EP1868700A2 - Verwendung von hydrophobin als phasen-stabilisator - Google Patents

Abstract

Hydrophobine sind in besonderer Weise geeignet, zweiphasige flüssige Systeme zu stabilisieren.

Description

Verwendung von Hydrophobin als Phasen-Stabilisator

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin und/oder einem seiner Derivate zur Stabilisierung von Phasen in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, insbesondere öl und Wasser.

Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteristisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf.

Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen, um die Eigenschaften der Grenzflächen durch Bildung von amphiphatischen Membranen zu verändern. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.

Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Ebenso sind Herstellverfahren für Hydrophobine und Derivate davon bekannt. Beispielsweise offenbart die deutsche Patentanmeldung DE 10 2005 007 480 ein Herstellverfahren für Hydrophobine und Derivate davon.

Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen bereits vorgeschlagen worden.

WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-inWasser-Emulsionen oder von Wasser-in-öl-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen. WO 96/41882 beschreibt darüber hinaus Zusammensetzungen, insbesondere Zusammensetzungen für pharmazeutische Anwendungen, enthaltend Hydrophobine. EP-A 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiff rümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 80⁰C.

WO 03/53383 beschreibt die Verwendung von Hydrophobin zum Behandeln von Kera- tin-Materialien in kosmetischen Anwendungen.

WO 03/10331 offenbart, dass Hydrophobine oberflächenaktive Eigenschaften aufweisen. So wird ein mit Hydrophobin beschichteter Sensor vorgestellt, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z.B. elektroaktive Substanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.

WO 2004/000880 betrifft ebenfalls die Beschichtung von Oberflächen mit Hydrophobin oder Hydrophobin-ähnlichen Substanzen.

Auch WO 01/74864, die Hydrophobin-ähnliche Proteine betrifft, offenbart, dass diese zur Stabilisierung von Dispersionen und Emulsionen eingesetzt werden können.

Die Verwendung von Proteinen zur Phasentrennung ist prinzipiell bekannt.

So wird in EP-A 05 016 962 die Verwendung von Proteinen zur Verbesserung der Phasentrennung von z.B. Öl/Wasser- oder Kraftstoff/Wassergemischen beschrieben. Dem Fachmann ist bekannt, dass amphiphile Moleküle je nach Anwendungskonzentration und umgebendem Medium sowohl stabilisierend als auch destabilisierend auf Phasengrenzen wirken können.

GB 195,876 offenbart ein Verfahren zum Brechen von Wasser-in-öl-Emulsionen unter Verwendung von Kolloiden. Als Kolloide werden beispielhaft Proteine wie Gelatine, Casein, Albumin oder Polysaccharide wie Gummi Arabicum oder Gummi Tragacanth genannt.

JP-A 11-169177 beschreibt die Verwendung von Proteinen mit Lipase-Aktivität zum Brechen von Emulsionen.

WO 01/60916 offenbart die Verwendung von tensidfreien Mischungen aus mindestens einem wasserlöslichen Protein, mindestens einem wasserlöslichen Polysaccharid sowie mindestens einem wasserlöslichen Polymer wie beispielsweise Polyethylenoxid für verschiedene Anwendungen, darunter auch zum Demulgieren von Rohöl. Keine der zitierten Schriften offenbart die Verwendung von Hydrophobinen zur Verhinderung einer Re-Emulgierung.

Die Verwendung von Proteinen hat den allgemeinen Vorteil, dass es sich um natürlich vorkommende Substanzen handelt, die biologisch abbaubar sind und damit nicht zu einer dauerhaften Belastung der Umwelt führen.

Bei vielen großtechnischen Anwendungen, beispielsweise bei der Trennung von Roh- öl-Wasser-Emulsionen, kommt es einerseits auf eine möglichst schnelle Phasentrennung und andererseits auf eine Vermeidung beziehungsweise Verhinderung einer Re- Emulgierung der Phasen an. Aufgabe der Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Stabilisierung der Phasen durch Einsatz von Proteinen bereitzustellen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung mindestens eines Hydrophobins in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, insbesondere öl und Wasser.

Dabei kann das Hydrophobin erfindungsgemäß grundsätzlich in beliebiger Menge ein- gesetzt werden, solange gewährleistet ist, dass die Phasenstabilisierung in den Zusammensetzungen, enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, verbessert wird.

Unter „Verbesserung der Phasenstabilisierung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die Re-Emulgierung von zwei flüssigen Phasen bei Zusatz einer Substanz zu einem Gemisch langsamer erfolgt, als in demselben Gemisch ohne den Zusatz der Substanz, beziehungsweise dass durch den Zusatz der Substanz die Re-Emulgierung von zwei flüssigen Phasen vermieden wird.

Unter einem Hydrophobin werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Deriva- te davon beziehungsweise modifizierte Hydrophobine verstanden. Bei modifizierten beziehungsweise derivatisierten Hydrophobinen kann es sich beispielsweise um Hydrophobin-Fusionsproteine handeln oder um Proteine, die eine Aminosäurensequenz aufweisen, die mindestens 60 %, beispielsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere bevorzugt mindestens 95 % Identität mit der Sequenz eines Hydrophobins aufweisen, und die noch zu 50 %, beispielsweise zu 60 %, insbesondere zu 70 %, besonders bevorzugt zu 80 % die biologischen Eigenschaften eines Hydrophobins erfüllen, insbesondere die Eigenschaft, dass die Oberflächeneigenschaften durch Beschichten mit diesen Proteinen derart geändert werden, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung einer Glasoberfläche mit dem Protein eine Vergrößerung um mindestens 20°, bevorzugt um mindestens 25°, insbesondere um mindestens 30° aufweist.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass Hydrophobine oder Derivate davon die Neubildung von Emulsionen nach erfolgter Phasentrennung vermindern beziehungsweise vermeiden. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn eine längere Koexistenz von zwei Phasen nebeneinander gegeben ist oder das Auftreten von erneuten Emulsionen verhindert werden soll. Hierbei sind schon geringe Mengen des Peptids äußerst wirksam.

Für die Definition von Hydrophobinen ist dabei die Struktur- und nicht die Sequenzspe- zifität der Hydrophobine entscheidend. Die Aminosäuresequenz der natürlichen Hydrophobine ist sehr divers, sie haben jedoch alle ein hochcharakteristisches Muster von 8 konservierten Cysteinresten. Diese Reste bilden vier intramolekulare Disulfid- brücken.

Der N- und C-Terminus ist über einen größeren Bereich variabel. Hier können mittels dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Techniken Fusionspartnerproteine mit einer Länge von 10 bis 500 Aminosäuren angefügt werden.

Darüber hinaus sind im Sinne der vorliegenden Erfindung unter Hydrophobinen und Derivaten davon Proteine mit einer ähnlichen Struktur und funktioneller Äquivalenz zu verstehen.

Unter dem Begriff „Hydrophobin" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)

X_n-C -Xi_₅o-C -Xo-₅-C -Xi-ioo-C -Xi_ioo-C -Xi_₅o-C -X_0-S-C -Xi_-S0-C -X_m (I)

verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300.

Die Polypeptide gemäß Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergröße- rung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.

Die mit C¹ bis C⁸ benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C¹ bis C⁸ aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Di- sulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C-Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumer- füllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.

Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der ein- zelnen C-Positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.

Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)

X_n-C -X3-25-C -Xθ-2"C -X5-50-C -X2-35"C -X2-15"C -Xθ-2"C -X3-35"C -Xm (H)

zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 300 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.

Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (IM)

Xn"C -Xö-g-C -C -Xn-₃₉-C -X2-2₃"C -X_δ-g-C -C -X_ß-I_δ-C -Xm (Hl)

eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich bei mindes- tens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.

Bei den Resten X_n und X_m kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicher- weise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste X_n und/oder X_m zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptid- sequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz verlängert ist.

Falls es sich bei X_n und/oder X_n, um natürlicherweise nicht in Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders be- vorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.

Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (X_n) und am Carboxyterminus (X_n,) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (X_n oder X_n,) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden.

Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 15 und 16), yaae (SEQ ID NO: 17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, beispielsweise 70 bis 99 %, bevorzugt 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt 10 bis 40 % der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren beziehungsweise Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren bezieht.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem Fusionspartner als eine Gruppe X_n oder X_n, noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affin ity tag / affin ity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen Wechsel- wirken können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)_k- , (Arg)_k-, (Asp)_k-, (Phe)_k- oder (Cys)_k-Gruppen, wobei k im Allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His)_k-Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht.

Die erfindungsgemäß als Hydrophobine oder Derivate davon verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielswei- se mit Glutardialdehyd.

Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine beziehungsweise deren Derivate ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell beispielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.

Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 μl und die Verwendung von Glasplättchen als Substrat. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Fusionsproteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.

Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi , basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobinteile, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.

Erfindungsgemäß besonders geeignet sind weiterhin die Fusionsproteine yaad-Xa- dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf 1 - his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deleti- on von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.

Besonders zur Ausführung der Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa-dewA- his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf 1 -his (SEQ

ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Reste. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürzter yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis

150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden.

Eine Spaltstelle zwischen dem Hydrophobin und dem Fusionspartner beziehungsweise den Fusionspartnern kann dazu genutzt, das reine Hydrophobin in underivatisierter Form freizusetzen (beispielsweise durch BrCN-Spaltung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin-, TEV-Spaltung etc.).

Es ist weiterhin möglich, Fusionsproteine aus einem Fusionspartner, beispielsweise yaad oder yaae, und mehreren Hydrophobinen, auch unterschiedlicher Sequenz, bei- spielsweise DewA-RodA oder Sc3-DewA, Sc3-RodA), hintereinander zu generieren. Ebenso können Hydrophobinfragmente (beispielsweise N- oder C-terminale Verkürzungen) oder Mutein, die bis zu 70% Homologie aufweisen, eingesetzt werden. Die Auswahl der optimalen Konstrukte erfolgt jeweils in Bezug auf die jeweilige Verwendung, d.h. die zu trennenden flüssigen Phasen.

Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine beziehungsweise die in den erfindungsgemäßen Formulierungen enthaltenen Hydrophobine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.

Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen. Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäure- sequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung DE 102005007480.4 offenbart.

Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfahren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschließlich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula poly- morpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a..

Gegenstand der Arbeiten ist außerdem die Verwendung von Expressionskonstrukten, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen, eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5"-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3"-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer "operativen Verknüpfung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann, verstanden.

Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie En- hancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und derglei- chen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Se- quenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere so- genannte "Enhancer"-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3"-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.

Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Au- xotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für die Herstellung sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, Iaclq-T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.

Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, TransposonsJS- EIe- mente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium- System zu verstehen.

Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,plN-lll^lI3-B1, tgt11 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Cory- nebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3"-und/oder δ'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Gen- expression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "En- hancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft, die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt beziehungsweise Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.

Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine oder Derivate davon eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfek- tion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Ex- pressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure- Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu ver- ändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockouf'-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503. Als rekombinante Wirtsorganismen für derartige Nukleinsäuren oder derartige Nuklein- säurekonstrukte kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gramnegative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomo- nadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.

Die im oben beschriebenen Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen beziehungsweise gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoff- quelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und 100 ⁰C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 ⁰C unter Sauerstoff begasung angezogen. Dabei kann der pH- Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch "-weise, "semi- batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon können mittels eines Verfahrens zur rekombinanten Herstellung hergestellt werden, wobei man einen Polypeptide produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Proteine induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Proteine können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen bei- spielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Labo- ratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Proteine nicht in das Kulturmedium sezerniert wer- den, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren auf- geschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Proteine kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chroma- tographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruy- ter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Besonders vorteilhaft kann es sein, die Fusions-Hydrophobine zur Erleichterung der Isolierung und Reinigung mit speziellen Ankergruppen zu versehen, die an entsprechende komplementäre Gruppen an festen Trägern, insbesondere geeigneten Polymeren anbinden können. Derartige feste Träger können beispielsweise als Füllung für Chromatographiesäulen verwendet werden, und auf diese Art und Weise kann die Effizienz der Trennung in der Regel deutlich gesteigert werden. Solche Trennverfahren sind auch als Affinitätschromatographie bekannt. Zum Einbau der Ankergruppen kann man bei der Herstellung der Proteine Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit veränderte Proteine oder Fusionsproteine kodieren. Zur leichteren Reinigung modifizierte Proteine umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa- Histidin-Anker bekannte Modifikation. Mit Histidin-Ankem modifizierte Fusions-Hydrophobine lassen sich beispielsweise unter Verwendung von Nickel-Sepharose als Säulenfüllung chromatographisch reinigen. Das Fusions-Hydrophobin kann anschließend mittels geeigneten Mitteln zum Eluieren, wie beispielsweise einer Imidazol-Lösung, wieder von der Säule eluiert werden.

In einem vereinfachten Reinigungsverfahren kann auf die chromatographische Reinigung verzichtet werden. Hierzu werden die Zellen zunächst mittels einer geeigneten Methode aus der Fermentationsbrühe abgetrennt, beispielsweise durch Mikrofiltration oder durch Zentrifugieren. Anschließend können die Zellen mittels geeigneter Methoden, beispielsweise mittels der bereits oben genannten Methoden, aufgeschlossen, und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern (inclusion bodies) getrennt werden. Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Ein- Schlusskörper in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Fusions-Hydrophobine freizusetzen. Dies kann beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergenzien erfolgen. Die Einschlusskörper mit den erfindungsgemäß verwendeten Fusion-Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0,1 m NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden. Die Reinheit der nach diesem vereinfachten Verfahren erhaltenen Fusions-Hydrophobine liegt in der Regel bei 60 bis 80 Gew.-% bezüglich der Menge aller Proteine. Die nach dem beschriebenen, vereinfachten Reinigungsverfahren erhaltenen Lösungen können ohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden.

Die wie beschrieben hergestellten Hydrophobine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.

Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich, eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacca etch virus Protease).

Erfindungsgemäß können die Hydrophobine oder Derivate davon, zur Stabilisierung der bereits getrennten Phasen in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen eingesetzt werden. Dabei kann es sich im Prinzip um beliebige Zusammensetzungen handeln, solange diese mindestens zwei flüssige Phasen aufweisen.

Insbesondere kann es sich auch um Zusammensetzungen handeln, die vor der Zuga- be des mindestens einen Hydrophobins oder Derivats davon, in Form einer Emulsion vorlagen, dann in einem längeren Prozess (vorzugsweise mehr als 1 Minute, insbesondere mehr als 5 Minuten) in zwei Phasen getrennt wurden und erst dann mit Hydrophobin versetzt werden.

Die Zusammensetzung kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung neben den mindestens zwei flüssigen Phasen im Prinzip auch weitere Phasen aufweisen.

Bei den mindestens zwei flüssigen Phasen handelt es sich um zwei flüssige Phasen unterschiedlicher Dichte, bevorzugterweise um ein öl und Wasser, zwei organische Lösungen unterschiedlicher Dichte, einen Kraftstoff und Wasser, einen Brennstoff und Wasser oder ein Lösungsmittel und Wasser. Dabei werden unter einer wässrigen Lösung im Rahmen der vorliegenden Erfindung Lösungen verstanden, die Wasser, gegebenenfalls in Kombination mit einem weiteren Lösungsmittel enthalten. Jede der flüssigen Phasen kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung weitere Stoffe enthal- ten.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei einem öl vorzugsweise um ein Rohöl.

Geeignete Lösungsmittel sind alle Flüssigkeiten, die mit Wasser zweiphasige Gemi- sehe ausbilden, insbesondere organische Lösungsmittel, beispielsweise Ether, aromatische Verbindungen wie Toluol oder Benzol, Alkohole, Alkane, Alkene, Cycloalkane, Cycloalkene, Ester, Ketone, Naphtene oder halogenierte Kohlenwasserstoffe.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher eine wie zuvor beschriebene Verwendung mindestens eines Hydrophobins oder mindestens eines Derivats davon, wobei die Zusammensetzung öl, bevorzugt Rohöl und Wasser enthält oder aber Kraft- oder Brennstoff und Wasser.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung auch weitere Phasen enthalten, beispielsweise eine feste oder flüssige Phase, insbesondere eine feste Phase.

Die Hydrophobine oder Derivate davon können für alle dem Fachmann bekannten Anwendungen eingesetzt werden. Insbesondere sind im Rahmen der vorliegenden Erfin- düng die Verwendung als Phasen-Stabilisator in Ottokraftstoff/Wasser-Mischungen, in anderen Kraftstoff- oder Brennstoff/Wasser-Mischungen, Rohöl und Wasser-Phasen bei der Rohölförderung beziehungsweise Rohöltransport sowie die Entsalzung von Rohöl durch Extraktion von Rohöl mit Wasser sowie anschließende Weiterleitung der resultierenden Phasen zu nennen.

Durch Zugabe von Demulgatoren können Emulsionen gebrochen werden. So liegt beispielsweise gefördertes Erdöl in der Regel als relativ stabile Wasser-in-öl-Emulsion vor, welche je nach Art der Lagerstätte bis zu 90 Gew.-% Wasser enthalten kann. Bei der Aufarbeitung und Reinigung des Rohöls fällt nach dem Abtrennen eines Großteils des Wassers ein Rohöl an, das immer noch ca. 2 bis 3 Gew.-% Wasser enthält. Dieses bildet mit dem öl eine stabile Emulsion, die auch durch Zentrifugierung und Zugabe herkömmlicher Demulgatoren nicht vollständig abzutrennen ist. Dies ist insofern problematisch, als das Wasser einerseits stark salzhaltig ist und damit korrodierend wirkt, zum anderen wird durch das Restwasser das zu transportierende und zu lagernde Vo- lumen erhöht, was zu erhöhten Kosten führt. Es wurde gefunden, dass Hydrophobine oder Derivate davon eingesetzt werden können, um die Phasentrennung in diesen Zusammensetzungen zu verbessern. Es wird eine sehr schnelle Trennung erreicht.

Dabei muss der Demulgator auf die Art der emulgierten öle und Fette sowie auf gege- benenfalls enthaltene Emulgatoren und Tenside eingestellt werden, um eine optimale Wirkung zu erzielen. Das Brechen von Emulsionen kann durch eine erhöhte Temperatur zusätzlich unterstützt werden, beispielsweise eine Temperatur von 0 bis 100°C, beispielsweise von 10 bis 80 °C, insbesondere von 20 bis 60°C.

Eine weitere erfindungsgemäße Anwendung ist die Phasen-Stabilisierung in Öl-inWasser- oder Wasser-in-öl-Gemischen, beispielsweise 2-Phasen-Systeme, die als Kühlschmierstoffe eingesetzt wurden und recycelt werden sollen. Wasser/Öl-Gemische fallen beispielsweise auch an Bord von Seeschiffen als Bilgewasser an. Dabei ist die Trennung von Emulsionen und Aufrechterhaltung der getrennten Phasen nötig, um das Wasser zuverlässig abtrennen zu können.

Die Menge des eingesetzten Hydrophobins oder Derivats davon kann in weiten Bereichen variieren, wobei die Menge vorteilhafterweise auf die Zusammensetzung an sich und gegebenenfalls in der Zusammensetzung enthaltene weitere Komponenten abge- stimmt wird.

Sofern beispielsweise die Zusammensetzung Stoffe enthält, die eine Phasentrennung der mindestens zwei flüssigen Phasen verzögern oder verschlechtern, beispielsweise Tenside oder Emulgatoren, wird vorteilhaft eine größere Menge eines Hydrophobins oder eines Derivats davon eingesetzt.

Da öle, insbesondere Rohöle, aus einem Gemisch vieler chemischer Verbindungen bestehen, ist es erforderlich, aufgrund der unterschiedlichen chemischen Zusammensetzung des Öls, der Wasser- und Salzanteile sowie der konkreten Bedingungen der Emulsionsspaltung, wie Temperatur, Dauer der Emulsionsspaltung, Art der Zudosie- rung und Wechselwirkungen mit weiteren Komponenten des Gemischs, den Demulgator auf die konkreten Bedingungen abzustimmen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass bereits geringe Mengen eines Hydropho- bins oder Derivats davon zu einer Verbesserung der Phasenstabilisierung führen.

Das Hydrophobin oder Derivat davon kann erfindungsgemäß in jeder geeigneten Menge eingesetzt werden. In der Regel wird das mindestens eine Hydrophobin oder Derivat davon in einer Menge von 0,001 bis 100 ppm, bezogen auf die gesamte Zusam- mensetzung, eingesetzt; bevorzugt in einer Menge von 0,001 bis 80 ppm, besonders bevorzugt von 0,001 bis 20 ppm und ganz besonders bevorzugt 0,01 bis 10 ppm.

Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung bezeichnet die Angabe ppm mg pro kg.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine wie zuvor beschriebene Verwendung, wobei das Hydrophobin oder das mindestens eine Derivat davon in einer Menge von 0,001 bis 100 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird. Die eingesetzte Konzentration wird vom Fach- mann je nach Art der zu stabilisierenden Phasen-Zusammensetzung festgelegt.

Sofern es sich bei der Zusammensetzung um eine Zusammensetzung enthaltend Kraft- oder Brennstoffe und Wasser handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon in der Regel in einer Menge vom 0,001 bis 20 ppm, bevorzugt von 0,005 bis 2 ppm, insbesondere von 0,01 bis 1 ppm, besonders bevorzugt 0,05 bis 1 ppm eingesetzt.

Sofern es sich bei der Zusammensetzung um eine Zusammensetzung enthaltend Rohöl und Wasser handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon in der Regel in einer Menge von 0,01 bis 100 ppm, bevorzugt von 0,1 bis 80 ppm, insbesondere von 0,1 bis 50 ppm, besonders bevorzugt 0,1 bis 20 ppm eingesetzt.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass die Zusammensetzung neben dem mindestens einen Hydrophobin oder Derivat davon weitere Verbindungen enthält, die die Phasenstabilisierung verbessern. Dabei kann es sich um alle Verbindungen handeln, die dem Fachmann für derartige Anwendungen bekannt sind. Beispielsweise geeignet als weitere Verbindung zur Verbesserung der Phasenstabilisierung sind insbesondere für die Anwendung als Emulsionsspalter bei der Rohölproduktion oxyalkylierte Phenolformaldehydharze, EO/PO-Blockcopolymere, vernetzte Diepoxide, Polyamide beziehungsweise deren Alkoxylate, Salze der Sulfonsäuren, ethoxylierte Fettamine, Succi- nate sowie die in DE 10 2005 006 030.7 für derartige Anwendungen genannten Verbindungen.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine wie zuvor beschriebene Verwendung, wobei neben mindestens einem Hydrophobin oder dem mindestens einen Derivat davon mindestens eine weitere Verbindung eingesetzt wird, die die Phasenstabilisierung verbessert.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Stabilisierung von flüssigen Phasen in einer Zusammensetzung enthaltend mindes- tens zwei flüssige Phasen, umfassend die Zugabe von mindestens einem Hydrophobin beziehungsweise mindestens einem Derivat davon zu der Zusammensetzung.

Dabei kann es sich bei der Zusammensetzung um eine wie zuvor beschriebene Zu- sammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen handeln, beispielsweise Zusammensetzungen enthaltend öl, bevorzugt Rohöl, und Wasser oder auch Zusammensetzungen enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann weitere Schritte umfassen, beispielsweise zu- nächst die Durchführung einer Phasentrennung beziehungsweise das Brechen von Emulsionen und daran anschließendes Hinzufügen von Hydrophobinen zur wässrigen Phase.

Erfindungsgemäß können Hydrophobine oder Derivate davon der wässrigen Phase eines 2-Phasen-Systems zugesetzt werden aber auch Formulierungen enthaltend Kraft- oder Brennstoffe. Dies ermöglicht bei Kontakt der Formulierung mit Wasser eine Stabilisierung der Phasen beziehungsweise verhindert die Re-Emulgierung.

Ebenso ist es vorteilhaft, Rohöl-Wasser-Phasen Hydrophobine oder Derivate davon zuzusetzen, um beispielsweise die erneute Bildung von Emulsionen beim Transport zu verhindern.

Die Formulierung enthaltend Kraft- oder Brennstoffe kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung weitere Additive enthalten, die üblicherweise in derartigen Formulie- rungen enthalten sind. Geeignete Zusatzstoffe sind beispielsweise in WO 2004/087808 genannt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Brennstoffen beispielsweise leichte, mittlere oder schwere Heizöle verstanden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Kraftstoffen beispielsweise Ottokraftstoffe, Dieselkraftstoffe oder Turbinenkraftstoffe verstanden. Besonders bevorzugt handelt es sich um Ottokraftstoffe.

Die genannten Additive werden dabei in dem Fachmann für die jeweilige Anwendung geeignet erscheinenden Mengen eingesetzt.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen können darüber hinaus mit noch weiteren üblichen Komponenten und Additiven kombiniert werden. Hier sind in beispielsweise Trägeröle ohne ausgeprägte Detergenswirkung zu nennen. Geeignete mineralische Trägeröle sind bei der Erdölverarbeitung anfallende Fraktionen, wie Brightstock oder Grundöle mit Viskositäten wie beispielsweise aus der Klasse SN 500-2000; aber auch aromatische Kohlenwasserstoffe, paraffinische Kohlenwas- serstoffe und Alkoxyalkanole. Erfindungsgemäß geeignet ist ebenfalls eine als "hydro- crack oil" bekannte und bei der Raffination von Mineralöl anfallende Fraktion (Vakuumdestillatschnitt mit einem Siedebereich von etwa 360 bis 500 °C, erhältlich aus unter Hochdruck katalytisch hydriertem und isomerisiertem sowie entparaffiniertem natürlichen Mineralöl). Ebenfalls geeignet sind Mischungen oben genannter mineralischer Trägeröle.

Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare synthetische Trägeröle sind ausgewählt unter: Polyolefinen (Polyalphaolefine oder Polyintemalolefine), (Poly)estern, (Poly)al- koxylaten, Polyethem, aliphatischen Polyetheraminen, alkylphenolgestarteten PoIy- ethern, alkylphenolgestarteten Polyetheraminen und Carbonsäureester langkettiger Alkanole.

Weitere geeignete Trägerölsysteme sind beispielsweise beschrieben in DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074, EP-A 0 452 328 und EP-A 0 548 617, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.

Weitere geeignete synthetische Trägeröle sind alkoxylierte Alkylphenole, wie sie in der DE-A 10 102 913.6 beschrieben sind.

Die genannten Trägeröle werden dabei in dem Fachmann für die jeweilige Anwendung geeignet erscheinenden Mengen eingesetzt.

Weitere übliche Additive sind Korrosionsinhibitoren, beispielsweise auf Basis von zur Filmbildung neigenden Ammoniumsalzen organischer Carbonsäuren oder von hetero- cyclischen Aromaten im Falle von Buntmetallkorrosionsschutz; Antioxidantien oder Stabilisatoren, beispielsweise auf Basis von Aminen wie p-Phenylendiamin, Dicyclohe- xylamin oder Derivaten hiervon oder von Phenolen wie 2,4-Di-tert.-butylphenol oder 3, 5-Di-tert.-butyl-4-hydroxyphenylpropionsäure; weitere herkömmliche Demulgatoren; Antistatikmittel; Metallocene wie Ferrocen; Methylcyclopentadienylmangantricarbonyl; Schmierfähigkeitsverbesserer (Lubricity-Additive) wie bestimmte Fettsäuren, Alkenyl- bemsteinsäureester, Bis(hydroxyalkyl)fettamine, Hydroxyacetamide oder Ricinusöl; sowie Farbstoffe (Marker). Gegebenenfalls werden auch Amine zur Absenkung des pH-Wertes des Kraftstoffes zugesetzt. Die genannten Detergensadditive mit den polaren Gruppierungen (a) bis (i) werden dem Kraftstoff üblicherweise in einer Menge von 10 bis 5000 Gew.-ppm, insbesondere 50 bis 1000 Gew.-ppm, zugegeben. Die sonstigen erwähnten Komponenten und Additive werden, wenn gewünscht, in hierfür üblichen Mengen zugesetzt.

Als Kraft- und Brennstoffe sind erfindungsgemäß alle dem Fachmann bekannten Kraft- und Brennstoffe geeignet, beispielsweise Ottokraftstoffe, wie sie beispielsweise in LJII- mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5.Aufl. 1990, Band A16, S. 719ff. beschrieben sind. Geeignete Kraftstoffe sind erfindungsgemäß auch Dieselkraftstoff, Ke- rosin und Jet-Treibstoff.

Insbesondere ein Ottokraftstoff mit einem Aromatengehalt von maximal 60, wie z. B. maximal 42 Vol.-% und einem Schwefelgehalt von maximal 2000, wie z. B. maximal 150 Gew.-ppm ist geeignet.

Der Aromatengehalt des Ottokraftstoffes beträgt beispielsweise 10 bis 50, wie z. B. 30 bis 42 Vol.-%, insbesondere 32 bis 40 Vol.-%. Der Schwefelgehalt des Ottokraftstoffes beträgt beispielsweise 2 bis 500, wie z. B. 5 bis 150 Gew.-ppm, oder 10 bis 100 Gew.- ppm.

Weiterhin kann ein geeigneter Ottokraftstoff beispielsweise einen Olefingehalt bis zu 50 Vol.-%, wie z. B. von 6 bis 21 Vol.-%, insbesondere 7 bis 18 Vol.-%; einen Benzolgehalt von bis zu 5 Vol.-%, wie z. B. 0,5 bis 1,0 Vol.-%, insbesondere 0,6 bis 0,9 Vol.-% und/oder einen Sauerstoffgehalt von bis zu 25 Gew.-%, wie z. B. bis zu 10 Gew.-% oder 1,0 bis 2,7 Gew.-%, insbesondere von 1,2 bis 2,0 Gew.-%, aufweisen.

Insbesondere können solche Ottokraftstoffe beispielhaft genannt werden, welche gleichzeitig einen Aromatengehalt von maximal 38 Vol.-%, einen Olefingehalt von maximal 21 Vol.-%, einen Schwefelgehalt von maximal 50 Gew. -ppm, eine Benzolgehalt von maximal 1 ,0 Vol.-% und eine Sauerstoffgehalt von 1 ,0 bis 2,7 Gew.-% aufweisen.

Der Gehalt an Alkoholen und Ethern im Ottokraftstoff kann über einem weiten Bereich variieren. Beispiele typischer maximaler Gehalte sind für Methanol 15 Vol.-%, für Etha- nol 65 Vol.-%, für Isopropanol 20 Vol.-%, für tert.-Butanol 15 Vol.-%, für Isobutanol 20 Vol.-% und für Ether mit 5 oder mehr C-Atomen im Molekül 30 Vol.-%.

Der Sommer-Dampfdruck eines erfindungsgemäß geeigneten Ottokraftstoffes beträgt üblicherweise maximal 70 kPa, insbesondere 60 kPa (jeweils bei 37°C). Die ROZ des Ottokraftstoffes beträgt in der Regel 75 bis 105. Ein üblicher Bereich für die entsprechende MOZ liegt bei 65 bis 95.

Die genannten Spezifikationen werden nach üblichen Methoden bestimmt (DIN EN 228).

Die Erfindung wird im Folgenden durch Beispiele näher erläutert.

Beispiele

Beispiel 1

Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-HisJ vaaE-HiSg

Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (HaI 572/ HaI 573) wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD / yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine Ncol bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so entstandenen Vektoren pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS₆ bzw. YAAE::HIS₆ verwendet werden.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

Beispiel 2

Klonierung von vaad-Hvdrophobin DewA-HiSg

Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklea- se BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 klo- niert.

Der so entstandene Vektor #508 kann zur Expression eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS₆ verwendet werden.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC

Beispiel 3

Klonierung von vaad-Hvdrophobin RodA-HiSg

Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

Beispiel 4

Klonierung von vaad-Hvdrophobin BASFI-HiSg

Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.

Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 11 und 12).

KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Beispiel 5 Klonierung von vaad-Hydrophobin BASF2-HiSfi

Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.

Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 13 und 14).

KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Beispiel 6

Klonierung von vaad-Hvdrophobin SC3-HiSfi

Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.

Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 9 und 10).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Beispiel 7

Fermentation des rekombinanten E.coli Stammes vaad-Hvdrophobin DewA-HiSg

Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His₆ expri- mierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 11 Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.

13,51 LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 2Ol Fermenter mit 0,51 Vorkultur (OD₆oo_nm 1 :10 gegen H₂O gemessen) animpfen. Bei einer OD_60nm von -3.5 Zugabe von 140ml 10OmM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.

Beispiel 8

Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins

100 g Zellpellet (100 - 500 mg Hydrophobin) werden mit 50 rtiM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschließend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum Zellaufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentri- fugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert.

Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschließende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugen becher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g).

Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschließenden Zentrifuga- tion im Überstand enthalten (Abbildung 1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E.coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 rtiM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschließend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.

Abbildung 1 (Figur 1) zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins: Spur A: Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1 :10 Verdünnung)

Spur B: Durchlauf = Eluat Waschschritt

Spuren C - E: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen (WP1 , WP2, WP3)

Spur F zeigt den aufgetragenen Marker.

Das Hydrophobin der Abbildung 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.

Beispiel 9

Anwendungstechnische Prüfung: Charakterisierung des Hvdrophobins durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas

Substrat:

Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim):

Es wurde das gemäß Beispiel 8 gereinigte Hydrophobin eingesetzt.

- Konzentration des Hydrophobins in der Lösung: 100 μg/ml, die Lösung enthielt weiterhin 50 rtiM Na-Acetat-Puffer sowie 0,1% Polyoxyethylen(20)-sorbitan- monolaureat (Tween^® 20)), pH-Wert der Lösung: 4 Eintauchen von Glasplättchen in diese Lösung über Nacht (Temperatur 80°C) - Danach wird das mit Hydrophobin beschichtete Glasplättchen der Lösung entnommen und in destilliertem Wasser gewaschen,

Danach Inkubation 10min / 80°C / 1% SDS-Lösung in destilliertem Wasser Erneutes Waschen in destilliertem Wasser

Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser mit der beschichteten Glasoberfläche bei Raumtemperatur bestimmt.

Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäß den Herstellerangaben.

Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; Das mit dem Hydrophobin gemäß Beispiel 8 (yaad-dewA-his₆) beschichtete Glasplätt- chen ergab einen Kontaktwinkel von 75 ± 5°.

==> Zunahme des Kontaktwinkels: 45°

Beispiel 10

Experimente zur Phasenstabilisierung durch Hydrophobin

In Schnappdeckelgläschen wurden jeweils 50 ml einer Emulsion aus Roherdöl (homogenes Roherdöl, Wintershall AG, Emiichheim, Sonde 60, 64, 83, 87, 301 und 507) und Wasser gegeben. Die Herstellung der Emulsion erfolgte durch Emulgierung von 1000 ppm Roherdöl in ca. 50 ml Wasser mittels eines Ultraturrax-Rührers (Rührzeit von 4 Minuten bei 24000 U/min).

Zu dieser Emulsion wurden gegeben

im Falle A kein Demulgator gegeben, im Falle B 10 ppm Hydrophobin aus Beispiel 8, im Falle C 10 ppm PoIyDADMAC (Demulgator mit Feststoffgehalt von 28 bis 32% (ISO3251), Viskosität 200 bis 800 mPas (ISO2595)) im Falle D 10 ppm Lupasol SK (mit Polyethylenimin gepfropftes Polyamidoamin, Hersteller Nippon Shokubai, Japan)

Die Proben wurden im Anschluss 3 Tage stehen gelassen, wobei sich die Emulsionen auftrennten (s. Schematische Abbildung in Figur 2, obere Reihe).

Dann wurden die Proben mit der Hand leicht durch ein paar kreisförmige Bewegungen geschüttelt. Hierbei entstanden in den Fällen A, C und D wieder starke Eintrübungen (Emulsionsbildung), im Falle von B (enthaltend Hydrophobin) blieb die Phasentrennung erhalten.

Vereinzelt bildeten sich auch in der 10 ppm Hydrophobin enthaltenden Probe B Flocken, die jedoch sofort zur oberen Öl-Phase aufstiegen (siehe untere Reihe der schematischen Abbildung in Figur 2). Diese Experimente belegen, dass Hydrophobine die bereits erfolgte Auftrennung von Emulsionen in zwei getrennte Phasen besser als handelsübliche Demulgatoren stabilisieren.

Das Hydrophobin kann auch nach Aufspaltung der Emulsion der wässrigen Phase zugesetzt werden.

Beispiel 11

Vergleich der Phasenstabilisierung

Es werden zunächst 5 gew.-%ige Lösungen der in der Tabelle gelisteten Demulgatoren in Xylol/Isopropanol-Gemisch 3 : 1 (bezogen auf Volumen) hergestellt.

Das Hydrophobin aus Beispiel 8 wurde 1 h vor Zugabe als 1 %ige Lösung (0,25 % Wirksubstanz) in destilliertem Wasser angesetzt.

Beispielhaft verwendete Demulgatoren sind dabei:

Pluronic^® PE 6800: (Ethylenoxid/Propylenoxid Copolymer)

Basorol^® P380: (Triol Polyol Polyether)

Basorol^® HP: (Tetrol-Ethylenoxid/Propylenoxid Copolymer)

Eine Rohölemulsion (Wintershall AG, Emiichheim, Sonden 60, 64, 83, 87, 301 und 507 mit einem Wassergehalt von 62 Vol-%, bestimmt nach Destillationsverfahren DIN ISO

3733) wurde für ca. 2 h im Wasserbad in einem verschlossenen Behälter auf eine

Temperatur von 52 ⁰C erwärmt.

Die Rohölemulsion wurde ca. 30 Sek. durch Schütteln homogenisiert und jeweils 100 ml der Rohölemulsion wurden in 100 ml-Schüttelzylinder gefüllt. Die mit öl gefüllten

Schüttelzylinder wurden in das Wasserbad eingesetzt.

Mit einer Eppendorf-Pipette wurden jeweils 50 μl der 5 gew.-%igen Lösung der oben genannten Demulgatoren in einen Schüttelzylinder mit Rohölemulsion dosiert und der Zylinder mit dem Glasstopfen verschlossen. Danach wurde der Schüttelzylinder aus dem Wasserbad herausgenommen, 60 x geschüttelt und entspannt. Der Schüttelzylinder wurde nun wieder in das Wasserbad (52 °C) gestellt und das Volumen des sich nun abscheidenden Wassers nach 30 und 240 Min. abgelesen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben.

Nach 240 Minuten wurden die in der Tabelle angegebenen Mengen Hydrophobin mittels einer Einwegspritze jeweils in das abgesetzte Wasser eingespritzt. Anschließend werden die Mischungen jeweils für 30 Sek. geschüttelt. Im Anschluss daran lässt man die Proben bei 52 °C für 1 Minute ruhen und bestimmt dann die Menge des abgeschiedenen Wassers. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefasst.

Tabelle

Man sieht deutlich, dass durch die Zugabe des Hydrophobins die erneute Auftrennung der Phasen beschleunigt erfolgt. Es scheint demnach die re-Emulgierung der Wasserphase in die ölphase durch das Protein reduziert zu sein.

Erstaunlich ist auch die niedrige Konzentration von 0,5 bis 1 ppm an Hydrophobin, die zur Erzielung des Ergebnisses ausreicht.

Claims

Patentansprüche

1. Verwendung mindestens eines Hydrophobins zur Phasen-Stabilisierung in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen.

2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine wässrige und eine organische Phase aufweist.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin ein Fusions-Hydrophobin ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen eine Zusammensetzung enthaltend öl und Wasser oder eine Zusammensetzung enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens ein Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 80 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Rohöl-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das Hydropho- bin in einer Menge von 0,001 bis 20 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Kraft-/Brennstoff-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das Hydrophobin in einer Menge von 0,01 bis 10 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass neben dem mindestens einen Hydrophobin mindestens eine weitere Verbindung eingesetzt wird, die die Phasen-Stabilisierung verbessert.

10. Verfahren zur Stabilisierung von flüssigen Phasen in einer Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, umfassend die Zugabe von mindestens einem Hydrophobin zu der Zusammensetzung.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin ein Fusions-Hydrophobin oder ein Derivat davon ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der

Gruppe von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen eine Zusammensetzung enthaltend öl und Wasser oder eine Zusammensetzung enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 80 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Rohöl-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 20 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Kraft-/Brennstoff-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 20 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst eine Aufspaltung der Phasen erfolgt und danach eine Zugabe des Hydrophobins zu der wässrigen Phase erfolgt.

18. Formulierung, enthaltend mindestens eine organische Phase bestehend aus Kraftstoffen, Brennstoffen und/oder Rohölen sowie eine wässrige Phase enthaltend mindestens ein Hydrophobin.

19. Formulierung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 80 ppm, bezogen auf die gesamte Formulierung, in der Formulierung enthalten ist.

20. Formulierung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung mindestens einen Kraft- oder Brennstoff enthält und das

Hydrophobin oder das Derivat davon in einer Menge von 0,01 bis 1 ppm, bezogen auf die gesamte Formulierung, in der Formulierung enthalten ist.

21. Formulierung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Kraft- oder Brennstoff um einen Kraftstoff ausgewählt aus der Gruppe von

Ottokraftstoffen, Dieselkraftstoffen oder Turbinenkraftstoffen handelt.

22. Formulierung nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin ein Fusions-Hydrophobin oder ein Derivat davon ist.

23. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.