EP1957525A2 - Reaktivfarbstoffe enthaltende keratinbindende effektormoleküle - Google Patents

Reaktivfarbstoffe enthaltende keratinbindende effektormoleküle

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Publication number
EP1957525A2
EP1957525A2 EP06830097A EP06830097A EP1957525A2 EP 1957525 A2 EP1957525 A2 EP 1957525A2 EP 06830097 A EP06830097 A EP 06830097A EP 06830097 A EP06830097 A EP 06830097A EP 1957525 A2 EP1957525 A2 EP 1957525A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
keratin
binding
hair
nucleic acid
dyes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06830097A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heiko Barg
Burghard Liebmann
Martin VÖLKERT
Arne Ptock
Laszlo Somogyi
Heike Reents
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to EP06830097A priority Critical patent/EP1957525A2/de
Publication of EP1957525A2 publication Critical patent/EP1957525A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/06—Preparations for styling the hair, e.g. by temporary shaping or colouring
    • A61Q5/065—Preparations for temporary colouring the hair, e.g. direct dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/10—Preparations for permanently dyeing the hair
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/94—Involves covalent bonding to the substrate

Definitions

  • the invention relates to keratin-binding effector molecules containing reactive dyes and keratin-binding polypeptides, and to their use in hair dye preparations and the hair dye preparations themselves.
  • Another object of the present invention is a method for dyeing hair.
  • Hair coloring compositions are classified into three classes depending on their color fastness: temporary hair dyes that are only 1-2 shampoos, semi-permanent hair dyes that need to be renewed after 8-10 washes, and permanent hair dyes that are not - wash out.
  • Temporary and semipermanent hair dyes are referred to as non-oxidative.
  • the dyes attach to the keratin of the hair or penetrate into the hair fiber.
  • With permanent hair dyes by far the most widely used hair dyes, the colors of colorless precursors are formed directly on and in the hair by chemical reaction in the presence of hydrogen peroxide, which acts as the oxidant. The hair is completely dyed through, the color is not washable.
  • These hair dyes are referred to as oxidative hair dyes.
  • the permanent hair coloring is very resistant to shampooing, exposure to light and other hair treatment methods. It is the most widely used and has a market share of approx. 80% among hair dye products. It only needs, due to the hair growth, about every month to be renewed.
  • the dyes are formed directly on and in the hair, by chemical reactions to which the undyed intermediates or precursors are subjected. It run from oxidation reactions and coupling processes or condensations, which are caused by hydrogen peroxide in the presence of ammonia or monoethanolamine.
  • the use of hydrogen peroxide as an oxidizing agent is necessary because it not only initiates dye formation, but also destroys the melanin pigments of the hair and thus causes bleaching, which is why this dyeing process is also referred to as lightening dyeing.
  • hair dyes are usually in the form of aqueous solutions, preferably thickened solutions or emulsions and contain, in addition to dyes, for example, fatty alcohols and / or other oil components, emulsifiers and surfactants, and optionally alcohols.
  • Oxidizing hair dyes usually consist of two components, namely
  • Typical administration forms for such permanent or oxidation hair dyes are cream hair colors and hair coloring gels.
  • hair dyes contain two components: an oxidizing agent and a color cream.
  • the aromatic amines found in hair dyes have been particularly criticized in the recent past. During staining, they should be absorbed into the body via the head and broken down in the liver. In the bladder, the degradation products are then partially converted to carcinogenic substances.
  • active compound compounds which have a keratin-binding property and are also suitable for the production of cosmetic agents and / or hair colorants.
  • suitable compounds which can be coupled via a covalent bond to a polypeptide having keratin-binding properties.
  • these objects could be achieved as described below by the coupling of chemical dyes to keratin-binding polypeptides.
  • the invention relates to keratin-binding effector molecules comprising (a) at least one reactive dye (i) and (b) at least one keratin-binding polypeptide (ii).
  • said keratin-binding effector molecules contain at least one keratin-binding polypeptide (ii) which has a binding affinity to human skin, hair or nail keratin.
  • the keratin-binding polypeptide (ii) mentioned under (b) comprises
  • polypeptide which is at least 40% identical to at least one of the sequences according to SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106,
  • the keratin-binding polypeptide (ii) used according to the invention is encoded by a nucleic acid molecule comprising at least one nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule which encodes a polypeptide comprising those shown in SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 , 36, 38, 40,
  • nucleic acid molecule which has at least one polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID No .: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 or 169;
  • nucleic acid molecule which comprises a polypeptide according to the sequences SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 , 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 , 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 16, 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132 , 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156,
  • nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence corresponding to at least one of the sequences according to SEQ ID No .: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57,
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide which is derived from a monoclonal antibody directed against a polypeptide which is expressed by the
  • nucleic acid molecule encoding a keratin-binding protein that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid molecule according to (a) to (c);
  • nucleic acid molecule coding for a keratin-binding protein which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt (nucleotides), preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt , 100 nt, 200 nt or 500 nt as a probe under stringent
  • Hybridization conditions can be isolated, and h) Nucleic acid molecule, which by back translation of one of the in the sequences SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 , 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 , 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130 , 132, 134, 136, 138,
  • 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 or 170 can be generated.
  • said keratin-binding effector molecules contain at least one reactive dye (ii) which has at least one reactive anchor selected from the group consisting of
  • the bond to the dye molecule (F) means
  • V is fluorine or chlorine
  • Ui, U2 are independently fluorine, chlorine or hydrogen
  • Q 1, Q 2 independently of one another chlorine, fluorine, cyanamido, hydroxy, (C 1 -Ce) alkoxy, phenoxy, sulfophenoxy, mercapto, (C 1 -C 6) -alkylmercapto, pyridino, carboxypyridino, carbamoylpyridino, or a group of the general Mean formula (6) or (7)
  • R 24 , R 25 and R 26 are (C 1 -C 4 ) -alkyl or (C 1 -C 4 ) -hydroxyalkyl;
  • B- is the equivalent of an anion such as hydrogen sulfate, sulfate, fluoride, chloride, bromide, dihydrogen phosphate, hydrogen phosphate, phosphate, hydroxide or acetate;
  • the keratin-binding effector molecule contains a reactive dye containing a reactive anchor according to formula 1, wherein at least one of the radicals present there is a group SO3H.
  • keratin-binding effector molecules containing dyes selected from the group of phthalocyanine-series dyes, anthraquinone dyes, azo dyes, formazan dyes, dioxazine dyes, actidine dyes, xanthene dyes, polymethine dyes , Stilbene dyes, sulfur dyes, triarylmethane dyes, benzopyran dyes, dibenzanthrone dyes and the metal complexes of these dyes.
  • keratin-binding effector molecules comprising at least one reactive dye which comprises a reactive anchor selected from the following residues (1-1) to (1-43).
  • a preferred subject of the present invention are also keratin-binding effector molecules in which the reactive dye (i) is indirectly coupled via a linker molecule to the keratin-binding polypeptide (ii).
  • the dye or the reactive dye is coupled to the keratin-binding polypeptide via a linker molecule (iii) according to formula 9 or 10.
  • n is an integer between 0 and 40.
  • Another object of the present invention is the use of the keratin-binding effector molecules described above in skin, hair dyes or decorative cosmetics.
  • the present invention furthermore relates to skin, nail and / or hair dyes, preferably hair dyes, containing at least one of the keratin-binding effector molecules according to the invention described above.
  • a further subject of this invention is a process for dyeing hair, skin or nails with keratin-binding effector molecules comprising (a) at least one keratin-binding polypeptide (ii) and (b) a dye or reactive dye (i).
  • the keratin-binding effector molecules according to the invention as defined above are used.
  • the keratin-binding effector molecule by treatment with (i) a keratin-binding polypeptide, or (ii) a keratin-containing solution in a displacing reaction is displaced from the hair, skin or nail keratin or the keratin-binding effector molecule is removed by a solution with a high detergent content (eg SDS) of the skin, hair or nails.
  • a high detergent content eg SDS
  • amino functions in the context of the description "amino function-carrying effector molecule”, means amino groups which make it possible to covalently link the molecules carrying said amino functions via an amide bond with other molecules.
  • amino functions are also those which can be converted chemically into amino functions, the effector molecules according to the invention having at least one amino function, but also effector molecules having two, three or more amino functions and / or secondary amino groups can be used become.
  • antibodies are proteins which humans and the kite-bearing vertebrates produce to repel antigens (infectious agents or body-foreign biological material) They are a central component of the immune system of higher eukaryotes and are produced by a class of white blood cells, the B Cells are secreted, occurring in the blood and extracellular fluid of the tissues.
  • Decorative cosmetics means cosmetic aids which are not primarily used for care purposes but for beautifying or improving the appearance of the skin, hair and / or fingernails. These aids are known to the person skilled in the art and include, for example, kohl pencils, mascara, eye shadows , tinted topicals, powders, masking sticks, blushes, lipsticks, lip pencils, make-up, nail varnish, glamor gel, etc. In particular, for the purposes of the present invention, agents are suitable for dyeing skin, nails and / or hair.
  • “Hair dyes” are agents or preparations (i) dyeing of hair. "Hair dyes” in the sense of the present invention are distinguished into direct colors and true hair colors. For direct colors, one or more washes are sufficient to remove the color (tints). The dye is only superficially attached to the hair substance, there is no chemical reaction. For the hair itself, the process is harmless.
  • Hair dyes contain in a cosmetically acceptable medium suitable auxiliaries and additives which are familiar to the person skilled in the art and handbooks of cosmetics, for example Schrader, bases and formulations of the Kosmetika, Weghig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7775-1491-1, or Limbach, cosmetics: development, production and application of cosmetics, 2nd extended edition, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9, can be removed.
  • Effective molecule in the sense of the present invention means molecules which have a certain predictable effect, preferably a color-altering and / or nourishing effect or a cosmetically decorative effect on skin, hair or nails for example, shown in Tables 3, 5 and 6.
  • Keratin in the sense of the present invention means intermediary filaments constructed from rope-shaped protein complexes. Intermediate filaments are composed of many similar proteins (monomers), which assemble in parallel to a tubular structure. Intermediate filaments are connected to larger bundles (tonofibrils). Intermediate filaments together with the microtubules and actin filaments form the cytoskeleton of the cell. There are five types of intermediate filaments: acidic and basic keratins, desmines, neurofilaments and lamins. Especially preferred for the purposes of the present invention are the acidic and basic keratins occurring in the epithelia (single or multi-layer cell layers which cover all outer body surfaces of the multicellular animal organisms).
  • Keratin-binding polypeptide means a polypeptide or protein that has the property of binding to keratin
  • keratin-binding polypeptides are also intermediate filament-associated proteins
  • These keratin-binding polypeptides have a binding affinity to keratin or to keratin-based macrostructures such as protofibrils
  • keratin-binding polypeptides are to be understood as meaning those polypeptides which have a binding affinity for skin, hair and / or fingernails of mammals.
  • Keratin-binding polypeptides are also polypeptides having a biological function associated with the binding of keratin, keratin fibers, skin or hair within a mammalian organism, keratin-binding polypeptides also means those for the actual binding to the keratin, the keratin fibers, skin, hair Binding of the keratin-binding polypeptide (ii) to keratin can be tested under the conditions described in Examples 8, 9 and 10. Keratin-binding polypeptides are those polypeptides that are approximately 10% in the above-mentioned quantitative keratin binding tests.
  • Coupling in connection with the binding of a linker molecule to an effector molecule or keratin-binding protein, means a covalent linkage of the said molecules.
  • Cosmetically acceptable medium is to be understood broadly and means substances which are suitable for the preparation of cosmetic or dermocosmetic preparations and mixtures thereof, preferably protein-compatible media.
  • Cosmeticsmetically-compatible substances do not cause irritation or damage on contact with human or animal dermal tissue or hair and are incompatible with other substances, and have low allergenic potential and are approved by the state regulatory authorities for use in cosmetic preparations These substances are familiar to the person skilled in the art and may, for example, be manuals for cosmetics, for example Schrader, bases and formulations of cosmetics, Weghig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1, are taken.
  • Nucleic acid or nucleic acid molecule means deoxyribonucleotides, ribonucleotides or polymers or hybrids thereof, in single- or double-stranded form, in sense or antisense orientation.
  • the term nucleic acid or nucleic acid molecule can be used to describe a gene, DNA, cDNA, mRNA, oligonucleotide or polynucleotide.
  • Nucleic acid sequence means a sequential and interlinked sequence of deoxyribonucleotides or ribonucleotides of a nucleic acid molecule as defined above, as determined using available DNA / RNA sequencing techniques, and in the form of a list of abbreviations, letters or words representing nucleotides, can be displayed or displayed.
  • Polypeptide in the sense of the present invention means a macromolecule composed of amino acid molecules, in which the amino acids are linked to one another in a linear sequence via peptide bonds
  • a polypeptide can be composed of a few amino acids (about 10 to 100), but also comprises proteins. Proteins are generally composed of at least 100 amino acids, but may also comprise several thousand amino acids
  • polypeptides comprise at least 20, 30, 40 or 50, more preferably at least 60, 70, 80 or 90, most preferably at least 100, 125, 150, 175 or 200, most preferably at least over 200 amino acids, wherein the upper limit may be several thousand amino acids.
  • “Homology” or “identity” between two nucleic acid sequences is understood to mean the identity of the nucleic acid sequence over the respective entire sequence length, which is determined by comparison with the aid of the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389ff), using the following parameters:
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • GAP WorldNetwork Organization
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • a sequence having a polypeptide-based homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 2 is understood as meaning a homology of, in a comparison with the sequence SEQ ID NO: 2 according to the above program algorithm with the above parameter set at least 80%.
  • Hybridization conditions is to be understood broadly and, depending on the application, means stringent as well as less stringent hybridization conditions Such hybridization conditions are described inter alia in Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition CoId, Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6 The skilled artisan would select hybridization conditions that would allow him allow to distinguish specific from non-specific hybridizations.
  • the conditions of low-stringency conditions (approximately 2X SSC at 5O 0 C.) and preferably at high stringency (approximately 0.2X SSC at 5O 0 C at 65 0 C) (2 O x SSC. 0.3M sodium citrate, 3M NaCl, pH 7.0) in addition, the temperature during the washing step from low stringency Conditions at room temperature, about 22 0 C, to more stringent conditions, about 65 0 C, raised. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously or individually, keeping the other parameter constant.
  • denaturing agents such as formamide or SDS may also be used. In the presence of 50% formamide, hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • Hybridization conditions may for example be selected from the following conditions: a) 4X SSC at 65 ° C, b) 6X SSC at 45 ° C, c) 6X SSC, 100 ⁇ g / ml denatured, fragmented fish sperm DNA at 68 ° C, d) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA at 68 ° C, e) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 ⁇ g / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA, 50% formamide at 42 ° C.
  • Wash steps can be selected for example from the following conditions: a) 0.015 M NaCl / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% SDS at 50 0 C. b) 0.1X SSC at 65 ° C. c) 0.1X SSC, 0.5% SDS at 68 ° C. d) 0.1X SSC, 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C. e) 0.2X SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. f) 2X SSC at 65 ° C (weak stringent condition).
  • the stringent hybridization conditions are chosen as follows:
  • a hybridization buffer which contains formamide, NaCl and PEG 6000.
  • the presence of formamide in the hybridization buffer destabilizes double-stranded nucleic acid molecules, allowing the hybridization temperature to be lowered to 42 ° C without thereby lowering the stringency.
  • the use of salt in the hybridization buffer increases the renaturation rate of a duplex or the hybridization efficiency.
  • PEG increases the viscosity of the solution, which has a negative influence on renaturation rates, the presence of the polymer in the solution increases the concentration of the probe in the remaining medium, which increases the rate of hybridization.
  • the composition of the buffer is as follows:
  • Hybridization buffer The hybridizations are carried out at 42 ° C overnight. The filters are washed 3x 2xSSC + 0.1% SDS the next morning for approx. 10 min each. washed.
  • "Hydroxy function” in the context of the description "hydroxy function-carrying effector molecule”, means free OH groups or hydroxyl groups, which make it possible to covalently link these OH-group-carrying molecules via an esterification reaction with other molecules.
  • Haldroxy functions within the meaning of the present invention are also those which can be converted chemically into OH functions (for example derivatives such as methoxy, ethoxy), the effector molecules according to the invention having at least one hydroxyl group, but also effector molecules having two, three or more hydroxy functions are used.
  • Coupling functionalities are functional groups of a linker molecule which can covalently bind with functional groups of the effector molecule or the keratin-binding protein, by way of example but not limited to: hydroxyl groups, carboxyl groups, thio groups and amino groups. "Coupling functionalities” or “coupling functionality” and " Anchor Groups "or” Anchor Group “are used synonymously.
  • Reactive dye in the sense of the present invention means dyes containing at least one reactive anchor which can be coupled via a covalent bond to a keratin-binding polypeptide.
  • Reactive anchor in the context of the present invention means chemically functional groups or radicals by means of which a covalent bond between a carbon or phosphorus atom of the reactive dye molecule and an oxygen, nitrogen or sulfur atom of a hydroxy, amino or thiol group of another molecule is realized.
  • Residues which are cleaved under alkaline conditions, ie at pH values of 7 or above, preferably 7.5 or above, with elimination and formation of a vinylsulfone group.
  • groups are halogen, for example chlorine, bromine or iodine, furthermore -O-SO 3 H, -S-SO 3 H, dialkylamino, quaternary ammonium radicals such as tri-C 1 -C 4 -alkylammonium, benzyldiCi-C 4 - Alkylammonium or N-bonded pyridinium, and radicals of the formulas R 3 S (O) 2 -, R 4 S (O) 2 -O-, R 5 C (O) -O-.
  • R 3 , R 4 and R 5 are independently alkyl, haloalkyl or optionally substituted phenyl, wherein R 5 may also be hydrogen.
  • Q is a group -O- (CO) CH 3 and especially -O-SO 3 H.
  • Reversible coloring in the sense of the present invention means a change in the color of skin, hair or nail keratin achieved by use of the method according to the invention, which can be reversed.
  • "Back translation” in the sense of the present invention means the translation of a protein sequence into a nucleic acid sequence coding for this protein .Therefore, the back translation is a process of decoding an amino acid sequence into the nucleic acid sequence corresponding thereto.
  • codons most commonly used for a particular species for a particular species can be determined Protein back translation can be performed using computer algorithms known to those skilled in the art and specifically designed for this purpose (Andres Moreira and Alejandro Maass TIP: protein back translation aided by genetic algorithms, Bioinformatics, Volume 20, Number 13 pp. 2148-2149 (2004); G Pesole, M. Attimonelli, and S. Liuni thod based on codon usage strategy. Nucleic Acids Res. 1988 March 1 1; 16 (5 Pt A): 1715-1728.).
  • the present invention relates to keratin-binding effector molecules comprising (a) at least one reactive dye (i) and (b) at least one keratin-binding polypeptide (ii).
  • the said keratin-binding effector molecules contain at least one keratin-binding polypeptide (ii) which has a binding affinity to human skin, hair or nail keratin.
  • Keratin-binding polypeptide domains suitable according to the invention are e.g. present in the polypeptide sequences of desmoplakins, Plakophilinen, Plakoglobinen, Plectinen, Periplakinen, Envoplakinen, Trichohyalinen, Epiplakinen or Haarfolikelproteinen.
  • the keratin-binding polypeptide (ii) mentioned under (b) comprises
  • polypeptide which is at least 40% identical to at least one of the sequences according to SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106,
  • said keratin-binding effector molecules contain at least one keratin-binding polypeptide (ii) which is encoded by a nucleic acid molecule comprising at least one nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising those shown in SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 , 36, 38, 40,
  • nucleic acid molecule which has at least one polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID No .: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139,
  • nucleic acid molecule which comprises a polypeptide according to the sequences SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 , 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,
  • nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence corresponding to at least one of the sequences according to SEQ ID No .: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 or
  • nucleic acid molecule derived therefrom by substitution, deletion or insertion which codes for a polypeptide which is at least 40% identical to at least one of the sequences according to SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,
  • nucleic acid molecule encoding a keratin-binding protein that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid molecule according to (a) to (c);
  • nucleic acid molecule encoding a keratin-binding protein from a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or their partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions, and
  • Nucleic acid molecule which by back translation of one of the in the sequences SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 , 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,
  • said keratin-binding effector molecules contain desmoplakins or their partial fragments according to the sequences SEQ ID No .: 2, 42, 44, 46, 48, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164 or 166, and / or Plakophillins or their partial sequences according to the sequences SEQ ID No .: 18, 20, 26, 28, 32, 34, 36, 168, 170 and / or Plakoglobine or their partial sequences according to the sequences having the
  • Preferred keratin-binding domains are those shown in the sequences SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 or 170 Desmoplakin polypeptides, as well as their functional equivalents.
  • the keratin-binding polypeptides depicted in the sequences SEQ ID No .: 156, 157, 158, 160, 162, 164, 168 and / or 170 are used in the method according to the invention.
  • the keratin-binding protein shown in the sequence SEQ ID No .: 168 is used.
  • this protein can be used both with and without the histidine anchor present in SEQ ID No .: 168.
  • the histidine anchor (or a purification / Detektiossystem to be used analogously) may also be C-terminal.
  • a histidine anchor (or a purification / detection system to be used analogously) is not necessary.
  • the use of said proteins without additional amino acid sequences is preferred
  • keratin-binding polypeptides are, in the context of the present invention, different polypeptides which furthermore possess the desired biological activity, such as keratin binding, for example, “functional equivalents” of keratin-binding polypeptides
  • Polypeptides those polypeptides which, under otherwise comparable conditions, in the quantitative keratin binding tests described in the examples are about 10%, 20%, 30%, 40% or 50%, preferably 60%, 70%, 80% or 90%, more preferably 100%, 125%, 150%, most preferably 200%, 300% or 400%, most preferably 500%, 600%, 700% or 1000% or more of the keratin binding capacity of SEQ ID NO: 2 , 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 , 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,
  • “functional equivalents” are in particular also understood to mean muteins which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless possess one of the abovementioned biological activities.
  • “Functional equivalents” thus include those represented by a Mutations obtainable muteins, said changes can occur in any sequence position, as long as they lead to a mutein with the property profile according to the invention.
  • “Mutation” in the sense of the present invention means the alteration of the nucleic acid sequence of a gene variant in a plasmid or in the genome of an organism Mutations can arise, for example as a consequence of errors in the replication or caused by mutagens Organisms are very low, but a variety of biological, chemical or physical mutagens are known to those skilled in the art.
  • Mutations include substitutions, insertions, deletions of one or more nucleic acid residues. Substitutions are understood as meaning the exchange of individual nucleic acid bases, a distinction being made between transitions (substitution of a purine for a purine base or a pyrimidine for a pyrimidine base) and transversions (substitution of a purine for a pyrimidine base (or vice versa).
  • addition or insertion is meant the incorporation of additional Nuklein Text- reresten in the DNA, which can lead to shifts of the reading frame.
  • frame shifts distinguish between “in frame” insertions / additions and “out of frame” insertions.
  • in-frame insertions / additions the reading frame is retained and a polypeptide increased by the number of amino acids encoded by the inserted nucleic acids is formed.
  • out of frame insertions / additions the original reading frame is lost and the formation of a complete and functional polypeptide is no longer possible.
  • Deletions describe the loss of one or more base pairs, which also result in "in frame” or “out of frame” shifts of the reading frame and the consequent consequences on the formation of an intact protein.
  • mutagenic agents useful for generating random or targeted mutations and the applicable methods and techniques are known to those skilled in the art.
  • Such methods and mutagens are e.g. described by A.M. van Harten [1998], "Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK], E Friedberg, G Walker, W Siede [(1995), “DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing], or K. Sankaranarayanan, JM Gentile, LR Ferguson [(2000) “Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences].
  • the mutagens listed below are illustrative but not limiting. Chemical mutagens can be subdivided according to their mechanism of action. Thus there are base analogues (eg 5-bromouracil, 2-amino purine), monofunctional and bifunctional alkylating agents (eg monofunctional such as ethyl methyl sulfonate, dimethyl sulfate or bifunctional such as dichloroethyl sulfite, mitomycin, nitrosoguanidines - dialkylnitrosamines, N-nitrosoguanidine derivatives) or intercalating substances (eg acridines, ethidium bromide).
  • base analogues eg 5-bromouracil, 2-amino purine
  • monofunctional alkylating agents eg monofunctional such as ethyl methyl sulfonate, dimethyl sulfate or bifunctional such as dichloroethyl sulfite, mitomycin, nitro
  • those polypeptides may also be present in the keratin-binding effector molecules according to the invention which are obtained as a result of a mutation of a polypeptide according to the invention, e.g. according to SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146 , 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 and / or 170.
  • SEQ ID NO: 2 the naturally occurring serine at position 2849 can be exchanged, for example, for glycine, in order to avoid phosphorylation at this position (Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH , Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May; 14 (5): 1978-92. Epub 2003 Jan 26).
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without desired biological activity.
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules of the invention.
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, egg salts and salts with organic bases, such as, for example, amines, such as triethylamine, arginine, lysine, piperidine, etc.
  • Acid addition salts for example salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and Oxalic acid are also the subject of the invention.
  • “functional equivalents” also encompass polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants (alleles) thereof. For example, regions of homologous sequence regions or conserved regions can be determined by sequence comparisons. Using these sequences, DNA databases (e.g., genomic or cDNA databases) can be screened for equivalent enzymes using comparative bioinformatics programs. Suitable computer programs and publicly accessible databases are well known to those skilled in the art. These alignments of known protein sequences can be carried out, for example, with a computer program such as Vector NTI 8 (version of September 25, 2002) from InforMax Inc.
  • Fusion equivalents are also fusion proteins comprising one of the above-mentioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one other functionally distinct heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie, without mutual substantial functional impairment of the fusion protein moieties)
  • heterologous sequences are, for example, signal peptides or enzymes.
  • Homologs to the specifically disclosed proteins according to the invention include at least 40%, 45% or 50%, preferably at least 55%, 60%, 65% or 70%, particularly preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% or 94%, most preferably at least 95% or 96% homology to any of the specifically disclosed amino acid sequences calculated using the computer programs and computer algorithms disclosed in the Definitions.
  • “functional equivalents” include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
  • “functional equivalents” include proteins of the type indicated above in dephosphorylated or phosphorylated form as well as modified forms obtainable by altering the phosphorylation pattern.
  • Homologs of the polypeptides of the invention may be prepared by screening combinatorial libraries of mutants, such as e.g. Shortening mutants, to be identified.
  • a library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, e.g. by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be performed in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods of synthesizing degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1: 477).
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • the probe may also be one or several kilobases long, eg 1 Kb, 1, 5 Kb or 3 Kb.
  • SEQ ID No . 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 165, 167 and / or 169, more preferably 165 and 167, most preferably
  • DNA molecules which, under standard conditions, have the amino acids represented by SEQ ID No .: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 165, 167 and / or 169, more preferably 165 and 167, most preferably 167 and for keratin-binding polypeptides encoding nucleic acid
  • the keratin-binding effector molecules contain as keratin-binding polypeptides (ii) those polypeptides which contain at least one of the polypeptide sequences as shown in SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 , 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114 , 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 or 170, provided that
  • keratin-binding polypeptides (ii) are used which have a highly specific affinity for the desired organism.
  • more than one keratin-binding polypeptide (ii) can also be used in combination with the effector molecule (i) according to the invention; for example, a keratin-binding polypeptide (ii) which has a high binding affinity to human skin keratin can be used in conjunction with another keratin-binding polypeptide (ii ), which has a high affinity for human hair keratin, can be combined with an effector molecule. It is also possible to use chimeric polypeptides which contain multiple copies of the same (or also different) keratin-binding polypeptides (ii) or their keratin-binding domains. Thus, for example, a particularly effective keratin binding could be achieved.
  • Suitable keratin-binding polypeptides are known.
  • desmoplakins and plectins contain keratin-binding domains (Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate , Mol Biol Cell, 2003 May; 14 (5): 1978-92, Epub 2003 Jan 26; Hopkinson SB, Jones JC, The N terminus of the transmembrane protein BP180 interacts with the N-terminal domain of BP230, in the presence of mediating keratin cytoskeleton anchorage to the cell surface at the site of the hemidesmosome, Mol Biol Cell. 2000 Jan; 1 1 (1): 277-86).
  • the keratin-binding effector molecules of the invention are preferably used in hair cosmetics, preferably hair coloring. They allow a high concentration and long duration of action of nourishing, protective or color-changing effector molecules.
  • keratin-binding polypeptides having a binding affinity to human skin, hair or nail keratin are used.
  • said keratin-binding effector molecules contain at least one reactive dye (ii) which has at least one reactive anchor selected from the group consisting of
  • bond to the dye molecule (F) is X is an electron-withdrawing radical or is an alkyl, -O-alkyl, cyano, hydroxy, halogen radical or H, k is 1, 2 or 3, n is 0 or 1, and
  • V is fluorine or chlorine
  • Ui, U2 are independently fluorine, chlorine or hydrogen
  • Q 1, Q 2 independently of one another chlorine, fluorine, cyanamido, hydroxy, (C 1 -C 6) -alkoxy, phenoxy, sulfophenoxy, mercapto, (C 1 -C 6) -alkylmercapto, pyridino, carboxypyridino,
  • Carbamoylpyridino or a group of the general formula (6) or (7) mean
  • R 2 is hydrogen or (Ci-C 6) -alkyl, sulfo- (Ci-C 6) alkyl, or phenyl which is un- substituted or substituted by (Ci-C4) alkyl, (Ci-C4) Alkoxy, sulfo, halogen, carboxy, acetamido, ureido, R 3 and R 4 independently of one another have one of the meanings of R 2 , or are a group of the general formula (8)
  • R 24 , R 25 and R 26 are (C 1 -C 4 ) -alkyl or (C 1 -C 4 ) -hydroxyalkyl;
  • B- is the equivalent of an anion such as hydrogen sulfate, sulfate, fluoride, chloride, bromide,
  • Dihydrogen phosphate hydrogen phosphate, phosphate, hydroxide or acetate
  • the present invention relates to a keratin-binding effector molecule which comprises, as effector molecule, at least one reactive dye (ii) which contains at least one group of formula 1 which can be activated under alkaline conditions
  • - represents the bond to the rest of the dye molecule (F);
  • alkyl is generally a linear or branched hydrocarbon radical having 1 to 6 and preferably having 1 to 4 carbon atoms (C 1 -C 6 - or C 1 -C 4 -alkyl), such as methyl, ethyl, propyl , Isopropyl and the like.
  • Haloge- nalkyl is alkyl as defined above, wherein the hydrogen atoms are partially or completely replaced by halogen atoms, in particular by fluorine atoms, as in trifluoromethyl, trichloromethyl, pentafluoroethyl, and the like.
  • Alkoxy is an alkyl radical bonded via an oxygen atom as defined above.
  • Optionally substituted phenyl means that the phenyl radical may have one or more, for example 1, 2, 3 or 4 substituents, which are for example selected under halogen, alkyl, alkoxy, nitro, cyano, COOH, SO3H and the like.
  • Halogen is in particular fluorine, chlorine or bromine.
  • Electron-withdrawing radicals X are those which exert an M and / or an I effect on the aromatic radical to which they are attached. These include, for example, fluorine or chlorine, CN, NO 2 and groups of the formulas -C (O) -R 1 and S (O) 2R 2 , wherein R 1 and R 2 independently of one another are OH, alkyl, haloalkyl, alkoxy or optionally substituted phenyl. If the formula 1 has several groups (k> 1), then the groups X may be the same or different.
  • At least one of the groups X is a hydroxysulfonyl group (SO 3 H).
  • variable k is preferably 1 or 2, i. of the formula 1 has one or two electron-withdrawing radicals X.
  • "n" in Formula 1 is O, that is, Formula 1 is derived from benzene, and when "n" is 1, Formula 1 is derived from naphthalene.
  • the group SO2-B may be located on the same benzene nucleus as the group X.
  • keratin-binding effector molecules according to the invention have 1, 2 or 3, preferably 1 or 2, of the abovementioned reactive dyes.
  • the group which can be activated under alkaline conditions according to formula 1 can (but does not have to) be part of the dye chromophore.
  • the reactive dye has one or more, for example 1 to 10, in particular 2 to 8, functional groups per dye molecule which impart water solubility to the dye.
  • functional groups which dissociate in an aqueous medium at a weakly acidic or alkaline pH, generally at pH values above 4, to form anionic groups.
  • anionic or acidic functional groups which dissociate in an aqueous medium at a weakly acidic or alkaline pH, generally at pH values above 4, to form anionic groups.
  • examples of such groups are hydroxysulfonyl groups (-SO 3 H), carboxyl groups (COOH) and hydroxysulfonyloxy groups (-O-SO 3 H) and the anions of these groups.
  • anionic / acidic groups may be bound to a group of formula 1 and / or to other parts of the dye molecule.
  • Suitable counterions are in particular alkali metal ions, especially sodium, potassium and lithium ions and ammonium ions, for example ammonium ions, which are derived from mono-, di- or triethanolamine.
  • a particularly preferred subject of the invention is those keratin-binding effector molecules containing dyes ("F") selected from the group of phthalocyanine series dyes, anthraquinone dyes, azo dyes, formazan dyes, dioxazine dyes, actidine dyes, xanthene Dyes, polymethine dyes, stilbene dyes, sulfur dyes, triarylmethane dyes, benzopyran dyes, dibenzanthrone dyes, and the metal complexes of these dyes.
  • F keratin-binding effector molecules containing dyes
  • Such dyes F are known in part from the prior art, and may be e.g. Patent Applications WO 94/18381, EP-A 356 931, EP-A 559 617, EP-A 201 868, DE-A 195 23 245, DE-A 197 31 166, EP 745 640, EP-A 889 098, EP -A 1 097 971, EP-A 880 098 or in analogy to known production methods for structurally similar dyes, as they are, for example from EP 602 562, EP-A 597 41 1, EP-A 592 105 or DE 43 196 74 are known.
  • an amino compound of the formula 1b is generally reacted with a dye precursor which has a nucleophilic displaceable group in a manner known per se.
  • nucleophilic displaceable groups are halogen, in particular chlorine or bromine, which is bonded to an aromatic (as in halotriazine residues) or in the form of a halosulfonyl group or a halogeno-carbonyl group. Processes for this purpose are known from the prior art cited here and can be used in an analogous manner for the preparation of the dyes F.
  • the amino compound 1 b may also initially be diazotized and then coupled to a corresponding dye precursor.
  • the reaction product obtained in the reaction of the amino compound 1 b or of its diazonium salt with the dye precursor can already be the dye F or, in turn, can be a precursor for the dye F, which is further processed into the dye F in analogy to known processes.
  • dyes may contain inorganic salts and actuators due to manufacturing.
  • the proportion of such constituents len hereinafter also referred to as non-colored constituents, will generally amount to no more than 60 wt .-% and is often in the range of 10 to 50 wt .-%, based on the total weight of colored and non-colored constituents of the dye.
  • the chromophore systems of the dyes (F) can have different structures, irrespective of whether they are reactive or non-reactive dyes.
  • Each of the chromophores (1 to 7) shown below represents a compound that is representative of a particular structural class. This listing is not meant to be limiting. The person skilled in the art is, of course, aware that, in principle, all dyes belonging to these substance classes, directly as a reactive dye or via a linker molecule, can be bound to a keratin-binding polypeptide.
  • the dyes may be metal-free dyes, but also metal complexes, preferably transition metal complexes, in particular complexes of transition metals of groups VI to X of the periodic table and hereunder in particular of Cu, Cr, Fe, Ni, Co and Mn.
  • the molar ratio of transition metal to dye molecule in these metal complexes is usually in the range of 2: 1 to 1: 2.
  • the complexing of the metal ions via deprotonated hydroxyl groups, via amino groups, imino groups, nitrogen atoms which are incorporated into an aromatic ⁇ -electron system, or via azo groups takes place in these dyes.
  • N N-) containing the dyes.
  • the bond with the reactive anchor at 1 a, 1 b and 1 c is of course also an azo bridge. a) monoazo
  • keratin-binding effector molecules which contain a reactive dye (i) which comprises a reactive anchor which is selected from the following residues (1-1) to (1-43).
  • V-SO 2 -CH CH 2
  • V ⁇ -S0, -CH, -CH, -O-S0, H ⁇ f V-S0, -CH, -CH, -CI ⁇ f ⁇ SO 0 -CH CH,
  • Particularly preferred reactive dyestuffs comprise at least one reactive anchor according to formula 1, this radical being at least one of those in the formulas (1 -1) to (1-12) and (1-16), (1-17), preferably (1-1) , (1-3), (1-4), (1-6), (1-7), (1-9), (1-10), (1-12), (1-16), ( 1-17), most preferably (1-1), (1-4), (1-7), (1-10), (1-17).
  • Vinylsulfone anchor containing dyes are typically prepared as sulfuric acid ester compounds.
  • the activation (elimination to the active vinylsulfone form) of the sulfuric acid ester compounds takes place in situ during dyeing in textile and leather applications, ie it is not necessary to pre-eliminate the dyes to vinylsulfone before use.
  • the dyes may be if also be isolated as vinyl sulfone between and implemented at a later date with the substrate.
  • Keratinbindedomäne (hereinafter also referred to as KBD) is selected a pH near the neutral point, and the reaction temperature for coupling with
  • Dyes should not exceed 45 ° C, the dyes must be pre-elimination to the active vinyl sulfone form and thereafter with e.g. coupled to a KBD.
  • Reaction with e.g. a KBD can be right after the elimination in the same fleet
  • a pH range of 5-14 in particular 7-12 and a temperature range of 0-80 ° C, in particular 15-50 ° C, prefers 25-45 ° C.
  • a pH range of pH 5-9, especially 7-8, and a temperature range of 20-50 ° C, in particular 25-45 ° C is set, wherein the dye quickly (often within minutes) with the substrate (in this case with a keratin-binding polypeptide / KBD).
  • the activation (elimination) of the sulfuric acid ester to vinyl sulfone proceeds according to the scheme shown in Figure 1.
  • Dyes with a heteroaromatic anchor can be directly reacted without preelimination (activation) with eg KBD ( Figure 4).
  • the reaction conditions correspond to the conditions chosen for the vinylsulfone anchors.
  • the reactive dyes used here can 0-20 wt .-%, usually 0-10gew. %, often 0- 5 wt .-% non-reactive secondary components.
  • the minor components that do not have a reactive anchor do not react with the keratin-binding polypeptides. These can be removed during the synthesis or staining process.
  • the keratin-binding polypeptides reacted with the reactive dye are applied to hair and the unbound dye components are washed off the hair. Furthermore, it is possible to purify the keratin-binding polypeptides reacted with the reactive dye by, for example, column chromatography. It is also possible to carry out the reaction between keratin-binding polypeptides and the reactive dye in a type of "column reactor.”
  • the keratin-binding polypeptides could be coupled to a nickel affinity column, the dye could be bound to the keratin-binding polypeptides and the unfixed dye residues could be directly removed. to be washed. Subsequently, the keratin-binding polypeptide dye (keratin-binding effector molecule) could be eluted from the column.
  • the keratin-binding effector molecules contain dyes which are suitable for cosmetic purposes and are approved as such.
  • dyes are, for example, in the publication "Cosmetic Colorants” of the Dye Commission of the Irish Kla Chemie, Weinheim, 1984, and in the third completely revised edition of 1991 together.
  • keratin-binding effector molecules in which the reactive dye (i) is indirectly coupled via a linker molecule to the keratin-binding polypeptide (ii).
  • a keratin-binding effector molecule can take place by coupling an effector molecule (i) (for example selected from the above-described reactive dyes) containing at least one hydroxyl, amino or carboxyl function to one of the keratin-binding polypeptides (ii) described above using a linker molecule, which has at least two coupling functionalities, and a) in a first coupling step firstly the effector molecule (i) is bound to the linker molecule (iii), and b) in a further coupling step the reaction product from (a) via a still free coupling functionality of the linker molecule ( iii) is coupled to the keratin-binding polypeptide (ii).
  • an effector molecule (i) for example selected from the above-described reactive dyes) containing at least one hydroxyl, amino or carboxyl function
  • a linker molecule which has at least two coupling functionalities
  • the linker molecule (iii) has at least two different coupling functionalities, very particularly preferred are linker molecules (iii) which have a maleimide group.
  • linker molecules (iii) carboxy-group-bearing maleimides according to the general formula 9,
  • n is an integer between 0 to 40 or 0-20, preferably between 0 to 15, more preferably between 0 and 10, most preferably between 1 and 9, or between 2 and 8, or between 3 and 7, on Most preferably, the use of the maleimidocaproic acid is most preferred. Further, the use of the maleimidocaproic acid chloride is most preferred.
  • the linker molecule (iii) has at least two different coupling functionalities and additionally a module which increases the hydrophilicity. This preferred linker molecule is shown in Formula 9b,
  • n corresponds to an integer between 0 to 40 or 0 to 20, preferably between 0 and 15, particularly preferably between 0 and 10, very particularly preferably between 1 and 9, or between 2 and 8, or between 3 and 7, and
  • the linker molecule is a molecule according to the general formula 9c,
  • Formula 9c wherein X is in the o-, m- or p-position for COOH or R-COOH, and R is a C1-C12 linear alkyl group such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert. Butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, tert.
  • R can also correspond to the "module" described in formula 1b.
  • linker molecules (ii) represented by the general formula 10 are used,
  • n is an integer between 0 and 20, preferably between 0 and 15, more preferably between 1 and 10, most preferably between 1 and 8 and Y corresponds to a hydroxy or amino group
  • the maleimidoalkanols are preferably maleimidoethanol, most preferably the maleimidopentanol.
  • the linker molecule (iii) according to formula 10 has at least two different coupling functionalities and additionally a module which increases the hydrophilicity or lipophilicity. This preferred linker molecule is shown in Formula 10b, Formula 10b
  • n corresponds to an integer between 0 to 40 or 0 to 20, preferably between 0 and 15, particularly preferably between 0 and 10, very particularly preferably between 1 and 9, or between 2 and 8, or between 3 and 7, and
  • coupling of the linker molecule (Ni) with the effector molecule (i) is a carbodiimide-, anhydride- or acid chloride-mediated esterification reaction or amide formation, the use of the acid chloride the linker molecule (iii) is particularly preferred.
  • Carbodiimide, anhydride or acid chloride mediated reaction Action means the activation of the carboxyl group of the linker molecule necessary for the formation of an ester or amide between linker molecule (iii) and effector molecule (i)
  • Preferred carbodiimides are dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylpodiimide (DIC), N '- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), the use of diisopropylcarbodiimide or EDC being particularly preferred.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylpodiimide
  • EDC N '- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • CDI carbonyldiimidazole
  • amides can be accomplished by reaction of the carbodiimide-activated compound with the amine.
  • the amide formation can be carried out in the presence of additives such as N-hydroxysuccinimide, pentafluorophenol or N-hydroxybenzotriazole.
  • additives such as N-hydroxysuccinimide, pentafluorophenol or N-hydroxybenzotriazole.
  • additives are known in the art. If isolable active esters are obtained by means of these additives, the reactions of these isolated active esters with the effector molecules are also understood as carbodiimide-mediated esterification according to the invention.
  • the conversion of the linker molecule (iii) to the anhydride is carried out by general methods, as known to the person skilled in the art. Preference is given to the use of mixed anhydrides, as are obtained, for example, by reaction with acetic anhydride, pivaloyl anhydride, acetyl chloride, pivaloyl chloride or chloroformates. Particularly preferred are pivaloyl anhydrides and the anhydrides with carbonic acid. When using the acid chlorides, it is desirable to control the anhydride formation in the presence of a tertiary base, e.g. Pyridine, triethylamine perform.
  • a tertiary base e.g. Pyridine, triethylamine perform.
  • the coupling of the linker molecule (iii) with the effector molecule (i) described under (a) can preferably be carried out following the activation of the linker molecule (iii) to the anhydride described above in the presence of a base.
  • bases are: aromatic and tertiary alkylamines, e.g. Pyridine, triethylamine, tributylamine, trioctylamine, ethyldiisopropylamine, etc. In a particularly preferred embodiment, triethylamine is used as the base.
  • the chlorinating agents used are the customary chlorinating agents known to the person skilled in the art, for example thionyl chloride, phosphorus trichloride, phosphorus pentachloride, oxalyl chloride,
  • Phosgene or phosphorus oxychloride.
  • SOCl 2 thionyl chloride
  • thionyl chloride By using thionyl chloride it is possible, for example, to convert maleinimidocaproic acid into the acid chloride.
  • Suitable solvents are: aromatic and aliphatic hydrocarbons, for example benzene, toluene, xylene, hexane, heptane, etc., halogenated hydrocarbons, for example methylene chloride, ethers, for example diethyl ether, THF etc., as well as an excess of the chlorinating agent itself.
  • toluene is used.
  • the chlorination can be carried out with or without a catalyst.
  • DMF is particularly preferable.
  • reaction product from step (a) may be further purified to separate possible isomers of the reaction product.
  • linker effector molecule (iv) may be further purified to separate possible isomers of the reaction product.
  • All common methods for the purification of chemical substances can be used, for example: distillation, rectification, crystallization, extractions and chromatographic purification methods.
  • a column chromatography is performed.
  • particularly advantageous dyes are those mentioned in the following list.
  • the Color Index Numbers (CIN) are taken from the Rowe Color Index, 3rd Edition, Society of Dyers and Colourists, Bradford, England, 1971.
  • such keratin-binding effector molecules are used for the inventive method for dyeing skin, hair or nails, containing one of the dye molecules shown in Table 3, coupled via a linker described above.
  • the above dyes may also be used as effector molecules (i) on a skin or nail binding polypeptide sequence (ii) for skin or nail colouration, e.g. to be used in tattoos.
  • Particularly suitable is the use of fluorescent dyes (eg the fluorescence dyes mentioned in Table 3) to achieve a healthier and brighter skin tone or skin whitening after application to the skin for example, in US Pat. No. 6,753,002.
  • Fluorescent dyes for producing a healthier skin tone are described in "Filling the Fluorescent Palette, Cosmetics & Toiletries, 26-34, 121, No. 5, 2006".
  • Preferred are e.g. Fluorescent dye fabrics from the company DayGlo.
  • these keratin-binding effector molecules containing fluorescent dyes can also be used for lightening hair or for producing special reflexes or shimmering on the hair. This is e.g. in lair lightening by fluorescent dyes, Cosmetics & Toiletries, 56-57, 120, no. 7, 2005 "and the document cited therein US 2004/0258641.
  • the binding of the reaction product resulting from step (a) described above with the keratin-binding polypeptide (ii) takes place via the second, still free anchor group of the linker molecule.
  • an anchor group may be a thiol function by which the linker may form a disulfide bond with a cysteine residue of the keratin-binding polypeptide (ii).
  • tailored linkers allows the exact adaptation of the linkage of the linker effector molecule to the keratin-binding polypeptide. In addition, it is thereby possible to link several effector molecules with a keratin-binding polypeptide (ii).
  • the linker used depends on the functionality to be coupled. Suitable are e.g. Molecules which couple to keratin-binding polypeptides (ii) by means of sulfhydryl reactive groups (e.g., maleimides, pydridyl disulfides, ⁇ -haloacetyls, vinylsulfones, sulfatoalkylsulfones (preferably sulfatoethylsulfones).
  • sulfhydryl reactive groups e.g., maleimides, pydridyl disulfides, ⁇ -haloacetyls, vinylsulfones, sulfatoalkylsulfones (preferably sulfatoethylsulfones).
  • amino acids having suitable functions may also be added to the sequence, or amino acids of the polypeptide sequence may be substituted by such amino acid functions.
  • suitable functions e.g., cysteines, lysines, aspartates, glutamates
  • Methods for mutagenesis or manipulation of nucleic acid molecules are well known to those skilled in the art. Some selected methods are described below.
  • linker effector molecule which has been prepared using the maleimidocaproic acid mentioned as being preferred for the inventive method.
  • the cysteine residues present in the keratin-binding polypeptide are used for coupling.
  • the binding of the ef maschineormoleküls such that they by the action of the skin's own enzymes (for example, esterases, lipases or glucosidases) or by the environmental conditions on the skin (eg, moisture, acidic pH) over time the keratin-binding polypeptides (ii) in the sense of a "slow release” or “controlled release” split off and can be released.
  • the keratin-binding polypeptides (ii) can be used as an application system with which small amounts of the free effector molecules on the skin can be achieved by a single or repeated application.
  • effectors from their corresponding derivatives for example from tocopherol acetate, ascorbyl palmitate or ascorbyl glucosides, can be released on the skin (exemplary literature: Redoules, D. et al, J. Invest.Dermatol. 270, Beijersbegen van Henegouwen, GMJ et al., J. Photochem., Photobiol., 29, 1995, 45).
  • dyes carrying carboxyl, hydroxyl or amino groups are used for the process according to the invention.
  • the effector molecules used may have one or more carboxyl, hydroxyl or amino groups.
  • Another object of the present invention is the use of the above-described keratin-binding effector molecules in cosmetic compositions suitable for dyeing keratin fibers, preferably hair, skin or nails, more preferably human hair.
  • the use of the abovementioned keratin-binding effector molecules according to the invention in agents is suitable for dyeing hair in combination with cosmetically suitable auxiliaries and adjuncts which are customarily used in hair dyeing compositions.
  • the above-mentioned dyes preferably dyes approved for cosmetic purposes, can be used. These dyes are usually in concentration of 0.001 to 1 weight percent (wt .-%), preferably 0.01 to 0.9 wt .-%, particularly preferably 0.01 to 0.8 wt .-% or 0.01 to 0 , 7 wt .-%, most preferably 0.01 to 0.6 wt .-% or 0.01 to 0.5 wt .-%, most preferably 0.01 to 0.4 wt .-% or 0 , 01 to 0.3 wt .-% based on the total weight of the agent attached.
  • wt .-% weight percent
  • these dyes are usually in concentration of 0.001 to 1 weight percent (wt .-%), preferably 0.01 to 0.9 wt .-%, particularly preferably 0.01 to 0.8 wt .-% or 0.01 to 0 , 7 wt .-%, most preferably 0.01 to 0.6
  • the agents can be a keratin-binding effector molecule according to the invention in a concentration of 1 to 10 wt .-%, preferably 2 to 8 wt .-%, 3 to 7 wt .-%, 4 to 6 wt .-% based on the Total weight of the agent included.
  • the agents can be a keratin-binding effector molecule according to the invention in a concentration of 10 to 20 wt .-%, preferably 1 1 to 19 wt .-%, 12 to 18 wt .-%, 13 to 17 wt .-%, 14 to 16 wt .-% based on the total weight of the composition.
  • the compositions should have a certain minimum viscosity.
  • This viscosity is usually achieved by the use of thickeners, which are thus a further component of most hair dyes.
  • thickeners usually crosslinked polyacrylic acids (eg carbonyl pol ®), hydroxyethyl cellulose, waxes, and especially mixtures of nonionic surfactants with specific HLB (hydrophobic lipophilic balance), anionic, cationic or non-ionic association polymers are used.
  • HLB hydrophobic lipophilic balance
  • ampholytic copolymers as thickeners for cosmetic compositions is known.
  • ampholytic or amphoteric polymers are referred to having both anionogenic / anionic and cationogenic / cationic groups.
  • Amphoteric polymers having a sufficient number of dissociable groups are water-soluble or water-dispersible and have found various uses in the pharmaceutical and cosmetic arts. Suitable thickeners or polymers are described in the patent applications WO 00/039176, WO 04/058837, EP-A-982 021, WO 01/62809, WO 05/004821, DE 202 07 896 U1 and WO 02/000181.
  • the preparations may additionally contain conditioning substances based on silicone compounds.
  • Suitable silicone compounds are, for example, polyalkylsiloxanes, polyarylsiloxanes, polyarylalkylsiloxanes, polyethersiloxanes, silicone resins or dimethicone copolyols (CTFA) and amino-functional silicone compounds such as amodimethicones (CTFA).
  • Blowing agents are the blowing agents commonly used for hairsprays or aerosol foams. Preference is given to mixtures of propane / butane, pentane, dimethyl ether, 1,1-difluoroethane (HFC-152a), carbon dioxide, nitrogen or compressed air.
  • emulsifiers all emulsifiers commonly used in hair foams can be used. Suitable emulsifiers may be nonionic, cationic or anionic or amphoteric. Examples of nonionic emulsifiers (INCI nomenclature) are Laurethe, for example Laureth-4; Cetethees, for example cetheth-1, polyethylene glycol cetyl ethers, cetearethes, for example cetheareth-25, polyglycol fatty acid glycerides, hydroxylated lecithin, lactyl esters of fatty acids, alkylpolyglycosides.
  • cationic emulsifiers are cetyldimethyl-2-hydroxyethylammonium dihydrogenphosphate, cetyltrimonium chloride, cetyltrimmonium bromide, cocotrimonium methylsulfate, quaternium-1 to x (INCI).
  • Anionic emulsifiers may, for example, be selected from the group of alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkyl sulfonates, alkylaryl sulfonates, alkyl succinates, alkyl sulfosuccinates, N-alkoyl sarcosinates, acyl taurates, acyl isethionates, alkyl phosphates, alkyl ether phosphates, alkyl ether carboxylates, alpha olefin sulfonates, especially the alkali and alkaline earth metal salts, e.g.
  • alkyl ether sulfates, alkyl ether phosphates and alkyl ether carboxylates can have between 1 to 10 ethylene oxide or propylene oxide units, preferably 1 to 3 ethylene oxide units in the molecule.
  • gel formers all gel formers customary in cosmetics can be used. These include lightly crosslinked polyacrylic acid, for example carbomer (INCI), celulose derivatives, e.g. Hydroxypropyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, cationic modified celluloses, polysaccharides, e.g.
  • Xanthan gum caprylic / capric triglyceride, sodium acrylate copolymers
  • Suitable anionic surfactants include, for example, alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkyl sulfonates, alkylaryl sulfonates, alkyl succinates, alkyl sulfosuccinates, N-alkoxy sarcosinates, acyl taurates, acyl isothionates, alkyl phosphates, alkyl ether phosphates, alkyl ether carboxylates, alpha olefin sulfonates, especially the alkali and alkaline earth metal salts, e.g. Sodium, potassium, magnesium, calcium, as well as ammonium and triethanolamine salts.
  • the alkyl ether sulfates, alkyl ether phosphates and alkyl ether carboxylates can have between 1 to 10 ethylene oxide or propylene oxide units, preferably 1 to 3 ethylene oxide units in the molecule.
  • Suitable examples are sodium lauryl sulfate, ammonium lauryl sulfate, sodium lauryl sulfate, ammonium lauryl ether sulfate, sodium lauroyl sarcosinate, sodium oleyl succinate, ammonium lauryl sulfosuccinate, sodium dodecylbenzenesulfonate, triethanolamine dodecylbenzenesulfonate.
  • Suitable amphoteric surfactants are, for example, alkylbetaines, alkylamidopropylbetaines, alkylsulfobetaines, alkylglycinates, alkylcarboxyglycinates, alkylamphoacetates or -propionates, alkylamphodiacetates or -dipropionates.
  • cocodimethylsulfopropyl betaine cocodimethylsulfopropyl betaine, lauryl betaine, cocamidopropyl betaine or sodium cocamphopropionate can be used.
  • Suitable nonionic surfactants are, for example, the reaction products of aliphatic alcohols or alkylphenols having 6 to 20 C atoms in the alkyl chain, which may be linear or branched, with ethylene oxide and / or propylene oxide.
  • the amount of alkylene oxide is about 6 to 60 moles per mole of alcohol.
  • alkylamine oxides, mono- or dialkylalkanolamides, fatty acid esters of polyethylene glycols, alkylpolyglycosides or sorbitan ether esters are also suitable.
  • the shampoo formulations may contain conventional cationic surfactants, e.g. quaternary ammonium compounds, for example cetyltrimethylammonium chloride.
  • conventional cationic surfactants e.g. quaternary ammonium compounds, for example cetyltrimethylammonium chloride.
  • Conventional conditioning agents in combination with the keratin-binding effector molecules according to the invention can be used in the shampoo formulations to achieve specific effects.
  • cationic polymers with the name Polyquaternium according to INCI, in particular copolymers of vinylpyrrolidone / N-vinylimidazolium salts (Luviquat FC, Luviquat & commat, HM, Luviquat MS, Luviquat Care), copolymers of N-vinylpyrrolidone / dimethylaminoethyl methacrylate, quaternized with diethyl sulfate ( Luviquat D PQ 1 1), copolymers of N-vinylcaprolactam / N-vinylpyrrolidone / N-vinylimidazolium salts (Luviquat D Hold), cationic cellulose derivatives (Polyquaternium-4 and -10), acrylamide copolymers (Polyquaternium-7).
  • protein hydrolysates can be used, as well as conditioning substances based on silicone compounds, for example polyalkylsiloxanes, polyarylsiloxanes, polyarylalkylsiloxanes, polyethersiloxanes or silicone resins.
  • silicone compounds for example polyalkylsiloxanes, polyarylsiloxanes, polyarylalkylsiloxanes, polyethersiloxanes or silicone resins.
  • suitable silicone compounds are dimethicone copolyols (CTFA) and amino-functional silicone compounds such as amodimethicones (CTFA).
  • CTFA dimethicone copolyols
  • amino-functional silicone compounds such as amodimethicones
  • cationic guar derivatives such as guar hydroxypropyltrimonium chloride (INCI) can be used.
  • the hair cosmetic or skin cosmetic preparation is used for application on the skin (topically) or hair.
  • Topical preparations are to be understood as meaning those preparations which are suitable for applying the active ingredients in finely distributed manner to the skin or the hair.
  • aqueous and aqueous-alcoholic solutions sprays, foams, foam aerosols, Ointments, aqueous gels, O / W or W / O type emulsions, microemulsions or cosmetic stick preparations.
  • the agent contains a carrier.
  • a carrier is water, a gas, a water-based liquid, an oil, a gel, an emulsion or microemulsion, a dispersion or a mixture thereof.
  • the mentioned carriers show good skin tolerance.
  • Particularly advantageous for topical preparations are aqueous gels, emulsions or microemulsions.
  • Nonionic surfactants, zwitterionic surfactants, ampholytic surfactants or anionic emulsifiers can be used as emulsifiers.
  • the emulsifiers may be present in the composition according to the invention in amounts of 0.1 to 10, preferably 1 to 5 wt .-%, based on the composition.
  • a surfactant of at least one of the following groups may be used:
  • Polysiloxane-polyalkyl-polyether copolymers or corresponding derivatives Polysiloxane-polyalkyl-polyether copolymers or corresponding derivatives; Mixed esters of pentaerythritol, fatty acids, citric acid and fatty alcohol according to DE PS 1 165574 and / or mixed esters of fatty acids having 6 to 22 carbon atoms, methyl glucose and polyols, preferably glycerol or polyglycerol and polyalkylene glycols.
  • zwitterionic surfactants can be used as emulsifiers.
  • Zwitterionic surfactants are those surface-active compounds which carry at least one quaternary ammonium group and at least one carboxy or sulfonate group in the molecule.
  • Particularly suitable zwitterionic surfactants are the so-called betaines, such as N-alkyl-N, N-dimethylammonium glycinates, for example cocoalkyldimethylammonium glycinate, N-acylamino-propyl-N, N-dimethylammonium glycinates, for example cocoacylaminopropyldimethylammonium glycinate, and 2-alkylbenzenesulfonate.
  • 3-carboxymethyl-3-hydroxy-ethylimidazolines having in each case 8 to 18 C atoms in the alkyl or acyl group, and the cocoacylaminoethylhydroxyethyl carboxymethylglycinate.
  • Particularly preferred is the known under the CTFA name Cocamidopropyl Betaine fatty acid amide derivative.
  • ampholytic surfactants are surface-active compounds which, in addition to a Cs.is-alkyl or acyl group in the molecule, contain at least one free amino group and at least one -COOH or -SOaH group and are capable of forming internal salts.
  • ampholytic surfactants are N-alkylglycines, N-alkylpropionic acids, N-alkylamino-butanoic acids, N-alkyliminodipropionic acids, N-hydroxyethyl-N-alkylamido-propylglycines, N-alkyltaurines, N alkylsarcosines, 2-alkylaminopropionic acids and alkylaminoacetic acids each having about 8 to 18 C atoms in the alkyl group.
  • ampholytic surfactants are N-cocoalkylaminopropionate, cocoacylaminoethylaminopropionate and C 12/18 acylsarcosine.
  • quaternary emulsifiers are also suitable, those of the esterquat type, preferably methyl-quaternized difatty acid triethanolamine ester salts, being particularly preferred.
  • anionic emulsifiers alkyl ether sulfates, monoglyceride sulfates, fatty acid sulfates, sulfosuccinates and / or ether carboxylic acids can be used.
  • oils bodies are silicone compounds, for example dimethylpolysiloxanes, methylphenylpolysiloxanes, cyclic silicones and also amino, fatty acid, alcohol, polyether, epoxy, fluorine, alkyl and / or glycoside-modified silicone compounds which may be both liquid and resinous at room temperature.
  • the oil bodies may be present in the compositions according to the invention in amounts of from 1 to 90, preferably from 5 to 80, and in particular from 10 to 50,% by weight, based on the composition.
  • the present invention relates to agents suitable for dyeing skin, nails and / or hair, preferably hair colorants, containing at least one of the above-described keratin-binding effector molecules according to the invention.
  • a further subject of this invention is a process for dyeing hair, skin and / or nails using the keratin-binding effector molecules according to the invention.
  • Keratin-binding effector molecules which contain at least one of the abovementioned keratin-binding polypeptides (ii) and at least one dyestuff or reactive dyestuff according to Tables 3, 5 and 6 are preferably used in this process.
  • keratin-binding effector molecules with different dyes can be mixed with each other in the preparation of the preparations suitable for dyeing hair, the special color shades are achieved.
  • the preparation of preparations with special color shades can e.g. be carried out by (a) mixture of selected reactive dyes or dyes in the
  • keratin-binding effector molecules Preparation of the keratin-binding effector molecule, or (b) Mixing of individual keratin-binding effector molecules when preparing the hair dye.
  • keratin-binding effector molecules are used, containing
  • keratin-binding polypeptide having one of the sequences according to SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,
  • 158, 160, 162, 164, 166, 168 or 170 preferably in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 44, 46, 48, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166,
  • 168 or 170 more preferably 166 and 168, most preferably 168, or a polypeptide which is at least 40%, 45% or 50%, preferably at least 55%, 60%, 65% or 70%, especially preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% or 94%, very particularly preferably at least 95% or 96% is identical to at least one of the sequences according to SEQ ID No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12,
  • the dyeing of the hair preferably takes place by applying a preparation containing the keratin-binding effector molecules according to the invention to the hair to be dyed in an amount and time sufficient to produce the desired color change.
  • good staining with a suitable keratin-binding effector molecule can already be achieved after a very short time (a few minutes) or at least within half an hour (see Example 20).
  • a reversible dyeing process in which the keratin-binding effect tormolekül in a displacement reaction of skin, hair or nails can be removed.
  • a rinse with keratin can be used, whereby the keratin-binding effector molecules are displaced from their existing bond to the keratin and are saturated with the keratin from the rinse.
  • rinsing with a high proportion of detergent (eg SDS) for washing off is possible (see Example 20).
  • Bos taurus placophilin 1 partial mRNA Accession XM_868348
  • Nucleic acid Xenopus laevis similar to placophilin 4 Accession BI390496 XM_621314 Protein Mus musculus desmoplakin, Accession XM_621315 Nucleic acid Rattus norvegicus similar to desmoplakin isoform II, Accession XM_225259 Protein Rattus norvegicus similar to desmoplakin isoform II, Accession XM_225260 Nucleic acid Pan troglodytes desmoplakin, Accession XM_518227 Protein Pan troglodytes desmoplakin, Accession XM_518228 Nucleic acid Gallus gallus similar to Desmoplakin , Accession XM_418957 Protein Gallus gallus similar to Desmoplakin, Accession XM_418958 Nucleic acid H.
  • TRHY Nucleic Acid Human Trichohyalin
  • TRHY Protein human trichohyalin
  • EPPK1 Nucleic Acid H. sapiens epiplakin 1
  • EPPK1 Protein H. sapiens epiplakin 1
  • nucleic acid Lib152 (SEQ ID No .: 157) was amplified
  • Example 1 Expression vectors and production strains
  • KBD keratin-binding domains
  • promoters e.g., IPTG-inducible, rhamnose inducible, arabinose inducible, methanol inducible, constitutive promoters, etc.
  • constructs were tested in which the KBDs were expressed as fusion proteins (e.g., as a fusion with thioredoxin, or eGFP, or YaaD [B.subtilis, SWISS-PROT: P37527, PDX1], etc.).
  • KBD-B Keratin-binding domain B, SEQ ID No .: 4
  • KBD-C Keratin-binding domain C, SEQ ID No .: 10
  • the mentioned vector constructs are not limiting for the stress.
  • the vector map of the IPTG-inducible vector pQE30-KBD-B ( Figure 5), the methanol-inducible vectors pLib15 ( Figure 6) and pLib16 ( Figure 7) and the inducible vector pLib19 ( Figure 8) are exemplified. Analogous to the described vector constructions and expressions, KBD-C can also be used.
  • KBD expression in B. megaterium was analogous to: Barg, H., Malten, M. & Jahn, D. (2005). Protein and vitamin production in Bacillus megaterium. Methods in Biotechnology- Micobial Products and Biotransformations (Barredo, J.-L., Ed, 205-224).
  • Fungal production strains were Pichia pastoris (see example 3, eg GS1 15 and KM71 [both Invitrogen] and others) and Aspergillus nidulans (see example 4; eg RMS011 [Stringer, MA, Dean, RA, Sewall, TC, Timberlake, WE (1991) Rodletless, a new Aspergillus developmental mutant induced by direct gene activation. Genes Dev 5: 1 161-1 171] and SRF200 [Karos, M, Fischer, R (1999) Molecular characterization of HymA, to evolutionarily highly conserved and highly expressed protein of Aspergillus nidulans. Mol Genetics 260: 510-521], and others).
  • Other fungal production hosts such as Aspergillus niger (KBD expression analogous to EP 0635574A1 and / or WO 98/46772) could also be used for KBD expression.
  • Example 2 KBD expression in E. coli strains with IPTG inducible promoters, e.g. through the expression plasmid pQE30-KBD-B
  • various production hosts were used, e.g. various E. coli strains (eg, XLI O-GoId [Stratagene], BL21-CodonPlus [Stratagene], and others), Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, etc.
  • E. coli strains e.g, XLI O-GoId [Stratagene], BL21-CodonPlus [Stratagene], and others
  • Bacillus megaterium Bacillus subtilis
  • Lambda maxiDNA (DNA lambda maxi kit, Qiagen company) was prepared from a cDNA library of human keratinocytes (BD Bioscience, Clontech,
  • the PCR was carried out using the following oligonucleotides: Bag 43 (5 '- GGTCAGTTACGTGCAGCTGAAGG -3') (SEQ ID No .: 141) and bag 44 (5 'GCTGAGGCTGCCGGATCG -3') (SEQ ID No .: 142)
  • Oligo Bag 43 (192ng / ⁇ l) 0.5 ⁇ l
  • Oligo Bag 44 (181 ng / ⁇ l) 0.5 ⁇ l
  • Bag 53 (5 '- CGCGCCTCGAGCCACATACTGGTCTGC -3') (SEQ ID No .: 143) and
  • Bag 51 (5 '- GCTTAGCTGAGGCTGCCGGATCG -3') (SEQ ID No .: 144)
  • Oligo Bag 53 (345ng / ⁇ l) 0.5 ⁇ l
  • Oligo Bag 51 (157ng / ⁇ l) 0.5 ⁇ l
  • the resulting approximately 1073 bp PCR product was excised from an agarose gel, purified and cloned into the vector: pCR2.1-TOPO (Invitrogen).
  • the resulting vector pCR2.1-TOPO + KBD-B (5027 bp) was then transformed, amplified in E. coli, then cut with Xhol and EcoRI and the resulting KBD-B fragment in pBAD / HisA (Invitrogen; cleaved with Xhol and EcoRI).
  • the newly formed vector pBAD / HisA + KBD-B (5171 bp) was again cut with Sacl and Stul and the resulting KBD-B fragment was cloned into pQE30 (Qiagen, cut with Sacl and SmaI).
  • the resulting expression vector pQE30-KBD-B (4321 bp; see also Figure 5) was used for the following KBD-B expressions.
  • the KBD-B expressed by the vector pQE30-KBD-B in E. coli (SEQ ID No .: 4) additionally contained the amino acids MRGSHHHHHHSACEL at the N-terminus and the amino acids GVDLQPSLIS (SEQ ID No .: 166) at the C-terminus.
  • Precultures were inoculated from plate or glycerol culture with E. coli strains transformed with pQE30-KBD-B (e.g., XLI O-GoId [Stratagene]). Depending on the size of the main culture was inoculated in a tube or a small flask with LB medium (about 1: 100).
  • the main culture was inoculated about 1: 100 with preculture, main culture: LB medium or suitable minimal medium with the respective antibiotics. Incubation at 250 rpm and 37 ° C.
  • the induction was carried out with 1 mM IPTG from an OD (600 nm) of 0.5.
  • the cells were centrifuged after 4 h induction.
  • Example 3 Intracellular and secretory expression of KBD by Pichia pastoris strains using methanol-inducible promoters, e.g. through the expression plasmids pLib 15 and pLib 16 (shake flasks)
  • Pichia pastoris strains were used, e.g. GS115 and KM71 (Pichia Expression Kit, Version M; Invitrogen Life Technologies).
  • KBD-B by P. pastoris transformed with pLib15 (intracellular expression, vector see Figure 6) or pLib16 (secretory expression, vector see Figure 7) is described here.
  • pLib15 a 948 bp KBD-B-encoding DNA fragment (SEQ ID No .: 145) was amplified by PCR using the oligonucleotides Lib148
  • a 942 bp KBD-B encoding DNA fragment (SEQ ID NO: 149) was amplified by PCR using oligonucleotides Lib149 ( ⁇ ' -GCTGGAGAATTCTCAGCTAATTAAGCTTGGCTGCA-S ' (SEQ ID NO: 148)). and Lib150 (5 ' - - GCTAAGGAATTCCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-S ' (SEQ ID No .: 151) as well as the vector pQE30-KBD-B (Example 2, Figure 5) as template amplified EcoRI restriction sites at both ends of the PCR products brought in.
  • the PCR was carried out in 50 ⁇ l of reaction mixtures which were composed as follows: 1 ⁇ l of plasmid DNA pQE30-KBD-B 1 ⁇ l of dNTP mix (each 10 mM, Eppendorf) 5 ⁇ l of 10 ⁇ PCR buffer + MgCl 2 (Roche) 1 ⁇ l Lib148 or Lib150 5 ' primer (corresponds to 50 pmol)
  • the PCR reactions were carried out under the following cycling conditions:
  • Step 1 5 minutes 95 ° C (denaturation)
  • Step 2 45 seconds 95 ° C
  • Step 3 45 seconds 50 ° C (annealing)
  • Step 4 2 minutes 72 ° C (elongation) 30 cycles of steps 2-4
  • Step 5 10 minutes 72 ° C (post-elongation)
  • Step 6 4 0 C (Pause)
  • the PCR product which was amplified with the oligonucleotides Lib148 / Lib149 was digested with EcoRI and inserted into the EcoRI-cut vector pPIC3.5 (Pichia Expression Kit, Version M, Invitrogen Company). ligated. The correct KBD-B amplification was checked by sequencing the vector pLib15 resulting from the ligation ( Figure 6).
  • the PCR product which was amplified with the oligonucleotides Lib149 / Lib150 was digested with EcoRI and inserted into the EcoRI-cut vector pPIC9 (Pichia Expression Kit, Version M, Invitrogen) ligated.
  • the correct KBD-B amplification was verified by sequencing the ligation-derived vector pl_ib16 ( Figure 7).
  • Electrocompetent cells and spheroplasts of the P. pastoris strains were probed with the circular and Stul linearized vectors pl_ib15 and pl_ib16, respectively
  • the incubation of the main culture was carried out at 250-300 rpm and 30 ° C for 1-96 h. - The induction was maintained every 24 hours by adding 100% methanol at a final concentration of 0.5% methanol.
  • the harvesting and digestion of the cells took place after the end of the main culture by means of a Menton Gaulin.
  • the culture supernatant was collected and the KBD-B purified therefrom directly.
  • P. pastoris KBD-B SEQ ID No .: 145) (pLib15) contained in addition to the polypeptide sequence SEQ ID No .: 4 additionally at the N-terminus, the amino acids MHHHHHH and at the C-terminus the amino acids GVDLQPSLIS.
  • P. pastoris KBD-B (SEQ ID No .: 149) (pLib16) included in addition to the polypeptide sequence SEQ ID No .: 4 additionally at the N-terminus, the amino acids YVEFHHHHHH and at the C-terminus, the amino acids GVDLQPSLIS.
  • pLib16 The secreted and processed by P. pastoris KBD-B (SEQ ID No .: 149) (pLib16) included in addition to the polypeptide sequence SEQ ID No .: 4 additionally at the N-terminus, the amino acids YVEFHHHHHH and at the C-terminus, the amino acids GVDLQPSLIS.
  • pLib16 The secreted and processed by P. pastoris KBD-B (SEQ ID No .: 149) (pLib16) included in addition to the polypeptide sequence SEQ ID No .: 4 additionally at the N-terminus, the amino acids YVEFHHHHHH and at the C-terminus, the amino acids GVDLQPSLIS.
  • A. nidulans wild type strains were used, e.g. RMS01 1 or SRF200.
  • RMS01 1 or SRF200 the expression of KBD-B by A. nidulans, transformed with pl_ib19 ( Figure 8) is described.
  • püb19 was a 922 bp (SEQ ID No .: 152) large, KBD-B DNA fragment encoding by PCR using the oligonucleotides Lib151 (5 '-CACCATGCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-
  • the PCR product was cloned into the vector pENTR / D (pENTR Directional TOPO ® Cloning TM Kit, version E, Invitrogen company)
  • the correct KBD-B amplification was checked by sequencing
  • the recombination of the KBD-B-encoding DNA fragment was carried out in the vector pMT-OvE (Toews MW, Warmbold J, Konzack S, Rischitor P , Veith D,
  • the fungal mycelium was harvested by filtration, washed with distilled water, and transferred to flasks containing 100-500 mL of fresh minimal medium.
  • 0.1% fructose was used as the C source instead of glucose.
  • the medium was additionally supplemented with ethanol (1% final concentration) or glycerol (50 mM) or sodium acetate
  • the mentioned additives for expression induction are not limiting for the stress.
  • the main culture was incubated for a further 5-48 h at 200-250 rpm and 37 ° C.
  • the fungal mycelium was harvested at 1500-3000 ⁇ g for 5 minutes at room temperature and disrupted by means of a Menton Gaulin.
  • the A. nidulans-expressed KBD-B (SEQ ID No .: 152) (pLib19) contained in addition to the polypeptide sequence SEQ ID No .: 4 additionally at the N-terminus the amino acids MHHHHHH and at the C-terminus the amino acids
  • Example 5 Cell disruption and inclusion body purification (pQE30-KBD-B). Soluble expressed KBD could be directly used or purified by chromatography (e.g., by means of Menton-Gaulin) after cell disruption (see Example 6). Insoluble KBD (e.g., in inclusion bodies) was purified as follows:
  • the digest was recentrifuged (15000g), the pellet of which was 20mM
  • the pH of the supernatant was adjusted to 7.5 - then centrifuged again and the supernatant on a Ni chelate
  • Example 6 Purification of Keratin Binding Domain B via Ni Chelate Sepharose.
  • the purification of the KBD could be purified by the attached His-tag over a Ni column chromatographisch.
  • the material was packed in a column (eg diameter 2.6 cm, height 10 cm) and equilibrated with Buffer A + 4% Buffer B (equivalent to 20 mM imidazole).
  • Buffer A + 4% Buffer B (equivalent to 20 mM imidazole).
  • Buffer B equivalent to 20 mM imidazole.
  • the protein extract (see, eg, Zeil-Hommen and Inclusion-Body-Reinvent) was applied to the column at pH 7.5 via a Superloop ( ⁇ KTA system) (flow about 5 ml / min).
  • the eluate could be desalted (advantageous for samples to be concentrated).
  • the eluate was e.g. desalted over a Sephadex G25 medium column (Amersham Company). Thereafter, it was possible to concentrate, for example, an Amicon chamber (Stirred Ultrafiltration Cell, Millipore).
  • Buffer A 20 mM sodium dihydrogenphosphate 500 mM NaCl (optionally, buffers with lower NaCl can also be used).
  • KBD is chromatographed, which has already been expressed soluble.
  • Buffer B 20 mM sodium dihydrogen phosphate
  • Example 7 Renaturation of keratin-binding domain B.
  • Insoluble-expressed keratin-binding domain (for example, from inclusion bodies) can be renatured and thus activated as follows:
  • Example 8 Binding to Skin 1 (Qualitative) A visual qualitative test was developed to check if KBD binds to skin. Used solutions:
  • TBS 20 mM Tris; 15 mM NaCl pH 7.5
  • TTBS TBS + 0.05% Tween20
  • the first step is the transfer of the outer keratin layer from the skin to a stable carrier.
  • a transparent adhesive strip was firmly applied to depilated human skin and removed again.
  • the test can be carried out directly on the transparent adhesive strip or the adhering keratin layer can be transferred to a glass slide by sticking it on again.
  • the detection of binding was carried out as follows:
  • a blue color precipitate indicates that KBD has bound to the skin.
  • a quantitative test has been developed that compares the hair / skin binding strength of the KBD with non-specific proteins. From a thawed dry piece of skin without hair (human or pig), a piece was drilled out with a 5 mm cork borer (or, in the case of a surface test, a piece of skin fitted into a falcon lid). The skin sample was then brought to a thickness of 2-3 mm to remove any existing tissue. The skin sample was then transferred to an eppendorf (protein lowbind) to perform binding detection (see also Figure 9) Alternatively, the episkin system [reconstituted human skin] from L'Oreal may be used:
  • the absorbance was measured at 405 nm
  • Peroxidase substrate (set shortly before): 0.1 ml TMB solution (42 mM TMB in DMSO)
  • Example 10 Binding to Hair (Quantitative) In order to demonstrate the binding strength of KBD to hair compared to other proteins, a quantitative assay was developed (see also Figure 9). In this test, hair was first incubated with KBD and excess KBD was washed off. Subsequently, an antibody-peroxidase conjugate was coupled via the His tag of KBD. Unbound antibody-peroxidase conjugate was rinsed off again. The bound antibody-peroxidase conjugate [Monoclonal AntipolyHistidine Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Sigma Company] can convert a colorless substrate (TMB) into a colored product that is phosphorous. measured at 405 nm.
  • TMB colorless substrate
  • the amount of absorption indicates the amount of bound KBD or control protein.
  • Y-aaD from B.subtilis was chosen as the comparison protein and likewise had a His tag for detection, as is necessary for this test.
  • His-tag instead of the His-tag, other specific antibodies conjugated to peroxidase can also be used.
  • Peroxidase substrate (set shortly before): 0.1 ml TMB solution (42 mM TMB in DMSO) + 10 ml Substrate buffer (0.1 M sodium acetate pH 4.9) + 14.7 ⁇ l H 2 O 2 3%
  • Table 4 Quantitative KBD activity test hair: 1) buffer; 2) comparative protein YaaD; 3) KBD-B denatured; 4) KBD-B renatured.
  • the table shows the measured absorbance values at 405 nm.
  • Example 1 Expression of KBD-D (SEQ ID No .: 167) by means of Escherichia coli strains using the expression plasmid pReeO24 with an IPTG inducible promoter ( Figure 8)
  • E. coli strain XL10 Gold [Stratagene] was used.
  • Lambda maxiDNA (DNA Lambda Maxi Kit, Qiagen Company) was prepared from a human keratinocyte cDNA library (BD Bioscience, Clontech, Human Keratinocyte cDNA, foreskin, log-phase primary culture, vector: ⁇ gt11).
  • PCR for amplification of the KBD-D gene was performed in two steps. First, the 5 ⁇ nde and 3 ' end was independently amplified. These fragments were the template for amplification of the entire KBD-D gene.
  • the PCR to amplify the 5 ' end was performed as follows:
  • the primers had the following sequence:
  • HRe6 5 - ATGAACCACTCGCCGCTCAAGACCGCCTTG - 3 ' (SEQ ID No .: 171)
  • HRe9 5 ' - CGTTCCCGGTTCTCCTCAGGAGGCTGACTG - 3 ' (SEQ ID No .: 172)
  • the PCR for amplification of the 3 'end was performed as follows:
  • the primers had the following sequence:
  • the 5 'end template and the 3 ⁇ nde- template was used as a template.
  • the PCR was carried out as follows: 100 ⁇ l PCR approach:
  • the resulting approximately 2150 bp PCR product was excised from an agarose gel, purified and cloned into the vector: pCR2.1 -TOPO (Invitrogen company).
  • the resulting vector pRee019 (61 12 bp) was then transformed, amplified in E. coli. and the KBD-D gene is checked by sequencing.
  • the KBD-D gene was cloned into the expression vector.
  • another PCR was carried out with the vector pReeO19 as template:
  • Precultures were inoculated from plate or glycerol culture with pReeO24 transformed E. coli strains (e.g., TG10). Depending on the size of the main culture was inoculated in a tube or a small flask with LB medium (about 1: 100).
  • Antibiotics were used depending on the strain used (for pReeO24 transformed E. coli TG10 ampicillin 100 ⁇ g / ml). It was incubated at 250 rpm and 37 ° C.
  • the main culture was inoculated approximately 1: 100 with preculture, main culture: LB medium or suitable minimal medium with the respective antibiotics. Incubation at 250 rpm and 37 ° C. - The induction was carried out with 1 mM IPTG from an OD 5 78nm of 1. Then the incubation temperature was lowered to room temperature (about 20 ° C). The cells were centrifuged 2 hours after induction. (See Figure 9)
  • buffer A (1 OmM NaHaPO 4 , 2 mM KH 2 PO 4 , 10 mM NaCl, 8 M urea, 5 mM DTT).
  • Example 12 The fractions from Example 12 containing purified KBD-D were placed in a dialysis tubing (MWCO 12-14KD). Then for about 1 hour against 1 L 8 M urea. dialyzed.
  • KBD-D was used for the following activity tests.
  • TBS 20 mM Tris; 150mM NaCl pH 7.5
  • TTBS TBS + 0.05% Tween20
  • the first step is the transfer of the outer keratin layer from the skin to a stable carrier.
  • a transparent adhesive strip was firmly applied to depilated human skin and removed again.
  • the test can be carried out directly on the transparent adhesive strip or the adhering keratin layer can be transferred to a glass slide by sticking it on again.
  • the detection of binding was carried out as follows: For incubation with the various reagents Transfer into a Falcon vessel, if necessary add ethanol for degreasing, remove ethanol and dry the slides
  • Peroxidase conjugate coupled via the His tag of KBD-B or -D. Unbound antibody-peroxidase conjugate was rinsed off again. The bound antibody-peroxidase conjugate can convert a colorless substrate (TMB) into a colored product which has been measured photometrically at 405 nm. The strength of the absorption indicates the amount of bound KBD-B or -D.
  • TMB colorless substrate
  • the test for binding to Haur was performed with human keratinocytes in microtiter plates as follows.
  • the absorbance was measured at 405 nm
  • Peroxidase substrate prepared shortly before: 0.1 ml TMB solution (42 mM TMB in DMSO)
  • keratin binding domain to be tested (coupled to tag - e.g., His ⁇ , HA, etc.) in 1 ml PBS / 0.05% Tween 20; Incubation for 2 h at room temperature with slight swiveling movements.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS phosphate buffered saline
  • Tween 20 polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n about 20
  • Tab.5 a Quantitative binding of KBD-D or KBD-B to the skin.
  • the listed absorption values are standardized values on the surface (of skin or hair)
  • Tab.5 c Quantitative binding of KBD-D and KBD-B to skin and hair after 10% SDS treatment in% relative to KBD-D and KBD-B untreated hair or skin. These results show that the protein can bind KBD-D to hair and more to skin (see Table 5). In contrast to KBD-B (SEQ ID No .: 166), the binding of KBD-D (SEQ ID No .: 168) is only influenced to a lesser extent by washing with up to 10% SDS solution (see Table 5a ).
  • Ellmann's reagent 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB); 4 mg / 1 ml in 0.1 M Na phosphate buffer
  • Example 17 Hair Binding Activity of KBD-B Dye
  • KBD-B SEQ ID No .: 166
  • a quantitative binding assay was performed (see Figure 9) First, hair was incubated with KBD-B dye and washed off unbound KBD-B dye. Subsequently, a peroxidase was coupled via the His-tag of the KBD-B. Unbound peroxidase was washed off again. The bound peroxidase can convert a colorless substrate (TMB) into a colored product that has been measured photometrically at 405 nm. The amount of absorption indicates the amount of bound KBD-B-panthenol. As a comparative sample KBD-B was chosen without dye. For exact execution see Example 10.
  • the reactive dye capable of coupling was coupled to the KBD-B (SEQ ID No .: 166) via at least one of the two free SH groups of a cysteine. Ideally, therefore, the reaction between KBD-B and activated dye takes place in a molar ratio of 1: 2.
  • Example 19a Coupling of reactive dyes to KBD-D (SEQ ID No .: 168)
  • cysteines in KBD-D can be used analogously to KBD-B.
  • KBD-D SEQ ID No .: 168
  • KBD-D has 24 cysteines.
  • targeted mutagenic cysteine residues can be inserted by directed mutagenesis.
  • the coupling of the dye to the KBD-D can thus be carried out analogously to the manner described in Example 19 and the dyes (14_1 to 14-366) as under 19 b) for the KBD-B described also using the KBD-D done (see Ex. 65).
  • the dyes 14_153, 14_154, 14-155, 14_156, 14_181, 14_182, 14_183, 14_276 and 14_289 are already in the vinyl sulfone form, i. H. these do not need to be activated (pre-eliminated), but can (according to Figure 1 1) be directly transposed with the KBD-D.
  • the KDB-D reactive dye thus obtained could be used analogously to the KDB-D reactive dye from Ex. 65 in the cosmetic formulations according to Examples 66-108.
  • Vinyl Sulfone Dyes (Formula 1): The reaction between KBD-B and activated dye is carried out in a molar ratio of 1: 2, since the KBD-B has two free cysteines for the effector coupling.
  • the vinylsulfone dyes chosen for the coupling are usually synthesized in the form of sulfuric acid ester and therefore have to be activated to form the vinylsulfone form before reaction with KBD-B because the dyes can react with nucleophilic groups only in their vinylsulfone form.
  • the activation is carried out under alkaline conditions, while the dye is adjusted to pH 1 1 in aqueous solution at room temperature for 2 minutes.
  • the dyes 14_153, 14_154, 14-155, 14_156, 14_181, 14_182, 14_183, 14_276 and 14_289 are already in the vinyl sulfone form, ie they do not need to be activated (pre-eliminated), but can (according to FIG. 1 1) be directly converted with the KBD become. The color of the respective product is indicated.
  • dyes e.g., dye 14_354, Figure 12
  • dyes which have a substitutable halogen atom in their reactive anchor
  • These dyes can be reacted without activation with the SH groups of KBD-B.
  • the reaction between KBD and dye 14_354 takes place in a molar ratio of 1: 2, since the KBD-B has two free cysteines for the effector coupling.
  • the reaction solution is gently shaken for 30 minutes at 30 ° C., pH 8-9.
  • the following dyes (14_292 to 14_366) can be reacted with KBD-B (SEQ ID No .: 166) or KBD-D (SEQ ID No .: 168). The color of the respective product is indicated.
  • a molecule with free SH groups e.g., cysteine
  • cysteine e.g., cysteine
  • the dyes used here are not to be purified after the synthesis, they contain both reactive and non-reactive secondary components.
  • Such minor components may be added after the coupling reaction or e.g. be removed during the hair dyeing process.
  • One possibility is to purify the dye-reacted KBD-B, e.g. by column chromatography. It is also possible to carry out the reaction between KBD-B and the reactive dye in a kind of "column reactor.”
  • the KBD-B could be coupled to a nickel affinity column, the dye can be bound to KBD-B, and the unfixed dye residues can be directly washed out
  • the KBD-B dye may be eluted from the column, or alternatively the KBD-B reacted with the dye may be applied to hair along with the non-reactive minor components and the unbound dye portion washed off the hair
  • a 15% Tween 20 solution in water is suitable.
  • a reactive red dye 14_264 was coupled to KBD-B (SEQ ID NO: 166) by the method described above. To show that the binding of KBD-B dye coupling to hair is mediated by the protein and not by the free dye itself, the same dye was treated only with cysteine but without KBD-B. Subsequently, KBD-B-14_264 and 14_264, respectively, were added to 5 mg of hair, briefly incubated and unbound KBD-B dye or pure Wash off the dye with a 15% Tween 20 solution. The result clearly shows that the binding to the hair is mediated by the KBD-B and a staining of the hair has taken place.
  • Desmocosmetic preparations according to the invention are described below containing the keratin-binding effector molecule prepared according to Example 19 (keratin binding domain according to SEQ ID No .: ID 166 coupled with the dye 14_264).
  • Said keratin-binding effector molecule is referred to in the following examples as keratin binding domain reactive dye 14_264. It is obvious to the person skilled in the art that all the other dyes described in Tables 6 and 7 can also be coupled with the KBD according to Example 19, 19 a or 19 b and can be used in the preparations mentioned below.
  • Example 21 Shampoo (base formulation without keratin-binding domain reactive dye)
  • phase A Weigh in the components of phase A and dissolve. Adjust the pH to 6-7. Add phase B and warm to approx. 50 ° C. Cool to room temperature while stirring.
  • the content of keratin-binding domain reactive dye 14_264 in the following examples refers to 100% keratin-binding domain reactive dye 14_264.
  • the active ingredient according to the invention can be used both in pure form and as an aqueous solution. In the case of the aqueous solution, the content of water must be the. be adapted in the respective formulation.
  • Preparation Mix the components of phase A. Weigh out phase B and dissolve it clearly, then stir into phase A. Fill with phase C.
  • Example 25 Two strands of blond, unbleached hair: Euro-natural hair, color 9/0, natural blond (2g) are treated with 0.5 g of the hair dye shampoo Example 22 / Variation 1 and the hair dye shampoo is left on the hair for 15 min. Subsequently, the hair strands are washed with water and cleaned with shampoo Example 21 and dried. The hair is completely red. There is no longer any blond hair to detect. A strand is reset as a comparison.
  • the second tress is washed five times with Shampoo Example 21 and dried. After the fifth wash, the tress is compared with the return sample. chen. The tress washed five times is still completely red. Both strands have the same shade of red. There is no visual difference in color depth.
  • Two strands of white hair selected, white Euro-natural hair (2 g) are treated with 0.5 g of the hair dye shampoo Example 22 / Variation 1 and the hair dye shampoo is left on the hair for 15 min. Subsequently, the hair strands are washed with water and cleaned with shampoo Example 21 and dried. The hair is completely red. There is no more white hair to detect. A strand is reset as a comparison.
  • the second tress is washed five times with Shampoo Example 21 and dried. After the fifth wash, the tress is compared with the return pattern. The tress washed five times is still completely red. Both strands have the same shade of red. Visually, there is no difference in color depth.
  • Two strands of blond, unbleached hair Two strands of blond, unbleached hair: Euro-natural hair, color 9/0, natural blonde
  • Example 29 the second tress is washed five times with Shampoo Example 21 and dried. After the fifth wash, the tress is compared with the return pattern. The tress washed five times is still completely red. Both strands have the same shade of red. There is no visual difference in color depth.
  • Example 29
  • the second tress is washed five times with Shampoo Example 21 and dried. After the fifth wash, the tress is compared with the return pattern. The tress washed five times is still completely red. Both strands have the same shade of red. There is no visual difference in color depth.
  • Example 30 Two Strands of White Hair: Selected White Euro Nature Hair (2g) is treated with 0.5g of the Color Styling Mousse Example 23 / Variation 1 and the Color Styling Mousse is left on the hair for 15 minutes. Subsequently, the hair strands are washed with water and cleaned with shampoo Example 21 and dried. The hair is completely red. There is no more white hair to detect. A strand is reset as a comparison.
  • the second tress is washed five times with Shampoo Example 21 and dried. After the fifth wash, the tress is compared with the return pattern. The tress washed five times is still completely red. Both strands have the same shade of red. There is no visual difference in color depth visually.
  • Example 31 Use of the KBD in a Day Care Emulsion - Type O / W

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Abstract

Die Erfindung betrifft keratinbindende Effektormoleküle, enthaltend Reaktivfarbstoffe und keratinbindende Polypeptide und deren Verwendung in Haarfärbezubereitungen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Färben von Haaren.

Description

Reaktivfarbstoffe enthaltende keratinbindende Effektormoleküle
Beschreibung
Die Erfindung betrifft keratinbindende Effektormoleküle, enthaltend Reaktivfarbstoffe und keratinbindende Polypeptide, sowie deren Verwendung in Haarfärbezubereitungen und die Haarfärbezubereitungen selber. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Färben von Haaren.
Stand der Technik
Zusammensetzungen zum Färben von Haaren (Haarfärbemittel) werden je nach ihrer Farbbeständigkeit in drei Klassen eingeteilt: Temporäre Haarfärbemittel, die nur 1-2 Haarwäschen haltbar sind, semipermanente Haarfärbemittel, die nach 8-10 Haarwäschen erneuert werden müssen und permanente Haarfärbemittel, die sich nicht her- auswaschen lassen.
Temporäre und semipermanente Haarfärbemittel werden als nicht oxidativ bezeichnet. Hier lagern sich die Farbstoffe an das Keratin des Haares an oder dringen in die Haarfaser ein. Bei permanenten Haarfärbemitteln, den mit Abstand am weitesten verbreite- ten Haarfärbemitteln, werden die Farben aus farblosen Vorstufen durch chemische Reaktion in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid, das als Oxidationsmittel dient, direkt auf und im Haar gebildet. Dabei wird das Haar vollständig durchgefärbt, die Farbe ist nicht auswaschbar. Man bezeichnet diese Haarfärbemittel als oxidative Haarfärbemittel. Die permanente Haarfärbung ist sehr beständig gegenüber der Haarwäsche, Lichteinwirkung und anderen Haarbehandlungsmethoden. Sie ist am weitesten verbreitet und besitzt unter den Haarfärbemitteln einen Marktanteil von ca. 80%. Sie braucht nur, bedingt durch den Haarwuchs, etwa jeden Monat erneuert zu werden. Bei diesem Färbesystem werden die Farbstoffe direkt auf und im Haar gebildet, und zwar durch Chemi- sehe Reaktionen, denen die ungefärbten Zwischenprodukte bzw. Vorprodukte unterworfen werden. Es laufen dabei Oxidationsreaktionen und Kupplungsvorgänge bzw. Kondensationen ab, die durch Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Ammoniak oder Monoethanolamin hervorgerufen werden. Die Verwendung von Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel ist deshalb erforderlich, weil es nicht nur die Farbstoffbildung initiiert, sondern gleichzeitig auch die Melanin-Pigmente des Haares zerstört und auf diese Weise eine Blondierung hervorruft, weshalb man bei diesem Färbevorgang auch von einer aufhellenden Färbung spricht.
Zu den permanenten Haarfärbemitteln sind prinzipiell auch die sog. selbstoxidierenden Farbstoffe zu rechnen, die bereits durch Luftsauerstoff oxidiert werden. Haarfärbemittel liegen üblicherweise in Form von wässrigen -vorzugsweise verdickten- Lösungen oder Emulsionen vor und enthalten neben Farbstoffen beispielsweise Fettalkohole und/oder andere Ölkomponenten, Emulgatoren und Tenside, sowie gegebenenfalls Alkohole. Oxidations-Haarfärbemittel bestehen in der Regel aus zwei Komponenten, nämlich
(A) der die Farbstoffe enthaltenden Farbstoffträgermasse und
(B) der Oxidationsmittelzubereitung.
Diese Komponenten werden kurz vor der Anwendung vermischt und dann auf die zu färbende Faser aufgetragen. Übliche Darreichungsformen für solche Permanent-oder Oxidations-Haarfärbemittel sind Cremehaarfarben und Haarfärbegele.
Laut Studien färben sich 35 Prozent der Frauen und zehn Prozent der Männer in In- dustrieländern regelmäßig die Haare. Allerdings sind chemische Haarfarben seit längerem umstritten, da gesundheitliche Risiken nicht ausgeschlossen sind. So erfolgt bei jeder Haarfärbung auch gleichzeitig eine Schädigung der Haare. Die färbenden Pigmente müssen durch die schützende Schuppenschicht hindurch in die Rindenschicht des Haares geschleust werden.
Wie bereits oben ausgeführt, enthalten Haarfarben zwei Komponenten: ein Oxidati- onsmittel und eine Farbcreme. Die in den Haarfarben enthaltenen aromatischen Amine sind in der jüngsten Vergangenheit besonders in die Kritik geraten. Bei der Färbung sollen diese über den Kopf in den Körper gelangen und in der Leber abgebaut werden. In der Blase werden die Abbauprodukte dann teilweise zu krebserregenden Stoffen umgewandelt.
Eine kürzlich erschienene Studie der Dartmouth Medical School im "International Journal of Cancer" (A. Andres: Int J Cancer 2004; 109: 581-586) sieht einen möglichen Zusammenhang zwischen Haarfärbungen und Blasenkrebs: Frauen, die regelmäßig permanente Haarfärbemittel benutzten, hätten im Durchschnitt ein 1 ,5 bis 2,3-fach erhöhtes Risiko an Harnblasenkrebs zu erkranken als Frauen, die sich nicht die Haare färbten.
Permanente Haarfarben, die nicht auf ihre Unbedenklichkeit hin getestet worden sind, sollen in der EU zukünftig verboten werden. Das beträfe im Moment die Hälfte aller Haarfärbemittel.
Eine Aufgabe dieser Erfindung bestand darin, neuartige dermokosmetische Wirkstoffverbindungen zur Applikation auf Haut oder Haar, im speziellen zur Färbung von Haut, Haar oder Nägel, sowie Verfahren zur Herstellung derselben, bereitzustellen. Vorteil- hafterweise sollten Wirkstoffverbindungen identifiziert werden, die über eine keratinbin- dende Eigenschaft verfügen und zudem zur Herstellung von kosmetischen Mitteln und/oder Haarfärbemitteln geeignet sind. Ferner war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, geeignete Verbindungen zu identifizieren, welche über eine kovalente Bindung an ein Polypeptid mit keratinbindenden Eigenschaften gekoppelt werden können. Im Besonderen war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine innovative Methode zur Haarfärbung, bevorzugt einer reversiblen Färbung, zur Verfügung zu stellen, bei der das Haar möglichst wenig geschädigt wird. Diese Aufgaben konnten überraschenderweise wie im folgendem beschrieben gelöst werden durch die Kopplung von chemischen Farbstoffen an keratinbindende Polypeptide.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung keratinbindende Effektormoleküle, enthaltend (a) mindestens einen Reaktivfarbstoff (i) und (b) mindestens ein keratin- bindendes Polypeptid (ii).
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die genannten keratinbindenden Effektormoleküle zumindest ein keratinbindendes Polypeptid (ii), welches eine Bindungsaffinität zu menschlichen Haut-, Haar- oder Nagelkeratin aufweist.
Vorzugsweise umfasst das unter (b) genannte keratinbindende Polypeptid (ii)
(a) mindestens ein Polypeptid mit einer der in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 dargestellten Sequenzen, oder
(b) ein Polypeptid, welches mindestens zu 40% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106,
108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 und in der Lage ist Keratin zu binden.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäß verwendete keratinbindende Polypeptid (ii) kodiert von einem Nukleinsäuremolekül umfassend mindestens ein Nukleinsäuremole- kül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40,
42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 gezeigte Sequenz;
b) b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No.: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161 , 163, 165, 167 oder 169 umfasst;
c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid gemäß der Sequenzen SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156,
157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 kodiert;
d) Nukleinsäuremolekül, mit einer Nukleinsäuresequenz entsprechend wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57,
59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161 , 163, 165, 167 oder 169 oder ein davon durch Substitution, Deletion oder Insertion abgeleitetes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches mindestens zu
40% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156,
157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 und in der Lage ist an Keratin zu binden;
e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem mo- noklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid, welches durch die
Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird;
f) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein keratinbindendes Protein, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert;
g) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein keratinbindendes Protein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt (Nukleotide), vorzugswei- se 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann, und h) Nukleinsäuremolekül, welches durch Rückübersetzung einer der in den Sequenzen SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138,
140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170gezeigten Aminosäuresequenzen erzeugt werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die genannten keratinbindenden Effektormoleküle zumindest einen Reaktivfarbstoff (ii), der über wenigstens einen Reaktivanker verfügt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
(a) einer unter alkalischen Bedingungen aktivierbaren Gruppe der Formel 1 ,
Formel 1
worin die Bindung zum Farbstoffmolekül (F) bedeutet, X für einen elektronenziehenden Rest oder für ein Alkyl-, -O-Alkyl-, Cyano-, Hydro- xy-, Halogen-Rest oder H steht, k für 1 , 2 oder 3 steht, n 0 oder 1 bedeutet, und B für eine Gruppe -CH=CH2 oder eine Gruppe -CH2-CH2-Q oder -NH-CH2-CH2-Q oder -NH-CH=CH2 steht, worin Q eine unter alkalischen Bedingungen abspaltbare Gruppe steht, und
(b) einem Acrylamido-Anker der Formel 2,
Formel 2 worin
— die Bindung zum Farbstoffmolekül (F) bedeutet, und
(c) einer der Verbindungen gemäß der Formeln 3, 4 oder 5,
Formel 3 Formel 4
Formel 5
worin
— die Bindung zum Farbstoffmolekül (F) bedeutet,
V Fluor oder Chlor bedeutet;
Ui, U2 unabhängig voneinander Fluor, Chlor oder Wasserstoff sind; und
Qi, Q2 unabhängig voneinander Chlor, Fluor, Cyanamido, Hydroxy, (C 1 -Ce)-Al koxy, Phenoxy, Sulfophenoxy, Mercapto, (Ci-C6)-Alkylmercapto, Pyridino, Carboxypy- ridino, Carbamoylpyridino, oder eine Gruppe der allgemeinen Formel (6) oder (7) bedeuten,
R2 / Formel 6 — N ^W — SO2Z
R3
_ / Formel 7 N
R4 worin R2 Wasserstoff oder (Ci-C6)-Alkyl, Sulfo-(Ci-C6)-Alkyl, oder Phenyl ist, das un- substituiert oder durch (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Sulfo, Halogen, Carboxy, Aceta- mido, Ureido substituiert ist; R3 und R4 haben unabhängig voneinander eine der Bedeutungen von R2, oder sind eine Gruppe der allgemeinen Formel (8),
Formel 8
oder bilden ein cyclisches Ringsystem der Formel -(Chb)]- wobei j 4 oder 5 bedeutet, oder alternativ -(CH2)2-E-(CH2)2-, wobei E Sauerstoff, Schwefel, Sulfo, -NR5- mit R5'=(Ci-C6)-Alkyl ist; W ist Phenylen, das unsubstituiert oder substituiert ist durch ein oder zwei Substituen- ten, wie (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Carboxy, Sulfo, Chlor, Brom, oder ist (Ci-C4)- Alkylen-Arylen oder (C2-C6)-Alkylen, das unterbrochen sein kann durch Sauerstoff, Schwefel, Sulfo, Amino, Carbonyl, Carbonamido, oder ist Phenylen-CONH-Phenylen, das unsubstituiert oder durch (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Hydroxy, Sulfo, Carboxy, Amido, Ureido oder Halogen substituiert ist, oder ist Naphthylen, das unsubstituiert oder durch eine oder zwei Sulfogruppen substituiert ist; und
Z für eine Gruppe -CH=CH2 oder eine Gruppe -CH2-CH2-Q oder -NH-CH2-CH2-Q oder -NH-CH=CH2 steht, worin Q für eine unter alkalischen Bedingungen abspaltbare Gruppe steht;
R24, R25 und R26 sind (Ci-C4)-Alkyl oder (Ci-C4)-Hydroxyalkyl;
B- ist das Äquivalent eines Anions, wie Hydrogensulfat, Sulfat, Fluorid, Chlorid, Bromid, Dihydrogenphosphat, Hydrogenphosphat, Phosphat, Hydroxid oder Acetat;
In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das keratinbindende Effektormolekül einen Reaktivfarbstoff, enthaltend einen Reaktivanker gemäß Formel 1 , wobei wenigstens einer der dort vorhandenen Reste für eine Gruppe SO3H steht.
Desweiteren betrifft die Erfindung bevorzugt keratinbindende Effektormoleküle, welche einen Reaktivfarbstoff enthalten, welcher einen Reaktivanker gemäß Formel 1 enthält und worin B in Formel 1 für CH=CH2, eine Gruppe CH2-CH2-O-SO3H oder für CH2-CH2- Cl steht.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die oben beschriebenen keratinbindenden Effektormoleküle, bei denen die unter alkalischen Bedingungen aktivierbare Gruppe der Formel 1 über eine Gruppe -NH-, -N=N-, -NH-C(O)-, -NH-SO2- oder -N(R)- an das Farbstoffmolekül (F) gebunden ist, wobei R für Alkyl steht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um keratinbindende Effektormoleküle, welche Farbstoffe enthalten, ausgewählt aus der Gruppe von Farbstoffen der Phthalocyanin-Reihe, Antrachinon-Farbstoffen, Azofarbstoffen, Formazanfarbstoffen, Dioxazin-Farbstoffen, Actidin-Farbstoffen, Xanthen-Farbstoffen, Polymethin-Farbstoffen, Stilbenfarbstoffen, Schwefelfarbstoffen, Triarylmethanfarbstoffen, Benzopyran-farbstoffen, Dibenzanthron- farbstoffen und den Metallkomplexen dieser Farbstoffe.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind ferner keratinbindende Effektormoleküle, enthaltend mindestens einen Reaktivfarbstoff, welcher einen Reaktivanker umfasst, ausgewählt aus den nachfolgenden Resten (1-1 ) bis (1-43).
(1-10) (1-1 1 ) (1-12)
(1-13) (1-14) (1-15)
SO2-CH2-CH2-O-SO3H
(1-16) (1-17) (1-18)
)
* V soo-CHo-CHo-O-SO,H -SO,-CH,-CH,-O-SO,H
(1-22) (1-23) (1-24)
(1-25) (1-26) (1-27)
(1-28) (1-29) (1-30) — <f VsO2-NH-CH2-CH2-O-SO3H -→^Λ- SO0-NH-CH0-CH0-CI -J \ -SO2-NH-CH=CH2
(1-31 ) (1-32) (1-33)
CH,O— <f V— SO0-NH-CI-L-CH0-O-SO-H Γ C ^nMH3X nU)—- —/ v/ \ v — SO2-NH-CH=CH2
(1-34) (1-35) (1-36)
(1-40)
(1-37) (1-38) (1-39)
(1-41 ) (1-42) (1-43)
Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner keratinbindende Effektormoleküle, bei denen der Reaktivfarbstoff (i) indirekt über ein Linkermolekül an das keratinbindende Polypeptid (ii) gekoppelt ist.
Bei erfindungsgemäß bevorzugten keratinbindenden Effektormolekülen wird der Farbstoff oder der Reaktivfarbstoff über ein Linkermolekül (iii) gemäß der Formel 9 oder 10 an das keratinbindende Polypeptid gekoppelt.
Formel 9
Formel 10
wobei „n" einer ganzen Zahl zwischen 0 bis 40 entspricht. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der oben beschriebenen keratinbindenden Effektormoleküle in Haut-, Haarfärbemitteln oder dekorativer Kosmetik.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Haut-, Nagel- und/oder Haarfärbemittel, be- vorzugt Haarfärbemittel, enthaltend mindestens eines der oben beschriebenen erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormoleküle.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Färben von Haaren, Haut oder Nägeln mit keratinbindenden Effektormolekülen, enthaltend (a) mindestens ein keratinbindendes Polypeptid (ii) und (b) einem Farbstoff oder Reaktivfarbstoff (i).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, werden die oben definierten erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormoleküle eingesetzt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des oben genannten Verfahrens zum Färben von Haaren, Haut oder Nägel, handelt es sich um ein reversibles Verfahren, bei dem das keratinbindende Effektormolekül durch eine Behandlung mit (i) einem keratinbindenden Polypeptid, oder (ii) einer keratinhaltigen Lösung in einer Verdrän- gungsreaktion vom Haar-, Haut- oder dem Nagelkeratin verdrängt wird oder das keratinbindende Effektormolekül durch eine Lösung mit einem hohen Detergenzanteil (z.B. SDS) von Haut, Haar oder Nägel entfernt wird.
Definitionen
„Aminofunktionen", im Zusammenhang mit der Beschreibung „Aminofunktion tragendes Effektormolekül", meint Aminogruppen, die es ermöglichen, die besagten Aminofunktionen tragenden Moleküle über eine Amidbindung mit anderen Molekülen kovalent zu verknüpfen. „Aminofunktionen" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind auch solche, die sich chemisch in Aminofunktionen überführen lassen. Dabei verfügen die erfindungsgemäßen Effektormoleküle über mindestens eine Aminofunktion. Es können a- ber auch Effektormoleküle mit zwei, drei oder mehr Aminofunktionen und/oder sekundären Aminogruppen verwendet werden.
„Antikörper" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Eiweißstoffe, die der Mensch und die kiefertragenden Wirbeltiere zur Abwehr von Antigenen (Infektionserregern oder körperfremdem biologischem Material) produzieren. Sie sind zentraler Bestandteil des Immunsystems höherer Eukaryonten und werden von einer Klasse von weißen Blutkörperchen, den B-Zellen sezerniert. Sie kommen im Blut und in der extrazellulären Flüssigkeit der Gewebe vor. „Dekorative Kosmetik" meint kosmetische Hilfsmittel die nicht primär zur Pflege, sondern zur Verschönerung oder Verbesserung des Aussehens von Haut, Haar und/oder Finger- bzw. Fußnägeln angewendet werden. Derartige Hilfsmittel sind dem Fachmann einschlägig bekannt und umfassen z.B. Kajalstifte, Mascara, Lidschatten, getönte Ta- gescremes, Puder, Abdeckstifte, Rouge, Lippenstifte, Lippenkonturenstifte, Make-up, Nagellack, Glamour Gel usw. Insbesondere handelt es sich im Sinne der vorliegenden Erfindung um Mittel geeignet zum Färben von Haut, Nägel und/oder Haaren.
„Haarfärbemittel" sind Mittel oder Zubereitungen (i) Färben von Haaren. „Haarfärbemit- tel" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unterschieden in Direktfarben und echte Haarfarben. Bei Direktfarben genügen eine oder mehrere Haarwäschen um die Farbe wieder zu entfernen (Tönungen). Der Farbstoff ist nur oberflächlich an der Haarsubstanz angelagert, es findet keine chemische Reaktion statt. Für das Haar selbst ist der Vorgang unbedenklich. Die echten (permanenten) Haarfarben bedienen sich der Oxidationsfärbung (siehe auch „Stand der Technik"). Haarfärbemittel enthalten in einem kosmetisch verträglichen Medium geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe, welche dem Fachmann geläufig sind und Handbüchern der Kosmetik, beispielsweise Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3- 7785-1491-1 , oder Limbach, Kosmetik: Entwicklung, Herstellung und Anwendung kos- metischer Mittel, 2. erweiterte Auflage, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9, entnommen werden können.
„Effektormolekül" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint Moleküle, die eine bestimmte vorhersehbare Wirkung, bevorzugt eine farbverändernde und/oder pflegende Wirkung bzw. einen kosmetisch dekorativen Effekt auf Haut, Haar oder Nägel besitzen. Bevorzugt handelt es sich bei den Effektormolekülen um Farbstoffe, wie z.B. in den Tabellen 3, 5 und 6 abgebildet.
Keratin im Sinne der vorliegenden Erfindung meint aus seilförmigen Proteinkomplexen aufgebaute Intermediärfilamente. Intermediärfilamente sind aus vielen gleichartigen Proteinen (Monomeren) aufgebaut, die sich parallel zu einer röhrenförmigen Struktur zusammenlagern. Intermediärfilamente sind zu größeren Bündeln (Tonofibrillen) verbunden. Intermediärfilamente bilden mit den Mikrotubuli und Actinfilamenten das Cy- toskelett der Zelle. Man unterscheidet fünf Typen von Intermediärfilamenten: saure und basische Keratine, Desmine, Neurofilamente und Lamine. Speziell bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung sind die in den Epithelien (ein- oder mehrlagige Zellschichten, die alle äußeren Körperoberflächen der vielzelligen tierischen Organismen bedecken) vorkommenden sauren und basischen Keratine. „Keratin" oder "Keratine" (auch: Hornsubstanz, Skieroprotein) meint ein Eiweiß, das für Stabilität und Form der Zellen verantwortlich ist. Dieses Protein ist Bestandteil von Säugetierhaut, -haar und -nageln. Die Festigkeit von Keratin wird durch Faserbildung verstärkt: die einzelnen Aminosäureketten bilden eine rechtsgängige Alpha-Helix, je drei dieser Helices bilden eine linksgängige Superhelix (= Protofibrille). Elf Protofibrillen vereinigen sich zu einer Mikrofibril- Ie - diese vereinigen sich ihrerseits zu Bündeln und bilden Makrofibrillen aus, die z.B. die Zellen des Haares umgeben.
„Keratinbindendes Polypeptid" meint ein Polypeptid oder ein Protein, welches die Eigenschaft besitzt an Keratin zu binden. Somit sind keratinbindende Polypeptide auch Intermediärfilament-assoziierte Proteine . Diese keratinbindenden Polypeptide haben eine Bindungsaffinität gegenüber dem Keratin bzw. den aus Keratin bestehenden Mak- rostrukturen wie Protofibrillen, Mikrofibrillen oder Makrofibrillen. Ferner sind unter keratinbindende Polypeptide solche Polypeptide zu verstehen, die eine Bindungsaffinität zu Haut, Haar und/oder Finger- bzw. Fußnägel von Säugetieren besitzen.
„Keratinbindende Polypeptide" sind ferner Polypeptide, die innerhalb eines Säugetier- Organismus eine mit der Bindung von Keratin, Keratinfasern, Haut oder Haar verbundene biologische Funktion besitzen, keratinbindende Polypeptide meint ebenfalls die für die eigentliche Bindung an das Keratin, die Keratinfasern, Haut, Haar oder Nägel notwendigen Bindungsmotive oder Proteindomänen. Die Bindung des keratinbindenden Polypeptids (ii) an Keratin, kann unter den in Beispiel 8, 9 und 10 beschriebenen Bedingungen getestet werden. Keratinbindende Polypeptide sind solche Polypeptide, die in den oben genannten quantitativen Keratinbindungstests ca. 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, bevorzugt 50%, 60%, 70%, 80% oder 90%, besonders bevorzugt 100%, 125%, 150%, ganz besonders bevorzugt 200%, 300% oder 400%, am meisten bevorzugt 500%, 600%, 700% oder 1000% oder mehr der Keratinbindungskapazität des Desmoplakin (SEQ ID No.: 2), bevorzugt der Keratin-Bindedomäne B des Des- moplakin (SEQ ID No.: 4), aufweisen.
„Kopplung", im Zusammenhang mit der Bindung eines Linkermoleküls an ein Effektormolekül oder keratinbindendes Protein, meint eine kovalente Verknüpfung der genann- ten Moleküle.
„Kosmetisch verträgliches Medium" ist breit zu verstehen und meint für die Herstellung von kosmetischen oder dermokosmetischen Zubereitungen geeignete Substanzen und Mischungen derselben. Bevorzugt handelt es sich um Protein verträgliche Medien.
„Kosmetisch verträgliche Substanzen" führen bei Kontakt mit menschlichem bzw. tierischen Hautgewebe oder Haaren zu keinen Irritationen oder Schäden und weisen keine Inkompatibilitäten mit anderen Substanzen auf. Ferner verfügen diese Substanzen über ein geringes allergenes Potential und sind von staatlichen Zulassungsbehörden für die Verwendung in kosmetische Zubereitungen zugelassen. Diese Substanzen sind dem Fachmann geläufig und können z.B. Handbüchern der Kosmetik, beispielsweise Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1 , entnommen werden.
„Nukleinsäure" oder „Nukleinsäuremolekül" meint Desoxyribonukleotide, Ribonukleoti- de oder Polymere oder Hybride derselben, in einzel- oder doppelsträngiger Form, in Sense- oder Antisenseorientierung. Der Begriff Nukleinsäure oder Nukleinsäuremolekül kann verwendet werden um ein Gen, DNA, cDNA, mRNA, Oligonukleotid oder Polynukleotid zu beschreiben. „Nukleinsäuresequenz" meint eine aufeinanderfolgende und miteinander verknüpfte Abfolge von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden eines Nukleinsäuremoleküls gemäß der oben gegebenen Definition, wie sie durch Verwendung von verfügbaren DNA/RNA Sequenzierungstechniken ermittelt, und in Form einer Liste von Abkürzungen, Buchstaben oder Wörtern, welche Nukleotide repräsentieren, abgebildet oder dargestellt werden kann.
„Polypeptid" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint ein aus Aminosäuremolekülen aufgebautes Makromolekül, indem die Aminosäuren in linearer Folge über Peptidbin- düngen miteinander verknüpft sind. Ein Polypeptid kann aus wenigen Aminosäuren (ca. 10 bis 100) aufgebaut sein, umfasst aber auch Proteine. Proteine sind in der Regel aus mindestens 100 Aminosäuren aufgebaut, können aber auch mehrere tausend A- minosäuren umfassen. Bevorzugt umfassen Polypeptide mindestens 20, 30, 40 oder 50, besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90, ganz besonders bevorzugt mindestens 100, 125, 150, 175 oder 200, am meisten bevorzugt mindestens über 200 Aminosäuren, wobei die Obergrenze bei mehreren tausend Aminosäuren liegen kann.
Unter „Homologie" oder „Identität" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die I- dentität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatch: 0
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2,003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Polypeptidbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Ηybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint je nach Anwendung stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisie- rungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. Der Fachmann würde Hybridisierungsbedingungen auswählen, die es ihm ermöglichen, spezifische von unspezifischen Hybridisierungen zu unterscheiden. Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein, aus Bedingungen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 5O0C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 5O0C bevorzugt bei 650C) (2OX SSC: 0,3M Natriumeitrat, 3M NaCI, pH 7.0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Be- dingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 220C, bis zu stärker stringenten Bedingungen, ungefähr 650C, angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig oder auch einzeln variiert werden, wobei der jeweils andere Parameter konstant gehalten wird. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
1. Hybridisierungsbedingungen können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingun- gen ausgewählt sein: a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C, d) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, Lachssperma-DNA bei 68°C, e) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma- DNA, 50 % Formamid bei 42°C. f) 50 % Formamid, 4XSSC bei 42°C, oder g) 50 % (vol/vol) Formamid, 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinyl pyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCI, 75 mM
Natriumeitrate bei 42°C, oder h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente
Bedingung).
500 mN Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 7 % SDS (g/V), 1 mM EDTA, 10 μg/ml Single stranded DNA, 0,5% BSA (g/V) (Church und Gilbert, Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.81 :1991. 1984)
2. Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein: a) 0,015 M NaCI/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % SDS bei 500C. b) 0.1X SSC bei 65°C. c) 0,1 X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C. d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C. e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C. f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).
In einer Ausführungsform werden die stringenten Hybridisierungsbedingungen wie folgt gewählt:
Es wird ein Hybridisierungspuffer gewählt der Formamid, NaCI und PEG 6000 enthält. Die Anwesenheit von Formamid im Hybridisierungspuffer destabilisiert Doppelstrang Nukleinsäuremoleküle, wodurch die Hybridisierungstemperatur auf 42°C gesenkt werden kann, ohne dadurch die Stringenz zu erniedrigen. Die Verwendung von Salz im Hybridisierungspuffer erhöht die Renaturierungsrate einer Duplex, bzw. die Hybridisie- rungseffizienz. Obwohl PEG die Viskosität der Lösung erhöht, was einen negativen Einfluß auf Renaturierungsraten besitzt, wird durch die Anwesenheit des Polymers in der Lösung die Konzentration der Sonde im verbleibenden Medium erhöht, was die Hybridisierungsrate steigert. Die Zusammensetzung des Puffers ist wie folgt:
Hybridisierungspuffer
250 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7,2
1 mM EDTA
7 % SDS (g/v)
250 mM NaCI
10 μg/ml ssDNA
5 % Polyethylenglykol (PEG) 6000
40 % Formamid Tabelle 1 : Hybridisierungspuffer Die Hybridisierungen werden bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Filter werden am nächsten Morgen 3x mit 2xSSC + 0,1 % SDS für jeweils ca. 10 min. gewaschen. „Hydroxyfunktion", im Zusammenhang mit der Beschreibung „Hydroxyfunktion tragendes Effektormolekül", meint freie OH-Gruppen bzw. Hydroxylgruppen, die es ermöglichen, diese OH- Gruppen tragenden Moleküle über eine Veresterungsreaktion mit anderen Molekülen kovalent zu verknüpfen. „Hydroxyfunktionen" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind auch solche, die sich chemisch in OH-Funktionen überführen las- sen (z.B. Derivate wie Methoxy, Ethoxy). Dabei verfügen die erfindungsgemäßen Effektormoleküle über mindestens eine Hydroxylgruppe. Es können aber auch Effektormoleküle mit zwei, drei oder mehr Hydroxyfunktionen verwendet werden.
„Kopplungsfunktionalitäten" sind funktionelle Gruppen eines Linkermoleküls, welche mit funktionellen Gruppen des Effektormoleküls oder des keratinbindenden Proteins eine kovalente Bindung eingehen können. Beispielhaft, aber nicht einschränkend seinen genannt: Hydroxygruppen, Carboxylgruppen, Thiogruppen und Aminogruppen. „Kopplungsfunktionalitäten" oder „Kopplungsfunktionalität" und „Ankergruppen" oder „Ankergruppe" werden synonym verwendet.
„Reaktivfarbstoff" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint Farbstoffe enthaltend mindestens einen Reaktivanker, welcher über eine kovalente Bindung an ein keratin- bindendes Polypeptid gekoppelt werden kann.
„Reaktivanker" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint chemisch funktionelle Gruppen oder Reste, mittels derer eine kovalente Bindung zwischen einem Kohlenstoffoder Phosphoratom des Reaktivfarbstoffmoleküls und einem Sauerstoff-, Stickstoffoder Schwefelatom einer Hydroxy-, Amino- oder Thiolgruppe eines anderen Moleküls realisiert wird.
Unter einer „unter alkalischen Bedingungen abspaltbaren Gruppe Q" versteht man
Reste, die unter alkalischen Bedingungen, d.h. bei pH-Werten von 7 oder darüber, bevorzugt 7,5 oder darüber, unter Eliminierung und Ausbildung einer Vinylsulfongruppe abgespalten werden. Beispiele für derartige Gruppen sind Halogen, z.B. Chlor, Brom oder Jod, weiterhin -0-SO3H, -S-SO3H, Dialkylamino, quartäres Ammoniumreste wie Tri-Ci-C4-alkylammonium, Benzyldi-Ci-C4-alkylammonium oder N-gebundenes Pyridi- nium, sowie Reste der Formeln R3S(O)2-, R4S(O)2-O-, R5C(O)-O-. Hierin stehen R3, R4 und R5 unabhängig voneinander für Alkyl, Halogenalkyl oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl, wobei R5 auch Wasserstoff bedeuten kann. Bevorzugt steht Q für eine Gruppe -0-(CO)CH3 und insbesondere für -0-SO3H.
„Reversible Färbung" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint eine durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erreichte Änderung der Farbe von Haut-, Haar- oder Nagelkeratin, welche rückgängig gemacht werden kann. „Rückübersetzung" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint die Übersetzung einer Proteinsequenz in eine für dieses Protein kodierende Nukleinsäuresequenz. Somit handelt es sich bei der Rückübersetzung um einen Prozess der Dekodierung einer Aminosäuresequenz in die dazu korrespondierende Nukleinsäuresequenz. Übliche Methoden basieren auf Codon Verwendungstabellen individueller Arten, welche durch computergestützte Sequenzvergleiche erzeugt werden. Unter Verwendung der Codon Verwendungstabellen können die für eine bestimmte Art am häufigsten für eine bestimmte Aminosäure verwendeten Codons ermittelt werden. Proteinrückübersetzung kann unter Verwendung von dem Fachmann bekannten und für diesen Zweck speziell erzeugter Computeralgorithmen durchgeführt werden (Andres Moreira and Alejandro Maass. TIP: protein backtranslation aided by genetic algorithms. Bioinformatics, Volume 20, Number 13 Pp. 2148-2149 (2004); G Pesole, M Attimonelli, and S Liuni. A backtranslation method based on codon usage strategy. Nucleic Acids Res. 1988 March 1 1 ; 16(5 Pt A): 1715-1728.).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind keratinbindende Effektormoleküle, enthaltend (a) mindestens einen Reaktivfarbstoff (i) und (b) mindestens ein keratinbindendes Polypeptid (ii).
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die genanten keratinbindenden Effektormoleküle zumindest ein keratinbindendes Polypeptid (ii) welches eine Bindungsaffinität zu menschlichen Haut-, Haar- oder Nagelkeratin aufweist. Erfindungsgemäß ge- eignete keratinbindende Polypeptiddomänen sind z.B. in den Polypeptidsequenzen von Desmoplakinen, Plakophilinen, Plakoglobinen, Plectinen, Periplakinen, Envoplakinen, Trichohyalinen, Epiplakinen oder Haarfolikelproteinen vorhanden.
Vorzugsweise umfasst das unter (b) genannte keratinbindende Polypeptid (ii)
(c) mindestens ein Polypeptid mit einer der in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 dargestellten Sequenzen, oder
(d) ein Polypeptid, welches mindestens zu 40% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106,
108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 und in der Lage ist Keratin zu binden.
Vorzugsweise enthalten die genannten keratinbindenden Effektormoleküle zumindest ein keratinbindendes Polypeptid (ii), welches von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40,
42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 gezeigte Sequenz;
d) b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139,
145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 oder 169 umfasst;
c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid gemäß der Sequenzen SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,
86, 88, 90, 92, 94, 96, 98100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 kodiert;
j) Nukleinsäuremolekül, mit einer Nukleinsäuresequenz entsprechend wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 oder
169 oder ein davon durch Substitution, Deletion oder Insertion abgeleitetes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches mindestens zu 40% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,
86, 88, 90, 92, 94, 96, 98100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 und in der Lage ist an Keratin zu binden;
k) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem mo- noklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid, welches durch die
Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird;
I) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein keratinbindendes Protein, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert;
m) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein keratinbindendes Protein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridi- sierungsbedingungen isoliert werden kann, und
n) Nukleinsäuremolekül, welches durch Rückübersetzung einer der in den Sequenzen SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,
74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 gezeigten Aminosäuresequenzen erzeugt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die genannten keratinbindenden Effektormoleküle Desmoplakine oder deren Teilfragmente gemäß der Sequenzen SEQ ID No.: 2, 42, 44, 46, 48, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164 oder 166, und/oder Plakophilline oder deren Teilsequenzen gemäß der Sequenzen SEQ ID No.: 18, 20, 26, 28, 32, 34, 36, 168, 170 und/oder Plakoglobine oder deren Teilsequenzen gemäß der Sequenzen mit der SEQ ID No.: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, und/oder das Periplakin gemäß der Sequenz mit der SEQ ID No.: 86, und/oder Envoplakine oder deren Teilsequenzen gemäß der Sequenzen mit der SEQ ID No.: 90, 92, 94, 96, 98, 102, 104, 105 und/oder die Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 138 und 140 als keratinbindende Polypeptide. Bevorzugte keratinbinden- de Domänen sind die in den Sequenzen SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 abgebildeten Desmoplakin Polypeptide, sowie deren funktionelle Äquivalente. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden im erfindungsgemäßen Verfahren die in den Sequenzen SEQ ID No.: 156, 157, 158, 160, 162, 164, 168 und/oder 170 abgebildeten keratinbindenden Polypeptide eingesetzt. In einer am allermeisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das in der Sequenz SEQ ID No.: 168 gezeigte keratinbindende Protein verwendet. Dabei versteht es sich, dass dieses Protein sowohl mit als auch ohne den in der SEQ ID No.: 168 vorhandenen Histidinanker verwendet werden kann. So kann der Histidinanker (oder eine analog zu verwendendes Aufreinigungs-/Detektiossystem) auch C-terminal vorhanden sein. In der praktischen Anwendung der genannten keratinbindenden Proteine (z.B in kosmeti- sehen Zubereitungen) ist ein Histidinanker (oder eine analog zu verwendendes Aufrei- nigungs-/Detektiossystem) nicht notwendig. Somit ist die Verwendung der genannten Proteine ohne zusätzliche Aminosäuresequenzen bevorzugt
Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret of- fenbarten keratinbindenden Polypeptide (ii) und die Verwendung dieser in den erfindungsgemäßen Verfahren.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten keratinbindenden Polypeptide (ii) sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypep- tide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Keratinbindung, besitzen. So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" von keratinbindenden Polypeptiden solche Polypeptide, die unter ansonsten vergleichbaren Bedingungen, in den in den Beispielen beschriebenen quantitativen Keratinbin- dungstests ca.10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, bevorzugt 60%, 70%, 80% oder 90%, besonders bevorzugt 100%, 125%, 150%, ganz besonders bevorzugt 200%, 300% oder 400%, am meisten bevorzugt 500%, 600%, 700% oder 1000% oder mehr der Keratinbindungskapazität der unter den SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 114, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170, bevorzugt in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 44, 46, 48, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170, besonders bevorzugt 166 und 168, am meisten bevorzugt 168 dargestellten Polypeptide aufweisen.
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Muteine, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquiva- lente" umfassen somit die durch eine Mutation erhältlichen Muteine, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einem Mutein mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen.
„Mutation" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint die Veränderung der Nukleinsäu- reabfolge einer Genvariante in einem Plasmid oder im Genom eines Organismus. Mutationen können z.B. als Folge von Fehlern bei der Replikation entstehen oder durch Mutagene hervorgerufen werden. Die Rate der Spontanmutationen im Zellgenom von Organismen ist sehr gering, allerdings sind dem kundigen Fachmann eine Vielzahl von biologischen, chemischen oder physikalischen Mutagenen bekannt.
Mutationen umfassen Substitutionen, Insertionen, Deletionen eines oder mehrerer Nukleinsäurereste. Unter Substitutionen versteht man den Austausch von einzelnen Nukleinsäurebasen, dabei unterscheidet man zwischen Transitionen (Substitution einer Purin- gegen eine Purinbase bzw. einer Pyrimidin- gegen eine Pyrimidinbase) und Transversionen (Substitution einer Purin- gegen eine Pyrimidinbase (oder umgekehrt).
Unter Additionen bzw. Insertion versteht man den Einbau von zusätzlichen Nukleinsäu- reresten in die DNA, wobei es zu Verschiebungen des Leserahmens kommen kann. Bei derartigen Leserahmenverschiebungen unterscheidet man zwischen „in frame" Insertionen/Additionen und „out of frame" Insertionen. Bei den „in-frame" Insertio- nen/Additionen bleibt der Leserahmen erhalten und ein um die Anzahl der von den inserierten Nukleinsäuren kodierten Aminosäuren vergrößertes Polypeptid entsteht. Bei „out of frame" Insertionen/Additionen geht der ursprüngliche Leserahmen verloren und die Bildung eines vollständigen und funktionstüchtigen Polypeptids ist nicht mehr möglich.
Deletionen beschreiben den Verlust von einem oder mehreren Basenpaaren, die ebenfalls zu „in frame" oder „out of frame" Verschiebungen des Leserahmens und den damit verbundenen Folgen bezüglich der Bildung eines intakten Proteins führen.
Die zur Erzeugung von zufälligen oder gezielten Mutationen verwendbaren mutagenen Agenzien (Mutagene) und die anwendbaren Methoden und Techniken sind dem Fachmann bekannt. Derartige Methoden und Mutagene sind z.B. beschrieben bei A.M. van Harten [(1998), "Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK], E Friedberg, G Walker, W Siede [(1995), „DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing], oder K. Sankaranarayanan, J. M. Gentile, L. R. Ferguson [(2000) „Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences].
Für die Einführung von gezielten Mutationen können geläufige molekularbiologische Methoden und Verfahren wie z.B der in vitro Mutagenese Kit „LA PCR in vitro Mutage- nesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto), QuikChange® Kit der Firma Stratagene oder PCR Mutagenesen unter Verwendung geeigneter Primer angewendet werden.
Wie bereits oben aufgeführt, gibt es eine Vielzahl von chemischen, physikalischen und biologischen Mutagenen.
Die im folgenden aufgeführten Mutagene sind beispielhaft, aber nicht einschränkend genannt. Chemische Mutagene können gemäß ihres Wirkmechanismus unterteilt werden. So gibt es Basenanaloga (z.B.5-bromouracil, 2-amino purin), mono- und bifunktionale alkylierende Agenzien (z.B. monofunktionale wie Ethylmethylsulfonat, Dimethylsulfat, oder bifunktionale wie Dichloroethylsulfit, Mitomycin, Nitrosoguanidine - Dialkylnitro- samine, N-Nitrosoguanidin Derivate) oder interkalierende Substanzen (z.B. Acridine, Ethidiumbromid).
Somit können beispielsweise auch solche Polypeptide in den erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormolekülen vorhanden sein, welche man in Folge einer Mutation eines erfindungsgemäßen Polypeptides z.B. gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164,166, 168 und/oder 170 erhält.
Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entnehmen:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa Ser
Arg Lys
As n GIn; His
Asp GIu
Cys Ser oder AIa
GIn As n
GIu Asp
GIy Pro
His Asn; GIn
Me Leu; VaI
Leu Me; VaI
Lys Arg; GIn; GIu
Met Leu; Me
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
VaI Me; Leu
Tabelle 2: geeignete Aminosäuresubstitutionen
Bekannt ist, dass in SEQ ID NO: 2 das an Position 2849 natürlich vorliegende Serin z.B. gegen Glycin ausgetauscht werden kann, um eine Phosphorylierung an dieser Position zu umgehen (Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May; 14(5): 1978-92. Epub 2003 Jan 26).
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne gewünschte biologische Aktivität.
Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Ei- sen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethylamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide, welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten (Allele) derselben. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleiche Bereiche homologer Sequenzregionen bzw. konservierte Bereiche festlegen. Unter Verwendung dieser Se- quenzen können DNA Datenbanken (z.B. genomische oder cDNA-Datenbanken) unter Anwendung bioinformatischer Vergleichsprogramme nach äquivalenten Enzymen durchmustert werden. Geeignete Computerprogramme und öffentlich zugängliche Datenbanken sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Diese alignments bekannter Proteinsequenzen können beispielsweise mit einem Com- puterprogramm wie Vector NTI 8 (Version vom 25. September 2002) der Firma Infor- Max Inc. durchgeführt werden.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitige wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, besonders bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% oder 96% Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet unter Verwendung der in den Definitionen offenbarten Computerprogrammen und Computeralgorithmen.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Im Falle einer möglichen Proteinphosphorylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in dephosphorylierter bzw. phosphorylierter Form sowie durch Veränderung des Phosphorylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Homologe der erfindungsgemäßen Polypeptide können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleo- tidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausge- wählten Eigenschaft bekannt. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivi- tat die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331). Auch die Durchmusterung von physikalisch verfügbaren cDNA- oder genomischen- DNA Bibliotheken anderer Organismen unter Verwendung der unter SEQ ID No.: 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51, 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 und/oder 169, besonders bevorzugt 165 und 167, am meisten bevorzugt 167 beschriebenen Nukleinsäurese- quenzen -oder Teilen derselben- als Sonden, ist ein dem Fachmann geläufiges Verfahren um Homologe in anderen Arten zu identifizieren. Dabei haben die von der Nuklein- säuresequenz gemäß SEQ ID No.: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, , 165, 167 und/oder 169, besonders bevorzugt 165 und 167, am meisten bevorzugt 167 abgeleiteten Sonden eine Länge von mindestens 20 bp, bevorzugt mindestens 50 bp, besonders bevorzugt mindestens 100 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 bp, am meisten bevorzugt mindestens 400 bp. Die Sonde kann auch eine oder mehre- re Kilobasen lang sein, z.B.1 Kb, 1 ,5 Kb oder 3 Kb. Für die Durchmusterung der Bibliotheken kann auch ein zu den unter SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 165, 167 und/oder 169, besonders bevorzugt 165 und 167, am meisten bevorzugt 167 beschriebenen Sequenzen komplementärer DNA-Strang, oder ein Fragment desselben, mit einer Länge zwischen 20 Bp und mehreren Kilobasen eingesetzt werden. Die zu verwendenden Hybridisierungsbedingungen sind oben beschrieben.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch solche DNA Moleküle verwendet werden, die unter Standardbedingungen mit den durch SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 165, 167 und/oder 169, besonders bevorzugt 165 und 167, am meisten bevorzugt 167 beschriebenen und für keratinbindende Polypeptide kodierenden Nukleinsäuremoleküle, der zu diesen komplementären Nukleinsäuremo- lekülen oder Teilen der vorgenannten, hybridisieren und als vollständige Sequenzen für Polypeptide kodieren, die über die gleichen Eigenschaften wie die unter SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 beschriebenen Polypeptide verfügen.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthalten die keratinbin- denden Effektormoleküle als keratinbindende Polypeptide (ii) solche Polypeptide, die mindestens eine der Polypeptidsequenzen wie gezeigt in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 umfassen, mit der Maßgabe, dass die Keratinbindung der genannten Polypeptide mindestens 10 %, 20%, 30%, 40% oder 50%, bevorzugt 60%, 70%, 80% oder 90%, besonders bevorzugt 100% des Wertes beträgt, den die entsprechenden Polypeptidsequenzen wie gezeigt in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 aufweisen, gemessen in dem Test gemäß Beispiel 9 oder 10.
Bevorzugt werden keratinbindende Polypeptide (ii) verwendet, die für den gewünschten Organismus eine hochspezifische Affinität besitzen. Für Anwendungen zur humanen Haarfärbung werden demzufolge solche keratinbindenden Polypeptide (ii) bevorzugt eingesetzt, die zu humanem Haar-Keratin eine besonders hohe Affinität haben.
Es können aber auch mehr als ein keratinbindendes Polypeptid (ii) mit dem erfindungsgemäßen Effektormolekül (i) gekoppelt verwendet werden, beispielsweise kann ein keratinbindendes Polypeptid (ii), welches eine hohe Bindungsaffinität zu humanem Hautkeratin besitzt, in Verbindung mit einem anderen keratinbindenden Polypeptid (ii), welches eine hohe Affinität zu humanem Haarkeratin besitzt, mit einem Effektormolekül kombiniert werden. Es können auch chimäre Polypeptide verwendet werden, die mehrere Kopien der gleichen (oder auch verschiedene) keratinbindenden Polypeptide (ii) oder deren keratinbindenden Domänen enthalten. Somit könnte beispielsweise eine besonders effektive Keratinbindung erzielt werden.
Geeignete keratinbindende Polypeptide (ii) sind bekannt. Beispielsweise enthalten Desmoplakine und Plectine keratinbindende Domänen (Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May; 14(5): 1978-92. Epub 2003 Jan 26; Hopkinson SB, Jones JC, The N terminus of the transmembrane protein BP180 interacts with the N-terminal domain of BP230, thereby mediating keratin cytoskeleton anchorage to the cell surface at the site of the hemidesmosome, Mol Biol Cell. 2000 Jan;1 1 (1 ):277-86).
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormoleküle in der Haarkosmetik, bevorzugt der Haarfärbung eingesetzt. Sie erlauben eine hohe Konzentration und lange Wirkdauer von pflegenden, schützenden oder farbverändernden Effektormolekülen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden keratinbindende Polypeptide verwendet, die eine Bindungsaffinität zu menschlichen Haut-, Haar- oder Nagelkeratin besitzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die genannten keratinbindenden Effektormoleküle zumindest einen Reaktivfarbstoff (ii), der über wenigstens einen Reaktivanker verfügt, ausgewählt aus der Gruppe beste- hend aus
(a) einer unter alkalischen Bedingungen aktivierbaren Gruppe der Formel 1 ,
Formel 1
worin die Bindung zum Farbstoffmolekül (F) bedeutet, X für einen elektronenziehenden Rest oder für ein Alkyl-, -O-Alkyl-, Cyano-, Hydro- xy-, Halogen-Rest oder H steht, k für 1 , 2 oder 3 steht, n 0 oder 1 bedeutet, und
B für eine Gruppe -CH=CH2 oder eine Gruppe -CH2-CH2-Q oder -NH-CH2-CH2-Q oder -NH-CH=CH2 steht, worin Q eine unter alkalischen Bedingungen abspaltbare Gruppe steht, und
(b) ein Acrylamido Anker der Formel 2,
Formel 2 worin
— die Bindung zum Farbstoffmolekül (F) bedeutet, und (c) einer der Verbindungen gemäß der Formeln 3, 4 oder 5, Formel 3
Formel 4
Formel 5
worin die Bindung zum Farbstoffmolekül (F) bedeutet
V Fluor oder Chlor bedeutet;
Ui, U2 unabhängig voneinander Fluor, Chlor oder Wasserstoff sind; und
Qi, Q2 unabhängig voneinander Chlor, Fluor, Cyanamido, Hydroxy, (C 1 -Ce)-Al koxy, Phenoxy, Sulfophenoxy, Mercapto, (Ci-C6)-Alkylmercapto, Pyridino, Carboxypyridino,
Carbamoylpyridino, oder eine Gruppe der allgemeinen Formel (6) oder (7) bedeuten,
R2
/
Formel 6 \ Xw-so2z
R3
Formel 7 — N
\4 worin R2 Wasserstoff oder (Ci-C6)-Alkyl, Sulfo-(Ci-C6)-Alkyl, oder Phenyl ist, das un- substituiert oder durch (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Sulfo, Halogen, Carboxy, Aceta- mido, Ureido substituiert ist;R3 und R4 haben unabhängig voneinander eine der Bedeutungen von R2, oder sind eine Gruppe der allgemeinen Formel (8),
Formel 8
oder bilden ein cyclisches Ringsystem der Formel -(CHb)J- wobei j 4 oder 5 bedeutet, oder alternativ -(CH2)2-E-(CH2)2-, wobei E Sauerstoff, Schwefel, Sulfo, -NR5- mit R5'=(Ci-C6)-Alkyl ist; W ist Phenylen, das unsubstituiert oder substituiert ist durch 1 oder 2 Substituenten, wie (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Carboxy, Sulfo, Chlor, Brom, oder ist (Ci-C4)-Alkylen- Arylen oder (C2-C6)-Alkylen, das unterbrochen sein kann durch Sauerstoff, Schwefel, Sulfo, Amino, Carbonyl, Carbonamido, oder ist Phenylen-CONH-Phenylen, das unsub- stituiert oder durch (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Hydroxy, Sulfo, Carboxy, Amido, U- reido oder Halogen substituiert ist, oder ist Naphthylen, das unsubstituiert oder durch eine oder zwei Sulfogruppen substituiert ist; und
Z für eine Gruppe CH=CH2 oder eine Gruppe CH2-CH2-Q oder -NH-CH2-CH2-Q oder - NH-CH=CH2 steht, worin Q eine unter alkalischen Bedingungen abspaltbare Gruppe steht;
R24, R25 und R26 sind (Ci-C4)-Alkyl oder (Ci-C4)-Hydroxyalkyl;
B- ist das Äquivalent eines Anions, wie Hydrogensulfat, Sulfat, Fluorid, Chlorid, Bromid,
Dihydrogenphosphat, Hydrogenphosphat, Phosphat, Hydroxid oder Acetat;
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein keratinbindendes Effektormolekül, welches als Effektormolekül zumindest einen Reaktivfarbstoff (ii) enthält, der wenigstens eine unter alkalischen Bedingungen aktivierbare Gruppe der Formel 1
Formel 1
aufweist, worin
— die Bindung zum Rest des Farbstoffmoleküls (F) darstellt; X für einen elektronenziehenden Rest steht, k für 1 , 2 oder 3 steht, n 0 oder 1 bedeutet, und B für eine Gruppe CH=CH2 oder eine Gruppe CH2-CH2-Q oder -NH-CH2-CH2-Q oder -NH-CH=CH2 steht, worin Q eine unter alkalischen Bedingungen abspaltbare Gruppe steht,
Hier und im Folgenden steht der Ausdruck Alkyl in der Regel für einen linearen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 und vorzugsweise mit 1 bis 4 C-Atomen (C-i-Cβ- bzw. Ci-C4-Alkyl) wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl und dergleichen. Haloge- nalkyl steht für Alkyl, wie vorstehend definiert, worin die Wasserstoffatome teilweise oder vollständig durch Halogenatome, insbesondere durch Fluoratome ersetzt sind, wie in Trifluormethyl, Trichlormethyl, Pentafluorethyl, und dergleichen. Alkoxy steht für einen über ein Sauerstoffatom gebundenen Alkylrest, wie vorstehend definiert. Gegebenenfalls substituiertes Phenyl bedeutet, dass der Phenylrest einen oder mehrere, z.B. 1 , 2, 3 oder 4 Substituenten aufweisen kann, die beispielsweise ausgewählt sind unter Halogen, Alkyl, Alkoxy, Nitro, Cyano, COOH, SO3H und dergleichen. Halogen steht insbesondere für Fluor, Chlor oder Brom.
Elektronenziehende Reste X sind solche, die einen -M- und/oder einen -I-Effekt auf den aromatischen Rest, an den sie gebunden sind, ausüben. Hierzu zählen beispiels- weise Fluor oder Chlor, CN, NO2 sowie Gruppen der Formeln -C(O)-R1 und S(O)2R2, worin R1 und R2 unabhängig voneinander für OH, Alkyl, Halogenalkyl, Alkoxy oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl stehen. Sofern der Formel 1 mehrere Gruppen aufweist (k >1 ), dann können die Gruppen X gleich oder verschieden sein.
Vorzugsweise steht wenigstens eine der Gruppen X für eine Hydroxysulfonyl-Gruppe (SO3H).
Die Variable k steht vorzugsweise für 1 oder 2, d.h. der Formel 1 weist ein oder zwei elektronenziehende Reste X auf. Vorzugsweise steht „n" in der Formel 1 für O, d.h. die Formel 1 ist vom Benzol abgeleitet. Sofern „n" für 1 steht, ist der Formel 1 von Naphthalin abgeleitet. In diesen Fällen kann sich die Gruppe SO2-B an dem gleichen Benzolkern wie die Gruppe X befinden.
Desweiteren betrifft die Erfindung keratinbindende Effektormoleküle, welche einen Re- aktivfarbstoff enthalten, welcher einen Reaktivanker gemäß Formel 1 enthält und worin B in Formel 1 für CH=CH2, eine Gruppe CH2-CH2-O-SO3H oder für CH2-CH2-CI steht.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die oben beschriebenen keratinbindenden Effektormoleküle, bei denen die unter alkalischen Bedingungen aktivierbaren Gruppe der For- mel 1 über eine Gruppe -NH-, -N=N-, -NH-C(O)-, -NH-SO2- oder -N(R)- an das Farbstoffmolekül gebunden ist, wobei R für Alkyl (wie oben definiert) steht. Zweckmäßigerweise weisen erfindungsgemäße keratinbindende Effektormoleküle 1 , 2 oder 3, vorzugsweise 1 oder 2 der vorgenannten Reaktivfarbstoffe auf. Die unter alkalischen Bedingungen aktivierbaren Gruppe gemäß Formel 1 kann (muss aber nicht) Bestandteil des Farbstoffchromophors sein.
In der Regel weist der Reaktivfarbstoff eine oder mehrere, z.B. 1 bis 10, insbesondere 2 bis 8, funktionelle Gruppen je Farbstoffmolekül auf, die dem Farbstoff Wasserlöslichkeit verleihen. Hierbei handelt es sich in der Regel um anionische bzw. saure funktio- nelle Gruppen, die im wässrigen Medium bei einem schwach sauren oder alkalischen pH-Wert, in der Regel bei pH-Werten oberhalb 4, unter Bildung anionischer Gruppen dissoziieren. Beispiele für derartige Gruppen sind Hydroxysulfonylgruppen (-SO3H), Carboxylgruppen (COOH) und Hydroxysulfonyloxygruppen (-0-SO3H) sowie die Anio- nen dieser Gruppen. Diese anionischen/sauren Gruppen können an eine Gruppe ge- maß Formel 1 und/oder an andere Teile des Farbstoffmoleküls gebunden sein. Sofern diese Gruppen im Farbstoff als anionische Gruppen vorliegen, versteht es sich von selber, dass der Farbstoff auch die zur Neutralisation erforderlichen Gegenionen um- fasst. Geeignete Gegenionen sind insbesondere Alkalimetallionen, speziell Natrium-, Kalium- und Lithium-Ionen sowie Ammoniumionen, z.B. Ammoniumionen, die sich von Mono-, Di- oder Triethanolamin ableiten.
Bei einem besonders bevorzugten Gegenstand der Erfindung handelt es sich um solche keratinbindenden Effektormoleküle, die Farbstoffe („F") ausgewählt aus der Gruppe von Farbstoffen der Phthalocyanin-Reihe, Antrachinon-Farbstoffen, Azofarbstoffen, Formazanfarbstoffen, Dioxazin-Farbstoffen, Actidin-Farbstoffen, Xanthen-Farbstoffen, Polymethin-Farbstoffen, Stilbenfarbstoffen, Schwefelfarbstoffen, Triarylmethanfarbstof- fen Benzopyranfarbstoffe, Dibenzanthronfarbstoffe und den Metallkomplexen dieser Farbstoffe enthalten.
Derartige Farbstoffe F sind zum Teil aus dem Stand der Technik bekannt, und können z.B. den Patentanmeldungen WO 94/18381 , EP-A 356 931 , EP-A 559 617, EP-A 201 868, DE-A 195 23 245, DE-A 197 31 166, EP 745 640, EP-A 889 098, EP-A 1 097 971 , EP-A 880 098 entnommen werden oder in Analogie zu bekannten Herstellungsverfahren für strukturell ähnliche Farbstoffe, wie sie z.B. aus den Dokumenten EP 602 562, EP-A 597 41 1 , EP-A 592 105 oder DE 43 196 74 bekannt sind, hergestellt werden.
Zur Herstellung der Reaktivfarbstoffe, enthaltend Reaktivanker gemäß der Formel 1 , wird man in der Regel eine Aminoverbindung der Formel 1 b mit einem Farbstoff- Vorprodukt, dass eine nucleophil verdrängbare Gruppe aufweist, in an sich bekannter Weise zur Reaktion bringen. Beispiele für nucleophil verdrängbare Gruppen sind Halogen, insbesondere Chlor oder Brom, das an einen Aromaten gebunden ist (wie in Ha- logentriazin-Resten) oder in Form einer Halogensulfonyl-Gruppe oder einer Halogen- carbonylgruppe vorliegt. Verfahren hierzu sind aus dem hier zitierten Stand der Technik bekannt und können in analoger Weise zur Herstellung der Farbstoffe F angewendet werden. Alternativ kann man die Aminoverbindung 1 b auch zunächst diazotieren und dann an ein entsprechendes Farbstoffvorprodukt koppeln. Das bei der Reaktion der Aminoverbindung 1 b bzw. ihres Diazoniumsalzes mit dem Farbstoff-Vorprodukt erhaltene Reaktionsprodukt, kann bereits der Farbstoff F sein oder seinerseits ein Vorprodukt für den Farbstoff F darstellen, das in Analogie zu bekannten Verfahren zum Farbstoff F weiterverarbeitet wird.
Formel 1 b
Die in der Formel 1 b gezeigten Reste entsprechen den in der Formel 1 gegebenen Definitionen. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass Farbstoffe herstellungsbedingt anorganische Salze und Stellmittel enthalten können. Der Anteil an derartigen Bestandtei- len, im Folgenden auch als nichtfarbige Bestandteile bezeichnet, wird in der Regel nicht mehr als 60 Gew.-% betragen und liegt häufig im Bereich von 10 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht von farbigen und nichtfarbigen Bestandteilen des Farbstoffs.
Die Chromophorsysteme der Farbstoffe (F) können unterschiedliche Strukturen aufweisen, unabhängig davon, ob es sich um reaktive oder nicht reaktive Farbstoffe handelt. Bei den im Folgenden dargestellten Chromophoren (1 bis 7) handelt es sich jeweils um für eine bestimmte Strukturklasse stellvertretend genannte Verbindung. Diese Auflistung ist nicht einschränkend zu verstehen. Dem Fachmann ist natürlich bewusst, dass prinzipiell alle diesen Substanzklassen angehörenden Farbstoffe, direkt als Reaktivfarbstoff oder über ein Linkermolekül, an ein keratinbindendes Polypeptid gebunden werden können. Die Farbstoffe können metallfreie Farbstoffe sein, aber auch Metallkomplexe, vorzugsweise Übergangsmetallkomplexe, insbesondere Komplexe der Ll- bergangsmetalle der Gruppen VI bis X des Periodensystems und hierunter insbesondere des Cu, Cr, Fe, Ni, Co und Mn. Das Molverhältnis von Übergangsmetall zu Farbstoffmolekül in diesen Metallkomplexen liegt üblicherweise im Bereich von 2:1 bis 1 :2. In der Regel erfolgt in diesen Farbstoffen die Komplexierung der Metallionen über deprotonierte Hydroxylgruppen, über Aminogruppen, Iminogruppen, Stickstoffatome, die in ein aromatischen π-Elektronensystem eingebunden sind, oder über Azogruppen.
1. Azofarbstoffe
Mono-, bis-, tris-, tetra- und Polyazofarbstoffe, je nachdem, wieviele Azobrücken ( -
N=N- ) die Farbstoffe enthalten. Die Bindung mit dem Reaktivanker bei 1 a, 1 b und 1 c ist selbstverständlich auch eine Azobrücke. a) Monoazo
b) Bisavo
c) Trisazo
2. Anthrachinon Farbstoffe
3. Triphendioxazinfarbstoffe
4. Phtalocyaninfarbstoffe
5. Benzopyranfarbstoffe
6. Dibenzanthronfarbstoffe
7. Formazanfarbstoffe
Erfindungsgemäß bevorzugt sind ferner keratinbindende Effektormoleküle, welche einen Reaktivfarbstoff (i) enthalten, welcher einen Reaktivanker umfaßt, der ausgewählt ist aus den nachfolgenden Resten (1-1 ) bis (1-43).
-~v ^- SO2-CH2-CH2-O-SO3H -/ V- SO2-CH2-CH2-CI -4 V- SO2-CH=CH2
(1-1 ) (1-2) (1-3)
V ^- S0,-CH,-CH,-0-S0,H <f V- S0,-CH,-CH,-CI <f ^SO0-CH=CH,
\=/
(1-4) (1-5) (1-6)
(1-10) (1-11 ) (1-12)
(1-16) (1-17) (1-18)
(1-22) (1-23) (1-24)
(1-25) (1-26) (1-27)
(1-28) (1-29) (1-30)
-J VsO2-NH-CH2-CH2-O-SO3H -- /~~Vsθ,-NH-CH,-CH,-CI -J x -SO2-NH-CH=CH2
(1-31 ) (1-32) (1-33)
CH3O- -SO,-NH-CH,-CH,-O-SO,H V SO2-NH-CH2-CH2-CI
(1-34) (1-35) (1-36) -
(1-41 ) (1-42) (1-43)
Besonders bevorzugte Reaktivfarbstoffe enthalten wenigstens einen Reaktivanker gemäß Formel 1 , wobei dieser Rest zumindest eine der in den Formeln (1 -1 ) bis (1-12) und (1-16), (1-17), bevorzugt (1-1 ), (1-3), (1-4), (1-6), (1-7), (1-9), (1-10), (1-12), (1-16), (1-17), am meisten bevorzugt (1-1 ), (1-4), (1-7), (1-10), (1-17) dargestellten Gruppen aufweist.
Bei der Umsetzung von Farbstoffen (F) mit einem keratinbindenden Polypeptid, sollten nahezu physiologische Bedingungen eingehalten werden, da das Polypeptid oder Pro- tein sich sonst entfaltet und es zu einer Prezipitation kommt. Das bedeutet im wesentlichen, dass keine reinen organischen Lösungsmittel verwendet werden können, sowie ein pH-Wert nahe dem Neutralpunkt gewählt werden sollte. Außerdem ist es wichtig, dass die Reaktionstemperaturen für die Kopplung 45° C nicht übersteigen. Theoretisch man kann demnach alle Reaktivfarbstoffe verwenden, die unter milden Bedingungen mit den SH Gruppen der keratinbindenden Polypeptide reagieren können. Unter milden Bedingungen versteht man Temperatur-, pH und Konzentrationsbereiche, bei denen das keratinbindende Polypeptid seine physikalischen und chemischen Eigenschaften behält bzw. nicht irreversibel verliert. Geeignete Reaktivfarbstoffe enthalten mindestens einen Reaktivanker, können aber auch zwei oder mehr Reaktivanker enthalten, wobei diese unterschiedlichen Reaktivankertypen entsprechen können.
Vinylsulfonanker enthaltende Farbstoffe (siehe Formel 1) werden in der Regel als Schwefelsäureester-Verbindungen hergestellt. Die Aktivierung (Eliminierung zur akti- ven Vinylsulfonform) der Schwefelsäureester-Verbindungen erfolgt in situ während der Färbung bei Textil- und Lederanwendungen, d.h. man braucht die Farbstoffe vor der Anwendung nicht zum Vinylsulfon voreliminieren. Die Farbstoffe können gegebenen- falls auch als Vinylsulfon zwischen isoliert werden und erst in einem späteren Zeitpunkt mit dem Substrat umgesetzt werden.
Dadurch, dass bei den erfindungsgemäßen keratinbindenden Polypeptiden bzw. der
Keratinbindedomäne (im folgenden auch als KBD bezeichnet) ein pH-Wert nahe dem Neutralpunkt gewählt wird, außerdem die Reaktionstemperatur für die Kopplung mit
Farbstoffen 45°C nicht übersteigen soll, müssen die Farbstoffe zur aktiven Vinylsulfon- form voreliminiert werden und danach erst mit z.B. einer KBD gekoppelt werden. Die
Umsetzung mit z.B. einer KBD kann direkt nach der Eliminierung in der gleichen Flotte
(ohne Zwischenisolierung des Farbstoffes in der Vinylsulfonform) erfolgen oder der Farbstoff kann auch zwischenisoliert werden.
Für die Aktivierung braucht man einen pH-Bereich von 5-14, insbesondere 7-12 und einen Temperaturbereich von 0-80°C, insbesondere 15-50°C, bevorzugt 25-45°C. Nach der Aktivierung wird einen pH-Bereich von pH 5-9, insbesondere 7-8, und einen Temperaturbereich von 20-50°C, insbesondere 25-45°C eingestellt, wobei der Farbstoff schnell (häufig innerhalb von Minuten) mit dem Substrat (in diesem Fall mit einem keratinbindenden Polypeptid/ KBD) reagiert. Die Aktivierung (Eliminierung) des Schwefelsäureesters zum Vinylsulfon läuft nach dem in Abbildung 1 dargestellten Schema ab.
Nach der Aktivierung (Eliminierung) läuft die in Abbildung 2 gezeigte Reaktion ab. Farbstoffe mit Acrylamido-Anker (Formel 2) können direkt, ohne Voreliminierung (Aktivierung) mit z.B. der KBD umgesetzt werden. Die Reaktionsbedingungen entsprechen den bei der Aktivierung der Vinylsulfonanker gewählten Bedingungen. In dem Fall kann sowohl Addition als auch Substitution erfolgen. (J.Soc.Dyers and Colourist, 1982, 98, 165-175) (Siehe Abbildung 3).
Farbstoffe mit einem heteroaromatischen Anker (Formeln 3, 4, 5) können direkt und ohne Voreliminierung (Aktivierung) mit z.B. der KBD umgesetzt werden (Abbildung 4). Die Reaktionsbedingungen entsprechen den bei den Vinylsulfonankern gewählten Be- dingungen. Die hier verwendeten Reaktivfarbstoffe können 0-20 Gew.-%, in der Regel 0- 10gew. %, häufig 0- 5 Gew.-% nicht reaktive Nebenkomponenten enthalten. Die Nebenkomponenten, die keinen Reaktivanker aufweisen, reagieren natürlich nicht mit den keratinbindenden Polypeptiden. Diese können während der Synthese oder des Färbeprozesses entfernt werden. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die mit dem Re- aktivfarbstoff umgesetzten keratinbindenden Polypeptide auf Haar appliziert werden und die nicht gebundenen Farbstoffanteile vom Haar heruntergewaschen werden. Desweiteren besteht die Möglichkeit, die mit dem Reaktivfarbstoff umgesetzten keratinbindenden Polypeptide durch z.B. Säulenchromatographie zu reinigen. Möglich ist auch die Reaktion zwischen keratinbindenden Polypeptiden und dem Reaktivfarbstoff in einer Art „Säulenreaktor" durchzuführen. Dabei könnten die keratinbindenden Polypeptide an eine Nickel-Affinitätssäule gekoppelt werden, der Farbstoff an die keratinbindenden Polypeptide gebunden und die unfixierten Farbstoffreste direkt herausge- waschen werden. Anschließend könnte man den keratinbindenden Polypeptid- Farbstoff (keratinbindendes Effektormolekül) von der Säule eluieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die keratinbindenden Effektormoleküle Farbstoffe, die sich für kosmetische Zwecke eignen und als solche zugelassen sind. Derartige Farbstoffe sind beispielsweise in der Publikation "Kosmetische Färbemittel" der Farbstoffkommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft, veröffentlicht im Verlag Chemie, Weinheim, 1984, bzw. in der dritten völlig überarbeiteten Auflage von 1991 zusammengestellt.
Weitere bei der Haarfärbung üblicherweise verwendete Farbstoffe, die in den erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormolekülen enthalten sein können, sind unter anderem in E. Sagarin, "Cosmetics, Science and Technology", Interscience Publishers Inc., New York (1957), Seiten 503 ff. sowie H. Janistyn, "Handbuch der Kosmetika und Riechstoffe", Band 3 (1 973), Seiten 388 ff. und K. Schrader „Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika", 2. Auflage (1989), Seiten 782-815 beschrieben.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind ferner keratinbindende Effektormoleküle, bei denen der Reaktivfarbstoff (i) indirekt über ein Linkermolekül an das keratinbindende Polypep- tid (ii) gekoppelt ist.
Die Herstellung eines solchen keratinbindenden Effektormoleküls kann erfolgen, durch Kopplung eines mindestens eine Hydroxy-, Amino- oder Carboxylfunktion tragenden Effektormoleküls (i) (z.B. ausgewählt aus den oben beschriebenen Reaktivfarbstoffen) an eines der oben beschriebenen keratinbindenden Polypeptide (ii) unter Verwendung eines Linkermoleküls, welches über mindestens zwei Kopplungsfunktionalitäten verfügt, und a) in einem ersten Kopplungsschritt zunächst das Effektormolekül (i) an das Linkermolekül (iii) gebunden wird, und b) in einem weiteren Kopplungsschritt das Reaktionsprodukt aus (a) über eine noch freie Kopplungsfunktionalität des Linkermoleküls (iii) an das keratinbindende Polypeptid (ii) gekoppelt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verfügt das Linkermo- lekül (iii) über mindestens zwei unterschiedliche Kopplungsfunktionalitäten, ganz besonders bevorzugt sind Linkermoleküle (iii), die über eine Maleinimidgruppe verfügen.
Besonders bevorzugt werden als Linkermoleküle (iii) carbonsäuregruppentragende Maleinimide gemäß der allgemeinen Formel 9 verwendet,
Formel 9
wobei „n" einer ganzen Zahl zwischen 0 bis 40 oder 0-20, bevorzugt zwischen 0 bis 15, besonders bevorzugt zwischen 0 und 10, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 9, oder zwischen 2 und 8, oder zwischen 3 und 7, am allermeisten bevorzugt 5 entspricht. Am allermeisten bevorzugt ist die Verwendung der Maleinimidocapronsäure. Ferner ist die Verwendung des Maleinimidocapronsäure-Chlorids ganz besonders bevorzugt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform verfügt das Linkermolekül (iii) über mindestens zwei unterschiedliche Kopplungsfunktionalitäten und zusätzlich über ein Modul, das die Hydrophilie erhöht. Dieses bevorzugte Linkermolekül ist in der Formel 9b abgebildet,
Formel 9b wobei „n" einer ganzen Zahl zwischen 0 bis 40 oder 0 bis 20, bevorzugt zwischen 0 bis 15, besonders bevorzugt zwischen 0 und 10, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 9, oder zwischen 2 und 8, oder zwischen 3 und 7 entspricht, und X den Resten O, S, N, CH2, -O-C=O, O=C-O-, -NR, -NR-C=O, O=C-NR- entspricht und R für H, C1-C12 verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, tert. Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, oder Cycloalkyl, Benzoyl, Benzyl, Cβ bis C10- Arylgruppen wie Phenyl und Naphtyl, Heteroaryl, bevorzugt H, Methyl und Ethyl steht, und das „Modul" einem Ethylenglykol- oder Polyethylenglykolrest mit 2 bis 40, bevorzugt 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 wiederholenden Einheiten, oder einer Aminosäure, bevorzugt ausgewählt aus Gruppe bestehend aus Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin und Cystein, oder einem Polypeptid mit 2 bis 40, bevorzugt 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 Aminosäuren, wobei es sich bei dem Aminosäuren vorzugsweise um polare Aminosäuren, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin und Cystein handelt, oder einem Polyacrylsäurerest mit 2-100, bevorzugt 2-80, besonders bevor- zugt 2-50, am meisten bevorzugt 2-20 Monomereinheiten entspricht, oder zur Erhöhung der Lipophilie das „Modul" einem Alkylrest mit 2-40 Kohlenstoffen oder Polyolefinrest mit 2 bis 40, bevorzugt 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 wiederholenden Einheiten, oder einer Aminosäure, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycin, VaNn, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Prolin, Methio- nin, oder einem Polypeptid mit 2 bis 40, bevorzugt 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 Aminosäuren, wobei es sich bei dem Aminosäuren vorzugsweise um unpolare Aminosäuren, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycin, VaNn, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Prolin, Methionin handelt, oder ei- nem Polyester, Polyamid oder Polyurethan mit 2-100, bevorzugt 2-80, besonders bevorzugt 2-50, am meisten bevorzugt 2-20 Monomereinheiten entspricht.
In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Linker- molekül um ein Molekül gemäß der allgemeinen Formel 9c,
Formel 9c wobei X in o-, m- oder p-Position für COOH oder R-COOH steht, und R einer C1-C12 linearen Alkylgruppe wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, tert. Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, oder einer cyclischen Alkylgruppe wie einem C5-Ci2-Cycloalkylrest, gegebenenfalls substituiert mit einer oder mehreren C1-C4- Alkylgruppen, oder einer o-, m- oder p- orientierten Aryl-, Benzyl- oder Benzoyleinheit, bevorzugt cyclohexyl, Phenyl und Naphtyl entspricht. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform kann R auch dem in Formel 1 b beschriebenen „Modul" entsprechen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die durch die allgemeine Formel 10 dargestellten Linkermoleküle (ii) verwendet,
Formel 10
wobei „n" einer ganzen Zahl zwischen 0 bis 20, bevorzugt zwischen 0 bis 15, beson- ders bevorzugt zwischen 1 und 10, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 8 entspricht und Y einer Hydroxy- oder Aminogruppe entspricht. Aminogruppen können primär oder sekundär sein. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Linkermolekül (iii) um ein Maleinimidoalkanol. Bei den Maleinimidoalkanolen handelt es sich bevorzugt um Maleinimidoethanol, am allermeisten bevorzugt um das Maleinimido- pentanol.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform verfügt das Linkermolekül (iii) gemäß Formel 10 über mindestens zwei unterschiedliche Kopplungsfunktionalitäten und zusätzlich über ein Modul, das die Hydrophilie oder Lipophilie erhöht. Dieses bevorzugte Linkermolekül ist in der Formel 10b abgebildet, Formel 10b
wobei „n" einer ganzen Zahl zwischen 0 bis 40 oder 0 bis 20, bevorzugt zwischen 0 bis 15, besonders bevorzugt zwischen 0 und 10, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 9, oder zwischen 2 und 8, oder zwischen 3 und 7 entspricht, und
X den Resten O, S, N, CH2, -O-C=O, O=C-O-, -NR -NR-C=O, O=C-NR- entspricht und R für H, C1-C12 verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, tert. Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, oder Cycloalkyl, Benzoyl, Benzyl, Ce bis Cio-Arylgruppen wie Phenyl und Naphtyl, Heteroaryl, bevorzugt H, Methyl und Ethyl steht, und das „Modul" einem Ethylenglykol- oder Polyethylenglykolrest mit 2 bis 40, bevorzugt 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 wiederholenden Einheiten, oder einer Aminosäure, bevorzugt ausgewählt aus Gruppe bestehend aus Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin und Cystein, oder einem Polypeptid mit 2 bis 40, bevorzugt 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 Aminosäuren, wobei es sich bei dem Aminosäuren vorzugsweise um polare Aminosäuren, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin und Cystein handelt, oder einem Polyacrylsäurerest mit 2-100, bevorzugt 2-80, besonders bevorzugt 2-50, am meisten bevorzugt 2-20 Monomereinheiten entspricht, oder zur Erhöhung der Lipophilie das „Modul" einem Alkylrest mit 2-40 Kohlenstoffen oder Polyolefinrest mit 2 bis 40, bevorzugt 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 wiederholenden Einheiten, oder einer Aminosäure, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe be- stehend aus Glycin, VaNn, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Prolin, Methio- nin, oder einem Polypeptid mit 2 bis 40, bevorzugt 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 10 Aminosäuren, wobei es sich bei dem Aminosäuren vorzugsweise um unpolare Aminosäuren, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycin, VaNn, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Prolin, Methionin handelt, oder ei- nem Polyester, Polyamid oder Polyurethan mit 2-100, bevorzugt 2-80, besonders bevorzugt 2-50, am meisten bevorzugt 2-20 Monomereinheiten entspricht und Y einer funktionellen Gruppe aus Hydroxy- oder Aminogruppen entspricht.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei Kopplung des Lin- kermoleküls (Ni) mit dem Effektormolekül (i) (z.B. Reaktivfarbstoff wie oben beschrieben) um eine Carbodiimid-, Anhydrid- oder Säurechlorid vermittelte Veresterungsreaktion bzw. Amidbildung, wobei die Verwendung des Säurechlorids des Linkermoleküls (iii) besonders bevorzugt ist. Carbodiimid-, Anhydrid- oder Säurechlorid vermittelte Re- aktion meint die für die Bildung eines Esters oder Amids zwischen Linkermolekül (iii) und Effektormolekül (i) notwendige Aktivierung der Carboxylgruppe des Linkermoleküls
Als Carbodiimide sind bevorzugt zu nennen Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopro- pylcarbodiimid (DIC), N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylcarbodiimid Hydrochlorid (EDC), wobei die Verwendung von Diisopropylcarbodiimid oder EDC als besonders bevorzugt gelten. Ferner ist es möglich, eine Aktivierung mit Carbonyldiimidazol (CDI) durchzuführen. Diese Veresterungen werden in Gegenwart von 0,1-100 Mol-% N1N- Dimethylaminopyridin (DMAP) durchgeführt, bevorzugt 0,5-10 %, besonders bevorzugt 1-6 %. Die Bildung von Amiden kann durch Reaktion der mit Carbodiimid aktivierten Verbindung mit dem Amin erfolgen. Optional kann die Amidbildung in Gegenwart von Zusätzen, wie z.B. N-Hydroxysuccinimid, Pentafluorphenol oder N-Hydroxybenzotriazol durchgeführt werden. Solche Zusätze sind dem Fachmann bekannt. Sofern durch die- se Zusätze isolierbare Aktivester erhalten werden, werden erfindungsgemäß auch die Umsetzungen dieser isolierten Aktivester mit den Effektormolekülen als Carbodiimid- vermittelte Veresterung verstanden.
Die Umsetzung des Linkermoleküls (iii) zum Anhydrid erfolgt nach allgemeinen Metho- den, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Bevorzugt ist die Verwendung gemischter Anhydride, wie sie beispielhaft durch Umsetzung mit Acetanhydrid, Pivaloylanhydrid, Acetylchlorid, Pivaloylchlorid oder Chlorameisensäureestern erhalten werden. Besonders bevorzugt sind Pivaloylanhydride sowie die Anhydride mit Kohlensäure. Bei Verwendung der Säurechloride ist es zweckmäßig, die Anhydridbildung in Gegenwart ei- ner tertiären Base, wie z.B. Pyridin, Triethylamin durchzuführen.
Die unter (a) beschriebene Kopplung des Linkermoleküls (iii) mit dem Effektormolekül (i) kann bevorzugt im Anschluss an die oben beschriebene Aktivierung des Linkermoleküls (iii) zum Anhydrid in Anwesenheit einer Base durchgeführt werden. Als bevor- zugte Basen sind zu nennen: aromatische und tertiäre Alkylamine, z.B. Pyridin, Triethylamin, Tributylamin, Trioktylamin, Ethyldiisopropylamin usw.. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als Base Triethylamin verwendet.
Bei der Umsetzung des Linkermoleküls (iii) zum Säurechlorid, werden als Chlorie- rungsmittel die dem Fachmann bekannten gängigen Chlorierungsmittel verwendet, beispielsweise Thionylchlorid, Phosphortrichlorid, Phosphorpentachlorid, Oxalylchlorid,
Phosgen, oder Phosphoroxychlorid. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Thionylchlorid (SOCI2).
Unter Verwendung von Thionylchlorid gelingt es z.B. Maleinimidocapronsäure in das Säurechlorid zu überführen. Dabei sind als Lösungsmittel geeignet: aromatische und aliphatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Benzol, Toluol, XyIoIe, Hexan, Heptan usw., ha- logenierte Kohlenwasserstoffe, z.B. Methylenchlorid, Ether, z.B. Diethylether, THF usw., sowie ein Überschuss des Chlorierungsmittels selbst. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Toluol verwendet.
Die Chlorierung kann mit oder ohne einen Katalysator durchgeführt werden. Als Katalysator für die Chlorierung ist DMF besonders bevorzugt.
Optional kann das Reaktionsprodukt aus dem Schritt (a) (im folgenden als Linker- Effektormolekül (iv) bezeichnet) zur Trennung möglicher Isomeren des Reaktionsproduktes weiter aufgereinigt werden. Dabei können alle gängigen Verfahren zur Aufreinigung chemischer Substanzen angewendet werden, z.B: Destillation, Rektifikation, Kristallisation, Extraktionen und chromatographische Reinigungsverfahren. Bevorzugt wird eine Säulenchromatographie durchgeführt.
Neben den oben genannten Reaktivfarbstoffen lassen sich auch andere Farbstoffe mittels eines Linkers an ein keratinbindendes Polypeptid koppeln und für das erfindungsgemäße Verfahren einsetzen.
Hierbei besonders vorteilhafte Farbstoffe sind die in der folgenden Liste genannten. Die Colour Index Nummern (CIN) sind dem Rowe Colour Index, 3. Auflage, Society of Dyers and Colourists, Bradford, England, 1971 entnommen.
Tabelle 3: vorteilhafte Farbstoffe
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für das erfindungsgemäße Verfahren zum Färben von Haut, Haar oder Nägel, solche ke- ratinbindende Effektormoleküle verwendet, die eines der in der Tabelle 3 gezeigten Farbstoffmoleküle, gekoppelt über einen oben beschriebenen Linker, enthalten.
Die oben genannten Farbstoffe können auch als Effektormoleküle (i) an einer haut- oder nagelbindenden Polypeptidsequenz (ii) für die Haut- oder Nagel-Colourierung z.B. in Tattoos eingesetzt werden. Insbesondere geeignet ist die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen (z.B die in Tabelle 3 mitgenannten Fluoreszenzfarbstoffe) enthaltenden keratinbindenen Effektormolekülen zur Erzielung eines gesünder und leuchtender wirkenden Hauttons oder zur optischen Aufhellung der Haut („skin whitening") nach Applikation auf der Haut. Die Anwendung von Fluoreszenzpigmenten ist z.B. beschrieben in US 6753002. Fluoreszenzfarbstoffe zur Erzeugung eines gesünderen Hauttons werden in „Filling the Fluorescent Palette, Cosmetics & Toiletries, 26-34, 121 , No. 5, 2006" beschrieben. Bevorzugt sind z.B. Fluoreszenzfarbsftoffe der Firma DayGlo. Ferner können diese Fluoreszenzfarbstoffe enthaltenden keratinbindenen Effektormoleküle auch zur Aufhellung von Haaren oder zur Erzeugung spezieller Reflexe oder Schimmer auf dem Haar verwendet werden. Dies wird z.B. in Ηair lightening by fluorescent dyes, Cosmetics & Toiletries, 56-57, 120, No. 7, 2005" und dem dort zitierten Schrift US 2004/0258641 beschrieben.
Die Bindung des aus dem oben beschriebenen Schritt (a) hervorgegangenen Reakti- onsproduktes mit dem keratinbindenden Polypeptid (ii) erfolgt über die zweite noch freie Ankergruppe des Linkermoleküls. Beispielsweise kann eine derartige Ankergruppe eine Thiolfunktion sein, mittels derer der Linker mit einem Cysteinrest des keratinbindenden Polypeptids (ii) eine Disulfidbindung eingehen kann. Die Verwendung maßgeschneiderter Linker erlaubt die genaue Anpassung der Verknüpfung des Linker-Effektormoleküls an das keratinbindende Polypeptid. Außerdem ist es dadurch möglich, mehrere Effektormoleküle mit einem keratinbindenden Polypeptid (ii) zu verknüpfen.
Der verwendete Linker richtet sich nach der zu koppelnden Funktionalität. Geeignet sind z.B. Moleküle, die zu keratinbindenden Polypeptiden (ii) mittels Sulfhydrylreaktiven Gruppen (z.B. Maleimide, Pydridyldisulfide, α -Haloacetyle, Vinylsulfone, Sulfatoalkyl- sulfone (bevorzugt Sulfatoethylsulfone) koppeln.
Bevorzugt ist eine kovalente Verknüpfung des Linkermoleküls (iii) mit dem keratinbindenden Polypeptid (ii). Diese kann beispielsweise über die Seitenketten des keratinbindenden Polypeptides (ii) erfolgen, insbesondere über Aminofunktionen, Hydroxy- funktionen, Carboxylatfunktionen oder Thiolfunktionen. Bevorzugt ist eine Verknüpfung über die Aminofunktionen von einem oder mehreren Lysinresten, einer oder mehreren Thiolgruppen von Cysteinresten einer oder mehrerer Hydroxylgruppen von Serin-, Threonin- oder Tyrosinresten, einer oder mehrerer Carboxylgruppen von Asparagin- säure- oder Glutaminsäureresten oder über die N-terminale oder C-terminale Funktion des keratinbindenden Polypeptides (ii). Außer den in der Primärsequenz des keratin- bindenden Polypeptides (ii) vorkommenden Aminosäurefunktionen können auch Aminosäuren mit geeigneten Funktionen (z.B. Cysteine, Lysine, Aspartate, Glutamate) an die Sequenz angefügt werden, oder Aminosäuren der Polypeptidsequenz durch solche Aminosäurefunktionen substituiert werden. Methoden zur Mutagenese oder Manipulation von Nukleinsäuremolekülen sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Einige aus- gewählte Methoden sind weiter unten beschreiben.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Linker-Effektormoleküls (iv), welches unter Verwendung der für das erfinderische Verfahren als bevorzugt genannten Malei- nimidocapronsäure hergestellt wurde. Bei einem derartigen Linker-Effektormolekül (iv) werden die in dem keratinbindenden Polypeptid vorhandenen Cysteinreste zur Kopplung verwendet.
Der Erfolg der Effektorkopplung kann über drei verschiedene Tests verfolgt werden:
(i) Ellmanntest, bei dem die Anzahl freier Cys-SH-Gruppen im Protein vor und nach der Effektorkopplung bestimmt werden kann. Hier zeigt eine starke
Reduzierung der freien SH-Gruppen nach der Kopplung einen guten Reaktionsablauf an (siehe Beispiele 11 ).
(ii) Aktivitätstest, bei dem die Bindung der KBD-B (SEQ ID No.: 166) mit und ohne gekoppelten Effektor an Haar gemessen werden kann. Eine gute Re- aktionsführung sollte die Aktivität von KBD-Effektor gegenüber ungekoppelter KBD-B (SEQ ID No.: 166) nicht vermindern (siehe Beispiel 12). (iii) sichtbare Färbung von Haar bzw. Haut durch die erfolgreiche Kopplung des Farbstoffes an die KBD-B (SEQ ID No.: 166) (siehe Beispiel 14).
In einer weiteren erfindungsgemäßen Anwendungsform erfolgt die Anbindung des Ef- fektormoleküls derart, dass sie durch die Wirkung hauteigener Enzyme (beispielsweise Esterasen, Lipasen oder Glucosidasen) oder durch die Umgebungsbedingungen auf der Haut (z. B. Feuchtigkeit, saurer pH) mit der Zeit aus den keratinbindenden Polypeptiden (ii) im Sinne eines „slow release" oder „controlled release" abgespalten und freigesetzt werden können. Somit können die keratinbindenden Polypeptide (ii) als Applikationssystem genutzt werden, mit dem durch einmalige oder wiederholte Anwendung geringe Mengen der freien Effektormoleküle auf der Haut erzielt werden können. Prinzipiell ist dem Fachmann bekannt, dass Effektoren aus ihren entsprechenden Derivaten , beispielsweise aus Tocopherolacetat, Ascorbylpalmitat oder Ascorbylglucosi- den, auf der Haut freigesetzt werden können (beispielhafte Literatur: Redoules, D. et al, J. Invest. Dermatol. 125, 2005, 270, Beijersbegen van Henegouwen, G. M. J. et al., J. Photochem. Photobiol. 29, 1995, 45.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden für das erfindungsgemäße Verfahren Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aminogruppen tragende Farbstoffe verwendet. Dabei können die verwendeten Effektormoleküle über eine oder mehrere Carboxyl-, Hydroxyl- bzw. Aminogruppen verfügen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der oben beschriebenen keratinbindenden Effektormoleküle in kosmetischen Zusammensetzungen geeignet zum Färben von Keratinfasern, bevorzugt Haaren, Haut oder Nägel, beson- ders bevorzugt menschlichen Haaren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verwendung der oben genannten erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormoleküle in Mitteln geeignet zum Färben von Haaren in Kombination mit kosmetisch geeigneten Hilfs- und Zusatz- Stoffen die üblicherweise in Haarfärbemitten eingesetzt werden.
Dabei können die oben genannten Farbstoffe, bevorzugt für kosmetische Zwecke zugelassene Farbstoffe, verwendet werden. Diese Farbstoffe werden üblicherweise in Konzentration von 0,001 bis 1 Gewichtsprozent (Gew.-%), vorzugsweise 0,01 bis 0,9 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,01 bis 0,8 Gew.-% oder 0,01 bis 0,7 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 0,01 bis 0,6 Gew.-% oder 0,01 bis 0,5 Gew.-%, am meisten bevorzugt 0,01 bis 0,4 Gew.-% oder 0,01 bis 0,3 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels beigefügt. In einer weiteren Ausführungsform können die Mittel ein erfindungsgemäßes keratinbindendes Effektormolekül in einer Konzentration von 1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 8 Gew.-%, 3 bis 7 Gew.-%, 4 bis 6 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels enthalten. Darüber hinaus können die Mittel ein erfindungsgemäßes keratinbindendes Effektormolekül in einer Konzentration von 10 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 1 bis 19 Gew.-%, 12 bis 18 Gew.-%, 13 bis 17 Gew.-%, 14 bis 16 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels enthalten.
Um zu gewährleisten, dass die aktiven Inhaltsstoffe der Haarfärbezusammensetzun- gen nach der Anwendung für eine gewisse Zeit auf dem Haar verbleiben und nicht an Stellen gelangen, an denen sie unerwünscht sind, wie beispielsweise das Gesicht, sollten die Zusammensetzungen eine gewisse Mindestviskosität aufweisen. Diese Viskosität wird üblicherweise durch den Einsatz von Verdickungsmitteln erreicht, die somit weiterer Bestandteil der meisten Haarfärbemittel sind. Als Verdickungsmittel werden üblicherweise vernetzte Polyacrylsäuren (z.B. Carbo- pol®), Hydroxyethylcellulose, Wachse und besonders Mischungen von nicht-ionischen Tensiden mit bestimmtem HLB-Wert (Hydrophobie Lipophilic Balance), anionische, kationische oder nicht-ionische Assoziationspolymere verwendet. Der Einsatz von ampholytischen Copolymeren als Verdicker für kosmetische Zusammensetzungen ist bekannt. Als ampholytisch bzw. amphoter werden Polymere bezeichnet, die sowohl anionogene/anionische als auch kationogene/kationische Gruppen aufweisen. Ampho- tere Polymere mit einer ausreichenden Anzahl von dissoziierbaren Gruppen sind wasserlöslich oder wasserdispergierbar und haben vielfältige Anwendungen im Bereich der Pharmazie und Kosmetik gefunden. Geeignete Verdickungsmittel bzw. Polymere sind in den Patentanmeldungen WO 00/039176, WO 04/058837, EP-A-O 982 021 , WO 01/62809, WO 05/004821 , DE 202 07 896 U1 und WO 02/000181 beschrieben.
Zur Einstellung bestimmter Eigenschaften können die Zubereitungen zusätzlich auch konditionierende Substanzen auf Basis von Silikonverbindungen enthalten. Geeignete Silikonverbindungen sind beispielsweise Polyalkylsiloxane, Polyarylsiloxane, Polyary- lalkylsiloxane, Polyethersiloxane, Silikonharze oder Dimethicon Copolyole (CTFA) und aminofunktionelle Silikonverbindungen wie Amodimethicone (CTFA).
Treibmittel sind die für Haarsprays oder Aerosolschäume üblich verwendeten Treibmittel. Bevorzugt sind Gemische aus Propan/Butan, Pentan, Dimethylether, 1 ,1- Difluorethan (HFC-152 a), Kohlendioxid, Stickstoff oder Druckluft.
Als Emulgatoren können alle in Haarschäumen üblicherweise eingesetzten Emulgato- ren verwendet werden. Geeignete Emulgatoren können nichtionisch, kationisch bzw. anionisch oder amphoter sein. Beispiele für nichtionische Emulgatoren (INCI- Nomenklatur) sind Laurethe, z.B. Lau- reth-4; Cetethe, z.B. Cetheth-1 , Polyethylengly- colcetylether, Cetearethe, z.B. Cetheareth-25, Polyglycolfettsäureglyceride, hydroxy- liertes Lecithin, Lactylester von Fettsäuren, Alkylpolyglycoside. Beispiele für kationische Emulgatoren sind Cetyldimethyl-2-hydroxyethylammonium- dihydrogenphosphat, Cetyltrimoniumchlorid, Cetyltrimmoniumbromid, Cocotrimonium- methylsulfat, Quaternium-1 bis x (INCI).
Anionische Emulgatoren können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe der Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N-Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisethionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Triethanolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletherphosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid oder Propylenoxid- Einheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxid-Einheiten im Molekül aufweisen.
Als Gelbildner können alle in der Kosmetik üblichen Gelbildner eingesetzt werden. Hierzu zählen leicht vernetzte Polyacrylsäure, beispielsweise Carbomer (INCI), CeIIu- losederivate, z.B. Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulose, kationisch modifizierte Cellulosen, Polysaccharide, z.B. Xanthangummi, Capryl/Caprin-Triglycerid, Natriu- macrylat-Copolymere, Polyquaternium-32 (und) Paraffinum Liquidum (INCI), Natriu- macrylat-Copolymere (und) Paraffinum Liquidum (und) PPG-1 Trideceth-6, Acrylami- dopropyltrimoniumchlorid / Acrylamid-Copolymere, Steareth-10-Allylether, Acrylat- Copolymere, Polyquaternium-37 (und) Paraffinum Liquidum (und) PPG-1 Trideceth-6, Polyquaternium 37 (und) Propylenglycoldicapratdicaprylat (und) PPG-1 Trideceth-6, Polyquaternium-7, Polyquaternium-44.
In den Shampooformulierungen können alle in Shampoos üblicherweise eingesetzten anionischen, neutralen, amphoteren oder kationischen Tenside verwendet werden.
Geeignete anionische Tenside sind beispielsweise Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N- Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisothionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Triethanolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletherphosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid- oder Propylenoxid- Einheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxid-Einheiten im Molekül aufweisen.
Geeignet sind zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, Ammoniumlaurysulfat, Natriumlaury- lethersulfat, Ammoniumlaurylethersulfat, Natriumlauroylsarkosinat, Natriumoleylsucci- nat, Ammoniumlaurylsulfosuccinat, Natriumdodecylbenzolsulfonat, Triethanolamindo- decylbenzolsulfonat. Geeignete amphotere Tenside sind zum Beispiel Alkylbetaine, Alkylamidopropylbetai- ne, Alkylsulfobetaine, Alkylglycinate, Alkylcarboxyglycinate, Alkylamphoacetate oder - propionate, Alkylamphodiacetate oder -dipropionate.
Beispielsweise können Cocodimethylsulfopropylbetain, Laurylbetain, Cocamidopropyl- betain oder Natriumcocamphopropionat eingesetzt werden.
Als nichtionische Tenside sind beispielsweise geeignet die Umsetzungsprodukte von aliphatischen Alkoholen oder Alkylphenolen mit 6 bis 20 C-Atomen in der Alkylkette, die linear oder verzweigt sein kann, mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid. Die Menge Alkylenoxid beträgt ca. 6 bis 60 Mole auf ein Mol Alkohol. Ferner sind Alkylaminoxide, Mono- oder Dialkylalkanolamide, Fettsäureester von Polyethylenglykolen, Alkylpolygly- koside oder Sorbitanetherester geeignet.
Außerdem können die Shampooformulierungen übliche kationische Tenside enthalten, wie z.B. quaternäre Ammoniumverbindungen, beispielsweise Cetyltrimethylammoni- umchlorid.
In den Shampooformulierungen können zur Erzielung bestimmter Effekte übliche Kon- ditioniermittel in Kombination mit den erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormolekülen eingesetzt werden.
Hierzu zählen beispielsweise die zuvor genannten kationischen Polymere mit der Bezeichnung Polyquaternium nach INCI, insbesondere Copolymere aus Vinylpyrrolidon/ N-Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat FC, Luviquat&commat, HM, Luviquat MS, Luviquat Care), Copolymere aus N-Vinylpyrrolidon/Dimethylaminoethylmethacrylat, quaternisiert mit Diethylsulfat (Luviquat D PQ 1 1 ), Copolymere aus N-Vinylcaprolactam/N- Vinylpyrrolidon/N-Vinylimidazoliumsalzen (Luviquat D Hold), kationische Cellulosederi- vate (Polyquaternium-4 und -10), Acrylamidcopolymere (Polyquaternium-7). Ferner können Eiweißhydrolysate verwendet werden, sowie konditionierende Substanzen auf Basis von Silikonverbindungen, beispielsweise Polyalkylsiloxane, Polyarylsiloxane, Polyarylalkylsiloxane, Polyethersiloxane oder Silikonharze. Weitere geeignete Silikonverbindungen sind Dimethicon Copolyole (CTFA) und aminofunktionelle Silikonverbindungen wie Amodimethicone (CTFA). Ferner können kationische Guarderivate wie Guarhydroxypropyltrimoniumchlorid (INCI) verwendet werden.
Im Regelfall wird die haarkosmetische oder hautkosmetische Zubereitung zur Applikation auf der Haut (topisch) oder Haar verwendet. Unter topischen Zubereitungen sind dabei solche Zubereitungen zu verstehen, die dazu geeignet sind, die Wirkstoffe in feiner Verteilung auf die Haut oder das Haar aufzubringen. Hierfür eignen sich z.B. wässrige und wässrig-alkoholische Lösungen, Sprays, Schäume, Schaumaerosole, Salben, wässrige Gele, Emulsionen vom O/W- oder W/O-Typ, Mikroemulsionen oder kosmetische Stiftpräparate.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen kosmetischen Mit- tels enthält das Mittel einen Träger. Bevorzugt als Träger ist Wasser, ein Gas, eine Wasser-basierte Flüssigkeit, ein Öl, ein Gel, eine Emulsion oder Mikroemulsion, eine Dispersion oder eine Mischung davon. Die genannten Träger zeigen eine gute Hautverträglichkeit. Besonders vorteilhaft für topische Zubereitungen sind wässrige Gele, Emulsionen oder Mikroemulsionen.
Als Emulgatoren können nichtionogene Tenside, zwitterionische Tenside, ampholyti- sche Tenside oder anionische Emulgatoren verwendet werden. Die Emulgatoren können in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Mengen von 0,1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung, enthalten sein.
Als nichtionogenes Tensid kann beispielsweise ein Tensid aus mindestens einer der folgenden Gruppen verwendet werden:
Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid und/oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen, an Fettsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen und an Alkylphenole mit 8 bis 15 C-Atomen in der Alkylgruppe;
Ci2/18-Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von 1 bis 30 Mol Ethylenoxid an Glycerin; Glycerinmono- und -diester und Sorbitanmono- und -diester von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen und deren Ethylenoxidanlagerungsprodukte; Alkylmono- und -oligoglycoside mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alkylrest und deren ethoxylierte Analoga; Anlagerungsprodukte von 15 bis 60 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl; Polyol- und insbesondere Polyglycerinester, wie z.B. Polyglycerinpolyricinoleat, Polyglycerinpoly-12- hydroxystearat oder Polyglycerindimerat. Ebenfalls geeignet sind Gemische von Verbindungen aus mehreren dieser Substanzklassen;
Anlagerungsprodukte von 2 bis 15 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl; Partialester auf Basis linearer, verzweigter, ungesättigter bzw. gesättigter C6/22 - Fettsäuren, Ricinolsäure sowie 12-Hydroxystearinsäure und Glycerin, Polyglycerin, Pentaerythrit, Dipenta-erythrit, Zuckeralkohole (z. B. Sorbit), Alkylglucoside (z.B. Me- thylglucosid, Butylglucosid, Lauryl-glucosid) sowie Polyglucoside (z.B. Cellulose); Mono-, Di- und Trialkylphosphate sowie Mono-, Di- und/oder Tri-PEG-alkylphosphate und deren Salze; Wollwachsalkohole;
Polysiloxan-Polyalkyl-Polyether-Copolymere bzw. entsprechende Derivate; Mischester aus Pentaerythrit, Fettsäuren, Citronensäure und Fettalkohol gemäß DE PS 1 165574 und/oder Mischester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, Methyl- glucose und Polyolen, vorzugsweise Glycerin oder Polyglycerin sowie Polyalkylengly- cole.
Weiterhin können als Emulgatoren zwitterionische Tenside verwendet werden. Als zwitterionische Tenside werden solche oberflächenaktiven Verbindungen bezeichnet, die im Molekül mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe und mindestens eine Car- boxylat- oder eine Sulfonatgruppe tragen. Besonders geeignete zwitterionische Tenside sind die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosalkyldimethyl-ammoniumglycinat, N-Acylamino-propyl-N,N dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacylaminopropyldimethylam- monium-glycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxy-ethylimidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydro- xyethyl-carboxymethylglycinat. Besonders bevorzugt ist das unter der CTFA Bezeichnung Cocamidopropyl Betaine bekannte Fettsäureamid-Derivat.
Ebenfalls geeignete Emulgatoren sind ampholytische Tenside. Unter ampholytischen Tensiden werden solche oberflächenaktive Verbindungen verstanden, die außer einer Cs.is-Alkyl- oder -Acylgruppe im Molekül mindestens eine freie Aminogruppe und mindestens eine -COOH- oder -SOaH-Gruppe enthalten und zur Ausbildung innerer Salze befähigt sind. Beispiele für geeignete ampholytische Tenside sind N-Alkylglycine, N- Alkylpropionsäuren , N-Alkylamino-buttersäuren , N Alkyliminodipropionsäuren, N- Hydroxyethyl-N-alkylamido-propylglycine, N-Alkyltaurine, N Alkylsarcosine, 2- Alkylaminopropionsäuren und Alkylaminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C- Atomen in der Alkylgruppe.
Besonders bevorzugte ampholytische Tenside sind das N-Kokosalkylaminopropionat, Kokosacylaminoethylaminopropionat und das Ci2/18-Acylsarcosin. Neben den ampholytischen kommen auch quartäre Emulgatoren in Betracht, wobei solche vom Typ der Esterquats, vorzugsweise methyl-quaternierte Difettsäuretriethanolaminester-Salze, besonders bevorzugt sind. Desweiteren können als anionische Emulgatoren Alky- lethersulfate, Monoglyceridsulfate, Fettsäuresulfate, Sulfosuccinate und/oder Ethercar- bonsäuren eingesetzt werden.
Als Ölkörper kommen Guerbetalkohole auf Basis von Fettalkoholen mit 6 bis 18, vorzugsweise 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, Ester von linearen C6-C22-Fettsäuren mit linea- ren C6-C22-Fettalkoholen, Ester von verzweigten C6-Ci3-Carbonsäuren mit linearen Ce- C22-Fettalkoholen, Ester von linearen C6-C22-Fettsäuren mit verzweigten Alkoholen, insbesondere 2-Ethylhexanol, Ester von linearen und/oder verzweigten Fettsäuren mit mehrwertigen Alkoholen (wie z.B. Propylenglycol, Dimerdiol oder Trimertriol) und/oder Guerbetalkoholen, Triglyceride auf Basis Cβ-Cio-Fettsäuren, flüssige Mono-/Di-, Trigly- ceridmischungen auf Basis von Cδ-Cis-Fettsäuren, Ester von C6-C22-Fettalkoholen und/oder Guerbetalkoholen mit aromatischen Carbonsäuren, insbesondere Benzoe- säure, Ester von C2-Ci2-Dicarbonsäuren mit linearen oder verzweigten Alkoholen mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen oder Polyolen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und 2 bis 6 Hydroxylgruppen, pflanzliche Öle, verzweigte primäre Alkohole, substituierte Cyclohe- xane, lineare C6-C22-Fettalkoholcarbonate, Guerbetcarbonate, Ester der Benzoesäure mit linearen und/oder verzweigten C6-C22-Alkoholen (z.B. Finsolv® TN), Dialkylether, Ringöffnungsprodukte von epoxidierten Fettsäureestern mit Polyolen, Siliconöle und/oder aliphatische bzw. naphthenische Kohlenwasserstoffe in Betracht. Als Ölkör- per können ferner auch Siliconverbindungen eingesetzt werden, beispielsweise Di- methylpolysiloxane, Methylphenylpolysiloxane, cyclische Silicone sowie amino-, fett- säure-, alkohol-, polyether-, epoxy-, fluor-, alkyl- und/oder glykosidmodifizierte Silicon- Verbindungen, die bei Raumtemperatur sowohl flüssig als auch harzförmig vorliegen können. Die Ölkörper können in den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von 1 bis 90, vorzugsweise 5 bis 80, und insbesondere 10 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung enthalten sein.
Die Liste der genannten Inhaltstoffe, die gemeinsam mit den erfindungsgemäßen kera- tinbindenden Effektormolekülen verwendet werden können, soll selbstverständlich nicht als abschließend oder limitierend betrachtet werden. Die Inhaltsstoffe können einzelnen oder in beliebigen Kombinationen miteinander verwendet werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Mittel geeignet zum Färben von Haut, Nägeln und/oder Haaren, bevorzugt Haarfärbemittel, enthaltend mindestens eines der oben beschriebenen erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormoleküle.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Färben von Haaren, Haut und/oder Nägeln unter Verwendung der erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormoleküle. Bevorzugt werden in diesem Verfahren keratinbindende Effektormoleküle eingesetzt, welche mindestens eines der oben genannten keratinbindenden Polypeptide (ii) und mindestens einem Farbstoff oder Reaktivfarbstoff gemäß der Tabellen 3, 5 und 6 enthalten.
Natürlich können bei der Herstellung der zur Färbung von Haaren geeigneten Zubereitungen auch keratinbindende Effektormoleküle mit unterschiedlichen Farbstoffen so miteinander gemischt werden, das spezielle Farbnuancen erzielt werden. Die Herstellung von Zubereitungen mit speziellen Farbnuancen kann z.B. erfolgen durch (a) Mischung ausgewählter Reaktivfarbstoffe oder Farbstoffe bei der
Herstellung des keratinbindenden Effektormoleküls, oder (b) Mischung individueller keratinbindender Effektormoleküle beim Erstellen des Haarfärbemittels. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfinderischen Verfahrens werden keratinbindende Effektormoleküle verwendet, enthaltend
(e) ein keratinbindendes Polypeptid welches eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,
44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,
86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18,
120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157,
158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170, bevorzugt in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 44, 46, 48, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166,
168 oder 170, besonders bevorzugt 166 und 168, am meisten bevorzugt 168 dargestellte Sequenz umfasst, oder einem Polypeptid entsprechen, welches mindestens zu 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, besonders bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% oder 96% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12,
14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54,
56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96,
98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166,
168 oder 170, bevorzugt in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 40, 42, 44, 46,
48, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170, besonders bevorzugt 166 und 168, am meisten bevorzugt 168 dargestellte Sequenz und in der Lage ist, Keratin zu binden, und (f) als Linkermolekül (iii) die Maleinimidocapronsäure oder ein Maleinimidoalkanol, bevorzugt Maleinimidopentanol, und (g) ein Effektormolekül (i) ausgewählt aus den in Tabelle 3 gelisteten Farbstoffen, oder
(h) einen Reaktivfarbstoff ausgewählt aus den Tabellen 6 oder 7.
Vorzugsweise erfolgt das Färben der Haare durch Aufbringen einer die erfindungsgemäßen keratinbindenden Effektormoleküle enthaltenden Zubereitung auf die zu färbenden Haare in einer Menge und Zeit ausreichend zur Erzeugung der gewünschten Farbveränderung. Dabei lässt sich eine gute Färbung mit einem geeigneten keratinbindenden Effektormolekül bereits nach sehr kurzer Zeit (wenigen Minuten) oder zumindest innerhalb einer halben Stunde erreichen (siehe Beispiel 20).
Der Fachmann ist sich bewusst, dass die zur Färbung notwendige Menge und Zeit von der Länge und Anzahl der zu färbenden Haare abhängt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des oben genannten Verfahrens handelt es sich um ein reversibles Färbeverfahren, bei dem das keratinbindende Effek- tormolekül in einer Verdrängungsreaktion von Haut, Haar oder Nägel entfernt werden kann. Hierzu kann beispielsweise eine Spülung mit Keratin eingesetzt werden, wodurch die keratinbindenden Effektormoleküle aus ihrer bestehenden Bindung zum Keratin verdrängt werden und mit dem Keratin aus der Spülung abgesättigt werden. Alternativ ist auch eine Spülung mit einem hohen Anteil an Detergenz (z.B. SDS) zum Abwaschen möglich, (siehe Beispiel 20).
Sequenzen
SEQ lD
NO.: Sequenztyp Sequenzbeschreibung
1 Nukleinsäure H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415
2 Protein H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415
3 Nukleinsäure H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B
4 Protein H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B
5 Nukleinsäure H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-1
6 Protein H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B- 1
7 Nukleinsäure H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-2
8 Protein H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-2
9 Nukleinsäure H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne C
10 Protein H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne C
11 Nukleinsäure H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne C- 1
12 Protein H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne C- 1
13 Nukleinsäure H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne C-2
14 Protein H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne C-2
15 Nukleinsäure H.sapiens_Filaggrin_Accession CA119595
16 Protein H.sapiens_Filaggrin_Accession CA119596
17 Nukleinsäure H. sapiens plakophilin 1 Accession NM_001005337, transcript variant 1a
18 Protein H. sapiens plakophilin 1 Accession NM_001005337, transcript variant 1a
19 Nukleinsäure H. sapiens plakophilin 1 Accession N M_000299, transcript variant 1 b
20 Protein H. sapiens plakophilin 1 Accession N M_000299, transcript variant 1 b
21 Nukleinsäure Mus musculus plakophilin 2 Accession NM_026163 NM_027894
22 Protein Mus musculus plakophilin 2 Accession NM_026163 NM_027895
23 Nukleinsäure Mus musculus plakophilin 1 ACCESSION NM_019645
24 Protein Mus musculus plakophilin 1 ACCESSION NM_019646
25 Nukleinsäure Bos taurus plakophilin 1 partial mRNA, Accession XM_868348
26 Protein Bos taurus plakophilin 1 partial mRNA, Accession XM_868349
27 Nukleinsäure Canis familiaris similar to plakophilin 1 isoform 1a, Accession XM_851528
28 Protein Canis familiaris similar to plakophilin 1 isoform 1a, Accession XM_851529
29 Nukleinsäure Danio rerio similar to Plakophilin 1 Accession XM_695832
30 Protein Danio rerio similar to Plakophilin 1 Accession XM_695833
31 Nukleinsäure Rattus norvegicus similar to plakophilin 1 , Accession XM_222666
32 Protein Rattus norvegicus similar to plakophilin 1 , Accession XM_222667
33 Nukleinsäure Pan troglodytes similar to Plakophilin 1 , Accession XM_514091
34 Protein Pan troglodytes similar to Plakophilin 1 , Accession XM_514092
35 Nukleinsäure Gallus gallus similar to plakophilin 1 , Accession XM_419240
36 Protein Gallus gallus similar to plakophilin 1 , Accession XM_419241 Nukleinsäure Xenopus laevis similar to plakophilin 4, Accession BI390496 Protein Xenopus laevis similar to plakophilin 4, Accession BI390497 Nukleinsäure H. sapiens desmoplakin, transcript variant 2, Accession NM_001008844 Protein H. sapiens desmoplakin, transcript variant 2, Accession NM_001008845 Nukleinsäure Mus musculus desmoplakin, Accession XM_621314 Protein Mus musculus desmoplakin, Accession XM_621315 Nukleinsäure Rattus norvegicus similar to desmoplakin isoform II, Accession XM_225259 Protein Rattus norvegicus similar to desmoplakin isoform II, Accession XM_225260 Nukleinsäure Pan troglodytes desmoplakin, Accession XM_518227 Protein Pan troglodytes desmoplakin, Accession XM_518228 Nukleinsäure Gallus gallus similar to Desmoplakin, Accession XM_418957 Protein Gallus gallus similar to Desmoplakin, Accession XM_418958 Nukleinsäure H. sapiens junction plakoglobin (JUP), transcript variant 2, Accession NM_021991 Protein H. sapiens junction plakoglobin (JUP), transcript variant 2, Accession NM_021992 Nukleinsäure Mus musculus, plakoglobin; gamma-catenin, Accession NM_010593 Protein Mus musculus, plakoglobin; gamma-catenin, Accession NM_010594 Nukleinsäure Rattus norvegicus gamma-catenin (plakoglobin), Accession NM_031047 Protein Rattus norvegicus gamma-catenin (plakoglobin), Accession NM_031048 Nukleinsäure Danio rerio armadillo protein family; plakoglobin, Accession NM_131177 Protein Danio rerio armadillo protein family; plakoglobin, Accession NM_131178 Nukleinsäure Xenopus tropicalis junction plakoglobin, Accession BC064717 Protein Xenopus tropicalis junction plakoglobin, Accession BC064718 Nukleinsäure Canis familiaris similar to junction plakoglobin isoform 10, Accession XM_856625 Protein Canis familiaris similar to junction plakoglobin isoform 10, Accession XM_856626 Nukleinsäure Xenopus laevis Ju p protein, Accession BC094116 Protein Xenopus laevis Ju p protein, Accession BC094117 Nukleinsäure Bos taurus junction plakoglobin, Accession NM_001004024 Protein Bos taurus junction plakoglobin, Accession NM_001004025 Nukleinsäure Sus scrofa plakoglobin, Accession NM_214323 Protein Sus scrofa plakoglobin, Accession NM_214324 Nukleinsäure Danio rerio junction plakoglobin, Accession BC058305 Protein Danio rerio junction plakoglobin, Accession BC058306
Saccharomyces cerevisiae, plakoglobin/armadillo/beta-catenin, Accession Nukleinsäure AF005267
Saccharomyces cerevisiae, plakoglobin/armadillo/beta-catenin, Accession Protein AF005268 Nukleinsäure H. sapiens plectin 1 , intermediate filament binding protein, Accession NM_201380 Protein H. sapiens plectin 1 , intermediate filament binding protein, Accession NM_201381
Mus musculus plectin 1 (Pled ), transcript variant 11 , mRNA, Accession Nukleinsäure NM_201394 XM
Mus musculus plectin 1 (Pled ), transcript variant 11 , mRNA, Accession Protein NM_201394 XM Nukleinsäure Bos taurus similar to plectin 1 isoform 1 (LOC510991 ), Accession XM_588232 Protein Bos taurus similar to plectin 1 isoform 1 (LOC510991 ), Accession XM_588233 Nukleinsäure Canis familiaris similar to plectin 1 isoform, Accession XM_539204 Protein Canis familiaris similar to plectin 1 isoform, Accession XM_539205 Nukleinsäure Trypanosoma cruzi, plectin-like protein, Accession XM_809849 80 Protein Trypanosoma cruzi, plectin-like protein, Accession XM_809850
81 Nukleinsäure Rattus norvegicus plectin, Accession X59601
82 Protein Rattus norvegicus plectin, Accession X59602
83 Nukleinsäure Cricetulus griseus plectin, Accession AF260753
84 Protein Cricetulus griseus plectin, Accession AF260754
85 Nukleinsäure H. sapiens periplakin, Accession NM_002705
86 Protein H. sapiens periplakin, Accession NM_002706
87 Nukleinsäure Mus musculus periplakin , Accession NM_008909 XM_358905
88 Protein Mus musculus periplakin , Accession NM_008909 XM_358906
89 Nukleinsäure H. sapiens envoplakin, Accession NM_001988
90 Protein H. sapiens envoplakin, Accession NM_001989
91 Nukleinsäure Mus musculus envoplakin, Accession NM_025276 XM_283024
92 Protein Mus musculus envoplakin, Accession NM_025276 XM_283025
93 Nukleinsäure Bos taurus similar to Envoplakin, Accession XM_587641
94 Protein Bos taurus similar to Envoplakin, Accession XM_587642
95 Nukleinsäure Canis familiaris similar to Envoplakin, Accession XM_540443
96 Protein Canis familiaris similar to Envoplakin, Accession XM_540444
97 Nukleinsäure Danio rerio similar to Envoplakin, Accession XM_687958
98 Protein Danio rerio similar to Envoplakin, Accession XM_687959
99 Nukleinsäure Rattus norvegicus, similar to envoplakin, db_xref GenelD:303687
100 Protein Rattus norvegicus, similar to envoplakin, db_xref GenelD:303688
101 Nukleinsäure Pan troglodytes similar to Envoplakin, Accession XM_511692
102 Protein Pan troglodytes similar to Envoplakin, Accession XM_511693
103 Nukleinsäure Human bullous pemphigoid antigen, Accession M63618
104 Protein Human bullous pemphigoid antigen, Accession M63619
105 Nukleinsäure Mus musculus bullous pemphigoid antigen 1 (Bpagi ), Accession AF396877
106 Protein Mus musculus bullous pemphigoid antigen 1 (Bpagi ), Accession AF396878
107 Nukleinsäure Mus musculus trichohyalin-like 1 , Accession NM_027762
108 Protein Mus musculus trichohyalin-like 1 , Accession NM_027763
109 Nukleinsäure Bos taurus similar to trichohyalin-like 1 , Accession XM_597026
110 Protein Bos taurus similar to trichohyalin-like 1 , Accession XM_597027
111 Nukleinsäure H. sapiens trichohyalin-like 1 , Accession NM_001008536 XM_060104
112 Protein H. sapiens trichohyalin-like 1 , Accession NM_001008536 XM_060105
113 Nukleinsäure Strongylocentrotus purpuratus similar to Trichohyalin, Accession XM_793822
114 Protein Strongylocentrotus purpuratus similar to Trichohyalin, Accession XM_793823
115 Nukleinsäure Trypanosoma cruzi trichohyalin, putative, Accession XM_809758
116 Protein Trypanosoma cruzi trichohyalin, putative, Accession XM_809759
117 Nukleinsäure Giardia lamblia ATCC 50803 trichohyalin, Accession XM_765825
118 Protein Giardia lamblia ATCC 50803 trichohyalin, Accession XM_765826
119 Nukleinsäure Aspergillus fumigatus Af293, trichohyalin, Accession XM_748643
120 Protein Aspergillus fumigatus Af293, trichohyalin, Accession XM_748644
121 Nukleinsäure O. cuniculus trichohyalin, Accession Z19092
122 Protein O.cuniculus trichohyalin, Accession Z19093
123 Nukleinsäure Pan troglodytes similar to Trichohyalin, Accession XM_526770
124 Protein Pan troglodytes similar to Trichohyalin, Accession XM_526771
125 Nukleinsäure Human trichohyalin (TRHY), Accession L09190
126 Protein Human trichohyalin (TRHY), Accession L09191
127 Nukleinsäure Mus musculus small proline-rich protein 3, Accession NM_011478
128 Protein Mus musculus small proline-rich protein 3, Accession NM_011479 129 Nukleinsäure H. sapiens small proline-rich protein 2B (SPRR2B), Accession NM_001017418
130 Protein H. sapiens small proline-rich protein 2B (SPRR2B), Accession NM_001017419
131 Nukleinsäure Mus musculus hair follicle protein AHF, Accession XM_485271
132 Protein Mus musculus hair follicle protein AHF, Accession XM_485272
133 Nukleinsäure H. sapiens epiplakin 1 (EPPK1 ), Accession NM_031308 XM_372063
134 Protein H. sapiens epiplakin 1 (EPPK1 ), Accession NM_031308 XM_372064
135 Nukleinsäure Mus musculus epiplakin 1 , Accession NM_144848 NM_173025
136 Protein Mus musculus epiplakin 1 , Accession NM_144848 NM_173026
137 Nukleinsäure Mus musculus structural protein FBF1 , Accession AF241249
138 Protein Mus musculus structural protein FBF1 , Accession AF241250
139 Nukleinsäure Streptococcus mutans spaP gene for antigen l/l I, Accession X17390
140 Protein Streptococcus mutans spaP gene for antigen l/ll, Accession X17391
141 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Bag 43
142 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Bag 44
143 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Bag 53
144 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Bag 51
DNA-Fragment welches mittels der PCR-Primer Lib148 (SEQ ID No.: 147) und
145 Nukleinsäure Lib149 (SEQ ID No.: 148) amplifiziert wurde
146 Protein Translationsprodukt des Nukleinsäuremoleküls SEQ ID No.: 145
147 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib148
148 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib149
DNA-Fragment welches mittels der PCR-Primer Lib149 (SEQ ID NO.: 148) und
149 Nukleinsäure Lib150 (SEQ ID NO. :151 ) amplifiziert wurde.
150 Protein Translationsprodukt des Nukleinsäuremoleküls SEQ ID No.: 149
151 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib150
DNA-Fragment welches mittels der PCR-Primer Lib151 (SEQ ID No.:156 ) und
152 Nukleinsäure Lib152 (SEQ ID No.: 157) amplifiziert wurde
153 Protein Translationsprodukt des Nukleinsäuremoleküls SEQ ID No.: 152
154 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib151
155 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib152
156 Protein KBD-B_3_H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-3
157 Protein KBD-B_4 H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-4
158 Protein KBD-B_5 H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-5
159 Nukleinsäure KBD-B_6 H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-5
160 Protein KBD-B_6 H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-5
161 Nukleinsäure H. sapiens trichoplein, BC004285
162 Protein H. sapiens trichoplein, BC004285
H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 mit Nukleinsäureaustauschen an
163 Nukleinsäure den Positionen ca.2715, 8000 und 8000 im Verlgeich zu SEQ ID No.: ID 1
H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 mit Aminosäureaustauschen an
164 Protein den Positionen 905, 2687 und 2688 im Verlgeich zu SEQ ID No.: ID 2
165 Nukleinsäure KBD-B_7 H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-7
166 Protein KBD-B_7 H. sapiens Desmoplakin_Accession NM_004415 Domäne B-7
KBD-D mit N-terminalem Histidinanker , H. sapiens Plakophilin 1a ACCESSION
167 Nukleinsäure NM_001005337
KBD-D mit N-terminalem Histidinanker , H. sapiens Plakophilin IaACCESSION
168 Protein NP_001005337
169 Nukleinsäure KBD-D Aminosäuren 1-273 mit C-terminalem Histidinanker , H. sapiens Plakophi- lin Ia ACCESSION NM_001005337
BD-D Aminosäuren 1-273 mit C-terminalem Histidinanker , H. sapiens Plakophilin
170 Protein 1a ACCESSION NP_001005337
171 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers H Re6
172 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers H Re9
173 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers H Re7
174 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers H Re8
175 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers H Re26
176 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers H Re27
Experimentelle Beispiele
Die folgenden Beispiele werden offenbart um bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu illustrieren. Diese Beispiele sind nicht als abschließend oder den Erfindungsgegestand limitierend zu betrachten.
In der experimentellen Beschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet: (2-Amino-2-Methyl-Propanol) AMP, (Grad Celsius) C°, (Ethylendiamintetraessigsäure) EDTA, (1 ,1-Difluorethan) HFC 152, (International Nomenclature of Cosmetic Ingre- dients) INCI, (Milliliter) ml_, (Minuten) min., (Öl/Wasser) O/W, (Polyethylenglykol) PEG- 25, (Para Amino Benzoesäure) PABA, (parts per million) ppm, (quantum satis) q.s, (Vinylpyrrolidone) VP, (Wasser/Öl) W/O, (Wirkstoff) WS, (Polyvinylpyrrolydone) PVP, Keratin bindende Domäne (KBD), Keratin bindende Domäne B des humanen Des- moplakin (KBD-B) , Keratin bindende Domäne C des humanen Desmoplakin (KBD-C)
Beispiel 1 : Expressionsvektoren und Produktionsstämme
Es wurden verschiedene Expressionsvektoren für die Expression der keratinbindenden Domänen (KBD) getestet. Dabei kamen verschiedene Promotoren (z.B. IPTG- induzierbar, Rhamnose-induzierbar, Arabindose-induzierbar, Methanol-induzierbar, konstitutive Promotoren, u.a.) zum Einsatz. Ebenso wurden Konstrukte getestet, bei denen die KBD als Fusionsproteine exprimiert wurden (z.B. als Fusion mit Thioredoxin, oder eGFP, oder YaaD [B. subtilis, SWISS-PROT: P37527, PDX1], u.a.). Dabei wurden sowohl die beschriebene KBD-B (keratinbindende Domäne B, SEQ ID No.: 4), als auch KBD-C (keratinbindende Domäne C, SEQ ID No.: 10), sowie die Kombination aus beiden Domänen KBD-BC mit den verschiedenen Expressionssystemen exprimiert. Die erwähnten Vektor-Konstrukte sind nicht limitierend für die Beanspruchung.
Stellvertretend als Beispiel ist die Vektorkarte des IPTG-induzierbaren Vektors pQE30- KBD-B (Abbildung 5), der Methanol-induzierbaren Vektoren pLib15 (Abbildung 6) und pLib16 (Abbildung 7) sowie des induzierbaren Vektors pLib19 (Abbildung 8) angegeben. Analog zu den beschriebenen Vektorkonstruktionen und Expressionen kann auch für KBD-C vorgegangen werden.
Für die Expression der KBD wurden verschiedene Produktionswirte genutzt, wie z.B. E. coli-Stämme (siehe Bsp. 2; z.B. XLI O-GoId [Firma Stratagene], BL21-CodonPlus [Firma Stratagene], und andere). Es wurden aber auch andere bakterielle Produktionswirte, wie z.B. Bacillus megaterium oder Bacillus subtilis genutzt. Bei der KBD- Expression in B. megaterium wurde analog zu: Barg, H., Malten, M. & Jahn, D. (2005). Protein and vitamin production in Bacillus megaterium. In Methods in Biotechnology- Micobial Products and Biotransformations (Barredo, J. -L., ed, 205-224) vorgegangen. Als pilzliche Produktionsstämme kamen Pichia pastoris (siehe Bsp. 3; z.B. GS1 15 und KM71 [beide Firma Invitrogen]; und andere) und Aspergillus nidulans (siehe Bsp. 4; z.B. RMS011 [Stringer, MA, Dean, RA, Sewall, TC, Timberlake, WE (1991 ) Rodletless, a new Aspergillus developmental mutant induced by direct gene activation. Genes Dev 5:1 161-1 171] und SRF200 [Karos, M, Fischer, R (1999) Molecular characterization of HymA, an evolutionarily highly conserved and highly expressed protein of Aspergillus nidulans. Mol Genet Genomics 260:510-521], und andere) zum Einsatz. Es könnten aber auch andere pilzliche Produktionswirte, wie z.B. Aspergillus niger (KBD- Expression analog zu EP 0635574A1 und/oder WO 98/46772) zur KBD-Expression genutzt werden.
Beispiel 2: KBD-Expression in E. coli-Stämmen mit IPTG induzierbaren Promotoren, z.B. durch das Expressionsplasmid pQE30-KBD-B
Für die Expression wurden verschiedene Produktionswirte eingesetzt, wie z.B. verschiedene E. coli-Stämme (z.B. XLI O-GoId [Firma Stratagene], BL21-CodonPlus [Firma Stratagene], und andere), Bacillus megaterium, Bacillus subtilis u.a.. Hier wird - stellvertretend als Beispiel - die Klonierung und Expression von KBD-B durch E. coli, transformiert mit pQE30-KBD-B beschrieben:
Klonierung von pQE30-KBD-B
Lambda-MaxiDNA (DNA-Lambda Maxi Kit, Firma Qiagen) wurde aus einer cDNA- Bank von humanen Keratinozyten hergestellt (Firma BD Bioscience, Clontech,
Human Keratinocyte cDNA, foreskin, primary culture in log phase, Vektor: λgtl 1).
Die PCR wurde unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide durchgeführt: Bag 43 (5'- GGTCAGTTACGTGCAGCTGAAGG -3') (SEQ ID No.: 141 )und Bag 44 (5' GCTGAGGCTGCCGGATCG -3') (SEQ ID No.: 142)
50 μl PCR-Ansatz:
10x PCR-Puffer Pfu Ultra High Fidelity: 5μl
Lambda DNA(744ng/μl) 1 μl (1 :30 Verd.) dNTP's.-Mix (10mM) 1 μl
Oligo Bag 43 (192ng/μl) 0,5μl
Oligo Bag 44 (181 ng/μl) 0,5μl
Pfu Ultra High Fidelity Polymerase 1 μl
H2O 41 μl
Temperaturprogramm:
2 Min. - 95°C
ient 500C -> 600C
10 Min - 72°C Das entstandene etwa 1 102 bp große PCR-Produkt wurde aus einem Agarosegel ausgeschnitten und aufgereinigt.
Anschließend wurde mit dem gereinigten PCR-Produkt als Templat eine 2. PCR durchgeführt:
Verwendete Ohgonukleotide:
Bag 53: (5'- CGCGCCTCGAGCCACATACTGGTCTGC -3') (SEQ ID No.: 143) und
Bag 51 (5'- GCTTAGCTGAGGCTGCCGGATCG -3') (SEQ ID No.: 144)
50 μl PCR-Ansatz:
10x PCR-Puffer TAQ: 5μl
Template aus obiger PCR 3,5μl dNTP's.-Mix (10mM) 1 μl
Oligo Bag 53 (345ng/μl) 0,5μl
Oligo Bag 51 (157ng/μl) 0,5μl
TAQ Polymerase 1 μl
H2O 39μl
Temperaturprogramm:
2 Min. - 95°C f 30 Sek. - 95°C
3Ox i 30 Sek. - 58°C
L 3 Min. - 72°C
10 Min - 72°C
Das entstandene etwa 1073 bp große PCR-Produkt wurde aus einem Agarosegel ausgeschnitten, aufgereinigt und in folgenden Vektor kloniert: pCR2.1-TOPO (Firma Invitrogen).
- Der entstehende Vektor pCR2.1-TOPO+KBD-B (5027 bp) wurde anschließend transformiert, amplifiziert in E. coli, dann mit Xhol und EcoRI geschnitten und das entstandene KBD-B-Fragment in pBAD/HisA (Firma Invitrogen; ebenfalls geschnitten mit Xhol und EcoRI) kloniert.
- Der neu entstandene Vektor pBAD/HisA+KBD-B (5171 bp) wurde erneut geschnitten mit Sacl und Stul und das entstandene KBD-B-Fragment in pQE30 (Firma Qiagen; geschnitten mit Sacl und Smal) kloniert. Der daraus entstandene Expressionsvektor pQE30-KBD-B (4321 bp; siehe auch Abbildung 5) wurde für die folgenden KBD-B-Expressionen verwendet. Die durch den Vektor pQE30-KBD-B in E. coli expremierte KBD-B (SEQ ID No.: 4) beinhaltete zusätzlich am N-Terminus die Aminosäuren MRGSHHHHHHGSACEL sowie am C-Terminus die Aminosäuren GVDLQPSLIS (SEQ ID No.: 166) .
Expression von KBD-B durch pQE30-KBD-B in E. coli
- Vorkulturen wurden von Platte oder Glycerinkultur mit pQE30-KBD-B transformierten E. coli Stämmen (z.B. XLI O-GoId [Firma Stratagene]) angeimpft. Je nach Größe der Hauptkultur wurde in einem Röhrchen oder einem kleinen Kolben mit LB- Medium angeimpft (ca. 1 :100).
- Antibiotika wurden je nach verwendetem Stamm eingesetzt (für pQE30-KBD-B Ampicillin 100 μg/ml).
- Es wurde bei 250 rpm und 37°C inkubiert.
- Die Hauptkultur wurde ca. 1 :100 mit Vorkultur angeimpft, Hauptkultur: LB-Medium oder geeignetes Minimalmedium mit den jeweiligen Antibiotika. Inkubation bei 250 rpm und 37°C.
- Die Induktion erfolgte mit 1 mM IPTG ab einer OD(600nm) von 0,5.
- Die Zellen wurden nach 4 h Induktion abzentrifugiert.
In Fermentern wurde analog vorgegangen, jedoch konnte bei sehr viel höheren OD- Einheiten induziert werden und damit die Zell- und Protein-Ausbeute erheblich gesteigert werden.
Beispiel 3: Intrazelluläre und sekretorische Expression von KBD mittels Pichia pastoris- Stämmen unter Verwendung von Methanol-induzierbaren Promotoren, z.B. durch die Expressionsplasmide pLib 15 und pLib 16 (Schüttelkolben)
Für die KBD-Expression wurden verschiedene Pichia pastoris-Stämme eingesetzt, wie z.B. GS115 und KM71 (Pichia Expression Kit, Version M; Invitrogen Life Technolo- gies).
Hier wird - stellvertretend als Beispiel - die Expression von KBD-B durch P. pastoris, transformiert mit pLib15 (intrazelluläre Expression, Vektor siehe Abbildung 6) oder pLib16 (sekretorische Expression, Vektor siehe Abbildung 7) beschrieben.
Zur Konstruktion von pLib15 wurde ein 948 bp großes, KBD-B-kodierendes DNA- Fragment (SEQ ID No.: 145) mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide Lib148
- (5'- GCTAAGGAATTCACCATGCATCACCATCACCATCACGAGCCACA-
TACTGGTCTGCT-3' (SEQ ID No.: 147) und Lib149 (5'-GCTGGAGAATTCTCAGCTAATTAAGCTTGGCTGCA-S' SEQ ID NO.: 148) sowie des Vektors pQE30-KBD-B (Beispiel 2, Abb. 5) als Template amplifiziert. Dabei wurden EcoRI-Restriktionsschnittstellen an beiden Enden der PCR- Produkte eingebracht.
Zur Konstruktion von pl_ib16 wurde ein 942 bp großes, KBD-B-kodierendes DNA- Fragment (SEQ ID No.:149) mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide Lib149 (δ'-GCTGGAGAATTCTCAGCTAATTAAGCTTGGCTGCA-S' (SEQ ID NO.: 148)) und Lib150 (5'- - GCTAAGGAATTCCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-S' (SEQ ID No.: 151) sowie des Vektors pQE30-KBD-B (Beispiel 2, Abbildung 5) als Template amplifiziert. Dabei wurden EcoRI-Restriktionsschnittstellen an beiden Enden der PCR-Produkte eingebracht.
- Die PCR wurden in 50 μl Reaktionsansätzen durchgeführt, welche wie folgt zusammengesetzt waren: 1 μl Plasmid-DNA pQE30-KBD-B 1 μl dNTP-Mix (jedes 10 mM; Fa. Eppendorf) 5 μl 10 x PCR-Puffer + MgCI2 (Fa. Roche) 1 μl Lib148 oder Lib150 5'Primer (entspricht 50 pmol)
1 μl Lib149 3'Primer (entspricht 50 pmol) 5 U Pwo-Polymerase (Fa. Roche)
Die PCR-Reaktionen wurden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
Schritt 1 : 5 Minuten 95 °C (Denaturierung)
Schritt 2: 45 Sekunden 95 °C
Schritt 3: 45 Sekunden 50 °C (Annealing)
Schritt 4: 2 Minuten 72 °C (Elongation) 30 Zyklen der Schritte 2-4
Schritt 5: 10 Minuten 72 °C (Post- Elongation)
Schritt 6: 4 0C (Pause)
Das PCR-Produkt, welches mit den Oligonukleotiden Lib148/Lib149 amplifiziert wurde (SEQ ID No.: 145), wurde mit EcoRI verdaut und in den EcoRI- geschnittenen Vektor pPIC3.5 (Pichia Expression Kit, Version M, Firma Invitro- gen) ligiert. Die korrekte KBD-B Amplifizierung wurde durch Sequenzierung des aus der Ligation resultierenden Vektors pLib15 (Abbildung 6) überprüft.
- Das PCR-Produkt, welches mit den Oligonukleotiden Lib149/Lib150 amplifiziert wurde, (SEQ ID No.: 149) wurde mit EcoRI verdaut und in den EcoRI- geschnittenen Vektor pPIC9 (Pichia Expression Kit, Version M, Firma Invitrogen) ligiert. Die korrekte KBD-B Amplifizierung wurde durch Sequenzierung des aus der Ligation resultierenden Vektors pl_ib16 (Abbildung 7) überprüft.
Elektrokompetente Zellen und Spheroplasten der P. pastoris-Stämme wurden mit den zirkulären und Stul-linearisierten Vektoren pl_ib15 bzw. pl_ib16 gemäß der
Vorgaben des Herstellers (Pichia Expression Kit, Version M, Firma Invitrogen) transformiert.
Die Analyse der Transformanten erfolgte mittels PCR und Southern Blot unter Verwendung chromosomaler DNA. - Zur Vorkultur wurden KBD-B-expremierende P. pastoris-Transformanten von Platte oder Glycerinkultur angeimpft. Je nach Größe der Hauptkultur wurde ein Röhrchen oder ein kleiner Kolben mit MGY-, BMG- oder BMGY-Medium (Pichia- Expression-Kit, Version M, Firma Invitrogen) angeimpft (ca. 1 :100). Die Kultur wurde bei 250-300 rpm und 30°C bis zur OD6oo=2-6 inkubiert. - Die Zellen wurden mit 1500-3000 x g für 5 min bei Raumtemperatur geerntet.
Zur Hauptkultur wurde das geerntete Zellpellet auf eine OD6oo=1 in Methanolenthaltendem mM-, BMM- oder BMMY-Medium (Pichia-Expression-Kit, Version M, Firma Invitrogen) aufgenommen, um die Expression zu induzieren. Die Inkubation der Hauptkultur erfolgte bei 250-300 rpm und 30°C für 1-96 h. - Die Aufrechterhaltung der Induktion erfolgte alle 24 h durch Zugabe von 100 % Methanol bei einer Methanol-Endkonzentration von 0,5 %. Bei intrazellulärer Expression erfolgte die Ernte und der Aufschluss der Zellen nach Ende der Hauptkultur mittels eines Menton-Gaulin. Bei sekretorischer Expression wurde der Kulturüberstand gesammelt und die KBD-B direkt daraus gereinigt.
Die intrazellulär in P. pastoris expremierte KBD-B (SEQ ID No.: 145) (pLib15) beinhaltete neben der Polypeptidsequenz SEQ ID No.: 4 zusätzlich am N- Terminus die Aminosäuren MHHHHHH sowie am C-Terminus die Aminosäuren GVDLQPSLIS. - Die sekretorisch in P. pastoris expremierte KBD-B (SEQ ID No.: 149) (pLib16) beinhaltete vor der Prozessierung neben der Polypeptidsequenz SEQ ID No.: 4 zusätzlich am N-Terminus die Aminosäuren MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTT- TEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVS- LEKREAEAYVEFHHHHHH sowie am C-Terminus die Aminosäuren GVDLQPSLIS.
Die mittels P. pastoris sekretierte und prozessierte KBD-B (SEQ ID No.: 149) (pLib16) beinhaltete neben der Polypeptidsequenz SEQ ID No.: 4 zusätzlich am N-Terminus die Aminosäuren YVEFHHHHHH sowie am C-Terminus die Aminosäuren GVDLQPSLIS. - Beispiel 4: Expression von KBD mittels Aspergillus nidulans-Stämmen unter Verwendung des induzierbaren alcA-Promotors, z.B. durch das Expressionsplasmid pLib 19 (Schüttelkolben)
Für die Expression wurden A. nidulans-Wildtypstämme eingesetzt, wie z.B. RMS01 1 oder SRF200. Hier wird - stellvertretend als Beispiel - die Expression von KBD-B durch A. nidulans, transformiert mit pl_ib19 (Abbildung 8) beschrieben.
Zur Konstruktion von püb19 wurde ein 922 bp (SEQ ID No.: 152) großes, KBD-B- kodierendes DNA-Fragment mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide Lib151 (5 '-CACCATGCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-
3' (SEQ ID No.: 154) und Lib152 (5'- GCTAATTAAGCTTGGCTGCA-3' (SEQ ID No.: 155) sowie des Vektors pQE30-KBD-B (Beispiel 2, Abbildung 5) als Template (unter Verwendung der oben genannten PCR Bedingungen, wobei die Annea- ling Temperatur des PCR Programms mit 53 °C an die Tm-Werte der Primer Lib151 und Lib152 angepasst wurden) amplifiziert . Das PCR-Produkt wurde in den Vektor pENTR/D (pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kit, Version E, Firma Invitrogen) ligiert. Die korrekte KBD-B Amplifizierung wurde durch Sequenzierung überprüft. Die Rekombination des KBD-B kodierenden DNA-Fragmentes erfolgte in den Vektor pMT-OvE (Toews MW, Warmbold J, Konzack S, Rischitor P, Veith D,
Vienken K, Vinuesa C, Wei H, Fischer R; Establishment of mRFP1 as a fluores- cent marker in Aspergillus nidulans and construction of expression vectors for high-throughput protein tagging using recombination in vitro (GATEWAY). (2004) Curr Genet 45: 383-389) unter Verwendung des „Gateway® LR clonase™ enzyme mix" (Firma Invitrogen). Dabei entstand der Vektor pLib19 (Abbildung 8 ).
Protoplasten der A. nidulans Wildtyp-Stämme wurden mit dem zirkulären Vektor pLib19 in transformiert (Yelton MM, Hamer JE, Timberlake WE; Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid., (1984) Proc Natl Acad Sei USA 81 : 1479-1474). Die Analyse der Transformanten erfolgte mittels PCR und Southern
Blot unter Verwendung chromosomaler DNA.
Zur Vorkultur von KBD-B-expremierenden A. nidulans-Transformanten wurden 100 ml Minimalmedium (0,6 % NaNO3; 0,152 % KH2PO4; 0,052 % KCl [pH 6,5]; 0,8 % Glukose; 0,05 % MgSO4; 1 ml Spurenelementelösung [1 g/l FeSO4 x 7
H2O; 8,8 g/l ZnSO4 x 7 H2O; 0,4 g/l CuSO4 x 5 H2O; 0,15 g/l MnSO4 x 4 H2O; 0,1 g/l Na2B4O7 x 10 H2O; 0,05 g/l (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O], + stammspezifische Supplemente) oder 100 ml Komplettmedium (2 % Malzextrakt; 0,1 % Pepton; 2 % Glukose; + stammspezifische Supplemente) in 500 ml Kolben mit 106-107 Sporen angeimpft und für 16-24 h bei 200-250 rpm und 37°C inkubiert. Nach der Vorkultur wurde das Pilzmyzel durch Filtration geerntet, mit destilliertem Wasser gewaschen und in Kolben mit 100-500 ml frischem Minimalmedium überführt. In diesem Hauptkulturmedium wurde 0,1 % Fructose statt Glukose als C- Quelle verwendet. Zur Induktion der KBD-Expression wurde dem Medium zusätz- lieh Ethanol (1 % Endkonzentration) oder Glycerol (50 mM) oder Natriumacetat
(50 mM) oder Ethylamin oder Threonin zugegeben. Die erwähnten Zusätze zur Expressionsinduktion sind nicht limitierend für die Beanspruchung. Die Hauptkultur wurde für weitere 5-48 h bei 200-250 rpm und 37°C inkubiert.
- Nach Kulturende wurde das Pilzmyzel mit 1500-3000 x g für 5 min bei Raumtemperatur geerntet und mittels eines Menton-Gaulin aufgeschlossen.
Die in A. nidulans expremierte KBD-B (SEQ ID No.: 152) (pLib19) beinhaltete neben der Polypeptidsequenz SEQ ID No.: 4 zusätzlich am N-Terminus die Ami- nosäuren MHHHHHH sowie am C-Terminus die Aminosäuren
GVDLQPSLISKGGRADPAFLYKVVMIRLLTK- PERKLLEGGPGTQLLFPLVRVNCALGVIMVIAVSCVKLLSAHNSTQHTSRKHKV.
Beispiel 5: Zell-Aufschluss und Inclusion-Body-Reinigung (pQE30-KBD-B). Löslich exprimierte KBD konnte nach Zellaufschluss (z.B. mittels Menton-Gaulin) direkt verwendet bzw. chromatographisch gereinigt werden (siehe Beispiel 6). Unlöslich exprimierte KBD (z.B. in Inclusion Bodies) wurde folgendermaßen gereinigt:
Der Fermenterinhalt wurde zentrifugiert, das Pellet in 20 mM Phosphatpuffer pH = 7,5 suspendiert und mittels eines Menton-Gaulin aufgeschlossen.
Der Aufschluss wurde erneut zentrifugiert (15000g), das Pellet hiervon mit 20 mM
Phosphat, 500 mM NaCI und 8 M Harnstoff versetzt und so gerührt. (Lösen der
Inclusion-Bodies)
Der pH-Wert des Überstandes wurde auf 7,5 eingestellt - Danach wurde nochmals zentrifugiert und der Überstandes auf eine Ni-Chelat
Sepharose Säule aufgetragen und wie in Beispiel 6 beschrieben aufgereinigt.
Beispiel 6: Reinigung von Keratin-Binde-Domäne B über Ni-Chelat-Sepharose. Die Reinigung der KBD konnte durch das angehängte His-Tag über eine Ni-Säule chromatographisch gereinigt werden.
Säulenmaterial: Ni-Sepharose High Performance
Firma Amersham Biosciences Best. Nr.: 17-5268-02
Das Material wurde in eine Säule gepackt (z.B. Durchmesser 2,6 cm, Höhe 10 cm) und mit Puffer A + 4 % Puffer B (entspricht 20 mM Imidazol) äquilibriert. Der Proteinextrakt (siehe z.B. Zeil-Auf Schluss und Inclusion-Body-Reinigung) wurde mit pH 7,5 über einen Superloop (ÄKTA-System) auf die Säule auftragen (Flow ca. 5 ml/Min).
Nach dem Auftrag wurde mit Puffer A + 2OmM Imidazol gewaschen. Elution erfolgte mit Puffer B (50OmM Imidazol in Puffer A). Das Eluat wurde mittels eines Fraktionssammlers fraktioniert aufgefangen.
Anschließend konnte das Eluat entsalzt werden (vorteilhaft für Proben die konzentriert werden sollen). Dazu wurde das Eluat z.B. über eine Sephadex G25 Medium Säule (Firma Amersham) entsalzt. Danach konnte zum Konzentrieren z.B eine Amicon- Kammer (Stirred Ultrafiltration Cell, Firma Millipore).
Puffer A: 2O mM Natriumdihydrogenphosphat 500 mM NaCI (es können wahlweise auch Puffer mit geringeren NaCI-
Konzentrationen verwendet werden) 8M Harnstoff (Harnstoff braucht nicht verwendet werden, wenn „aktive"
KBD chromatographiert wird, die bereits löslich exprimiert wor- den ist.
Ohne Harnstoff braucht keine Renaturierung des Proteins folgen.) pH = 7,50
Puffer B: 20 mM Natriumdihydrogenphosphat
500 mM NaCI (es können wahlweise auch Puffer mit geringeren NaCI- Konzentrationen verwendet werden)
8M Harnstoff 500 mM Imidazol pH = 7,50
Beispiel 7: Renaturierung von Keratin-Binde-Domäne B.
Unlöslich exprimierte Keratin-Binde-Domäne (z.B. aus Inclusion Bodies) kann folgen- dermaßen renaturiert und damit aktiviert werden:
Methode 1 : diskontinuierliche Dialyse
Zu 6,5 ml KBD-B-Inclusion-Bodies in 8M Harnstoff (Ni-Chelat-Eluat, HiTrap) wurden 6,5 ml Cellytic IB (Firma Sigma, Bestellnr. C5236) und 5 mM DTT gegeben. Danach wurde die zu renaturierende Lösung in einen Dialyseschlauch gefüllt (Firma Spectrum: Spectra Por MWCO: 12-14kD). Ca. 12 Stunden gegen 1 L 6M Harnstofflsg. bei 4°C unter vorsichtigem Rühren dialysie- ren.
Es wurden 500 ml 25 mM Tris/HCI pH = 7,50 zugegeben und so für 9 Stunden bei 4°C dialysiert. Anschließend Zugabe von weiteren 250 ml des Trispuffers (s.o) und weitere 12 Stunden dialysiert.
Anschließend wurden erneut 500 ml 25 mM Tris/HCI pH = 7,50 zugegeben und so für 9 Stunden bei 4°C dialysiert. Anschließend Zugabe von weiteren 250 ml des Trispuffers (s.o.) und weitere 12 Stunden dialysiert.
Anschließend wurden erneut 500 ml 25 mM Tris/HCI pH = 7,50 zugegeben und so für
9 Stunden bei 4°C dialysiert. Dann wurde der Dialyseschlauch mit dem Dialysat in 2L: 25 mM Tris + 150 mM NaCI pH= 7,50 gegeben. So wurde erneut bei 4°C für 12 Stunden dialysiert.
Anschließend wurde der Inhalt des Dialyseschlauches entnommen.
Methode 2: kontinuierliche Dialyse
20 ml KBD-B-Inclusion-Bodies in 8 M Harnstoff (Ni-Chelat-Eluat, HiTrap) wurden mit
10 ml Cellytic IB (Firma Sigma, Bestellnr. C5236) und 5 mM DTT versetzt. Danach wurde die Lösung in eine Dialysekammer: Slide-A-Lyzer Dialyses Cassette Firma PIERCE, MWCO: 10 kD. Bestellnr.: 66830, eingefüllt.
Anschließend wurde für ca. 1 Stunde gegen 1 L 6 M Harnstofflsg. bei 4°C dialysiert.
Danach wurden über einen Zeitraum von 48 h kontinuierlich 2 L des folgenden Puffers mittels einer Schlauchpumpe zudosiert: 25 mM Tris/HCI pH = 7,5.
Anschließend wurde der Dialyseschlauch mit dem Dialysat in 2 L des Endpuffers gegeben:
25 mM Tris + 150 mM NaCI pH= 7,50 und für ca. 12 Stunden bei 4°C dialysiert.
Anschließend wurde der Inhalt des Dialyseschlauches entnommen.
Beispiel 8: Bindung an Haut 1 (Qualitativ) Es wurde ein visueller qualitativer Test entwickelt, um zu überprüfen, ob KBD an Haut bindet. Verwendete Lösungen:
Blockierungslsg: Western Blocking Reagent 1921673 Roche (10 x Lsg) in TBS verdünnt
TBS: 20 mM Tris; 15O mM NaCI pH 7,5 TTBS: TBS + 0,05% Tween20
Der erste Schritt ist der Transfer der äußeren Keratinschicht von der Haut auf einen stabilen Träger. Dazu wurde ein Klarsichtklebestreifen fest auf enthaarte menschliche Haut aufgebracht und wieder entfernt. Der Test kann direkt auf dem Klarsichtklebestreifen durchgeführt werden oder die anhaftende Keratinschicht durch erneutes Aufkleben auf einen Glasobjektträger überführt werden. Der Nachweis von Bindung wurde wie folgt vorgenommen:
- zur Inkubation mit den verschiedenen Reagentien, Transfer in ein Falcongefäß ggf. Zugabe von Ethanol zur Entfettung, Entfernung von Ethanol und Trocknung der Objektträger
1 h bei Raumtemperatur inkubiert mit Blocking Puffer
2x 5 min gewaschen mit TTBS - 1x 5 min gewaschen mit TBS
Inkubation mit der zu testenden KBD (gekoppelt an tag - z.B. Hisβ, HA etc.) bzw.
Kontrollprotein in TBS / 0,05% Tween 20 während 2-4 h bei Raumtemperatur
Entfernung des Überstands
3x Waschen mit TBS - 1 h bei Raumtemperatur Inkubation mit Monoclonal Anti-polyHistidin (oder spezifischen KBD Rabbit) Antikörper, verdünnt 1 :2000 in TBS + 0,01 % Blocking
2x 5min gewaschen mit TTBS
1x 5 min gewaschen mit TBS
1 h bei Raumtemperatur Inkubation mit Anti-Mouse IgG Alkalische-Phosphatase- Conjugate, verdünnt 1 :5000 in TBS + 0,01 % Blocking
2x 5 min gewaschen mit TTBS
1x 5 min gewaschen mit TBS
Zugabe von Phosphatasesubstrat (NBT-BCIP; Boehringer MA 1 Tablette/40 ml
Wasser 2,5 min; Stopp: mit Wasser) - Optische Detektion des Farbniederschlages mit bloßem Auge oder im Mikroskop.
Ein blauer Farbniederschlag zeigt an, dass KBD an die Haut gebunden hat.
Beispiel 9: Bindung an Haut 2 (Quantitativ)
Es wurde ein quantitativer Test entwickelt, mit dem sich die Haar/Haut-Bindungsstärke der KBD mit unspezifischen Proteinen vergleichen lässt. Aus einem aufgetauten trockenen Stück Haut ohne Haare (human oder Schwein), wurde mit einem 5 mm Korkbohrer ein Stück herausgebohrt (bzw. bei einem Oberflächentest ein Stück Haut in ein Falcondeckel eingepasst). Die Hautprobe wurde dann auf eine Dicke von 2-3 mm gebracht um evt. vorhandenes Gewebe zu entfernen. Die Hautprobe wurde anschließend in ein Eppendorfgefäß (Protein-Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen (siehe auch Abbildung 9; Alternativ kann auch das Episkin-System [rekonstituierte humane Haut] von L'Oreal verwendet werden):
2 x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20 - Zugabe von 1 ml 1 % BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen (900 rpm). Entfernung des Überstands
Zugabe von 100 μg KBD in PBS mit 0,05 % Tween 20; Inkubation 2 h bei Raum- temperatur und leichten Schwenkbewegungen (900 rpm).
Entfernung des Überstands
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA oder spezifischen
KBD)-Antikörper mit Peroxidase Conjugate (1 :2000 in PBS mit 0,05 % Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophili- zed powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung (900 rpm)
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml / Eppendorfgefäß; Zusammensetzung s.u.) - Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 90 Sekunden).
Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen.
Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen
Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten): 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO)
+ 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
Beispiel 10: Bindung an Haar (Quantitativ) Um die Bindungsstärke der KBD an Haar auch im Vergleich zu anderen Proteinen nachweisen zu können, wurde ein quantitativer Assay entwickelt (siehe auch Abbildung 9). Bei diesem Test wurde zunächst Haar mit KBD inkubiert und überschüssige KBD abgewaschen. Anschließend wurde eine Antikörper-Peroxidase-Konjugat über das His- Tag der KBD gekoppelt. Nicht gebundene Antikörper-Peroxidase-Konjugat wurde er- neut abgewaschen. Das gebundene Antikörper-Peroxidase-Konjugat [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] kann ein farbloses Substrat (TMB) in ein farbiges Produkt umsetzen, das pho- tometrisch bei 405 nm vermessen wurde. Die Stärke der Absorption zeigt die Menge an gebundenem KBD bzw. Vergleichsprotein an. Als Vergleichsprotein wurde z.B. Y- aaD aus B. subtilis gewählt, das ebenfalls - wie es für diesen Test nötig ist - ein His- Tag zur Detektion aufwies. Anstatt des His-Tag können auch andere, spezifische Anti- körper konjugiert mit Peroxidase verwendet werden.
5 mg Haare (human) werden in 5 mm lange Stücke geschnitten und in Eppendorfgefä- ße (Protein-Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen:
- Zugabe von 1 ml Ethanol zur Entfettung
Zentrifugation, Entfernung von Ethanol und Waschung der Haare mit H2O Zugabe von 1 ml 1 % BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen. Zentrifugation, Entfernung des Überstands - Zugabe der zu testenden Keratinbindedomäne (gekoppelt an tag - z.B. Hisβ, HA etc.) bzw. Kontrollprotein in 1 ml PBS / 0,05 % Tween 20; Inkubation für 16 h bei 4°C (oder mindestens 2 h bei Raumtemperatur) bei leichten Schwenkbewegungen. Zentrifugation, Entfernung des Überstands
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA)-Anti körper mit Peroxidase-Konjugat (1 :2000 in PBS / 0,05 % Tween 20) [Monoclonal Antipoly- Histidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung
3 x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20 Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml / Eppendorfgefäß) Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 2 Minuten). Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen. - Die Absorption wird bei 405 nm gemessen
Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten): 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
BSA = Bovine serum albumin PBS = Phosphat gepufferte Salzlösung Tween 20 = Polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n ca. 20 TMB = 3,5,3,'5' Tetramethylbenzidin Ein beispielhaft für KBD-B durchgeführter Bindungs-Test an Haar zeigte eine deutliche Überlegenheit der Bindung von KBD-B (SEQ ID No.: 166) an Haar gegenüber einer wesentlichen schlechteren Bindung des Vergleichsproteins YaaD:
Tabelle 4.: Quantitativer KBD Aktivitäts-Test Haar: 1 ) Puffer; 2) Vergleichsprotein Y- aaD; 3) KBD-B denaturiert; 4) KBD-B renaturiert. Die Tabelle zeigt die gemessenen Absorptionswerte bei 405 nm.
Beispiel 1 1 : Expression von KBD-D (SEQ ID No.: 167) mittels Escherichia coli - Stämmen unter Verwendung des Expressionsplasmids pReeO24 mit einem IPTG induzierbaren Promotor (Abbildung 8)
Für die Expression wurde der E. coli Stamm XL10 Gold [Stratagene] verwendet. Hier wird, stellvertretend als Beispiel, die Klonierung von KBD-D (SEQ ID No.:167) und die anschließende Expression des KBD-D Proteins (SEQ ID No.:168) in E. coli, transformiert mit pReeO24 (Abbildung 8) beschrieben:
Klonierung von pReeO24:
- Lambda-MaxiDNA (DNA-Lambda Maxi Kit, Firma Qiagen) wurde aus einer cDNA- Bank von humanen Keratinozyten hergestellt (Firma BD Bioscience, Clontech, Human Keratinocyte cDNA, foreskin, primary culture in log phase, Vektor: λgtl 1).
Die PCR zur Amplifikation des KBD-D Gens wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurde das 5Εnde und 3'Ende unabhängig amplifiziert. Diese Fragmente wa- ren die Matrize für die Amplifikation des gesamten KBD-D Gens.
Die PCR zur Amplifikation des 5'Endes wurde wie folgt durchgeführt: Die Primer hatten die folgende Sequenz:
HRe6: 5 - ATGAACCACTCGCCGCTCAAGACCGCCTTG - 3' (SEQ ID No.: 171 ) HRe9: 5' - CGTTCCCGGTTCTCCTCAGGAGGCTGACTG - 3' (SEQ ID No.: 172)
100 μl PCR-Ansatz:
10x PCR-Puffer Pfu Ultra High Fidelity: 10μl
Lambda DNA(744ng/μl) 1 μl (1 :10 Verd.) dNTP's.-Mix (10mM) 10μl
HRe6 (196ng/μl) 1 μl
HRe9 (201 ng/μl) 1 μl
Pfu Ultra High Fidelity Polymerase 1 μl H2O bidest 76μl
Temperaturprogramm:
2 Min. 95°C
30 Sek. 95°C
3Ox 30 Sek. 63°C
1 Min. 30 Sek. 72°C
Im Agarosegel wurde ein etwa 1 kb großes Fragment detektiert. Die Reaktion wurde gereinigt und im folgenden als 5'-Ende-Template für die Amplifikation des KBD-D Gens eingesetzt.
Die PCR zur Amplifikation des 3'Endes wurde wie folgt durchgeführt:
Die Primer hatten die folgende Sequenz:
HRe7: 5'- TTAGAATCGGGAGGTGAAGTTCCTGAGGCT - 3' (SEQ ID No.: 173)
HRe8: 5' - CACCACCAACAAGCTGGAGACCCGGAG - 3' (SEQ ID No.: 174)
100 μl PCR-Ansatz:
10x PCR-Puffer Pfu Ultra High Fidelity: 10μl
Lambda DNA(744ng/μl) 1 μl (1 :10 Verd.) dNTP's.-Mix (10mM) 10μl HRe7 (201 ng/μl) 1 μl
HRe8 (209ng/μl) 1 μl
Pfu Ultra High Fidelity Polymerase 1 μl
H2O bidest 76μl
Temperaturprogramm:
Im Agarosegel wurde ein etwa 1 ,2 kb großes Fragment detektiert. Die Reaktion wurde gereinigt und im folgenden als 3'- Ende -Template für die Amplifikation des KBD-D Gens eingesetzt.
- Zur Amplifikation des KBD-D Gens wurde das 5'Ende-Template und das 3Εnde- Template als Matrize eingesetzt. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: 100 μl PCR-Ansatz:
1 Ox PCR-Puffer Pfu Ultra High Fidelity: 10μl dNTP - Mix (1O mM) 10μl
H2O bidest 75μl
5Εnde-Template 1 μl
3Εnde-Template 1 μl
Pfu Ultra High Fidelity Polymerase 1 μl
H2O 76μl
Temperaturprogramm:
f 60 Sek. 94°C 10x |j300 Sek. 72°C
nach den 10 Zyklen wurde 1 μl Primer HRe6 (196μg/ml) und HRe7 (206μg/ml) und 1 μl Pfu Ultra High Fidelity Polymerase zugegeben und mit der Reaktion das folgende Temperaturprogramm durchgeführt:
Temperaturprogramm:
Anschließend wurde 1 μl Taq-Polymerase dazugegeben und für 10 Minuten bei 72°C inkubiert.
Das entstandene etwa 2150 bp große PCR-Produkt wurde aus einem Agarose- gel ausgeschnitten, aufgereinigt und in folgenden Vektor kloniert: pCR2.1 -TOPO (Fir- ma Invitrogen).
Der so erhaltene Vektor pRee019 (61 12 bp) wurde anschließend transformiert, in E. coli amplifiziert. und das KBD-D Gen durch eine Sequenzierung überprüft.
Im folgenden wurde das KBD-D Gen in den Expressionsvektor kloniert. Dazu wurde mit dem Vektor pReeO19 als Templat eine weitere PCR durchgeführt:
Verwendete Oligonukleotide:
HRe26: 5 - CTCGGTACCAACCACTCGCCGCTCAAGACCGCCTTGGCG - 3' (SEQ ID No.: 175)
HRe27: 5'- ATTAAGCTTTTAGAATCGGGAGGTGAAGTTCCTGAGGCT- 3' (SEQ ID No.: 176) 100 μl PCR-Ansatz:
1 Ox PCR-Puffer Pfu Ultra High Fidelity: 10μl pReeO19 (25ng/μl) 1 μ dNTP's.-Mix (IOmM) 10μl
HRe26 (287ng/μl) 1 μ
HRe27 (354ng/μl) 1 μ
Pfu Ultra High Fidelity Polymerase 1 μl
H2O bidest 76μl
Temperaturprogramm
Im Agarosegel wurde ein etwa 2,2 kb großes Fragment detektiert. Die Reaktion wurde gereinigt und im folgenden mit den Restriktionsendonucleasen Kpnl und Hindill geschnitten; das entstandene Fragment wurde in den Expressionsvektor kloniert. So wurde der Vektor pReeO24 erhalten, der im weiteren für die KBD-D Expression eingesetzt wurde.
Expression von KBD-D (SEQ ID No.:167) durch pReeO24 in E. coli
Vorkulturen wurden von Platte oder Glycerinkultur mit pReeO24 transformierten E. coli Stämmen (z.B. TG10) angeimpft. Je nach Größe der Hauptkultur wurde in einem Röhrchen oder einem kleinen Kolben mit LB-Medium angeimpft (ca. 1 :100).
Antibiotika wurden je nach verwendetem Stamm eingesetzt (für mit pReeO24 transformierte E. coli TG10 Ampicillin 100 μg/ml). Es wurde bei 250 rpm und 37°C inkubiert.
Die Hauptkultur wurde ca. 1 :100 mit Vorkultur angeimpft, Hauptkultur: LB- Medium oder geeignetes Minimalmedium mit den jeweiligen Antibiotika. Inkubation bei 250 rpm und 37°C. - Die Induktion erfolgte mit 1 mM IPTG ab einer OD578nm von 1. Dann wurde die Inkubationstemperatur abgesenkt auf Raumtemperatur (etwa 20°C). Die Zellen wurden 2 Stunden nach Induktion abzentrifugiert. (Siehe Abbildung 9)
Beispiel 12: Zell-Aufschluss und Inclusion-Body-Reinigung (pReeO24) Unlöslich exprimierte KBD-D (SEQ ID No.:168) (z.B. in Inclusion Bodies) wurde folgendermaßen gereinigt: Das Zellsediment aus Beispiel 2 wurde in 2OmM Phosphatpuffer mit 100 mM NaCI pH = 7,5 resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Der Aufschluss wurde erneut zentrifugiert (4°C, 12 000g, 20 Minuten). Der Überstnad wurde verworfen. Das Sediment wurde in Puffer A (1 OmM NaHaPO4, 2mM KH2PO4, 10OmM NaCI, 8 M Harnstoff, 5mM DTT) gelöst. Danach wurde nochmals zentrifugiert und der Überstand auf eine Ni-Chelat-Sepharose aufgetragen. Nach dem Auftrag wurde mit Puffer A und 2OmM Imidazol gewaschen. Die Elution von der Säule erfolgte mit Puffer B (1OmM NaH2PO4, 2mM KH2PO4, 10OmM NaCI, 8 M Harnstoff, 5mM DTT, 50OmM Imidazol). Das Eluat wurde fraktioniert aufgefangen und mittels SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, die gereinigte KBD-D enthielten, wurden renaturiert, wie in Beispiel 13 beschrieben.
Beispiel 13: Renaturierung von Keratin-Bindedomäne D (SEQ ID No.:168) Unlöslich exprimierte Keratin-Bindedomäne D (z.B. aus Inclusion Bodies) konnte durch eine Dialyse renaturiert und damit aktiviert werden. Es wurde folgendermaßen vorgegangen:
Die Fraktionen aus Beispiel 12, die gereinigte KBD-D enthielten, wurden in einen Dialyseschlauch (MWCO 12-14KD) gefüllt. Anschließend wurde für ca. 1 Stunde gegen 1 L 8 M Harnstofflsg. dialysiert.
Danach wurde über einen Zeitraum von 12 Stunden kontinuierlich 2 L deionisiertes
Wasser mittels einer Schlauchpumpe zudosiert.
Anschließend wurde der Inhalt des Dialyseschlauchs entnommen. Die so aktivierte
KBD-D wurde für folgende Aktivitätstests eingesetzt.
Beispiel 14: Qualitative Bindung an Haut
Es wurde ein visueller qualitativer Test eingesetzt, um zu überprüfen, ob die KBD-D
(SEQ ID No.:168) an Haut bindet.
Verwendete Lösungen:
Blockierungslsg: Western Blocking Reagent 1921673 Roche (10 x Lsg) in TBS verdünnt
TBS: 20 mM Tris; 150 mM NaCI pH 7,5 TTBS: TBS + 0,05% Tween20
Der erste Schritt ist der Transfer der äußeren Keratinschicht von der Haut auf einen stabilen Träger. Dazu wurde ein Klarsichtklebestreifen fest auf enthaarte menschliche Haut aufgebracht und wieder entfernt. Der Test kann direkt auf dem Klarsichtklebestreifen durchgeführt werden oder die anhaftende Keratinschicht durch erneutes Aufkleben auf einen Glasobjektträger überführt werden. Der Nachweis von Bindung wurde wie folgt vorgenommen: -zur Inkubation mit den verschiedenen Reagentien, Transfer in ein Falcongefäß ggf. Zugabe von Ethanol zur Entfettung, Entfernung von Ethanol und Trocknung der Objektträger
-1 h bei Raumtemperatur inkubiert mit Blocking Puffer -2x 5 min gewaschen mit TTBS -1x 5 min gewaschen mit TBS
-Inkubation mit der zu testenden KBD (gekoppelt an tag - z.B. Hisβ, HA etc.) in TBS / 0,05% Tween 20 während 2-4 h bei Raumtemperatur -Entfernung des Überstands -3x Waschen mit TBS
-1 h bei Raumtemperatur Inkubation mit monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA)- Antikörper mit Peroxidase-Konjugat (1 :2000 in in TBS + 0,01 % Blocking) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] -2x 5min gewaschen mit TTBS -1x 5 min gewaschen mit TBS
-Zugabe von Phosphatasesubstrat (NBT-BCIP; Boehringer MA 1 Tablette/40 ml Wasser 2,5 min; Stopp: mit Wasser) -Optische Detektion des Farbniederschlages mit bloßem Auge oder im Mikroskop. Ein blauer Farbniederschlag, als Reaktion des mit der KBD-D wechselwirkenden Anti- Polyhistidin-AP-Conjugats, wurde auf dem mit KBD-D behandelten Klarsichtklebestreifen sichtbar. Als Negativkontrolle wurde ein Klarsichtklebestreifen nur mit Puffer behandelt. Hier war keine signifikante Blaufärbung zu erkennen. Diese Ergebnisse zeigen, dass KBD-D an das Hautkeratin auf dem Klarsichtklebestreifen gebunden hat.
Beispiel 15: Quantitative Bindung an Haut und Haar
Um die Bindungsstärke der KBD-D (SEQ ID No.:168) an Haut und Haar im Vergleich zur KBD-B (SEQ ID No. :166) zu untersuchen, wurde ein quantitativer Test durchgeführt. Bei diesem Test wurde zunächst Haar mit KBD-B bzw. KBD-D inkubiert und ü- berschüssige KBD-B bzw. -D abgewaschen. Anschließend wurde ein Antikörper-
Peroxidase-Konjugat über das His-Tag der KBD-B bzw. -D gekoppelt. Nicht gebundenes Antikörper-Peroxidase-Konjugat wurde erneut abgewaschen. Das gebundene An- tikörper-Peroxidase-Konjugat kann ein farbloses Substrat (TMB) in ein farbiges Produkt umsetzen, das photometrisch bei 405 nm vermessen wurde. Die Stärke der Ab- Sorption zeigt die Menge an gebundener KBD-B bzw. -D an.
Der Test auf Bindung an Haur wurde mit humanen Keratinocyten in Mikrotiterplatten folgendermaßen durchgeführt.
- 2 x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
- Zugabe von 1 ml 1 % BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen (900 rpm). - Entfernung des Überstands
- Zugabe von 100 μg KBD in PBS mit 0,05 % Tween 20; Inkubation 2 h bei Raumtemperatur und leichten Schwenkbewegungen (900 rpm).
-Entfernung des Überstands - 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
- Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-His6-Antikörper während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung (900 rpm)
- 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
- Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml / Eppendorfgefäß; Zusammensetzung s.u.) Reaktion bis zur Blaufärbung (ca. 90 Sekunden).
- Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abgestoppt.
- Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen
Peroxidasesubstrat (kurz vorher angesetzt): 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO)
+ 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
Um die Haarbindung der KBD-D im Vergleich zur KBD-B zu charakterisieren, wurde der folgende Bindungsassay durchgeführt:
5 mg Haare (human) wurden in 5 mm lange Stücke geschnitten und in Eppendorfgefä- ße (Protein-Lowbind) überführt.
- Zugabe von 1 ml Ethanol zur Entfettung
Zentrifugation, Entfernung von Ethanol und Waschung der Haare mit H2O Zentrifugation, Entfernung des Überstands
Zugabe der zu testenden Keratinbindedomäne (gekoppelt an tag - z.B. Hisβ, HA etc.) in 1 ml PBS / 0,05 % Tween 20; Inkubation für 2 h bei Raumtempera- tur bei leichten Schwenkbewegungen.
Zentrifugation, Entfernung des Überstands
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA)-Antikörper mit
Peroxidase-Konjugat (1 :2000 in PBS / 0,05 % Tween 20) [Monoclonal Antipo- lyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma
Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung 3 x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20 Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml / Eppendorfgefäß) Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (90 Sekunden). - Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen.
Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten): 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
BSA = Bovine serum albumin
PBS = Phosphat gepufferte Salzlösung
Tween 20 = Polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n ca. 20
TMB = 3, 5, 3, '5' Tetramethylbenzidin
Keratin-Bindedomäne Absorption bei 405nm
KBD-D an Haut 3,69
KBD-D an Haut nach 10%iger SDS-Behandlung 3,15
KBD-B an Haut 0,93
KBD-B an Haut nach 10%iger SDS-Behandlung 0,185
Tab.5 a: Quantitative Bindung von KBD-D bzw. KBD-B an Haut. Die aufgeführten Absorptionswerte sind auf die Oberfläche (von Haut bzw. Haar) normierte Werte
Keratin-Bindedomäne Absorption bei 405nm
KBD-D an Haar 0,88 KBD-D an Haar nach 10%iger SDS-Behandlung 0,62
Tab.5 b Quantitative Bindung von KBD-D an Haar. Die aufgeführten Absorptionswerte sind auf die Oberfläche normierte Werte relativer Absorptionsverlust
Keratin-Bindedomäne nach 10% iger SDS-
Behandlung in %
KBD-D an Haut nach 10%iger SDS-Behandlung 15
KBD-B an Haut nach 10%iger SDS-Behandlung 80
KBD-D an Haar nach 10%iger SDS-Behandlung 30
KBD-B an Haar nach 10%iger SDS-Behandlung 86
Tab.5 c: Quantitative Bindung von KBD-D und KBD-B an Haut und Haar nach 10% iger SDS-Behandlung in % relativ zum KBD-D und KBD-B unbehandeltem Haar bzw. Haut. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Protein KBD-D an Haar und stärker an Haut binden kann (siehe Tab. 5). Die Bindung der KBD-D (SEQ ID No.: 168) wird im Gegenteil zur KBD-B (SEQ ID No.: 166) durch eine Waschung mit einer bis zu 10%igen SDS-Lösung nur schwächer beeinflusst (siehe Tab. 5a).
Beispiel 16: Überprüfung des Kopplungserfolges (Ellmanntest)
Der Erfolg der Effektorkopplung wurde über drei verschiedene Tests verfolgt:
(i) Ellmanntest, bei dem die Anzahl freier Cys-SH-Gruppen im Protein vor und nach der Effektorkopplung bestimmt werden kann. Hier zeigt eine starke
Reduzierung der freien SH-Gruppen nach der Kopplung einen guten Reaktionsablauf an.
(ii) Aktivitätstest, bei dem die Bindung der KBD-B (SEQ ID No.: 166) mit und ohne gekoppeltem Effektor an Haar gemessen werden kann. Eine gute Re- aktionsführung sollte die Aktivität von KBD-Effektor gegenüber ungekoppelter KBD-B (SEQ ID No.: 166) nicht vermindern (siehe Beispiel 17).
(iii) sichtbare Färbung von Haar bzw. Haut durch die erfolgreiche Kopplung des Farbstoffes an die KBD-B (SEQ ID No.: 166) (siehe Beispiel 20).
Zu (iii): Der Erfolg der Effektorkopplung wurde mittels Ellmanntest folgendermaßen geprüft:
Benötigte Materialien:
- Ellmannsreagenz: 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB); 4mg / 1 ml in 0,1 M Na- Phosphat Puffer
- 0,1 M Na-Phosphat Puffer pH 8,0
- Cysteinlösung (26,3 mg Cystein hydrochlorid monohydrate / 100ml Na-Phosphat Puffer). Die Lösungen wurden und dürfen erst kurz vor dem Gebrauch angesetzt werden.
1. Jeweils 25 μl, 50 μl, 100 μl, 150 μl 200 μl und 250 μl Cysteinlösung wurden in Reagenzgläser (13 x 100 mm) für eine Eichgerade pipettiert. Die zu bestimmenden Proteinproben wurden in separate Reagenzgläser abgefüllt (Volumen <= 250 μl). Von der zu testenden KBD wurden mindestens eine Menge von 1 mg pro Reaktionsansatz abge- füllt. Bei den Reagenzgläsern wurde nun das Gesamtvolumen auf jeweils 250 μl mit Na-Phosphat Puffer eingestellt. Wenn das Volumen von 250 μl Probe überschritten war (aufgrund der benötigten 1 mg KBD), wurde dies beim Auffüllen bei Punkt 2 mit 2,5 ml Na-Phosphat Puffer berücksichtigt. 2. Zugabe von je 50 μl Ellmannsreagenz und 2,5 ml Na-Phosphat Puffer. Kurz mischen und 15 Min bei RT inkubieren.
3. Messen der Absorbtion bei 412nm
4. Erstellen der Eichgeraden, eintragen und ablesen der Werte der zu bestimmenden Proteinproben.
Die Auswertung von Ellmanntests nach Kopplungsreaktionen mit verschiedenen Effek- toren zeigt, dass 2/3 der freien Thiolgruppen an aktivierte Reaktivfarbstoffe (siehe Beispiel 19) oder Farbstoff mit Maleinimidocapronsäurelinker gekoppelt werden können, wenn das Mischungsverhältnis KBD-B : Farbstoff bei 1 : 2 liegt.
Beispiel 17: Haarbindeaktivität von KBD-B-Farbstoff Um zu überprüfen, ob KBD-B (SEQ ID No.: 166) auch mit gekoppeltem Farbstoff an Haar bindet, wurde ein quantitativer Bindungsassay durchgeführt (siehe Abb. 9): Bei diesem Test wurde zunächst Haar mit KBD-B-Farbstoff inkubiert und nicht gebundenes KBD-B-Farbstoff abgewaschen. Anschließend wurde eine Peroxidase über das His- Tag der KBD-B gekoppelt. Nicht gebundene Peroxidase wurde erneut abgewaschen. Die gebundene Peroxidase kann ein farbloses Substrat (TMB) in ein farbiges Produkt umsetzen, das photometrisch bei 405 nm vermessen wurde. Die Stärke der Absorption zeigt die Menge an gebundenem KBD-B-Panthenol an. Als Vergleichsprobe wurde KBD-B ohne Farbstoff gewählt. Zur genauen Durchführung siehe Beispiel 10.
Beispiel 18: Aktivierung der in den Reaktivfarbstoffen enthaltenen Vinylsulfon- Reaktivanker
0,075 mol Farbstoff (14-264, siehe Tabelle 6) wurde in 800 ml Wasser gelöst und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 25 gew.%iger NaOH Lösung auf 10,5 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH- Wert bei 10,5 gehalten wurde bis es stabil geblieben ist. Danach wurde der pH-Wert durch Zugabe von 21 gew.%iger HCl Lösung auf 4,5 gestellt und die Reaktionsmischung in Vakuum eingedampft (siehe Abbildung 10). Beispiel 19: Kopplung von Reaktivfarbstoffen an KBD-B (SEQ ID No.: 166)
Bei der Umsetzung von Farbstoffen mit der KBD-B sollten nahezu physiologische Bedingungen eingehalten werden, da das Protein sich sonst entfaltet und es zu einer Prezipitation kommt. Das bedeutet im Wesentlichen, dass keine reinen organischen Lösungsmittel verwendet werden können, sowie ein pH-Wert nahe dem Neutralpunkt gewählt werden sollte. Außerdem ist es wichtig, dass die Reaktionstemperatur für die Kopplung 45° C nicht übersteigen sollte. Zur Kopplung von Reaktivfarbstoffen wurden Cysteine in der KBD (SEQ ID No.: 166) genutzt. So verfügt KBD-B (SEQ ID No.: 166) über vier Cysteine. Davon liegen zwei Cysteine im Inneren der Struktur und sind für die Kopplung eines Effektors nicht zugänglich (erkennbar an der Kristallstruktur). Die zwei verbleibenden Cysteine nahe des N-Terminus (Aminosäure Positionen 14 und 83; siehe Sequenz KBD-B (SEQ ID No.: 166) sind für eine Effektorkopplung zugänglich.
Der kopplungsfähige Reaktivfarbstoff wurde an die KBD-B (SEQ ID No.: 166) über mindestens eine der beiden freien SH-Gruppen eines Cysteins gekoppelt. Idealerweise erfolgt die Reaktion zwischen KBD-B und aktiviertem Farbstoff daher im molaren Ver- hältnis von 1 :2.
Beispiel 19a: Kopplung von Reaktivfarbstoffen an KBD-D (SEQ ID No.: 168)
Zur Kopplung des aktivierten Farbstoffes können analog zur KBD-B auch Cysteine in der KBD-D (SEQ ID No.: 168) genutzt werden. So verfügt KBD-D (SEQ ID No.: 168) über 24 Cysteine. Weiterhin können durch eine gerichtete Mutagenese gezielt kopplungsfähige Cysteinreste eingefügt werden.
Das Kopplung des Farbstoffes an die KBD-D (SEQ ID No.: 168) kann somit analog zu der in Beispiel 19 beschriebenen Art und Weise erfolgen und die Farbstoffe (14_1 bis 14-366) wie unter 19 b) für die KBD-B beschrieben auch unter Verwendung der KBD-D erfolgen (siehe Bsp. 65). Die Farbstoffe 14_153, 14_154, 14-155, 14_156, 14_181 , 14_182, 14_183, 14_276 und 14_289 sind bereits in der Vinylsulfonform, d. h. diese brauchen nicht aktiviert (voreliminiert) werden, sondern können (entsprechend Abbildung 1 1 ) mit der KBD-D direkt umgesetz werden. Der so gewonnene KDB-D- Reaktivfarbstoff könnte analog zu dem KDB-D-Reaktivfarbstoff aus Bsp. 65 in die kos- metischen Formulierungen gemäß den Beispielen 66-108 eingesetzt werden.
Beispiel 19 b) Kopplung der KBD-B (SEQ ID No.: 166) an
a) Vinylsulfon Farbstoffe (Formel 1): Die Reaktion zwischen KBD-B und aktiviertem Farbstoff erfolgt im molaren Verhältnis von 1 :2, da die KBD-B über zwei freie Cysteine für die Effektorkopplung verfügt. Die für die Kopplung gewählten Vinylsulfonfarbstoffe werden in der Regel in der Schwefelsäureester-Form synthetisiert und müssen deshalb vor der Umsetzung mit KBD-B zum Vinylsulfon-Form aktiviert werden, weil die Farbstoffe nur in ihrer Vinylsulfon Form mit nukleophilen Gruppen reagieren können. Die Aktivierung erfolgt unter alkalischen Bedingungen, dabei wird der Farbstoff in wässriger Lösung bei Raumtemperatur für 2 Minuten auf pH 1 1 eingestellt. Danach wird vor der Zugabe des Proteins der pH mit Salzsäure auf 7-8 eingestellt (siehe auch Beispiel 18). Die Reaktionslösung wird 30 min bei 30° C, pH 7-8 leicht geschüttelt. Dabei reagieren aktivierte Vinylsulfonfarbstoffe (z.B. 14-264, siehe Tabelle 6) mit den Thiol-Gruppen der freien Cysteine der KBD (siehe Abbildung 2). In analoger Weise können folgende Farbstoffe (14_1 bis 14-291 ) mit der KBD umgesetzt werden. Die Farbstoffe 14_153, 14_154, 14-155, 14_156, 14_181 , 14_182, 14_183, 14_276 und 14_289 sind bereits in der Vinylsulfonform, d. h. diese brauchen nicht aktiviert (voreliminiert) werden, sondern können (entsprechend Abbildung 1 1) mit der KBD direkt umgesetz werden. Die Farbe des jeweiligen Produktes ist angegeben.
Tabelle 6
b) Farbstoffe der Formeln 3, 4, 5:
Alternativ können auch Farbstoffe (z.B. Farbstoff 14_354, Abbildung 12) verwendet werden, die ein substituierbares Halogenatom in ihren Reaktivanker aufweisen. Diese Farbstoffe können ohne Aktivierung mit den SH-Gruppen der KBD-B umgesetzt werden. Die Reaktion zwischen KBD und Farbstoff 14_354 erfolgt im molaren Verhältnis von 1 :2, da die KBD-B über zwei freie Cysteine für die Effektorkopplung verfügt. Die Reaktionslösung wird 30 min bei 30° C, pH 8-9 leicht geschüttelt.
In analoger Weise können folgende Farbstoffe (14_292 bis 14_366) mit KBD-B (SEQ ID No.: 166) oder KBD-D (SEQ ID No.: 168) umgesetzt werden. Die Farbe des jeweiligen Produktes ist angegeben.
Tabelle 7
Im Anschluss der unter a) und b) beschriebenen Reaktionen kann ein Molekül mit freien SH-Gruppen (z.B. Cystein) zugegeben werden, das nicht umgesetzten Farbstoff inaktiviert. Sollen die hier verwendeten Farbstoffe nach der Synthese nicht gereinigt werden, enthalten sie sowohl reaktive, als auch nicht reaktive Nebenkomponenten. Die Nebenkomponenten, die keinen Reaktivanker aufweisen, bzw. an deren Reaktivanker z.B. freies Cystein nach der eigentlichen KBD-Kopplungsreaktion gebunden wurde, reagieren nicht mit den KBD-B Molekülen.
Solche Nebenkomponenten können nach der Kopplungsreaktion oder z.B. beim Haarfärbeprozesses entfernt werden. Eine Möglichkeit besteht darin, dass man die mit dem Farbstoff umgesetzte KBD-B reinigt, z.B. durch Säulenchromatographie. Möglich ist auch die Reaktion zwischen KBD-B und dem Reaktivfarbstoff in einer Art „Säuleneak- tor" durchzuführen. Dabei könnte die KBD-B an eine Nickel-Affinitätssäule gekoppelt werden, der Farbstoff an KBD-B gebunden und die unfixierten Farbstoffreste direkt herausgewaschen werden. Anschließend kann man den KBD-B-Farbstoff von der Säule eluieren. Eine andere Möglichkeit ist, dass die mit dem Farbstoff umgesetzte KBD-B zusammen mit den nicht reaktiven Nebenkomponenten auf Haar appliziert wird und die nicht gebundenen Farbstoffanteile vom Haar heruntergewaschen werden. Dazu eignet sich beispielsweise eine 15%ige Tween 20 Lösung in Wasser.
Beispiel 20. Haarfärbung mit KBD-B-Farbstoff-Kopplungen
Zunächst wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren ein roter Reaktivfarbstoff 14_264 an KBD-B (SEQ ID No.: 166) gekoppelt. Um zu zeigen, dass die Bindung der KBD-B-Farbstoff-Kopplung an Haar durch das Protein und nicht durch den freien Farbstoff selbst vermittelt wird, wurde der gleiche Farbstoff jeweils nur mit Cystein aber ohne KBD-B behandelt. Anschließend wurden KBD-B-14_264 bzw. 14_264 auf jeweils 5 mg Haar gegeben, kurz inkubiert und nicht gebundener KBD-B-Farbstoff bzw. reiner Farbstoff mit einer 15%igen Tween 20-Lösung abgewaschen. Das Ergebnis zeigt eindeutig, dass die Bindung an das Haar durch die KBD-B vermittelt wird und eine Färbung des Haares stattgefunden hat.
Möchte man hingegen die Haare wieder entfärben, eignet sich eine Wäsche mit einem SDS-Anteil von 15 %, oder eine Behandlung mit einer keratinhaltigen Lösung.
Im Folgenden sind erfindungsgemäße dermokosmetische Zubereitungen beschrieben, enthaltend das gemäß Beispiel 19 hergestellte keratinbindende Effektormolekül (Kera- tinbindedomäne gemäß SEQ ID No.: ID 166 gekoppelt mit dem Farbstoff 14_264). Besagtes keratinbindendes Effektormolekül wird in den folgenden Beispielen als Keratin- Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 bezeichnet. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass auch alle anderen in den Tabellen 6 und 7 beschriebenen Farbstoffe mit der KBD gemäß Beispiel 19, 19 a oder 19 b gekoppelt werden können und in den unten genannten Zubereitungen verwendet werden können.
Beispiel 21 : Shampoo (Basisformulierung ohne Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff)
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,25 Polyquaternium-16
2,00 Laureth-3 q.s. Citric Acid
57,75 Aqua dem.
B 3,00 PEG-150 Distearate
Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Phase B zugeben und auf ca. 50°C erwärmen. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Der Gehalt an Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 in den folgenden Beispielen bezieht sich auf 100% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264. Der erfin- dungsgemäße Wirkstoff kann sowohl in reiner Form als auch als wässerige Lösung eingesetzt werden. Im Falle der wässerigen Lösung muss der Gehalt an Wasser dem. in der jeweiligen Formulierung angepasst werden. Beispiel 22: Haarfärbeshampoo
Variante 1 % Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,25 Polyquaternium-16
2,00 Laureth-3 q.s. Citric Acid
1 ,00 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
57,75 Aqua dem.
B 3,00 PEG-150 Distearate
Variante 2
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,25 Polyquaternium-16
2,00 Laureth-3 q.s. Citric Acid
5,00 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
53,75 Aqua dem.
B 3,00 PEG-150 Distearate
Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Phase B zugeben und auf ca. 40°C erwärmen. Unter Rühren schnell auf Raumtemperatur abkühlen. Beispiel 23: Colour Styling Mousse
Variante 1
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 6,70 Acrylates Copolymer
0,60 Aminomethyl Propanol
0,20 Ceteareth-25
0,20 Panthenol
0,20 Hydroxyethylcellulose
10,00 Alcohol
69,97 Aqua dem.
1 ,0 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
C 10,00 Propane/Butane
Variante 2
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 6,70 Acrylates Copolymer
0,60 Aminomethyl Propanol
0,20 Ceteareth-25
0,20 Panthenol
0,20 Hydroxyethylcellulose
10,00 Alcohol
69,97 Aqua dem.
0,5 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
10,00 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B einwiegen und klar lösen, dann in Phase A einrühren. Mit Phase C abfüllen. Beispiel 24: Colour-Styling-Mousse
Variante 1
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 7,00 Polyquaternium-46 2,00 Polyquaternium-1 1
78,87 Aqua dem.
2,0 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
C 10,00 Propane/Butane
Variante 2
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 7,00 Polyquaternium-46
2,00 Polyquaternium-1 1
78,87 Aqua dem.
1 ,0 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264
C 10,00 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B einwiegen und klar lö- sen, dann in Phase A einrühren. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 25: Zwei Strähnen blondes, ungebleichtes Haar: Euro-Natur-Haar, Farbe 9/0, naturblond (2g) werden mit 0,5g des Haarfärbeshampoos Beispiel 22/Variante 1 behandelt und das Haarfärbeshampoo wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 21 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein blondes Haar mehr zu detek- tieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 21 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster vergli- chen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 26:
Zwei Strähnen weißes Haar: selektiertes, weißes Euro-Natur-Haar (2g) werden mit 0,5g des Haarfärbeshampoos Beispiel 22/Variante 1 behandelt und das Haarfärbe- shampoo wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 21 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein weißes Haar mehr zu detektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 21 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster verglichen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Visuell ist kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 27
Zwei Strähnen blondes, ungebleichtes Haar: Euro-Natur-Haar, Farbe 9/0, naturblond
(2g) werden mit 0,5g des Colour Styling Mousse Beispiel 23/Variante 2 behandelt und das Colour Styling Mousse wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 21 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein blondes Haar mehr zu detektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt. In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 21 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster verglichen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 28:
Zwei Strähnen weißes Haar: selektiertes, weißes Euro-Natur-Haar (2g) werden mit 0,5g des Colour Styling Mousse Beispiel 23/Variante 2 behandelt und das Colour Styling Mousse wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 21 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein weißes Haar mehr zu detektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 21 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster verglichen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen. Beispiel 29:
Zwei Strähnen blondes, ungebleichtes Haar: Euro-Natur-Haar, Farbe 9/0, naturblond (2g) werden mit 0,5g des Colour Styling Mousse Beispiel 24/Variante 1 behandelt und das Colour Styling Mousse wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 21 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein blondes Haar mehr zu de- tektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 21 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster vergli- chen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 30: Zwei Strähnen weißes Haar: selektiertes, weißes Euro-Natur-Haar (2g) werden mit 0,5g des Colour Styling Mousse Beispiel 23/Variante 1 behandelt und das Colour Styling Mousse wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 21 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein weißes Haar mehr zu detektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 21 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster verglichen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erken- nen.
Beispiel 31 : Verwendung der KBD in einer Emulsion zur Tagespflege - Typ O/W
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
69,8 Aqua dem. C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 0,2 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Ascorbate, Tocopherol, Retinol
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14 _264
E q.s. Sodium Hydroxide
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
65,8 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 0,2 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Ascorbate, Tocopherol, Retinol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
E q.s. Sodium Hydroxide
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C in die kombinierten Phasen A und B einrühren und nochmals homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase D zugeben, den pH-Wert mit Phase E auf etwa 6.5 einstellen, homogenisieren und unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Hinweis: Die Formulierung wird ohne Schutzgas hergestellt. Die Abfüllung muß in sauerstoffundurchlässige Verpackungen, z.B. Aluminiumtuben erfolgen.
Beispiel 32: Verwendung der KBD in einer schützenden Tagescreme - Typ O/W WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
70,6 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 1 ,0 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
E q.s. Sodium Hydroxide
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
66,6 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 1 ,0 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
E q.s. Sodium Hydroxide Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C in die kombinierten Phasen A und B einarbeiten und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen. Phase D hinzugeben, den pH-Wert mit Phase E auf ca. 6.5 einstellen und homogenisieren. Un- ter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Beispiel 33: Verwendung der KBD in einer Gesichtsreinigungslotion - Typ O/W WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI) A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
1 ,5 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasilosane
2,0 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
B 3,5 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer C 1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Konservierungsmittel q.s. Parfümöl
D 3,0 Polyquaternium-44 0,5 Cocotrimonium Methosulfate
0,5 Ceteareth-25
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
4,0 Propylene Glycol
0,1 Disodium EDTA 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
60,7 Aqua dem.
WS 5%: % Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
1 ,5 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasilosane
2,0 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI B 3,5 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
C 1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Konservierungsmittel q.s. Parfümöl D 3,0 Polyquaternium-44
0,5 Cocotrimonium Methosulfate
0,5 Ceteareth-25 2,0 Panthenol, Propylene Glycol
4,0 Propylene Glycol
0,1 Disodium EDTA
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5 % Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
56,7 Aqua dem.
Herstellung: Phase A lösen. Phase B in Phase A einrühren, Phase C in die kombinierten Phasen A und B einarbeiten. Phase D lösen, in die kombinierten Phasen A, B und C einrühren und homogenisieren. 15min nachrühren.
Beispiel 34: Verwendung der KBD in einem Daily Care Body Spray
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
1 ,0 Polyquaternium-44
3,0 Propylene Glycol
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
1 ,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
10,0 Octyldodecanol
0,5 PVP
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
3,0 C12-15 Alkyl Benzoate
3,0 Glycerin
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,3 Bisabolol
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
59,2 Alcohol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
1 ,0 Polyquaternium-44
3,0 Propylene Glycol
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
1 ,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
10,0 Octyldodecanol
0,5 PVP
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
3,0 C12-15 Alkyl Benzoate
3,0 Glycerin
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,3 Bisabolol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
55,2 Alcohol
Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und klar lösen. Beispiel 35: Verwendung der KBD in einem Hautpflegegel
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,6 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
15,0 Alcohol
0,1 Bisabolol
0,5 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 3,0 Panthenol
0,6 Carbomer
1 ,0 wässrige Lösung mit ca . 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
75,4 Aqua dem,
C 0,8 Triethanolamine
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,6 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
15,0 Alcohol
0,1 Bisabolol
0,5 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 3,0 Panthenol
0,6 Carbomer
5,0 wässrige Lösung mit ca . 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
71 ,4 Aqua dem,
C 0,8 Triethanolamine
Herstellung: Die Phase A klar lösen. Phase B quellen lassen und mit Phase C neutralisieren. Phase A in die homogenisierte Phase B einrühren und homogenisieren.
Beispiel 36: Verwendung der KBD in einer After Shave Lotion
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Tocopheryl Acetate
1 ,0 Bisabolol
0,1 Parfümöl
0,3 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
B 15,0 Alcohol 1 ,0 Panthenol
3,0 Glycerin
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 0,1 Triethanolamine
63,5 Aqua dem.
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI) A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Tocopheryl Acetate
1 ,0 Bisabolol
0,1 Parfümöl
0,3 Acrylat.es/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer B 15,0 Alcohol
1 ,0 Panthenol
3,0 Glycerin
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 0,1 Triethanolamine
59,5 Aqua dem.
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B lösen, in Phase A einarbeiten und homogenisieren.
Beispiel 37: Verwendung der KBD in einer After Sun Lotion
WS
% Inhaltsstoff (INCI)
A 0,4 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
15,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 1 ,0 Panthenol
15,0 Alcohol
3,0 Glycerin
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
63,2 Aqua dem,
C 0,2 Triethanolamine
WS 5%: % Inhaltsstoff (INCI)
A 0,4 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
15,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 1 ,0 Panthenol
15,0 Alcohol
3,0 Glycerin
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
59,2 Aqua dem,
C 0,2 Triethanolamine
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B unter Homogenisieren in Phase A einrühren. Mit Phase C neutralisieren und erneut homogenisieren.
Beispiel 38: Verwendung der KBD in einer Sonnenschutzlotion
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 4,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
3,0 Octocrylene
2,5 Di-CI 2-13 Alkyl Malate
0,5 Tocopheryl Acetate
4,0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Distearate
B 3,5 Cetearyl Isononanoate
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
5,0 Isohexadecane
2,5 Di-CI 2-13 Alkyl Malate
3,0 Titanium Dioxide, Trimethoxycaprylylsilane
C 5,0 Glycerin
1 ,0 Sodium Cetearyl Sulfate
0,5 Xanthan Gum
61 ,7 Aqua dem.
D 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
1 ,0 Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Butylparaben, Prof paraben, Isobutylparaben 0,3 Bisabolol
WS 5%: % Inhaltsstoff (INCI)
A 4,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
3,0 Octocrylene
2,5 Di-CI 2-13 Alkyl Malate 0,5 Tocopheryl Acetate
4,0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Distearate
B 3,5 Cetearyl Isononanoate
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
5,0 Isohexadecane 2,5 Di-CI 2-13 Alkyl Malate
3,0 Titanium Dioxide, Trimethoxycaprylylsilane
C 5,0 Glycerin
1 ,0 Sodium Cetearyl Sulfate
0,5 Xanthan Gum 57,7 Aqua dem.
D 5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
1 ,0 Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Butylparaben, Propyl- paraben, Isobutylparaben 0,3 Bisabolol
Herstellung: Die Komponenten der Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C auf ca. 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase D zugeben und nochmals homogenisieren.
Beispiel 39: Verwendung der KBD in einer Sonnenschutzlotion - Typ O/W WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
3,0 Tribehenin
2,0 Cetearyl Alcohol
2,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
1 ,0 Ethylhexyl Triazone
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
7,0 Isopropyl Myristate
B 5,0 Zinc Oxide, Triethoxycaprylylsilane
C 0,2 Xanthan Gum
0,5 Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer, Squalane, Polysorbate 60
0,2 Disodium EDTA
5,0 Propylene Glycol
0,5 Panthenol
60,9 Aqua dem.
D 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Phenoxyethanol, Methylparaben, Butylparaben, Ethylparaben, Propylpa- raben, Isopropylparaben 1 1 ,,00 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI) A A 2 2,,00 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
3,0 Tribehenin
2,0 Cetearyl Alcohol
2,0 Cetearyl Ethylhexanoate 5 5,,00 Ethylhexyl Methoxycinnamate
1 ,0 Ethylhexyl Triazone
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
7,0 Isopropyl Myristate
B 5,0 Zinc Oxide, Triethoxycaprylylsilane C C 0 0,,22 Xanthan Gum
0,5 Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer,
Squalane, Polysorbate 60
0,2 Disodium EDTA
5,0 Propylene Glycol 0 0,,55 Panthenol
56,9 Aqua dem.
D 5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Phenoxyethanol, Methylparaben, Butylparaben, Ethylparaben, Propylpa- raben, Isopropylparaben
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
Herstellung: Phase A auf ca. 80°C erwärmen, Phase B einrühren und 3min homogeni- sieren. Phase C ebenfalls auf 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Abkühlen auf ca. 40°C, Phase D einrühren und nochmals homogenisieren. Beispiel 40: Verwendung der KBD in einer Sonnenschutzlotion - Typ O/W
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,5 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
1 ,5 Ceteareth-25
7,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
0,5 Bees Wax
3,0 Cetearyl Alcohol
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
B 5,0 Titanium Dioxide, Silica, Methicone, Alumina
C 3,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
0,3 Xanthan Gum
1 ,0 Decyl Glucoside
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
56,3 Aqua dem.
D 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,5 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
1 ,5 Ceteareth-25
7,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
0,5 Bees Wax
3,0 Cetearyl Alcohol
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
B 5,0 Titanium Dioxide, Silica, Methicone, Alumina
C 3,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
0,3 Xanthan Gum
1 ,0 Decyl Glucoside
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
52,3 Aqua dem. D 5,0 wässrige Lösung mit
14_ .264
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
Herstellung: Phase A auf ca. 80°C erwärmen, Phase B einrühren und 3min homogenisieren. Phase C ebenfalls auf 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombi- nierten Phasen A und B einrühren. Abkühlen auf ca. 40°C, Phase D einrühren und nochmals homogenisieren.
Beispiel 41 : Verwendung der KBD in einem Fußbalsam
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
5,0 Cetearyl Ethylhexanoate
4,0 Cetyl Alcohol
4,0 Glyceryl Stearate
5,0 Mineral OiI
0,2 Menthol
0,5 Camphor
B 69,3 Aqua dem. q.s. Konservierungsmittel
C 1 ,0 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate
D 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
5,0 Witch Hazel Extract
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
5,0 Cetearyl Ethylhexanoate
4,0 Cetyl Alcohol
4,0 Glyceryl Stearate
5,0 Mineral OiI
0,2 Menthol
0,5 Camphor B 65,3 Aqua dem. q.s. Konservierungsmittel
C 1 ,0 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate
D 5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
5,0 Witch Hazel Extract
Herstellung: Die Komponenten der Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A unter Homogenisieren einrühren. Unter Rühren abkühlen auf ca. 40°C, die Phasen C und D hinzugeben und kurz nachhomogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Beispiel 42: Verwendung der KBD in einer W/O Emulsion mit Bisabolol
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
8,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate
15,0 Mineral OiI
0,3 Magnesium Stearate
0,3 Aluminum Stearate
2,0 PEG-45/Dodecyl Glycol Copolymer
B 5,0 Glycerin
0,7 Magnesium Sulfate
55,6 Aqua dem.
C 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Tocopheryl Acetate
0,6 Bisabolol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
8,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate
15,0 Mineral OiI
0,3 Magnesium Stearate
0,3 Aluminum Stearate
2,0 PEG-45/Dodecyl Glycol Copolymer
B 5,0 Glycerin 0,7 Magnesium Sulfate
51 ,6 Aqua dem.
C 5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 0,5 Tocopheryl Acetate
0,6 Bisabolol
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 85°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase C hinzugeben und nochmals kurz homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Zusammenstellung Rezepturen für Patent Keratin-Bindedomäne - Haircare
Beispiel 43: Schaumconditioner mit Festiger
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 PVP/VA Copolymer 0,2 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
0,2 Ceteareth-25
0,5 Dimethicone Copolyol q.s. Parfümöl
10.0 Alcohol 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
68.1 Aqua dem.
B 10,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 PVP/VA Copolymer
0,2 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate 0,2 Ceteareth-25
0,5 Dimethicone Copolyol q.s. Parfümöl
10.0 Alcohol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
64.1 Aqua dem.
B 10,0 Propane/Butane Herstellung: Die Komponenten der Phase A zusammenwiegen, rühren bis alles gelöst ist und mit Phase B abfüllen.
Beispiel 44: Haarfärbeschaumconditioner
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,0 Polyquaternium-4
0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
91 ,5 Aqua dem.
B 6,0 Propane/Butane
WS 5% % Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,0 Polyquaternium-4
0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel 87,5 Aqua dem. B 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A zusammenwiegen, rühren bis alles klar gelöst ist und mit Phase B abfüllen.
Beispiel 45: Haarfärbeschaumconditioner
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,0 Polyquaternium-1 1 0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264 q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
91 ,5 Aqua dem.
B 6,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,0 Polyquaternium-1 1 0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel 87,5 Aqua dem.
B 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A zusammenwiegen, rühren bis alles klar gelöst ist und mit Phase B abfüllen.
Beispiel 46: HaarfärbeStyling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 0,5 Laureth-4 q.s. Parfümöl
B 77,3 Aqua dem.
10,0 Polyquaternium-28 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol 0,1 PEG-25 PABA
0,2 Hydroxyethylcellulose
C 10,0 HFC 152 A
WS 5% % Inhaltsstoff (INCI) A 0,5 Laureth-4 q.s. Parfümöl
B 73,3 Aqua dem.
10,0 Polyquaternium-28
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
0,2 Hydroxyethylcellulose
C 10,0 HFC 152 A
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 47: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 78,5 Aqua dem.
6,7 Acrylates Copolymer
0,6 AMP
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
0,2 Hydroxyethylcellulose
C 10,0 HFC 152 A
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 74,5 Aqua dem.
6,7 Acrylates Copolymer
0,6 AMP
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14..264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
0,2 Hydroxyethylcellulose
C 10,0 HFC 152 A
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 48: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 % % Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 7,70 Polyquaternium-44 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264 q.s. Konservierungsmittel
79,3 Aqua dem.
C 10,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl B 7,70 Polyquaternium-44
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264 q.s. Konservierungsmittel
75,3 Aqua dem. C 10,0 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B klar lösen, dann Phase B in Phase A einrühren. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen, mit Phase C abfüllen.
Beispiel 49: Haarfärbe Styling Schaum WS 5 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 72,32 Aqua dem.
2,00 VP/Acrylates/Lauryl Methacrylate Copolymer
0,53 AMP
1 ,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264 0 0,,2200 Ceteareth-25
0,50 Panthenol
0,05 Benzophenone-4
0,20 Amodimethicone, Cetrimonium Chloride, Trideceth-12
15,00 Alcohol C C 0 0,,2200 Hydroxyethylcellulose
D 6,00 Propane/Butane
WS 5 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
AA 22,,0000 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 68,32 Aqua dem.
2,00 VP/Acrylates/Lauryl Methacrylate Copolymer
0,53 AMP
55,,0000 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,20 Ceteareth-25
0,50 Panthenol
0,05 Benzophenone-4
00,,2200 Amodimethicone, Cetrimonium Chloride, Trideceth-12
15,00 Alcohol
C 0,20 Hydroxyethylcellulose
D 6,00 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Phase C in der Mischung aus A und B Iquellen lassen, dann den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Mit Phase D abfüllen
Beispiel 50: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI) A 2,00 Cetrimonium Chloride q.s. Parfümöl
B 67,85 Aqua dem.
7,00 Polyquaternium-46
1 ,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,20 Ceteareth-25
0,50 Panthenol
0,05 Benzophenone-4 0 0,,2200 Amodimethicone, Cetrimonium Chloride, Trideceth-12
15,00 Alcohol
C 0,20 Hydroxyethylcellulose
D 6,00 Propane/Butane
WS 5 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cetrimonium Chloride q.s. Parfümöl
B 63,85 Aqua dem.
77,,0000 Polyquaternium-46
5,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,20 Ceteareth-25
0,50 Panthenol
00,,0055 Benzophenone-4
0,20 Amodimethicone, Cetrimonium Chloride, Trideceth-12
15,00 Alcohol
C 0,20 Hydroxyethylcellulose
D 6,00 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Phase C in der Mischung aus A und B quellen lassen, dann den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Mit Phase D abfüllen. Beispiel 51 : Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl
85,5 Aqua dem.
B 7,0 Sodium Polystyrene Sulfonate
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Cetrimonium Bromide q.s. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
W WSS 5 5%%
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl 8 811 ,,55 Aqua dem.
B 7,0 Sodium Polystyrene Sulfonate
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Cetrimonium Bromide qq..ss.. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Phase A solubilisieren. Phase B in Phase A einwiegen und klar lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen, mit Phase C abfüllen.
Beispiel 52: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl
92,0 Aqua dem.
B 0,5 Polyquaternium-10 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
0,5 Cetrimonium Bromide q.s. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl
88,0 Aqua dem.
B 0,5 Polyquaternium-10
55,,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Cetrimonium Bromide q.s. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Phase A solubilisieren. Phase B in Phase A einwiegen und klar lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen, mit Phase C abfüllen.
Beispiel 53: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl 82,5 Aqua dem.
B 10,0 Polyquaternium-16
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate q.s. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl
78,5 Aqua dem.
B 10,0 Polyquaternium-16
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate qq..ss.. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Phase A solubilisieren. Phase B in Phase A einwiegen und klar lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen, mit Phase C abfüllen.
Beispiel 54: Haartönung Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 84,0 Aqua dem.
2,0 Chitosan
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
C 10,0 HFC 152 A
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 80,0 Aqua dem. 2,0 Chitosan
5,0 wässrige Lösung mit c
14_264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
C 10,0 HFC 152 A
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 55: Pflegeshampoo
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 30,0 Sodium Laureth Sulfate
6,0 Sodium Cocoamphoacetate
6,0 Cocamidopropyl Betaine 3,0 Sodium Laureth Sulfate, Glycol Distearate, Cocamide MEA, Laureth-10
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
7,7 Polyquaternium-44
2,0 Amodimethicone q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,0 Sodium Chloride
43,3 Aqua dem.
B q.s. Citric Acid
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 30,0 Sodium Laureth Sulfate
6,0 Sodium Cocoamphoacetate 6,0 Cocamidopropyl Betaine
3,0 Sodium Laureth Sulfate, Glycol Distearate, Cocamide MEA, Laureth-10
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
7,7 Polyquaternium-44 2,0 Amodimethicone q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel 1 ,0 Sodium Chloride
39 ,3 Aqua dem.
B q- S. Citric Acid
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen und lösen. Den pH-Wert mit Citronensäure auf 6-7 einstellen.
Beispiel 56: Duschgel
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 40,0 Sodium Laureth Sulfate
5,0 Decyl Glucoside
5,0 Cocamidopropyl Betaine 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
1 ,0 Panthenol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel 2,0 Sodium Chloride
46,0 Aqua dem.
B q.s. Citric Acid
WS 5% % Inhaltsstoff (INCI)
A 40,0 Sodium Laureth Sulfate
5,0 Decyl Glucoside
5,0 Cocamidopropyl Betaine
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
1 ,0 Panthenol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
2,0 Sodium Chloride 42,0 Aqua dem.
B q.s. Citric Acid
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen und lösen. Den pH-Wert mit Citronensäure auf 6-7 einstellen.
Beispiel 57: Shampoo WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 40,0 Sodium Laureth Sulfate
5,0 Sodium C12-15 Pareth-15 Sulfonate
5,0 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl
0,1 Phytantriol
44,6 Aqua dem.
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,3 Polyquaternium-10
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
1 ,0 Laureth-3
2,0 Sodium Chloride
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 40,0 Sodium Laureth Sulfate
5,0 Sodium C12-15 Pareth-15 Sulfonate
5,0 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl
0,1 Phytantriol
40,6 Aqua dem.
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,3 Polyquaternium-10
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
1 ,0 Laureth-3
2,0 Sodium Chloride
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen und lösen. Den pH-Wert mit Citronensäure auf 6-7 einstellen. Beispiel 58: Haarfärbe-Shampoo
WS 5 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,15 Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride
2,00 Laureth-3
58,00 Aqua dem. q.s. Citric Acid
B 3,00 PEG-150 Distearate
WS 5 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
5,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,15 Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride
2,00 Laureth-3
54,00 Aqua dem. q.s. Citric Acid
B 3,00 PEG-150 Distearate
Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Phase B zugeben und auf ca. 40°C erwärmen. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Beispiel 59: Feuchtigkeitsspendende Körperpflegecreme
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-25
2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
3,0 Cetearyl Ethylhexanoate
1 ,0 Dimethicone
4,0 Cetearyl Alcohol
3,0 Glyceryl Stearate SE
5,0 Mineral OiI
4,0 Simmondsia Chinensis (Jojoba) Seed OiI
3,0 Mineral OiI, Lanolin Alcohol
B 5,0 Propylene Glycol
1 ,0 Panthenol
0,5 Magnesium Aluminum Silicate q.s Konservierungsmittel
65,5 Aqua dem.
C q.s. Parfümöl
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
D q.s. Citric Acid
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-25
2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
3,0 Cetearyl Ethylhexanoate
1 ,0 Dimethicone
4,0 Cetearyl Alcohol
3,0 Glyceryl Stearate SE
5,0 Mineral OiI
4,0 Simmondsia Chinensis (Jojoba) Seed OiI
3,0 Mineral OiI, Lanolin Alcohol
B 5,0 Propylene Glycol
1 ,0 Panthenol
0,5 Magnesium Aluminum Silicate q.s Konservierungsmittel
61 ,5 Aqua dem.
C q.s. Parfümöl
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14 264 D q.s. Citric Acid
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt auf ca. 80°C erwärmen. Phase B kurz vorhomogenisieren, dann Phase B in Phase A einrühren und erneut homogenisie- ren.Abkühlen auf ca. 40°C, Phase C zugeben und nochmals gut homogenisieren. Den pH-Wert mit Citronensäure auf 6-7 einstellen.
Beispiel 60: Feuchtigkeitsspendende Körperpflegecreme
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate 7,0 Mineral OiI
0,5 Shea Butter (Butyrospermum Parkii)
0,5 Aluminum Stearate
0,5 Magnesium Stearate
0,2 Bisabolol 0,7 Quaternium-18-Hectorite
B 5,0 Dipropylene Glycol
0,7 Magnesium Sulfate q.s. Konservierungsmittel
62,9 Aqua dem. C q.s. Parfümöl
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
WS 5% % Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate
7,0 Mineral OiI 0,5 Shea Butter (Butyrospermum Parkii)
0,5 Aluminum Stearate
0,5 Magnesium Stearate
0,2 Bisabolol
0,7 Quaternium-18-Hectorite B 5,0 Dipropylene Glycol
0,7 Magnesium Sulfate q.s. Konservierungsmittel 58,9 Aqua dem. C q.s. Parfümöl
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase C zugeben und nochmals homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Beispiel 61 : Flüssiges Make-up - Typ O/W
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
6,0 Glyceryl Stearate
1 ,0 Cetyl Alcohol
8,0 Mineral OiI
7,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Dimethicone
B 3,0 Propylene Glycol
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
61 ,9 Aqua dem.
C 0,1 Bisabolol
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264 q.s. Parfümöl
D 5,7 C. I. 77 891 , Titanium Dioxide
1 ,1 Iron Oxides
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
6,0 Glyceryl Stearate
1 ,0 Cetyl Alcohol
8,0 Mineral OiI
7,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Dimethicone
B 3,0 Propylene Glycol 1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
57,9 Aqua dem.
C 0,1 Bisabolol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264 q.s. Parfümöl
D 5,7 C. I. 77 891 , Titanium Dioxide
1 ,1 Iron Oxides
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phasen C und D zugeben und nochmals gründlich homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Beispiel 62:
Der genannte Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 wird als ca. 5 Gew.-% ige wäßrige Lösung eingesetzt. Die folgenden Angaben sind Gewichtsteile.
Klares Haarfärbe Shampoo
Haarfärbe Shampoo
Klares Conditioner Shampoo zur Haarfärbung
Haartönung Schaum O/W- Emulsionen
Haarfärbe Conditioner Shampoo mit Perlglanz
pH einstellen auf 6,0 Klares Haarfärbe Conditioner Shampoo
pH einstellen auf 6,0
Klares Conditioner Shampoo mit Volumen Effekt zur Haarfärbung
pH einstellen auf 6,0
Haartönende Gelcreme
OW Sunscreenformulation
Hydrodispersion
WO Sunscreen Emulsion
PIT-Emulsion
Haut- oder haartönende Gelcreme
OW Formulations Selbstbräuner
1 2 3 4 5 6 7
Glyceryl Monostearate SE 0,50 1 ,00 3, 00 1 ,50
Glycerl Stearat Citrate 2,00 1 , 00 2 ,00 4,00
Stearic Acid 3 ,00 2 ,00
PEG-40 Stearate 0,50 2,00
Cetyl Phosphate 1 ,00
Cetearyl Sulfate 0, 75
Stearyl Alcohol 3, 00 2,00 0, 60
Cetyl Alcohol 2,50 1 ,10 1 ,50 0,60 2, 00
OW Make Up
Hydrodispersion Selbstbräuner mit Tönungseffekt
Hydrodispersion After sun
WO-Emulsion
Feststoff stabilisierte Emulsion (Pickering Emulsions)
Sticks
PIT-Emulsionen Selbstbräu- ner
Ölgel
Beispiel 63:
In den folgenden Rezepturen werden kosmetische Sonnenschutzzubereitungen, enthaltend eine Kombination aus mindestens einem anorganischen Pigment, bevorzugt Zinkoxid und/oder Titandioxid, Uvinul A Plus und weitere organische UV-A- und UV-B- Filter, beschrieben.
Die anorganischen Pigmente können dabei in gecoateter Form vorliegen, d.h. dass sie oberflächlich behandelt sind. Diese Oberflächenbehandlung kann beispielsweise darin bestehen, dass die Pigmente nach an sich bekannter Weise, wie in DE-A-33 14 742 beschrieben, mit einer dünnen hydrophoben Schicht versehen sind.
Die Herstellung der nachfolgend genannten Formulierungen erfolgt auf übliche, dem Fachmann bekannte Art und Weise.
Im Folgenden sind erfindungsgemäße dermokosmetische Zubereitungen beschrieben, enthaltend das gemäß Beispiel 19 hergestellte keratinbindende Effektormolekül (Kera- tinbindedomäne gemäß SEQ ID No.: ID 166 gekoppelt mit dem Farbstoff 14_264). Besagtes keratinbindendes Effektormolekül wird in den folgenden Beispielen als Keratin- Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 bezeichnet. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass auch alle anderen in den Tabellen 6 und 7 beschriebenen Farbstoffe mit der KBD gemäß Beispiel 19, 19 a oder 19 b gekoppelt werden können und in den unten genannten Zubereitungen verwendet werden können.
Der Gehalt an Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 bezieht sich auf 100% Wirkstoff. Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann sowohl in reiner Form als auch als wässerige Lösung eingesetzt werden. Im Falle der wässerigen Lösung muss der Gehalt an Wasser dem. in der jeweiligen Formulierung angepasst werden.
Paraffin
3,70 Candelillawachs LT 281 LJ Euphorbia Cerifera (Candelilla) Wax
1 ,80 Bienenwachs 3050 PH Bees Wax
3,20 TeCero-Wachs 30445 Microcrystalline Wax
3,20 TeCero-Wachs 1030 K Microcrystalline Wax
1 ,34 Cutina CP Cetyl Palmitate
6,40 Vaseline Petrolatum
7,30 Softisan 100 Hydrogenated Coco-Glycerides
10,00 Luvitol® EHO Cetearyl Ethylhexanoate
0,17 Bisabolol nat. Bisabolol
1 ,84 Vitamin E-Acetat Tocopheryl Acetate
0,42 D,L-Alpha-Tocopherol Tocopherol
1 ,00 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264
40,38 Rizinusöl Ricinus Communis (Castor) OiI
A 4,00 Dehymuls® SBL Polyglyceryl-2
Dipolyhydroxystearate, Dicaprylyl Ether, Cocoglycerides, Sorbitan Sesquioleate, Cera Alba, Aluminum Stearates, Dicocoyl Pentaerythrityl Distearyl Citrate
1 ,00 Dehymuls® PGPH Polyglyceryl-2 Dipolyhydroxystearate
8,00 Finsolv® TN C12-15 Alkyl Benzoate
4,00 Miglyol® 812 Caprylic/Capric Triglyceride
8,00 Uvinul® A Plus B Ethylhexyl Methoxycinnamate and Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
2,00 Uvinul® N 539 T Octocrylene
B 5,00 T-Lite® SF Titanium Dioxide, Alumina Hydrate, Dimethicone/Methicone Copolymer
C 3,00 1 ,2-Propylenglykol Care Propylene Glycol
0,30 Abiol Imidazolidinyl Urea
1 ,00 Magnesiumsulfat-7-hydrat Magnesium Sulfate
63,50 Wasser dem. Aqua dem.
0,20 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
1 ,00 Tinosorb® S Bis-Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine
3,00 Uvinul® MC 80 Ethylhexyl Methoxycinnamate
8,00 Miglyol® 812 Caprylic/Capric Triglyceride
1 ,50 Dow Corning® 350 Fluid Dimethicone
3,00 Z-COTE® MAX Zinc Oxide, Diphenyl Capryl Methicone
3,00 Finsolv® TN C12-15 Alkyl Benzoate
1 ,00 Cremophor® CO 40 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
B 2,00 Luvigel® EM Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
C 54,80 Wasser dem. Aqua dem.
D 15,00 Ethanol 96% Alcohol
5,00 1 ,2-Propylenglykol Care Propylene Glycol
0,50 Cremophor® A 25 Ceteareth-25
1 ,00 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264
1 ,00 Vitamin E-Acetat Tocopheryl Acetate
0,20 Bisabolol rac. Bisabolol
Beispiel 65. Haarfärbung mit KBD-D-Farbstoff-Kopplungen
Zunächst wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren (Bsp. 19) ein roter Reaktivfarbstoff 14_264 an KBD-D (SEQ ID No.: 168) gekoppelt. Um zu zeigen, dass die Bindung der KBD-D-Farbstoff-Kopplung an Haar durch das Protein und nicht durch den freien Farbstoff selbst vermittelt wird, wurde der gleiche Farbstoff jeweils nur mit Cystein aber ohne KBD-D behandelt. Anschließend wurden KBD-D-14_264 bzw. 14_264 auf jeweils 5 mg Haar gegeben, kurz inkubiert und nicht gebundener KBD-B- Farbstoff bzw. reiner Farbstoff mit einer 15%igen Tween 20-Lösung abgewaschen. Das Ergebnis zeigt eindeutig, dass die Bindung an das Haar durch die KBD-D vermittelt wird und eine Färbung des Haares stattgefunden hat.
Möchte man hingegen die Haare wieder entfärben, eignet sich eine Wäsche mit einem SDS-Anteil von 15 %, oder eine Behandlung mit einer keratinhaltigen Lösung.
Im Folgenden sind erfindungsgemäße dermokosmetische Zubereitungen beschrieben, enthaltend das gemäß Beispiel 20 hergestellte keratinbindende Effektormolekül (Kera- tinbindedomäne gemäß SEQ ID No.: ID 168 gekoppelt mit dem Farbstoff 14_264). Besagtes keratinbindendes Effektormolekül wird in den folgenden Beispielen als Keratin- Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 bezeichnet. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass auch alle anderen in den Tabellen 6 und 7 beschriebenen Farbstoffe mit der KBD gemäß Beispiel 21 gekoppelt werden können und in den unten genannten Zubereitungen verwendet werden können.
Beispiel 66: Shampoo (Basisformulierung ohne Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff)
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,25 Polyquaternium-16
2,00 Laureth-3 q.s. Citric Acid
57,75 Aqua dem.
B 3,00 PEG-150 Distearate
Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Phase B zugeben und auf ca. 50°C erwärmen. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Der Gehalt an Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 KBD-D (SEQ ID No.: 168) in den folgenden Beispielen bezieht sich auf 100% Keratin-Bindedomäne-
Reaktivfarbstoff 14_264. Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann sowohl in reiner Form als auch als wässerige Lösung eingesetzt werden. Im Falle der wässerigen Lösung muss der Gehalt an Wasser dem. in der jeweiligen Formulierung angepasst werden.
Beispiel 67: Haarfärbeshampoo
Variante 1
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,25 Polyquaternium-16
2,00 Laureth-3 q.s. Citric Acid
1 ,00 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
57,75 Aqua dem.
B 3,00 PEG-150 Distearate
Variante 2
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,25 Polyquaternium-16
2,00 Laureth-3 q.s. Citric Acid
5,00 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264
53,75 Aqua dem.
B 3,00 PEG-150 Distearate Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Phase B zugeben und auf ca. 40°C erwärmen. Unter Rühren schnell auf Raumtemperatur abkühlen.
Beispiel 68: Colour Styling Mousse
Variante 1
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 6,70 Acrylates Copolymer
0,60 Aminomethyl Propanol
0,20 Ceteareth-25
0,20 Panthenol
0,20 Hydroxyethylcellulose
10,00 Alcohol
69,97 Aqua dem.
1 ,0 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
C 10,00 Propane/Butane
Variante 2
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 6,70 Acrylates Copolymer
0,60 Aminomethyl Propanol
0,20 Ceteareth-25
0,20 Panthenol
0,20 Hydroxyethylcellulose
10,00 Alcohol
69,97 Aqua dem.
0,5 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
C 10,00 Propane/Butane Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B einwiegen und klar lösen, dann in Phase A einrühren. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 69: Colour-Styling-Mousse
Variante 1
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 7,00 Polyquaternium-46
2,00 Polyquaternium-1 1
78,87 Aqua dem. 2,0 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
C 10,00 Propane/Butane
Variante 2 % Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 7,00 Polyquaternium-46
2,00 Polyquaternium-1 1
78,87 Aqua dem.
1 ,0 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
C 10,00 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B einwiegen und klar lösen, dann in Phase A einrühren. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 70:
Zwei Strähnen blondes, ungebleichtes Haar: Euro-Natur-Haar, Farbe 9/0, naturblond (2g) werden mit 0,5g des Haarfärbeshampoos Beispiel 67/Variante 1 behandelt und das Haarfärbeshampoo wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 66 gereinigt und ge- trocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein blondes Haar mehr zu detek- tieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 66 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster vergli- chen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 71 : Zwei Strähnen weißes Haar: selektiertes, weißes Euro-Natur-Haar (2g) werden mit 0,5g des Haarfärbeshampoos Beispiel 67/Variante 1 behandelt und das Haarfärbe- shampoo wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 66 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein weißes Haar mehr zu detektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 66 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster verglichen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Visuell ist kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 72:
Zwei Strähnen blondes, ungebleichtes Haar: Euro-Natur-Haar, Farbe 9/0, naturblond (2g) werden mit 0,5g des Colour Styling Mousse Beispiel 68/Variante 2 behandelt und das Colour Styling Mousse wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 66 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein blondes Haar mehr zu detektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 66 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster vergli- chen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 73: Zwei Strähnen weißes Haar: selektiertes, weißes Euro-Natur-Haar (2g) werden mit 0,5g des Colour Styling Mousse Beispiel 68/Variante 2 behandelt und das Colour Styling Mousse wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 66 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein weißes Haar mehr zu detektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 66 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster vergli- chen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 74:
Zwei Strähnen blondes, ungebleichtes Haar: Euro-Natur-Haar, Farbe 9/0, naturblond (2g) werden mit 0,5g des Colour Styling Mousse Beispiel 69/Variante 1 behandelt und das Colour Styling Mousse wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 66 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein blondes Haar mehr zu de- tektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt.
In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 66 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster verglichen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 75:
Zwei Strähnen weißes Haar: selektiertes, weißes Euro-Natur-Haar (2g) werden mit 0,5g des Colour Styling Mousse Beispiel 69/Variante 1 behandelt und das Colour Styling Mousse wird 15 min auf dem Haar gelassen. Anschließend werden die Haarsträhnen mit Wasser gewaschen und mit Shampoo Beispiel 66 gereinigt und getrocknet. Das Haar ist vollständig rot gefärbt. Es ist kein weißes Haar mehr zu detektieren. Eine Strähne wird als Vergleich rückgestellt. In der Folge wird die zweite Strähne fünfmal mit Shampoo Beispiel 66 gewaschen und getrocknet. Nach der fünften Wäsche wird die Strähne mit dem Rückstellmuster verglichen. Die fünfmal gewaschene Strähne ist noch vollständig rot gefärbt. Beide Strähnen haben den gleichen Rotton. Es ist visuell kein Unterschied in der Farbtiefe zu erkennen.
Beispiel 76: Verwendung der KBD in einer Emulsion zur Tagespflege - Typ O/W
WS 1 %: % Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol 6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin 0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
69,8 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 0,2 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Ascorbate, Tocopherol, Retinol
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14 _264
E q.s. Sodium Hydroxide
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
65,8 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 0,2 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Ascorbate, Tocopherol, Retinol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
E q.s. Sodium Hydroxide
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C in die kombinierten Phasen A und B einrühren und nochmals homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase D zugeben, den pH-Wert mit Phase E auf etwa 6.5 einstellen, homogenisieren und unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Hinweis: Die Formulierung wird ohne Schutzgas hergestellt. Die Abfüllung muß in sauerstoffundurchlässige Verpackungen, z.B. Aluminiumtuben erfolgen.
Beispiel 77: Verwendung der KBD in einer schützenden Tagescreme - Typ O/W WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
0,7 Ceteareth-25 2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate
B 5,0 Glycerin 0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
70,6 Aqua dem.
C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer D 1 ,0 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 E q.s. Sodium Hydroxide
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,7 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol 0,7 Ceteareth-25
2,0 PEG-14 Dimethicone
3,6 Cetearyl Alcohol
6,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Dibutyl Adipate B 5,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
66,6 Aqua dem. C 4,0 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
D 1 ,0 Sodium Ascorbyl Phosphate
1 ,0 Tocopheryl Acetate 0,2 Bisabolol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
E q.s. Sodium Hydroxide
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C in die kombinierten Phasen A und B einarbeiten und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen. Phase D hinzugeben, den pH-Wert mit Phase E auf ca. 6.5 einstellen und homogenisieren. Un- ter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Beispiel 78: Verwendung der KBD in einer Gesichtsreinigungslotion - Typ O/W WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
1 ,5 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasilosane
2,0 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
B 3,5 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
C 1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Konservierungsmittel q.s. Parfümöl
D 3,0 Polyquaternium-44
0,5 Cocotrimonium Methosulfate
0,5 Ceteareth-25
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
4,0 Propylene Glycol
0,1 Disodium EDTA
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
60,7 Aqua dem.
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
1 ,5 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasilosane
2,0 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
B 3,5 Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
C 1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Konservierungsmittel q.s. Parfümöl
D 3,0 Polyquaternium-44
0,5 Cocotrimonium Methosulfate 0,5 Ceteareth-25
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
4,0 Propylene Glycol
0,1 Disodium EDTA
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5 % Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
56,7 Aqua dem.
Herstellung: Phase A lösen. Phase B in Phase A einrühren, Phase C in die kombinierten Phasen A und B einarbeiten. Phase D lösen, in die kombinierten Phasen A, B und C einrühren und homogenisieren. 15min nachrühren.
Beispiel 79: Verwendung der KBD in einem Daily Care Body Spray
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
1 ,0 Polyquaternium-44
3,0 Propylene Glycol
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
1 ,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
10,0 Octyldodecanol
0,5 PVP
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
3,0 C12-15 Alkyl Benzoate
3,0 Glycerin
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,3 Bisabolol
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
59,2 Alcohol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
1 ,0 Polyquaternium-44
3,0 Propylene Glycol
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
1 ,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
10,0 Octyldodecanol
0,5 PVP
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
3,0 C12-15 Alkyl Benzoate
3,0 Glycerin
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,3 Bisabolol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
55,2 Alcohol
Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und klar lösen. Beispiel 80: Verwendung der KBD in einem Hautpflegegel
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,6 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
15,0 Alcohol
0,1 Bisabolol
0,5 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 3,0 Panthenol
0,6 Carbomer
1 ,0 wässrige Lösung mit ca . 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
75,4 Aqua dem,
C 0,8 Triethanolamine
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,6 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
15,0 Alcohol
0,1 Bisabolol
0,5 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 3,0 Panthenol
0,6 Carbomer
5,0 wässrige Lösung mit ca . 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
71 ,4 Aqua dem,
C 0,8 Triethanolamine
Herstellung: Die Phase A klar lösen. Phase B quellen lassen und mit Phase C neutralisieren. Phase A in die homogenisierte Phase B einrühren und homogenisieren.
Beispiel 81 : Verwendung der KBD in einer After Shave Lotion
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Tocopheryl Acetate
1 ,0 Bisabolol
0,1 Parfümöl
0,3 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
B 15,0 Alcohol 1 ,0 Panthenol
3,0 Glycerin
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 0,1 Triethanolamine
63,5 Aqua dem.
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI) A 10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Tocopheryl Acetate
1 ,0 Bisabolol
0,1 Parfümöl
0,3 Acrylat.es/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer B 15,0 Alcohol
1 ,0 Panthenol
3,0 Glycerin
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 0,1 Triethanolamine
59,5 Aqua dem.
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B lösen, in Phase A einarbeiten und homogenisieren.
Beispiel 82: Verwendung der KBD in einer After Sun Lotion
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 0,4 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
15,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 1 ,0 Panthenol
15,0 Alcohol
3,0 Glycerin
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
63,2 Aqua dem,
C 0,2 Triethanolamine
WS 5%: % Inhaltsstoff (INCI)
A 0,4 Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer
15,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate q.s. Parfümöl
B 1 ,0 Panthenol
15,0 Alcohol
3,0 Glycerin
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
59,2 Aqua dem,
C 0,2 Triethanolamine
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Phase B unter Homogenisieren in Phase A einrühren. Mit Phase C neutralisieren und erneut homogenisieren.
Beispiel 83: Verwendung der KBD in einer Sonnenschutzlotion
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 4,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
3,0 Octocrylene
2,5 Di-CI 2-13 Alkyl Malate
0,5 Tocopheryl Acetate
4,0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Distearate
B 3,5 Cetearyl Isononanoate
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
5,0 Isohexadecane
2,5 Di-CI 2-13 Alkyl Malate
3,0 Titanium Dioxide, Trimethoxycaprylylsilane
C 5,0 Glycerin
1 ,0 Sodium Cetearyl Sulfate
0,5 Xanthan Gum
61 ,7 Aqua dem.
D 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
1 ,0 Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Butylparaben, Prof paraben, Isobutylparaben 0,3 Bisabolol
WS 5%: % Inhaltsstoff (INCI)
A 4,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
3,0 Octocrylene
2,5 Di-CI 2-13 Alkyl Malate 0,5 Tocopheryl Acetate
4,0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Distearate
B 3,5 Cetearyl Isononanoate
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
5,0 Isohexadecane 2,5 Di-CI 2-13 Alkyl Malate
3,0 Titanium Dioxide, Trimethoxycaprylylsilane
C 5,0 Glycerin
1 ,0 Sodium Cetearyl Sulfate
0,5 Xanthan Gum 57,7 Aqua dem.
D 5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
1 ,0 Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Butylparaben, Propyl- paraben, Isobutylparaben 0,3 Bisabolol
Herstellung: Die Komponenten der Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Phase C auf ca. 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase D zugeben und nochmals homogenisieren.
Beispiel 84: Verwendung der KBD in einer Sonnenschutzlotion - Typ O/W WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
3,0 Tribehenin
2,0 Cetearyl Alcohol
2,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Ethylhexyl Methoxycinnamate
1 ,0 Ethylhexyl Triazone
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
7,0 Isopropyl Myristate
B 5,0 Zinc Oxide, Triethoxycaprylylsilane
C 0,2 Xanthan Gum
0,5 Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer, Squalane, Polysorbate 60
0,2 Disodium EDTA
5,0 Propylene Glycol
0,5 Panthenol
60,9 Aqua dem.
D 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Phenoxyethanol, Methylparaben, Butylparaben, Ethylparaben, Propylpa- raben, Isopropylparaben 1 1 ,,00 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI) A A 2 2,,00 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
3,0 Tribehenin
2,0 Cetearyl Alcohol
2,0 Cetearyl Ethylhexanoate 5 5,,00 Ethylhexyl Methoxycinnamate
1 ,0 Ethylhexyl Triazone
1 ,0 VP/Eicosene Copolymer
7,0 Isopropyl Myristate
B 5,0 Zinc Oxide, Triethoxycaprylylsilane C C 0 0,,22 Xanthan Gum
0,5 Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer,
Squalane, Polysorbate 60
0,2 Disodium EDTA
5,0 Propylene Glycol 0 0,,55 Panthenol
56,9 Aqua dem.
D 5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Phenoxyethanol, Methylparaben, Butylparaben, Ethylparaben, Propylpa- raben, Isopropylparaben
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol
Herstellung: Phase A auf ca. 80°C erwärmen, Phase B einrühren und 3min homogeni- sieren. Phase C ebenfalls auf 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombinierten Phasen A und B einrühren. Abkühlen auf ca. 40°C, Phase D einrühren und nochmals homogenisieren. Beispiel 85: Verwendung der KBD in einer Sonnenschutzlotion - Typ O/W
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,5 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
1 ,5 Ceteareth-25
7,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
0,5 Bees Wax
3,0 Cetearyl Alcohol
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
B 5,0 Titanium Dioxide, Silica, Methicone, Alumina
C 3,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
0,3 Xanthan Gum
1 ,0 Decyl Glucoside
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
56,3 Aqua dem.
D 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 3,5 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
1 ,5 Ceteareth-25
7,5 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,0 Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
0,5 Bees Wax
3,0 Cetearyl Alcohol
10,0 Caprylic/Capric Triglyceride
B 5,0 Titanium Dioxide, Silica, Methicone, Alumina
C 3,0 Glycerin
0,2 Disodium EDTA
0,3 Xanthan Gum
1 ,0 Decyl Glucoside
2,0 Panthenol, Propylene Glycol
52,3 Aqua dem. D 5,0 wässrige Lösung mit
14_ .264
1 ,0 Tocopheryl Acetate
0,2 Bisabolol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
Herstellung: Phase A auf ca. 80°C erwärmen, Phase B einrühren und 3min homogenisieren. Phase C ebenfalls auf 80°C erwärmen und unter Homogenisieren in die kombi- nierten Phasen A und B einrühren. Abkühlen auf ca. 40°C, Phase D einrühren und nochmals homogenisieren.
Beispiel 86: Verwendung der KBD in einem Fußbalsam
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
5,0 Cetearyl Ethylhexanoate
4,0 Cetyl Alcohol
4,0 Glyceryl Stearate
5,0 Mineral OiI
0,2 Menthol
0,5 Camphor
B 69,3 Aqua dem. q.s. Konservierungsmittel
C 1 ,0 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate
D 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
5,0 Witch Hazel Extract
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
5,0 Cetearyl Ethylhexanoate
4,0 Cetyl Alcohol
4,0 Glyceryl Stearate
5,0 Mineral OiI
0,2 Menthol
0,5 Camphor B 65,3 Aqua dem. q.s. Konservierungsmittel
C 1 ,0 Bisabolol
1 ,0 Tocopheryl Acetate
D 5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
5,0 Witch Hazel Extract
Herstellung: Die Komponenten der Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A unter Homogenisieren einrühren. Unter Rühren abkühlen auf ca. 40°C, die Phasen C und D hinzugeben und kurz nachhomogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Beispiel 87: Verwendung der KBD in einer W/O Emulsion mit Bisabolol
WS 1 %:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
8,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate
15,0 Mineral OiI
0,3 Magnesium Stearate
0,3 Aluminum Stearate
2,0 PEG-45/Dodecyl Glycol Copolymer
B 5,0 Glycerin
0,7 Magnesium Sulfate
55,6 Aqua dem.
C 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Tocopheryl Acetate
0,6 Bisabolol
WS 5%:
% Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
8,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate
15,0 Mineral OiI
0,3 Magnesium Stearate
0,3 Aluminum Stearate
2,0 PEG-45/Dodecyl Glycol Copolymer
B 5,0 Glycerin 0,7 Magnesium Sulfate
51 ,6 Aqua dem.
C 5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 0,5 Tocopheryl Acetate
0,6 Bisabolol
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt voneinander auf ca. 85°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase C hinzugeben und nochmals kurz homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Zusammenstellung Rezepturen für Patent Keratin-Bindedomäne - Haircare
Beispiel 88: Schaumconditioner mit Festiger
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 PVP/VA Copolymer 0,2 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
0,2 Ceteareth-25
0,5 Dimethicone Copolyol q.s. Parfümöl
10.0 Alcohol 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
68.1 Aqua dem.
B 10,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 10,0 PVP/VA Copolymer
0,2 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate 0,2 Ceteareth-25
0,5 Dimethicone Copolyol q.s. Parfümöl
10.0 Alcohol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
64.1 Aqua dem.
B 10,0 Propane/Butane Herstellung: Die Komponenten der Phase A zusammenwiegen, rühren bis alles gelöst ist und mit Phase B abfüllen.
Beispiel 89: Haarfärbeschaumconditioner
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,0 Polyquaternium-4
0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
91 ,5 Aqua dem.
B 6,0 Propane/Butane
WS 5% % Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,0 Polyquaternium-4
0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel 87,5 Aqua dem. B 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A zusammenwiegen, rühren bis alles klar gelöst ist und mit Phase B abfüllen.
Beispiel 90: Haarfärbeschaumconditioner
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,0 Polyquaternium-1 1 0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264 q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
91 ,5 Aqua dem.
B 6,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 1 ,0 Polyquaternium-1 1 0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel 87,5 Aqua dem.
B 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A zusammenwiegen, rühren bis alles klar gelöst ist und mit Phase B abfüllen.
Beispiel 91 : HaarfärbeStyling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 0,5 Laureth-4 q.s. Parfümöl
B 77,3 Aqua dem.
10,0 Polyquaternium-28 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol 0,1 PEG-25 PABA
0,2 Hydroxyethylcellulose
C 10,0 HFC 152 A
WS 5% % Inhaltsstoff (INCI) A 0,5 Laureth-4 q.s. Parfümöl
B 73,3 Aqua dem.
10,0 Polyquaternium-28
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
0,2 Hydroxyethylcellulose
C 10,0 HFC 152 A
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 92: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 78,5 Aqua dem.
6,7 Acrylates Copolymer
0,6 AMP
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
0,2 Hydroxyethylcellulose
C 10,0 HFC 152 A
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 74,5 Aqua dem.
6,7 Acrylates Copolymer
0,6 AMP
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14..264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
0,2 Hydroxyethylcellulose
C 10,0 HFC 152 A
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 93: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 % % Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 7,70 Polyquaternium-44 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264 q.s. Konservierungsmittel
79,3 Aqua dem.
C 10,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl B 7,70 Polyquaternium-44
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264 q.s. Konservierungsmittel
75,3 Aqua dem. C 10,0 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B klar lösen, dann Phase B in Phase A einrühren. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen, mit Phase C abfüllen.
Beispiel 94: Haarfärbe Styling Schaum WS 5 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 72,32 Aqua dem.
2,00 VP/Acrylates/Lauryl Methacrylate Copolymer
0,53 AMP
1 ,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264 0 0,,2200 Ceteareth-25
0,50 Panthenol
0,05 Benzophenone-4
0,20 Amodimethicone, Cetrimonium Chloride, Trideceth-12
15,00 Alcohol C C 0 0,,2200 Hydroxyethylcellulose
D 6,00 Propane/Butane
WS 5 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
AA 22,,0000 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 68,32 Aqua dem.
2,00 VP/Acrylates/Lauryl Methacrylate Copolymer
0,53 AMP
55,,0000 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,20 Ceteareth-25
0,50 Panthenol
0,05 Benzophenone-4
00,,2200 Amodimethicone, Cetrimonium Chloride, Trideceth-12
15,00 Alcohol
C 0,20 Hydroxyethylcellulose
D 6,00 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Phase C in der Mischung aus A und B Iquellen lassen, dann den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Mit Phase D abfüllen
Beispiel 95: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI) A 2,00 Cetrimonium Chloride q.s. Parfümöl
B 67,85 Aqua dem.
7,00 Polyquaternium-46
1 ,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,20 Ceteareth-25
0,50 Panthenol
0,05 Benzophenone-4 0 0,,2200 Amodimethicone, Cetrimonium Chloride, Trideceth-12
15,00 Alcohol
C 0,20 Hydroxyethylcellulose
D 6,00 Propane/Butane
WS 5 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,00 Cetrimonium Chloride q.s. Parfümöl
B 63,85 Aqua dem.
77,,0000 Polyquaternium-46
5,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,20 Ceteareth-25
0,50 Panthenol
00,,0055 Benzophenone-4
0,20 Amodimethicone, Cetrimonium Chloride, Trideceth-12
15,00 Alcohol
C 0,20 Hydroxyethylcellulose
D 6,00 Propane/Butane
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Phase C in der Mischung aus A und B quellen lassen, dann den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Mit Phase D abfüllen. Beispiel 96: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl
85,5 Aqua dem.
B 7,0 Sodium Polystyrene Sulfonate
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Cetrimonium Bromide q.s. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
W WSS 5 5%%
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl 8 811 ,,55 Aqua dem.
B 7,0 Sodium Polystyrene Sulfonate
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Cetrimonium Bromide qq..ss.. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Phase A solubilisieren. Phase B in Phase A einwiegen und klar lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen, mit Phase C abfüllen.
Beispiel 97: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
Aq. s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl
92,0 Aqua dem.
BO, 5 Polyquaternium-10 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
0,5 Cetrimonium Bromide q.s. Konservierungsmittel
C6,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
Aq. s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl
88,0 Aqua dem.
B0,5 Polyquaternium-10
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
0,5 Cetrimonium Bromide q.s. Konservierungsmittel
C6,0 Propane/Butane
Herstellung: Phase A solubilisieren. Phase B in Phase A einwiegen und klar lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen, mit Phase C abfüllen.
Beispiel 98: Haarfärbe Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl 82,5 Aqua dem.
B 10,0 Polyquaternium-16
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate q.s. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A q.s. PEG-40 Hydrogenated Castor OiI q.s. Parfümöl
78,5 Aqua dem.
B 10,0 Polyquaternium-16
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Hydroxyethyl Cetyldimonium Phosphate qq..ss.. Konservierungsmittel
C 6,0 Propane/Butane
Herstellung: Phase A solubilisieren. Phase B in Phase A einwiegen und klar lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen, mit Phase C abfüllen.
Beispiel 99: Haartönung Styling Schaum
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 84,0 Aqua dem.
2,0 Chitosan
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
C 10,0 HFC 152 A
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Cocotrimonium Methosulfate q.s. Parfümöl
B 80,0 Aqua dem. 2,0 Chitosan
5,0 wässrige Lösung mit c
14_264
0,5 Dimethicone Copolyol
0,2 Ceteareth-25
0,2 Panthenol
0,1 PEG-25 PABA
C 10,0 HFC 152 A
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen. Die Komponenten der Phase B eine nach der anderen zugeben und lösen. Mit Phase C abfüllen.
Beispiel 100: Pflegeshampoo
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 30,0 Sodium Laureth Sulfate
6,0 Sodium Cocoamphoacetate
6,0 Cocamidopropyl Betaine 3,0 Sodium Laureth Sulfate, Glycol Distearate, Cocamide MEA, Laureth-10
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
7,7 Polyquaternium-44
2,0 Amodimethicone q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,0 Sodium Chloride
43,3 Aqua dem.
B q.s. Citric Acid
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 30,0 Sodium Laureth Sulfate
6,0 Sodium Cocoamphoacetate 6,0 Cocamidopropyl Betaine
3,0 Sodium Laureth Sulfate, Glycol Distearate, Cocamide MEA, Laureth-10
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
7,7 Polyquaternium-44 2,0 Amodimethicone q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel 1 ,0 Sodium Chloride
39 ,3 Aqua dem.
B q- S. Citric Acid
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen und lösen. Den pH-Wert mit Citronensäure auf 6-7 einstellen.
Beispiel 101 : Duschgel
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 40,0 Sodium Laureth Sulfate
5,0 Decyl Glucoside
5,0 Cocamidopropyl Betaine 1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_264
1 ,0 Panthenol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel 2,0 Sodium Chloride
46,0 Aqua dem.
B q.s. Citric Acid
WS 5% % Inhaltsstoff (INCI)
A 40,0 Sodium Laureth Sulfate
5,0 Decyl Glucoside
5,0 Cocamidopropyl Betaine
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
1 ,0 Panthenol q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
2,0 Sodium Chloride 42,0 Aqua dem.
B q.s. Citric Acid
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen und lösen. Den pH-Wert mit Citronensäure auf 6-7 einstellen.
Beispiel 102: Shampoo WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 40,0 Sodium Laureth Sulfate
5,0 Sodium C12-15 Pareth-15 Sulfonate
5,0 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl
0,1 Phytantriol
44,6 Aqua dem.
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,3 Polyquaternium-10
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
1 ,0 Laureth-3
2,0 Sodium Chloride
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 40,0 Sodium Laureth Sulfate
5,0 Sodium C12-15 Pareth-15 Sulfonate
5,0 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl
0,1 Phytantriol
40,6 Aqua dem.
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
0,3 Polyquaternium-10
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
1 ,0 Laureth-3
2,0 Sodium Chloride
Herstellung: Die Komponenten der Phase A mischen und lösen. Den pH-Wert mit Citronensäure auf 6-7 einstellen. Beispiel 103: Haarfärbe-Shampoo
WS 5 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
1 ,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,15 Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride
2,00 Laureth-3
58,00 Aqua dem. q.s. Citric Acid
B 3,00 PEG-150 Distearate
WS 5 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 15,00 Cocamidopropyl Betaine
10,00 Disodium Cocoamphodiacetate
5,00 Polysorbate 20
5,00 Decyl Glucoside q.s. Parfümöl q.s. Konservierungsmittel
5,00 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264
0,15 Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride
2,00 Laureth-3
54,00 Aqua dem. q.s. Citric Acid
B 3,00 PEG-150 Distearate
Herstellung: Die Komponenten der Phase A einwiegen und lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Phase B zugeben und auf ca. 40°C erwärmen. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Beispiel 104: Feuchtigkeitsspendende Körperpflegecreme
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-25
2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
3,0 Cetearyl Ethylhexanoate
1 ,0 Dimethicone
4,0 Cetearyl Alcohol
3,0 Glyceryl Stearate SE
5,0 Mineral OiI
4,0 Simmondsia Chinensis (Jojoba) Seed OiI
3,0 Mineral OiI, Lanolin Alcohol
B 5,0 Propylene Glycol
1 ,0 Panthenol
0,5 Magnesium Aluminum Silicate q.s Konservierungsmittel
65,5 Aqua dem.
C q.s. Parfümöl
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264
D q.s. Citric Acid
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-25
2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
3,0 Cetearyl Ethylhexanoate
1 ,0 Dimethicone
4,0 Cetearyl Alcohol
3,0 Glyceryl Stearate SE
5,0 Mineral OiI
4,0 Simmondsia Chinensis (Jojoba) Seed OiI
3,0 Mineral OiI, Lanolin Alcohol
B 5,0 Propylene Glycol
1 ,0 Panthenol
0,5 Magnesium Aluminum Silicate q.s Konservierungsmittel
61 ,5 Aqua dem.
C q.s. Parfümöl
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14 264 D q.s. Citric Acid
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt auf ca. 80°C erwärmen. Phase B kurz vorhomogenisieren, dann Phase B in Phase A einrühren und erneut homogenisie- ren.Abkühlen auf ca. 40°C, Phase C zugeben und nochmals gut homogenisieren. Den pH-Wert mit Citronensäure auf 6-7 einstellen.
Beispiel 105: Feuchtigkeitsspendende Körperpflegecreme
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate 7,0 Mineral OiI
0,5 Shea Butter (Butyrospermum Parkii)
0,5 Aluminum Stearate
0,5 Magnesium Stearate
0,2 Bisabolol 0,7 Quaternium-18-Hectorite
B 5,0 Dipropylene Glycol
0,7 Magnesium Sulfate q.s. Konservierungsmittel
62,9 Aqua dem. C q.s. Parfümöl
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
WS 5% % Inhaltsstoff (INCI)
A 6,0 PEG-7 Hydrogenated Castor OiI
10,0 Cetearyl Ethylhexanoate
5,0 Isopropyl Myristate
7,0 Mineral OiI 0,5 Shea Butter (Butyrospermum Parkii)
0,5 Aluminum Stearate
0,5 Magnesium Stearate
0,2 Bisabolol
0,7 Quaternium-18-Hectorite B 5,0 Dipropylene Glycol
0,7 Magnesium Sulfate q.s. Konservierungsmittel 58,9 Aqua dem. C q.s. Parfümöl
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phase C zugeben und nochmals homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Beispiel 106: Flüssiges Make-up - Typ O/W
WS 1 %
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
6,0 Glyceryl Stearate
1 ,0 Cetyl Alcohol
8,0 Mineral OiI
7,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Dimethicone
B 3,0 Propylene Glycol
1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
61 ,9 Aqua dem.
C 0,1 Bisabolol
1 ,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14_ 264 q.s. Parfümöl
D 5,7 C. I. 77 891 , Titanium Dioxide
1 ,1 Iron Oxides
WS 5%
% Inhaltsstoff (INCI)
A 2,0 Ceteareth-6, Stearyl Alcohol
2,0 Ceteareth-25
6,0 Glyceryl Stearate
1 ,0 Cetyl Alcohol
8,0 Mineral OiI
7,0 Cetearyl Ethylhexanoate
0,2 Dimethicone
B 3,0 Propylene Glycol 1 ,0 Panthenol q.s. Konservierungsmittel
57,9 Aqua dem.
C 0,1 Bisabolol
5,0 wässrige Lösung mit ca. 5% Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
14. .264 q.s. Parfümöl
D 5,7 C. I. 77 891 , Titanium Dioxide
1 ,1 Iron Oxides
Herstellung: Die Phasen A und B getrennt auf ca. 80°C erwärmen. Phase B in Phase A einrühren und homogenisieren. Unter Rühren auf ca. 40°C abkühlen, Phasen C und D zugeben und nochmals gründlich homogenisieren. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Beispiel 107:
Im Folgenden sind erfindungsgemäße dermokosmetische Zubereitungen beschrieben, enthaltend das gemäß Beispiel 19 hergestellte keratinbindende Effektormolekül (Kera- tinbindedomäne gemäß SEQ ID No.: ID 168 gekoppelt mit dem Farbstoff 14_264). Besagtes keratinbindendes Effektormolekül wird in den folgenden Beispielen als Keratin- Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 bezeichnet. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass auch alle anderen in den Tabellen 6 und 7 beschriebenen Farbstoffe mit der KBD gemäß Beispiel 19, 19 a oder 19 b gekoppelt werden können und in den unten genannten Zubereitungen verwendet werden können.
Der genannte Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 KBD-D (SEQ ID No.: 168) wird als ca. 5 Gew.-% ige wäßrige Lösung eingesetzt. Die folgenden Angaben sind Gewichtsteile.
Klares Haarfärbe Shampoo
Klares Conditioner Shampoo zur Haarfärbung
Aqua dem. ad 100 ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Haartönung Schaum 0/W- Emulsionen
Haarfärbe Conditioner Shampoo mit Perlglanz
pH einstellen auf 6,0
Klares Conditioner Shampoo mit Volumen Effekt zur Haarfärbung
1 2 3
Sodium Laureth Sulfate - 0,5 1 ,00
Uvinul® MC 80 2,00 1 ,50 2,30
Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 10,0 15,0 5,0
Cocamidopropyl Betaine 2,50 2,60 2,20
Disodium EDTA 0,01 0,10 0,01
Konservierungsmittel, Parfümöl, Verdicker q.s. q.s. q.s.
Aqua dem. ad 100 ad 100 ad 100 pH einstellen auf 6,0
Haartönende Gelcreme
OW Sunscreenformulation
1 2 3 4 5 6 7
Glyceryl Stearate SE 0,50 1 , 00 3, 00 1 ,50
Glycerl Stearate Citrate 2,00 1 , 00 2, 00 4,00
Stearic Acid 3, 00 2, 00
PEG-40 Stearate 0,50 2,00
Cetyl Phosphate 1 ,00
Sodium Cetearyl Sulfate 0, 75
Stearyl Alcohol 3, 00 2,00 0, 60
Cetyl Alcohol 2,50 1 , 10 1 , 50 0,60 2, 00
Hydrodispersion
WO Sunscreen Emulsion
Sticks
PIT-Emulsion
Haut- oder haartönende Gelcreme
OW Formulations Selbstbräuner
I 2 I 3 I 4 I 5 I «
Hydrodispersion Selbstbräuner mit Tönungseffekt
Aqua dem. ad 100 ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Hydrodispersion After sun
WO-Emulsion
Feststoff stabilisierte Emulsion (Pickering Emulsions)
Sticks
Ölgel
Beispiel 108:
In den folgenden Rezepturen werden kosmetische Sonnenschutzzubereitungen, enthaltend eine Kombination aus mindestens einem anorganischen Pigment, bevorzugt Zinkoxid und/oder Titandioxid, Uvinul A Plus und weitere organische UV-A- und UV-B- Filter, beschrieben.
Die anorganischen Pigmente können dabei in gecoateter Form vorliegen, d.h. dass sie oberflächlich behandelt sind. Diese Oberflächenbehandlung kann beispielsweise darin bestehen, dass die Pigmente nach an sich bekannter Weise, wie in DE-A-33 14 742 beschrieben, mit einer dünnen hydrophoben Schicht versehen sind.
Die Herstellung der nachfolgend genannten Formulierungen erfolgt auf übliche, dem Fachmann bekannte Art und Weise.
Im Folgenden sind erfindungsgemäße dermokosmetische Zubereitungen beschrieben, enthaltend das gemäß Beispiel 19 hergestellte keratinbindende Effektormolekül (Kera- tinbindedomäne gemäß SEQ ID No.: ID 168 gekoppelt mit dem Farbstoff 14_264). Besagtes keratinbindendes Effektormolekül wird in den folgenden Beispielen als Keratin- Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 bezeichnet. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass auch alle anderen in den Tabellen 6 und 7 beschriebenen Farbstoffe mit der KBD gemäß Beispiel 19, 19 a oder 19 b gekoppelt werden können und in den unten genannten Zubereitungen verwendet werden können.
Der Gehalt an Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14_264 KBD-D (SEQ ID No.: 168) bezieht sich auf 100% Wirkstoff. Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann sowohl in reiner Form als auch als wässerige Lösung eingesetzt werden. Im Falle der wässerigen Lösung muss der Gehalt an Wasser dem. in der jeweiligen Formulierung angepasst werden.
5,00 Witconol® APM PPG-3 Myristyl Ether
5,00 Softisan 154 Hydrogenated Palm OiI
8,00 Paraffinöl, dickflüssig Mineral OiI
3,00 Vaseline Petrolatum
2,00 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264
32,00 Rizinusöl Ricinus Communis (Castor) OiI
3,00 Uvinul® MC 80 Ethylhexyl Methoxycinnamate
2,00 Uvinul® T 150 Ethylhexyl Triazone
2,00 Uvinul® A Plus Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
10,00 Z-COTE® MAX Zinc Oxide, Diphenyl Capryl Methicone
12,00 Bienenwachs 3044 PH Bees Wax
3,00 Vaseline Petrolatum
8,00 Candelillawachs LT 281 LJ Euphorbia Cerifera (Candelilla) Wax
8,00 Paraffinöl, dickflüssig Mineral OiI
5,00 Tegin Glyceryl Stearate SE
5,00 Softisan 154 Hydrogenated Palm OiI
5,00 Witconol APM PPG-3 Myristyl Ether
5,00 Dow Corning 345 Fluid Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane
0,10 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264
28,90 Rizinusöl Ricinus Communis (Castor) OiI
A 4,00 Dehymuls® SBL Polyglyceryl-2
Dipolyhydroxystearate, Dicaprylyl Ether, Cocoglycerides, Sorbitan Sesquioleate, Cera Alba, Aluminum Stearates, Dicocoyl Pentaerythrityl Distearyl Citrate
1 ,00 Dehymuls® PGPH Polyglyceryl-2 Dipolyhydroxystearate
8,00 Finsolv® TN C12-15 Alkyl Benzoate
4,00 Miglyol® 812 Caprylic/Capric Triglyceride
8,00 Uvinul® A Plus B Ethylhexyl Methoxycinnamate and Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate
2,00 Uvinul® N 539 T Octocrylene
B 5,00 T-Lite® SF Titanium Dioxide, Alumina Hydrate, Dimethicone/Methicone Copolymer
C 3,00 1 ,2-Propylenglykol Care Propylene Glycol
0,30 Abiol Imidazolidinyl Urea
1 ,00 Magnesiumsulfat-7-hydrat Magnesium Sulfate
63,50 Wasser dem. Aqua dem.
0,20 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff
1 ,00 Tinosorb® S Bis-Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine
3,00 Uvinul® MC 80 Ethylhexyl Methoxycinnamate
8,00 Miglyol® 812 Caprylic/Capric Triglyceride
1 ,50 Dow Corning® 350 Fluid Dimethicone
3,00 Z-COTE® MAX Zinc Oxide, Diphenyl Capryl Methicone
3,00 Finsolv® TN C12-15 Alkyl Benzoate
1 ,00 Cremophor® CO 40 PEG-40 Hydrogenated Castor OiI
B 2,00 Luvigel® EM Caprylic/Capric Triglyceride, Sodium Acrylates Copolymer
C 54,80 Wasser dem. Aqua dem.
D 15,00 Ethanol 96% Alcohol
5,00 1 ,2-Propylenglykol Care Propylene Glycol
0,50 Cremophor® A 25 Ceteareth-25
1 ,00 Keratin-Bindedomäne-Reaktivfarbstoff 14 264
1 ,00 Vitamin E-Acetat Tocopheryl Acetate
0,20 Bisabolol rac. Bisabolol

Claims

Patentansprüche
1. Keratinbindendes Effektormolekül, enthaltend (a) mindestens einen Reaktivfarbstoff (i) und (b) mindestens ein keratinbindendes Polypeptid (ii).
2. Keratinbindendes Effektormolekül nach Anspruch 1 , wobei das keratinbindende Polypeptid (ii) Bindungsaffinität zu menschlichem Haar-, Nagel- oder Hautkeratin besitzt.
3. Keratinbindendes Effektormolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das verwendete keratinbindende Polypeptid (ii)
(a) mindestens eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58,
60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 umfaßt, oder (b) einem Polypeptid entspricht, welches mindestens zu 40% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder
170 und in der Lage ist Keratin zu binden.
4. Keratinbindendes Effektormolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das verwendete keratinbindende Polypeptid (ii) kodiert wird von einem Nukleinsäure- molekül umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80,
82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138,140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145,
149, 152, 159, 161 , 163, 165, 167 oder 169 umfasst;
c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid gemäß der Sequenzen SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,
86, 88, 90, 92, 94, 96, 98100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 kodiert;
d) Nukleinsäuremolekül, mit einer Nukleinsäuresequenz entsprechend wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 oder
169 oder ein davon durch Substitution, Deletion oder Insertion abgeleitetes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches mindestens zu 40% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,
86, 88, 90, 92, 94, 96, 98100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 und in der Lage ist an Keratin zu binden;
e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid, welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird;
f) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein keratinbindendes Protein, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und
g) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein keratinbindendes Protein, das aus ei- ner DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente umfassend mindestens 15 Nukleotide als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann.
h) Nukleinsäuremolekül, welches durch Rückübersetzung einer der in den Se- quenzen SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,
34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,
74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108,
1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138,
140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 gezeig- ten Aminosäuresequenzen erzeugt werden kann.
5. Keratinbindendes Effektormolekül nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei der Reaktivfarbstoff (i) über wenigstens einen Reaktivanker verfügt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einer unter alkalischen Bedingungen aktivierbaren Gruppe der Formel 1 ,
Formel 1
worin die Bindung zum Farbstoffmolekül (F) bedeutet, X für einen elektronenziehenden Rest oder für ein Alkyl-, -O-Alkyl-, Cy- ano-, Hydroxy-, Halogen-Rest oder H steht, k für 1 , 2 oder 3 steht, n 0 oder 1 bedeutet, und
B für eine Gruppe CH=CH2 oder eine Gruppe CH2-CH2-Q oder -NH- CH2-CH2-Q oder -NH-CH=CH2 steht, worin Q für eine unter alkalischen Bedingungen abspaltbare Gruppe steht,
(b) einem Acrylamido-Anker der Formel 2,
Formel 2
worin
— die Bindung zum Farbstoffmolekül F bedeutet, und (c) einer der Verbindungen gemäß der Formeln 3, 4 oder 5,
Formel 3
Formel 4
Formel 5 worin
— die Bindung zum Farbstoffmolekül (F) bedeutet,
V Fluor oder Chlor bedeutet;
Ui, U2 unabhängig voneinander Fluor, Chlor oder Wasserstoff sind; und Qi, Q2 unabhängig voneinander Chlor, Fluor, Cyanamido, Hydroxy, (Ci-Cβ)-
Alkoxy, Phenoxy, Sulfophenoxy, Mercapto, (Ci-C6)-Alkylmercapto, Pyridino, Car- boxypyridino, Carbamoylpyridino, oder eine Gruppe der allgemeinen Formel (6) oder (7) bedeuten,
R2 / Formel 6 — N
^W — SO2Z
R3
Formel 7 — N
\4
worin R2 Wasserstoff oder (Ci-C6)-Alkyl, Sulfo-(Ci-C6)-Alkyl, oder Phenyl ist, das unsubstituiert oder durch (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Sulfo, Halogen, Carboxy, Acetamido, Ureido substituiert ist; R3 und R4 haben unabhängig voneinander eine der Bedeutungen von R2, oder sind eine Gruppe der allgemeinen Formel (8),
Formel 8
oder bilden ein cyclisches Ringsystem der Formel -(CHb)J- wobei j 4 oder 5 bedeutet, oder alternativ -(CH2)2-E-(CH2)2-, wobei E Sauerstoff, Schwefel, Sulfo, - NR5- mit R5'=(Ci-C6)-Alkyl ist; W ist Phenylen, das unsubstituiert oder substituiert ist durch 1 oder 2 Substituen- ten, wie (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Carboxy, Sulfo, Chlor, Brom, oder ist (d-
C4)-Alkylen-Arylen oder (C2-C6)-Alkylen, das unterbrochen sein kann durch Sauerstoff, Schwefel, Sulfo, Amino, Carbonyl, Carbonamido, oder ist Phenylen- CONH-Phenylen, das unsubstituiert oder durch (Ci-C4)-Alkyl, (Ci-C4)-Alkoxy, Hydroxy, Sulfo, Carboxy, Amido, Ureido oder Halogen substituiert ist, oder ist Naphthylen, das unsubstituiert oder durch eine oder zwei Sulfogruppen substituiert ist;
Z für eine Gruppe CH=CH2 oder eine Gruppe CH2-CH2-Q oder -NH-CH2-CH2-Q oder -NH-CH=CH2 steht, worin Q eine unter alkalischen Bedingungen abspaltbare Gruppe steht; R24, R25 und R26 sind (Ci-C4)-Alkyl oder (Ci-C4)-Hydroxyalkyl, und
B- ist das Äquivalent eines Anions, wie Hydrogensulfat, Sulfat, Fluorid, Chlorid, Bromid, Dihydrogenphosphat, Hydrogenphosphat, Phosphat, Hydroxid oder Ace- tat.
6. Keratinbindendes Effektormolekül nach Anspruch 5, wobei wenigstens einer der Reste X in Formel 1 für eine Gruppe SO3H steht.
7. Keratinbindendes Effektormolekül nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin B in Formel 1 für -CH=CH2, eine Gruppe -CH2-CH2-O-SO3H oder für -CH2-CH2CI steht.
8. Keratinbindendes Effektormolekül nach einem der Ansprüche 4 bis 7, worin die aktivierbare Gruppe der Formel 1 über eine Gruppe -NH-, -N=N-, -NH-C(O)-, - NH-SO2- oder -N(R)- an das Farbstoffmolekül (F) gebunden ist, wobei R für Al- kyl steht.
9. Keratinbindendes Effektormolekül nach Anspruch 8, wobei der Farbstoff (F) ausgewählt ist unter Farbstoffen der Phthalocyanin-Reihe, Antrachinon-Farbstoffen, Azofarbstoffen, Formazanfarbstoffen, Dioxazin-Farbstoffen, Actidin-Farbstoffen, Xanthen-Farbstoffen, Polymethin-Farbstoffen, Stilbenfarbstoffen, Schwefelfarbstoffen, Triarylmethanfarbstoffen, Benzopyranfarbstoffen, Dibenzanthron- farbstoffen und den Metallkomplexen dieser Farbstoffe.
10. Keratinbindendes Effektormolekül nach einem nach einem der Ansprüche 4 bis 9, worin „n" in Formel 1 null ist.
1 1. Keratinbindendes Effektormolekül nach den Ansprüchen 5 bis 10, enthaltend wenigstens einen Reaktivfarbstoff, worin die Reaktivanker gemäß der Formeln 1 bis 5 ausgewählt ist aus den nachfolgenden Resten (1-1 ) bis (1-43):
-SO2-CH2-CH2-O-SO3H —4 ^-SO2-CH2-CH2-CI -SO2-CH=CH2
(1-1 ) (1-2) (1-3)
U ^- SO,-CH,-CH,-O-SO,H K V-SO0-CH0-CH0-CI K V-SO0-CH=CH0
(1-4) (1-5) (1-6)
(1-10) (1-1 1 ) (1-12)
O2-CH2-CH2-O-SO3H
(1-13) (1-14) (1-15)
(1-16) (1-17) (1-18)
(1-22) (1-23) (1-24)
(1-25) (1-26) (1-27)
(1-28) (1-29) (1-30)
J VsO2-NH-CH2-CH2-O-SO3H —f\- SO2-NH-CH2-CH2-CI -/ V SO2-NH-CH=CH2
(1-31 ) (1-32) (1-33)
CH ,0—f VSO.-NH-CH.-CH.-O-SO,H CH,O— (/ ^-SO2-NH-CH2-CH2-CI CH,O— <f ^>— SO0-NH-CH=CH0
(1-34) (1-35) (1-36)
(1-40)
(1-37) (1-38) (1-39)
(1-41 ) (1-42) (1-43)
12. Keratinbindendes Effektormolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , wobei der Reaktivfarbstoff (i) indirekt über ein Linkermolekül an das keratinbindende Polypeptid (ii) gekoppelt ist.
13. Keratinbindendes Effektormolekül nach Anspruch 12, wobei ein Linkermolekül (iii) gemäß der Formel 9 oder 10 verwendet wird,
Formel 9
Formel 10
wobei „n" einer ganzen Zahl zwischen 0 und 40 entspricht.
14. Verwendung der keratinbindenden Effektormoleküle gemäß der Ansprüche 1 bis 13 in Haarfärbemittel.
15. Haarfärbemittel enthaltend ein keratinbindendes Effektormolekül gemäß der Ansprüche 1 bis 13.
16. Verfahren zum Färben von Haaren oder Haut mit wenigstens einem keratinbindenden Effektormolekül enthaltend
(a) mindestens ein keratinbindendes Polypeptid (ii) und
(b) einen Reaktivfarbstoff (i) oder Farbstoff.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei wenigstens eines der in den Ansprüchen 1 bis 13 definierten keratinbindenden Effektormoleküle verwendet wird.
18. Verfahren gemäß den Ansprüchen 16 bis 17, wobei es sich um eine reversible Färbung handelt, bei der das keratinbindende Effektormolekül durch eine Behandlung mit einer Lösung enthaltend i. keratinbindende Polypeptide, oder ii. Haut- oder Haarkeratin, oder iii. Detergenz, in einer Verdrängungsreaktion von Haut oder Haar entfernt wird.
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