EP1898871A2 - Verwendung von hydrophobin-polypeptiden sowie konjugaten aus hydrophobin-polypeptiden mit wirk- oder effektstoffen und ihre herstellung sowie deren einsatz in der kosmetik - Google Patents

Verwendung von hydrophobin-polypeptiden sowie konjugaten aus hydrophobin-polypeptiden mit wirk- oder effektstoffen und ihre herstellung sowie deren einsatz in der kosmetik

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Publication number
EP1898871A2
EP1898871A2 EP06777430A EP06777430A EP1898871A2 EP 1898871 A2 EP1898871 A2 EP 1898871A2 EP 06777430 A EP06777430 A EP 06777430A EP 06777430 A EP06777430 A EP 06777430A EP 1898871 A2 EP1898871 A2 EP 1898871A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hydrophobin
acid
hair
cosmetic
polypeptide sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06777430A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Subkowski
Marvin Karos
Hans-Georg Lemaire
Heiko Barg
Claus Bollschweiler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
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Publication of EP1898871A2 publication Critical patent/EP1898871A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
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Definitions

  • Hydrophobins are small proteins of about 100 AA, which are characteristic of filamentous fungi and do not occur in other organisms. Recently, hydrophobin-like proteins have been discovered in Streptomyces coelicolor, also known as "chapliners,” which also have high surface-active properties, and at water-air interfaces can chapline into amyloid-like fibrils (Classen et al., 2003) Genes Dev 1714-1726; Elliot et al., 2003, Genes Dev. 17, 1727-1740).
  • Hydrophobins are in a water-insoluble form on the surface of various fungal structures, e.g. Aerial hyphae, spores, fruiting bodies, distributed.
  • the genes for hydrophobins could be isolated from ascomycetes, deuteromycetes and basidiomycetes.
  • Some fungi contain more than one hydrophobing, e.g. Schizophyllum commune, Coprinus cinereus, Aspergillus nidulans.
  • different hydrophobins are involved in different stages of fungal development. The hydrophobins are believed to be responsible for different functions (van Wetter et al., 2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210, Kershaw et al., 1998, Fungal Genet., Biol, 1998, 23, 18-33).
  • hydrophobins As a biological function for hydrophobins, in addition to reducing the surface tension of water to generate aerial hyphae, the hydrophobization of spores is also described (Wösten et al., 1999, Curr. Biol., 19, 1985-88; Bell et al., 1992, Genes Dev., 6, 2382-2394). Hydrophobins also serve to line gas channels in lichen fructoids and as components in the plant surface recognition system by fungal pathogens (Lugones et al., 1999, Mycol Res., 103, 635-640, Hamer & Talbot 1998, Curr. Opinion Microbiol. , Vol. 1, 693-697).
  • hydrophobins can functionally replace to some degree within a class.
  • the hitherto known hydrophobins can be prepared by conventional protein-chemical cleaning and isolation methods only in moderate yield and purity. Even attempts to provide larger amounts of hydrophobins with the aid of genetic engineering have not been successful so far.
  • the object of the present invention was to provide novel polypeptides which have a high affinity for keratin or keratin-containing substances such as skin, nails or hair and / or for mucous membranes and / or teeth.
  • Such polypeptides are suitable for the cosmetic and pharmaceutical treatment of keratin-containing structures, in particular of hair, nails and skin, or of mucous membranes or teeth and as an anchor for a variety of active ingredients and effect substances.
  • Such keratin-binding effector molecules allow a high local concentration of effector molecules on the keratin, i. a so-called "taringing" or a long duration of action on the keratin.
  • the invention relates to cosmetic compositions for the treatment of keratin-containing materials, mucous membranes and teeth, containing at least one hydrophobin polypeptide sequence (i) of the general structural formula (I) in a cosmetically acceptable medium.
  • X is any of the 20 naturally occurring amino acids (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, Glu, Gly) can and the indices standing at X represent the number of amino acids, the indices n and m being numbers between 0 and 500, preferably between 15 and 300, p being a number between 1 and 250, preferably 1-100, and C is cysteine, alanine, serine, glycine, methionine or threonine, with at least four of the radicals named C being cysteine, with the proviso that at least one of the peptide sequences abbreviated by X n or X n , or X p represents at least 20 Is amino acid-long peptide sequence, which is not naturally associated with a hydrophobin, which cause a contact angle change of at least 20 ° after coating a glass surface.
  • the amino acids designated C 1 to C 8 are preferably cysteines; but they can also be replaced by other amino acids of similar space filling, preferably by alanine, serine, threonine, methionine or glycine. However, at least four, preferably at least 5, more preferably at least 6 and in particular at least 7, of the positions C 1 to C 8 should consist of cysteines. Cysteines can either be reduced in the proteins according to the invention or form disulfide bridges with one another. Particularly preferred is the intramolecular formation of CC bridges, in particular those having at least one, preferably 2, more preferably 3 and most preferably 4 intramolecular disulfide bridges. In the exchange of cysteines described above by amino acids of similar space filling, it is advantageous to exchange in pairs those C positions which are capable of forming intramolecular disulfide bridges with one another.
  • cysteines, serines, alanines, glycines, methionines or threonines are also used in the positions indicated by X, the numbering of the individual C-positions in the general formulas may change accordingly.
  • polypeptides (i) are those of the general formula (II)
  • X is any of the 20 naturally occurring amino acids (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, Glu, Gly) and the indices standing at X represent the number of amino acids, the indices n and m being numbers between 2 and 300, and C being cysteine, alanine, serine, glycine, methionine or threonine, at least four of which are designated C.
  • Residues for cysteine with the proviso that at least one of the peptide sequences abbreviated to X n or X m stands for a peptide sequence which is at least 35 amino acids long and which is not naturally linked to a hydrophobin which, after coating a glass surface, changes the contact angle - effect at least 20 °.
  • X is any of the 20 naturally occurring amino acids (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, Glu, Gly) and the indices standing at X represent the number of amino acids, the indices n and m being numbers between 0 and 200, and C being cysteine, alanine, serine, glycine, methionine or threonine, at least six of which are denoted by C with the proviso that at least one of the peptide sequences abbreviated to X n or X m represents a peptide sequence of at least 40 amino acids that is not naturally linked to a hydrophobin which, after coating a glass surface, changes the contact angle of cause at least 20 °.
  • the hydrophobins mentioned are structurally characterized in the sequence listing below. It is also possible to link together a plurality of hydrophobins, preferably 2 or 3, of the same or different structure and to link them to a corresponding suitable polypeptide sequence which is not naturally associated with a hydrophobin.
  • proteins having the polypeptide sequences shown in SEQ ID NO: 20, 22, 24 and the nucleic acid sequences coding therefor, in particular the sequences according to SEQ ID NO: 19, 21, 23.
  • proteins which are starting from those shown in SEQ ID NO. 22, 22 or 24 represented polypeptide sequences by exchange, insertion or deletion of at least one, up to 10, preferably 5, particularly preferably 5% of all amino acids, and still possess at least 50% of the biological property of the starting proteins are particularly preferred embodiments.
  • the biological property of the proteins is understood to mean the change in the contact angle as described in Example 10.
  • the proteins according to the invention carry at least one position which is abbreviated X n or X m or X p , a polypeptide sequence of at least 20, preferably at least 35, more preferably at least 50 and especially at least 100 amino acids (also referred to below as fusion partners) which are not more natural - Is linked to a hydrophobin.
  • X n or X m or X p a polypeptide sequence of at least 20, preferably at least 35, more preferably at least 50 and especially at least 100 amino acids (also referred to below as fusion partners) which are not more natural - Is linked to a hydrophobin.
  • the fusion partner portion can be selected from a variety of proteins. It is also possible to link a plurality of fusion partners with a hydrophobin part, for example at the amino terminus (X n ) and at the carboxy terminus (X n ,) of the hydrophobin part. However, it is also possible, for example, to link two fusion partners with a position (X n or X n ,) of the protein according to the invention.
  • Particularly preferred fusion partners are those polypeptide sequences which result in the protein according to the invention being able to coat glass surfaces and the protein-treated glass surface becoming resistant to a detergent treatment as described in detail in the experimental part (Example 10) (eg 1%). SDS / 80 ° C / 10 min).
  • fusion partners are polypeptides that occur naturally in microorganisms, in particular in E. coli or Bacillus subtilis.
  • fusion partners are the sequences yaad (SEQ ID NO: 15 and 16), yaae (SEQ ID NO: 17 and 18), and thioredoxin.
  • fragments or derivatives of said sequences which comprise only a part, preferably 10-90%, particularly preferably 25-75% of said sequences.
  • a deletion at the C-terminal end is preferred; for example, a yaad fragment which consists only of the first 75 N-terminal amino acids, or in which individual amino acids, or nucleotides are changed from the said sequence.
  • additional amino acids in particular two additional amino acids, preferably the amino acids Arg, Ser, can be added at the C-terminal end of the sequences yaad and yaae.
  • additional amino acids may be preferred be inserted opposite to the naturally occurring sequence, for example, the amino acid no. 2 (Gly) in SEQ ID NO: 17 and 18.
  • keratin binding domains for example those which occur in the human desmoplakin or which can be derived from them by conventional genetic engineering methods such as amino acid substitution, insertion or deletion. The binding to keratin can be easily checked with the experiments described in the experimental section.
  • amino acids can also be inserted at the junctions of two fusion partners, which result from the fact that recognition sites for restriction endonucleases are either newly created or inactivated at the nucleic acid level.
  • proteins according to the invention may also be modified in their polypeptide sequence, for example by glycosylation, acetylation or else by chemical crosslinking, for example with glutaraldehyde.
  • a characteristic of the proteins according to the invention is the change of surface properties when the surfaces are coated with the proteins.
  • the change in the surface properties can be determined experimentally by measuring the contact angle of a water drop before and after coating the surface with the protein according to the invention and determining the difference between the two measurements.
  • the proteins according to the invention have the property of increasing the contact angle by at least 20, preferably 25, more preferably 30 degrees.
  • a comparison of the amino acid sequences shows that the length of the region between cysteine C 3 and C 4 in class II hydrophobins is significantly shorter than in class I hydrophobins.
  • Class II hydrophobins continue to have more charged amino acids than Class I.
  • the hydrophobin (i) can be represented by all known hydrophobin polypeptides.
  • Particularly suitable hydrophobins (i) are the abovementioned polypeptides (i) of the general structural formula (I), (II) or (III).
  • Preferred hydrophobin polypeptide sequences (i) comprise an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1-24.
  • hydrophobin polypeptide sequences (i) are also included within the scope of the invention.
  • “Functional equivalents” or analogues of the specifically disclosed polypeptides (i) are, within the scope of the present invention, different polypeptides which furthermore possess the desired biological activity, such as, for example, keratin binding
  • hydrophobin polypeptide sequences which exhibit at least 10% binding according to one of the binding assays described in Examples 12/13, preferably at least 50%, more preferably 75%, most preferably 90% of the binding which is a Hy - shows drophobin of SEQ ID NO: 1-24 in the binding assays according to Examples 12/13.
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without desired biological activity.
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules of the invention
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts, as well as salts with organic bases such as amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like, acid addition salts such as salts with mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid and salts with organic acids such as acetic acid and oxalic acid also the subject of the invention.
  • inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts
  • organic bases such as amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like
  • acid addition salts such as salts with mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid and salts with organic acids such as acetic acid and
  • “Functional derivatives” of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reacting with acyl groups.
  • “functional equivalents” also encompass polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, it is possible to determine regions of homologous sequence regions by sequence comparison and to determine equivalent enzymes on the basis of the specific requirements of the invention.
  • “Functional equivalents” likewise include fragments, preferably individual domains or sequence motifs, of the polypeptides according to the invention which, for example, have the desired biological function.
  • “Functional equivalents” are also fusion proteins which comprise one of the abovementioned hydrophobin polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further, functionally different, heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without substantial mutual functional impairment
  • Nonlimiting examples of such heterologous sequences are, for example, signal peptides or enzymes.
  • homologs to the specifically disclosed proteins which have at least 50%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90%, 95% or 99%, homology to one of the specifically disclosed amino acid sequences, Calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc Natl Acad., U.S.A., 85 (8), 1988, 2444-2448
  • a percent homology of a homologous polypeptide of the invention means, in particular, percent identity of the amino acid residues relative to the total length of one of specifically described herein.
  • “functional equivalents” include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
  • Homologs of the polypeptides (i) of the invention may be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation or shortening of the protein.
  • Homologs of the polypeptides of the invention can be identified by screening combinatorial libraries of mutants such as truncation mutants.
  • a library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be performed in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture containing the desired set of potential protein sequences. encode frequencies.
  • Methods of synthesizing degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • hydrophobin-containing effector molecules in which the hydrophobin is represented by a polypeptide sequence (i) which comprises at least one of the following hydrophobin polypeptide sequences,
  • polypeptide sequence which is changed in relation to (a) in up to 60%, preferably up to 75%, particularly preferred up to 90% of the amino acid positions,
  • the keratin binding of the hydrophobin polypeptide sequence (b) is at least 10% of the value exhibited by the hydrophobin polypeptide sequence (a) measured in the assay of Examples 12 and 13, respectively.
  • altering amino acids is meant amino acid substitutions, insertions and deletions or any combination of these three possibilities.
  • hydrophobin polypeptide sequences (i) are used which have a highly specific affinity for the desired organism.
  • hydrophobin polypeptide sequences (i) are preferably used which have a particularly high affinity for the human dermal keratin.
  • hydrophobin polypeptide sequences (i) which have a particularly high affinity for the corresponding keratin, for example, dog keratin or cat keratin.
  • hydrophobin polypeptide sequence (i) in the effector molecule according to the invention.
  • multiple copies of the same hydrophobin polypeptide sequence (i) can be switched in tandem to achieve, for example, higher binding.
  • hydrophobins according to the invention having keratin-binding properties have a wide field of application in human cosmetics, in particular skin and hair care, animal care.
  • hydrophobin polypeptides (i) according to the invention are preferably used for hair and skin cosmetics. They allow a high concentration and long duration of action of skin-care or skin-protecting effector substances.
  • effector molecules (ii) are understood in the following molecules having a certain predictable effect. These can be either proteinaceous molecules, such as enzymes or else non-proteinogenic molecules such as dyes, light stabilizers, vitamins and fatty acids, or metal ion-containing compounds.
  • enzymes and antibodies are preferred.
  • the enzymes the following are preferred as effector molecules (ii): oxidases, peroxidases, proteases, tyrosinases, metal-binding enzymes, lactoperoxidase, lysozyme, amyloglycosidase, glucose oxidase, superoxide dismutase, photolyase, calalase.
  • Hydrolysates of proteins from plant and animal sources for example hydrolyzates of proteins of marine origin or silk hydrolysates, are also very suitable as proteinaceous effector molecules (ii).
  • non-proteinaceous effector molecules (ii) dyes such as semipermanent dyes or oxidation dyes are preferred.
  • a component is preferably linked as effector molecule (ii) with the keratin-binding hydrophobin polypeptide sequence (i) and then at the site of action, i. after attachment to the hair, oxidatively coupled with the second dye component.
  • Suitable dyestuffs are all customary hair dyestuffs for the molecules according to the invention. Suitable dyes are the expert from manuals of cosmetics such as Schrader, bases and formulations of cosmetics, Weghig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1 known.
  • carotenoids are to be understood as meaning the following compounds: ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, zeaxanthin, cryptoxanthin, citranaxanthin, canthaxanthin, bixin, ⁇ -apo-4-carotenal, ⁇ -apo-8-carotenal, ⁇ -apo -8-carotenoic acid ester, singly or as a mixture.
  • carotenoids are ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, zeaxanthin, citranaxanthin and canthaxanthin.
  • retinoids in the context of the present invention is meant vitamin A alcohol (retinol) and its derivatives such as vitamin A aldehyde (retinal), vitamin A acid (retinoic acid) and vitamin A esters (e.g., retinyl acetate, retinyl propionate and retinyl palmitate).
  • retinoic acid encompasses both all-trans retinoic acid and 13-cis retinoic acid.
  • the terms retinol and retinal preferably include the all-trans compounds.
  • the preferred retinoid used for the suspensions of the invention all-trans-retinol, hereinafter referred to as retinol.
  • effector molecules (ii) are vitamins, especially vitamin A and their esters.
  • Vitamins, provitamins and vitamin precursors from groups A, C, E and F in particular 3,4-didehydroretinol, ß-carotene (provitamin of vitamin A), ascorbic acid
  • vitamin C the palmitic acid esters, glucosides or phosphates of ascorbic acid, tocopherols, in particular ⁇ -tocopherol and its esters, for example the acetate, the Nicotinate, the phosphate and the succinate; vitamin F, which is understood as meaning essential fatty acids, especially linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid;
  • Vitamin A and its derivatives and provitamins advantageously show a particular skin-smoothing effect.
  • vitamins, provitamins or vitamin precursors of the vitamin B group or derivatives thereof which are preferably to be used according to the invention and the derivatives of 2-furanone include, inter alia:
  • Vitamin B 1 common name thiamin, chemical name 3 - [(4'-amino-2'-methyl-5'-pyrimidyl) methyl] -5- (2-hydroxyethyl) -4-methylthiazole iu mch Lorid.
  • Vitamin B 2 trivial name riboflavin, chemical name 7,8-dimethyl-10- (1-D-ribityl) -benzo [g] pteridine-2,4 (3H, 10H) -dione.
  • riboflavin z As in whey, other riboflavin derivatives can be isolated from bacteria and yeasts.
  • a stereoisomer of riboflavin which is also suitable according to the invention is lyxoflavin which can be isolated from fishmeal or liver and carries a D-arabityl residue instead of D-ribityl.
  • Vitamin B 3 Vitamin B 3 .
  • the compounds nicotinic acid and nicotinamide (niacinamide) are often performed.
  • the nicotinic acid amide is preferred.
  • Vitamin B 5 pantothenic acid and panthenol.
  • Panthenol is preferably used.
  • Derivatives of panthenol which can be used according to the invention are, in particular, the esters and ethers of panthenol and also cationically derivatized panthenols.
  • Particularly preferred derivatives are the commercially available substances dihydro-3-hydroxy-4,4-dimethyl-2 (3H) -furanone with the trivial name pantolactone (Merck), 4 hydroxymethyl- ⁇ -butyrolactone (Merck), 3,3-dimethyl 2-hydroxy- ⁇ -butyrolactone (Aldrich) and 2,5-dihydro-5-methoxy-2-furanone (Merck), expressly including all stereoisomers.
  • Vitamin B 6 which is understood here not a single substance, but the known under the common names pyridoxine, pyridoxamine and pyridoxal derivatives of 5-hydroxymethyl-2-methylpyridin-3-ols.
  • Vitamin B 7 also known as vitamin H or "skin vitamin”.
  • Biotin is (3aS, 4S, 6aR) -2-oxohexahydrothienol [3,4-d] imidazole-4-valeric acid.
  • Panthenol, pantolactone, nicotinamide and biotin are very particularly preferred according to the invention.
  • suitable derivatives salts, esters, sugars, nucleotides, nucleosides, peptides and lipids.
  • Preferred lipophilic, oil-soluble antioxidants from this group are tocopherol and its derivatives, gallic acid esters, flavonoids and carotenoids, and butylhydroxytoluene / anisole.
  • water-soluble antioxidants are amino acids, eg. As tyrosine and cysteine and their derivatives and tanning agents, especially those of plant origin are preferred.
  • Triterpenes in particular triterpenic acids such as ursolic acid, rosmarinic acid, betulinic acid, boswellic acid and brononolic acid.
  • Further preferred effector molecules (ii) are UV light protection filters.
  • organic substances capable of absorbing ultraviolet rays and absorbing the absorbed energy in the form of longer wavelength radiation, e.g. Heat, give it up again.
  • the organic substances may be oil-soluble or water-soluble.
  • oil-soluble UV-B filters e.g. the following substances are used:
  • 4-aminobenzoic acid derivatives preferably 2-ethylhexyl 4- (dimethylamino) benzoate, 2-octyl 4- (dimethylamino) benzoate and 4- (dimethylamino) benzoic acid ester;
  • esters of cinnamic acid preferably 2-ethylhexyl 4-methoxycinnamate, 4-propyl methoxy cinnamate, isoamyl 4-methoxycinnamate, 4-isoacetyl methoxycinnamate, 2-cyano-3-phenylcinnamic acid 2-ethylhexyl ester (octocrylene);
  • Esters of acidic acid preferably 2-ethylhexyl salicylate, 4-isopropylbenzyl salicylate, homomenthyl salicylate;
  • Derivatives of benzophenone preferably 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone, 2-hydroxy- 1- methoxy- 1 -methylbenzophenone, 2,2-dihydroxy-4-methoxybenzophenone;
  • Esters of benzalmalonic acid preferably di-2-ethylhexyl 4-methoxybenzmalonate
  • Triazine derivatives such as 2 J 4 J 6-trianilino- (p-carbo-2 l -ethyl-r-hexyloxy) -1,3 J 5-triazine (octyl tyltriazone) and Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb HEB ®):
  • Propane-1,3-diones such as e.g. 1 - (4-tert-butylphenyl) -S-3'-methoxyphenylpropane-1-dione.
  • Suitable water-soluble substances are:
  • Sulfonic acid derivatives of benzophenones preferably 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid and its salts;
  • Sulfonic acid derivatives of the 3-benzylidene camphor e.g. 4- (2-oxo-3-bomylidenemethyl) benzenesulfonic acid and 2-methyl-5- (2-oxo-3-bomylidene) -sulfonic acid and its salts.
  • esters of cinnamic acid preferably 4-methoxycinnamic acid 2-ethylhexyl ester, 4-methoxycinnamic acid isopentyl ester, 2-cyano-3-phenylcinnamic acid 2-ethylhexyl ester (octocrylene).
  • Typical UV-A filters are:
  • benzoylmethane for example 1- (4'-tert-butylphenyl) -3- (4 1 - methoxyphenyl) propane-1,3-dione, 4-tert-butyl-4'-methoxydibenzoylmethane or 1-phenyl-3 - (4'-isopropylphenyl) -propane-1,3-dione;
  • UV-A and UV-B filters can also be used in mixtures.
  • insoluble pigments e.g. finely disperse metal oxides or salts such as titanium dioxide, iron oxide, aluminum oxide, cerium oxide, zirconium oxide, silicates (talc), barium sulfate and zinc stearate.
  • the particles should have an average diameter of less than 100 nm, preferably between 5 and 50 nm and in particular between 15 and 30 nm.
  • secondary light stabilizers of the antioxidant type which interrupt the photochemical reaction chain which is triggered when UV radiation penetrates into the skin.
  • Typical examples are superoxide dismutase, catalase, tocopherols (vitamin E) and ascorbic acid (vitamin C).
  • anti-irritants which have an anti-inflammatory effect on UV-damaged skin.
  • anti-irritants which have an anti-inflammatory effect on UV-damaged skin.
  • Such substances are, for example, bisabolol, phytol and phytantriol.
  • the effector molecules (ii) are linked to a hydrophobin polypeptide sequence (i) which has a binding affinity to a keratin.
  • the connection between (i) and (ii) can be based both covalently and on ionic or van-der Waals interactions ( Figure 3).
  • the linkage of the effector molecules (ii) with the hydrophobin polypeptide sequence (i) can be either directly, ie as a covalent linkage of two in (i) and (ii) already existing chemical functions, for example, an amino function of (i) with a carboxylate function of (ii) linked to the acid amide.
  • the linkage can also take place via a so-called linker, ie an at least bifunctional molecule which, with one function, enters into a bond with (i) and is linked to another function by (ii).
  • effector molecule (ii) also consists of a polypeptide sequence
  • linkage of (i) and (ii) can be effected by a so-called fusion protein, ie a continuous polypeptide sequence consisting of the two partial sequences (i) and (ii).
  • spacer elements between (i) and (ii), for example polypeptide sequences which have a potential cleavage site for a protease, lipase, esterase, phosphatase, hydrolase or polypeptide sequences which permit easy purification of the fusion protein, for example called His-tags, ie Oligohistidinreste.
  • the linkage in the case of a non-proteinaceous effector molecule with the hydrophobin polypeptide sequence (i) is preferably carried out by functionalizable groups (side groups) on the hydrophobin polypeptide (i) which form a covalent bond with a chemical function of the effector molecule.
  • Preferred here is the bond formation via an amino, thiol or hydroxyl function of the hydrophobin polypeptide (i), which can enter into a corresponding amide, thioester or ester bond, for example with a carboxyl function of the effector molecule (ii), if appropriate after activation.
  • Another preferred linkage of the hydrophobin polypeptide sequence (i) with an effector molecule (ii) is the use of a tailor-made linker.
  • a linker has two or more so-called anchor groups with which it can link the hydrophobin polypeptide sequence (i) and one or more effector molecules (ii).
  • an anchor group for (i) may be a thiol function by which the linker may form a disulfide bond with a cysteine residue of the polypeptide (i).
  • An anchor group for (ii) can be, for example, a carboxyl function, by means of which the linker can enter into an ester bond with a hydroxyl function of the effector molecule (ii).
  • linker used depends on the functionality to be coupled.
  • suitable molecules are those which couple to polypeptides (i) by means of sulfhydryl-reactive groups, for example maleimides, pyridyl disulfides, ⁇ -haloacetyls, vinyl sulfone and to effector molecules (ii) Sulfhydryl-reactive groups, for example maleimides, pydridyl disulfides, ⁇ -haloacetyls, vinyl sulfones) amine-reactive groups (eg succinimidyl esters, carbodiimde, hydroxymethyl-phosphine, imidoesters, PFP esters, etc.) sugars or oxidized sugar-reactive groups (eg hydrazides etc.) - carboxy-reactive groups (eg carbodiimides etc.) hydroxyl-reactive groups (eg isocyanates etc.) thymine-reactive groups (eg psoralen etc
  • Antibodies and fragments e.g., single-chain antibodies, F (ab) fragments of antibodies, catalytic antibodies.
  • a direct coupling between active / effect substance and the keratin binding domain can be e.g. by means of carbodiimides, glutaric dialdehyde or other crosslinkers known to the person skilled in the art.
  • the linker may be stable, thermo gapable, photocleavable or enzymatically cleavable (especially by lipases, esterases, proteases, phosphatases, hydrolases, etc.). Corresponding chemical structures are known to the person skilled in the art and are integrated between the moieties (i) and (ii).
  • novel keratin-binding hydrophobin effector molecules have a wide field of application in human cosmetics, in particular skin and hair care, animal care.
  • the keratin-binding hydrophobin effector molecules according to the invention are preferably used for dermal, nail and hair cosmetics. They allow a high concentration and long duration of action of skin, nail and hair care or skin, nail and hair protecting effector.
  • Suitable auxiliaries and additives for the production of hair cosmetic or skin cosmetic preparations are familiar to the expert and can from manuals of cosmetics, such as Schrader, bases and formulations of cosmetics, Weghig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1, taken become.
  • the cosmetic agents according to the invention may be skin-cosmetic, hair-cosmetic, dermatological, hygienic or pharmaceutical agents.
  • the agents according to the invention are preferably in the form of a gel, foam, spray, ointment, cream, emulsion, suspension, lotion, milk or paste. If desired, liposomes or microspheres can also be used.
  • the cosmetically or pharmaceutically active agents according to the invention may additionally contain cosmetically and / or dermatologically active agents as well as excipients.
  • the cosmetic compositions according to the invention contain at least one hydrophobin polypeptide sequence (i) as defined above, and at least one different constituent selected from cosmetically active substances, emulsifiers, surfactants, preservatives, perfume oils, thickeners,
  • Typical thickeners in such formulations are crosslinked polyacrylic acids and their derivatives, polysaccharides and their derivatives, such as xanthan gum, agar-agar, alginates or tyloses, cellulose derivatives, e.g. Carboxymethylcellulose or hydroxycarboxymethylcellulose, fatty alcohols, monoglycerides and fatty acids, polyvinyl alcohol and polyvinylpyrrolidone.
  • Nonionic thickeners are preferably used.
  • Suitable cosmetically and / or dermatologically active substances are, for example, coloring agents, skin and hair pigmenting agents, tinting agents, suntanning agents, bleaching agents, keratin-hardening substances, antimicrobial agents, light filter active ingredients, repellent active ingredients, hyperemic substances, keratolytic and keratoplasmic substances, antidandruff active ingredients, Antiphlogistics, keratinizing substances, antioxidants or radical scavengers active ingredients, skin moisturizing or moisturizing substances, moisturizing agents, anti-erythematous or anti-allergic active ingredients and mixtures thereof.
  • Artificial skin tanning agents which are suitable for tanning the skin without natural or artificial UV rays are, for example, dihydroxyacetone, alloxan and walnut shale extract.
  • Suitable keratin-hardening substances are as a rule active substances, as are also used in antiperspirants, for example potassium aluminum sulfate, aluminum hydroxychloride, aluminum lactate, etc.
  • Antimicrobial agents are used to destroy microorganisms or to inhibit their growth and thus serve both as a preservative and as a deodorizing substance, which reduces the formation or intensity of body odor.
  • These include e.g. conventional preservatives known to those skilled in the art, such as p-hydroxybenzoic acid esters, imidazolidinyl urea, formaldehyde, sorbic acid, benzoic acid, salicylic acid, etc.
  • deodorizing substances are e.g. Zinc ricinoleate, triclosan, undecylenic acid alkylolamides, citric acid triethyl ester, chlorhexidine etc.
  • Suitable light filter active substances are substances which absorb UV rays in the UV-B and / or UV-A range.
  • Suitable UV filters are e.g. 2,4,6-triaryl-1,3,5-triazines in which the aryl groups can each bear at least one substituent, which is preferably selected from hydroxy, alkoxy, especially methoxy, alkoxycarbonyl, especially methoxycarbonyl and ethoxycarbonyl and mixtures thereof.
  • substituent which is preferably selected from hydroxy, alkoxy, especially methoxy, alkoxycarbonyl, especially methoxycarbonyl and ethoxycarbonyl and mixtures thereof.
  • p-aminobenzoic acid esters cinnamic acid esters, benzophenones, camphor derivatives and UV-radiation-stopping pigments, such as titanium dioxide, talc and zinc oxide.
  • Suitable repellent agents are compounds which are able to prevent or expel certain animals, in particular insects, from humans. These include, for example, 2-ethyl-1, 3-hexanediol, N, N-diethyl-m-toluamide, etc.
  • Suitable hyperemic substances which stimulate the circulation of the skin are, for example, essential oils, such as mountain pine extract, lavender extract, rosemary extract, juniper berry extract, Horse chestnut extract, birch leaf extract, hay flower extract, ethyl acetate, camphor, menthol, peppermint oil, rosemary extract, eucalyptus oil, etc.
  • Suitable keratolytic and keratoplastic substances are, for example, salicylic acid, calcium thioglycolate, thioglycollic acid and its salts, sulfur, etc.
  • Suitable antidandruff active substances are, for example, sulfur Sulfur polyethylene glycol sorbitan monooleate, sulfur ricinol polyethoxylate, zinc pyrithione, aluminum pyrithione, etc.
  • Suitable antiphlogistic agents which counteract the effects on the skin are, for example, allantoin, bisabolol, dragosantol, chamomile extract, panthenol, etc.
  • the cosmetic agents according to the invention may contain as cosmetic and / or pharmaceutical active ingredient (as well as optionally as adjuvant) at least one cosmetically or pharmaceutically acceptable polymer which differs from the polymers which form the polyelectrolyte complex used according to the invention.
  • cosmetically or pharmaceutically acceptable polymer which differs from the polymers which form the polyelectrolyte complex used according to the invention.
  • These include, in general, cationic, amphoteric and neutral polymers.
  • Suitable polymers are e.g. cationic polymers called polyquaternium according to INCI, e.g. Copolymers of vinylpyrrolidone / N-vinylimidazolium salts (Luviquat FC, Luviquat HM, Luviquat MS, Luviquat & commat, Care), copolymers of N-vinylpyrrolidone / dimethylaminoethyl methacrylate, quaternized with diethyl sulfate (Luviquat PQ 11), copolymers of N-vinylcaprolactam / N-vinylpyrrolidone / N-vinylimidazolium salts (Luviquat E Hold), cationic cellulose derivatives (polyquaternium-4 and -10), acrylamidocopolymers (Polyquatemium-7) and chitosan.
  • polyquaternium cationic polymers called polyquaternium according to INCI,
  • Suitable cationic (quaternized) polymers are also merquat (dimethyldiallylammonium chloride based polymer), gafquat (quaternary polymers formed by reaction of polyvinylpyrrolidone with quaternary ammonium compounds), polymer JR (hydroxyethylcellulose with cationic groups), and plant based cationic polymers, e.g. Guarpolymers, such as the Jaguar brands of Rhodia.
  • polystyrene resins are also neutral polymers, such as polyvinylpyrrolidones, copolymers of N-vinylpyrrolidone and vinyl acetate and / or vinyl propionate, polysiloxanes, polyvinylcaprolactam and other copolymers with N-vinylpyrrolidone, polyethylenimines and their salts, polyvinylamines and their salts, cellulose derivatives, Polyasparaginic acid salts and derivatives.
  • neutral polymers such as polyvinylpyrrolidones, copolymers of N-vinylpyrrolidone and vinyl acetate and / or vinyl propionate, polysiloxanes, polyvinylcaprolactam and other copolymers with N-vinylpyrrolidone, polyethylenimines and their salts, polyvinylamines and their salts, cellulose derivatives, Polyasparaginic acid salts and derivatives.
  • Suitable polymers are also nonionic, water-soluble or water-dispersible polymers or oligomers, such as polyvinylcaprolactam, e.g. Luviskol 0 Plus (BASF), or polyvinylpyrrolidone and their copolymers, in particular with vinyl esters, such as vinyl acetate, e.g. Luviskol 0 VA 37 (BASF), polyamides, e.g. based on itaconic acid and aliphatic diamines, e.g. in DE-A-43 33 238 are described.
  • polyvinylcaprolactam e.g. Luviskol 0 Plus (BASF)
  • BASF Luviskol 0 VA 37
  • polyamides e.g. based on itaconic acid and aliphatic diamines, e.g. in DE-A-43 33 238 are described.
  • Suitable polymers are also amphoteric or zwitterionic polymers, such as the octylacrylamide / methyl methacrylate / tert.-butylaminoethyl methacrylate-hydroxypropyl methacrylate copolymers available under the names Amphomer (National Starch) and zwitterionic polymers, as described, for example, in the German patent application. fertil DE39 29 973, DE 21 50 557, DE 28 17 369 and DE 3708 451 are disclosed. Acrylamidopropyltrimethylannnnoniunnchlorid / acrylic acid respectively. Methacrylic acid copolymers and their alkali metal and ammonium salts are preferred zwitterionic polymers.
  • zwitterionic polymers are methacroylethylbetaine / methacrylate copolymers, which are commercially available under the name Amersette (AMERCHOL), and copolymers of hydroxyethyl methacrylate, methyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and acrylic acid (Jordapon (D)).
  • Suitable polymers are also nonionic, siloxane-containing, water-soluble or -dispersible polymers, e.g. Polyether siloxanes, such as Tegopren 0 (Goldschmidt) or Besi & commat (Wacker).
  • Polyether siloxanes such as Tegopren 0 (Goldschmidt) or Besi & commat (Wacker).
  • the formulation base of pharmaceutical agents according to the invention preferably contains pharmaceutically acceptable excipients.
  • Pharmaceutically acceptable excipients which are known in the pharmaceutical, food technology and related fields, in particular those listed in relevant pharmacopoeias (eg DAB Ph. Eur. BP NF) and other excipients whose properties do not preclude physiological application.
  • Suitable auxiliaries may be: lubricants, wetting agents, emulsifying and suspending agents, preserving agents, antioxidants, anti-irritants, chelating agents, emulsion stabilizers, film formers, gelling agents, odor masking agents, resins, hydrocolloids, solvents, solubilizers, neutralizing agents, permeation accelerators, pigments, quaternary ammonium compounds, Rest grease and superfatting agents, ointment, cream or oil bases, silicone derivatives, stabilizers, sterilants, blowing agents, drying agents, opacifiers, thickeners, waxes, softeners, white oil.
  • a related embodiment is based on expert knowledge, as for example in Fiedler, H. P. Lexicon of excipients for pharmacy, cosmetics and related fields, 4th ed., Aulendorf: ECV Editio Kantor Verlag, 1996, are shown.
  • the active ingredients may be mixed or diluted with a suitable excipient (excipient).
  • Excipients may be solid, semi-solid or liquid materials which may serve as a vehicle, carrier or medium for the active ingredient. If desired, the admixing of further auxiliaries takes place in the manner known to the person skilled in the art.
  • the polymers and dispersions are suitable as auxiliaries in pharmacy, preferably as or in Coating agent (s) or binder (s) for solid dosage forms. They can also be used in creams and as tablet coatings and tablet binders.
  • the agents according to the invention are a skin cleanser.
  • Preferred skin cleansing agents are soaps of liquid to gelatinous consistency, such as transparent soaps, luxury soaps, deep soaps, cream soaps, baby soaps, skin soaps, abrasive soaps and syndets, pasty soaps, greases and washes, liquid detergents, bath and shower preparations such as washing lotions, shower baths and gels, bubble baths, oil baths and scrub preparations, shaving creams, lotions and creams.
  • the agents according to the invention are cosmetic agents for the care and protection of the skin, nail care preparations or preparations for decorative cosmetics.
  • Suitable skin cosmetic agents are e.g. Face lotions, face masks, deodorants and other cosmetic lotions.
  • Means for use in decorative cosmetics include, for example, masking pens, theatrical paints, mascara and eye shadows, lipsticks, kohl pencils, eyeliners, rouges, powders, and eyebrow pencils.
  • hydrophobin polypeptide sequences (i) can be used in nasal strips for pore cleansing, in anti-acne agents, repellents, shaving agents, hair removers, personal care products, foot care products and in baby care.
  • the skin care compositions according to the invention are in particular W / O or O / W skin creams, day and night creams, eye creams, face creams, anti-wrinkle creams, moisturizing creams, bleaching creams, vitamin creams, skin lotions, skin lotions and moisturizing lotions.
  • Skin cosmetic and dermatological compositions based on the above-described polyelectrolyte complexes show advantageous effects.
  • the polymers can contribute to the moisturizing and conditioning of the skin and to the improvement of the skin feel.
  • the polymers may also act as thickeners in the formulations.
  • By adding the polymers of the invention can be achieved in certain formulations, a significant improvement in skin compatibility.
  • Skin cosmetic and dermatological agents preferably contain at least one hydrophobin polypeptide sequence (i) in a proportion of about 0.000001 to 10% by weight, preferably 0.0001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • Particularly light stabilizers based on the hydrophobin polypeptide sequences (i) have the property to increase the residence time of the UV-absorbing ingredients in comparison to conventional adjuvants such as polyvinylpyrrolidone.
  • compositions according to the invention may be in a form suitable for skin care, such as e.g. as a cream, foam, gel, pen, mousse, milk, spray (pump spray or propellant spray) or lotion can be applied.
  • skin care such as e.g. as a cream, foam, gel, pen, mousse, milk, spray (pump spray or propellant spray) or lotion can be applied.
  • the skin cosmetic preparations may contain other active ingredients and adjuvants customary in skin cosmetics, as described above. These preferably include emulsifiers, preservatives, perfume oils, cosmetic active ingredients such as phytantriol, vitamins A, E and C, retinol, bisabolol, panthenol, light stabilizers, bleaching agents, colorants, tinting agents, tanning agents, collagen, protein hydrolysates, stabilizers, pH regulators , Dyes, salts, thickeners, gelling agents, bodying agents, silicones, humectants, moisturizers and other common additives.
  • active ingredients and adjuvants customary in skin cosmetics, as described above. These preferably include emulsifiers, preservatives, perfume oils, cosmetic active ingredients such as phytantriol, vitamins A, E and C, retinol, bisabolol, panthenol, light stabilizers, bleaching agents, colorants, tinting agents, tanning agents, collagen, protein hydrolys
  • Preferred oil and fat components of the skin cosmetic and dermatological agents are the aforementioned mineral and synthetic oils, e.g. Paraffins, silicone oils and aliphatic hydrocarbons having more than 8 carbon atoms, animal and vegetable oils, such as e.g. Sunflower oil, coconut oil, avocado oil, olive oil, lanolin, or waxes, fatty acids, fatty acid esters, e.g. Triglycerides of C6-C30 fatty acids, wax esters, e.g. Jojoba oil, fatty alcohols, vaseline, hydrogenated lanolin and acetylated lanolin, and mixtures thereof.
  • mineral and synthetic oils e.g. Paraffins, silicone oils and aliphatic hydrocarbons having more than 8 carbon atoms
  • animal and vegetable oils such as e.g. Sunflower oil, coconut oil, avocado oil, olive oil, lanolin, or waxes, fatty acids, fatty acid esters, e.g. Triglycerides of C6-C30
  • hydrophobin polypeptide sequences (i) according to the invention can also be mixed with conventional polymers if special properties are to be set.
  • the skin-cosmetic and dermatological preparations can be used. additionally contain conditioning substances based on silicone compounds.
  • Suitable silicone compounds are, for example, polyalkylsiloxanes, polyarylsiloxanes, polyarylalkylsiloxanes, polyethersiloxanes or silicone resins.
  • the preparation of the cosmetic or dermatological preparations is carried out by customary methods known to the person skilled in the art.
  • the cosmetic and dermatological agents are preferably in the form of emulsions, in particular as water-in-oil (W / O) or oil-in-water (O / W) emulsions.
  • formulations for example hydrolispersions, gels, oils, oleogels, multiple emulsions, for example in the form of W / O / W or O / W / O emulsions, anhydrous ointments or ointment bases, etc.
  • Emulsions are prepared by known methods.
  • the emulsions contain, in addition to at least one hydrophobin polypeptide sequence (i), as a rule, customary constituents, such as fatty alcohols, fatty acid esters and, in particular, fatty acid triglycerides, fatty acids, lanolin and derivatives thereof, natural or synthetic oils or waxes and emulsifiers in the presence of water.
  • customary constituents such as fatty alcohols, fatty acid esters and, in particular, fatty acid triglycerides, fatty acids, lanolin and derivatives thereof, natural or synthetic oils or waxes and emulsifiers in the presence of water.
  • a suitable emulsion e.g. for a skin cream, etc.
  • a suitable emulsion generally contains an aqueous phase which is emulsified by means of a suitable emulsifier system in an oil or fat phase.
  • a polyelectrolyte complex can be used.
  • Preferred fat components which may be included in the fat phase of the emulsions are: hydrocarbon oils such as paraffin oil, purcellin oil, perhydrosqualene and solutions of microcrystalline waxes in these oils; animal or vegetable oils, such as sweet almond oil, avocado oil, calophilum oil, lanolin and derivatives thereof, castor oil, seed oil, olive oil, jojoba oil, karite oil, hoplostethus oil, mineral oils whose distillation begins under atmospheric pressure at about 250.degree distillation end at 410 ° C, such as Vaselineöl, esters of saturated or unsaturated fatty acids, such as alkyl myristates, for example i-propyl, butyl or Cetylmyristat, hexadecyl, ethylene or i-propyl palmitate, octanoic or Decankladriglyceride and Cetylricinoleat.
  • hydrocarbon oils such as paraffin oil, purcellin oil, perhydrosqualen
  • the fat phase may also contain other oil-soluble silicone oils, such as dimethylpolysiloxane, methylphenylpolysiloxane and the silicone glycol copolymer, fatty acids and fatty alcohols.
  • oil-soluble silicone oils such as dimethylpolysiloxane, methylphenylpolysiloxane and the silicone glycol copolymer, fatty acids and fatty alcohols.
  • waxes may also be used, e.g. Carnauba wax, candililla wax, beeswax, microcrystalline wax, ozokerite wax and Ca, Mg and Al oleates, myristates, linoleates and stearates.
  • an emulsion of the invention may be present as O / W emulsion.
  • Such an emulsion usually contains an oil phase, emulsifiers which stabilize the oil phase in the water phase, and an aqueous phase, which is usually thickened.
  • Suitable emulsifiers are preferably O / W emulsifiers, such as polyglycerol esters, sorbitan esters or partially esterified glycerides into consideration.
  • the agents according to the invention are a shower gel, a shampoo formulation or a bathing preparation.
  • Such formulations contain at least one hydrophobin polypeptide sequence (i) as well as usually anionic surfactants as base surfactants and amphoteric and / or nonionic surfactants as cosurfactants.
  • suitable active ingredients and / or adjuvants are generally selected from lipids, perfume oils, dyes, organic acids, preservatives and antioxidants and thickeners / gelling agents, skin conditioners and moisturizers.
  • formulations preferably contain from 2 to 50% by weight, preferably from 5 to 40% by weight, particularly preferably from 8 to 30% by weight of surfactants, based on the total weight of the formulation.
  • anionic surfactants are, for example, alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkyl sulfonates, alkylaryl sulfonates, alkyl succinates, alkyl sulfosuccinates, N-alkoxy sarcosinates, acyl taurates, acyl isothionates, alkyl phosphates, alkyl ether phosphates, alkyl ether carboxylates, alpha-olefin sulfonates, in particular the alkali metal and alkaline earth metal salts, for example sodium, potassium , Magnesium, calcium, as well as ammonium and triethanolamine salts.
  • alkali metal and alkaline earth metal salts for example sodium, potassium , Magnesium, calcium, as well as ammonium and triethanolamine salts.
  • the alkyl ether sulfates, alkyl ether phosphates and alkyl ether carboxylates can have between 1 to 10 ethylene oxide or propylene oxide units, preferably 1 to 3 ethylene oxide units in the molecule. These include, for example, sodium lauryl sulfate, ammonium tauryl sulfate, sodium lauryl ether sulfate, ammonium lauryl ether sulfate, sodium lauryl sarcosinate, sodium oleyl succinate, ammonium lauryl sulfosuccinate, sodium dodecylbenzenesulfonate and triethanolamine dodecylbenzene sulfonate.
  • Suitable amphoteric surfactants are e.g. Alkylbetaines, alkylamidopropylbetaines, alkylsulfobetaines, alkylglycinates, alkylcarboxyglycinates, alkylamphoacetates or -propionates, alkylamphodiacetates or -dipropionates.
  • cocodimethylsulfopropyl betaine cocodimethylsulfopropyl betaine, lauryl betaine, cocamidopropyl betaine or sodium cocamphopropionate can be used.
  • Suitable nonionic surfactants are, for example, the reaction products of aliphatic alcohols or alkylphenols having 6 to 20 C atoms in the alkyl chain, which may be linear or branched, with ethylene oxide and / or propylene oxide.
  • the amount of alkylene oxide is about 6 to 60 moles per mole of alcohol.
  • alkylamine oxides, mono- or dialkylalkanolamides, fatty acid esters of polyethylene glycols, ethoxylated fatty acid amides, alkylpolyglycosides or sorbitan ether esters are also suitable.
  • washing, showering and bathing preparations may contain conventional cationic surfactants, such as e.g. quaternary ammonium compounds, for example cetyltrimethylammonium chloride.
  • conventional cationic surfactants such as e.g. quaternary ammonium compounds, for example cetyltrimethylammonium chloride.
  • shower gel / shampoo formulations thickeners such as sodium chloride, PEG-55 propylene glycol oleate, PEG-120 methylglucose dioleate and others, so-as preservatives, other active 'and auxiliaries and water.
  • the invention appropriate means to a hair treatment agent.
  • Hair treatment agents according to the invention preferably contain at least one hydrophobin polypeptide sequence (i) in an amount in the range of about 0.000001 to 10% by weight, preferably 0.00001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the hair treatment compositions of the present invention are in the form of a mousse, hair mousse, hair gel, shampoo, hair spray, hair mousse, top fluid, perming, hair dyeing and bleaching or hot oil treatments.
  • the hair cosmetic preparations can be applied as (aerosol) spray, (aerosol) foam, gel, gel spray, cream, lotion or wax.
  • Hairsprays include both aerosol sprays and pump sprays without propellant gas.
  • Hair foams include both aerosol foams and pump foams without propellant gas.
  • Hair sprays and hair foams preferably comprise predominantly or exclusively water-soluble or water-dispersible components.
  • the compounds used in the hair sprays and hair foams according to the invention are water-dispersible, they can be used in the form of aqueous microdispersions with particle diameters of usually from 1 to 350 nm, preferably from 1 to 250 nm.
  • the solids contents of these preparations are usually in a range of about 0.5 to 20 wt .-%.
  • these microdispersions do not require emulsifiers or surfactants for their stabilization.
  • the hair cosmetic formulations according to the invention contain in a preferred embodiment a) 0.000001 to 10% by weight of at least one hydrophobin polypeptide sequence (i), b) 20 to 99.95% by weight of water and / or alcohol, c) 0 to 50% by weight of at least one propellant, d) 0 to 5% by weight of at least one emulsifier, e) 0 to 3% by weight of at least one thickener and up to 25% by weight of further constituents.
  • alcohol By alcohol are meant all alcohols customary in cosmetics, e.g. Ethanol, isopropanol, n-propanol.
  • Further constituents are understood to mean the additives customary in cosmetics, for example propellants, defoamers, surface-active compounds, ie surfactants, emulsifiers, foaming agents and solubilizers.
  • the interface used active compounds may be anionic, cationic, amphoteric or neutral.
  • Further customary constituents may also be, for example, preservatives, perfume oils, opacifiers, active ingredients, UV filters, care substances such as panthenol, collagen, vitamins, protein hydrolysates, alpha- and beta-hydroxycarboxylic acids, stabilizers, pH regulators, dyes, viscosity regulators, gel formers, Salts, humectants, greases, complexing agents and other common additives.
  • this includes all known in cosmetics styling and conditioner polymers, which can be used in combination with the hydrophobin polypeptide sequences (i) according to the invention, if very special properties are to be set.
  • Suitable conventional hair cosmetic polymers are, for example, the abovementioned cationic, anionic, neutral, nonionic and amphoteric polymers, to which reference is made here.
  • the preparations may additionally contain conditioning substances based on silicone compounds.
  • Suitable silicone compounds are, for example, polyalkylsiloxanes, polyarylsiloxanes, polyarylalkylsiloxanes, polyethersiloxanes, silicone resins or dimethicone copolyols (CTFA) and amino-functional silicone compounds such as amodimethicones (CTFA).
  • the polymers according to the invention are suitable in particular as setting agents in hairstyling preparations, in particular hairsprays (aerosol sprays and pump sprays without propellant gas) and hair foams (aerosol foams and pump foams without propellant gas).
  • spray formulations contain a) 0.000001 to 10% by weight of at least one hydrophobin polypeptide sequence (i), b) 90 to 99.9% by weight of water and / or alcohol, c) 0 to 70 Wt .-% of at least one blowing agent, d) 0 to 20 wt .-% further ingredients.
  • Blowing agents are the blowing agents commonly used for hairsprays or aerosol foams. Preference is given to mixtures of propane / butane, pentane, dimethyl ether, 1,1-difluoroethane (HFC-152a), carbon dioxide, nitrogen or compressed air.
  • a preferred formulation for aerosol hair foams according to the invention contains a) 0.000001 to 10% by weight of at least one hydrophobin polypeptide sequence (i), b) 90 to 99.9% by weight of water and / or alcohol, c) 5 to 20% by weight of a propellant, d) 0 , 1 to 5 wt .-% of an emulsifier, e) 0 to 10 wt .-% further constituents.
  • emulsifiers all emulsifiers commonly used in hair foams can be used. Suitable emulsifiers may be nonionic, cationic or anionic or amphoteric.
  • nonionic emulsifiers are Laurethe, e.g. Laureth-4; Cetethe, e.g. Cetheth-1, polyethylene glycol cetyl ether, ceteareth, e.g. Cethetereth-25, polyglycol fatty acid glycerides, hydroxylated lecithin, lactyl esters of fatty acids, alkylpolyglycosides.
  • cationic emulsifiers are cetyldimethyl-2-hydroxyethylammonium dihydrogenphosphate, cetyltrimonium chloride, cetyltrimmonium bromide, cocotrimonium methylsulfate, quaternium-1 to x (INCI).
  • Anionic emulsifiers may, for example, be selected from the group of alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkyl sulfonates, alkylaryl sulfonates, alkyl succinates, alkyl sulfosuccinates, N-alkoyl sarcosinates, acyl taurates, acyl isethionates, alkyl phosphates, alkyl ether phosphates, alkyl ether carboxylates, alpha olefin sulfonates, especially the alkali and alkaline earth metal salts, e.g.
  • alkyl ether sulfates, alkyl ether phosphates and alkyl ether carboxylates can have between 1 to 10 ethylene oxide or propylene oxide units, preferably 1 to 3 ethylene oxide units in the molecule.
  • a preparation suitable for styling gels according to the invention can be composed, for example, as follows: a) 0.000001 to 10% by weight of at least one hydrophobin polypeptide sequence (i), b) 80 to 99.85% by weight of water and / or Alcohol, c) 0 to 3 wt .-%, preferably 0.05 to 2 wt .-%, of a gelling agent, d) 0 to 20 wt .-% further ingredients.
  • hydrophobin polypeptide sequences (i) used according to the invention are already “self-thickening", so that in many cases the use of gelling agents can be dispensed with in the preparation of gels. Their use, however, may be advantageous to adjust for specific rheological or other performance properties of the gels.
  • gel formers all in the cosmetics commonly used gel former.
  • polyacrylic acid for example carbomer (INCI)
  • cellulose derivatives for example hydroxypropylcellulose, hydroxyethylcellulose, cationically modified celluloses
  • polysaccharides for example xanthan gum, caprylic / capric triglyceride, sodium acrylate copolymers
  • polyquaternium-32 and) paraffin liquid (INCI)
  • Sodium acrylate copolymers and) Paraffin Liquidum (and) PPG-1 trideceth-6, acrylamidopropyltrimonium chloride / acrylamide copolymers, steareth-10-allyl ethers, acrylate copolymers
  • hydrophobin polypeptide sequences (i) according to the invention can be used as conditioners in cosmetic preparations.
  • a formulation containing the hydrophobin polypeptide sequences (i) according to the invention can preferably be used in shampoo formulations as a setting and / or conditioning agent.
  • Preferred shampoo formulations comprise a) 0.000001 to 10% by weight of at least one hydrophobin polypeptide sequence (i), b) 25 to 94.95% by weight of water, c) 5 to 50% by weight of surfactants, c) 0 to 5% by weight of a further conditioning agent, d) 0 to 10% by weight of further cosmetic constituents.
  • Suitable anionic surfactants are, for example, alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkyl sulfonates, alkyl aryl sulfonates, alkyl succinates, alkyl sulfosuccinates,
  • the alkyl ether sulfates, alkyl ether phosphates and alkyl ether carboxylates can have between 1 to 10 ethylene oxide or propylene oxide units, preferably 1 to 3 ethylene oxide units in the molecule.
  • Suitable examples are sodium lauryl sulfate, ammonium lauryl sulfate, sodium lauryl ether sulfate, ammonium lauryl ether sulfate, sodium lauroyl sarcosinate, sodium oleyl succinate, ammonium lauryl sulfosuccinate, sodium dodecylbenzenesulfonate and triethanolamine dodecylbenzenesulfonate.
  • Suitable amphoteric surfactants are, for example, alkylbetaines, alkylamidopropylbetaines, alkylsulfobetaines, alkylglycinates, alkylcarboxyglycinates, alkylamphoacetates or -propionates, alkylamphodiacetates or -dipropionates.
  • cocodimethylsulfopropyl betaine cocodimethylsulfopropyl betaine, lauryl betaine, cocamidopropyl betaine or sodium cocamphopropionate can be used.
  • nonionic surfactants are the reaction products of aliphatic alcohols or alkylphenols having 6 to 20 C atoms in the alkyl chain, which may be linear or branched, with ethylene oxide and / or propylene oxide.
  • the amount of alkylene oxide is about 6 to 60 moles per mole of alcohol.
  • alkylamine oxides, mono- or dialkylalkanolamides, fatty acid esters of polyethylene glycols, alkylpolyglycosides or sorbitan ether esters are also suitable.
  • the shampoo formulations may contain conventional cationic surfactants, e.g. quaternary ammonium compounds, for example cetyltrimethylammonium chloride.
  • conventional cationic surfactants e.g. quaternary ammonium compounds, for example cetyltrimethylammonium chloride.
  • Conventional conditioning agents in combination with the hydrophobin polypeptide sequences (i) can be used in the shampoo formulations to achieve certain effects.
  • cationic polymers with the name Polyquaternium according to INCI, in particular copolymers of vinylpyrrolidone / N-vinylimidazolium salts (Luviquat FC, Luviquat & commat, HM, Luviquat MS, Luviquat Care), copolymers of N-vinylpyrrolidone / dimethylaminoethyl methacrylate, quaternized with diethyl sulfate ( Luviquat D PQ 11), copolymers of N-vinylcaprolactam / N-vinylpyrrolidone / N-vinylimidazolium salts (Luviquat D Hold), cationic cellulose derivatives (Polyquaternium-4 and -10), acrylamide copolymers (Polyquaternium-7).
  • protein hydrolysates can be used, as well as conditioning substances based on silicone compounds, for example polyalkylsiloxanes, polyarylsiloxanes, polyarylalkylsiloxanes, polyethersiloxanes or silicone resins.
  • silicone compounds for example polyalkylsiloxanes, polyarylsiloxanes, polyarylalkylsiloxanes, polyethersiloxanes or silicone resins.
  • suitable silicone compounds are dimethicone copolyols (CTFA) and amino-functional silicone compounds such as amodimethicones (CTFA).
  • CTFA dimethicone copolyols
  • amino-functional silicone compounds such as amodimethicones
  • cationic guar derivatives such as guar hydroxypropyltrimonium chloride (INCI) can be used.
  • this hair cosmetic or skin cosmetic preparation is for the care or protection of the skin or hair and is in the form of an emulsion, a dispersion, a suspension, an aqueous surfactant preparation, a milk, a lotion, a cream, a balm, an ointment, gel, granule, powder, stick preparation, such as a lipstick, foam, aerosol or spray.
  • emulsions are oil-in-water emulsions and water-in-oil emulsions or microemulsions.
  • the hair cosmetic or skin cosmetic preparation is used for application on the skin (topically) or hair.
  • Topical preparations are to be understood as meaning those preparations which are suitable for applying the active ingredients to the skin in fine distribution and preferably in a form absorbable by the skin.
  • aqueous and aqueous-alcoholic solutions sprays, foams, foam aerosols, ointments, aqueous gels, emulsions of the O / W or W / O type, microemulsions or cosmetic stick preparations.
  • the agent contains a carrier.
  • a carrier is water, a gas, a water-based liquid, an oil, a gel, an emulsion or a microemulsion, a dispersion or a mixture thereof.
  • the mentioned carriers show good skin tolerance.
  • Particularly advantageous for topical preparations are aqueous gels, emulsions or microemulsions.
  • Nonionic surfactants, zwitterionic surfactants, ampholytic surfactants or anionic emulsifiers can be used as emulsifiers.
  • the emulsifiers may be present in the composition according to the invention in amounts of 0.1 to 10, preferably 1 to 5 wt .-%, based on the composition.
  • a surfactant of at least one of the following groups may be used:
  • Alkyl mono- and oligoglycosides having 8 to 22 carbon atoms in the alkyl radical and their ethoxylated analogs
  • Polyol and especially polyglycerol esters e.g. Polyglycerinpolyricinoleat, Polygl ycerinpoly-12-hydroxystearat or Polyglycerindimerat. Also suitable are mixtures of compounds of several of these classes of substances;
  • Partial esters based on linear, branched, unsaturated or saturated C 6/22 fatty acids, ricinoleic acid and 12-hydroxystearic acid and glycerol, polyglycerol, pentaerythritol, dipentaerythritol, sugar alcohols (eg sorbitol), alkyl glucosides (eg methyl glucoside, Butyl glucoside, lauryl glucoside) as well as polyglucosides (eg cellulose);
  • zwitterionic surfactants can be used as emulsifiers.
  • Zwitterionic surfactants are surface-active compounds which have at least one quaternary ammonium group and at least one carbene in the molecule. carry boxylate or a sulfonate group.
  • Particularly suitable zwitterionic surfactants are the so-called betaines, such as N-alkyl-N, N-dimethylammonium glycinates, for example cocoalkyldimethylammonium glycinate, N-acylamino-propyl-N, N-dimethylammonium glycinates, for example cocoacylaminopropyldimethylammonium glycinate, and Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethylimidazolines having in each case 8 to 18 carbon atoms in the alkyl or acyl group and the Kokosacylaminoethylhydro- xyethyl-carboxymethylglycinat.
  • Particularly preferred is the known under the CTFA name Cocamidopropyl Betaine fatty acid amide derivative.
  • ampholytic surfactants are surface-active compounds which, apart from a C 8, i 8 alkyl or acyl group in the molecule at least one free amino group and at least one -COOH or -S0 3 H group and are capable of forming inner salts .
  • suitable ampholytic surfactants are N-alkylglycines, N-alkylpropionic acids, N-alkylamino-butanoic acids, N-alkyliminodipropionic acids, N-hydroxyethyl-N-alkylamido-propylglycines, N-alkyltaurines, N alkylsarcosines, 2-alkylaminopropionic acids and alkylaminoacetic acids each having about 8 to 18 C atoms in the alkyl group.
  • ampholytic surfactants are N-cocoalkylaminopropionate, cocoacylaminoethyl aminopropionate and C i 2 / i 8 acyl sarcosine.
  • quaternary emulsifiers are also suitable, with those of the esterquat type, preferably methyl-quaternized difatty acid triethanolamine ester salts, being particularly preferred. It is also possible to use, as anionic emulsifiers, alkyl ether sulfates, monoglyceride sulfates, fatty acid sulfates, sulfosuccinates and / or ether carboxylic acids.
  • Suitable oil components are Guerbet alcohols based on fatty alcohols having 6 to 18, preferably 8 to 10 carbon atoms, esters of linear C 6 -C 22 fatty acids with linear C 6 -C 22 -Fettaikohoien, esters of branched C 6 -C 3 - Carboxylic acids with linear C 6 - C 22 -FeUaI koholen, esters of linear C 6 -C 22 fatty acids with branched alcohols, especially 2-ethylhexanol, esters of linear and / or branched fatty acids with polyhydric alcohols (such as propylene glycol, dimerdiol or trimer triol ) and / or Guerbet alcohols, triglycerides based on C 6 -C 10 -fatty acids, liquid mono- / di-, triglyceride mixtures based on C 6 -C 8 -fatty acids, esters of C 6 -C 22 -fatty alcohols and /
  • silicone oil compounds are silicone compounds, for example dimethylpolysiloxanes, methylphenylpolysiloxanes, cyclic silicones and also amino, fatty acid, alcohol, polyether, epoxy, fluorine, alkyl and / or glycoside-modified silicone compounds which may be both liquid and resinous at room temperature.
  • the oil particles may be present in the compositions according to the invention in amounts of from 1 to 90, preferably from 5 to 80, and in particular from 10 to 50,% by weight, based on the composition.
  • the duration of action on the skin can be significantly prolonged.
  • the coupling takes place as described above, formulation and application are carried out by methods known to the person skilled in the art.
  • Particularly suitable for deodorants are suitable effector molecules (ii): perfume oils, cyclodextrins, ion exchangers, zinc ricinoleate, germ-inhibiting / bacteriostatic compounds (for example DCMX, Irgasan DP 300, TCC).
  • Suitable antiperspirants are: tannins, and zinc / aluminum salts.
  • Another field of application for the substances according to the invention is the therapeutic or prophylactic use in certain diseases of the skin and mucous membranes.
  • viral diseases e.g., herpes, coxsackie, varicella zoster, cytomegalovirus, etc.
  • bacterial diseases e.g., TB, syphilis, etc.
  • fungal diseases e.g., Candida, Cryptococcus, Histoplasmosis, Aspergillus,
  • Mucormycosis, etc. - tumors (e.g., melanomas, adenomas, etc.)
  • Autoimmune diseases e.g., PEMPHIGUS VULGARIS, BULLOUS PEMPHIGOID, SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSA, etc.
  • Sunburn parasitic infestation eg ticks, mites, fleas etc.
  • insect contact eg blood-sucking insects such as Anopheles etc.
  • the substances suitable for therapy or prophylaxis eg corticoids, immunosuppressive compounds, antibiotics, antimycotics, anti-viral compounds, insect repellent, etc.
  • Keratin-binding polypeptides i) are coupled.
  • oligonucleotides Hal570 and Hal571 (HaI 572 / HaI 573) a polymerase chain reaction was carried out.
  • the PCR fragment obtained contained the coding sequence of the gene yaaD / yaaE from Bacillus subtilis, and at the ends in each case an NcoI or BglII restriction cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and cut with the restriction endonucleases NcoI and BglII.
  • This DNA fragment was used as insert, and cloned into the vector pQE60 from Qiagen, previously linearized with the restriction endonucleases NcoI and BglI.
  • the resulting vectors pQE60YAAD # 2 / pQE60YaaE # 5 can be used to express proteins consisting of, YAAD :: HIS 6 and YAAE :: HIS 6
  • Hal570 gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
  • Hal571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac
  • Hal572 ggccatgggattaacaataggtgtactagg
  • Hal573 gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
  • the oligonucleotides KaM 416 and KaM 417 Using the oligonucleotides KaM 416 and KaM 417, a polymerase chain reaction was carried out.
  • the template DNA used was genomic DNA of the mold Aspergillus nidulans.
  • the resulting PCR fragment contained the coding sequence of the hydrophobin gene dewA and an N-terminal factor Xa proteinase cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and cut with the restriction endonuclease Barn HI. This DNA fragment was used as insect, and in the previously linearized with the restriction endonuclease BgIII vector pQE60YAAD # 2 cloned.
  • the resulting vector # 508 can be used to express a fusion protein consisting of, YAAD :: Xa :: dewA :: HIS 6 .
  • KaM416 GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • plasmid # 513 The cloning of plasmid # 513 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 434 and KaM 435.
  • KaM434 GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
  • the cloning of plasmid # 507 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • the template DNA used was an artificially synthesized DNA sequence - hydrophobin BASF1 (see Appendix).
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • KaM418 CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
  • plasmid # 506 The cloning of plasmid # 506 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • template DNA an artificially synthesized DNA sequence - hydrophobin BASF2 - was used (see Appendix).
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • Plasmid # 526 was analogous to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM464 and KaM465.
  • the template DNA used was Schyzophyllum commune cDNA (see Appendix).
  • KaM464 CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
  • KaM465 GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
  • 100 g cell pellet (100-500 mg hydrophobin) are made up to 200 ml total volume with 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5 and resuspended.
  • the suspension is treated with an Ultraturrax type T25 (Janke and Kunkel, IKA-Labortechnik) for 10 minutes and then incubated for 1 hour at room temperature with 500 units of benzonase (Merck, Darmstadt, Order No. 1.01697.0001) to break down the nucleic acids.
  • filter with a glass cartridge P1.
  • two homogenizer runs are carried out at 1500 bar (Microfluidizer M-110EH, Microfluidics Corp.).
  • the homogenate is centrifuged (Sorvall RC-5B, GSA rotor, 250 ml centrifuge beaker, 60 minutes, 4 ° C, 12,000 rpm, 23,000 g), the supernatant placed on ice and the pellet resuspended in 100 ml sodium phosphate buffer, pH 7.5 , Centrifugation and resuspension are repeated 3 times with the sodium phosphate buffer containing 1% SDS at the third repetition. After resuspension, stir for one hour and carry out a final centrifugation (Sorvall RC-5B, GSA rotor, 250 ml centrifuge beaker, 60 minutes, 4 ° C, 12,000 rpm, 23,000 g).
  • the hydrophobin is contained in the supernatant after the final centrifugation ( Figure 1).
  • the experiments show that the hydrophobin is probably contained in the form of inclusion bodies in the corresponding E. coli cells.
  • 50 ml of the hydrophobin-containing supernatant are applied to a 50 ml nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 column (Amersham) equilibrated with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • the column is washed with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer and the hydrophobin is subsequently eluted with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer containing 200 mM imidazole.
  • the solution is dialyzed against 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • Lane 1 shows the purification of the hydrophobin according to the invention: Lane 1: application of nickel-Sepharose column (1:10 dilution)
  • Lanes 3 - 5 OD 280 maxima of the elution fractions
  • the inventive hydrophobin of Figure 1 has a molecular weight of about 53 kD.
  • the smaller bands partially represent degradation products of the hydrophobin.
  • the samples are air dried and the contact angle (in degrees) of a drop of 5 ⁇ l of water is determined. There are e.g. the following values:
  • the samples are air dried and the contact angle (in degrees) of a drop of 5 ⁇ l of water is determined.
  • the contact angle measurement was performed on a device Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). The measurement was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • TBS 2OmM Tris; 15 mM NaClpH 7.5
  • TTBS TBS + 0.05% Tween20
  • the first step is the transfer of the outer keratin layer from the skin to a stable carrier.
  • a transparent adhesive strip was firmly applied to depilated human skin and removed again.
  • the test can be carried out directly on the transparent adhesive strip or the adhering keratin layer can be transferred to a glass slide by re-adhering.
  • the binding was detected as follows: for incubation with the various reagents, transfer into a Falcon vessel, if necessary addition of ethanol for degreasing, removal of ethanol and drying of the slides
  • the amount of absorption indicates the amount of bound hydrophobin or control protein.
  • comparative protein e.g. YaaD from B. subtilis, which also had a His tag for detection as needed for this test.
  • His tag instead of the His tag, other specific antibodies conjugated to peroxidase may also be used.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS phosphate buffered saline
  • Tween 20 polyoxyethylene sorbitan monolaureate
  • TMB 3,5,3, 1 O 1 tetramethylbenzidine
  • hydrophobin-based binding test on hair showed a clear superiority of the binding of hydrophobin to hair compared to a substantially poorer binding of the control protein YaaD:
  • Table 1 Quantitative Hydrophobin Activity Test Hair: 1) Buffer; 2) comparative protein yaad; 3) hydrophobin.
  • the table shows the measured absorbance values at 405 nm.
  • Analogous to Example 11 (binding to the skin) the binding to the mucous membrane can also be measured by taking a sample of mucous membrane (for example human oral mucosa) by means of a transparent adhesive strip, which can then be examined for binding action.
  • the binding to teeth can be determined by incubating the polypeptide sequences to be examined directly with the tooth surface (for example bovine teeth) and measuring according to Example 11.
  • the coupling of the dye is carried out according to the manufacturer's instructions (Alexa 532 Protein Delivery Kit, Molecular Probes, MP-A-10236).
  • the coating of human hair with Alexa-coupled hydrophobin is performed as follows:
  • Preparation Heat phases A and B separately from each other to about 80 ° C. Stir phase B into phase A and homogenize. Incorporate phase C into the combined phases A and B and homogenize. Cool with stirring to about 40 ° C. Add phase D, adjust the pH to about 6.5 with phase E and homogenize. Cool to room temperature while stirring.
  • hydrophobin in a facial cleansing lotion - Type O / W
  • Preparation Mix the components of phase A. Dissolve phase B, work in phase A and homogenize.
  • Preparation Heat the components of phases A and B separately from each other to approx. 80 ° C. Stir phase B into phase A and homogenize. Heat phase C to about 80 ° C. and stir into the combined phases A and B while homogenizing. Cool with stirring to about 40 0 C, add phase D and homogenize again.
  • hydrophobin in a sunscreen lotion - Type O / W
  • Preparation Heat the components of phases A and B separately from each other to approx. 80 ° C. Stir phase B into phase A while homogenizing. Cool with stirring to about 40 0 C, add the phases C and D and briefly nachhomogen gives. Cool to room temperature while stirring.
  • Example 26 Use of the hydrophobin in a W / O emulsion with bisabolol

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Abstract

Kosmetische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, Schleimhäuten und Zähnen, enthaltend mindestens eine Hydrophobin Polypeptidsequenz (i) X<SUB>n</SUB>-C<SUP>1</SUP>-X<SUB>1-50</SUB>-C<SUP>2</SUP>-X<SUB>0-5</SUB>-C<SUP>3</SUP>-X<SUB>p</SUB>-C<SUP>4</SUP>-X<SUB>1-100</SUB>-C<SUP>5</SUP>-X<SUB>1-50</SUB>-C<SUP>6</SUP>-X<SUB>0-5</SUB>-C<SUP>7</SUP>-X<SUB>1-50</SUB>-C<SUP>8</SUP>-X<SUB>m</SUB> (I)

Description

Verwendung von Hydrophobin-Polypeptiden sowie Konjugaten aus Hydrophobin- Polypeptiden mit Wirk- oder Effektstoffen und ihre Herstellung sowie deren Einsatz in der Kosmetik
Beschreibung
Stand der Technik
Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 AS, die charakteristisch für filamentö- se Pilze sind und nicht in anderen Organismen vorkommen. Kürzlich wurden Hy- drophobin-ähnliche Proteine in Streptomyces coelicolor entdeckt, die als „Chapline" bezeichnet werden und ebenfalls hoch oberflächenaktive Eigenschaften haben. An Wasser/Luft-Grenzflächen können sich Chapline zu Amyloid-ähnlichen Fibrillen as- semblieren (Classen et al. 2003 Genes Dev 1714-1726 ; Elliot et al. 2003, Genes Dev. 17, 1727-1740).
Hydrophobine sind in einer wasserunlöslichen Form auf der Oberfläche von verschiedenen pilzlichen Strukturen, wie z.B. Lufthyphen, Sporen, Fruchtkörpern, verteilt. Die Gene für Hydrophobine konnten aus Ascomyzeten, Deuteromyzeten und Basidiomyze- ten isoliert werden. Einige Pilze enthalten mehr als ein Hydrophobingen, z.B. Schi- zophyllum commune, Coprinus cinereus, Aspergillus nidulans. Offensichtlich sind verschiedene Hydrophobine in unterschiedlichen Stadien der pilzlichen Entwicklung involviert. Die Hydrophobine sind dabei vermutlich verantwortlich für unterschiedliche Funktionen (van Wetter et al., 2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210; Kershaw et al. 1998, Fungal Genet. Biol, 1998, 23, 18-33).
Als biologische Funktion für Hydrophobine wird neben der Reduzierung der Oberflächenspannung von Wasser zur Generierung von Lufthyphen auch die Hydrophobisie- rung von Sporen beschrieben (Wösten et al. 1999, Curr. Biol., 19, 1985-88; Bell et al. 1992, Genes Dev., 6, 2382-2394). Weiterhin dienen Hydrophobine zur Auskleidung von Gaskanälen in Fruchtkörpern von Flechten und als Komponenten im Erkennungssystem von pflanzlichen Oberflächen durch pilzliche Pathogene (Lugones et al. 1999, Mycol. Res., 103, 635-640; Hamer & Talbot 1998, Curr. Opinion Microbiol., Band 1, 693-697).
Komplementationsexperimente haben gezeigt, dass Hydrophobine sich innerhalb einer Klasse bis zu einem gewissen Grad funktionell ersetzen können. Die bisher bekannten Hydrophobine lassen sich mit üblichen proteinchemischen Reini- gungs- und Isolationsverfahren nur in massiger Ausbeute und Reinheit darstellen. Auch Versuche, mit Hilfe von gentechnischen Verfahren, grossere Mengen an Hy- drophobinen bereitzustellen, waren bisher nicht erfolgreich.
US 20030217419A1 beschreibt die Verwendung des Hydrophobins SC3 aus Schi- zophyllumg commune für kosmetische Zubereitungen.
Aufgabenstellung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Polypeptide bereitzustellen, die eine hohe Affinität zu Keratin bzw. keratinhaltigen Stoffen wie Haut , Nägel oder Haare und / oder zu Schleimhäuten und / oder Zähnen besitzen. Solche Polypeptide eignen sich für die kosmetische und pharmazeutische Behandlung von keratinhaltigen Strukturen, insbesondere von Haaren, Nägeln und Haut, oder von Schleimhäuten oder Zähnen sowie als Anker für eine Vielzahl von Wirk- und Effektstoffen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es weiterhin, neue keratin-bindende Effektor- moleküle bereitzustellen, die ein Bindepeptid mit hoher Affinität zu Keratin bzw. keratinhaltigen Stoffen wie Haut oder Haare besitzen, und an die bestimmte Effektormoleküle gebunden sind. Solche keratin-bindende Effektormoleküle erlauben eine hohe lokale Konzentration von Effektormolekülen am Keratin ,d.h. ein sogenanntes „targe- ting bzw. eine lange Wirkdauer am Keratin.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind kosmetische Zusammensetzungen zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, Schleimhäuten und Zähnen, enthaltend mindestens eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) der allgemeinenen Strukturformel (I) in einem kosmetisch verträglichen Medium.
Strukturformel (I):
Xn-C -Xi_5o-C -Xo-5-C -Xp-C -Xi-ioo-C -Xi_5o-C -X0-S-C -Xi-S0-C -Xm (I)
wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 500 , bevorzugt zwischen 15 und 300, stehen, p für eine Zahl zwischen 1 und 250, bevorzugt 1-100 steht, und C für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit Xn oder Xn, oder Xp abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 20 Aminosäuren lange Peptidsequenz steht , die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von minde- stens 20° bewirken.
Die mit C1 bis C8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C1 bis C8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemässen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevor- zugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.
Besonders vorteilhafte Polypeptide (i) sind solche der allgemeinen Formel (II)
Xn-C -X3-25-C -Xθ-2"C -Xs-SO-C -X2-35"C -X2-15"C -Xθ-2"C -X3-35"C -Xm (H)
wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 2 und 300 stehen und C für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit Xn oder Xm abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 35 Aminosäuren lange Peptidse- quenz steht , die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von minde- stens 20° bewirken.
Ganz besonders vorteilhaft sind solche Polypeptide (i) der allgemeinen Formel (III)
Xn-C -Xδ-g-C -C -Xn-39-C -X2-23-C -Xδ-g-C -C -X6-18"C -Xm (III)
wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen und C für Cystein, Alanin, Se- rin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens sechs der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit Xn oder Xm abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 40 Aminosäuren lange Peptid- sequenz steht , die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von minde- stens 20° bewirken.
Bevorzugte Ausführungsformen der beschriebenen Erfindung sind Polypeptide mit der allgemeinen Strukturformel (I) (II) oder (III), wobei diese Strukturformel mindestens ein Hydrophobin der Klasse I, bevorzugt mindestens ein Hydrophobin dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi, basf2, oder Teile oder Derivate davon umfasst. Die genannten Hydrophobine sind im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert. Es können auch mehrere Hydrophobine, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypep- tidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die neuen Proteine mit der in SEQ ID NO: 20, 22, 24 dargestellen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 22, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10. bevorzugt 5 , besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die Änderung des Kontaktwinkels wie in Beispiel 10 beschrieben, verstanden.
Die erfindungsgemässen Proteine tragen an mindestens einer Position, die mit Xn oder Xm oder Xp abgekürzt wird, eine Polypeptidsequenz aus mindestens 20 bevorzugt mindestens 35 besonders bevorzugt mindestens 50 und insbesonders mindestens 100 Aminosäuren (im folgenden auch Fusionspartner genannt), die nicht natürlicher- weise mit einem Hydrophobin verknüpft ist. Damit soll ausgedrückt werden, dass die erfindungsgemässen Proteine aus einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.
Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (Xn) und am Carboxyterminus (Xn,) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (Xn oder Xn,) des erfindungsgemässen Proteins verknüpft werden.
Als Fusionspartner sind besonders bevorzugt solche Polypeptidsequenzen, die dazu führen, dass das erfindungsgemässe Protein zur Beschichtung von Glasoberflächen fähig ist und die mit Protein behandelte Glasoberfläche resistent wird gegenüber einer Detergenzbehandlung, wie sie im experimentellen Teil (Beispiel 10) ausführlich beschrieben ist (z.B. 1% SDS / 800C / 10 min) ist.
Besonders geeignete Fusionspartner sind Polypeptide, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO:15 und 16 ) , yaae(SEQ ID NO:17 und 18 ), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 10-90%, besonders bevorzugt 25-75% der genannten Sequenzen umfassen. Eine Deletion am C-terminalen Ende wird dabei bevorzugt; beispielsweise ein yaad-Fragment, das nur aus den ersten 75 N-terminalen Aminosäuren besteht, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind. Beispielsweise können am C-terminalen Ende der Sequenzen yaad und yaae noch zusätzliche Aminosäuren, insbesondere zwei zusätzliche Aminosäuren, bevorzugt die Aminosäuren Arg, Ser, angefügt sein. Ferner können bevorzugt in der Sequenz yaae zusätzliche Aminosäuren gegenüber der natürlich vorkommenden Sequenz eingefügt sein, beispielsweise die Aminosäure Nr. 2 (GIy) in SEQ ID NO: 17 und 18.
Weitere bevorzugte Fusionspartner sind Keratin-Bindedomänen, beispielsweise sol- che, die im humanen Desmoplakin vorkommen bzw. die davon durch übliche gentechnische Verfahren wie Aminosäurdesubstitution, - insertion oder -deletion ableitbar sind. Die Bindung an Keratin kann mit den im experimentellen Teil beschriebenen Versuchen leicht überprüft werden.
Weiterhin können auch an den Verknüpfungsstellen zweier Fusionsparter zusätzliche Aminosäuren eingefügt werden, die sich dadurch ergeben, dass auf der Nukleinsäure- ebene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entweder neu kreiert oder inaktiviert werden.
Die erfindungsgemässen Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.
Eine Eigenschaft der erfindungsgemässen Proteine ist die Änderung von Oberflächen- eigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem erfindungsgemässen Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die genauen experimentellen Bedingungen zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil in Beispiel 10 niedergelegt. Unter diesen Bedingungen besitzen die erfindungsgemässen Proteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20, bevorzugt 25, besonders bevorzugt 30 Grad zu vergrössem.
Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hy- drophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und Il (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437). Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1% SDS bei erhöhter Temperatur) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA), bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse Il Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60%iges Ethanol, bzw. 1% SDS (bei Raumtemperatur) wieder aufgelöst werden. Diese hohe Stabilität gegenüber Lösungsmitteln und Deter- gentien ist eine besondere Eigenschaft der Hydrophobine und unterscheidet Beschich- tungen mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden von „unspezifischen" Proteinbe- schichtungen, wie sie eine Vielzahl von Proteinen an Oberflächen ausbilden.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C3 und C4bei Klasse Il Hydrophobinen deutlich kürzer ist, als bei Hydrophobinen der Klasse I.
Klasse Il Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Hydrophobin-enthaltended Effektormoleküle bestehend aus
(i) mindestens einem Hydrophobin,
(ii) einem Effektormolekül, das natürlicherweise nicht mit dem Hydrophobin (i) verknüpft ist.
Das Hydrophobin (i) kann durch alle bekannten Hydrophobinpolypeptide repräsentiert werden. Besonders geeignete Hydrophobine (i) sind die oben genannten Polypeptide (i) der allgemeinen Strukturformel (I), (II) oder (IM).
Bevorzugte Hydrophobin Polypeptidsequenzen (i) umfassen eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-24.
Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret offenbarten Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) und die Verwendung dieser in den erfindungsgemäßen Verfahren.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide (i) sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Keratinbindung, besitzen. So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Hydrophobin- Polypeptidsequenzen die gemäß einem der in Beispielen 12/13 beschriebenen Bindungstests eine mindestens 10%ige Bindung zeigen, bevorzugt mindestens 50 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % der Bindung, die ein Hy- drophobin von SEQ ID NO: 1-24 in den Bindungstests gemäß Beispielen 12/13 zeigt.
Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entnehmen:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn; GIn
Ne Leu; VaI
Leu Ne; VaI
Lys Arg; GIn; GIu
Met Leu; Ne
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
VaI Ne; Leu
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch
Muteine, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquiva- lente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen,
-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Muteine, wobei die ge- nannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einem Mutein mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne gewünschte biologische Aktivität.
Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide, welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen. „Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Hydrophobin-Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Se- quenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitie- rende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 50 %, vorzugsweise wenigstens 75 %, insbesondere wenigstens 85 %, wie z.B. 90 %, 95 % oder 99 %, Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktio- nale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Homologe der erfindungsgemäßen Polypeptide (i) können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins.
Homologe des erfindungsgemäßen Polypeptide können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleo- tidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinse- quenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 :477).
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sind Hydrophobin-enthaltende Effektormoleküle, bei denen das Hydrophobin durch eine Polypeptidsequenzen (i) re- präsentiert wird, die mindestens eine der folgenden Hydrophobin-Polypeptidsequenzen umfasst,
a) Polypetidsequenz der allgemeinen Strukturformel (I),
b) Polypeptidsequenz, die gegenüber (a) in bis zu 60 % , bevorzugt bis zu 75% , besonders bevorzugt bis zu 90% der Aminosäurepositionen verändert ist,
mit der Massgabe, dass die Keratin-Bindung der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (b) mindestens 10 % des Wertes beträgt, den die Hydrophobin-Polypeptidsequenz (a) aufweist, gemessen in dem Test gemäß Beispielen 12 bzw. 13. Mit Veränderung von Aminosäuren sind hiermit Aminosäure-Substitutionen, - Insertionen und -Deletionen oder beliebige Kombinationen aus diesen drei Möglichkeiten gemeint.
Bevorzugt werden Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) verwendet, die für den gewünschten Organismus eine hochspezifische Affinität besitzen. Für Anwendungen in der Hautkosmetik werden demzufolge Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) bevorzugt eingesetzt, die zu dem humanen Hautkeratin eine besonders hohe Affinität haben. Für Anwendungen in der Haarkosmetik werden solche Hydrophobin-Polypeptidsequenzen bevorzugt, die zu humanem Haarkeratin eine besonders hohe Affinität haben.
Für Anwendungen auf dem Haustiergebiet werden entsprechend solche Hydrophobin- Polypeptidsequenzen (i) bevorzugt, die zu dem entsprechenden Keratin, beispielsweise Hundekeratin oder Katzenkeratin eine besonders hohe Affinität besitzen.
Es können aber auch mehr als eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in dem erfindungsgemäßen Effektormolekül verwendet werden. Es können auch mehrere Kopien der gleichen Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) hintereinander geschaltet werden, um beispielsweise eine höhere Bindung zu erzielen.
Die erfindungsgemäßen Hydrophobine mit Keratin-bindenden Eigenschaften besitzen ein weites Anwendungsgebiet in der Humankosmetik, insbesondere der Haut- und Haarpflege, der Tierpflege.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Hydrophobin Polypeptide (i) für die Haar- und Hautkosmetik angewendet. Sie erlauben eine hohe Konzentration und lange Wirkdauer von hautpflegenden oder hautschützenden Effektorstoffen.
Effektormoleküle (ii)
Als Effektormoleküle (ii) werden im folgenden Moleküle verstanden, die eine bestimmte, vorhersehbare Wirkung aufweisen. Dies können entweder proteinartige Moleküle sein, wie Enzyme oder auch nicht-proteinogene Moleküle wie Farbstoffe, Lichtschutzmittel, Vitamine und Fettsäuren, oder Metallionen- enthaltende Verbindungen.
Unter den proteinartigen Effektormolekülen sind Enzyme und Antikörper, bevorzugt. Unter den Enzymen sind folgende als Effektormoleküle (ii) bevorzugt: Oxidasen, Pero- xidasen, Proteasen, Tyrosinasen, metallbindende Enzyme, Lactoperoxidase, Lysozym, Amyloglycosidase, Glucoseoxidase, Superoxiddismutase, Photolyase, Calalase.
Gut geeignet als proteinartige Effektormoleküle (ii) sind auch Hydrolysate von Proteinen aus pflanzlichen und tierischen Quellen, beispielsweise Hydrolysate von Proteinen marinen Ursprungs oder Seidenhydrolysate.
Unter den nicht-proteinartigen Effektormolekülen (ii) sind Farbstoffe beispielsweise semipermanente Farbstoffe oder Oxidationsfarbstoffe bevorzugt. Bei den Reaktivfarbstoffen wird bevorzugt eine Komponente als Effektormolekül (ii) mit der Keratin- bindenden Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) verknüpft und anschliessend am Wirkort, d.h. nach Bindung am Haar, oxidativ mit der zweiten Farbstoffkomponente gekuppelt.
Als Farbstoffe sind alle gängigen Haarfarbstoffe für die erfindungsgemässen Moleküle geeignet. Geeignete Farbstoffe sind dem Fachmann aus Handbüchern der Kosmetik beispielsweise Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1 bekannt.
Weitere geeignete Effektormoleküle (ii) sind Carotinoide. Unter Carotinoide sind erfindungsgemäß folgende Verbindungen zu verstehen: ß-Carotin, Lycopin, Lutein, Asta- xanthin, Zeaxanthin, Cryptoxanthin, Citranaxanthin, Canthaxanthin, Bixin, ß-Apo-4- carotinal, ß-Apo-8-carotinal, ß-Apo-8-carotinsäureester, einzeln oder als Mischung. Bevorzugt verwendete Carotinoide sind ß-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Citranaxanthin und Canthaxanthin.
Unter Retinoide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Vitamin A Alkohol (Retinol) und seine Derivate wie Vitamin A Aldehyd (Retinal), Vitamin A Säure (Retinsäure) und Vitamin A Ester (z.B. Retinylacetat, Retinylpropionat und Retinylpalmitat) gemeint. Der Begriff Retinsäure umfasst dabei sowohl all-trans Retinsäure als auch 13-cis Retinsäure. Die Begriffe Retinol und Retinal umfassen bevorzugt die all-trans Verbindungen. Als bevorzugtes Retinoid verwendet man für die erfindungsgemäßen Suspensionen all-trans-Retinol, im folgenden als Retinol bezeichnet.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle (ii) sind Vitamine, insbesondere Vitamin A und deren Ester.
Vitamine, Provitamine und Vitaminvorstufen aus den Gruppen A, C, E und F, insbe- sondere 3,4-Didehydroretinol, ß-Carotin (Provitamin des Vitamin A), Ascorbinsäure
(Vitamin C), sowie die Palmitinsäureester, Glucoside oder Phosphate der Ascorbinsäure, Tocopherole, insbesondere α-Tocopherol sowie seine Ester, z.B. das Acetat, das Nicotinat, das Phosphat und das Succinat; weiterhin Vitamin F, worunter essentielle Fettsäuren, besonders Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure, verstanden werden;
Vitamin A und seine Derivate und Provitamine zeigen vorteilhafterweise einen besonderen hautglättenden Effekt.
Zu den erfindungsgemäß bevorzugt einzusetzenden Vitaminen, Provitaminen oder Vitaminvorstufen der Vitamin B-Gruppe oder deren Derivaten sowie den Derivaten von 2-Furanon gehören unter anderem:
Vitamin B1 , Trivialname Thiamin, chemische Bezeichnung 3-[(4'-Amino-2'-methyl-5'- pyri m id i nyl ) methyl]-5-(2-hyd roxyethyl )-4-methylth iazol i u mch lorid .
Vitamin B2, Trivialname Riboflavin, chemische Bezeichung 7,8-Dimethyl-10-(1-D- ribityl)-benzo[g]pteridin-2,4(3H,10H)-dion. In freier Form kommt Riboflavin z. B. in Molke vor, andere Riboflavin-Derivate lassen sich aus Bakterien und Hefen isolieren. Ein erfindungsgemäß ebenfalls geeignetes Stereoisomeres des Riboflavin ist das aus Fischmehl oder Leber isolierbare Lyxoflavin, das statt des D-Ribityl einen D-Arabityl- Rest trägt.
Vitamin B3. Unter dieser Bezeichnung werden häufig die Verbindungen Nicotinsäure und Nicotinsäureamid (Niacinamid) geführt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nicotinsäureamid.
Vitamin B5 (Pantothensäure und Panthenol). Bevorzugt wird Panthenol eingesetzt. Erfindungsgemäß einsetzbare Derivate des Panthenols sind insbesondere die Ester und Ether des Panthenols sowie kationisch derivatisierte Panthenole. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können zusätzlich zu Pantothensäure oder Panthenol auch Derivate des 2-Furanon eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Derivate sind die auch im Handel erhältlichen Substanzen Dihydro-3 hydroxy-4,4- dimethyl-2(3H)-furanon mit dem Trivialnamen Pantolacton (Merck), 4 Hydroxymethyl-γ- butyrolacton (Merck), 3,3-Dimethyl-2-hydroxy-γ-butyrolacton (Aldrich) und 2,5- Dihydro- 5-methoxy-2-furanon (Merck), wobei ausdrücklich alle Stereoisomeren eingeschlossen sind.
Vorteilhafterweise verleihen diese Verbindungen den erfindungsgemässen Keratin- bindenden Effektormolekülen feuchtigkeitsspendende sowie hautberuhigende Eigenschaften. Vitamin B6, wobei man hierunter keine einheitliche Substanz, sondern die unter den Trivialnamen Pyridoxin, Pyridoxamin und Pyridoxal bekannten Derivate des 5 Hydro- xymethyl-2-methylpyridin-3-ols versteht.
Vitamin B7 (Biotin), auch als Vitamin H oder "Hautvitamin" bezeichnet. Bei Biotin handelt es sich um (3aS,4S, 6aR)-2-Oxohexahydrothienol[3,4-d]imidazol-4-valeriansäure.
Panthenol, Pantolacton, Nicotinsäureamid sowie Biotin sind erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt.
Erfindungsgemäß können geeignete Derivate (Salze, Ester, Zucker, Nukleotide, Nu- kleoside, Peptide und Lipide). Als lipophile, öllösliche Antioxidantien aus dieser Gruppe sind Tocopherol und dessen Derivate, Gallussäureester, Flavonoide und Carotinoide sowie Butylhydroxytoluol/anisol bevorzugt. Als wasserlösliche Antioxidantien sind Ami- nosäuren, z. B. Tyrosin und Cystein und deren Derivate sowie Gerbstoffe, insbesondere solche pflanzlichen Ursprungs bevorzugt.
Triterpene, insbesondere Triterpensäuren wie Ursolsäure, Rosmarinsäure, Betulinsäu- re, Boswelliasäure und Brγonolsäure.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle (ii) sind UV-Lichtschutzfilter. Darunter sind organische Substanzen zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, z.B. Wärme, wieder abzugeben. Die organischen Substanzen können öllöslich oder wasserlöslich sein.
Als öllösliche UV-B-Filter können z.B. folgende Substanzen verwendet werden:
3-Benzylidencampher und dessen Derivate, z.B. 3-(4-Methylbenzyliden)campher;
4-Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2- ethylhexylester, 4-( Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4-(Dimethylamino)- benzoesäureamylester;
Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4 Methoxy- zimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimtsäureisoamylester, 4 Methoxyzimtsäureisopenty- lester, 2-Cyano-3-phenyl-zimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene);
Ester der SaI icylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4 isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester; Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2- Hydroxy^-methoxy-^-methylbenzophenon, 2,21-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon;
Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2- ethylhexylester;
Triazinderivate, wie z.B. 2J4J6-Trianilino-(p-carbo-2l-ethyl-r-hexyloxy)-1,3J5-triazin (Oc- tyltriazone) und Dioctyl Butamido Triazon (Uvasorb® HEB):
Propan-1,3-dione, wie z.B. 1 -(4-tert. ButylphenylJ-S-^'-methoxyphenyOpropan-I .S- dion.
Als wasserlösliche Substanzen kommen in Frage:
2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alky- lammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze;
Sulfonsäurederivate von Benzophenonen , vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzo- phenon-5-sulfonsäure und ihre Salze;
Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie z.B. 4-(2-Oxo-3- bomylidenmethyl)benzolsulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bomyliden)sulfonsäure und deren Salze.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Estern der Zimtsäure, vorzugsweise 4- Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäureisopentylester, 2-Cyano-3- phenyl-zimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene).
Des weiteren ist die Verwendung von Derivaten des Benzophenons, insbesondere 2- Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4Λ-methylbenzophenon, 2,2'- Dihydroxy-4-methoxybenzophenon sowie der Einsatz von Propan-1,3-dionen, wie z.B. 1 -(4-tert. Butylphenyl)-3-(4-'methoxyphenyl)propan-1 ,3-dion bevorzugt.
Als typische UV-A-Filter kommen in Frage:
Derivate des Benzoylmethans, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(41- methoxyphenyl)propan-1,3-dion, 4-tert.-Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan oder 1- Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan-1,3-dion;
Amino-hydroxy-substituierte Derivate von Benzophenonen wie z.B. N,N-Diethylamino- hydroxybenzoyl-n-hexylbenzoat. Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden.
Als weitere Lichtschutzfilter können aber auch andere unlösliche Pigmente, z.B. fein- disperse Metalloxide bzw. Salze wie beispielsweise Titandioxid, Eisenoxid, Aluminiumoxid, Ceroxid, Zirkoniumoxid, Silicate (Talk), Bariumsulfat und Zinkstearat verwendet werden. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen.
Neben den beiden vorgenannten Gruppen primärer Lichtschutzstoffe können auch sekundäre Lichtschutzmittel vom Typ der Antioxidantien eingesetzt werden, die die photochemische Reaktionskette unterbrechen, welche ausgelöst wird, wenn UV- Strahlung in die Haut eindringt. Typische Beispiele hierfür sind Superoxid-Dismutase, Catalase, Tocopherole (Vitamin E) und Ascorbinsäure (Vitamin C).
Eine weitere Gruppe sind Anti-irritantien, die eine entzündungshemmende Wirkung auf durch UV-Licht geschädigte Haut besitzten. Solche Stoffe sind beispielsweise Bisabo- lol, Phytol und Phytantriol.
Verknüpfung der Effektormoleküle (ii) mit der Keratin-bindenden Hydrophobin- Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i)
Die Effektormoleküle (ii) sind mit einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) , die eine Bindungsaffinität zu einem Keratin besitzt, verbunden. Die Verbindung zwischen (i) und (ii) kann sowohl kovalent als auch auf ionische oder van-der Waals Wechselwirkungen beruhen (Abb. 3).
Bevorzugt ist eine kovalente Verknüpfung. Dies kann beispielsweise über die Seitenketten der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) erfolgen, insbesondere über Aminofunk- tionen oder Carboxylatfunktionen oder Thiolfunktionen. Bevorzugt ist eine Verknüfung über die Aminofunktionen von einem oder mehreren Lysinresten, einer oder mehrerer Thiolgruppe von Cysteinresten oder über die N-terminale oder C-terminale Funktion des Hydrophobin-Polypeptids (i). Die Verknüpfung der Effektormoleküle (ii) mit der Hydrphobin-Polypeptidsequenz (i) kann entweder direkt, d.h. als kovalente Verknüpfung zweier in (i) und (ii) bereits vorhandener chemischer Funktionen erfolgen, beispielsweise eine Aminofunktion von (i) wird mit einer Carboxylatfunktion von (ii) zum Säureamid verknüpft. Die Verknüpfung kann aber auch über einen sogenannten Lin- ker, d.h. einem mindestens bifunktionellen Molekül erfolgen, der mit einer Funktion mit (i) eine Bindung eingeht und mit einer anderen Funktion mit (ii) verknüpft wird. Falls das Effektormolekül (ii) ebenfalls aus einer Polypeptidsequenz besteht, kann die Verknüpfung von (i) und (ii) durch ein sogenanntes Fusionsprotein erfolgen, d.h. eine durchgängige Polypeptidsequenz, die aus den beiden Teilsequenzen (i) und (ii) besteht.
Es können zwischen (i) und (ii) auch noch sogenannte Spacerelemente eingebaut werden, beispielsweise Polypeptidsequenzen, die eine potentielle Spaltstelle für eine Protease, Lipase, Esterase, Phosphatase, Hydrolase besitzen oder Polypeptidsequenzen, die eine leichte Aufreinigung des Fusionsproteins gestatten, beispielsweise soge- nannte His-tags, d.h. Oligohistidinreste.
Die Verknüpfung im Falle eines nicht-proteinartigen Effektormoleküls mit der Hy- drophobin-Polypeptidsequenz (i) erfolgt bevorzugt durch funktionalisierbare Reste (Seitengruppen) am Hydrophobin-Polypeptid (i), die mit einer chemischen Funktion des Effektormoleküls eine kovalente Verbindung eingehen.
Bevorzugt ist hier die Bindungsknüpfung über eine Amino-, Thiol- oder Hydroxyfunktion des Hydrophobin-Polypeptids (i) , die beispielsweise mit einer Carboxylfunktion des Effektormoleküls (ii), ggf. nach Aktivierung, eine entsprechende Amid-, Thioester oder Esterbindung eingehen können.
Eine weitere bevorzugte Verknüpfung der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) mit einem Effektormolekül (ii) ist die Verwendung eines massgeschneiderten Linkers. Ein solcher Linker hat zwei oder mehr sogenannte Ankergruppen mit denen er die Hy- drophobin-Polypeptidsequenz (i) und ein oder mehrere Effektormoleküle (ii) verknüpfen kann. Beispielsweise kann eine Ankergruppe für (i) eine Thiolfunktion sein, mittels derer der Linker mit einem Cysteinrest des Polypeptids (i) eine Disulfidbindung eingehen kann. Eine Ankergruppe für (ii) kann beispielsweise eine Carboxylfunktion sein, mittels derer der Linker mit einer Hydroxylfunktion des Effektormoleküls (ii) eine Ester- bindung eingehen kann.
Die Verwendung solcher massgeschneiderter Linker erlaubt die genaue Anpassung der Verknüpfung an das gewünschte Effektormolekül. Ausserdem ist es dadurch möglich, mehrere Effektormoleküle mit einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) definiert zu verknüpfen.
Der verwendete Linker richtet sich nach der zu koppelnden Funktionalität. Geeignet sind z.B. Moleküle, die zu Polypeptiden (i) koppeln mittels Sulfhydryl-reaktiven Gruppen, z.B. Maleimide, Pydridyldisulfide, α -Haloacetyle, Vinylsulfon und zu Effektormole- külen (ii) mittels Sulfhydryl-reaktiven Gruppen z.B. Maleimide, Pydridyldisulfide, α -Haloacetyle, Vinylsulfone) Amin-reaktive Gruppen (z.B. Succinimidylester, Carbodiimde, Hy- droxymethyl- Phosphin, Imidoester, PFP-Ester etc.) Zucker bzw. oxidierte Zucker-reaktive Gruppen (z.B. Hydrazide etc.) - Carboxy-reaktive Gruppen (z.B. Carbodiimide etc.) Hydroxyl-reaktive Gruppen (z.B. Isocyanate etc.) Thymin-reaktive Gruppen (z.B. Psoralen etc.) unselektive Gruppen (z.B. Arylazide etc.) photoaktivierbare Gruppen (z.B. Perfluorphenylazid etc.) - Metallkomplexierenden Gruppen (z.B. EDTA, Hexahis, Ferritin)
Antikörper und -fragmente (z.B. single-chain antibodies, F(ab)-Fragmente von Antikörpern, katalytische Antikörper).
Alternativ kann eine direkte Kopplung zwischen Wirk-/Effektstoff und der Keratin- Bindedomäne z.B. mittels Carbodiimiden, Glutardialdehyd oder anderen, dem Fachmann bekannten Crosslinkern durchgeführt werden.
Der Linker kann stabil, thermospaltbar, photospaltbar oder auch enzymatisch spaltbar sein (besonders durch Lipasen, Esterasen, Proteasen, Phosphatasen, Hydrolasen etc.). Entsprechende chemische Strukturen sind dem Fachmann bekannt und werden zwischen die Molekülteile (i) und (ii) integriert.
Beispiele für enzymatisch spaltbare Linker, die bei den erfindungsgemässen Molekülen eingesetzt werden können, sind beispielsweise in WO 98/01406 genannt, auf deren gesamten Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Die erfindungsgemässen Keratin-bindenden Hydrophobin-Effektormoleküle besitzen ein weites Anwendungsgebiet in der Humankosmetik, insbesondere der Haut- und Haarpflege, der Tierpflege.
Bevorzugt werden die erfindungsgemässen Keratin-bindenden Hydrophobin- Effektormoleküle für die Haut-, Nagel und Haarkosmetik angewendet. Sie erlauben eine hohe Konzentration und lange Wirkdauer von haut-, nagel- und haarpflegenden oder haut-, nagel-, und haarschützenden Effektorstoffen.
Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe für die Herstellung von haarkosmetischen oder hautkosmetischen Zubereitungen sind dem Fachmann geläufig und können aus Handbüchern der Kosmetik, beispielsweise Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1 , entnommen werden. Bei den erfindungsgemäßen kosmetischen Mitteln kann es sich um hautkosmetische, haarkosmetische, dermatologische, hygienische oder pharmazeutische Mittel handeln.
Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Mittel in Form eines Gels, Schaums, Sprays, einer Salbe, Creme, Emulsion, Suspension, Lotion, Milch oder Paste vor. Ge- wünschtenfalls können auch Liposomen oder Mikrosphären eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen kosmetisch oder pharmazeutisch aktiven Mittel können zusätzlich kosmetisch und/oder dermatologisch aktive Wirkstoffe sowie Hilfsstoffe enthal- ten.
Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen kosmetischen Mittel wenigstens eine wie vorstehend definierte Hydrophobin Polypeptidsequenz (i), und wenigstens einen davon verschiedenen Bestandteil, der ausgewählt ist unter kosmetisch aktiven Wirk- Stoffen, Emulgatoren, Tensiden, Konservierungsmitteln, Parfümölen, Verdickern,
Haarpolymeren, Haar-und Hautconditionern, Pfropfpolymeren, wasserlöslichen oder dispergierbaren silikonhaltigen Polymeren, Lichtschutzmitteln, Bleichmitteln, Gelbildnern, Pflegemitteln, Färbemitteln, Tönungsmitteln, Bräunungsmitteln, Farbstoffen, Pigmenten, Konsistenzgebern, Feuchthaltemitteln, Rückfettem, Collagen, Eiweißhy- drolysaten, Lipiden, Antioxidantien, Entschäumern, Antistatika, Emollienzien und Weichmachern.
Übliche Verdickungsmittel in derartigen Formulierungen sind vernetzte Polyacrylsäu- ren und deren Derivate, Polysaccharide und deren Derivate, wie Xanthangum, Agar- Agar, Alginate oder Tylosen, Cellulosederivate, z.B. Carboxymethylcellulose oder Hy- droxycarboxymethylcellulose, Fettalkohole, Monoglyceride und Fettsäuren, Polyvinyl- alkohol und Polyvinylpyrrolidon. Bevorzugt werden nichtionische Verdicker eingesetzt.
Geeignete kosmetisch und/oder dermatologisch aktive Wirkstoffe sind z.B. färbende Wirkstoffe, Haut-und Haarpigmentierungsmittel, Tönungsmittel, Bräunungsmittel, Bleichmittel, Keratin-härtende Stoffe, antimikrobielle Wirkstoffe, Lichtfilterwirkstoffe, Repellentwirkstoffe, hyperemisierend wirkende Stoffe, keratolytisch und keratopla- stisch wirkende Stoffe, Antischuppenwirkstoffe, Antiphlogistika, keratinisierend wirkende Stoffe, antioxidativ bzw. als Radikalfänger aktive Wirkstoffe, hautbefeuchtende oder -feuchthaltende Stoffe, rückfettende Wirkstoffe, antierythimatös oder antiallergisch aktive Wirkstoffe und Mischungen davon. Künstlich hautbräunende Wirkstoffe, die geeignet sind, die Haut ohne natürliche oder künstliche Bestrahlung mit UV-Strahlen zu bräunen, sind z.B. Dihydroxyaceton, AIIo- xan und Walnussschaienextrakt. Geeignete Keratin-härtende Stoffe sind in der Regel Wirkstoffe, wie sie auch in Antitranspirantien eingesetzt werden, wie z.B. Kaliumalumi- niumsulfat, Aluminiumhydroxychlorid, Aluminiumlactat, etc.
Antimikrobielle Wirkstoffe werden eingesetzt, um Mikroorganismen zu zerstören bzw. ihr Wachstum zu hemmen und dienen somit sowohl als Konservierungsmittel als auch als desodorierend wirkender Stoff, welcher die Entstehung oder die Intensität von Kör- pergeruch vermindert. Dazu zählen z.B. übliche, dem Fachmann bekannte Konservierungsmittel, wie p-Hydroxybenzoesäureester, Imidazolidinyl-Hamstoff, Formaldehyd, Sorbinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, etc. Derartige desodorierend wirkende Stoffe sind z.B. Zinkricinoleat, Triclosan, Undecylensäurealkylolamide, Citronensäuretriethy- lester, Chlorhexidin etc.
Geeignete Lichtfilterwirkstoffe sind Stoffe, die UV-Strahlen im UV-B- und/oder UV-A- Bereich absorbieren. Geeignete UV-Filter sind z.B. 2,4,6-Triaryl-1 ,3,5- triazine, bei denen die Arγlgruppen jeweils wenigstens einen Substituenten tragen können, der vorzugsweise ausgewählt ist unter Hydroxy, Alkoxy, speziell Methoxy, Alkoxycarbonyl, speziell Methoxycarbonyl und Ethoxycarbonyl und Mischungen davon. Geeignet sind weiterhin p-Aminobenzoesäureester, Zimtsäureester, Benzophenone, Campherderivate sowie UV-Strahlen abhaltende Pigmente, wie Titandioxid, Talkum und Zinkoxid.
Geeignete Repellentwirkstoffe sind Verbindungen, die in der Lage sind, bestimmte Tie- re, insbesondere Insekten, vom Menschen abzuhalten oder zu vertreiben. Dazu gehört z.B. 2-Ethyl-1 , 3-hexandiol, N, N-Diethyl-m-toluamid etc. Geeignete hyperemisierend wirkende Stoffe, welche die Durchblutung der Haut anregen, sind z.B. ätherische öle, wie Latschenkieferextrakt, Lavendelextrakt, Rosmarinextrakt, Wacholderbeerextrakt, Rosskastanienextrakt, Birkenblätterextrakt, Heublumenextrakt, Ethylacetat, Campher, Menthol, Pfefferminzöl, Rosmarinextrakt, Eukalyptusöl, etc. Geeignete keratolytisch und keratoplastisch wirkende Stoffe sind z.B. Salicylsäure, Kalziumthioglykolat, Thio- glykolsäure und ihre Salze, Schwefel, etc. Geeignete Antischuppen-Wirkstoffe sind z.B. Schwefel, Schwefelpolyethylenglykolsorbitanmonooleat, Schwefelricinolpolyetho- xylat, Zinkpyrithion, Aluminiumpyrithion, etc. Geeignete Antiphlogistika, die Hautrei- zungen entgegenwirken, sind z.B. Allantoin, Bisabolol, Dragosantol, Kamillenextrakt, Panthenol, etc. Die erfindungsgemäßen kosmetischen Mittel können als kosmetischen und/oder pharmazeutischen Wirkstoff (wie auch gegebenenfalls als Hilfsstoff) wenigstens ein kosmetisch oder pharmazeutisch akzeptables Polymer enthalten, das sich von den Polymeren unterscheidet, die den erfindungsgemäß eingesetzten Polyelektrolytkomplex bil- den. Dazu zählen ganz allgemein kationische, amphotere und neutrale Polymere.
Geeignete Polymere sind z.B. kationische Polymere mit der Bezeichnung Polyquater- nium nach INCI, z.B. Copolymere aus Vinylpyrrolidon/N-Vinylimidazoliumsalzen (Luvi- quat FC, Luviquat HM, Luviquat MS, Luviquat&commat, Care), Copolymere aus N-Vinylpyrrolidon/Dimethylaminoethylmethacrylat, quaternisiert mit Diethylsulfat (Luviquat PQ 11), Copolymere aus N-Vinylcaprolactam/N-Vinylpyrrolidon/N- Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat E Hold), kationische Cellulosederivate (Polyquater- nium-4 und -10), Acrylamidocopolymere (Polyquatemium-7) und Chitosan.
Geeignete kationische (quatemisierte) Polymere sind auch Merquat (Polymer auf Basis von Dimethyldiallylammoniumchlorid), Gafquat (quatemäre Polymere, die durch Reaktion von Polyvinylpyrrolidon mit quatemären Ammoniumverbindungen entstehen), Polymer JR (Hydroxyethylcellulose mit kationischen Gruppen) und kationische Polymere auf pflanzlicher Basis, z.B. Guarpolymere, wie die Jaguar-Marken der Firma Rhodia.
Weitere geeignete Polymere sind auch neutrale Polymere, wie Polyvinylpyrrolidone, Copolymere aus N-Vinylpyrrolidon und Vinylacetat und/oder Vinylpropionat, Polysilo- xane, Polyvinylcaprolactam und andere Copolymere mit N-Vinylpyrrolidon, Polyethyle- nimine und deren Salze, Polyvinylamine und deren Salze, Cellulosederivate, Polyaspa- raginsäuresalze und Derivate. Dazu zählt beispielsweise Luviflex 0 Swing (teilverseiftes Copolymerisat von Polyvinylacetat und Polyethylenglykol, Firma BASF).
Geeignete Polymere sind auch nichtionische, wasserlösliche bzw. wasserdispergierba- re Polymere oder Oligomere, wie Polyvinylcaprolactam, z.B. Luviskol 0 Plus (BASF), oder Polyvinylpyrrolidon und deren Copolymere, insbesondere mit Vinylestem, wie Vinylacetat, z.B. Luviskol 0 VA 37 (BASF), Polyamide, z.B. auf Basis von Itaconsäure und aliphatischen Diaminen, wie sie z.B. in der DE-A-43 33 238 beschrieben sind.
Geeignete Polymere sind auch amphotere oder zwitterionische Polymere, wie die unter den Bezeichnungen Amphomer (National Starch) erhältlichen Octylacrylamid / Methyl- methacrylat / tert.-Butylaminoethylmethacrylat-Hydroxypropylmethacrylat-Copolymere sowie zwitterionische Polymere, wie sie beispielsweise in den deutschen Patentanmel- düngen DE39 29 973, DE 21 50 557, DE28 17 369 und DE 3708 451 offenbart sind. Acrylamidopropyltrimethylannnnoniunnchlorid/Acrylsäure-bzw. -Methacrylsäure- Copolymerisate und deren Alkali-und Ammoniumsalze sind bevorzugte zwitterionische Polymere. Weiterhin geeignete zwitterionische Polymere sind Methacroylethylbe- tain/Methacrylat-Copolymere, die unter der Bezeichnung Amersette (AMERCHOL) im Handel erhältlich sind, und Copolymere aus Hydroxyethylmethacrylat, Methylmethacry- lat, N, N-Dimethylaminoethylmethacrylat und Acrylsäure (Jordapon (D)).
Geeignete Polymere sind auch nichtionische, siloxanhaltige, wasserlösliche oder - dispergierbare Polymere, z.B. Polyethersiloxane, wie Tegopren 0 (Firma Goldschmidt) oder Besi&commat (Firma Wacker).
Die Formulierungsgrundlage erfindungsgemäßer pharmazeutischer Mittel enthält bevorzugt pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe. Pharmazeutisch akzeptabel sind die im Bereich der Pharmazie, der Lebensmitteltechnologie und angrenzenden Gebieten be- kanntermassen verwendbaren Hilfsstoffe, insbesondere die in einschlägigen Arzneibüchern (z.B. DAB Ph. Eur. BP NF) gelisteten sowie andere Hilfsstoffe, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.
Geeignete Hilfsstoffe können sein: Gleitmittel, Netzmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, konservierende Mittel, Antioxidantien, Antireizstoffe, Chelatbildner, Emulsionsstabilisatoren, Filmbildner, Gelbildner, Geruchsmaskierungsmittel, Harze, Hydrokolloide, Lösemittel, Lösungsvermittler, Neutralisierungsmittel, Permeations- beschleuniger, Pigmente, quatemäre Ammoniumverbindungen, Rückfettungs- und Überfettungsmittel, Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe, Siliconderivate, Stabilisatoren, Sterilantien, Treibmittel, Trocknungsmittel, Trübungsmittel, Verdickungsmittel, Wachse, Weichmacher, Weissöl. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie sie beispielsweise in Fiedler, H. P. Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Aufl., Aulendorf: ECV-Editio- Kantor-Verlag, 1996, dargestellt sind.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen dermatologischen Mittel können die Wirkstoffe mit einem geeigneten Hilfsstoff (Exzipient) vermischt oder verdünnt werden. Exzipien- ten können feste, halb feste oder flüssige Materialien sein, die als Vehikel, Träger oder Medium für den Wirkstoff dienen können. Die Zumischung weiterer Hilfsstoffe erfolgt gewünschtenfalls in der dem Fachmann bekannten Weise. Weiterhin sind die Polymere und Dispersionen geeignet als Hilfsmittel in der Pharmazie, bevorzugt als oder in Beschichtungsmittel(n) oder Bindemittel(n) für feste Arzneiformen. Sie können auch in Cremes und als Tablettenüberzugsmittel und Tablettenbindemittel verwendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Mitteln um ein Hautreinigungsmittel.
Bevorzugte Hautreinigungsmittel sind Seifen von flüssiger bis gelförmiger Konsistenz, wie Transparentseifen, Luxusseifen, Deoseifen, Cremeseifen, Babyseifen, Hautschutzseifen, Abrasiveseifen und Syndets, pasteuse Seifen, Schmierseifen und Waschpas- ten, flüssige Wasch-, Dusch- und Badepräparate, wie Waschlotionen, Duschbäder und -gele, Schaumbäder, Ölbäder und Scrub-Präparate, Rasierschäume, -lotionen und - cremes.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungs- gemäßen Mitteln um kosmetische Mittel zur Pflege und zum Schutz der Haut, Nagelpflegemittel oder Zubereitungen für die dekorative Kosmetik.
Geeignete hautkosmetische Mittel sind z.B. Gesichtswässer, Gesichtsmasken, Deodorant ien und andere kosmetische Lotionen. Mittel für die Verwendung in der dekorativen Kosmetik umfassen beispielsweise Abdeckstifte, Theaterfarben, Mascara und Lidschatten, Lippenstifte, Kajalstifte, Eyeliner, Rouges, Puder und Augenbrauenstifte.
Ausserdem können die Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) verwendet werden in Nose-Strips zur Porenreinigung, in Antiaknemitteln, Repellents, Rasiermitteln, Haarent- fernungsmitteln, Intimpflegemitteln, Fusspflegemitteln sowie in der Babypflege.
Bei den erfindungsgemäßen Hautpflegemitteln handelt es sich insbesondere um W/O- oder O/W-Hautcremes, Tag- und Nachtcremes, Augencremes, Gesichtscremes, Anti- faltencremes, Feuchthaltecremes, Bleichcremes, Vitamincremes, Hautlotionen, Pflege- lotionen und Feuchthaltelotionen.
Hautkosmetische und dermatologische Mittel auf Basis der zuvor beschriebenen PoIy- elektrolytkomplexe zeigen vorteilhafte Wirkungen. Die Polymere können unter anderem zur Feuchthaltung und Konditionierung der Haut und zur Verbesserung des Hautge- fühls beitragen. Die Polymere können auch als Verdicker in den Formulierungen wirken. Durch Zusatz der erfindungsgemäßen Polymere kann in bestimmten Formulierungen eine erhebliche Verbesserung der Hautverträglichkeit erreicht werden. Hautkosmetische und dermatologische Mittel enthalten vorzugsweise wenigstens eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in einem Anteil von etwa 0,000001 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,0001 bis 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels.
Besonders Lichtschutzmittel auf Basis der Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) besitzen die Eigenschaft, die Verweilzeit der UV-absorbierenden Inhaltsstoffe im Vergleich zu gängigen Hilfsmitteln wie Polyvinylpyrrolidon zu erhöhen.
Je nach Anwendungsgebiet können die erfindungsgemäßen Mittel in einer zur Hautpflege geeigneten Form, wie z.B. als Creme, Schaum, Gel, Stift, Mousse, Milch, Spray (Pumpspray oder treibmittelhaltiger Spray) oder Lotion appliziert werden.
Die hautkosmetischen Zubereitungen können neben den Hydrophobin- Polypeptidsequenzen (i) und geeigneten Trägern noch weitere in der Hautkosmetik übliche Wirkstoffe und Hilfsstoffe, wie zuvor beschrieben, enthalten. Dazu zählen vorzugsweise Emulgatoren, Konservierungsmittel, Parfümöle, kosmetische Wirkstoffe wie Phytantriol, Vitamin A, E und C, Retinol, Bisabolol, Panthenol, Lichtschutzmittel, Bleichmittel, Färbemittel, Tönungsmittel, Bräunungsmittel, Collagen, Eiweisshydrolysa- te, Stabilisatoren, pH-Wert-Regulatoren, Farbstoffe, Salze, Verdicker, Gelbildner, Konsistenzgeber, Silicone, Feuchthaltemittel, Rückfetter und weitere übliche Additive.
Bevorzugte öl- und Fettkomponenten der hautkosmetischen und dermatologischen Mittel sind die zuvor genannten mineralischen und synthetischen öle, wie z.B. Paraffi- ne, Siliconöle und aliphatische Kohlenwasserstoffe mit mehr als 8 Kohlenstoffatomen, tierische und pflanzliche öle, wie z.B. Sonnenblumenöl, Kokosöl, Avocadoöl, Olivenöl, Lanolin, oder Wachse, Fettsäuren, Fettsäureester, wie z.B. Triglyceride von C6-C30- Fettsäuren, Wachsester, wie z.B. Jojobaöl, Fettalkohole, Vaseline, hydriertes Lanolin und acetyliertes Lanolin sowie Mischungen davon.
Man kann die erfindungsgemäßen Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) auch mit herkömmlichen Polymeren abmischen, falls spezielle Eigenschaften eingestellt werden sollen.
Zur Einstellung bestimmter Eigenschaften wie z.B. Verbesserung des Anfassgefühls, des Spreitverhaltens, der Wasserresistenz und/oder der Bindung von Wirk- und Hilfs- stoffen, wie Pigmenten, können die hautkosmetischen und dermatologischen Zuberei- tungen zusätzlich auch konditionierende Substanzen auf Basis von Siliconverbindungen enthalten.
Geeignete Siliconverbindungen sind beispielsweise Polyalkylsiloxane, Polyarγlsiloxa- ne, Polyarylalkylsiloxane, Polyethersiloxane oder Siliconharze.
Die Herstellung der kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen erfolgt nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren.
Bevorzugt liegen die kosmetischen und dermatologischen Mittel in Form von Emulsionen insbesondere als Wasser-in-öl (W/O)- oder öl-in-Wasser (O/W)-Emulsionen vor.
Es ist aber auch möglich, andere Formulierungsarten zu wählen, beispielsweise Hyd- rodispersionen, Gele, öle, Oleogele, multiple Emulsionen, beispielsweise in Form von W/O/W- oder O/W/O-Emulsionen, wasserfreie Salben bzw. Salbengrundlagen, usw.
Die Herstellung von Emulsionen erfolgt nach bekannten Methoden. Die Emulsionen enthalten neben wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in der Regel übliche Bestandteile, wie Fettalkohole, Fettsäureester und insbesondere Fettsäuretri- glyceride, Fettsäuren, Lanolin und Derivate davon, natürliche oder synthetische öle oder Wachse und Emulgatoren in Anwesenheit von Wasser. Die Auswahl der Emulsionstyp-spezifischen Zusätze und die Herstellung geeigneter Emulsionen ist beispielsweise beschrieben in Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Buch Verlag, Heidelberg, 2. Auflage, 1989, dritter Teil, worauf hiermit ausdrücklich Be- zug genommen wird.
Eine geeignete Emulsion, z.B. für eine Hautcreme etc., enthält im Allgemeinen eine wässrige Phase, die mittels eines geeigneten Emutgatorsystems in einer öl- oder Fettphase emulgiert ist. Zur Bereitstellung der wässrigen Phase kann ein Polyelektrolyt- komplex eingesetzt werden.
Bevorzugte Fettkomponenten, welche in der Fettphase der Emulsionen enthalten sein können, sind: Kohlenwasserstofföle, wie Paraffinöl, Purcellinöl, Perhydrosqualen und Lösungen mikrokristalliner Wachse in diesen ölen; tierische oder pflanzliche öle, wie Süssmandelöl, Avocadoöl, Calophylumöl, Lanolin und Derivate davon, Ricinusöl, Se- samöl, Olivenöl, Jojobaöl, Karite-Öl, Hoplostethus-Öl, mineralische öle, deren Destillationsbeginn unter Atmosphärendruck bei ca. 250 °C und deren Destillationsendpunkt bei 410 °C liegt, wie z.B. Vaselinöl, Ester gesättigter oder ungesättigter Fettsäuren, wie Alkylmyristate, z.B. i-Propyl-, Butyl- oder Cetylmyristat, Hexadecylstearat, Ethyl- oder i- Propylpalmitat, Octan- oder Decansäuretriglyceride und Cetylricinoleat.
Die Fettphase kann auch in anderen ölen lösliche Siliconöle, wie Dimethylpolysiloxan, Methylphenylpolysiloxan und das Siliconglykol-Copolymer, Fettsäuren und Fettalkohole enthalten.
Neben den Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) können auch Wachse verwendet werden, wie z.B. Camaubawachs, Candilillawachs, Bienenwachs, mikrokristallines Wachs, Ozokeritwachs und Ca-, Mg- und Al-Oleate, -Myristate, -Linoleate und - Stearate.
Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Emulsion als O/W-Emulsion vorliegen. Eine derartige Emulsion enthält üblicherweise eine ölphase, Emulgatoren, die die ölphase in der Wasserphase stabilisieren, und eine wässrige Phase, die üblicherweise verdickt vorliegt. Als Emulgatoren kommen vorzugsweise O/W-Emulgatoren, wie Polyglycerin- ester, Sorbitanester oder teilveresterte Glyceride, in Betracht.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Mitteln um ein Duschgel, eine Shampoo-Formulierung oder ein Badepräparat.
Solche Formulierungen enthalten wenigstens eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) sowie üblicherweise anionische Tenside als Basistenside und amphotere und/oder nichtionische Tenside als Cotenside. Weitere geeignete Wirkstoffe und/oder Hilfsstoffe sind im allgemeinen ausgewählt unter Lipiden, Parfümölen, Farbstoffen, organischen Säuren, Konservierungsstoffen und Antioxidantien sowie Verdickern/Gelbildnern, Hautkonditioniermitteln und Feuchthaltemitteln.
Diese Formulierungen enthalten vorzugsweise 2 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 30 Gew.-% Tenside, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.
In den Wasch-, Dusch- und Badepräparaten können alle in Körperreinigungsmitteln üblicherweise eingesetzten anionische, neutrale, amphotere oder kationische Tenside verwendet werden. Geeignete anionische Tenside sind beispielsweise Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Al- kylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N- Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisothionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalime- tallsalze, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Trietha- nolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletherphosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid- oder Propylenoxideinheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxideinheiten im Molekül aufweisen. Dazu zählen z.B. Natriumlaurγlsulfat, Ammoniumtaurytsulfat, Natriumlaurγlethersulfat, Ammoniumlaurylethersulfat, Natriumlaurylsarkosinat, Natriumoleylsuccinat, Ammoni- umlaurγlsulfosuccinat, Natriumdodecylbenzolsulfonat, Triethanolamindodecylbenzol- sulfonat.
Geeignete amphotere Tenside sind z.B. Alkylbetaine, Alkylamidopropylbetaine, Alkyl- sulfobetaine, Alkylglycinate, Alkylcarboxyglycinate, Alkylamphoacetate oder - propionate, Alkylamphodiacetate oder -dipropionate.
Beispielsweise können Cocodimethylsulfopropylbetain, Laurylbetain, Cocamidopropyl- betain oder Natriumcocamphopropionat eingesetzt werden.
Als nichtionische Tenside sind beispielsweise geeignet die Umsetzungsprodukte von aliphatischen Alkoholen oder Alkylphenolen mit 6 bis 20 C-Atomen in der Alkylkette, die linear oder verzweigt sein kann, mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid. Die Menge Alkylenoxid beträgt ca. 6 bis 60 Mole auf ein Mol Alkohol. Ferner sind Alkylaminoxide, Mono-oder Dialkylalkanolamide, Fettsäureester von Polyethylenglykolen, ethoxylierte Fettsäureamide, Alkylpolyglycoside oder Sorbitanetherester geeignet.
Ausserdem können die Wasch-, Dusch- und Badepräparate übliche kationische Tensi- de enthalten, wie z.B. quatemäre Ammoniumverbindungen, beispielsweise Cetyltri- methylammoniumchlorid.
Weiterhin können die Duschgel-/Shampoo-Formulierungen Verdicker, wie z.B. Kochsalz, PEG-55, Propylenglykol-Oleat, PEG-120-Methylglucosedioleat und andere, so- wie Konservierungsmittel, weitere Wirk-'und Hilfsstoffe und Wasser enthalten.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungs- gemäßen Mitteln um ein Haarbehandlungsmittel.
Erfindungsgemäße Haarbehandlungsmittel enthalten vorzugsweise wenigstens eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in einer Menge im Bereich von etwa 0,000001 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,00001 bis 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels.
Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Haarbehandlungsmittel in Form eines Schaumfestigers, Haarmousses, Haargels, Shampoos, Haarsprays, Haarschaums, Spitzenfluids, Egalisierungsmittels für Dauerwellen, Haarfärbe- und -bleichmittels oder "Hot-Oil-Treatments" vor. Je nach Anwendungsgebiet können die haarkosmetischen Zubereitungen als (Aerosol-) Spray, (Aerosol-) Schaum, Gel, Gelspray, Creme, Lotion oder Wachs appliziert werden. Haarsprays umfassen dabei sowohl Aerosolsprays als auch Pumpsprays ohne Treibgas. Haarschäume umfassen sowohl Aerosolschäume wie auch Pumpschäume ohne Treibgas. Haarsprays und Haarschäume umfassen vorzugsweise überwiegend oder ausschliesslich wasserlösliche oder wasserdispergierba- re Komponenten. Sind die in den erfindungsgemäßen Haarsprays und Haarschäumen eingesetzten Verbindungen wasserdispergierbar, können sie in Form von wässrigen Mikrodispersionen mit Teilchendurchmessern von üblicherweise 1 bis 350 nm, bevor- zugt 1 bis 250 nm, zur Anwendung gebracht werden. Die Feststoffgehalte dieser Präparate liegen dabei üblicherweise in einem Bereich von etwa 0,5 bis 20 Gew.-%. Diese Mikrodispersionen benötigen in der Regel keine Emulgatoren oder Tenside zu ihrer Stabilisierung.
Die erfindungsgemäßen haarkosmetischen Formulierungen enthalten in einer bevorzugten Ausführungsform a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens einer Hydrophobin- Polypeptidsequenz (i), b) 20 bis 99,95 Gew.-% Wasser und/oder Alkohol, c) 0 bis 50 Gew.-% wenigstens eines Treibgases, d) 0 bis 5 Gew.-% wenigstens eines Emulga- tors, e) 0 bis 3 Gew.-% wenigstens eines Verdickers, sowie bis zu 25 Gew.-% weitere Bestandteile.
Unter Alkohol sind alle in der Kosmetik üblichen Alkohole zu verstehen, z.B. Ethanol, Isopropanol, n-Propanol.
Unter weiteren Bestandteilen sind die in der Kosmetik üblichen Zusätze zu verstehen, beispielsweise Treibmittel, Entschäumer, grenzflächenaktive Verbindungen, d.h. Tenside, Emulgatoren, Schaumbildner und Solubilisatoren. Die eingesetzten grenzflächen- aktiven Verbindungen können anionisch, kationisch, amphoter oder neutral sein. Weitere übliche Bestandteile können ferner sein z.B. Konservierungsmittel, Parfümöle, Trübungsmittel, Wirkstoffe, UV-Filter, Pflegestoffe wie Panthenol, Collagen, Vitamine, Eiweisshydrolysate, Alpha- und Beta-Hydroxycarbonsäuren, Stabilisatoren, pH-Wert- Regulatoren, Farbstoffe, Viskositätsregulierer, Gelbildner, Salze, Feuchthaltemittel, Rückfetter, Komplexbildner und weitere übliche Additive.
Weiterhin zählen hierzu alle in der Kosmetik bekannten Styling- und Conditioner- Polymere, die in Kombination mit den erfindungsgemäßen Hydrophobin- Polypeptidsequenzen (i) eingesetzt werden können, falls ganz spezielle Eigenschaften eingestellt werden sollen.
Als herkömmliche Haarkosmetik-Polymere eignen sich beispielsweise die zuvor genannten kationischen, anionischen, neutralen, nichtionischen und amphoteren Polyme- re, auf die hier Bezug genommen wird.
Zur Einstellung bestimmter Eigenschaften können die Zubereitungen zusätzlich auch konditionierende Substanzen auf Basis von Silikonverbindungen enthalten. Geeignete Silikonverbindungen sind beispielsweise Polyalkylsiloxane, Polyarylsiloxane, Polyary- lalkylsiloxane, Polyethersiloxane, Silikonharze oder Dimethicon Copolyole (CTFA) und aminofunktionelle Silikonverbindungen wie Amodimethicone (CTFA).
Die erfindungsgemäßen Polymerisate eignen sich insbesondere als Festigungsmittel in Haarstyling-Zubereitungen, insbesondere Haarsprays (Aerosolsprays und Pumpsprays ohne Treibgas) und Haarschäume (Aerosolschäume und Pumpschäume ohne Treibgas).
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten Spray-Zubereitungen a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 90 bis 99,9 Gew.- % Wasser und/oder Alkohol, c) 0 bis 70 Gew.-% wenigstens eines Treibmittel, d) 0 bis 20 Gew.-% weitere Bestandteile.
Treibmittel sind die für Haarsprays oder Aerosolschäume üblich verwendeten Treibmittel. Bevorzugt sind Gemische aus Propan/Butan, Pentan, Dimethylether, 1,1- Difluorethan (HFC-152 a), Kohlendioxid, Stickstoff oder Druckluft.
Eine erfindungsgemäß bevorzugte Formulierung für Aerosol haarschäume enthält a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 90 bis 99,9 Gew.-% Wasser und/oder Alkohol, c) 5 bis 20 Gew.-% eines Treibmittel, d) 0,1 bis 5 Gew.-% eines Emulgators, e) 0 bis 10 Gew.-% weitere Bestandteile.
Als Emulgatoren können alle in Haarschäumen üblicherweise eingesetzten Emulgato- ren verwendet werden. Geeignete Emulgatoren können nichtionisch, kationisch bzw. anionisch oder amphoter sein.
Beispiele für nichtionische Emulgatoren (INCI-Nomenklatur) sind Laurethe, z.B. Lau- reth-4 ; Cetethe, z.B. Cetheth-1, Polyethylenglycolcetylether, Cetearethe, z.B. Cethea- reth-25, Polyglycolfettsäureglyceride, hydroxyliertes Lecithin, Lactylester von Fettsäuren, Alkylpolyglycoside.
Beispiele für kationische Emulgatoren sind Cetyldimethyl-2-hydroxyethylammonium- dihydrogenphosphat, Cetyltrimoniumchlorid, Cetyltrimmoniumbromid, Cocotrimonium- methylsulfat, Quatemium-1 bis x (INCI).
Anionische Emulgatoren können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe der Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N-Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisethionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Triethanolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletherphosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid oder Propylenoxid- Einheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxid-Einheiten im Molekül aufweisen.
Eine erfindungsgemäß für Styling-Gele geeignete Zubereitung kann beispielsweise wie folgt zusammengesetzt sein: a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens eines Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 80 bis 99,85 Gew.-% Wasser und/oder Alkohol, c) 0 bis 3 Gew.-%, bevorzugt 0,05 bis 2 Gew.-%, eines Gelbildners, d) 0 bis 20 Gew.-% weitere Bestandteile.
Im allgemeinen wirken die erfindungsgemäß eingesetzten Hydrophobin- Polypeptidsequenzen (i) bereits "selbstverdickend", so dass in vielen Fällen bei der Herstellung von Gelen auf den Einsatz von Gelbildnern verzichtet werden kann. Ihr Einsatz kann jedoch von Vorteil sein, um spezielle rheologische oder andere anwendungstechnische Eigenschaften der Gele einzustellen. Als Gelbildner können alle in der Kosmetik üblichen Gelbildner eingesetzt werden. Hierzu zählen leicht vernetzte Polyacrylsäure, beispielsweise Carbomer (INCI), Cellulosederivate, z.B. Hydroxypro- pylcellulose, Hydroxyethylcellulose, kationisch modifizierte Cellulosen, Polysaccharide, z.B. Xanthangummi, Capryl/Caprin-Triglycerid, Natriumacrylat-Copolymere, Polyqua- temium-32 (und) Paraffinum Liquidum (INCI), Natriumacrylat-Copolymere (und) Paraf- finum Liquidum (und) PPG-1 Trideceth-6, Acrylamidopropyltrimoniumchlorid / Acryla- mid-Copolymere, Steareth-10-Allylether, Acrylat-Copolymere, Polyquaternium-37 (und) Paraffinum Liquidum (und) PPG-1 Trideceth-6, Polyquatemium 37 (und) Propylengly- coldicapratdicaprylat (und) PPG-1 Trideceth-6, Polyquatemium-7, Polyquatemium-44.
Die erfindungsgemäßen Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) können in kosmetischen Zubereitungen als Konditioniermittel eingesetzt werden.
Eine die erfindungsgemäßen Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) enthaltende Zube- reitung kann bevorzugt in Shampooformulierungen als Festigungs- und/oder Konditioniermittel eingesetzt werden. Bevorzugte Shampooformulierungen enthalten a) 0,000001 bis 10 Gew.-% wenigstens einer Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i), b) 25 bis 94,95 Gew.-% Wasser, c) 5 bis 50 Gew.-% Tenside, c) 0 bis 5 Gew.-% eines weiteren Konditioniermittels, d) 0 bis 10 Gew.-% weitere kosmetische Bestandteile.
In den Shampooformulierungen können alle in Shampoos üblicherweise eingesetzte anionische, neutrale, amphotere oder kationische Tenside verwendet werden.
Geeignete anionische Tenside sind beispielsweise Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylsulfonate, Alkylarγlsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N-
Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisothionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Trietha- nolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletherphosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid- oder Propylenoxid-Einheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxid-Einheiten im Molekül aufweisen.
Geeignet sind zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, Ammoniumlaurγsulfat, Natriumlaurγ- lethersulfat, Ammoniumlaurylethersulfat, Natriumlauroylsarkosinat, Natriumoleylsucci- nat, Ammoniumlaurylsulfosuccinat, Natriumdodecylbenzolsulfonat, Triethanolamindo- decylbenzolsulfonat. Geeignete amphotere Tenside sind zum Beispiel Alkylbetaine, Alkylamidopropylbetai- ne, Alkylsulfobetaine, Alkylglycinate, Alkylcarboxyglycinate, Alkylamphoacetate oder - propionate, Alkylamphodiacetate oder -dipropionate.
Beispielsweise können Cocodimethylsulfopropylbetain, Laurylbetain, Cocamidopropyl- betain oder Natriumcocamphopropionat eingesetzt werden.
Als nichtionische Tenside sind beispielsweise geeignet die Umsetzungsprodukte von aliphatischen Alkoholen oder Alkylphenolen mit 6 bis 20 C-Atomen in der AI kyl kette, die linear oder verzweigt sein kann, mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid. Die Menge Alkylenoxid beträgt ca. 6 bis 60 Mole auf ein Mol Alkohol. Ferner sind Alkylaminoxide, Mono- oder Dialkylalkanolamide, Fettsäureester von Polyethylenglykolen, Alkylpolygly- koside oder Sorbitanetherester geeignet.
Ausserdem können die Shampooformulierungen übliche kationische Tenside enthalten, wie z.B. quaternäre Ammoniumverbindungen, beispielsweise Cetyltrimethylammo- niumchlorid.
In den Shampooformulierungen können zur Erzielung bestimmter Effekte übliche Kon- ditioniermittel in Kombination mit den Hydrophobin-Polypeptidsequenzen (i) eingesetzt werden.
Hierzu zählen beispielsweise die zuvor genannten kationischen Polymere mit der Bezeichnung Polyquatemium nach INCI, insbesondere Copolymere aus Vinylpyrrolidon/ N-Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat FC, Luviquat&commat, HM, Luviquat MS, Luviquat Care), Copolymere aus N-Vinylpyrrolidon/Dimethylaminoethylmethacrylat, quatemisiert mit Diethylsulfat (Luviquat D PQ 11 ), Copolymere aus N-Vinylcaprolactam/N- Vinylpyrrolidon/N-Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat D Hold), kationische Cellulosederi- vate (Polyquaternium-4 und -10), Acrylamidcopolymere (Polyquaternium-7). Ferner können Eiweißhydrolysate verwendet werden, sowie konditionierende Substanzen auf Basis von Silikonverbindungen, beispielsweise Polyalkylsiloxane, Polyarylsiloxane, Polyarylalkylsiloxane, Polyethersiloxane oder Silikonharze. Weitere geeignete Silikonverbindungen sind Dimethicon Copolyole (CTFA) und aminofunktionelle Silikonverbindungen wie Amodimethicone (CTFA). Ferner können kationische Guarderivate wie Guarhydroxypropyltrimoniumchlorid (INCI) verwendet werden. Nach einer weiteren Ausführungsform dient diese haarkosmetische oder hautkosmetische Zubereitung der Pflege oder dem Schutz der Haut oder Haars und liegt in Form einer Emulsion, einer Dispersion, einer Suspension, einer wässrigen Tensidzube- reitung, einer Milch, einer Lotion, einer Creme, eines Balsams, einer Salbe, eines Gels, eines Granulats, eines Puders, eines Stiftpräparates, wie z.B. eines Lippenstifts, eines Schaums, eines Aerosols oder eines Sprays vor. Solche Formulierungen sind gut geeignet für topische Zubereitungen. Als Emulsionen kommen öl-in-Wasser-Emulsionen und Wasser-in-öl-Emulsionen oder Mikroemulsionen in Frage.
Im Regelfall wird die haarkosmetische oder hautkosmetische Zubereitung zur Applikation auf der Haut (topisch) oder Haar verwendet. Unter topischen Zubereitungen sind dabei solche Zubereitungen zu verstehen, die dazu geeignet sind, die Wirkstoffe in feiner Verteilung und bevorzugt in einer durch die Haut resorbierbaren Form auf die Haut aufzubringen. Hierfür eignen sich z.B. wässrige und wässrig-alkoholische Lösun- gen, Sprays, Schäume, Schaumaerosole, Salben, wässrige Gele, Emulsionen vom O/W- oder W/O-Typ, Mikroemulsionen oder kosmetische Stiftpräparate.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen kosmetischen Mittels enthält das Mittel einen Träger. Bevorzugt als Träger ist Wasser, ein Gas, eine Wasser-basierte Flüssigkeit, ein öl, ein Gel, eine Emulsion oder Mikroemulsion, eine Dispersion oder eine Mischung davon. Die genannten Träger zeigen eine gute Hautverträglichkeit. Besonders vorteilhaft für topische Zubereitungen sind wässrige Gele, Emulsionen oder Mikroemulsionen.
Als Emulgatoren können nichtionogene Tenside, zwitterionische Tenside, ampholyti- sche Tenside oder anionische Emulgatoren verwendet werden. Die Emulgatoren können in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Mengen von 0,1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung, enthalten sein.
Als nichtionogenes Tensid kann beispielsweise ein Tensid aus mindestens einer der folgenden Gruppen verwendet werden:
Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid und/oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen, an Fettsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen und an Alkylphenole mit 8 bis 15 C-Atomen in der Alkylgruppe; Ci2/18-Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von 1 bis 30 Mol Ethy- lenoxid an Glycerin;
Glycerinmono- und -diester und Sorbitanmono- und -diester von gesättigten und unge- sättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen und deren Ethylenoxidanlage- rungsprodukte;
Alkylmono- und -oligoglycoside mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alkylrest und deren ethoxylierte Analoga;
Anlagerungsprodukte von 15 bis 60 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
Polyol- und insbesondere Polyglycerinester, wie z.B. Polyglycerinpolyricinoleat, Polygl ycerinpoly-12-hydroxystearat oder Polyglycerindimerat. Ebenfalls geeignet sind Gemische von Verbindungen aus mehreren dieser Substanzklassen;
Anlagerungsprodukte von 2 bis 15 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
Partialester auf Basis linearer, verzweigter, ungesättigter bzw. gesättigter C6/22- Fettsäuren, Ricinolsäure sowie 12-Hydroxystearinsäure und Glycerin, Polyglycerin, Pentaerythrit, Dipenta-erythrit, Zuckeralkohole (z. B. Sorbit), Alkylglucoside (z.B. Me- thylglucosid, Butylglucosid, Laurγl-glucosid) sowie Polyglucoside (z.B. Cellulose);
Mono-, Di- und Trialkylphosphate sowie Mono-, Di- und/oder Tri-PEG-alkylphosphate und deren Salze;
Wollwachsalkohole;
Polysiloxan-Polyalkyl-Polyether-Copolymere bzw. entsprechende Derivate;
Mischester aus Pentaerythrit, Fettsäuren, Citronensäure und Fettalkohol gemäß DE PS 1165574 und/oder Mischester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, Methyl- glucose und Polyolen, vorzugsweise Glycerin oder Polyglycerin sowie Polyalkylengly- cole und Betaine.
Weiterhin können als Emulgatoren zwitterionische Tenside verwendet werden. Als zwitterionische Tenside werden solche oberflächenaktiven Verbindungen bezeichnet, die im Molekül mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe und mindestens eine Car- boxylat- oder eine Sulfonatgruppe tragen. Besonders geeignete zwitterionische Tensi- de sind die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosalkyldimethyl-ammoniumglycinat, N-Acylamino-propyl-N,N dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacylaminopropyldimethylam- monium-glycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethylimidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydro- xyethyl-carboxymethylglycinat. Besonders bevorzugt ist das unter der CTFA Bezeichnung Cocamidopropyl Betaine bekannte Fettsäureamid-Derivat.
Ebenfalls geeignete Emulgatoren sind ampholytische Tenside. Unter ampholytischen Tensiden werden solche oberflächenaktiven Verbindungen verstanden, die außer einer C8,i8-Alkyl- oder -Acylgruppe im Molekül mindestens eine freie Aminogruppe und mindestens eine -COOH- oder -S03H-Gruppe enthalten und zur Ausbildung innerer Salze befähigt sind. Beispiele für geeignete ampholytische Tenside sind N-Alkylglycine, N- Alkylpropionsäuren , N-Alkylamino-buttersäuren , N Alkyliminodipropionsäuren, N- Hydroxyethyl-N-alkylamido-propylglycine, N-Alkyltaurine, N Alkylsarcosine, 2- Alkylaminopropionsäuren und Alkylaminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C- Atomen in der Alkylgruppe.
Besonders bevorzugte ampholytische Tenside sind das N-Kokosalkyl-aminopropionat , Kokosacylaminoethylaminopropionat und das Ci2/i8-Acylsarcosin. Neben den ampholytischen kommen auch quartäre Emulgatoren in Betracht, wobei solche vom Typ der Esterquats, vorzugsweise methyl-quatemierte Difettsäuretriethanolaminester-Salze, besonders bevorzugt sind. Des weiteren können als anionische Emulgatoren Alky- lethersulfate, Monoglyceridsulfate, Fettsäuresulfate, Sulfosuccinate und/oder Ethercar- bonsäuren eingesetzt werden.
Als ölkörper kommen Guerbetalkohole auf Basis von Fettalkoholen mit 6 bis 18, vorzugsweise 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, Ester von linearen C6-C22-Fettsäuren mit linea- ren C6-C22-Fettaikohoien, Ester von verzweigten C6-Ci3-Carbonsäuren mit linearen C6- C22-FeUaI koholen, Ester von linearen C6-C22-Fettsäuren mit verzweigten Alkoholen, insbesondere 2-Ethylhexanol, Ester von linearen und/oder verzweigten Fettsäuren mit mehrwertigen Alkoholen (wie z.B. Propylenglycol, Dimerdiol oder Trimertriol) und/oder Guerbetalkoholen, Triglyceride auf Basis C6-Cio-Fettsäuren, flüssige Mono-/Di-, Trigly- ceridmischungen auf Basis von C6-Ci8-Fettsäuren, Ester von C6-C22-Fettalkoholen und/oder Guerbetalkoholen mit aromatischen Carbonsäuren, insbesondere Benzoesäure, Ester von C2-Ci2-Dicarbonsäuren mit linearen oder verzweigten Alkoholen mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen oder Polyolen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und 2 bis 6 Hydroxylgruppen, pflanzliche öle, verzweigte primäre Alkohole, substituierte Cyclohe- xane, lineare C6-C22-Fettalkoholcarbonate, Guerbetcarbonate, Ester der Benzoesäure mit linearen und/oder verzweigten C6-C22-Alkoholen (z.B. Finsolv® TN), Dialkylether, Ringöffnungsprodukte von epoxidierten Fettsäureestern mit Polyolen, Siliconöle und/oder aliphatische bzw. naphthenische Kohlenwasserstoffe in Betracht. Als ölkör- per können ferner auch Siliconverbindungen eingesetzt werden, beispielsweise Di- methylpolysiloxane, Methylphenylpolysiloxane, cyclische Silicone sowie amino-, fett- säure-, alkohol-, polyether-, epoxy-, fluor-, alkyl- und/oder glykosidmodifizierte Silicon- Verbindungen, die bei Raumtemperatur sowohl flüssig als auch harzförmig vorliegen können. Die ölkörper können in den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von 1 bis 90, vorzugsweise 5 bis 80, und insbesondere 10 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung enthalten sein.
Durch Kopplung von entsprechenden Verbindungen an ein Hydrophobin-Polypeptid (i) kann die Wirkdauer auf der Haut signifikant verlängert werden. Die Kopplung erfolgt wie oben beschrieben, Formulierung und Applikation erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden. Insbesondere für Deodorantien sind geeignete Effektormoleküle (ii): Parfumöle, Cyclodextrine, Ionenaustauscher, Zink-Ricinoleat, keimhemmen- de/bakteriostatische Verbindungen (z.B. DCMX, Irgasan DP 300, TCC ).
Für Antitranspirantien geeignet sind: Tannine, und Zink-/Aluminiumsalze.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für die erfindungsgemässen Substanzen ist der the- rapeutische oder prophylaktische Einsatz bei bestimmten Erkrankungen der Haut und der Schleimhäute. Besonders im Mund-, Rachen- und Nasenraum ist es von Vorteil, Wirkstoffe zur Therapie/Prophylaxe über eine Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) verstärkt und länger andauernd zu binden. Anwendungsgebiete hierfür sind insbesondere:
- virale Erkrankungen (z.B. Herpes, Coxsackie, Varicella zoster, Cytomegalovirus etc) bakterielle Erkrankungen (z.B. TB, Syphilis etc.) pilzliche Erkrankungen (z.B. Candida, Cryptococcus, Histoplasmosis, Aspergillus,
Mucormycosis etc.) - Tumorerkrankungen (z.B. Melanome, Adenome etc.)
Autoimmunerkrankungen (z.B. PEMPHIGUS VULGARIS, BULLOUS PEMPHIGOID, SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSA etc.)
Sonnenbrand parasitärer Befall (z.B. Zecken, Milben, Flöhe etc.) - Insektenkontakt (z.B. blutsaugende Insekten wie Anopheles etc.) Die zur Therapie oder Prophylaxe geeigneten Substanzen (z.B. Corticoide, immunsup- primierende Verbindungen, Antibiotika, Antimykotika, anti-virale Verbindungen, Insek- tenrepellent etc.) können über die oben beschriebenen Linker (je nach zu koppelnder Funktionalität ein zu optimierender Linker) an die Keratin-bindenden Polypeptide (i) gekoppelt werden.
Experimenteller Teil
Beispiel 1
Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-His6/ yaaE-His6
Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (HaI 572/ HaI 573) wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD / yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine Ncol bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als I nsert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS6 bzw. YAAE::HIS6 verwendet werden.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
Beispiel 2
Klonierung von yaad-Hydrophobin DewA-His6
Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenre- aktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklea- se Barn H I geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als I nsert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 klo- niert.
Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins beste- hend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS6 verwendet werden.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417 : CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC
Beispiel 3
Klonierung von yaad-Hydrophobin RodA-His6
Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Beispiel 4
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF1-His6
Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418. Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 5
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF2-His6
Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418. Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 6
Klonierung von yaad-Hydrophobin SC3-His6
Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.
Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Beispiel 7 Fermentation des rekombinanten E. coli Stammes yaad-Hydrophobin DewA-His6
Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His6 ex- primierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 11 Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.
13.51 LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 2Ol Fermenter mit 0,51 Vorkultur (OD600nm 1 :10 gegen H20 gemessen) animpfen. Bei einer OD60nm von -3.5 Zugabe von 140ml 10OmM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentations- brühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
Beispiel 8
Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins
(Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)
100 g Zellpellet (100 - 500 mg Hydrophobin) werden mit 50 rtiM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum ZeI- laufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M- 110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA- Rotor, 250 ml Zentrifugen becher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (Abbildung 1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E. coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Nik- kel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 rtiM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 rtiM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
Abbildung 1 zeigt die Reinigung des erfindungsgemässen Hydrophobins: Spur 1 : Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1 :10 Verdünnung)
Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt
Spuren 3 - 5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen
Das erfindungsgemässe Hydrophobin der Abbildung 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hy- drophobins.
Beispiel 9
Beschichtung/Evaluierung von Oberflächen mit Hydrophobin Die Evaluierung der Beschichtungseigenschaften von Hydrophobin bzw. Hydrophobin- fusionsprotein wird bevorzugt auf Glas bzw. Teflon als Modelle für eine hydrophile bzw. hydrophobe Oberflächen vorgenommen.
Standard-Versuche für Beschichtung
Glas:
Konzentration Hydrophobin: 1 - 100 μg/mL
Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur: 80°C) in 5OmM Na- Acetat pH 4 + 0, 1 % Tween 20 nach Beschichtung waschen in VE-Wasser
- danach Inkubation 10min / 800C / 1% SDS
- waschen in VE-Wasser
Teflon:
Konzentration: 1 - 100 μg/mL
Inkubation von Teflonplättchen über Nacht (Temperatur: 80°C) in 1OmM Tris pH 8 nach Beschichtung waschen in VE-Wasser - Inkubation 10min / 800C / 0,1% Tween 20
- waschen in VE-Wasser
- danach Inkubation 10min / 800C / 1% SDS
- waschen in VE-Wasser
Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt. Es ergeben sich z.B. folgende Werte:
Ansatz mit yaad-DewA Fusionsprotein gemäss Beispiel 8(Kontrolle: ohne Protein; y- aad-dewA-his6: 100 μg/ml gereinigter Fusionspartner):
Beispiel 10
Beschichtung/Evaluierung von Oberflächen mit Hydrophobin
Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim): Konzentration Hydrophobin: 100 μg/mL
- Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur 800C) in 5OmM Na- Acetat pH 4 + 0,1% Tween 20 nach Beschichtung waschen in destilliertem Wasser
- danach Inkubation 10min / 800C / 1% SDS-Lösung in dest. Wasser
- waschen in dest. Wasser
Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; eine Beschichtung mit einem funktionellen Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his6) ergab Kontakt- winkel von 75 ± 5°.
Beispiel 11
Bindung an Haut 1 (Qualitativ) Es wurde ein visueller qualitativer Test entwickelt, um zu überprüfen, ob Hydrophobin an Haut bindet.
Verwendete Lösungen:
Blockierungslsg: DIG Wash+Bufferset 1585762 BoehringerMA (WxLsg) in TBS verdünnt
TBS: 2OmM Tris; 15OmM NaCIpH 7,5 TTBS: TBS + 0,05% Tween20
Der erste Schritt ist der Transfer der äußeren Keratinschicht von der Haut auf einen stabilen Träger. Dazu wurde ein Klarsichtklebestreifen fest auf enthaarte menschliche Haut aufgebracht und wieder entfernt. Der Test kann direkt auf dem Klarsichtklebestreifen durchgeführt werden oder die anhaftende Keratinschicht durch erneutes Auf- kleben auf einen Glasobjektträger überführt werden. Der Nachweis von Bindung wurde wie folgt vorgenommen: zur Inkubation mit den verschiedenen Reagentien, Transfer in ein Falconge- fäß ggf. Zugabe von Ethanol zur Entfettung, Entfernung von Ethanol und Trock- nung der Objektträger
1 h bei Raumtemperatur inkubiert mit Blocking Puffer 2x 5 min gewaschen mit TTBS 1x 5 min gewaschen mit TBS
Inkubation mit dem zu testenden Hydrophobin (gekoppelt an tag - z.B. HiS6, HA etc.) bzw. Kontrollprotein in TBS / 0,05% Tween 20 während 2-4 h bei
Raumtemperatur Entfernung des Überstands 3x Waschen mit TBS
1 h bei Raumtemperatur Inkubation mit Monoclonal Anti-poly-Histidin Anti- körper, verdünnt 1 :2000 in TBS + 0,01 % Blocking
2x 5min gewaschen mit TTBS 1x 5 min gewaschen mit TBS
1 h bei Raumtemperatur Inkubation mit Anti-Mouse IgG Alkalische- Phosphatase-Conjugate, verdünnt 1 :5000 in TBS + 0,01 % Blocking - 2x 5 min gewaschen mit TTBS
1x 5 min gewaschen mit TBS Zugabe von Phosphatasesubstrat (NBT-BCIP; Boehringer MA 1 Tablette/40 ml Wasser 2,5 min; Stopp: mit Wasser)
Optische Detektion des Farbniederschlages mit bloßem Auge oder im Mikroskop. Ein blauer Farbniederschlag zeigt an, dass Hydrophobin an die Haut gebunden hat.
Beispiel 12
Bindung an Haut 2 (Quantitativ)
Es wurde ein quantitativer Test entwickelt, mit dem sich die Haar/Haut-Bindungsstärke des Hydrophobins mit unspezifischen Proteinen vergleichen lässt (Abb. 2). Aus einem aufgetauten trockenem Stück Haut ohne Haare (human oder Schwein), wurde mit einem 5 mm Korkbohrer ein Stück herausgebohrt (bzw. bei einem Oberflächentest ein Stück Haut in ein Falcondeckel eingepasst). Die Hautprobe wurde dann auf eine Dicke von 2-3 mm gebracht um evt. vorhandenes Gewebe zu entfernen. Die Hautprobe wurde anschließend in ein Eppendorfgefäß (Protein-Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen (siehe auch Abbildung 2): 2x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Zugabe von 1 ml 1% BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raum- temperatur, leichte Schwenkbewegungen (900rpm).
Entfernung des Überstands
Zugabe von 100 μg Hydrophobin in PBS+0,05 % Tween 20; Inkubation 2 h bei Raumtemperatur und leichten Schwenkbewegungen (900 rpm). Entfernung des Überstands - 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA oder spezifischen KBD)-Antikörper mit Peroxidase Conjugate (1 :2000 in PBS / 0,05% Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtempera- tur, leichte Schwenkbewegung (900 rpm)
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Zugabe von Peroxidasesubstrat (1ml / Eppendorfgefäß; Zusammensetzung s.u.) Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 1 :30 Minuten). Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen. Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen
Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten):
0,1 ml TMB-Lösung (42 rtiM TMB in DMSO) + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
Beispiel 13
Bindung an Haar (Quantitativ)
Um die Bindungsstärke des Hydrophobins an Haar auch im Vergleich zu anderen Proteinen nachweisen zu können, wurde ein quantitativer Assay entwickelt (Abb. 2). Bei diesem Test wurde zunächst Haar mit Hydrophobin inkubiert und überschüssiges Hy- drophobin abgewaschen. Anschließend wurde eine Antikörper-Peroxidase-Konjugat über das His-Tag des Hydrophobins gekoppelt. Nicht gebundene Antikörper- Peroxidase-Konjugat wurde erneut abgewaschen. Das gebundene Antikörper- Peroxidase-Konjugat [Mono-clonal Antipoly-Histidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] kann ein farbloses Substrat (TMB) in ein farbiges Produkt umsetzen, das photometrisch bei 405 nm vermessen wurde. Die Stärke der Absorption zeigt die Menge an gebundenem Hydrophobin bzw. Vergleichsprotein an. Als Vergleichsprotein wurde z.B. YaaD aus B. subtilis gewählt, das ebenfalls - wie es für diesen Test nötig ist - ein His-Tag zur Detektion aufwies. Anstatt des His-Tag können auch andere, spezifische Antikörper konjugiert mit Peroxidase verwendet werden.
5 mg Haare (human) werden in 5 mm lange Stücke geschnitten und in Eppendorfgefä- ße (Protein-Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen: - Zugabe von 1 ml Ethanol zur Entfettung
Zentrifugation, Entfernung von Ethanol und Waschung der Haare mit H2O Zugabe von 1 ml 1% BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen. Zentrifugation, Entfernung des Überstands - Zugabe des zu testenden Hydrophobins (gekoppelt an tag - z.B. HiS6, HA etc.) bzw. Kontroll protein in 1 ml PBS / 0,05 % Tween 20; Inkubation für 16 h bei 4° C (oder mindestens 2 h bei Raumtemperatur) bei leichten Schwen kbewegu ngen . Zentrifugation, Entfernung des Überstands 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20 - Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA)-Antikörper mit Peroxidase-Konjugat (1 :2000 in PBS / 0,05 % Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized pow- der, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung - 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml / Eppendorfgefäß) Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 2 Minuten). Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen. Die Absorption wird bei 405 nm gemessen
Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten):
0,1 ml TMB-Lösung (42 rtiM TMB in DMSO) + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
BSA = Bovine serum albumin PBS = Phosphat gepufferte Salzlösung Tween 20 = Polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n ca. 20 TMB = 3,5,3,1O1 Tetramethylbenzidin
Ein beispielhaft für Hydrophobin durchgeführter Bindungs-Test an Haar zeigte eine deutliche Überlegenheit der Bindung von Hydrophobin an Haar gegenüber einer wesentlichen schlechteren Bindung des Vergleichsproteins YaaD:
Tabelle 1.: Quantitativer Hydrophobin Aktivitäts-Test Haar: 1) Puffer; 2) Vergleichsprotein yaad; 3) Hydrophobin. Die Tabelle zeigt die gemessenen Absorptionswerte bei 405 nm. Analog zu Beispiel 11 (Bindung an Haut) kann auch die Bindung an Schleimhaut gemessen werden, indem man von Schleimhaut (beispielsweise menschlicher Mundschleimhaut) mittels eines Klarsichtklebestreifens eine Probe entnimmt, die anschlie- ssend auf Bindungswirkung untersucht werden kann.
Die Bindung an Zähne kann ermittelt werden, indem die zu untersuchenden Polypep- tidsequenzen direkt mit der Zahnoberfläche (beispielsweise Rinderzähne) inkubiert und entsprechend Beispiel 11 vermessen werden.
Beispiel 14
Derivatisierung von Hydrophobin mit Farbstoff „Alexa" und Bindung an Haar
Eine Möglichkeit zur Kopplung von Wirk- oder Effektstoffen an Proteine (allgemeines Prinzip Abb. 3) erfolgt über die SH-Gruppen der Cysteine. Vor Kopplung des Farbstoffes Alexa Fluor 532 werden die Disulfidbrücken des Hydrophobins gespalten:
Alexa Fluor 532
1 mg Hydrophobin 0,5 ml Puffer (75 rtiM Tris pH 8,0
2,5 rtiM EDTA
1 rtiM DTT) Inkubation für 30 Minuten bei 37°C
Die Kopplung des Farbstoffes erfolgt nach Herstellerangaben (Alexa 532 Protein Labe- ling Kit; Molecular Probes; MP-A-10236) Die Beschichtung von human Haar mit Alexa-gekoppeltem Hydrophobin wird wie folgt durchgeführt:
10 mg human Haar mit 50 μg/ml Alexa-Hydrophobin bzw. Kontrollprotein yaad bzw. ungekoppeltem Farbstoff Alexa 532 in Puffer TBS 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren
2x waschen mit TBS/0,05% Tween 20
1x waschen mit TBS
1x waschen mit TBS/1 % SDS
Detektion im Fluoreszenzmikroskop (Abb. 4)
Beispiel 15
Verwendung des Hydrophobins in einer Emulsion zur Tagespflege - Typ O/W
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
67,8 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 0,2 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Ascorbate, Tocopherol, Retinol
1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
E q.s. Sodium Hydroxide WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
63,8 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 0,2 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Ascorbate, Tocopherol, Retinol
5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
E q.s. Sodium Hydroxide
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Pha- se B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C in die kombinierten Phasen A und B einrühren und nochmals homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase D zugeben, den pH-Wert mit Phase E auf etwa 6.5 einstellen, homogenisieren und unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Hinweis: Die Formulierung wird ohne Schutzgas hergestellt. Die Abfüllung muß in sauerstoffundurchlässige Verpackungen, z.B. Aluminiumtuben erfolgen. Beispiel 16
Verwendung des Hydrophobins in einer schützenden Tagescreme - Typ O/W
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
68,6 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 1 ,0 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
E q.s. Sodium Hydroxide
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
64,6 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 1 ,0 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
E q.s. Sodium Hydroxide
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 800C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C in die kombinierten Phasen A und B einarbeiten und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen. Phase D hinzugeben, den pH-Wert mit Phase E auf ca. 6.5 einstellen und homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Beispiel 17
Verwendung des Hydrophobins in einer Gesichtsreinigungslotion - Typ O/W
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
1 ,5 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasilosane
2,0 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
B 3,5 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
C 1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Konservierungsmittel q.s. Parfümöl
D 3,0 Polyq uatern iu m-44
0,5 Cocotrimonium Methosulfate
0,5 Ceteareth-25
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
4,0 Propylene Glycol
0,1 Disodium EDTA
1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
60,7 Aqua dem. WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
1 ,5 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasilosane
2,0 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
B 3,5 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
C 1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Konservierungsmittel q.s. Parfümöl
D 3,0 Polyq uatern iu m-44
0,5 Cocotrimonium Methosulfate
0,5 Ceteareth-25
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
4,0 Propylene Glycol
0,1 Disodium EDTA
5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
56,7 Aqua dem.
Herstellung: Phase A lösen. Phase B in Phase A einrühren, Phase C in die kombinierten Phasen A und B einarbeiten. Phase D lösen, in die kombinierten Phasen A, B und C einrühren und homogenisieren. 15min nachrühren.
Beispiel 18
Verwendung des Hydrophobins in einem Daily Care Body Spray
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
1 ,0 Polyq uatern iu m-44
3,0 Propylene Glycol
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
1 ,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
10,0 Octyldodecanol 0,5 PVP
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
3,0 C12-15 Alkyl Benzoate
3,0 Glycerin
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,3 Bisabolol
1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
59,2 Alcohol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
1 ,0 Polyquaternium-44
3,0 Propylene Glycol
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
1 ,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
10,0 Octyldodecanol
0,5 PVP
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
3,0 C12-15 Alkyl Benzoate
3,0 Glycerin
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,3 Bisabolol
5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
55,2 Alcohol
Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und klar lösen.
Beispiel 19
Verwendung des Hydrophobins in einem Hautpflegegel
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,6 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
15,0 Alcohol
0,1 Bisabolol
0,5 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 3,0 Panthenol
0,6 Carbomer
1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
75,4 Aqua dem,
C 0,8 Triethanolamine
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,6 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
15,0 Alcohol
0,1 Bisabolol
0,5 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 3,0 Panthenol
0,6 Carbomer
5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
71,4 Aqua dem,
C 0,8 Triethanolamine
Herstellung: Die Phase A klar lösen. Phase B quellen lassen und mit Phase C neutralisieren. Phase A in die homogenisierte Phase B einrühren und homogenisieren. Beispiel 20
Verwendung des Hydrophobins in einer After Shave Lotion
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Tocopheryl Acetate
1 ,0 Bisabolol
0,1 Parfümöl
0,3 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
B 15,0 Alcohol
1 ,0 Panthenol
3,0 Glycerin
1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
0,1 Triethanolamine
63,5 Aqua dem.
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Tocopheryl Acetate
1 ,0 Bisabolol
0,1 Parfümöl
0,3 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
B 15,0 Alcohol
1 ,0 Panthenol
3,0 Glycerin
5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
0,1 Triethanolamine
59,5 Aqua dem.
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B lösen, in Phase A einarbeiten und homogenisieren.
Beispiel 21 Verwendung des Hydrophobins in einer After Sun Lotion
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 0,4 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
15,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 1 ,0 Panthenol
15,0 Alcohol
3,0 Glycerin
1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
63,2 Aqua dem,
C 0,2 Triethanolamine
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 0,4 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
15,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 1 ,0 Panthenol
15,0 Alcohol
3,0 Glycerin
5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
59,2 Aqua dem,
C 0,2 Triethanolamine
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B unter Homogenisieren in Phase A einrühren. Mit Phase C neutralisieren und erneut homogenisieren. Beispiel 22
Verwendung des Hydrophobins in einer Sonnenschutzlotion
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 4,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
3,0 Octocrylene
2,5 Di-C12-13 Alkyl Malate
0,5 Tocopheryl Acetate
4,0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Distearate
B 3,5 Cetearyl Isononanoate
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
5,0 Isohexadecane
2,5 Di-C12-13 Alkyl Malate
3,0 Titanium Dioxide, Trimethoxycaprylylsilane
C 5,0 Glycerin
1 ,0 Sodium Cetearyl Sulfate
0,5 Xanthan Gum
59,7 Aqua dem.
D 1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
1 ,0 Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Butylparaben, Propylpa raben,
Isobutylparaben
0,3 Bisabolol
WS 5%: % Inhaltsstoff (INCI)
A 4,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
3,0 Octocrylene
2,5 Di-C12-13 Alkyl Malate 0,5 Tocopheryl Acetate
4,0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Distearate
B 3,5 Cetearyl Isononanoate 1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
5,0 Isohexadecane
2,5 Di-C12-13 Alkyl Malate
3,0 Titanium Dioxide, Trimethoxycaprylylsilane
C 5,0 Glycerin
1 ,0 Sodium Cetearyl Sulfate
0,5 Xanthan Gum
55,7 Aqua dem.
D 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
1 ,0 Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Butylparaben, Propylpa raben,
Isobutylparaben
0.3 Bisabolol
Herstellung: Die Komponenten der Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C auf ca. 800C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Unter Rühren auf ca. 400C abkühlen, Phase D zugeben und nochmals homogenisieren.
Beispiel 23
Verwendung des Hydrophobins in einer Sonnenschutzlotion - Typ O/W
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
3,0 Tribehenin
2,0 Cetearyl Alcohol
2,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
1 ,0 Ethylhexyl Triazone
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
7,0 Isopropyl Myristate
B 5,0 Zinc Oxide, Triethoxycaprylylsilane C 0,2 Xanthan Gum
0,5 Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer,
Squalane, Polysorbate 60
0,2 Disodium EDTA
5,0 Propylene Glycol
0,5 Panthenol
60,9 Aqua dem.
D 1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
0,5 Phenoxyethanol, Methylparaben, Butylparaben, Ethylparaben, Propylpa raben, Isopropylparaben
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
3,0 Tribehenin
2,0 Cetearyl Alcohol
2,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
1 ,0 Ethylhexyl Triazone
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
7,0 Isopropyl Myristate
B 5,0 Zinc Oxide, Triethoxycaprylylsilane
C 0,2 Xanthan Gum
0,5 Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer,
Squalane, Polysorbate 60
0,2 Disodium EDTA
5,0 Propylene Glycol
0,5 Panthenol
56,9 Aqua dem.
D 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
0,5 Phenoxyethanol, Methylparaben, Butylparaben, Ethylparaben, Propylpa raben, Isopropylparaben
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol Herstellung: Phase A auf ca. 800C erwärmen, Phase B einrühren und 3min homogenisieren. Phase C ebenfalls auf 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Abkühlen auf ca. 40°C, Phase D einrühren und nochmals homogenisieren.
Beispiel 24
Verwendung des Hydrophobins in einer Sonnenschutlotion - Typ O/W
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,5 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
1 ,5 Ceteareth-25
7,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
2,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
0,5 Bees Wax
3,0 Cetearyl Alcohol
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
B 5,0 Titanium Dioxide, Silica, Methicone, Alumina
C 3,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
0,3 Xanthan Gum
1 ,0 Decyl Glucoside
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
56,3 Aqua dem.
D 1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI) A 3,5 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
1 ,5 Ceteareth-25
7,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate 2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
2,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
0,5 Bees Wax
3,0 Cetearyl Alcohol
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
B 5,0 Titanium Dioxide, Silica, Methicone, Alumina
C 3,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
0,3 Xanthan Gum
1 ,0 Decyl Glucoside
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
52,3 Aqua dem.
D 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
Herstellung: Phase A auf ca. 80°C erwärmen, Phase B einrühren und 3min homoge- nisieren. Phase C ebenfalls auf 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Abkühlen auf ca. 40°C, Phase D einrühren und nochmals homogenisieren.
Beispiel 25 Verwendung des Hydrophobins in einem Fußbalsam
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
5,0 Cetearyl Ethylhexanoate
4,0 Cetyl Alcohol
4,0 Glyceryl Stearate
5,0 Mineral OiI
0,2 Menthol
0,5 Camphor
B 69,3 Aqua dem. q.s. Konservierungsmittel
C 1 ,0 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate
D 1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
5,0 Witch Hazel Extract
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
5,0 Cetearyl Ethylhexanoate
4,0 Cetyl Alcohol
4,0 Glyceryl Stearate
5,0 Mineral OiI
0,2 Menthol
0,5 Camphor
B 65,3 Aqua dem. q.s. Konservierungsmittel
C 1 ,0 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate
D 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
5,0 Witch Hazel Extract
Herstellung: Die Komponenten der Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A unter Homogenisieren einrühren. Unter Rühren abkühlen auf ca. 400C, die Phasen C und D hinzugeben und kurz nachhomogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Beispiel 26 Verwendung des Hydrophobins in einer W/O Emulsion mit Bisabolol
WS 1%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
8,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate
15,0 Mineral OiI 0,3 Magnesium Stearate
0,3 Aluminum Stearate
2,0 PEG-45/Dodecyl Glycol Copolymer
B 5,0 Glycerin
0,7 Magnesium Sulfate
55,6 Aqua dem.
C 1 ,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
0,5 Tocopheryl Acetate
0,6 Bisabolol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
8,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate
15,0 Mineral OiI
0,3 Magnesium Stearate
0,3 Aluminum Stearate
2,0 PEG-45/Dodecyl Glycol Copolymer
B 5,0 Glycerin
0,7 Magnesium Sulfate
51,6 Aqua dem.
C 5,0 wäßrige Lösung mit ca. 5% Hydrophobin
0,5 Tocopheryl Acetate
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 85°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase C hinzugeben und nochmals kurz homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Zuordnung der Sequenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenzen im Sequenzprotokoll

Claims

Patentansprüche
1. Kosmetische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, Schleimhäuten und Zähnen, enthaltend mindestens eine Hydrophobin Po- lypeptidsequenz (i)
Xn-C -Xi_5o-C -Xo-5-C -Xp-C -Xi-ioo-C -Xi_5o-C -X0-S-C -Xi-S0-C -Xm (I)
wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 500 stehen und C für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit Xn oder Xn, oder Xp abgekürzten Peptidsequenzen für eine minde- stens 20 Aminosäuren lange Peptidsequenz steht , die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von mindestens 20° bewirken, in einem kosmetisch verträglichen Medium.
2. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) eine Bindungsaffinität zu menschlichem oder tierischem Haar-, Nagel- oder Hautkeratin oder Schleimhäuten o- der Zähnen besitzt.
3. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Xn oder Xn, oder Xp für eine Human- Keratin-bindende Domäne steht.
4. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) in einer Menge von 0,000001 bis 10 Gew.-% enthält.
5. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie neben der Hydrophobin-Polypeptidsequenz (i) mindestens einen kos- metischen Wirkstoff enthält.
20050355 Dp/Ass 21.06.2006 4 Abb.
6. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der kosmetische Wirkstoff ausgewählt wird aus der Gruppe der natürlichen oder synthetischen Polymere, Pigmente, Feuchthaltemittel, öle, Wachse, Enzyme, Mineralien, Vitamine, Sonnenschutzmittel, Farbstoffe, Duftstoffe, An- tioxidantien und Konservierungsmittel.
7. Verwendung von kosmetischen Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 1-5 zur Verbesserung der Kämmbarkeit von Haaren.
8. Verwendung von kosmetischen Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 1-5 zur Verbesserung der Festigung von Haaren.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, enthaltend mindestens eine Hydrophobin Polypeptidsequenz (i) in ei- nem pharmazeutisch verträglichen Medium.
10. Konjugate aus Hydrophobin und verschiedenen Wirk- und Effektstoffen enthaltend ein Hydrophobin das kovalent mit einem Effektormolekül verknüpft ist.
11. Konjugate nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Effektormolekül ausgewählt ist aus der Gruppe der Farbstoffe, Antioxidantien, UV-Filter, Vitamine, Fungizide, Insektizide und Biozide.
12. Konjugate nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin eine Polypeptidsequenz (i) der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 ist.
13. Kosmetische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, enthaltend mindestens ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 10-12.
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