, inserción u omisión de al menos, hasla 10, preferiblemeníe 5, más preferible 5% de todos los aminoácidos y que todavía posee por lo menos 50% de la propiedad biológica de las proteínas de paríida. La propiedad biológica de las proíeínas usadas de conformidad con la preseníe invención en la preseníe se debe enlender como significando el cambio aníes mencionado en el ángulo de conlacío por al menos 20°.

Los polipéplidos usados de conformidad con la presente invención se pueden preparar químicamente por técnicas familiares de síntesis de péptido, por ejemplo, por síntesis de fase sólida de Merrifield. Las hidrofobinas que ocurren de manera natural se pueden aislar de fuentes naturales usando méíodos adecuados. Como un ejemplo, ver Wóslen el al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO 96/41882. Las proleínas de fusión se pueden preparar de preferencia por procesos de ingeniería genética en donde una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia de ADN, codificando para la pareja de fusión y una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia de ADN, codificando para la porción de hidrofobina se combinan de modo que la proteína deseada se genera en un organismo huésped por expresión de genes de la secuencia de ácido nucleico combinada. Dicho método de hacer se describe en nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4. Organismos huésped adecuados, o productores, para el méíodo de hacer procarioías (incluyendo Archaea) o eucariotas, en particular bacteria incluyendo halobacteria y meíanococci, hongos, células de insecto, células vegetales y células de mamífero, más preferible Escherichia coli, Bacillus subtillis, Bacillus megaíerium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pasloris, Pseudomonas spec., lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (o células relacionadas), y así sucesivamente. Para los propósitos de la presente invención las construcciones de expresión obtenidas, bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico reguladoras, una secuencia de ácido nucleico codificando para un polipéplido usado de conformidad con la présenle invención, y también vectores comprendiendo al menos una de estas construcciones de expresión se pueden usar para preparar hidrofobínas. Las construcciones de expresión usadas comprenden de preferencia un promotor 5' ascendente de la secuencia codificadora particular y una secuencia terminadora 3' descendente de la secuencia codificadora particular y también, de ser apropiado, más elementos reguladores de costumbre, cada uno ligado operativamenle a la secuencia codificadora. "Ligadura operativa" se refiere a la disposición en secuencia de promolor, secuencia codificadora, íerminador y, de ser apropiado, más elemeníos reguladores de modo que cada uno de los elemenlos reguladores es capaz de cumplir su función según se requiera en expresar la secuencia codificadora. Ejemplos de secuencias que se pueden ligar operaíivamenle son secuencias focalizadoras y lambién polenciadores, señales de poliadenilación y similares. Otros elementos reguladores comprenden marcadores que se pueden seleccionar, señales de amplificación, orígenes de réplica y similares. Se describen secuencias reguladoras adecuadas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Además de estas secuencias reguladoras, la regulación nalural de esías secuencias todavía puede estar preseníe ascendenle de los genes estructurales reales y, de ser apropiado, se pudo haber modificado genéticameníe de modo que la regulación naíural se ha cambiado y se ha realzado la expresión de los genes. Una consírucción de ácido nucleico preferida venlajosameníe comprende lambién una o más de las secuencias poíenciadoras antes mencionadas que se ligan funcionalmente al promotor y que permiten una expresión potenciada de la secuencia de ácido nucleico. Secuencias veníajosas adicionales íales como elemenlos reguladores o terminadores también se pueden insertar en el extremo 3' de las secuencias de ADN. Los ácidos nucleicos pueden estar preseníes en la consírucción en una o más copias. La conslrucción puede comprender además marcadores adicionales fales como resisíencias anlibióíicas o genes complemeníarios de auxotrofía, si es apropiado para el propósito de seleccionar dicha construcción. Secuencias ventajosamenle reguladoras para el proceso están presentes, por ejemplo, en promoíores tales como cos, tac, trp, tet, trp- teí, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, írc, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6, lambda-PR o promolor imlambda-P, los cuales promolores se usan venlajosamenle en bacteria Gram-negativa. Otras secuencias reguladoras ventajosas están presentes, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos amy y SP02, en los promotores de levadura u hongo ADC1, MFalfa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. También es posible usar promotores artificiales para regulación. Para expresar la construcción de ácido nucleico en un organismo huésped, se inserta ventajosamente en un vector, por ejemplo, un plásmido o fago, lo que permite expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores, así como plásmidos y fagos, incluyen además todos los otros vectores conocidos per se, es decir, por ejemplo, virus, tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, íransposons, elemeníos IS, fásmidos, cósmicos, y ADN lineal o circular, y íambién el sisíema Agrobaclerium. Eslos veclores se pueden replicar autónomamente en el organismo huésped o cromosómicamente. Estos vectores constituyen otra forma de la invención. Ejemplos de plásmidos adecuados son, en E. colí, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pl N-l 11 "3-B 1 , tgl11 o pBdCI, en Streptomyces, pl J 101, plJ364, plJ702 o pl J361 , en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, pl L2 o pBB116, en levaduras 2alfa, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pHGIac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos mencionados constiluyen una selección pequeña de los plásmidos posibles. Oíros plásmidos son conocidos per se y se pueden descubrir, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ámsterdam-Nueva York-Oxford, 1985, ISBN 0444 904018). Para expresar los oíros genes que esíán preseníes, la conslrucción de ácido nucleico veníajosameníe comprende además secuencias reguladoras de terminal 3' y/o 5' para realzar la expresión que se seleccionan para expresión óptima de conformidad con la elección de organismo huésped y gen o genes. Estas secuencias reguladoras deben permiíir a los genes y expresión de proíeína expresarse específicameníe. Dependiendo del organismo huésped, eslo puede significar, por ejemplo, que el gen se exprese o sobreexprese sólo después de inducción, o que se exprese y/o sobreexprese de inmedialo. Es preferiblemenle la expresión de los genes que se han iníroducido la que se puede influenciar positivamente y así realzar por las secuencias reguladoras o facíores. Los elemeníos reguladores así se pueden realzar veníajosameníe en el nivel de íranscripción al usar señales de íranscripción fueríes íales como promotores y/o potenciadores. Sin embargo, además de esto, íambién es posible realzar la traducción al mejorar la esíabilidad del mARN, por ejemplo. En otra forma del veclor, el veclor que comprende la conslrucción de ácido nucleico o el ácido nucleico íambién se puede iníroducir venlajosamenle en los microorganismos en la forma de un ADN lineal e integrarse en el genoma del organismo huésped vía recombinación heteróloga u homologa. Este ADN lineal puede consistir de un vector linealizado tal como un plásmido o solamente de la construcción de ácido nucleico o el ácido nucleico. Para expresión óptima de genes heíerólogos en organismos, es veníajoso modificar las secuencias de ácido nucleico de conformidad con el uso de codón específico uíilizado en el organismo. El uso de codón se puede delerminar prontamente con la ayuda de análisis a computadora de otros genes conocidos del organismo en cuestión. Una cinta de expresión se prepara al fusionar un promotor adecuado a una secuencia de nucleóíido codificadora adecuada y a un lerminador o señal de poliadenilación. Se usan para esle propósilo técnicas de recombinación y clonación comunes como se describe en, por ejemplo, T. Maniatís, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y también en T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquisí, Experimenfs ilh Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboraíory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience (1987). Para lograr expresión en un organismo huésped adecuado, la construcción de ácido nucleico recombinante, o consírucción de gen, se insería veníajosameníe en un veclor específico de huésped que provee expresión óplima de los genes en el huésped. Vectores son conocidos per se y se pueden tomar, por ejemplo, de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. y otros, Eds, Elsevier, Ámsterdam-Nueva York-Oxford, 1985). Es posible preparar, con la ayuda de los vectores, microorganismos recombinantes que son, por ejemplo, transformados con al menos un vector y que se pueden usar para producir los polipépfidos usados de conformidad con la invención. Ventajosameníe, las construcciones recombinantes descritas antes se introducen en un sistema huésped adecuado y se expresan. En esta conexión, de preferencia se usan métodos de clonación y transfección familiares conocidos a un experto en la técnica, lales como, por ejemplo, coprecipilación, fusión de protoplasto, electroporación, transfección retroviral y similares, a fin de causar que dichos ácidos nucleicos se expresen en el sistema de e?presión particular. Se describen sistemas adecuados, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel y otros, Eds., Wiley Inlerscience, Nueva York 1997, o Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. También es posible preparar microorganismos homólogamente recombinados. Para este propósito, se prepara un vector que comprende por lo menos una sección de un gen a usarse de conformidad con la invención o de una secuencia codificadora en donde, si es apropiado, por lo menos una omisión de aminoácido, adición de aminoácido o sustiíución de aminoácido se ha iníroducido a fin de modificar, por ejemplo traslornar funcionalmenle, la secuencia (veclor de golpe). La secuencia introducida, por ejemplo, lambién puede ser un homólogo de un microorganismo relacionado o se puede derivar de una fuente de mamífero, levadura o insecto. Alternativamente, el vector usado para recombinación homologa se puede diseñar en tal manera que el gen endógeno, en el caso de recombinación homologa, se muta o de lo contrario altera pero todavía codifica la proteína funcional (por ejemplo, la región reguladora ascendente pudo haber sido alterada en tal manera que la expresión de la proteína endógena así se alíera). La sección alíerada del gen usado de conformidad con la invención eslá en el veclor de recombinacíón homologa. La construcción de vectores que son adecuados para recombinación homologa se describe, por ejemplo, en Thomas, K.R. y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503. Los organismos huésped recombinantes adecuados para el ácido nucleico usado de conformidad con la invención o la construcción de ácido nucleico son en principio cualquier organismo procariótico o eucariótíco. Veníajosameníe, los microorganismos tales como bacteria, hongos o levaduras se usan como organismos huésped. También se usan ventajosamenie bacíeria Gram-posiíiva y Gram-negaliva, de preferencia bacíeria de las familias Eníerobacleriaceae, Psudomonadeceae, Rhizobíaceae, Sírepíomyceíaceae o Nocardiaceae, en paríicular preferiblemenle bacleria del género Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus. Los organismos usados en el proceso de preparar proíeínas de fusión son, dependiendo del organismo huésped, crecidos o culíivados en una manera conocida al experto en la técnica. Los microorganismos usualmeníe son crecidos en un medio líquido que comprende una fueníe de carbón, usualmenle en la forma de azúcares, una fuenle de nitrógeno, usualmente en la forma de fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracío de levadura o sales íales como sulfato de amonio, elementos de rastro lales como sales de hierro, sales de manganeso y sales de magnesio y, si es apropiado, viíaminas, a temperaturas de entre 0°C y 100°C, de preferencia entre 10°C y 60°C, al mismo tiempo siendo suministrado con oxígeno. En esta conexión, el pH del líquido nuírieníe se puede maníener a un valor fijo, es decir, se puede o no regular duraníe el culfivo. El cullivo se puede llevar a cabo en forma de loíe, en forma de semilote o coníinuameníe. Los nulrienles se pueden inlroducir inicialmenle al comienzo de la fermeníación o alimenlarse posteriormente en una manera semicontinua o continua. Las enzimas se pueden aislar de los organismos por el proceso descriío en los ejemplos o usarse para la reacción como un exlraclo crudo. También son adecuados procesos para preparar recombinaníemeníe polipéptidos o fragmentos biológicamente acíivos, funcionales de los mismos, con un microorganismo produciendo polipépíido siendo culíivado, expresión de los polipépíidos siendo inducidos si es apropiado y dichos polipépíidos siendo aislados del culíivo. También se pueden producir polipéplidos en esía manera en una escala industrial si esío se desea. El microorganismo recombinaníe se puede cultivar y fermentar por métodos conocidos. Se puede propagar bacteria, por ejemplo, en medio TB o medio LB y a una íemperafura de 20 a 40°C y un pH de 6 a 9. Se describen condiciones de cullivo adecuadas en delalle, por ejemplo, en T. Maniaíis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboraíory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Si los polipépíidos no son secrelados en el medio de culíivo, enlonces las células se trastornan y el producío se obíiene del lisaío por procesos de aislamienío de proteína conocidos. Las células se pueden traslornar, según se desee, por medio de ultrasonido de frecuencia alta, por medio de presión alta, tal como, por ejemplo, en una célula de presión francesa, por medio de osmolisis, por la acción de detergentes, enzimas lííicas o solveníes orgánicos, por medio de homogenizadores o por una combinación de dos o más de los procesos lisiados. Se pueden purificar polipépíídos usando méíodos cromalográficos conocidos lales como cromalografía de tamiz molecular (filtración de gel), tal como cromatografía de Q Sefarosa, cromaíografía de iníercambio de iones y cromalografía hidrofóbica, y lambién usando otros métodos de costumbre íales como ultraf i Itración , precipitación por sales, diálisis y electroforesis de gel nativa. Procesos adecuados se describen, por ejemplo, en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlín, Nueva York o en Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, Nueva York, Heidelberg, Berlín. Puede ser veníajoso aislar la proíeína recombinaníe al usar sisíemas de vecíor u oligonucleólidos que extienden el cADN por secuencias de nucleóíido particulares y así codifican polipépíidos alíerados o proíeínas de fusión que se usan, por ejemplo, para simplificar la purificación. Ejemplos de modificaciones adecuadas de esla clase son "eíiquetas" actuando como anclas, tal como la modificación conocida como el ancla de hexa-hisíidina, o epiíopos que se pueden reconocer como anlígenos por anlicuerpos (descrilos, por ejemplo, en Harlow, E. y Lañe, D., 1988, Anlibodies: A Laboralory Manual, Cold Spring Harbor (NY) Press). Oirás eliquelas adecuadas son, por ejemplo, HA, calmodulin-BD, GST, MBD; quiíin-BD, síeptavídin-BD-aví-tag, Flag-lag, T7, eíc. Esías anclas se pueden usar para fijar las proíeínas a un soporíe sólido íal como una malriz de polímero, por ejemplo, que, por ejemplo, se puede empacar en una columna de cromaíografía, o se puede usar en una placa de microtítulo o en otro soporte. Los protocolos de purificación correspondientes se pueden obtener de los proveedores de etiqueía de afinidad comerciales. Las proteínas preparadas como se describió se pueden usar directamenle como proteínas de fusión o, después de cortar y eliminar la porción de pareja de fusión, como hidrofobinas "puras". Cuando se pretende eliminación de la porción de pareja de fusión, se aconseja incorporar un sitio de coríe poíencial (siíio de reconocimienlo específico para proíeasas) en la proíeína de fusión eníre la porción de hidrofobina y la porción de pareja de fusión. Siíios de coríe adecuados incluyen en parlicular aquellas secuencias de pépíido que de lo conlrario ocurren ni en la porción de hidrofobina ni en la porción de pajera de fusión, como se delermina prontamente por medio de herramienlas bioinformáticas. Son particularmente adecuados, por ejemplo, corte BrCN en metionina o corte mediado con proteasa con factor Xa, corte de enterokinasa, trombina, corte de TEV (proteasa de virus por ataque de tabaco). Se pueden usar hidrofobinas en sustancia cuando se usan de conformidad con la presente invención para el tralamiento repélenle a suciedad de superficies duras. Sin embargo, preferiblemenle, las hidrofobinas se usan como formulaciones o composiciones en al menos un solvente adecuado. La elección de hidrofobinas para abarcar la invención no está restringida. Es posible usar una hidrofobina o de lo contrario una pluralidad de diferentes. Un experto en la técnica hará una elección adecuada. Por ejemplo, es posible usar proíeínas de fusión lales como, por ejemplo, yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 19) o yaad-Xa-rodA-his (SEC ID NO: 21). Los solvenles para formulaciones pueden comprender agua y/o solventes orgánicos. También se pueden usar mezclas de solvente. La identidad del solvente depende de la hidrofobina, la identidad de la superficie a tratarse y también el uso, y se selecciona apropiadamente por un experto en la técnica. Por lo general, agua y formulaciones acuosas se prefieren para aplicaciones doméslicas. Formulaciones acuosas, predominanlemenle acuosas y no acuosas son adecuadas para aplicaciones industriales. El solvente comprende de preferencia agua o mezclas de agua y solventes orgánicos miscibles en agua. Ejemplos de dichos solventes orgánicos comprenden alcoholes monohídricos o polihídricos miscibles en agua, por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, etilen glicol, propilen glicol o glicerol. También son una posibilidad alcoholes de éter. Ejemplos comprenden éteres monoalquílicos de (poli)etilen o (poli)propilen glicoles íal como éfer monobuíílico de etilen glicol. La identidad y caníidad de los solveníes solubles en agua y de los orgánicos se eligen por un experío en la íécnica. Mezclas acuosas comprenden de preferencia al menos 80% en peso de agua con base en la suma íolal de iodos los solveníes. Aparte de agua, los alcoholes son solventes preferidos. Para preparar la composición usada de conformidad con la presente invención, se puede preferir emplear las soluciones de hidrofobina acuosas como sintetizadas, aisladas y/o purificadas. Esías todavía pueden comprender, dependiendo de su pureza, residuos de auxiliares de la síntesis. Pero también es posible aislar las hidrofobinas al inicio como sustancia, por ejemplo, secado en frío, y para que sólo se formulen en un segundo paso. La cantidad de hidrofobina en la formulación se puede determinar por un experto en la técnica de conformidad con la identidad de la superficie y/o el uso planeado. Pero incluso cantidades relativamente pequeñas serán suficientes para lograr un efecto repelente a suciedad. Una cantidad de 0.0001% a 1% en peso con base en la suma toíal de todos los constiíuyeníes de la formulación se ha descubierío satisfacloria sin la invención así siendo resíringida a esla escala. La canlidad está de preferencia en la escala de 0.0005% a 0.5% en peso y más preferible en la escala de 0.001% a 0.1% en peso. Preferiblemente, la composición usada comprende un agente limpiador, por ejemplo, limpiadores de vidrio, limpiadores de pisos, limpiadores de todo uso, limpiadores de tina, auxiliares de enjuague, agentes de lavado de platos para limpieza manual o a máquina de platos, limpiadores de máquina, desengrasantes de metal, limpiadores de alta presión, limpiadores alcalinos, limpiadores ácidos, desengrasantes de punto o limpiadores de lácteos. El agente limpiador de la presente invención, así como un solvente o por lo menos una hidrofobina, comprende en una manera que es conocida en principio uno o más agentes tensioactivos en cantidades efectivas. Las composiciones también pueden comprender agentes antes o después del traíamienfo para superficies duras, en particular para vidrio, cerámica o pisos. Los agentes tensioacíivos pueden comprender agentes tensioaclivos amónicos, no iónicos, anfoléricos y/o caíiónicos. Dichos ageníes lensioaclivos y íambién su uso preferido respeclivo son conocidos en principio a un experto en la técnica. Ejemplos de agentes tensioacíivos aniónicos comprenden sulfalos de alcohol graso, sulfaíos de éíer alquílico, alcanosulfonatos, alquilbencenosulfonatos o alquil fosfatos. Se pueden usar los ácidos o sales libres de los mismos. Ejemplos de ageníes íensioaclivos no iónicos comprenden alcoholes de C8-C22 alcoxilados íales como alcoxilalos de alcohol graso o alcoxilalos de alcohol de proceso oxo, alquilfenol etoxilalos teniendo cadenas alquilo de C8-C14 y 5 a 30 mol de unidades de óxido de etileno, alquilpoliglucosidas íeniendo 8 a 22 en la cadena de alquilo, alquilamina alcoxilatos o alquilamida eíoxilaios. Ejemplos de ageníes lensioaclivos anfotéricos comprenden alquilbetaínas, alquilamidabetaínas, aminopropionatos, amino-glicinatos o compuestos de imidazolio anfotérico. Ejemplos de agentes tensioacíivos caíiónicos comprenden sales de amonio cuaiernario susíifuidas o no susíiiuidas, de cadena recia o ramificada, por ejemplo, haluros de dialquildimeiilamonio de C8-ß, haluros de dialcoxidimetilamonio o sales de imidazolio leniendo un radical de alquilo de cadena larga. Otros ejemplos de agentes tensioaclivos se citan en las secciones

[0056] a

[0073] de DE-A 101 60993. Un experto en la técnica hará una selección adecuada con respecto al tipo y cantidad de agente tensíoactivo. Se ha descubierto ser satisfacloria una caníidad de 0.01% a 30% en peso de ageníe tensioactivo con base en la suma iotal de iodos los componentes de la formulación. La formulación puede comprender además opcionalmeníe oíros componentes, por ejemplo, materiales y/o asistenies de mezcla.

Ejemplos de dichos componentes comprenden ácidos o bases, por ejemplo ácidos carboxílicos o amoníaco, sislemas reguladores, polímeros, partículas inorgánicas tales como SiO2 o silicatos, colóranles, fragancias o biocidas. Oíros ejemplos de materiales de mezcla se citan en DE-A 101 60 993, en particular secciones

[0074] a

[0131]. Un experto en la técnica hará una selección adecuada con respecto al tipo y cantidad de componentes adicionales dependiendo de la aplicación. De acuerdo con la presente invención, se íralan superficies duras en una manera repeleníe a suciedad al contactar la superficie dura con una composición que comprende por lo menos una hidrofobina y también al menos un solvente. El contacío es gobernado por el lipo de aríículo. Se puede realizar, por ejemplo, medianíe aspersión, enjuague o limpieza de la superficie con la composición o de lo contrario al sumergir el artículo entero en la formulación. El último naturalmeníe sólo es posible con aríículos que no se han insíalado. El liempo de íraíamíento es decidido por un experto en la técnica. Puede tardar algunos segundos a varias horas. Después del trafamienío, la superficie se puede enjuagar, con agua, por ejemplo, para eliminar el exceso de solución de íraíamienlo. El iratamienío repeleníe a suciedad en paríicular se puede realizar venlajosamenle en combinación con una limpieza, es decir, en el curso del proceso de limpieza real. Esto se hace usando la composición limpiadora que comprende como se describió anles por lo menos una hidrofobina, por lo menos un agenle tensioactivo y también al menos un solvente. El tratamiento se puede llevar a cabo fuera a temperaturas inferiores a lemperatura ambiente, a temperaíura ambieníe o íemperaturas elevadas, por ejemplo a 20 a 100°C, de preferencia 20 a 60°C. El traíamienío de preferencia se lleva a cabo a íemperaluras de no más de 30°C, en parlicular de 20 a 30°C. Después del íralamiento con la composición, se seca la superficie íratada. El secado de la superficie tralada puede ocurrir casi a íemperaíura ambiente, o el secado iambién se puede llevar a cabo a lemperaíuras elevadas. El Iratamienío y lambién, si es apropiado, el secado de la superficie se puede seguir por un posl-tratamiento térmico de la superficie a temperaturas elevadas, por ejemplo, a temperaluras de hasta 120°C. El post-lralamienlo térmico también se puede llevar a cabo combinado con el secado. Las temperaturas de post-íratamiento íérmico de preferencia esíán en la escala de 30 a 100°C, más preferible en la escala de 40 a 80°C y por ejemplo en la escala de 50 a 70°C. El íiempo de íralamienío es decido por un experío en la lécnica, y puede estar en la escala de 1 minuto a 10 horas, por ejemplo. El proceso de la presente invención provee una superficie dura que comprende un revestimiento repelente a suciedad que comprende por lo menos una hidrofobina. El revestimiento por lo general comprende al menos una capa monomolecular de hidrofobina en la superficie. El efecto repelente a suciedad se puede determinar por medio de métodos conocidos en principio, por ejemplo, al comparar el desprendimiento de suciedad al enjuagar con agua para una superficie no tratada contra una superficie tratada con hidrofobinas.

Las hidrofobinas tienen un efecto distinlo incluso en canlidades pequeñas. El íratamiento con una composición que comprende justo 0.01% en peso de hidrofobinas conducirá a liberación de suciedad distinlamenle mejorada. El íralamiento repelente a suciedad de conformidad con la presente invención es particularmeníe úlil para superficies de cerámica, por ejemplo para azulejos. Aquí, una hidrofobización de la superficie se puede lograr a íravés del íralamienío así como el efeclo repelente a suciedad. Esto es una ventaja significativa particularmente en habitaciones húmedas, tales como baños, por ejemplo. Los ejemplos que siguen ilustran la invención: Parte A: Preparación y prueba de hidrofobinas usadas de acuerdo con la invención Ejemplo 1 Trabajo preliminar para la clonación de vaad-HisB/vaaE-HiSfi Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa con la ayuda de los oligonucleótídos Hal570 y Hal571 (Hal 572/Hal 573). El ADN molde usado fue ADN genómico de la bacleria Bacillus subíilis.

El fragmenío de PCR obíenido comprendió la secuencia codificadora del gen Bacillus sublilis yaaD/yaaE y, en su lerminal, en cada caso un Ncol y, respectivamente, sitio de corte de restricción Bglll. El fragmento de PCR se purificó y cortó con las endonucleasas de restricción Ncol y Bglll. Este fragmento de ADN se usó como inserto y se clonó en el vector pQE60 de Qiagen, que se había linearizado previamente con las endonucleasas de restricción Ncol y Bglll. Los vectores así obtenidos, pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5, se puede usar expresando proteínas consistiendo de YAAD::HIS6 y YAAE::HIS6, respectivamente.

Hal570: gcgcgcccatggclcaaacaggíaclga Hal571: gcagaícíccagccgcgllcíígcalac Hal572: ggccalgggaílaacaataggtgtactagg Hal573: gcagaícttacaagígcclllfgcllaíaífcc Ejemplo 2 Clonación de vaad hidrofobina DewA-HisR Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa con el oligonucleóíido KaM 416 y KaM 417. El ADN molde usado fue ADN genómico del molde Aspergillus nidulans. El fragmenlo de PCR obíenido comprendió la secuencia codificadora del gen de hidrofobina dewA y un siíio de corte de proteinasa Xa de facíor de lerminal N. El fragmenlo de PCR se purificó y corló con la endonucleasa de reslricción BamHl. Este fragmento de ADN se usó como inserto y se clonó en el vector pQE60YAAD#2 previamenle linearizado con la endonucleasa de resíricción Bglll.

El vector así obíenido, #508, se puede usar para expresar una proteína de fusión que consiste de YAAD::Xa::dewA::HIS6.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCC GC Ejemplo 3 Clonación de vaad hidrofobina RodA-His^ El plásmido #513 se clonó análogamente al plásmido #508, usando los oligonucleótidos KaM 434 y KaM 435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Ejemplo 4 Clonación de vaad hidrofobina BASF1-H¡SR El plásmido #507 se clonó análogamente al plásmido #508, usando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. El ADN molde empleado fue una secuencia de ADN artificialmeníe sinletizada -hidrofobina BASF1 (ver apéndice).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCC GC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 5 Clonación de vaad hidrofobina BASF2-HiSs El plásmido #506 se clonó análogameníe al plásmido #508, usando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. El ADN molde empleado fue una secuencia de ADN artificialmenle sinlelizada -hidrofobina BASF2 (ver apéndice).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCC GC KaM 18: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 6 Clonación de vaad hidrofobina SC3-His^ El plásmido #526 se clonó análogamenle al plásmido #508, usando los oligonucleótidos KaM464 y KaM465. El ADN molde empleado fue cADN Schyzophyllum commune (ver apéndice).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT Ejemplo 7 Fermeníación de la cepa recombinanie E. coli vaad hidrofobina DewA-HiSfi Inoculación de 3 ml de medio líquido LB con una cepa E. coli expresando yaad hidrofobina DewA-His6 en 15 ml de íubos Greiner. Incubación en un agiíador a 200 rpm a 37°C duraníe 8 horas. En cada caso, 2 frascos Erlenmeyer de 1 ml con deflecíores y 250 ml de medio LB (+ 100 µg/ml ampicilina) se inocularon con 1 ml de preculíivo y se incubaron en un agifador a 180 rpm a 37°C duraníe 9 horas. Inocular 13.5 I de medio LB (_100 µg/ml de ampicilina) con 0.5 I de precultivo (OD6oonm 1:10 medido contra H2O) en un fermenfador de 20 I. Adición de 140 ml de 100 mM de IPTG a un ODeonm de ~3.5. Después de 3 horas, enfriar fermenlador a 10°C y eliminar caldo de fermeníación medíanle centrifugación. Usar perdigón de célula para purificación adicional.

Ejemplo 8 Purificación de la proteína de fusión hidrofobina recombinaníe (purificación de proteínas de fusión hidrofobina poseyendo una etiqueta His6 de terminal C) 100 g de perdigón de célula (100 - 500 mg de hidrofobina) se hicieron con 50 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 7.5, a un volumen íoíal de 200 ml y se resuspendieron. La suspensión fue íratada con un Ulíralurrax íipo T25 (Janke y Kunkel; IKA-Laboríechnik) duranle 10 minulos y posteriormente, para los propósitos de degradar los ácidos nucleicos, incubados con 500 unidades de benzonasa (Merck, Darmstadt; orden No. 1.01697.0001) a temperatura ambiente durante 1 hora. Aníes de la disrupción celular, se llevó a cabo una filtración usando un cartucho de vidrio (P1). Para los propósitos de traslornar las células y de cortar el ADN genómico restanle, se llevaron a cabo dos vuelías del homogenizador a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). El homogeneizado se cenlrifugó (Sorvall RC-5B, GSA Rotor, 250 ml de vaso de precipitados centrífugo, 60 minutos, 4°C, 12000 rpm, 23000 g), el sobrenadante se puso en hielo y el perdigón se resuspendió en 100 ml de regulador de fosfato de sodio, pH 7.5. Se repitieron la centrifugación y resuspensión tres veces, el regulador de fosfato de sodio comprendiendo 1% de SDS en la tercera repetición. Después de resuspender, la solución se agitó durante una hora, seguido por una centrifugación final (Sorvall RC-5B, GSA Roíor, 250 ml vaso de precipilados centrífugo, 60 minuíos, 4°C, 12000 rpm, 23000 g). De acuerdo con análisis SDS-PAGE, la hidrofobina eslá présenle en el sobrenadante después de la centrifugación final (figura 1). Los experimentos muestran que la hidrofobina está presente en las células E. coli correspondientes probablemente en la forma de cuerpos de inclusión. 50 ml del sobrenadante conteniendo hidrofobína se aplicaron a una columna de 50 ml níquel-Sepharose High Performance 17-5268-02 (Amersham) equilibrada con 50 mM de regulador de Tris-Cl, pH 8.0. La columna se lavó con 50 mM de regulador de Tris-Cl, pH 8.0, y la hidrofobina fue eluada posteriormente con 50 mM de regulador de Tris-Cl, pH 8.0, comprendiendo 200 mM de imidazol. Para el propósito de eliminar el imidazol, la solución se dializó contra 50 mM de regulador de Tris-Cl, pH 8.0. La figura 1 ilustra la purificación de la hidrofobina preparada: Línea 1: solución aplicada a columna de níquel-Sefarosa (1:10 dilución) Línea 2: flujo = eluado de paso de lavado Línea 3: picos OD 280 de fracciones de elución La hidrofobina de la figura 1 tiene un peso molecular de aproximadamente 53 kD. Algunas de las bandas más pequeñas represenlan producios de degradación de hidrofobina.

Ejemplo 9 Prueba de rendimienío: caracterización de la hidrofobina al cambiar el ángulo de contacio de una gota de aqua en vidrio Susirato: Vidrio (vidrio de venlana, Süddeutsche Glas, Mannheim, Alemania): Conceníración de hidrofobina: 100 µg/ml Incubación de portaobjelos de vidrio duraníe la noche (lemperalura 80°C) en 50 mM de acetato de sodio (pH 4) + 0.1% en peso de Tween 20 seguido por, lavado de portaobjetos de vidrio con revestimiento de hidrofobina en agua destilada seguido por incubación: 10 m¡n/80°C/1% en peso de solución acuosa de n-dodecil sulfato de sodio (SDS) en agua destilada lavado en agua destilada Las muestras se secan al aire (temperatura ambiente) y se someten a temperaíura ambieníe a una deíerminación del ángulo de contacto (en grados) de una gota de 5 µl de agua. La medicación de ángulo de contacío se deíerminó en un sistema Dataphysics Contací Angle System OC 15 + , Sofíware SCA 20.2.0. (Noviembre 2002). La medición se llevó a cabo de conformidad con las insírucciones del fabricaníe. El vidrio no íraíado dio un ángulo de conlacío de 30 ± 5o; un revestimiento con la hidrofobina funcional del ejemplo 8 (yaad-dewA-his6) dio ángulo de contacto de 75 ±5°.

Parte B: Uso de hidrofobinas para revestimiento repelente a suciedad en superficies duras Solución usada: Las pruebas de rendimiento se llevaron a cabo usando una solución en agua de la proteína de fusión yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 19) preparada de conformidad con el ejemplo 8. Concentración de la hidrofobina en solución: 100 µg/ml (0.01% en peso).

Superficie dura usada: Azulejo de cerámica, blanco brillante, 10 cm x 15 cm (de Novocker), limpiado con etanol y agua.

Suciedad usada: Las pruebas se llevaron a cabo usando suciedad de balasta IKW (de conformidad con Seifen, Felte, Ole, Wachse (SÓFW) -Journal, volumen 124, 14/98, página 1029).

Método de tratamiento Un azulejo tuvo 2 g de la solución de hidrofobina acuosa antes mencionada teniendo una concentración de 100 µg/ml sumergida en (1.3 µm de hidrofobina/cm2) y distribuida suavemente con una tela para cubrir toda la superficie. El azulejo entonces se dejó esíar para secarse al aire duranle 24 horas. El azulejo se enjuagó posíeriormente con agua y se colocó durante 3 x 10 minutos en un vaso de precipitados de vidrio con agua. Se usó agua fresca para cada enjuague. El azulejo entonces se dejó secar al aire verticalmeníe.

Medición de ángulo de coníacío y efecio repeleníe a suciedad El azulejo íraíado dio una medición de ángulo de coníacío coníra una gota de agua (S µl, método como se describió antes) de 56° (promedio de 10 mediciones). Para comparación, un azulejo no fraíado íiene un ángulo de coníacío de 20°. El azulejo así ha sido disíiníameníe hidrofobicizado. El azulejo íraíado y, en comparación, un azulejo no íraíado cada uno se manchó con 50, 100 y 200 µg de suciedad de balasío IKW usando una pipeía de íransferencia y se dejó secar a lemperaíura ambieníe durante una hora. Los azulejos entonces se enjuagaron 3 veces con 500 ml de agua cada vez. Aunque esto no desprendió la suciedad de la superficie no traíada, se observó desprendimienlo de suciedad parcial para el azulejo pretratado con hidrofobina. El pretraíamienlo con hidrofobina así condujo a adhesión de suciedad reducida en la superficie del azulejo.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1.- El uso de una hidrofobina para fralar de forma repeleníe a suciedad una superficie dura. 2 - El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho íralamienlo repélenle a suciedad se realiza en combinación con una limpieza de dicha superficie. 3.- El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde dicho Iratamiento se realiza usando un ageníe limpiador que comprende al menos una hidrofobina, un agenle tensíoactivo y también un solvente. 4 - Un proceso para tratar de forma repelente a suciedad una superficie dura, el cual comprende coníactar dicha superficie con una composición que comprende al menos una hidrofobina y también un solvente. 5.- El proceso de conformidad con la reivindicación 4, en donde dicha composición comprende un agente limpiador que comprende por lo menos una hidrofobina, un agente tensioaclivo y íambién un solvenle. 6 - El proceso de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, en donde la canlidad de hidrofobina en dicha composición está en la escala de 0.0001% a 1% en peso con base en la suma total de todos los constiíuyentes de dicha composición. 7.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde dicho Iralamienfo se realiza a lemperaturas debajo de 30°C. 8.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde dicha hidrofobina comprende al menos una hidrofobina de fusión. 9.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde dicha superficie comprende una superficie doméslica. 10 - El proceso de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicha superficie dura comprende una superficie dura seleccionada a partir del grupo que consiste de superficies de azulejos, pisos, ajustes, lavabos, tinas, bañeras, tazas de baño, regaderas, muebles de baño, muebles, espejos, platos, cubiertos, vasos, artículos de porcelana o las superficies de aparatos domésticos. 11 - Un agente limpiador para una superficie dura, limpiadores de vidrio, limpiadores de pisos, limpiadores para todo uso, limpiadores de tina, auxiliares de enjuague, agentes de lavado de platos para lavado manual o a máquina de platos, limpiadores de máquina, desengrasantes de metal, limpiadores a presión alia, limpiadores alcalinos, limpiadores ácidos, desengrasaníes de punía o limpiadores de lácíeos, que comprenden al menos una hidrofobina, por lo menos un agente tensioactivo y también un solvente. 12 - El agente limpiador de conformidad con la reivindicación 11, en donde al menos un solvente comprende agua. 13.- El agente limpiador de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, en donde la cantidad de hidrofobina está en la escala de 0.0001% a 1% en peso con base en la suma total de todos los constiluyentes del agenle limpiador. 14 - El agente limpiador de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, en donde la cantidad de hidrofobina está en la escala de 0.001% a 0.1% en peso con base en la suma toíal de lodos los constiluyentes del agente limpiador. 15 - El agente limpiador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde dicha hidrofobina comprende al menos una hidrofobina de fusión. 16.- Una superficie dura que comprende un revestimiento repelente a suciedad que comprende al menos una hidrofobina y en donde dicha superficie dura es una superficie dura seleccionada del grupo de superficies de azulejos, pisos, ajustes, lavabos, tinas, bañeras, tazas de baño, regaderas, muebles de baño, muebles, espejos, platos, cubiertos, vasos, artículos de porcelana o las superficies de aparatos domésticos. 17.- La superficie dura de conformidad con la reivindicación 15 obtenible por un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9.