DE102005029704A1 - Verwendung von Hydrophobin-Polypeptiden sowie Konjugaten aus Hydrophobin-Polypeptiden mit Wirk-oder Effektstoffen und ihre Herstellung sowie deren Einsatz in der Kosmetik - Google Patents

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Abstract

Kosmetische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, Schleimhäuten und Zähnen, enthaltend mindestens eine Hydrophobin Polypeptidsequenz (i) DOLLAR A X¶n¶-C·1·-X¶1-50¶-C·2·-X¶0-5¶-C·3·-X¶1-100¶-C·4·-X¶1-100¶-C·5·-X¶1-50¶-C·6·-X¶0-5¶-C·7·-X¶1-50¶-C·8·-X¶m¶ (I).

Description

  • Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 AS, die charakteristisch für filamentöse Pilze sind und nicht in anderen Organismen vorkommen. Kürzlich wurden Hydrophobin-ähnliche Proteine in Streptomyces coelicolor entdeckt, die als „Chapline" bezeichnet werden und ebenfalls hoch oberflächenaktive Eigenschaften haben. An Wasser/Luft-Grenzflächen können sich Chapline zu Amyloid-ähnlichen Fibrillen assemblieren (Classen et al. 2003 Genes Dev 1714-1726; Elliot et al. 2003, Genes Dev. 17, 1727-1740).
  • Hydrophobine sind in einer wasserunlöslichen Form auf der Oberfläche von verschiedenen pilzlichen Strukturen, wie z.B. Lufthyphen, Sporen, Fruchtkörpern, verteilt. Die Gene für Hydrophobine konnten aus Ascomyzeten, Deuteromyzeten und Basidiomyzeten isoliert werden. Einige Pilze enthalten mehr als ein Hydrophobingen, z.B. Schizophyllum commune, Coprinus cinereus, Aspergillus nidulans. Offensichtlich sind verschiedene Hydrophobine in unterschiedlichen Stadien der pilzlichen Entwicklung involviert. Die Hydrophobine sind dabei vermutlich verantwortlich für unterschiedliche Funktionen (van Wetter et al., 2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210; Kershaw et al. 1998, Fungal Genet. Biol, 1998, 23, 18-33).
  • Als biologische Funktion für Hydrophobine wird neben der Reduzierung der Oberflächenspannung von Wasser zur Generierung von Lufthyphen auch die Hydrophobisierung von Sporen beschrieben (Wösten et al. 1999, Curr. Biol., 19, 1985-88; Bell et al. 1992, Genes Dev., 6, 2382-2394). Weiterhin dienen Hydrophobine zur Auskleidung von Gaskanälen in Fruchtkörpern von Flechten und als Komponenten im Erkennungssystem von pflanzlichen Oberflächen durch pilzliche Pathogene (Lugones et al. 1999, Mycol. Res., 103, 635-640; Hamer & Talbot 1998, Curr. Opinion Microbiol., Band 1, 693-697).
  • Komplementationsexperimente haben gezeigt, dass Hydrophobine sich innerhalb einer Klasse bis zu einem gewissen Grad funktionell ersetzen können.
  • Die bisher bekannten Hydrophobine lassen sich mit üblichen proteinchemischen Reinigungs- und Isolationsverfahren nur in mässiger Ausbeute und Reinheit darstellen. Auch Versuche, mit Hilfe von gentechnischen Verfahren, grössere Mengen an Hydrophobinen bereitzustellen, waren bisher nicht erfolgreich.
  • US 20030217419A1 beschreibt die Verwendung des Hydrophobins SC3 aus Schizophyllumg commune für kosmetische Zubereitungen.
    •
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Polypeptide bereitzustellen, die eine hohe Affinität zu Keratin bzw. keratinhaltigen Stoffen wie Haut, Nägel oder Haare und/oder zu Schleimhäuten und/oder Zähnen besitzen. Solche Polypeptide eignen sich für die kosmetische und pharmazeutische Behandlung von keratinhaltigen Strukturen, insbesondere von Haaren, Nägeln und Haut, oder von Schleimhäuten oder Zähnen sowie als Anker für eine Vielzahl von Wirk- und Effektstoffen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es weiterhin, neue keratin-bindende Effektormoleküle bereitzustellen, die ein Bindepeptid mit hoher Affinität zu Keratin bzw. keratinhaltigen Stoffen wie Haut oder Haare besitzen, und an die bestimmte Effektormoleküle gebunden sind. Solche keratin-bindende Effektormoleküle erlauben eine hohe lokale Konzentration von Effektormolekülen am Keratin, d.h. ein sogenanntes „targeting bzw. eine lange Wirkdauer am Keratin.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Gegenstand der Erfindung sind kosmetische Zusammensetzungen zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, Schleimhäuten und Zähnen, enthaltend mindestens eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) der allgemeinenen Strukturformel (I) in einem kosmetisch verträglichen Medium.
  • Strukturformel (I):
    • Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I) wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300, stehen und C für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit Xn oder Xm abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 20 Aminosäuren lange Peptidsequenz steht, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von mindestens 20° bewirken.
  • Die mit C1 bis C8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C1 bis C8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemässen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
  • Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.
  • Besonders vorteilhafte Polypeptide (i) sind solche der allgemeinen Formel (II) Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 2 und 300 stehen und C für Cystein, Alanin, Se rin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit Xn oder Xm abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 35 Aminosäuren lange Peptidsequenz steht, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von mindestens 20° bewirken.
  • Ganz besonders vorteilhaft sind solche Polypeptide (i) der allgemeinen Formel (III) Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III)wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen und C für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens sechs der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit Xn oder Xm abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 40 Aminosäuren lange Peptidsequenz steht, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von mindestens 20° bewirken.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der beschriebenen Erfindung sind Polypeptide mit der allgemeinen Strukturformel (I) (II) oder (III), wobei diese Strukturformel mindestens ein Hydrophobin der Klasse I, bevorzugt mindestens ein Hydrophobin dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, oder Teile oder Derivate davon umfasst. Die genannten Hydrophobine sind im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert. Es können auch mehrere Hydrophobine, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die neuen Proteine mit der in SEQ ID NO: 20, 22, 24 dargestellen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 19, 21, 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 22, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10. bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die Änderung des Kontaktwinkels wie in Beispiel 10 beschrieben, verstanden.
  • Die erfindungsgemässen Proteine tragen an mindestens einer Position, die mit Xn oder Xm abgekürzt wird, eine Polypeptidsequenz aus mindestens 20 bevorzugt mindestens 35 besonders bevorzugt mindestens 50 und insbesonders mindestens 100 Aminosäuren (im folgenden auch Fusionspartner genannt), die nicht natürlicherweise mit einem Hydrophobin verknüpft ist. Damit soll ausgedrückt werden, dass die erfindungsgemässen Proteine aus einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.
  • Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (Xn) und am Carboxyterminus (Xm) des Hydrophobinteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (Xn oder Xm) des erfindungsgemässen Proteins verknüpft werden.
  • Als Fusionspartner sind besonders bevorzugt solche Polypeptidsequenzen, die dazu führen, dass das erfindungsgemässe Protein zur Beschichtung von Glasoberflächen fähig ist und die mit Protein behandelte Glasoberfläche resistent wird gegenüber einer Detergenzbehandlung, wie sie im experimentellen Teil (Beispiel 10) ausführlich beschrieben ist (z.B. 1% SDS/80°C/10 min) ist.
  • Besonders geeignete Fusionspartner sind Polypeptide, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO:15 und 16), yaae(SEQ ID NO:17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 10-90%, besonders bevorzugt 25-75% der genannten Sequenzen umfassen. Eine Deletion am C-terminalen Ende wird dabei bevorzugt; beispielsweise ein yaad-Fragment, das nur aus den ersten 75 N-terminalen Aminosäuren besteht, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind. Beispielsweise können am C-terminalen Ende der Sequenzen yaad und yaae noch zusätzliche Aminosäuren, insbesondere zwei zusätzliche Aminosäuren, bevorzugt die Aminosäuren Arg, Ser, angefügt sein. Ferner können bevorzugt in der Sequenz yaae zusätzliche Aminosäuren gegenüber der natürlich vorkommenden Sequenz eingefügt sein, beispielsweise die Aminosäure Nr. 2 (Gly) in SEQ ID NO: 17 und 18.
  • Weitere bevorzugte Fusionspartner sind Keratin-Bindedomänen, beispielsweise solche, die im humanen Desmoplakin vorkommen bzw. die davon durch übliche gentechnische Verfahren wie Aminosäurdesubstitution, -insertion oder -deletion ableitbar sind. Die Bindung an Keratin kann mit den im experimentellen Teil beschriebenen Versuchen leicht überprüft werden.
  • Weiterhin können auch an den Verknüpfungsstellen zweier Fusionsparter zusätzliche Aminosäuren eingefügt werden, die sich dadurch ergeben, dass auf der Nukleinsäureebene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entweder neu kreiert oder inaktiviert werden.
  • Die erfindungsgemässen Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.
  • Eine Eigenschaft der erfindungsgemässen Proteine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem erfindungsgemässen Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
  • Die genauen experimentellen Bedingungen zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil in Beispiel 10 niedergelegt. Unter diesen Bedingungen besitzen die erfindungsgemässen Proteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20, bevorzugt 25, besonders bevorzugt 30 Grad zu vergrössern.
  • Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hydrophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und II (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).
  • Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1% SDS bei erhöhter Temperatur) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA), bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse II Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60%iges Ethanol, bzw. 1% SDS (bei Raumtemperatur) wieder aufgelöst werden. Diese hohe Stabilität gegenüber Lösungsmitteln und Detergentien ist eine besondere Eigenschaft der Hydrophobine und unterscheidet Beschichtungen mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden von „unspezifischen" Proteinbeschichtungen, wie sie eine Vielzahl von Proteinen an Oberflächen ausbilden.
  • Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C3 und C4 bei Klasse II Hydrophobinen deutlich kürzer ist, als bei Hydrophobinen der Klasse I.
  • Klasse II Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Hydrophobin-enthaltended Effektormoleküle bestehend aus
    • (i) mindestens einem Hydrophobin,
    • (ii) einem Effektormolekül, das natürlicherweise nicht mit dem Hydrophobin (i) verknüpft ist.
  • Das Hydrophobin (i) kann durch alle bekannten Hydrophobinpolypeptide repräsentiert werden. Besonders geeignete Hydrophobine (i) sind die oben genannten Polypeptide (i) der allgemeinen Strukturformel (I), (II) oder (III).
  • Bevorzugte Hydrophobin Polypeptidsequenzen (i) umfassen eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-24.
  • Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret offenbarten Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) und die Verwendung dieser in den erfindungsgemäßen Verfahren.
  • „Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide (i) sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Keratinbindung, besitzen. So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Hydrophobin-Polypeptidsequenzen die gemäß einem der in Beispielen 12/13 beschriebenen Bindungstests eine mindestens 10%ige Bindung zeigen, bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt 90% der Bindung, die ein Hydrophobin von SEQ ID NO: 1-24 in den Bindungstests gemäß Beispielen 12/13 zeigt.
  • Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entnehmen:
    Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
    Ala Ser
    Arg Lys
    Asn Gln; His
    Asp Glu
    Cys Ser
    Gln Asn
    Glu Asp
    Gly Pro
    His Asn; Gln
    Ile Leu; Val
    Leu Ile; Val
    Lys Arg; Gln; Glu
    Met Leu; Ile
    Phe Met; Leu; Tyr
    Ser Thr
    Thr Ser
    Trp Tyr
    Tyr Trp; Phe
    Val Ile; Leu
  • Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Muteine, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Muteine, wobei die ge nannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einem Mutein mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen.
  • „Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.
  • „Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne gewünschte biologische Aktivität.
  • Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • „Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
  • "Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide, welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
  • „Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
  • „Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Hydrophobin-Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.
  • Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 75%, insbesondere wenigstens 85%, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.
  • Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
  • Homologe der erfindungsgemäßen Polypeptide (i) können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins.
  • Homologe des erfindungsgemäßen Polypeptide können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinse quenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).
  • Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
  • Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sind Hydrophobin-enthaltende Effektormoleküle, bei denen das Hydrophobin durch eine Polypeptidsequenzen (i) repräsentiert wird, die mindestens eine der folgenden Hydrophobin-Polypeptidsequenzen umfasst,
    • a) Polypetidsequenz der allgemeinen Strukturformel (I),
    • b) Polypeptidsequenz, die gegenüber (a) in bis zu 60%, bevorzugt bis zu 75%, besonders bevorzugt bis zu 90% der Aminosäurepositionen verändert ist,
    mit der Massgabe, dass die Keratin-Bindung der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (b) mindestens 10% des Wertes beträgt, den die Hydrophobin-Polypeptidsequenz (a) aufweist, gemessen in dem Test gemäß Beispielen 12 bzw. 13.
  • Mit Veränderung von Aminosäuren sind hiermit Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und -Deletionen oder beliebige Kombinationen aus diesen drei Möglichkeiten gemeint.
  • Bevorzugt werden Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) verwendet, die für den gewünschten Organismus eine hochspezifische Affinität besitzen. Für Anwendungen in der Hautkosmetik werden demzufolge Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) bevorzugt eingesetzt, die zu dem humanen Hautkeratin eine besonders hohe Affinität haben. Für Anwendungen in der Haarkosmetik werden solche Hydrophobin-Polypeptidsequenzen bevorzugt, die zu humanem Haarkeratin eine besonders hohe Affinität haben.
  • Für Anwendungen auf dem Haustiergebiet werden entsprechend solche Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) bevorzugt, die zu dem entsprechenden Keratin, beispielsweise Hundekeratin oder Katzenkeratin eine besonders hohe Affinität besitzen.
  • Es können aber auch mehr als eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in dem erfindungsgemäßen Effektormolekül verwendet werden. Es können auch mehrere Kopien der gleichen Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) hintereinander geschaltet werden, um beispielsweise eine höhere Bindung zu erzielen.
  • Die erfindungsgemäßen Hydrophobine mit Keratin-bindenden Eigenschaften besitzen ein weites Anwendungsgebiet in der Humankosmetik, insbesondere der Haut- und Haarpflege, der Tierpflege.
  • Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Hydrophobin Polypeptide (i) für die Haar- und Hautkosmetik angewendet. Sie erlauben eine hohe Konzentration und lange Wirkdauer von hautpflegenden oder hautschützenden Effektorstoffen.
  • Effektormoleküle (ii)
  • Als Effektormoleküle (ii) werden im folgenden Moleküle verstanden, die eine bestimmte, vorhersehbare Wirkung aufweisen. Dies können entweder proteinartige Moleküle sein, wie Enzyme oder auch nicht-proteinogene Moleküle wie Farbstoffe, Lichtschutzmittel, Vitamine und Fettsäuren, oder Metallionen- enthaltende Verbindungen.
  • Unter den proteinartigen Effektormolekülen sind Enzyme und Antikörper, bevorzugt.
  • Unter den Enzymen sind folgende als Effektormoleküle (ii) bevorzugt: Oxidasen, Peroxidasen, Proteasen, Tyrosinasen, metallbindende Enzyme, Lactoperoxidase, Lysozym, Amyloglycosidase, Glucoseoxidase, Superoxiddismutase, Photolyase, Calalase.
  • Gut geeignet als proteinartige Effektormoleküle (ii) sind auch Hydrolysate von Proteinen aus pflanzlichen und tierischen Quellen, beispielsweise Hydrolysate von Proteinen marinen Ursprungs oder Seidenhydrolysate.
  • Unter den nicht-proteinartigen Effektormolekülen (ii) sind Farbstoffe beispielsweise semipermanente Farbstoffe oder Oxidationsfarbstoffe bevorzugt. Bei den Reaktivfarbstoffen wird bevorzugt eine Komponente als Effektormolekül (ii) mit der Keratin-bindenden Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) verknüpft und anschliessend am Wirkort, d.h. nach Bindung am Haar, oxidativ mit der zweiten Farbstoffkomponente gekuppelt.
  • Als Farbstoffe sind alle gängigen Haarfarbstoffe für die erfindungsgemässen Moleküle geeignet. Geeignete Farbstoffe sind dem Fachmann aus Handbüchern der Kosmetik beispielsweise Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1 bekannt.
  • Weitere geeignete Effektormoleküle (ii) sind Carotinoide. Unter Carotinoide sind erfindungsgemäß folgende Verbindungen zu verstehen: β-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Cryptoxanthin, Citranaxanthin, Canthaxanthin, Bixin, β-Apo-4-carotinal, β-Apo-8-carotinal, β-Apo-8-carotinsäureester, einzeln oder als Mischung. Bevorzugt verwendete Carotinoide sind β-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Citranaxanthin und Canthaxanthin.
  • Unter Retinoide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Vitamin A Alkohol (Retinol) und seine Derivate wie Vitamin A Aldehyd (Retinal), Vitamin A Säure (Retinsäure) und Vitamin A Ester (z.B. Retinylacetat, Retinylpropionat und Retinylpalmitat) gemeint. Der Begriff Retinsäure umfasst dabei sowohl all-trans Retinsäure als auch 13-cis Retinsäure. Die Begriffe Retinol und Retinal umfassen bevorzugt die all-trans Verbindungen. Als bevorzugtes Retinoid verwendet man für die erfindungsgemäßen Suspensionen all-trans-Retinol, im folgenden als Retinol bezeichnet.
  • Weitere bevorzugte Effektormoleküle (ii) sind Vitamine, insbesondere Vitamin A und deren Ester.
    Vitamine, Provitamine und Vitaminvorstufen aus den Gruppen A, C, E und F, insbesondere 3,4-Didehydroretinol, β-Carotin (Provitamin des Vitamin A), Ascorbinsäure (Vitamin C), sowie die Palmitinsäureester, Glucoside oder Phosphate der Ascorbinsäure, Tocopherole, insbesondere α-Tocopherol sowie seine Ester, z.B. das Acetat, das Nicotinat, das Phosphat und das Succinat; weiterhin Vitamin F, worunter essentielle Fettsäuren, besonders Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure, verstanden werden;
    Vitamin A und seine Derivate und Provitamine zeigen vorteilhafterweise einen besonderen hautglättenden Effekt.
  • Zu den erfindungsgemäß bevorzugt einzusetzenden Vitaminen, Provitaminen oder Vitaminvorstufen der Vitamin B-Gruppe oder deren Derivaten sowie den Derivaten von 2-Furanon gehören unter anderem:
    Vitamin B1, Trivialname Thiamin, chemische Bezeichnung 3-[(4'-Amino-2'-methyl-5'-pyrimidinyl)methyl]-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumchlorid.
    Vitamin B2, Trivialname Riboflavin, chemische Bezeichung 7,8-Dimethyl-10-(1-D-ribityl)-benzo[g]pteridin-2,4(3H,10H)-dion. In freier Form kommt Riboflavin z. B. in Molke vor, andere Riboflavin-Derivate lassen sich aus Bakterien und Hefen isolieren. Ein erfindungsgemäß ebenfalls geeignetes Stereoisomeres des Riboflavin ist das aus Fischmehl oder Leber isolierbare Lyxoflavin, das statt des D-Ribityl einen D-Arabityl-Rest trägt.
    Vitamin B3. Unter dieser Bezeichnung werden häufig die Verbindungen Nicotinsäure und Nicotinsäureamid (Niacinamid) geführt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nicotinsäureamid.
    Vitamin B5 (Pantothensäure und Panthenol). Bevorzugt wird Panthenol eingesetzt. Erfindungsgemäß einsetzbare Derivate des Panthenols sind insbesondere die Ester und Ether des Panthenols sowie kationisch derivatisierte Panthenole. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können zusätzlich zu Pantothensäure oder Panthenol auch Derivate des 2-Furanon eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Derivate sind die auch im Handel erhältlichen Substanzen Dihydro-3hydroxy-4,4-dimethyl-2(3H)-furanon mit dem Trivialnamen Pantolacton (Merck), 4 Hydroxymethyl-γ-butyrolacton (Merck), 3,3-Dimethyl-2-hydroxy-γ-butyrolacton (Aldrich) und 2,5-Dihydro-5-methoxy-2-furanon (Merck), wobei ausdrücklich alle Stereoisomeren eingeschlossen sind.
  • Vorteilhafterweise verleihen diese Verbindungen den erfindungsgemässen Keratin-bindenden Effektormolekülen feuchtigkeitsspendende sowie hautberuhigende Eigenschaften.
    Vitamin B6, wobei man hierunter keine einheitliche Substanz, sondern die unter den Trivialnamen Pyridoxin, Pyridoxamin und Pyridoxal bekannten Derivate des 5 Hydroxymethyl-2-methylpyridin-3-ols versteht.
    Vitamin B7 (Biotin), auch als Vitamin H oder "Hautvitamin" bezeichnet. Bei Biotin handelt es sich um (3aS,4S,6aR)-2-Oxohexahydrothienol[3,4-d]imidazol-4-valeriansäure.
    Panthenol, Pantolacton, Nicotinsäureamid sowie Biotin sind erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt.
  • Erfindungsgemäß können geeignete Derivate (Salze, Ester, Zucker, Nukleotide, Nukleoside, Peptide und Lipide). Als lipophile, öllösliche Antioxidantien aus dieser Gruppe sind Tocopherol und dessen Derivate, Gallussäureester, Flavonoide und Carotinoide sowie Butylhydroxytoluol/anisol bevorzugt. Als wasserlösliche Antioxidantien sind Aminosäuren, z. B. Tyrosin und Cystein und deren Derivate sowie Gerbstoffe, insbesondere solche pflanzlichen Ursprungs bevorzugt.
    Triterpene, insbesondere Triterpensäuren wie Ursolsäure, Rosmarinsäure, Betulinsäure, Boswelliasäure und Bryonolsäure.
  • Weitere bevorzugte Effektormoleküle (ii) sind UV-Lichtschutzfilter. Darunter sind organische Substanzen zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, z.B. Wärme, wieder abzugeben. Die organischen Substanzen können öllöslich oder wasserlöslich sein.
  • Als öllösliche UV-B-Filter können z.B. folgende Substanzen verwendet werden:
    3-Benzylidencampher und dessen Derivate, z.B. 3-(4-Methylbenzyliden)campher;
    4-Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4-(Dimethylamino)-benzoesäureamylester;
    Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4 Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimtsäureisoamylester, 4 Methoxyzimtsäureisopentylester, 2-Cyano-3-phenyl-zimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene);
    Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4 isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester;
    Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon;
    Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester;
    Triazinderivate, wie z.B. 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1'-hexyloxy)-1,3,5-triazin (Octyltriazone) und Dioctyl Butamido Triazon (Uvasorb® HEB):
    Propan-1,3-dione, wie z.B. 1-(4-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion.
  • Als wasserlösliche Substanzen kommen in Frage:
    2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze;
    Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze;
    Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie z.B. 4-(2-Oxo-3-bornylidenmethyl)benzolsulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)sulfonsäure und deren Salze.
  • Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Estern der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäureisopentylester, 2-Cyano-3-phenyl-zimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene).
  • Des weiteren ist die Verwendung von Derivaten des Benzophenons, insbesondere 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon sowie der Einsatz von Propan-1,3-dionen, wie z.B. 1-(4-tert. Butylphenyl)-3-(4-'methoxyphenyl)propan-1,3-dion bevorzugt.
  • Als typische UV-A-Filter kommen in Frage:
    Derivate des Benzoylmethans, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion, 4-tert.-Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan oder 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan-1,3-dion;
    Amino-hydroxy-substituierte Derivate von Benzophenonen wie z.B. N,N-Diethylaminohydroxybenzoyl-n-hexylbenzoat.
  • Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden.
  • Als weitere Lichtschutzfilter können aber auch andere unlösliche Pigmente, z.B. feindisperse Metalloxide bzw. Salze wie beispielsweise Titandioxid, Eisenoxid, Aluminiumoxid, Ceroxid, Zirkoniumoxid, Silicate (Talk), Bariumsulfat und Zinkstearat verwendet werden. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen.
  • Neben den beiden vorgenannten Gruppen primärer Lichtschutzstoffe können auch sekundäre Lichtschutzmittel vom Typ der Antioxidantien eingesetzt werden, die die photochemische Reaktionskette unterbrechen, welche ausgelöst wird, wenn UV-Strahlung in die Haut eindringt. Typische Beispiele hierfür sind Superoxid-Dismutase, Catalase, Tocopherole (Vitamin E) und Ascorbinsäure (Vitamin C).
  • Eine weitere Gruppe sind Anti-irritantien, die eine entzündungshemmende Wirkung auf durch UV-Licht geschädigte Haut besitzten. Solche Stoffe sind beispielsweise Bisabolol, Phytol und Phytantriol.
  • Verknüpfung der Effektormoleküle (ii) mit der Keratin-bindenden Hydrophobin-Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i)
  • Die Effektormoleküle (ii) sind mit einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), die eine Bindungsaffinität zu einem Keratin besitzt, verbunden. Die Verbindung zwischen (i) und (ii) kann sowohl kovalent als auch auf ionische oder van-der Waals Wechselwirkungen beruhen (3).
  • Bevorzugt ist eine kovalente Verknüpfung. Dies kann beispielsweise über die Seitenketten der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) erfolgen, insbesondere über Aminofunktionen oder Carboxylatfunktionen oder Thiolfunktionen. Bevorzugt ist eine Verknüfung über die Aminofunktionen von einem oder mehreren Lysinresten, einer oder mehrerer Thiolgruppe von Cysteinresten oder über die N-terminale oder C-terminale Funktion des Hydrophobin-Polypeptids (i). Die Verknüpfung der Effektormoleküle (ii) mit der Hydrphobin-Polypeptidsequenz (i) kann entweder direkt, d.h. als kovalente Verknüpfung zweier in (i) und (ii) bereits vorhandener chemischer Funktionen erfolgen, beispielsweise eine Aminofunktion von (i) wird mit einer Carboxylatfunktion von (ii) zum Säureamid verknüpft. Die Verknüpfung kann aber auch über einen sogenannten Linker, d.h. einem mindestens bifunktionellen Molekül erfolgen, der mit einer Funktion mit (i) eine Bindung eingeht und mit einer anderen Funktion mit (ii) verknüpft wird.
  • Falls das Effektormolekül (ii) ebenfalls aus einer Polypeptidsequenz besteht, kann die Verknüpfung von (i) und (ii) durch ein sogenanntes Fusionsprotein erfolgen, d.h. eine durchgängige Polypeptidsequenz, die aus den beiden Teilsequenzen (i) und (ii) besteht.
  • Es können zwischen (i) und (ii) auch noch sogenannte Spacerelemente eingebaut werden, beispielsweise Polypeptidsequenzen, die eine potentielle Spaltstelle für eine Protease, Lipase, Esterase, Phosphatase, Hydrolase besitzen oder Polypeptidsequenzen, die eine leichte Aufreinigung des Fusionsproteins gestatten, beispielsweise sogenannte His-tags, d.h. Oligohistidinreste.
  • Die Verknüpfung im Falle eines nicht-proteinartigen Effektormoleküls mit der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) erfolgt bevorzugt durch funktionalisierbare Reste (Seitengruppen) am Hydrophobin-Polypeptid (i), die mit einer chemischen Funktion des Effektormoleküls eine kovalente Verbindung eingehen.
  • Bevorzugt ist hier die Bindungsknüpfung über eine Amino-, Thiol- oder Hydroxyfunktion des Hydrophobin-Polypeptids (i), die beispielsweise mit einer Carboxylfunktion des Effektormoleküls (ii), ggf. nach Aktivierung, eine entsprechende Amid-, Thioester oder Esterbindung eingehen können.
  • Eine weitere bevorzugte Verknüpfung der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) mit einem Effektormolekül (ii) ist die Verwendung eines massgeschneiderten Linkers. Ein solcher Linker hat zwei oder mehr sogenannte Ankergruppen mit denen er die Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) und ein oder mehrere Effektormoleküle (ii) verknüpfen kann. Beispielsweise kann eine Ankergruppe für (i) eine Thiolfunktion sein, mittels derer der Linker mit einem Cysteinrest des Polypeptids (i) eine Disulfidbindung eingehen kann. Eine Ankergruppe für (ii) kann beispielsweise eine Carboxylfunktion sein, mittels derer der Linker mit einer Hydroxylfunktion des Effektormoleküls (ii) eine Esterbindung eingehen kann.
  • Die Verwendung solcher massgeschneiderter Linker erlaubt die genaue Anpassung der Verknüpfung an das gewünschte Effektormolekül. Ausserdem ist es dadurch möglich, mehrere Effektormoleküle mit einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) definiert zu verknüpfen.
  • Der verwendete Linker richtet sich nach der zu koppelnden Funktionalität. Geeignet sind z.B. Moleküle, die zu Polypeptiden (i) koppeln mittels Sulfhydryl-reaktiven Gruppen, z.B. Maleimide, Pydridyldisulfide, α-Haloacetyle, Vinylsulfon und zu Effektormolekülen (ii) mittels
    • – Sulfhydryl-reaktiven Gruppen z.B. Maleimide, Pydridyldisulfide, α-Haloacetyle, Vinylsulfone) Amin-reaktive Gruppen (z.B. Succinimidylester, Carbodiimde, Hydroxymethyl- Phosphin, Imidoester, PFP-Ester etc.)
    • – Zucker bzw. oxidierte Zucker-reaktive Gruppen (z.B. Hydrazide etc.)
    • – Carboxy-reaktive Gruppen (z.B. Carbodiimide etc.)
    • – Hydroxyl-reaktive Gruppen (z.B. Isocyanate etc.)
    • – Thymin-reaktive Gruppen (z.B. Psoralen etc.)
    • – unselektive Gruppen (z.B. Arylazide etc.)
    • – photoaktivierbare Gruppen (z.B. Perfluorphenylazid etc.)
    • – Metallkomplexierenden Gruppen (z.B. EDTA, Hexahis, Ferritin)
    • – Antikörper und -fragmente (z.B. single-chain antibodies, F(ab)-Fragmente von Antikörpern, katalytische Antikörper).
  • Alternativ kann eine direkte Kopplung zwischen Wirk-/Effektstoff und der Keratin-Bindedomäne z.B. mittels Carbodiimiden, Glutardialdehyd oder anderen, dem Fachmann bekannten Crosslinkern durchgeführt werden.
  • Der Linker kann stabil, thermospaltbar, photospaltbar oder auch enzymatisch spaltbar sein (besonders durch Lipasen, Esterasen, Proteasen, Phosphatasen, Hydrolasen etc.). Entsprechende chemische Strukturen sind dem Fachmann bekannt und werden zwischen die Molekülteile (i) und (ii) integriert.
  • Beispiele für enzymatisch spaltbare Linker, die bei den erfindungsgemässen Molekülen eingesetzt werden können, sind beispielsweise in WO 98/01406 genannt, auf deren gesamten Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Die erfindungsgemässen Keratin-bindenden Hydrophobin-Effektormoleküle besitzen ein weites Anwendungsgebiet in der Humankosmetik, insbesondere der Haut- und Haarpflege, der Tierpflege.
  • Bevorzugt werden die erfindungsgemässen Keratin-bindenden Hydrophobin-Effektormoleküle für die Haut-, Nagel und Haarkosmetik angewendet. Sie erlauben eine hohe Konzentration und lange Wirkdauer von haut-, nagel- und haarpflegenden oder haut-, nagel-, und haarschützenden Effektorstoffen.
  • Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe für die Herstellung von haarkosmetischen oder hautkosmetischen Zubereitungen sind dem Fachmann geläufig und können aus Handbüchern der Kosmetik, beispielsweise Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1, entnommen werden.
  • Bei den erfindungsgemäßen kosmetischen Mitteln kann es sich um hautkosmetische, haarkosmetische, dermatologische, hygienische oder pharmazeutische Mittel handeln.
  • Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Mittel in Form eines Gels, Schaums, Sprays, einer Salbe, Creme, Emulsion, Suspension, Lotion, Milch oder Paste vor. Gewünschtenfalls können auch Liposomen oder Mikrosphären eingesetzt werden.
  • Die erfindungsgemäßen kosmetisch oder pharmazeutisch aktiven Mittel können zusätzlich kosmetisch und/oder dermatologisch aktive Wirkstoffe sowie Hilfsstoffe enthalten.
  • Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen kosmetischen Mittel wenigstens eine wie vorstehend definierte Hydrophobin Polypeptidsequenz (i), und wenigstens einen davon verschiedenen Bestandteil, der ausgewählt ist unter kosmetisch aktiven Wirkstoffen, Emulgatoren, Tensiden, Konservierungsmitteln, Parfümölen, Verdickern, Haarpolymeren, Haar- und Hautconditionern, Pfropfpolymeren, wasserlöslichen oder dispergierbaren silikonhaltigen Polymeren, Lichtschutzmitteln, Bleichmitteln, Gelbildnern, Pflegemitteln, Färbemitteln, Tönungsmitteln, Bräunungsmitteln, Farbstoffen, Pigmenten, Konsistenzgebern, Feuchthaltemitteln, Rückfettern, Collagen, Eiweißhydrolysaten, Lipiden, Antioxidantien, Entschäumern, Antistatika, Emollienzien und Weichmachern.
  • Übliche Verdickungsmittel in derartigen Formulierungen sind vernetzte Polyacrylsäuren und deren Derivate, Polysaccharide und deren Derivate, wie Xanthangum, Agar-Agar, Alginate oder Tylosen, Cellulosederivate, z.B. Carboxymethylcellulose oder Hydroxycarboxymethylcellulose, Fettalkohole, Monoglyceride und Fettsäuren, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Bevorzugt werden nichtionische Verdicker eingesetzt.
  • Geeignete kosmetisch und/oder dermatologisch aktive Wirkstoffe sind z.B. färbende Wirkstoffe, Haut- und Haarpigmentierungsmittel, Tönungsmittel, Bräunungsmittel, Bleichmittel, Keratin-härtende Stoffe, antimikrobielle Wirkstoffe, Lichtfilterwirkstoffe, Repellentwirkstoffe, hyperemisierend wirkende Stoffe, keratolytisch und keratoplastisch wirkende Stoffe, Antischuppenwirkstoffe, Antiphlogistika, keratinisierend wirkende Stoffe, antioxidativ bzw. als Radikalfänger aktive Wirkstoffe, hautbefeuchtende oder -feuchthaltende Stoffe, rückfettende Wirkstoffe, antierythimatös oder antiallergisch aktive Wirkstoffe und Mischungen davon.
  • Künstlich hautbräunende Wirkstoffe, die geeignet sind, die Haut ohne natürliche oder künstliche Bestrahlung mit UV-Strahlen zu bräunen, sind z.B. Dihydroxyaceton, Alloxan und Walnussschaienextrakt. Geeignete Keratin-härtende Stoffe sind in der Regel Wirkstoffe, wie sie auch in Antitranspirantien eingesetzt werden, wie z.B. Kaliumaluminiumsulfat, Aluminiumhydroxychlorid, Aluminiumlactat, etc.
  • Antimikrobielle Wirkstoffe werden eingesetzt, um Mikroorganismen zu zerstören bzw. ihr Wachstum zu hemmen und dienen somit sowohl als Konservierungsmittel als auch als desodorierend wirkender Stoff, welcher die Entstehung oder die Intensität von Körpergeruch vermindert. Dazu zählen z.B. übliche, dem Fachmann bekannte Konservierungsmittel, wie p-Hydroxybenzoesäureester, Imidazolidinyl-Harnstoff, Formaldehyd, Sorbinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, etc. Derartige desodorierend wirkende Stoffe sind z.B. Zinkricinoleat, Triclosan, Undecylensäurealkylolamide, Citronensäuretriethylester, Chlorhexidin etc.
  • Geeignete Lichtfilterwirkstoffe sind Stoffe, die UV-Strahlen im UV-B- und/oder UV-A-Bereich absorbieren. Geeignete UV-Filter sind z.B. 2,4,6-Triaryl-1,3,5-triazine, bei denen die Arylgruppen jeweils wenigstens einen Substituenten tragen können, der vorzugsweise ausgewählt ist unter Hydroxy, Alkoxy, speziell Methoxy, Alkoxycarbonyl, speziell Methoxycarbonyl und Ethoxycarbonyl und Mischungen davon. Geeignet sind weiterhin p-Aminobenzoesäureester, Zimtsäureester, Benzophenone, Campherderivate sowie UV-Strahlen abhaltende Pigmente, wie Titandioxid, Talkum und Zinkoxid.
  • Geeignete Repellentwirkstoffe sind Verbindungen, die in der Lage sind, bestimmte Tiere, insbesondere Insekten, vom Menschen abzuhalten oder zu vertreiben. Dazu gehört z.B. 2-Ethyl-1,3-hexandiol, N,N-Diethyl-m-toluamid etc. Geeignete hyperemisierend wirkende Stoffe, welche die Durchblutung der Haut anregen, sind z.B. ätherische Öle, wie Latschenkieferextrakt, Lavendelextrakt, Rosmarinextrakt, Wacholderbeerextrakt, Rosskastanienextrakt, Birkenblätterextrakt, Heublumenextrakt, Ethylacetat, Campher, Menthol, Pfefferminzöl, Rosmarinextrakt, Eukalyptusöl, etc. Geeignete keratolytisch und keratoplastisch wirkende Stoffe sind z.B. Salicylsäure, Kalziumthioglykolat, Thioglykolsäure und ihre Salze, Schwefel, etc. Geeignete Antischuppen-Wirkstoffe sind z.B. Schwefel, Schwefelpolyethylenglykolsorbitanmonooleat, Schwefelricinolpolyethoxylat, Zinkpyrithion, Aluminiumpyrithion, etc. Geeignete Antiphlogistika, die Hautreizungen entgegenwirken, sind z.B. Allantoin, Bisabolol, Dragosantol, Kamillenextrakt, Panthenol, etc.
  • Die erfindungsgemäßen kosmetischen Mittel können als kosmetischen und/oder pharmazeutischen Wirkstoff (wie auch gegebenenfalls als Hilfsstoff) wenigstens ein kosmetisch oder pharmazeutisch akzeptables Polymer enthalten, das sich von den Polymeren unterscheidet, die den erfindungsgemäß eingesetzten Polyelektrolytkomplex bilden. Dazu zählen ganz allgemein kationische, amphotere und neutrale Polymere.
  • Geeignete Polymere sind z.B. kationische Polymere mit der Bezeichnung Polyquaternium nach INCI, z.B. Copolymere aus Vinylpyrrolidon/N-Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat FC, Luviquat HM, Luviquat MS, Luviquat&commat, Care), Copolymere aus N-Vinylpyrrolidon/Dimethylaminoethylmethacrylat, quaternisiert mit Diethylsulfat (Luviquat PQ 11), Copolymere aus N-Vinylcaprolactam/N-Vinylpyrrolidon/N-Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat E Hold), kationische Cellulosederivate (Polyquaternium-4 und -10), Acrylamidocopolymere (Polyquaternium-7) und Chitosan.
  • Geeignete kationische (quaternisierte) Polymere sind auch Merquat (Polymer auf Basis von Dimethyldiallylammoniumchlorid), Gafquat (quaternäre Polymere, die durch Reaktion von Polyvinylpyrrolidon mit quaternären Ammoniumverbindungen entstehen), Polymer JR (Hydroxyethylcellulose mit kationischen Gruppen) und kationische Polymere auf pflanzlicher Basis, z.B. Guarpolymere, wie die Jaguar-Marken der Firma Rhodia.
  • Weitere geeignete Polymere sind auch neutrale Polymere, wie Polyvinylpyrrolidone, Copolymere aus N-Vinylpyrrolidon und Vinylacetat und/oder Vinylpropionat, Polysiloxane, Polyvinylcaprolactam und andere Copolymere mit N-Vinylpyrrolidon, Polyethylenimine und deren Salze, Polyvinylamine und deren Salze, Cellulosederivate, Polyasparaginsäuresalze und Derivate. Dazu zählt beispielsweise Luviflex 0 Swing (teilverseiftes Copolymerisat von Polyvinylacetat und Polyethylenglykol, Firma BASF).
  • Geeignete Polymere sind auch nichtionische, wasserlösliche bzw. wasserdispergierbare Polymere oder Oligomere, wie Polyvinylcaprolactam, z.B. Luviskol 0 Plus (BASF), oder Polyvinylpyrrolidon und deren Copolymere, insbesondere mit Vinylestern, wie Vinylacetat, z.B. Luviskol 0 VA 37 (BASF), Polyamide, z.B. auf Basis von Itaconsäure und aliphatischen Diaminen, wie sie z.B. in der DE-A-43 33 238 beschrieben sind.
  • Geeignete Polymere sind auch amphotere oder zwitterionische Polymere, wie die unter den Bezeichnungen Amphomer (National Starch) erhältlichen Octylacrylamid/Methylmethacrylat/tert.-Butylaminoethylmethacrylat-Hydroxypropylmethacrylat-Copolymere sowie zwitterionische Polymere, wie sie beispielsweise in den deutschen Patentanmeldungen DE 39 29 973 , DE 21 50 557 , DE 28 17 369 und DE 3708 451 offenbart sind. Acrylamidopropyltrimethylammoniumchlorid/Acrylsäure- bzw. -Methacrylsäure-Copolymerisate und deren Alkali- und Ammoniumsalze sind bevorzugte zwitterionische Polymere. Weiterhin geeignete zwitterionische Polymere sind Methacroylethylbetain/Methacrylat-Copolymere, die unter der Bezeichnung Amersette (AMERCHOL) im Handel erhältlich sind, und Copolymere aus Hydroxyethylmethacrylat, Methylmethacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat und Acrylsäure (Jordapon (D)).
  • Geeignete Polymere sind auch nichtionische, siloxanhaltige, wasserlösliche oder -dispergierbare Polymere, z.B. Polyethersiloxane, wie Tegopren 0 (Firma Goldschmidt) oder Besi&commat (Firma Wacker).
  • Die Formulierungsgrundlage erfindungsgemäßer pharmazeutischer Mittel enthält bevorzugt pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe. Pharmazeutisch akzeptabel sind die im Bereich der Pharmazie, der Lebensmitteltechnologie und angrenzenden Gebieten bekanntermassen verwendbaren Hilfsstoffe, insbesondere die in einschlägigen Arzneibüchern (z.B. DAB Ph. Eur. BP NF) gelisteten sowie andere Hilfsstoffe, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.
  • Geeignete Hilfsstoffe können sein: Gleitmittel, Netzmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, konservierende Mittel, Antioxidantien, Antireizstoffe, Chelatbildner, Emulsionsstabilisatoren, Filmbildner, Gelbildner, Geruchsmaskierungsmittel, Harze, Hydrokolloide, Lösemittel, Lösungsvermittler, Neutralisierungsmittel, Permeationsbeschleuniger, Pigmente, quaternäre Ammoniumverbindungen, Rückfettungs- und Überfettungsmittel, Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe, Siliconderivate, Stabilisatoren, Sterilantien, Treibmittel, Trocknungsmittel, Trübungsmittel, Verdickungsmittel, Wachse, Weichmacher, Weissöl. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie sie beispielsweise in Fiedler, H. P. Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Aufl., Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt sind.
  • Zur Herstellung der erfindungsgemäßen dermatologischen Mittel können die Wirkstoffe mit einem geeigneten Hilfsstoff (Exzipient) vermischt oder verdünnt werden. Exzipienten können feste, halb feste oder flüssige Materialien sein, die als Vehikel, Träger oder Medium für den Wirkstoff dienen können. Die Zumischung weiterer Hilfsstoffe erfolgt gewünschtenfalls in der dem Fachmann bekannten Weise. Weiterhin sind die Polyme re und Dispersionen geeignet als Hilfsmittel in der Pharmazie, bevorzugt als oder in Beschichtungsmittel(n) oder Bindemittel(n) für feste Arzneiformen. Sie können auch in Cremes und als Tablettenüberzugsmittel und Tablettenbindemittel verwendet werden.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Mitteln um ein Hautreinigungsmittel.
  • Bevorzugte Hautreinigungsmittel sind Seifen von flüssiger bis gelförmiger Konsistenz, wie Transparentseifen, Luxusseifen, Deoseifen, Cremeseifen, Babyseifen, Hautschutzseifen, Abrasiveseifen und Syndets, pasteuse Seifen, Schmierseifen und Waschpasten, flüssige Wasch-, Dusch- und Badepräparate, wie Waschlotionen, Duschbäder und -gele, Schaumbäder, Ölbäder und Scrub-Präparate, Rasierschäume, -lotionen und -cremes.
  • Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Mitteln um kosmetische Mittel zur Pflege und zum Schutz der Haut, Nagelpflegemittel oder Zubereitungen für die dekorative Kosmetik.
  • Geeignete hautkosmetische Mittel sind z.B. Gesichtswässer, Gesichtsmasken, Deodorantien und andere kosmetische Lotionen. Mittel für die Verwendung in der dekorativen Kosmetik umfassen beispielsweise Abdeckstifte, Theaterfarben, Mascara und Lidschatten, Lippenstifte, Kajalstifte, Eyeliner, Rouges, Puder und Augenbrauenstifte.
  • Ausserdem können die Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) verwendet werden in Nose-Strips zur Porenreinigung, in Antiaknemitteln, Repellents, Rasiermitteln, Haarentfernungsmitteln, Intimpflegemitteln, Fusspflegemitteln sowie in der Babypflege.
  • Bei den erfindungsgemäßen Hautpflegemitteln handelt es sich insbesondere um W/O- oder O/W-Hautcremes, Tag- und Nachtcremes, Augencremes, Gesichtscremes, Antifaltencremes, Feuchthaltecremes, Bleichcremes, Vitamincremes, Hautlotionen, Pflegelotionen und Feuchthaltelotionen.
  • Hautkosmetische und dermatologische Mittel auf Basis der zuvor beschriebenen Polyelektrolytkomplexe zeigen vorteilhafte Wirkungen. Die Polymere können unter anderem zur Feuchthaltung und Konditionierung der Haut und zur Verbesserung des Hautgefühls beitragen. Die Polymere können auch als Verdicker in den Formulierungen wirken. Durch Zusatz der erfindungsgemäßen Polymere kann in bestimmten Formulierun gen eine erhebliche Verbesserung der Hautverträglichkeit erreicht werden.
  • Hautkosmetische und dermatologische Mittel enthalten vorzugsweise wenigstens eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in einem Anteil von etwa 0,000001 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,0001 bis 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels.
  • Besonders Lichtschutzmittel auf Basis der Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) besitzen die Eigenschaft, die Verweilzeit der UV-absorbierenden Inhaltsstoffe im Vergleich zu gängigen Hilfsmitteln wie Polyvinylpyrrolidon zu erhöhen.
  • Je nach Anwendungsgebiet können die erfindungsgemäßen Mittel in einer zur Hautpflege geeigneten Form, wie z.B. als Creme, Schaum, Gel, Stift, Mousse, Milch, Spray (Pumpspray oder treibmittelhaltiger Spray) oder Lotion appliziert werden.
  • Die hautkosmetischen Zubereitungen können neben den Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) und geeigneten Trägern noch weitere in der Hautkosmetik übliche Wirkstoffe und Hilfsstoffe, wie zuvor beschrieben, enthalten. Dazu zählen vorzugsweise Emulgatoren, Konservierungsmittel, Parfümöle, kosmetische Wirkstoffe wie Phytantriol, Vitamin A, E und C, Retinol, Bisabolol, Panthenol, Lichtschutzmittel, Bleichmittel, Färbemittel, Tönungsmittel, Bräunungsmittel, Collagen, Eiweisshydrolysate, Stabilisatoren, pH-Wert-Regulatoren, Farbstoffe, Salze, Verdicker, Gelbildner, Konsistenzgeber, Silicone, Feuchthaltemittel, Rückfetter und weitere übliche Additive.
  • Bevorzugte Öl- und Fettkomponenten der hautkosmetischen und dermatologischen Mittel sind die zuvor genannten mineralischen und synthetischen Öle, wie z.B. Paraffine, Siliconöle und aliphatische Kohlenwasserstoffe mit mehr als 8 Kohlenstoffatomen, tierische und pflanzliche Öle, wie z.B. Sonnenblumenöl, Kokosöl, Avocadoöl, Olivenöl, Lanolin, oder Wachse, Fettsäuren, Fettsäureester, wie z.B. Triglyceride von C6-C30-Fettsäuren, Wachsester, wie z.B. Jojobaöl, Fettalkohole, Vaseline, hydriertes Lanolin und acetyliertes Lanolin sowie Mischungen davon.
  • Man kann die erfindungsgemäßen Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) auch mit herkömmlichen Polymeren abmischen, falls spezielle Eigenschaften eingestellt werden sollen.
  • Zur Einstellung bestimmter Eigenschaften wie z.B. Verbesserung des Anfassgefühls, des Spreitverhaltens, der Wasserresistenz und/oder der Bindung von Wirk- und Hilfs stoffen, wie Pigmenten, können die hautkosmetischen und dermatologischen Zubereitungen zusätzlich auch konditionierende Substanzen auf Basis von Siliconverbindungen enthalten.
  • Geeignete Siliconverbindungen sind beispielsweise Polyalkylsiloxane, Polyarylsiloxane, Polyarylalkylsiloxane, Polyethersiloxane oder Siliconharze.
  • Die Herstellung der kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen erfolgt nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren.
  • Bevorzugt liegen die kosmetischen und dermatologischen Mittel in Form von Emulsionen insbesondere als Wasser-in-Öl (W/O)- oder Öl-in-Wasser (O/W)-Emulsionen vor.
  • Es ist aber auch möglich, andere Formulierungsarten zu wählen, beispielsweise Hydrodispersionen, Gele, Öle, Oleogele, multiple Emulsionen, beispielsweise in Form von W/O/W- oder O/W/O-Emulsionen, wasserfreie Salben bzw. Salbengrundlagen, usw.
  • Die Herstellung von Emulsionen erfolgt nach bekannten Methoden. Die Emulsionen enthalten neben wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in der Regel übliche Bestandteile, wie Fettalkohole, Fettsäureester und insbesondere Fettsäuretriglyceride, Fettsäuren, Lanolin und Derivate davon, natürliche oder synthetische Öle oder Wachse und Emulgatoren in Anwesenheit von Wasser. Die Auswahl der Emulsionstyp-spezifischen Zusätze und die Herstellung geeigneter Emulsionen ist beispielsweise beschrieben in Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Buch Verlag, Heidelberg, 2. Auflage, 1989, dritter Teil, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Eine geeignete Emulsion, z.B. für eine Hautcreme etc., enthält im Allgemeinen eine wässrige Phase, die mittels eines geeigneten Emutgatorsystems in einer Öl- oder Fettphase emulgiert ist. Zur Bereitstellung der wässrigen Phase kann ein Polyelektrolytkomplex eingesetzt werden.
  • Bevorzugte Fettkomponenten, welche in der Fettphase der Emulsionen enthalten sein können, sind: Kohlenwasserstofföle, wie Paraffinöl, Purcellinöl, Perhydrosqualen und Lösungen mikrokristalliner Wachse in diesen Ölen; tierische oder pflanzliche Öle, wie Süssmandelöl, Avocadoöl, Calophylumöl, Lanolin und Derivate davon, Ricinusöl, Sesamöl, Olivenöl, Jojobaöl, Karite-Öl, Hoplostethus-Öl, mineralische Öle, deren Destilla tionsbeginn unter Atmosphärendruck bei ca. 250 °C und deren Destillationsendpunkt bei 410 °C liegt, wie z.B. Vaselinöl, Ester gesättigter oder ungesättigter Fettsäuren, wie Alkylmyristate, z.B. i-Propyl-, Butyl- oder Cetylmyristat, Hexadecylstearat, Ethyl- oder i-Propylpalmitat, Octan- oder Decansäuretriglyceride und Cetylricinoleat.
  • Die Fettphase kann auch in anderen Ölen lösliche Siliconöle, wie Dimethylpolysiloxan, Methylphenylpolysiloxan und das Siliconglykol-Copolymer, Fettsäuren und Fettalkohole enthalten.
  • Neben den Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) können auch Wachse verwendet werden, wie z.B. Carnaubawachs, Candilillawachs, Bienenwachs, mikrokristallines Wachs, Ozokeritwachs und Ca-, Mg- und Al-Oleate, -Myristate, -Linoleate und -Stearate.
  • Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Emulsion als O/W-Emulsion vorliegen. Eine derartige Emulsion enthält üblicherweise eine Ölphase, Emulgatoren, die die Ölphase in der Wasserphase stabilisieren, und eine wässrige Phase, die üblicherweise verdickt vorliegt. Als Emulgatoren kommen vorzugsweise O/W-Emulgatoren, wie Polyglycerinester, Sorbitanester oder teilveresterte Glyceride, in Betracht.
  • Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Mitteln um ein Duschgel, eine Shampoo-Formulierung oder ein Badepräparat.
  • Solche Formulierungen enthalten wenigstens eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) sowie üblicherweise anionische Tenside als Basistenside und amphotere und/oder nichtionische Tenside als Cotenside. Weitere geeignete Wirkstoffe und/oder Hilfsstoffe sind im allgemeinen ausgewählt unter Lipiden, Parfümölen, Farbstoffen, organischen Säuren, Konservierungsstoffen und Antioxidantien sowie Verdickern/Gelbildnern, Hautkonditioniermitteln und Feuchthaltemitteln.
  • Diese Formulierungen enthalten vorzugsweise 2 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 30 Gew.-% Tenside, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.
  • In den Wasch-, Dusch- und Badepräparaten können alle in Körperreinigungsmitteln üblicherweise eingesetzten anionische, neutrale, amphotere oder kationische Tenside verwendet werden.
  • Geeignete anionische Tenside sind beispielsweise Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N-Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisothionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Triethanolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletherphosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid- oder Propylenoxideinheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxideinheiten im Molekül aufweisen.
  • Dazu zählen z.B. Natriumlaurylsulfat, Ammoniumtaurytsulfat, Natriumlaurylethersulfat, Ammoniumlaurylethersulfat, Natriumlaurylsarkosinat, Natriumoleylsuccinat, Ammoniumlaurylsulfosuccinat, Natriumdodecylbenzolsulfonat, Triethanolamindodecylbenzolsulfonat.
  • Geeignete amphotere Tenside sind z.B. Alkylbetaine, Alkylamidopropylbetaine, Alkylsulfobetaine, Alkylglycinate, Alkylcarboxyglycinate, Alkylamphoacetate oder -propionate, Alkylamphodiacetate oder -dipropionate.
  • Beispielsweise können Cocodimethylsulfopropylbetain, Laurylbetain, Cocamidopropylbetain oder Natriumcocamphopropionat eingesetzt werden.
  • Als nichtionische Tenside sind beispielsweise geeignet die Umsetzungsprodukte von aliphatischen Alkoholen oder Alkylphenolen mit 6 bis 20 C-Atomen in der Alkylkette, die linear oder verzweigt sein kann, mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid. Die Menge Alkylenoxid beträgt ca. 6 bis 60 Mole auf ein Mol Alkohol. Ferner sind Alkylaminoxide, Mono- oder Dialkylalkanolamide, Fettsäureester von Polyethylenglykolen, ethoxylierte Fettsäureamide, Alkylpolyglycoside oder Sorbitanetherester geeignet.
  • Ausserdem können die Wasch-, Dusch- und Badepräparate übliche kationische Tenside enthalten, wie z.B. quaternäre Ammoniumverbindungen, beispielsweise Cetyltrimethylammoniumchlorid.
  • Weiterhin können die Duschgel-/Shampoo-Formulierungen Verdicker, wie z.B. Kochsalz, PEG-55, Propylenglykol-Oleat, PEG-120-Methylglucosedioleat und andere, sowie Konservierungsmittel, weitere Wirk- und Hilfsstoffe und Wasser enthalten.
  • Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Mitteln um ein Haarbehandlungsmittel.
  • Erfindungsgemäße Haarbehandlungsmittel enthalten vorzugsweise wenigstens eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in einer Menge im Bereich von etwa 0,000001 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,00001 bis 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels.
  • Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Haarbehandlungsmittel in Form eines Schaumfestigers, Haarmousses, Haargels, Shampoos, Haarsprays, Haarschaums, Spitzenfluids, Egalisierungsmittels für Dauerwellen, Haarfärbe- und -bleichmittels oder "Hot-Oil-Treatments" vor. Je nach Anwendungsgebiet können die haarkosmetischen Zubereitungen als (Aerosol-) Spray, (Aerosol-) Schaum, Gel, Gelspray, Creme, Lotion oder Wachs appliziert werden. Haarsprays umfassen dabei sowohl Aerosolsprays als auch Pumpsprays ohne Treibgas. Haarschäume umfassen sowohl Aerosolschäume wie auch Pumpschäume ohne Treibgas. Haarsprays und Haarschäume umfassen vorzugsweise überwiegend oder ausschliesslich wasserlösliche oder wasserdispergierbare Komponenten. Sind die in den erfindungsgemäßen Haarsprays und Haarschäumen eingesetzten Verbindungen wasserdispergierbar, können sie in Form von wässrigen Mikrodispersionen mit Teilchendurchmessern von üblicherweise 1 bis 350 nm, bevorzugt 1 bis 250 nm, zur Anwendung gebracht werden. Die Feststoffgehalte dieser Präparate liegen dabei üblicherweise in einem Bereich von etwa 0,5 bis 20 Gew.-%. Diese Mikrodispersionen benötigen in der Regel keine Emulgatoren oder Tenside zu ihrer Stabilisierung.
  • Die erfindungsgemäßen haarkosmetischen Formulierungen enthalten in einer bevorzugten Ausführungsform a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 20 bis 99,95 Gew.-% Wasser und/oder Alkohol, c) 0 bis 50 Gew.-% wenigstens eines Treibgases, d) 0 bis 5 Gew.-% wenigstens eines Emulgators, e) 0 bis 3 Gew.-% wenigstens eines Verdickers, sowie bis zu 25 Gew.-% weitere Bestandteile.
  • Unter Alkohol sind alle in der Kosmetik üblichen Alkohole zu verstehen, z.B. Ethanol, Isopropanol, n-Propanol.
  • Unter weiteren Bestandteilen sind die in der Kosmetik üblichen Zusätze zu verstehen, beispielsweise Treibmittel, Entschäumer, grenzflächenaktive Verbindungen, d.h. Ten side, Emulgatoren, Schaumbildner und Solubilisatoren. Die eingesetzten grenzflächenaktiven Verbindungen können anionisch, kationisch, amphoter oder neutral sein. Weitere übliche Bestandteile können ferner sein z.B. Konservierungsmittel, Parfümöle, Trübungsmittel, Wirkstoffe, UV-Filter, Pflegestoffe wie Panthenol, Collagen, Vitamine, Eiweisshydrolysate, Alpha- und Beta-Hydroxycarbonsäuren, Stabilisatoren, pH-Wert-Regulatoren, Farbstoffe, Viskositätsregulierer, Gelbildner, Salze, Feuchthaltemittel, Rückfetter, Komplexbildner und weitere übliche Additive.
  • Weiterhin zählen hierzu alle in der Kosmetik bekannten Styling- und Conditioner-Polymere, die in Kombination mit den erfindungsgemäßen Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) eingesetzt werden können, falls ganz spezielle Eigenschaften eingestellt werden sollen.
  • Als herkömmliche Haarkosmetik-Polymere eignen sich beispielsweise die zuvor genannten kationischen, anionischen, neutralen, nichtionischen und amphoteren Polymere, auf die hier Bezug genommen wird.
  • Zur Einstellung bestimmter Eigenschaften können die Zubereitungen zusätzlich auch konditionierende Substanzen auf Basis von Silikonverbindungen enthalten. Geeignete Silikonverbindungen sind beispielsweise Polyalkylsiloxane, Polyarylsiloxane, Polyanlalkylsiloxane, Polyethersiloxane, Silikonharze oder Dimethicon Copolyole (CTFA) und aminofunktionelle Silikonverbindungen wie Amodimethicone (CTFA).
  • Die erfindungsgemäßen Polymerisate eignen sich insbesondere als Festigungsmittel in Haarstyling-Zubereitungen, insbesondere Haarsprays (Aerosolsprays und Pumpsprays ohne Treibgas) und Haarschäume (Aerosolschäume und Pumpschäume ohne Treibgas).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten Spray-Zubereitungen a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 90 bis 99,9 Gew.-% Wasser und/oder Alkohol, c) 0 bis 70 Gew.-% wenigstens eines Treibmittel, d) 0 bis 20 Gew.-% weitere Bestandteile.
  • Treibmittel sind die für Haarsprays oder Aerosolschäume üblich verwendeten Treibmittel. Bevorzugt sind Gemische aus Propan/Butan, Pentan, Dimethylether, 1,1-Difluorethan (HFC-152 a), Kohlendioxid, Stickstoff oder Druckluft.
  • Eine erfindungsgemäß bevorzugte Formulierung für Aerosolhaarschäume enthält a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 90 bis 99,9 Gew.-% Wasser und/oder Alkohol, c) 5 bis 20 Gew.-% eines Treibmittel, d) 0,1 bis 5 Gew.-% eines Emulgators, e) 0 bis 10 Gew.-% weitere Bestandteile.
  • Als Emulgatoren können alle in Haarschäumen üblicherweise eingesetzten Emulgatoren verwendet werden. Geeignete Emulgatoren können nichtionisch, kationisch bzw. anionisch oder amphoter sein.
  • Beispiele für nichtionische Emulgatoren (INCI-Nomenklatur) sind Laurethe, z.B. Laureth-4; Cetethe, z.B. Cetheth-1, Polyethylenglycolcetylether, Cetearethe, z.B. Cetheareth-25, Polyglycolfettsäureglyceride, hydroxyliertes Lecithin, Lactylester von Fettsäuren, Alkylpolyglycoside.
  • Beispiele für kationische Emulgatoren sind Cetyldimethyl-2-hydroxyethylammoniumdihydrogenphosphat, Cetyltrimoniumchlorid, Cetyltrimmoniumbromid, Cocotrimoniummethylsulfat, Quaternium-1 bis x (INCI).
  • Anionische Emulgatoren können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe der Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N-Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisethionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Triethanolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletherphosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid oder Propylenoxid-Einheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxid-Einheiten im Molekül aufweisen.
  • Eine erfindungsgemäß für Styling-Gele geeignete Zubereitung kann beispielsweise wie folgt zusammengesetzt sein: a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens eines Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 80 bis 99,85 Gew.-% Wasser und/oder Alkohol, c) 0 bis 3 Gew.-%, bevorzugt 0,05 bis 2 Gew.-%, eines Gelbildners, d) 0 bis 20 Gew.-% weitere Bestandteile.
  • Im allgemeinen wirken die erfindungsgemäß eingesetzten Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) bereits "selbstverdickend", so dass in vielen Fällen bei der Herstellung von Gelen auf den Einsatz von Gelbildnern verzichtet werden kann. Ihr Einsatz kann jedoch von Vorteil sein, um spezielle rheologische oder andere anwen dungstechnische Eigenschaften der Gele einzustellen. Als Gelbildner können alle in der Kosmetik üblichen Gelbildner eingesetzt werden. Hierzu zählen leicht vernetzte Polyacrylsäure, beispielsweise Carbomer (INCI), Cellulosederivate, z.B. Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulose, kationisch modifizierte Cellulosen, Polysaccharide, z.B. Xanthangummi, Capryl/Caprin-Triglycerid, Natriumacrylat-Copolymere, Polyquaternium-32 (und) Paraffinum Liquidum (INCI), Natriumacrylat-Copolymere (und) Paraffinum Liquidum (und) PPG-1 Trideceth-6, Acrylamidopropyltrimoniumchlorid/Acrylamid-Copolymere, Steareth-10-Allylether, Acrylat-Copolymere, Polyquaternium-37 (und) Paraffinum Liquidum (und) PPG-1 Trideceth-6, Polyquaternium 37 (und) Propylenglycoldicapratdicaprylat (und) PPG-1 Trideceth-6, Polyquaternium-7, Polyquaternium-44.
  • Die erfindungsgemäßen Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) können in kosmetischen Zubereitungen als Konditioniermittel eingesetzt werden.
  • Eine die erfindungsgemäßen Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) enthaltende Zubereitung kann bevorzugt in Shampooformulierungen als Festigungs- und/oder Konditioniermittel eingesetzt werden. Bevorzugte Shampooformulierungen enthalten a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 25 bis 94,95 Gew.-% Wasser, c) 5 bis 50 Gew.-% Tenside, c) 0 bis 5 Gew.-% eines weiteren Konditioniermittels, d) 0 bis 10 Gew.-% weitere kosmetische Bestandteile.
  • In den Shampooformulierungen können alle in Shampoos üblicherweise eingesetzte anionische, neutrale, amphotere oder kationische Tenside verwendet werden.
  • Geeignete anionische Tenside sind beispielsweise Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N-Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisothionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Triethanolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletherphosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid- oder Propylenoxid-Einheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxid-Einheiten im Molekül aufweisen.
  • Geeignet sind zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, Ammoniumlaurysulfat, Natriumlaurylethersulfat, Ammoniumlaurylethersulfat, Natriumlauroylsarkosinat, Natriumoleylsuccinat, Ammoniumlaurylsulfosuccinat, Natriumdodecylbenzolsulfonat, Triethanolamindodecylbenzolsulfonat.
  • Geeignete amphotere Tenside sind zum Beispiel Alkylbetaine, Alkylamidopropylbetaine, Alkylsulfobetaine, Alkylglycinate, Alkylcarboxyglycinate, Alkylamphoacetate oder -propionate, Alkylamphodiacetate oder -dipropionate.
  • Beispielsweise können Cocodimethylsulfopropylbetain, Laurylbetain, Cocamidopropylbetain oder Natriumcocamphopropionat eingesetzt werden.
  • Als nichtionische Tenside sind beispielsweise geeignet die Umsetzungsprodukte von aliphatischen Alkoholen oder Alkylphenolen mit 6 bis 20 C-Atomen in der Alkylkette, die linear oder verzweigt sein kann, mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid. Die Menge Alkylenoxid beträgt ca. 6 bis 60 Mole auf ein Mol Alkohol. Ferner sind Alkylaminoxide, Mono- oder Dialkylalkanolamide, Fettsäureester von Polyethylenglykolen, Alkylpolyglykoside oder Sorbitanetherester geeignet.
  • Ausserdem können die Shampooformulierungen übliche kationische Tenside enthalten, wie z.B. quaternäre Ammoniumverbindungen, beispielsweise Cetyltrimethylammoniumchlorid.
  • In den Shampooformulierungen können zur Erzielung bestimmter Effekte übliche Konditioniermittel in Kombination mit den Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) eingesetzt werden.
  • Hierzu zählen beispielsweise die zuvor genannten kationischen Polymere mit der Bezeichnung Polyquaternium nach INCI, insbesondere Copolymere aus Vinylpyrrolidon/N-Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat FC, Luviquat&commat, HM, Luviquat MS, Luviquat Care), Copolymere aus N-Vinylpyrrolidon/Dimethylaminoethylmethacrylat, quaternisiert mit Diethylsulfat (Luviquat D PQ 11), Copolymere aus N-Vinylcaprolactam/N-Vinylpyrrolidon/N-Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat D Hold), kationische Cellulosederivate (Polyquaternium-4 und -10), Acrylamidcopolymere (Polyquaternium-7). Ferner können Eiweißhydrolysate verwendet werden, sowie konditionierende Substanzen auf Basis von Silikonverbindungen, beispielsweise Polyalkylsiloxane, Polyarylsiloxane, Polyarylalkylsiloxane, Polyethersiloxane oder Silikonharze. Weitere geeignete Silikonverbindungen sind Dimethicon Copolyole (CTFA) und aminofunktionelle Silikonverbindungen wie Amodimethicone (CTFA). Ferner können kationische Guarderivate wie Guarhydroxypropyltrimoniumchlorid (INCI) verwendet werden.
  • Nach einer weiteren Ausführungsform dient diese haarkosmetische oder hautkosmetische Zubereitung der Pflege oder dem Schutz der Haut oder Haars und liegt in Form einer Emulsion, einer Dispersion, einer Suspension, einer wässrigen Tensidzubereitung, einer Milch, einer Lotion, einer Creme, eines Balsams, einer Salbe, eines Gels, eines Granulats, eines Puders, eines Stiftpräparates, wie z.B. eines Lippenstifts, eines Schaums, eines Aerosols oder eines Sprays vor. Solche Formulierungen sind gut geeignet für topische Zubereitungen. Als Emulsionen kommen Öl-in-Wasser-Emulsionen und Wasser-in-Öl-Emulsionen oder Mikroemulsionen in Frage.
  • Im Regelfall wird die haarkosmetische oder hautkosmetische Zubereitung zur Applikation auf der Haut (topisch) oder Haar verwendet. Unter topischen Zubereitungen sind dabei solche Zubereitungen zu verstehen, die dazu geeignet sind, die Wirkstoffe in feiner Verteilung und bevorzugt in einer durch die Haut resorbierbaren Form auf die Haut aufzubringen. Hierfür eignen sich z.B. wässrige und wässrig-alkoholische Lösungen, Sprays, Schäume, Schaumaerosole, Salben, wässrige Gele, Emulsionen vom O/W- oder W/O-Typ, Mikroemulsionen oder kosmetische Stiftpräparate.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen kosmetischen Mittels enthält das Mittel einen Träger. Bevorzugt als Träger ist Wasser, ein Gas, eine Wasser-basierte Flüssigkeit, ein Öl, ein Gel, eine Emulsion oder Mikroemulsion, eine Dispersion oder eine Mischung davon. Die genannten Träger zeigen eine gute Hautverträglichkeit. Besonders vorteilhaft für topische Zubereitungen sind wässrige Gele, Emulsionen oder Mikroemulsionen.
  • Als Emulgatoren können nichtionogene Tenside, zwitterionische Tenside, ampholytische Tenside oder anionische Emulgatoren verwendet werden. Die Emulgatoren können in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Mengen von 0,1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung, enthalten sein.
  • Als nichtionogenes Tensid kann beispielsweise ein Tensid aus mindestens einer der folgenden Gruppen verwendet werden:
    Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid und/oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen, an Fettsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen und an Alkylphenole mit 8 bis 15 C-Atomen in der Alkylgruppe;
    C12/18-Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von 1 bis 30 Mol Ethylenoxid an Glycerin;
    Glycerinmono- und -diester und Sorbitanmono- und -diester von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen und deren Ethylenoxidanlagerungsprodukte;
    Alkylmono- und -oligoglycoside mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alkylrest und deren ethoxylierte Analoga;
    Anlagerungsprodukte von 15 bis 60 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
    Polyol- und insbesondere Polyglycerinester, wie z.B. Polyglycerinpolyricinoleat, Polygl ycerinpoly-12-hydroxystearat oder Polyglycerindimerat. Ebenfalls geeignet sind Gemische von Verbindungen aus mehreren dieser Substanzklassen;
    Anlagerungsprodukte von 2 bis 15 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
    Partialester auf Basis linearer, verzweigter, ungesättigter bzw. gesättigter C6-22-Fettsäuren, Ricinolsäure sowie 12-Hydroxystearinsäure und Glycerin, Polyglycerin, Pentaerythrit, Dipenta-erythrit, Zuckeralkohole (z. B. Sorbit), Alkylglucoside (z.B. Methylglucosid, Butylglucosid, Lauryl-glucosid) sowie Polyglucoside (z.B. Cellulose);
    Mono-, Di- und Trialkylphosphate sowie Mono-, Di- und/oder Tri-PEG-alkylphosphate und deren Salze;
    Wollwachsalkohole;
    Polysiloxan-Polyalkyl-Polyether-Copolymere bzw. entsprechende Derivate;
    Mischester aus Pentaerythrit, Fettsäuren, Citronensäure und Fettalkohol gemäß DE PS 1165574 und/oder Mischester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, Methylglucose und Polyolen, vorzugsweise Glycerin oder Polyglycerin sowie Polyalkylenglycole und Betaine.
  • Weiterhin können als Emulgatoren zwitterionische Tenside verwendet werden. Als zwitterionische Tenside werden solche oberflächenaktiven Verbindungen bezeichnet, die im Molekül mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe und mindestens eine Car boxylat- oder eine Sulfonatgruppe tragen. Besonders geeignete zwitterionische Tenside sind die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosalkyldimethyl-ammoniumglycinat, N-Acylamino-propyl-N,N dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacylaminopropyldimethylammonium-glycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethylimidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydroxyethyl-carboxymethylglycinat. Besonders bevorzugt ist das unter der CTFA Bezeichnung Cocamidopropyl Betaine bekannte Fettsäureamid-Derivat.
  • Ebenfalls geeignete Emulgatoren sind ampholytische Tenside. Unter ampholytischen Tensiden werden solche oberflächenaktiven Verbindungen verstanden, die außer einer C8,18-Alkyl- oder -Acylgruppe im Molekül mindestens eine freie Aminogruppe und mindestens eine -COOH- oder -SO3H-Gruppe enthalten und zur Ausbildung innerer Salze befähigt sind. Beispiele für geeignete ampholytische Tenside sind N-Alkylglycine, N-Alkylpropionsäuren, N-Alkylamino-buttersäuren, N Alkyliminodipropionsäuren, N-Hydroxyethyl-N-alkylamido-propylglycine, N-Alkyltaurine, N Alkylsarcosine, 2-Alkylaminopropionsäuren und Alkylaminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe.
  • Besonders bevorzugte ampholytische Tenside sind das N-Kokosalkyl-aminopropionat, Kokosacylaminoethylaminopropionat und das C12/18-Acylsarcosin. Neben den ampholytischen kommen auch quartäre Emulgatoren in Betracht, wobei solche vom Typ der Esterquats, vorzugsweise methyl-quaternierte Difettsäuretriethanolaminester-Salze, besonders bevorzugt sind. Des weiteren können als anionische Emulgatoren Alkylethersulfate, Monoglyceridsulfate, Fettsäuresulfate, Sulfosuccinate und/oder Ethercarbonsäuren eingesetzt werden.
  • Als Ölkörper kommen Guerbetalkohole auf Basis von Fettalkoholen mit 6 bis 18, vorzugsweise 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, Ester von linearen C6-C22-Fettsäuren mit linearen C6-C22-Fettalkoholen, Ester von verzweigten C6-C13-Carbonsäuren mit linearen C6-C22-Fettalkoholen, Ester von linearen C6-C22-Fettsäuren mit verzweigten Alkoholen, insbesondere 2-Ethylhexanol, Ester von linearen und/oder verzweigten Fettsäuren mit mehrwertigen Alkoholen (wie z.B. Propylenglycol, Dimerdiol oder Trimertriol) und/oder Guerbetalkoholen, Triglyceride auf Basis C6-C10-Fettsäuren, flüssige Mono-/Di-, Triglyceridmischungen auf Basis von C6-C18-Fettsäuren, Ester von C6-C22-Fettalkoholen und/oder Guerbetalkoholen mit aromatischen Carbonsäuren, insbesondere Benzoesäure, Ester von C2-C12-Dicarbonsäuren mit linearen oder verzweigten Alkoholen mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen oder Polyolen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und 2 bis 6 Hydroxylgruppen, pflanzliche Öle, verzweigte primäre Alkohole, substituierte Cyclohexane, lineare C6-C22-Fettalkoholcarbonate, Guerbetcarbonate, Ester der Benzoesäure mit linearen und/oder verzweigten C6-C22-Alkoholen (z.B. Finsolv® TN), Dialkylether, Ringöffnungsprodukte von epoxidierten Fettsäureestern mit Polyolen, Siliconöle und/oder aliphatische bzw. naphthenische und/oder aliphatische bzw. naphthenische Kohlenwasserstoffe in Betracht. Als Ölkörper können ferner auch Siliconverbindungen eingesetzt werden, beispielsweise Dimethylpolysiloxane, Methylphenylpolysiloxane, cyclische Silicone sowie amino-, fettsäure-, alkohol-, polyether-, epoxy-, fluor-, alkyl- und/oder glykosidmodifizierte Siliconverbindungen, die bei Raumtemperatur sowohl flüssig als auch harzförmig vorliegen können. Die Ölkörper können in den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von 1 bis 90, vorzugsweise 5 bis 80, und insbesondere 10 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung enthaften sein.
  • Durch Kopplung von entsprechenden Verbindungen an ein Hydrophobin-Polypeptid (i) kann die Wirkdauer auf der Haut signifikant verlängert werden. Die Kopplung erfolgt wie oben beschrieben, Formulierung und Applikation erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden. Insbesondere für Deodorantien sind geeignete Effektormoleküle (ii): Parfumöle, Cyclodextrine, Ionenaustauscher, Zink-Ricinoleat, keimhemmende/bakteriostatische Verbindungen (z.B. DCMX, Irgasan DP 300, TCC).
  • Für Antitranspirantien geeignet sind: Tannine, und Zink-/Aluminiumsalze.
  • Ein weiteres Anwendungsgebiet für die erfindungsgemässen Substanzen ist der therapeutische oder prophylaktische Einsatz bei bestimmten Erkrankungen der Haut und der Schleimhäute. Besonders im Mund-, Rachen- und Nasenraum ist es von Vorteil, Wirkstoffe zur Therapie/Prophylaxe über eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) verstärkt und länger andauernd zu binden. Anwendungsgebiete hierfür sind insbesondere:
    • – virale Erkrankungen (z.B. Herpes, Coxsackie, Varicella zoster, Cytomegalovirus etc)
    • – bakterielle Erkrankungen (z.B. TB, Syphilis etc.)
    • – pilzliche Erkrankungen (z.B. Candida, Cryptococcus, Histoplasmosis, Aspergillus, Mucormycosis etc.)
    • – Tumorerkrankungen (z.B. Melanome, Adenome etc.)
    • – Autoimmunerkrankungen (z.B. PEMPHIGUS VULGARIS, BULLOUS PEMPHIGOID, SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSIS etc.)
    • – Sonnenbrand
    • – parasitärer Befall (z.B. Zecken, Milben, Flöhe etc.)
    • – Insektenkontakt (z.B. blutsaugende Insekten wie Anopheles etc.)
  • Die zur Therapie oder Prophylaxe geeigneten Substanzen (z.B. Corticoide, immunsupprimierende Verbindungen, Antibiotika, Antimykotika, anti-virale Verbindungen, Insektenrepellent etc.) können über die oben beschriebenen Linker (je nach zu koppelnder Funktionalität ein zu optimierender Linker) an die Keratin-bindenden Polypeptide (i) gekoppelt werden.
  • Experimenteller Teil
  • Beispiel 1
  • Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-His6/yaaE-His6
  • Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (Hal 572/Hal 573) wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD/yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine NcoI bzw. BglII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BglII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BglII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS6 bzw. YAAE::HIS6 verwendet werden.
    Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
    Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac
    Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg
    Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
  • Beispiel 2
  • Klonierung von yaad-Hydrophobin DewA-His6
  • Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BglII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 kloniert.
  • Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS6 verwendet werden.
    KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
    KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • Beispiel 3
  • Klonierung von yaad-Hydrophobin RodA-His6
  • Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
    KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
    KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
  • Beispiel 4
  • Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF1-His6
  • Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
  • Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz – Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang).
    KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
    KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
  • Beispiel 5
  • Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF2-His6
  • Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
  • Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz – Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang).
    KaM417:000GTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
    KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
  • Beispiel 6
  • Klonierung von yaad-Hydrophobin SC3-His6
  • Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.
  • Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).
    KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
    KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
  • Beispiel 7
  • Fermentation des rekombinanten E.coli Stammes yaad-Hydrophobin DewA-His6
  • Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His6 exprimierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 1l Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1 ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.
  • 13.5l LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 20l Fermenter mit 0,5l Vorkultur (OD600nm 1:10 gegen H20 gemessen) animpfen. Bei einer OD60nm von ~3.5 Zugabe von 140ml 100mM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
  • Beispiel 8
  • Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins
  • (Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)
  • 100 g Zellpellet (100-500 mg Hydrophobin) werden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum Zellaufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1% SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E.coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
  • 1 zeigt die Reinigung des erfindungsgemässen Hydrophobins:
    Spur 1: Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1:10 Verdünnung)
    Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt
    Spuren 3-5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen
  • Das erfindungsgemässe Hydrophobin der 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.
  • Beispiel 9
  • Beschichtung/Evaluierung von Oberflächen mit Hydrophobin
  • Die Evaluierung der Beschichtungseigenschaften von Hydrophobin bzw. Hydrophobinfusionsprotein wird bevorzugt auf Glas bzw. Teflon als Modelle für eine hydrophile bzw. hydrophobe Oberflächen vorgenommen.
  • Standard-Versuche für Beschichtung
  • Glas:
    • – Konzentration Hydrophobin: 1-100 μg/mL
    • – Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur: 80°C) in 50mM Na-Acetat pH 4 + 0,1% Tween 20
    • nach Beschichtung waschen in VE-Wasser
    • – danach Inkubation 10min/80°C/1% SDS
    • – waschen in VE-Wasser
  • Teflon:
    • – Konzentration: 1-100 μg/mL
    • – Inkubation von Teflonplättchen über Nacht (Temperatur: 80°C) in 10mM Tris pH 8
    • – nach Beschichtung waschen in VE-Wasser
    • – Inkubation 10min/80°C/0,1% Tween 20
    • – waschen in VE-Wasser
    • – danach Inkubation 10min/80°C/1% SDS
    • – waschen in VE-Wasser
  • Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt. Es ergeben sich z.B. folgende Werte:
    Ansatz mit yaad-DewA Fusionsprotein gemäss Beispiel 8 (Kontrolle: ohne Protein; yaad-dewA-his6: 100 μg/ml gereinigter Fusionspartner):
    Figure 00420001
    Figure 00430001
  • Beispiel 10
  • Beschichtung/Evaluierung von Oberflächen mit Hydrophobin
  • Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim):
    • – Konzentration Hydrophobin: 100 μg/mL
    • – Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur 80°C) in 50mM Na-Acetat pH 4 + 0,1% Tween 20
    • – nach Beschichtung waschen in destilliertem Wasser
    • – danach Inkubation 10min/80°C/1% SDS-Lösung in dest. Wasser
    • – waschen in dest. Wasser
  • Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt.
  • Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
  • Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; eine Beschichtung mit einem funktionellen Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his6) ergab Kontaktwinkel von 75 ± 5°.
  • Beispiel 11
  • Bindung an Haut 1 (Qualitativ)
  • Es wurde ein visueller qualitativer Test entwickelt, um zu überprüfen, ob Hydrophobin an Haut bindet.
  • Verwendete Lösungen:
    • Blockierungslsg: DIG Wash+Bufferset 1585762 Boehringer MA (10×Lsg) in TBS verdünnt
    • TBS: 20mM Tris; 150mM NaCl pH 7,5
    • TTBS: TBS + 0,05 Tween20
  • Der erste Schritt ist der Transfer der äußeren Keratinschicht von der Haut auf einen stabilen Träger. Dazu wurde ein Klarsichtklebestreifen fest auf enthaarte menschliche Haut aufgebracht und wieder entfernt. Der Test kann direkt auf dem Klarsichtklebestreifen durchgeführt werden oder die anhaftende Keratinschicht durch erneutes Aufkleben auf einen Glasobjektträger überführt werden. Der Nachweis von Bindung wurde wie folgt vorgenommen:
    • – zur Inkubation mit den verschiedenen Reagentien, Transfer in ein Falcongefäß
    • – ggf. Zugabe von Ethanol zur Entfettung, Entfernung von Ethanol und Trocknung der Objektträger
    • – 1h bei Raumtemperatur inkubiert mit Blocking Puffer
    • – 2 × 5 min gewaschen mit TTBS
    • – 1 × 5 min gewaschen mit TBS
    • – Inkubation mit dem zu testenden Hydrophobin (gekoppelt an tag – z.B. His6, HA etc.) bzw. Kontrollprotein in TBS/0,05% Tween 20 während 2-4 h bei Raumtemperatur
    • – Entfernung des Überstands
    • – 3 × Waschen mit TBS
    • – 1h bei Raumtemperatur Inkubation mit Monoclonal Anti-poly-Histidin Antikörper, verdünnt 1:2000 in TBS + 0,01% Blocking
    • – 2 × 5 min gewaschen mit TTBS
    • – 1 × 5 min gewaschen mit TBS
    • – 1h bei Raumtemperatur Inkubation mit Anti-Mouse IgG Alkalische-Phosphatase-Conjugate, verdünnt 1:5000 in TBS + 0,01% Blocking
    • – 2 × 5 min gewaschen mit TTBS
    • – 1 × 5 min gewaschen mit TBS
    • – Zugabe von Phosphatasesubstrat (NBT-BCIP; Boehringer MA 1Tablette/40 ml Wasser 2,5 min; Stopp: mit Wasser)
    • – Optische Detektion des Farbniederschlages mit bloßem Auge oder im Mikroskop. Ein blauer Farbniederschlag zeigt an, dass Hydrophobin an die Haut gebunden hat.
  • Beispiel 12
  • Bindung an Haut 2 (Quantitativ)
  • Es wurde ein quantitativer Test entwickelt, mit dem sich die Haar/Haut-Bindungsstärke des Hydrophobins mit unspezifischen Proteinen vergleichen lässt (2).
  • Aus einem aufgetauten trockenem Stück Haut ohne Haare (human oder Schwein), wurde mit einem 5 mm Korkbohrer ein Stück herausgebohrt (bzw. bei einem Oberflächentest ein Stück Haut in ein Falcondeckel eingepasst). Die Hautprobe wurde dann auf eine Dicke von 2-3 mm gebracht um evt. vorhandenes Gewebe zu entfernen. Die Hautprobe wurde anschließend in ein Eppendorfgefäß (Protein-Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen (siehe auch 2):
    • – 2 × Waschen mit PBS/0,05% Tween 20
    • – Zugabe von 1 ml 1% BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen (900rpm).
    • – Entfernung des Überstands
    • – Zugabe von 100 μg Hydrophobin in PBS+0,05% Tween 20; Inkubation 2 h bei Raumtemperatur und leichten Schwenkbewegungen (900 rpm).
    • – Entfernung des Überstands
    • – 3 × Waschen mit PBS/0,05% Tween 20
    • – Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA oder spezifischen KBD)-Antikörper mit Peroxidase Conjugate (1:2000 in PBS/0,05% Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung (900 rpm)
    • – 3 × Waschen mit PBS/0,05% Tween 20
    • – Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml/Eppendorfgefäß; Zusammensetzung s.u.)
    • – Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 1:30 Minuten).
    • – Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen.
    • – Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen
  • Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten):
    • 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO)
    • + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9)
    • + 14,7 μl H2O2 3%ig
  • Beispiel 13
  • Bindung an Haar (Quantitativ)
  • Um die Bindungsstärke des Hydrophobins an Haar auch im Vergleich zu anderen Proteinen nachweisen zu können, wurde ein quantitativer Assay entwickelt (2). Bei diesem Test wurde zunächst Haar mit Hydrophobin inkubiert und überschüssiges Hydrophobin abgewaschen. Anschließend wurde eine Antikörper-Peroxidase-Konjugat über das His-Tag des Hydrophobins gekoppelt. Nicht gebundene Antikörper-Peroxidase-Konjugat wurde erneut abgewaschen. Das gebundene Antikörper-Peroxidase-Konjugat [Mono-clonal Antipoly-Histidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] kann ein farbloses Substrat (TMB) in ein farbiges Produkt umsetzen, das photometrisch bei 405 nm vermessen wurde. Die Stärke der Absorption zeigt die Menge an gebundenem Hydrophobin bzw. Vergleichsprotein an. Als Vergleichsprotein wurde z.B. YaaD aus B. subtilis gewählt, das ebenfalls – wie es für diesen Test nötig ist – ein His-Tag zur Detektion aufwies. Anstatt des His-Tag können auch andere, spezifische Antikörper konjugiert mit Peroxidase verwendet werden.
  • 5 mg Haare (human) werden in 5 mm lange Stücke geschnitten und in Eppendorfgefäße (Protein-Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen:
    • – Zugabe von 1 ml Ethanol zur Entfettung
    • – Zentrifugation, Entfernung von Ethanol und Waschung der Haare mit H2O
    • – Zugabe von 1 ml 1% BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen.
    • – Zentrifugation, Entfernung des Überstands
    • – Zugabe des zu testenden Hydrophobins (gekoppelt an tag – z.B. His6, HA etc.) bzw. Kontrollprotein in 1 ml PBS/0,05% Tween 20; Inkubation für 16 h bei 4° C (oder mindestens 2 h bei Raumtemperatur) bei leichten Schwenkbewegungen.
    • – Zentrifugation, Entfernung des Überstands
    • – 3 × Waschen mit PBS/0,05% Tween 20
    • – Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA)-Antikörper mit Peroxidase-Konjugat (1:2000 in PBS/0,05% Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized pow powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung
    • – 3 × Waschen mit PBS/0,05% Tween 20
    • – Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml/Eppendorfgefäß)
    • – Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 2 Minuten).
    • – Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen.
    • – Die Absorption wird bei 405 nm gemessen
  • Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten):
    • 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO)
    • + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9)
    • + 14,7 μl H2O2 3%ig
    • BSA
      = Bovine serum albumin
      PBS
      = Phosphat gepufferte Salzlösung
      Tween
      20 = Polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n ca. 20
      TMB
      = 3,5,3,'5' Tetramethylbenzidin
  • Ein beispielhaft für Hydrophobin durchgeführter Bindungs-Test an Haar zeigte eine deutliche Überlegenheit der Bindung von Hydrophobin an Haar gegenüber einer wesentlichen schlechteren Bindung des Vergleichsproteins YaaD:
    Figure 00470001
    Tabelle 1.: Quantitativer Hydrophobin Aktivitäts-Test Haar. 1) Puffer, 2) Vergleichsprotein yaad; 3) Hydrophobin. Die Tabelle zeigt die gemessenen Absorptionswerte bei 405 nm.
  • Analog zu Beispiel 11 (Bindung an Haut) kann auch die Bindung an Schleimhaut gemessen werden, indem man von Schleimhaut (beispielsweise menschlicher Mundschleimhaut) mittels eines Klarsichtklebestreifens eine Probe entnimmt, die anschliessend auf Bindungswirkung untersucht werden kann.
  • Die Bindung an Zähne kann ermittelt werden, indem die zu untersuchenden Polypeptidsequenzen direkt mit der Zahnoberfläche (beispielsweise Rinderzähne) inkubiert und entsprechend Beispiel 11 vermessen werden.
  • Beispiel 14
  • Derivatisierung von Hydrophobin mit Farbstoff „Alexa" und Bindung an Haar
  • Eine Möglichkeit zur Kopplung von Wirk- oder Effektstoffen an Proteine (allgemeines Prinzip 3) erfolgt über die SH-Gruppen der Cysteine. Vor Kopplung des Farbstoffes Alexa Fluor 532 werden die Disulfidbrücken des Hydrophobins gespalten:
    Figure 00480001
    • 1 mg Hydrophobin
    • 0,5 ml Puffer (75 mM Tris pH 8,0 2,5 mM EDTA 1 mM DTT)
    • Inkubation für 30 Minuten bei 37°C
  • Die Kopplung des Farbstoffes erfolgt nach Herstellerangaben (Alexa 532 Protein Labeling Kit; Molecular Probes; MP-A-10236)
  • Die Beschichtung von human Haar mit Alexa-gekoppeltem Hydrophobin wird wie folgt durchgeführt:
    • – 10 mg human Haar mit 50 μg/ml Alexa-Hydrophobin bzw. Kontrollprotein yaad bzw. ungekoppeltem Farbstoff Alexa 532 in Puffer TBS 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren
    • – 2 × waschen mit TBS/0,05% Tween 20
    • – 1 × waschen mit TBS
    • – 1 × waschen mit TBS/1% SDS
    • – Detektion im Fluoreszenzmikroskop (4)
  • Beispiel 15
  • Verwendung des Hydrophobins in einer Emulsion zur Tagespflege – Typ O/W
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 1,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    0,7 Ceteareth-25
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    2,0 PEG-14 Dimethicone
    3,6 Cetearyl Alcohol
    6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Dibutyl Adipate
    B 5,0 Glycerin
    0,2 Disodium EDTA
    1,0 Panthenol
    q.s. Konservierungsmittel
    67,8 Aqua dem.
    C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
    D 0,2 Sodium Ascorbyl Phosphate
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    1,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Ascorbate, Tocopherol, Retinol
    1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    E q.s. Sodium Hydroxide
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 1,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    0,7 Ceteareth-25
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    2,0 PEG-14 Dimethicone
    3,6 Cetearyl Alcohol
    6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Dibutyl Adipate
    B 5,0 Glycerin
    0,2 Disodium EDTA
    1,0 Panthenol
    q.s. Konservierungsmittel
    63,8 Aqua dem.
    C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
    D 0,2 Sodium Ascorbyl Phosphate
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    1,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Ascorbate, Tocopherol, Retinol
    5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    E q.s. Sodium Hydroxide
  • Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C in die kombinierten Phasen A und B einrühren und nochmals homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase D zugeben, den pH-Wert mit Phase E auf etwa 6.5 einstellen, homogenisieren und unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
  • Hinweis: Die Formulierung wird ohne Schutzgas hergestellt. Die Abfüllung muß in sauerstoffundurchlässige Verpackungen, z.B. Aluminiumtuben erfolgen.
  • Beispiel 16
  • Verwendung des Hydrophobins in einer schützenden Tagescreme – Typ O/W
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 1,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    0,7 Ceteareth-25
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    2,0 PEG-14 Dimethicone
    3,6 Cetearyl Alcohol
    6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Dibutyl Adipate
    B 5,0 Glycerin
    0,2 Disodium EDTA
    1,0 Panthenol
    q.s. Konservierungsmittel
    68,6 Aqua dem.
    C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
    D 1,0 Sodium Ascorbyl Phosphate
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    E q.s. Sodium Hydroxide
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 1,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    0,7 Ceteareth-25
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    2,0 PEG-14 Dimethicone
    3,6 Cetearyl Alcohol
    6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Dibutyl Adipate
    B 5,0 Glycerin
    0,2 Disodium EDTA
    1,0 Panthenol
    q.s. Konservierungsmittel
    64,6 Aqua dem.
    C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
    D 1,0 Sodium Ascorbyl Phosphate
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    E q.s. Sodium Hydroxide
  • Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C in die kombinierten Phasen A und B einarbeiten und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen. Phase D hinzugeben, den pH-Wert mit Phase E auf ca. 6.5 einstellen und homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
  • Beispiel 17
  • Verwendung des Hydrophobins in einer Gesichtsreinigungslotion – Typ O/W
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
    1,5 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasilosane
    2,0 PEG-40 Hydrogenated Castor Oil
    B 3,5 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
    C 1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    q.s. Konservierungsmittel
    q.s. Parfümöl
    D 3,0 Polyquaternium-44
    0,5 Cocotrimonium Methosulfate
    0,5 Ceteareth-25
    2,0 Panthenol, Propylene Glycol
    4,0 Propylene Glycol
    0,1 Disodium EDTA
    1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    60,7 Aqua dem.
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
    1,5 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasilosane
    2,0 PEG-40 Hydrogenated Castor Oil
    B 3,5 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
    C 1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    q.s. Konservierungsmittel
    q.s. Parfümöl
    D 3,0 Polyquaternium-44
    0,5 Cocotrimonium Methosulfate
    0,5 Ceteareth-25
    2,0 Panthenol, Propylene Glycol
    4,0 Propylene Glycol
    0,1 Disodium EDTA
    5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    56,7 Aqua dem.
  • Herstellung: Phase A lösen. Phase B in Phase A einrühren, Phase C in die kombinierten Phasen A und B einarbeiten. Phase D lösen, in die kombinierten Phasen A, B und C einrühren und homogenisieren. 15min nachrühren.
  • Beispiel 18
  • Verwendung des Hydrophobins in einem Daily Care Body Spray
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 3,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    1,0 Polyquaternium-44
    3,0 Propylene Glycol
    2,0 Panthenol, Propylene Glycol
    1,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
    10,0 Octyldodecanol
    0,5 PVP
    10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
    3,0 C12-15 Alkyl Benzoate
    3,0 Glycerin
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,3 Bisabolol
    1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    59,2 Alcohol
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 3,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    1,0 Polyquaternium-44
    3,0 Propylene Glycol
    2,0 Panthenol, Propylene Glycol
    1,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
    10,0 Octyldodecanol
    0,5 PVP
    10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
    3,0 C12-15 Alkyl Benzoate
    3,0 Glycerin
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,3 Bisabolol
    5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    55,2 Alcohol
  • Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und klar lösen.
  • Beispiel 19
  • Verwendung des Hydrophobins in einem Hautpflegegel
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 3,6 PEG-40 Hydrogenated Castor Oil
    15,0 Alcohol
    0,1 Bisabolol
    0,5 Tocopheryl Acetate
    q.s. Parfümöl
    B 3,0 Panthenol
    0,6 Carbomer
    1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    75,4 Aqua dem,
    C 0,8 Triethanolamine
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 3,6 PEG-40 Hydrogenated Castor Oil
    15,0 Alcohol
    0,1 Bisabolol
    0,5 Tocopheryl Acetate
    q.s. Parfümöl
    B 3,0 Panthenol
    0,6 Carbomer
    5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    71,4 Aqua dem,
    C 0,8 Triethanolamine
  • Herstellung: Die Phase A klar lösen. Phase B quellen lassen und mit Phase C neutralisieren. Phase A in die homogenisierte Phase B einrühren und homogenisieren.
  • Beispiel 20
  • Verwendung des Hydrophobins in einer After Shave Lotion
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    5,0 Tocopheryl Acetate
    1,0 Bisabolol
    0,1 Parfümöl
    0,3 Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
    B 15,0 Alcohol
    1,0 Panthenol
    3,0 Glycerin
    1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    0,1 Triethanolamine
    63,5 Aqua dem.
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    5,0 Tocopheryl Acetate
    1,0 Bisabolol
    0,1 Parfümöl
    0,3 Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
    B 15,0 Alcohol
    1,0 Panthenol
    3,0 Glycerin
    5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    0,1 Triethanolamine
    59,5 Aqua dem.
  • Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B lösen, in Phase A einarbeiten und homogenisieren.
  • Beispiel 21
  • Verwendung des Hydrophobins in einer After Sun Lotion
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 0,4 Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
    15,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    0,2 Bisabolol
    1,0 Tocopheryl Acetate
    q.s. Parfümöl
    B 1,0 Panthenol
    15,0 Alcohol
    3,0 Glycerin
    1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    63,2 Aqua dem,
    C 0,2 Triethanolamine
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 0,4 Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
    15,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    0,2 Bisabolol
    1,0 Tocopheryl Acetate
    q.s. Parfümöl
    B 1,0 Panthenol
    15,0 Alcohol
    3,0 Glycerin
    5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    59,2 Aqua dem,
    C 0,2 Triethanolamine
  • Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B unter Homogenisieren in Phase A einrühren. Mit Phase C neutralisieren und erneut homogenisieren.
  • Beispiel 22
  • Verwendung des Hydrophobins in einer Sonnenschutzlotion
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 4,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    3,0 Octocrylene
    2,5 Di-C12-13 Alkyl Malate
    0,5 Tocopheryl Acetate
    4,0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Distearate
    B 3,5 Cetearyl Isononanoate
    1,0 VP/Eicosene Copolymer
    5,0 Isohexadecane
    2,5 Di-C12-13 Alkyl Malate
    3,0 Titanium Dioxide, Trimethoxycaprylylsilane
    C 5,0 Glycerin
    1,0 Sodium Cetearyl Sulfate
    0,5 Xanthan Gum
    59,7 Aqua dem.
    D 1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    1,0 Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Butylparaben, Propylparaben, Isobutylparaben
    0,3 Bisabolol
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 4,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    3,0 Octocrylene
    2,5 Di-C12-13 Alkyl Malate
    0,5 Tocopheryl Acetate
    4,0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Distearate
    B 3,5 Cetearyl Isononanoate
    1,0 VP/Eicosene Copolymer
    5,0 Isohexadecane
    2,5 Di-C12-13 Alkyl Malate
    3,0 Titanium Dioxide, Trimethoxycaprylylsilane
    C 5,0 Glycerin
    1,0 Sodium Cetearyl Sulfate
    0,5 Xanthan Gum
    55,7 Aqua dem.
    D 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    1,0 Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Butylparaben, Propylparaben, Isobutylparaben
    0,3 Bisabolol
  • Herstellung: Die Komponenten der Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C auf ca. 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase D zugeben und nochmals homogenisieren.
  • Beispiel 23
  • Verwendung des Hydrophobins in einer Sonnenschutzlotion – Typ O/W
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    2,0 Ceteareth-25
    3,0 Tribehenin
    2,0 Cetearyl Alcohol
    2,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    5,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    1,0 Ethylhexyl Triazone
    1,0 VP/Eicosene Copolymer
    7,0 Isopropyl Myristate
    B 5,0 Zinc Oxide, Triethoxycaprylylsilane
    C 0,2 Xanthan Gum
    0,5 Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer, Squalane, Polysorbate 60
    0,2 Disodium EDTA
    5,0 Propylene Glycol
    0,5 Panthenol
    60,9 Aqua dem.
    D 1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    0,5 Phenoxyethanol, Methylparaben, Butylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, Isopropylparaben
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    2,0 Ceteareth-25
    3,0 Tribehenin
    2,0 Cetearyl Alcohol
    2,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    5,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    1,0 Ethylhexyl Triazone
    1,0 VP/Eicosene Copolymer
    7,0 Isopropyl Myristate
    B 5,0 Zinc Oxide, Triethoxycaprylylsilane
    C 0,2 Xanthan Gum
    0,5 Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer, Squalane, Polysorbate 60
    0,2 Disodium EDTA
    5,0 Propylene Glycol
    0,5 Panthenol
    56,9 Aqua dem.
    D 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    0,5 Phenoxyethanol, Methylparaben, Butylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, Isopropylparaben
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
  • Herstellung: Phase A auf ca. 80°C erwärmen, Phase B einrühren und 3min homogenisieren. Phase C ebenfalls auf 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Abkühlen auf ca. 40°C, Phase D einrühren und nochmals homogenisieren.
  • Beispiel 24
  • Verwendung des Hydrophobins in einer Sonnenschutlotion – Typ O/W
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 3,5 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    1,5 Ceteareth-25
    7,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    2,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
    0,5 Bees Wax
    3,0 Cetearyl Alcohol
    10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
    B 5,0 Titanium Dioxide, Silica, Methicone, Alumina
    C 3,0 Glycerin
    0,2 Disodium EDTA
    0,3 Xanthan Gum
    1,0 Decyl Glucoside
    2,0 Panthenol, Propylene Glycol
    56,3 Aqua dem.
    D 1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    q.s. Parfümöl
    q.s. Konservierungsmittel
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 3,5 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    1,5 Ceteareth-25
    7,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
    2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
    2,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
    0,5 Bees Wax
    3,0 Cetearyl Alcohol
    10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
    B 5,0 Titanium Dioxide, Silica, Methicone, Alumina
    C 3,0 Glycerin
    0,2 Disodium EDTA
    0,3 Xanthan Gum
    1,0 Decyl Glucoside
    2,0 Panthenol, Propylene Glycol
    52,3 Aqua dem.
    D 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    1,0 Tocopheryl Acetate
    0,2 Bisabolol
    q.s. Parfümöl
    q.s. Konservierungsmittel
  • Herstellung: Phase A auf ca. 80°C erwärmen, Phase B einrühren und 3min homogenisieren. Phase C ebenfalls auf 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Abkühlen auf ca. 40°C, Phase D einrühren und nochmals homogenisieren.
  • Beispiel 25
  • Verwendung des Hydrophobins in einem Fußbalsam
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    2,0 Ceteareth-25
    5,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    4,0 Cetyl Alcohol
    4,0 Glyceryl Stearate
    5,0 Mineral Oil
    0,2 Menthol
    0,5 Camphor
    B 69,3 Aqua dem.
    q.s. Konservierungsmittel
    C 1,0 Bisabolol
    1,0 Tocopheryl Acetate
    D 1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    5,0 Witch Hazel Extract
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
    2,0 Ceteareth-25
    5,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    4,0 Cetyl Alcohol
    4,0 Glyceryl Stearate
    5,0 Mineral Oil
    0,2 Menthol
    0,5 Camphor
    B 65,3 Aqua dem.
    q.s. Konservierungsmittel
    C 1,0 Bisabolol
    1,0 Tocopheryl Acetate
    D 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    5,0 Witch Hazel Extract
  • Herstellung: Die Komponenten der Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A unter Homogenisieren einrühren. Unter Rühren abkühlen auf ca. 40°C, die Phasen C und D hinzugeben und kurz nachhomogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
  • Beispiel 26
  • Verwendung des Hydrophobins in einer W/O Emulsion mit Bisabolol
  • WS 1%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor Oil
    8,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    5,0 Isopropyl Myristate
    15,0 Mineral Oil
    0,3 Magnesium Stearate
    0,3 Aluminum Stearate
    2,0 PEG-45/Dodecyl Glycol Copolymer
    B 5,0 Glycerin
    0,7 Magnesium Sulfate
    55,6 Aqua dem.
    C 1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    0,5 Tocopheryl Acetate
    0,6 Bisabolol
    WS 5%:
    % Inhaltsstoff (INCI)
    A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor Oil
    8,0 Cetearyl Ethylhexanoate
    5,0 Isopropyl Myristate
    15,0 Mineral Oil
    0,3 Magnesium Stearate
    0,3 Aluminum Stearate
    2,0 PEG-45/Dodecyl Glycol Copolymer
    B 5,0 Glycerin
    0,7 Magnesium Sulfate
    51,6 Aqua dem.
    C 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
    0,5 Tocopheryl Acetate
  • Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 85°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase C hinzugeben und nochmals kurz homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
  • Zuordnung der Sequenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenzen im Sequenzprotokoll
    Figure 00640001
    •
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (13)

  1. Kosmetische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, Schleimhäuten und Zähnen, enthaltend mindestens eine Hydrophobin Polypeptidsequenz (i) Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 500 stehen und C für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit Xn oder Xm abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 20 Aminosäuren lange Peptidsequenz steht, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von mindestens 20° bewirken, in einem kosmetisch verträglichen Medium.
  2. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) eine Bindungsaffinität zu menschlichem oder tierischem Haar-, Nagel- oder Hautkeratin oder Schleimhäuten oder Zähnen besitzt.
  3. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Xn oder Xm für eine Human- Keratin-bindende Domäne steht.
  4. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in einer Menge von 0,000001 bis 10 Gew.-% enthält.
  5. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie neben der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) mindestens einen kosmetischen Wirkstoff enthält.
  6. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der kosmetische Wirkstoff ausgewählt wird aus der Gruppe der natürlichen oder synthetischen Polymere, Pigmente, Feuchthaltemittel, Öle, Wachse, Enzyme, Mineralien, Vitamine, Sonnenschutzmittel, Farbstoffe, Duftstoffe, Antioxidantien und Konservierungsmittel.
  7. Verwendung von kosmetischen Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 1-5 zur Verbesserung der Kämmbarkeit von Haaren.
  8. Verwendung von kosmetischen Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 1-5 zur Verbesserung der Festigung von Haaren.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, enthaltend mindestens eine Hydrophobin Polypeptidsequenz (i) in einem pharmazeutisch verträglichen Medium.
  10. Konjugate aus Hydrophobin und verschiedenen Wirk- und Effektstoffen enthaltend ein Hydrophobin das kovalent mit einem Effektormolekül verknüpft ist.
  11. Konjugate nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Effektormolekül ausgewählt ist aus der Gruppe der Farbstoffe, Antioxidantien, UV-Filter, Vitamine, Fungizide, Insektizide und Biozide.
  12. Konjugate nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin eine Polypeptidsequenz (i) der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 ist.
  13. Kosmetische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, enthaltend mindestens ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 10-12.
DE102005029704A 2005-06-24 2005-06-24 Verwendung von Hydrophobin-Polypeptiden sowie Konjugaten aus Hydrophobin-Polypeptiden mit Wirk-oder Effektstoffen und ihre Herstellung sowie deren Einsatz in der Kosmetik Withdrawn DE102005029704A1 (de)

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