EP2395969A2 - Verwendung von hydrophobin als spreitmittel - Google Patents

Verwendung von hydrophobin als spreitmittel

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Publication number
EP2395969A2
EP2395969A2 EP10704350A EP10704350A EP2395969A2 EP 2395969 A2 EP2395969 A2 EP 2395969A2 EP 10704350 A EP10704350 A EP 10704350A EP 10704350 A EP10704350 A EP 10704350A EP 2395969 A2 EP2395969 A2 EP 2395969A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hydrophobin
composition
use according
skin
spreading
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10704350A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heiko Barg
Thomas Subkowski
Marvin Karos
Claus Bollschweiler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to EP10704350A priority Critical patent/EP2395969A2/de
Publication of EP2395969A2 publication Critical patent/EP2395969A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates to the use of hydrophobin as a spreading agent, in particular in cosmetic or pharmaceutical compositions. It further relates to compositions for the treatment of surfaces, in particular cosmetic or pharmaceutical compositions for topical application, which contain hydrophobin as a spreading agent.
  • spreading ability describes the ability of substances or mixtures of substances (e.g., oils and creams) to deposit on a solid, e.g. the skin spontaneously spread and thereby form a thin film. This surface spreading is dependent on the viscosity and surface tension of the substances, the presence of surfactants, and the properties of the surface (such as the moisture content of the skin and the tallow content of the horny layer). Good spreading ability is e.g. in skin care products of advantage.
  • Spreitffen are substances whose addition to a liquid or semi-solid composition to an increase of the.
  • Composition covered surface leads.
  • Spreaders work by, for example, reducing the surface tension of a composition or by increasing the wettability of the treated surface. They thereby facilitate the even distribution of the composition and its ingredients, as well as the formation of a uniform film on the treated surface.
  • the spreading agent eliminates the tendency of high surface tension compositions (such as aqueous solutions) to form droplets on the treated surface which would result in spotting of the materials contained in the composition (so-called "spotting").
  • compositions on surfaces e.g. of cosmetic or pharmaceutical products on the skin is measurable (e.g., Zeidler, U. (1985) Fats, Soaps, Coating 87: 403), the measurement result is referred to as Spreitwert.
  • B.W. Barry u. AJ Grace developed a method for determining spreading capacity (J. Pharm. Sci., 61, 335 (1972)), and C. Beyer developed a model test system for testing spreadability (Arch. Pharm. [Weinh.] 310, 473, 729 and 858 (1977); CA 88, 79017 (1978); ZbI. Pharm. 118, 51 (1979)).
  • Spreading ability according to DIN 53900 is the ability of a substance to spontaneously cover a surface of a liquid or a solid. Spreitrac is therefore used in cosmetics as the property of a substance on the skin distribute, understood.
  • the unit of measure of the spreading coefficient is that of the quotient of the spreading surface over which the spreading takes place and the spreading time in which the spreading takes place. It is usually stated in [mm 2 / minutes].
  • Spreaders are needed in a variety of products, i.a. in plant protection products, agents for the care of technical surfaces, cosmetics and medicines.
  • Plant protection products are usually sprayed on the treated plants and must spread as evenly and quickly on the plants in order to ensure a rapid and uniform distribution of the active ingredient before it, for. can be rinsed by rain.
  • emulsions Spreading properties of emulsions, creams, ointments, gels, pastes, body milks and oils.
  • Cosmetic and pharmaceutical compositions are often OfW or W / O emulsions.
  • the spreading properties of emulsions are usually determined by their oil component (s) (synonym: oil body).
  • Spreading agents can be classified as low (water coverage: - divided ⁇ 300 mm 2/10 min), aspreitende (300 min 1000 mm 2/10) and insectspreitende spreading (> 1000 mm 2/10 min). This not only describes their behavior on the skin in terms of their dispersibility, but also the intensity and duration of their smoothing effect.
  • Spreitsch are usually oils or fats, so these will be explained in more detail below by way of example.
  • Fast spreaders are especially oils with many short-chain fatty acids (C6 to ClO), z. As coconut oil and babassu oil, but also plant butter. In addition, squalane is a very fast spreading fat component.
  • oils having medium length fatty acid chains (C 12 to C 16) or high lecithin or squalene content e.g. Avocado oil, sesame oil, grapeseed oil or amaranth oil.
  • the accompanying substances of these oils change their surface tension (for example, lecithins belong to the phospholipids and are surface-active lipids) and thus cause faster spreading on the skin (in comparison to their spreading behavior due to their fatty acid spectrum) and a better absorption capacity.
  • oils or other spreading agents can be combined with each other or with other substances according to their spreading behavior.
  • An emulsion that contains fast, medium and slow spreading oils next to each other ensures a more pleasing application and skin feel than emulsions with just one oil. This combination is also called a spreading cascade designated.
  • Formulations that do not consider spreaders of all three categories usually have a spread gap, ie a component with a specific effect that determines the duration or speed of the smoothness sensation is missing.
  • a spreading agent which does not have the disadvantages of oils as spreading agents and can replace them partially or completely in a composition and in particular is miscible with water.
  • Hydrophobins are a class of small, cysteine-rich proteins with a length of about 100-150 amino acids, which in nature occur only in filamentous fungi. They are amphiphilic and can form a water-insoluble layer on the surface of an article.
  • hydrophobin genes have been identified in ascomycetes, deuteromycetes and basiodiomycetes.
  • Some fungi contain more than one hydrophobin gene, e.g. Schizophyllum commune, Coprinus cinereus and Aspergillus nidulans.
  • hydrophobins of one class can to a certain extent functionally replace hydrophobins of the other class.
  • the various hydrophobins appear to be involved in different fungal development stages and to perform different functions therein (van Wetter et al (2000) Mol Microbiol 36: 201-210, Kershaw et al (1998) Fungal Genet., Biol. 23: 18 -33).
  • Hydrophobins usually have eight cysteine units. They can be isolated from natural sources, but also by genetic engineering can be obtained, as described for example in WO 2006/082251 and WO 2006/131564.
  • hydrophobin in cosmetic preparations is known per se.
  • US 2003/0217419 A1 describes the use of the SC 3 hydrophobin from S. ses for the treatment of keratin-containing materials. This forms cosmetic depots that should withstand several washes with shampoo.
  • the hydrophobin is applied either simultaneously with or after the cosmetically active ingredient, but not before applying the cosmetic ingredient.
  • WO 2006/136607 A2 describes the use of hydrophobin and of hydrophobin conjugates in cosmetic preparations for hair care.
  • WO 2006/082251 describes hydrophobin proteins, their production and their use for surface coating of glass and Teflon.
  • WO 96/41882 proposes the use of hydrophobins and the like. as surface-active substances, for hydrophilizing hydrophobic surfaces, for improving the water resistance of hydrophilic substrates and for producing emulsions, ointments, creams, hair shampoos and rinses.
  • Another object is to provide non-greasy compositions, especially aqueous compositions, having good spreading properties.
  • the spreading agent according to the invention should be usable on a large number of surfaces, especially on natural surfaces such as human and animal skin or plant surfaces.
  • the present invention relates to the use of hydrophobin as
  • Spreading It further relates to a composition containing hydrophobin as a spreading agent.
  • hydrophobin can be used as spreading agent in compositions for the treatment of various surfaces, such as for the treatment of technical surfaces (paint, metal, plastic) and natural surfaces (skin, hair, teeth, nails, leather, textiles, wool, vegetable surfaces). It preferably serves as a spreading agent in a cosmetic or pharmaceutical composition or in a pesticide.
  • hydrophobin preferably results in that the oil content required for spreading in the compositions can be reduced compared to compositions without hydrophobin, for example from 50% to 100%.
  • Hyrophobin can thus serve according to the invention as a partial or complete oil body replacement. Another effect is that this causes a shine on the treated surface, e.g. The skin is reduced or prevented because less or no oil or fat is applied to the surface.
  • hydrophobin may further result in improved uptake and / or addition of other ingredients of the hydrophobin-containing composition. It preferably effects an improved uptake and / or addition of one or more active substances, for example cosmetic and / or pharmaceutical active ingredients, into / on the tissue treated with the hydrophobin-containing composition, for example the skin.
  • active substances for example cosmetic and / or pharmaceutical active ingredients
  • hydrophilic substances such as cosmetically or pharmaceutically active substances, for example panthenol.
  • the active ingredients are more intense, because they arrive faster, more evenly and / or in higher local concentration and / or in the treated surface, and / or the time to complete washing of these substances is prolonged.
  • the uptake and distribution of crop protection active ingredients can be improved by hydrophobin as spreading agents.
  • the present invention relates to the following subjects or embodiments:
  • hydrophobin e.g. of hydrophobin of structural formula (I), as a spreading agent in a surface treatment composition
  • hydrophobin e.g. of hydrophobin of structural formula (I)
  • a cosmetic or pharmaceutical composition in particular a composition for the treatment of human or animal skin
  • a surface treatment composition comprising at least one hydrophobin, e.g. Hydrophobin of the structural formula (I), contains and preferably a cosmetic or pharmaceutical composition or a plant protection agent.
  • a hydrophobin may also encompass more than one hydrophobin molecule, namely, two, three, four, five, etc. hydrophobins of a variety.
  • At least one means “one or more”, “at least” followed by a numerical value means “this or a higher numerical value”.
  • the term “about” or “about” in connection with a numerical value or a parameter range limit denotes a blur area in which, in the opinion of the skilled person, the technical effect of the feature concerned is still ensured.
  • the term typically means a deviation from the specified numerical value by +/- 10%, preferably +/- 5%.
  • acids are present either as the free acid or as a partial or complete salt of the acid or as a mixture of the acid with its salt.
  • bases especially amines, may be present as the free base or as a partial or complete salt of the base or as a mixture of the base with its salt.
  • a wild-type or native protein or polypeptide unless stated otherwise, is the usually naturally occurring form of this protein / polypeptide.
  • a "fragment" of an amino acid sequence results from the absence of one or more consecutive amino acids at the N and / or C terminus of said original sequence.
  • a "homologue" of an amino acid sequence in the context of the present invention is a protein or polypeptide which differs from the original sequence by the substitution of one or more amino acids.
  • the Function and / or conformation of the protein is not affected by this substitution.
  • the amino acid substitution is a conservative amino acid exchange, the exchanged amino acids are therefore replaced by amino acids with similar chemical properties, eg VaI by Ala.
  • conservative amino acid exchanges occur between the members of the following groups: acidic amino acids (aspartate and glutamic acid); basic amino acids (lysine, arginine, histidine); - hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine, methionine, valine, alanine); hydrophilic amino acids (serine, glycine, alanine, threonine);
  • Amino acids with aliphatic side chains (glycine, alanine, valine, leucine,
  • Amino acids with hydroxyaliphatic side chains (serine, threonine); - amino acids with amide groups in the side chain (asparagine, glutamine);
  • isolated means "separated or purified from the parent organism". An isolated hydrophobin is therefore no longer part of the fungus in which it occurs in nature. Recombinantly produced hydrophobins are also "isolated” hydrophobins.
  • hydrophilic and hydrophobic have the usual meaning in the chemical jargon.
  • a “hydrophilic” substance is therefore a substance which is preferably soluble in water and / or polar solvents. Hydrophilic substances are typically polar compounds that are either ionic, have a dipole moment, and / or contain electronegative groups. In contrast, a “hydrophobic” substance dissolves preferentially in nonpolar media and has no ionic functional groups and only weakly electronegative functional groups.
  • non-greasy has the same for pharmaceuticals and cosmetics in the
  • the present invention relates to the use of hydrophobin as a spreading agent and to corresponding hydrophobin-containing compositions.
  • the formulation of products containing oil bodies as spreading agents, in particular of cosmetics, pharmaceuticals and pesticides, is state of the art.
  • the object of the present invention was to develop formulations which, despite a reduced content of oil body, have very good properties, in particular good spreadability.
  • the use according to the invention of hydrophobin as spreading agent preferably also has good sensory properties, in particular a silky feel on the skin, high lubricity after the product has entered the skin and low tackiness.
  • hydrophobin can serve as a spreading agent instead of the usual oil bodies since hydrophobin is a protein and proteins are usually not used as spreading agents.
  • the composition has an oil body concentration less than the oil body concentration in a composition of the same ingredients but without hydrophobin and having a higher oil body content if both compositions have the same spreading behavior.
  • the composition preferably has an oil body concentration of from 0 to 20% by weight, particularly preferably from 0 to 10% by weight, very particularly preferably from 0 to 5% by weight.
  • the spreading agent has a wetting function and causes an optimal distribution of the remaining components over a large area. It is achieved by the fact that it does not come on the treated surface to partial over-concentrations, which would be visible as spotting (spotting).
  • hydrophobin as spreading agent furthermore leads to an improved spreadability of a composition on the surface, for example a cosmetic composition on the skin.
  • This distributability is essential in particular for a preparation containing active ingredient in order to ensure a good, uniform distribution of the Active ingredients on the surface, such as the skin, to ensure.
  • Criterion for a good dispersibility is the spreadability of the hydrophobin.
  • composition present in all embodiments of the invention which contains hydrophobin as a spreading agent, is usually a liquid or semi-solid composition.
  • "Semi-solid compositions” have the properties attributed to them in the definition given in the European Pharmacopoeia (Ph. Eur., 6th ed.)
  • the compositions used in the invention are not exclusively pharmaceutical or cosmetic compositions
  • all compositions are those which serve to treat surfaces, but the hydrophobin is preferably used in a pharmaceutical or cosmetic composition as a spreading agent.
  • a composition according to the invention may be an emulsion, cream, gel, paste, ointment, body milk, lotion, foam, suspension, milk or paste.
  • the skincare compositions according to the invention are in particular W / O or O / W emulsions.
  • Specifically skincare according to the invention are selected from the group consisting of skin creams, day and night creams, eye creams, face creams, anti-wrinkle creams, sunscreen creams, moisturizing creams, bleaching creams, self-tanning creams, vitamin creams, skin lotions, body lotions and moisturizing lotions.
  • a solution as e.g. is used in a spray is possible.
  • an aqueous solution is preferred. Solutions are particularly preferred when using hydrophobin as a spreading agent in a plant protection product.
  • the composition according to the invention in which hydrophobin is used as spreading agent, is a hydrophilic composition, in particular a solution, a hydrophilic ointment or hydrophilic cream.
  • the hydrophobin is advantageously contained in a composition which preferably also contains an acceptable carrier medium, depending on the field of application, for example, a cosmetically, pharmaceutically or plant protection acceptable carrier medium.
  • the inventive composition according to embodiment (4), in which the hydrophobin according to any one of embodiments (1) to (3) is used as a spreading agent, in one aspect of the present invention is a composition in which the carrier medium is water, one or more hydrophilic solvents, or a mixture of water and one or more hydrophilic solvents.
  • the proportion of water and / or hydrophilic solvents in the composition is preferably more than 40% by weight, particularly preferably more than 50% by weight, very particularly preferably more than 60% by weight, 70% by weight, 80% by weight, 90% by weight or 95% by weight. Particular preference is given to using exclusively water and / or hydrophilic solvents as the carrier medium. Most preferably, the only carrier medium is water.
  • compositions such as creams, lotions or milks, e.g.
  • Personal care products usually contain oil bodies (synonymous: oil component), which help to optimize the spreading behavior.
  • oil bodies are usually contained in a total amount of more than 50% by weight, usually from 5 to 50% by weight, predominantly from 5 to 25% by weight, in conventional compositions.
  • the hydrophobin is used according to the invention in compositions which contain little or no fat or oil, ie little or no oil component.
  • Oil components are in particular oil, fats, waxes and silicone compounds, especially hydrophobic lipids such as hydrocarbons, silicone oils, fatty alcohols and fatty acid esters.
  • compositions according to the invention containing hydrophobin as spreading agent contain less than 50% by weight of oil component, more preferably less than 40% by weight, very particularly preferably less than 25% by weight, 20% by weight, 15% by weight, 10% by weight. in particular less than 5% by weight, and most preferably 0% by weight of the oil component.
  • the hydrophobin is used as a spreading agent in a composition that is free of oil components.
  • the hydrophobin is used in a composition which contains less than 5% by weight of emulsifiers and is particularly preferably free of emulsifiers. This avoids a disadvantage of emulsifiers: the undesirable washing out of fats from the skin occurring during skin cleansing by emulsifiers which have remained on or in the skin.
  • the hydrophobin is used as a spreading agent in a non-greasy composition, especially in a non-greasy cream or lotion, such as e.g. a skin cream.
  • compositions with hydrophobin as spreading agent make do with a minimum of oil component and require no further auxiliaries for emulsion formation or for improving the spreading behavior. This is particularly suitable for sensitive skin.
  • the object of the present invention is for the treatment of surfaces.
  • the inventive composition according to embodiment (4), in which the hydrophobin according to any one of embodiments (1) to (3) is used as a spreading agent, is a surface treatment agent.
  • Surfaces to be treated according to the invention are all surfaces on which a spread of the By means of surface treatment after application to the surface is desired. This includes technical and natural surfaces.
  • the technical surfaces which can be treated according to the invention include surfaces made of plastic, paper, metal, lacquer, textiles, leather or other natural substances, in particular keratin-containing textiles, leather and paper.
  • surface treatment agents according to the invention are e.g. also car polishes, cleaning agents, impregnating agents, paper treatment agents and shoe polish.
  • the natural surfaces which can be treated according to the invention include herbal and animal materials, in particular plant, human or animal body surfaces.
  • the preferred natural surfaces are human or animal body surfaces.
  • these are keratin-containing surfaces such as skin, hair, nails, horns, wool, leather, fur, fur and feathers.
  • hair and skin Particularly preferred are hair and skin.
  • hydrophobin is used according to the invention as a spreading agent in a composition for the treatment of skin and the composition according to embodiment (4) is suitable for the treatment of the skin. Human skin is preferred.
  • the preferred natural surfaces are vegetable material, especially plant surfaces, such as e.g. be wetted by these agents when pesticides are applied.
  • the preferred treated surface of vegetable material is a cellulosic surface, especially paper.
  • Another aspect of the present invention is the use of hydrophobin for the manufacture of one of the said agents for the treatment of Surfaces, in particular a plant protection product, a cosmetic or a medicament.
  • hydrophobin-containing compositions are basically all for the targeted application of a liquid or semi-solid medium on a technical or natural surface available methods and techniques into consideration.
  • technical surfaces these include, for example, immersion, printing, painting or spraying methods and application by means of brushes, doctor blades or corrugating rolls.
  • natural surfaces these are in particular spreading (creaming), lathering, spraying and brushing.
  • Applying the composition of the composition depends on the nature of the nature of the surface to be coated, or the shape of the surface having body.
  • e.g. Metal or paper can be used in conventional painting processes, whereas in curved molds, spraying techniques are more suitable.
  • Skin is preferably creamed or sprayed while hair is preferably treated by lathering or spraying.
  • compositions serving for the surface treatment require the presence of at least one hydrophobin in a composition serving for the surface treatment.
  • This composition preferably contains further ingredients, in particular at least one substance which serves to care for the treated surface, such as panthenol, vitamins or bisabolol in cosmetic and pharmaceutical skin or hair care products.
  • a multiplicity of different active substances and effect substances can be formulated. If the composition is a cosmetic or pharmaceutical composition, it preferably contains other than hydrophobin pharmaceutically or cosmetically acceptable ingredients. Details of these ingredients are discussed below.
  • hydrophobin or “hydrophobins” are preferably polypeptides of the general formula (I)
  • X is for each of the 20 naturally occurring amino acids (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, Glu, Gly ) can stand.
  • the radicals X may be the same or different. In this case, the indices standing at X each represent the number of amino acids in the respective subsequence X.
  • indices n and m independently represent natural numbers. In general, neither m nor n are zero, but are usually 1 or more.
  • m and n can be independently from 1 to 500. Preferably, m and n are independently from 15 to 300.
  • the amino acids designated C * to C ° are preferably cysteines; but they can also be replaced by other amino acids of similar space filling, preferably by alanine, serine, threonine, methionine or glycine. However, at least four, preferably at least five, particularly preferably at least six, and in particular at least seven, of the positions C * to C ° should be occupied by cysteine. Cysteines at the positions C * to C ° may either be reduced in the inventive proteins or form disulfide bridges with one another.
  • the intramolecular formation of CC bridges in particular the formation of at least one, preferably two, more preferably three and most preferably four intramolecular disulfide bridges.
  • cysteines by amino acids of similar space filling, it is advantageous to replace those C-positions in pairs, which in the presence of Cys at the affected positions can form intramolecular disulfide bridges with one another.
  • positions indicated by X are also a cysteine, serine, alanine, glycine, methionine or threonine, the numbering of the individual C positions in the general hydrophobin formulas may change accordingly. Additional cysteines at X positions are also capable of forming disulfide bridges.
  • X and C and the indices standing at X have the above meaning.
  • the indices n and m stand for natural numbers including the number zero. In general, neither m nor n are zero, but are usually 1 or more.
  • m and n can be independently from 1 to 500.
  • m and n are independently from 15 to 300.
  • it is preferable at least six of the residues named C are cysteine, more preferably all residues C are cysteine. Most preferably, at least a pair of these cysteines form a disulfide bridge, and the formation of more than one disulfide bridge, that is, 2, 3, or 4 of these bridges, is most preferred.
  • X and C and the indices standing at X have the above meaning.
  • the indices n and m are natural numbers from 1 to 200.
  • at least six of the radicals named C are cysteine.
  • all of the C radicals are cysteine.
  • at least a pair of these cysteines form a disulfide bridge, and the formation of more than one disulfide bridge, that is, 2, 3, or 4 of these bridges, is most preferred.
  • the groups X n and X m in each of the formulas (I) to (III) may be peptide sequences which are naturally linked to the other components of the hydrophobin. However, one or both groups may be peptide sequences that are not naturally linked to the other components of the hydrophobin. These are also to be understood as meaning those groups X n and / or X m in which a peptide sequence occurring naturally in the protein is extended by a peptide sequence which does not occur naturally in the protein.
  • the group X n and / or X m may contain, wholly or in part, peptide sequences which do not naturally occur in the hydrophobin protein.
  • fusion partners are usually at least 20, preferably at least 35 amino acids long. They may, for example, be sequences from 20 to 500, preferably from 30 to 400 and particularly preferably from 35 to 100 amino acids.
  • the fusion partner can be selected from a variety of proteins. Only a single fusion partner can be linked to the remainder of the polypeptide, or multiple fusion partners can be linked to the remainder of the polypeptide. For example, two fusion partners at one of the X n or X m positions may be linked to the rest of the polypeptide, or there may be one or more fusion partners at each of the two positions.
  • Suitable fusion partners are disclosed, for example, in WO 2006/082251, WO 2006/082253, WO 2006/131564 and WO 2007/014897. These fusion partners are preferred fusion partners in the context of the present invention.
  • Particularly suitable fusion partners are proteins which occur naturally in microorganisms, preferably in prokaryotes, in particular in Escherichia coli or Bacillus subtilis.
  • particularly suitable fusion partners are the polypeptides with the sequences yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251, see Figure 1 of this application, SEQ ID NO: 15 or 16 in WO 2007/014897, see Figures 9 and 10, respectively) this application), yaae (SEQ ID NO: 18 in WO 2006/082251, see Figure 2 of this application), ubiquitin and thioredoxin.
  • fusion partners are yaad and truncated sequences derived therefrom, as described in the present description and in WO 2006/082251 and WO 2007/014897.
  • yaad and yaad40 are yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO. '26 from WO 2007/014897) which has a yaad residue truncated to 40 amino acids.
  • fragments or homologs of said sequences which comprise only one contiguous portion, for example from 70 to 99%, preferably from 5 to 50%, and more preferably from 10 to 40% of the amino acids of said sequences, or in which individual Amino acids, or nucleotides are exchanged with respect to the said sequence, wherein the percentages in each case refers to the total number of amino acids.
  • Preferred exchanges are described above under "Definitions”.
  • the hydrophobin - optionally in addition to one of the aforementioned fusion partners - as one of the groups X n or X m or as a terminal component of such a group still a so-called affinity domain (affinity tag / affmity tail) on.
  • affinity domains include (His) k, (Arg) k, (Asp) k, (Phe) k or (Cys) k
  • k is generally a natural number from 1 to 10. It is preferably a (His) k group, where k is one of the numbers four to six.
  • the group X n and / or X m can consist exclusively of such a affinity domain or of naturally or not naturally linked to the rest of the polypeptide amino acids or polypeptides and such affinity domain.
  • the hydrophobin is additionally modified on its polypeptide sequence, for example by glycosylation, acetylation or else by chemical cross-linking, for example with glutaric dialdehyde.
  • Hydrophobins their sequences and their preparation are disclosed, for example, in WO 2006/082251, the contents of which are hereby expressly incorporated into the present invention.
  • the hydrophobins described in WO 2006/082251 are preferred for carrying out the present invention.
  • Particularly preferred hydrophobins for carrying out the present invention are the hydrophobins of the type dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basF, basf2, especially hydrophobins of the type dewA (in the examples in the fusion proteins "hydrophobin A" and "hydrophobin B", respectively).
  • hypA and hypB especially hydrophobins of the dewA type.
  • hydrophobins and their sequences are disclosed, for example, in WO 2006/082251 and WO 2007/014897, the contents of which are hereby expressly incorporated into the present invention. Unless otherwise indicated, the sequence names and SEQ ID numbers given below refer to sequences disclosed in WO 2006/082251. An overview table with the SEQ ID numbers from WO 2006/082251 can be found in WO 2006/082251 on page 20 (FIG. 15 of this application).
  • hydrophobins selected from the group consisting of yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20, Figure 4 of this application), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22, Figure 6 of this application) and yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24, Figure 8 of this application) with the polypeptide sequences given in parentheses and the nucleic acid sequences coding therefor, in particular the sequences according to SEQ ID NO: 19, 21, 23 ( Figures 3, 5 7 of this application).
  • proteins derived from the polypeptide sequences shown in SEQ ID NO: 20, 22 or 24 are particularly preferred embodiments.
  • the biological property of the proteins is understood here to mean the change in the contact angle described below and / or the effect on the skin and / or keratin described below.
  • Hydrophobins particularly suitable for practicing the present invention are further from yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20, Figure 4 of this application), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22, Figure 6 of this application ) or yaad-Xa-basfl-hi (SEQ ID NO: 24, Figure 8 of this application) by truncation of the yaad fusion partner derived hydrophobins.
  • a shortened yaad residue can advantageously be used.
  • the truncated residue should, however, comprise at least 20, preferably at least 35, contiguous amino acids of the yaad sequence.
  • a truncated radical having 20 to 293, preferably 25 to 250, more preferably 35 to 150 and most preferably 35 to 100 amino acids can be used.
  • a particularly suitable protein is yaad40-xadewA-his (SEQ ID NOS: 25 and 26 in WO 2007/014897, see Figures 13 and 14 of this application), which has a reduced to 40 amino acids yaad residue.
  • a cleavage site between the fusion partner or fusion partners and the remainder of the polypeptide can be used to cleave off the fusion partner (for example by BrCN cleavage on methionine, factor Xa, enterokinase, thrombin, TEV cleavage etc.).
  • an Xa interface for example an interface of the hydrophobins used in the examples.
  • hydrophobins are surface-active polypeptides. They can be isolated from natural sources, but can also be obtained by genetic engineering. In principle, both hydrophobins of one and the other origin are suitable for carrying out the present invention.
  • hydrophobins used according to the invention can be prepared chemically by known methods of peptide synthesis, for example by solid phase synthesis according to Merrifield.
  • Naturally occurring hydrophobins can be isolated from natural sources by suitable methods. As an example, let Wösten et. al, Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) or WO 96/41882.
  • hydrophobins containing a fusion partner can preferably be carried out by genetic engineering methods in which a nucleic acid coding for the fusion partner and a coding for the rest of the polypeptide sequence, in particular DNA sequence, are combined so that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence.
  • a production method for example, is disclosed by WO 2006/082251 or WO 2006/082253.
  • the fusion partners greatly facilitate the production of hydrophobins.
  • Hydrophobins containing a fusion partner are produced in genetically engineered processes with significantly better yields than hydrophobins that do not contain a fusion partner.
  • hydrophobins produced by the host organisms according to the genetic engineering process can be worked up in a manner which is known in principle and purified by means of known chromatographic methods.
  • hydrophobins are used to carry out the invention.
  • the fermented cells are first separated from the fermentation broth, digested and the cell debris from the inclusion bodies
  • inclusion bodies separately.
  • the latter can be done advantageously by centrifuging.
  • the inclusion bodies for example by acids, bases and / or detergents can be digested in a manner known in principle in order to liberate the hydrophobins.
  • the inclusion bodies with the hydrophobins used according to the invention can generally be completely dissolved within about 1 h already using 0.1 M NaOH.
  • the solutions obtained may, if appropriate after adjusting the desired pH, be used for carrying out this invention without further purification.
  • the hydrophobins can also be isolated from the solutions as a solid. The isolation can preferably be carried out by means of spray granulation or spray drying, as described in WO 2006/082253, page 12.
  • the products obtained by the simplified work-up and purification process comprise, in addition to residues of cell debris, usually about 80 to 90% by weight of proteins.
  • the amount of hydrophobins is generally from 30 to 80% by weight with respect to the amount of all proteins.
  • the isolated hydrophobin-containing products can be stored as solids.
  • hydrophobins can be used as such or after cleavage and separation of the fusion partner for carrying out this invention.
  • Cleavage is advantageously carried out after isolation of the inclusion bodies and their dissolution.
  • a biological property of the hydrophobins is the change of surface properties when a surface, e.g. a glass surface coated with hydrophobin proteins.
  • the change in the surface properties can be determined experimentally, for example, by measuring the contact angle of a water drop before and after coating the surface with the proteins and determining the difference between the two measurements.
  • contact angle measurements is known in principle to the person skilled in the art.
  • the measurements are made, for example, at room temperature with a water drop of 5 ⁇ l and using glass slides as substrate carried out.
  • the exact experimental conditions for an example suitable method for measuring the contact angle are shown in Example 10 of WO 2006/136607.
  • the hydrophobins used can increase the contact angle.
  • the hydrophobins can increase the contact angle by at least 20 °, preferably at least 25 °, particularly preferably at least 30 °, at least 40 °, at least 45 °, in particular at least 50 °, in each case compared with the contact angle of a water droplet of the same size with the uncoated glass surface ,
  • hydrophobin is used as spreading agent.
  • the hydrophobin increases the contact angle of a hydophobin-containing composition according to the invention having a surface, for example by at least 5%, preferably at least 20 °, particularly preferably at least 25 °, at least 30 °; at least 40 °; increased at least 45 °, in particular at least 50 °, in each case compared with the contact angle of an equal drop of the composition without hydrophobin with the untreated surface.
  • the hydrophobin as a spreading agent increases the contact angle to the same extent when a surface is first treated with hydrophobin and then with another composition.
  • the present invention relates to the effect of hydrophobin on the spreading behavior of compositions, in particular of cosmetic or pharmaceutical compositions.
  • the binding of hydrophobin to the skin and hair can be tested as described in Examples 1 to 4 (identical to Examples 11 to 14 of WO 2006/136607).
  • the spreading behavior can be tested as described in Example 5.
  • the composition of the present invention according to embodiment (4) and the compositions resulting from the use of hydrophobin according to embodiment (1) to (3) preferably contain the hydrophobin in a concentration of 0.001 to 10% by weight, preferably 0.01 to 5% by weight .%, Particularly preferably an amount of 0.05 to 3 wt.%, Most preferably from 0.1 to 1 wt.% Total hydrophobin based on the total composition.
  • hydrophobin concentration of up to 0.2% by weight, more preferably from 0.01 to 0.05% by weight, most preferably 0.025% by weight.
  • the total hydrophobin is the total amount of hydrophobin molecules of one or more hydrophobin molecular species in the composition.
  • said hydrophobin concentrations are either already present in the inventive compositions according to embodiment (4) or the compositions used in the use of the hydrophobin according to embodiments (1) to (3), or they are prepared by diluting a concentrate prior to use of the composition receive.
  • the composition according to the invention may contain only one hydrophobin or else a combination of different hydrophobins, for example a composition comprising two or three hydrophobins.
  • a hydrophobin or a combination of different hydrophobins can be used.
  • the substances present in addition to hydrophobin in a composition according to the invention may in principle be hydrophobic or hydrophilic.
  • at least one other ingredient in addition to the hydrophobin and the carrier medium in embodiments (1) to (4) is a hydrophilic ingredient, in particular a hydrophilic drug or a hydrophilic effector molecule.
  • the hydrophobin improves its binding to the surface of the treated tissue, such as the skin, as it can render the surface more hydrophilic.
  • hydrophobic substances can penetrate a hydrophobin layer on the surface and intercalate into the deeper layers. Such stabilized hydrophobic substances remain longer on the treated tissue.
  • Their use as ingredients in a hydrophobin-containing composition according to the invention is therefore also an aspect of the present invention.
  • the use of at least one hydrophilic drug is preferred in all uses and compositions of the invention.
  • the greater part of the active ingredients present is particularly preferably hydrophilic (more than 50% by weight, based on the total active ingredients), very particularly preferably all the active substances present are hydrophilic. The same applies to effector molecules.
  • hydrophobin can also improve the uptake and retention of drugs that are applied to the surface simultaneously with or after the hydrophobin.
  • Hydrophobin can serve in particular as a penetration enhancer, that is to say to increase the amount of a further substance, in particular of an active substance, which penetrates into the surface per unit of time or passes through the surface.
  • Hydrophobin as a spreading agent may further alter the surface properties of the treated surface to alter the spreading behavior of subsequently applied compositions. This is especially true in a pretreatment of the surface to be treated with a hydrophobin-containing composition prior to applying a further composition whose propagation is to be promoted on the surface by the hydrophobin as a spreading agent.
  • steps (b) and (b) are carried out either simultaneously or sequentially.
  • steps (a) and (b) are carried out simultaneously, only one composition is applied, which then contains both the hydrophobin and the ingredients of the further composition.
  • This one composition can be prepared by mixing two separate compositions, one of which contains the hydrophobin.
  • step (a) and (b) are carried out successively (ie step (a) before step (b))
  • the hydrophobin preferably in the form of a hydrophobin-containing composition
  • the treated surface eg the skin
  • This composition acts for a certain exposure time long the surface.
  • another composition is applied to the surface.
  • the application of the last-mentioned composition can be directly followed by the action time of the hydrophobin-containing composition, or further steps (ie one or more steps) are carried out between steps (a) and (b).
  • these further steps may be any measures used for surface treatment, as long as they neither remove the hydrophobin layer nor affect the final result of the surface treatment.
  • a step is the drying of the surface after application of the hydrophobin-containing composition.
  • the steps of the method can also be repeated several times.
  • Example 5 The sequence and nature of the individual steps in Example 5 is a preferred way of carrying out the process (1) according to the invention. From these steps, a selection can be made, as far as it meets the above requirements.
  • the hydrophobin is used as a spreading agent in a pharmaceutical or cosmetic composition. Preference is given to cosmetic compositions.
  • compositions which usually contain one or more pharmaceutically active substances in effective concentration. These compositions also need to be improved both in terms of their spreadability to the skin and their sensory properties.
  • the hydrophobin is part of an agent for treating external body surfaces, such as the skin, hair or nails, in particular for the treatment of human hair, skin or nails.
  • the agent is particularly preferably a cream, an ointment, a lotion or an aqueous solution such as a spray.
  • it is an agent for treating large areas of skin, such as a sunscreen (spray, lotion or cream), a skin care product, or an insect repellent.
  • it is a pigment or dye-containing agent whose uniform distribution is desirable to avoid uneven discoloration of the skin or hair, such as a self-tanner, foundation, make-up or hair dye.
  • a cosmetic or pharmaceutical composition according to the invention generally contains at least one cosmetically or pharmaceutically acceptable carrier medium and may additionally contain other ingredients customary in cosmetics or pharmaceuticals.
  • hydrophobin as spreading agent can have further advantageous effects in addition to the abovementioned advantages.
  • the application of hydrophobin increases the intensity and consistency of dyeing by hair dyes (see, EP 08 16 2556.8) and can also extend the residence time of other cosmetic ingredients on hair (US 2003/0217419 Al).
  • the cosmetic or pharmaceutical compositions according to the invention generally contain a cosmetically or pharmaceutically acceptable medium and also suitable further ingredients which support the cosmetic or pharmaceutical action, in particular customary auxiliaries and additives in cosmetics and pharmaceuticals. These ingredients should not adversely affect the treatment outcome.
  • suitable further ingredients which support the cosmetic or pharmaceutical action, in particular customary auxiliaries and additives in cosmetics and pharmaceuticals. These ingredients should not adversely affect the treatment outcome.
  • Such base formulations for cosmetic and pharmaceutical compositions and the ingredients suitable therefor are well known to those skilled in the art and found in cosmetic manuals, such as e.g.
  • inventive compositions are, inter alia, as cosmetic or pharmaceutical preparations, for example as creams, emulsions, gels or surfactant-containing foaming solutions, such as shampoos, foam aerosols or other preparations which are suitable for use on body surfaces, in particular on skin and / or hair, ready-made.
  • cosmetic or pharmaceutical preparations for example as creams, emulsions, gels or surfactant-containing foaming solutions, such as shampoos, foam aerosols or other preparations which are suitable for use on body surfaces, in particular on skin and / or hair, ready-made.
  • Usual constituents of such aqueous cosmetic or pharmaceutical preparations are, for.
  • As wetting and emulsifying agents such as anionic, nonionic and ampholytic surfactants, eg. As fatty alcohol sulfates, alkanesulfonates, ⁇ -olefinsulfonates, Fettalkoholpolyglykolethersulfate, Ethylenoxidenvironrungs- products of fatty alcohols, fatty acids and alkylphenols, sorbitan fatty acid esters and fatty acid partial glycerides, fatty acid alkanolamides and thickeners, such as.
  • methyl or hydroxyethyl cellulose starch, fatty alcohols, paraffins, fatty acids, perfume oils and skin and / or hair care additives, such as.
  • water-soluble cationic ampholytic and anionic polymers protein derivatives, pantothenic acid, cholesterol, dyes, drugs such as panthenol, allantoin, pyrrolidone carboxylic acids and their salts, plant extracts and vitamins, light stabilizers, consistency regulator such as sugar esters, polyol esters or polyol, waxes such as beeswax and montan wax, complexing agents such as EDTA, NTA and phosphonic acids, swelling and penetrating substances such as glycerol, propylene glycol monoethyl ethers, carbonates, bicarbonates, guanidines, ureas and primary, secondary and tertiary phosphates, pearlescing agents such as ethylene glycol mono- and distearate,
  • Propellants such as propane-butane mixtures, N 2 O, dimethyl ether, CO 2 and air and antioxidants.
  • the cosmetic or pharmaceutical preparation is used for application to the skin (topically), teeth or hair.
  • Topical preparations are to be understood as meaning those preparations which are suitable for applying one or more active ingredients to the skin in fine distribution and preferably in a form absorbable by the skin.
  • Preparations which contain no or only a small amount (preferably less than 20% by weight, more preferably less than 10% by weight, very preferably less than 5% by weight) of oil bodies are preferred.
  • the surface treatment cosmetic or pharmaceutical agent of the present invention contains a carrier.
  • a carrier is water, a water-based or hydrophilic liquid, a gel, an ointment, a cream, an emulsion or microemulsion, a dispersion or a mixture thereof.
  • the mentioned carriers show good skin tolerance. Particularly advantageous are hydrophilic gels, hydrophilic ointments or hydrophilic creams.
  • compositions according to the invention can be used irrespective of the type of cosmetic or pharmaceutical preparation, for. B. as a cream, gel or shampoo have a weakly acidic, neutral or alkaline pH. Preference is given to a pH range of 6 to 8. The pH is adjusted by means of customary pH adjusters, but preferably not with ammonia or other chemicals considered harmful.
  • compositions according to the invention additionally contain, in addition to hydrophobin, at least one cosmetically or pharmaceutically active ingredient whose uptake and / or effect is improved by the presence of hydrophobin, is additionally applied to the treated surface.
  • compositions according to the invention additionally contain, in addition to hydrophobin, at least one cosmetically or pharmaceutically active ingredient whose
  • the additional cosmetically or pharmaceutically active ingredient is preferably hydrophilic.
  • hydrophobin as a spreading agent is preferably not a therapeutic treatment of the human or animal body. It is used in this regard only non-therapeutic purposes, such as
  • hydrophobin-containing composition Improvement of the distribution of the hydrophobin-containing composition on the treated surface.
  • it is used in particular for cosmetic purposes, so it is preferably a cosmetic use.
  • Preferred cosmetically active ingredients whose uptake is improved by hydrophobin are described in WO 2006/136607 as "effector molecules", to the corresponding passages of which reference is expressly made.
  • effector molecules can be used as cosmetically active ingredients in the compositions according to the invention.
  • effector molecule refers to molecules which have a certain, predictable effect. These can be either proteinaceous molecules, such as enzymes, or else non-proteinogenic molecules, such as dyes, light stabilizers, vitamins and fatty acids, sugars or metal ion-containing compounds.
  • sugars are glucans and especially sugars of natural origin, such as e.g. from honey or grain, preferred.
  • enzymes peptides and antibodies are preferred.
  • oxidases peroxidases, proteases, tyrosinases, metal-binding enzymes, lactoperoxidase, lysozyme, amyloglycosidase, glucose oxidase, superoxide dismutase, photolyase, catalase.
  • hydrolysates of proteins from plant and animal sources for example hydrolyzates of proteins of marine origin, milk or silk hydrolyzates.
  • peptides used for anti-aging such as matrixyl (INCI name glycerol-water-butylene glycol-carbomer).
  • matrixyl INCI name glycerol-water-butylene glycol-carbomer.
  • non-protein anti-aging agents e.g. Caffeine
  • antioxidants are preferred as effector molecules.
  • Antioxidants also referred to as radical scavengers, are capable of neutralizing so-called free radicals. These are aggressive compounds that arise physiologically in numerous metabolic processes and energy production. They are important for defense reactions of the body, but can also cause damage to the genetic material (DNA), the cell membranes and body whites. These damages can be premature
  • Antioxidants include carotenoids, ascorbic acid (vitamin C, E 300) as well as sodium L-ascorbate (E 301) and calcium L-ascorbate (E 302); Ascorbyl palmitate (E 304); Butylhydroxyanisole (E 320); Butylhydroxytoluene (E 321); Calcium disodium EDTA (E 385); Gallate as well as propyl gallate (E 310), octyl gallate (E 311) and dodecyl gallate (lauryl gallate) (E 312); Isoascorbic acid (E 315) as well as sodium isoascorbate (E 316); Lecithin (E 322); Lactic acid (E 270); Multiple phosphates such as diphosphates (E 450), triphosphates (E 451) and polyphosphates (E 452); Sulfur dioxide (E 220) as well as sodium sulphite (E 450), diphosphates (E
  • At least one compound selected from the above-mentioned group of antioxidants is selected as the antioxidant.
  • carotinoids are to be understood as meaning the following compounds: beta-carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, zeaxanthin, cryptoxanthin, citranaxanthin, canthaxanthin, bixin, beta-apo-4-carotenal, beta-apo-8-carotenal, beta-apo-8 -carotinklarester, individually or as a mixture.
  • carotenoids are beta-carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, zeaxanthin, citranaxanthin and canthaxanthin.
  • retinoids are vitamin A alcohol (retinol) and its derivatives such as vitamin A aldehyde (retinal), vitamin A acid (retinoic acid) and vitamin A esters (for example retinyl acetate, retinyl propionate and retinyl palmitate).
  • retinoic acid encompasses both all-trans retinoic acid and 13-cis retinoic acid.
  • retinol and retinal preferably include the all-trans compounds.
  • the preferred retinoid used is all-trans retinol, referred to below as retinol.
  • effector molecules are vitamins, especially vitamin A, and their esters.
  • Vitamins are essential organic compounds that are either not synthesized in the animal and human organism or only insufficiently synthesized. Based on this definition, 13 components or groups of components have been classified as vitamins.
  • the fat-soluble vitamins include vitamin A (retinol), vitamin D (calciferols), vitamin E (tocopherols, tocotrienols) and vitamin K (phylloquinone).
  • the water-soluble vitamins include vitamin B1 (thiamin), vitamin B2 (riboflavin), vitamin B6 (Pyridoxal group), vitamin B 12 (cobalamins), vitamin C (L-ascorbic acid), pantothenic acid, biotin, folic acid and niacin.
  • Vitamins, provitamins and vitamin precursors from groups A, C, E and F in particular 3,4-didehydroretinol, beta-carotene (provitamin of vitamin A),
  • vitamin C Ascorbic acid (vitamin C), as well as the palmitic acid esters, glucosides or phosphates of ascorbic acid, tocopherols, especially a-tocopherol, and its esters, e.g. the acetate, nicotinate, phosphate and succinate; vitamin F, which is understood as meaning essential fatty acids, especially linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid.
  • Vitamin E is a collective term for a group of (to date) eight fat-soluble substances with antioxidant and non-antioxidant effects. Vitamin E is part of all membranes of animal cells, but is formed only by photosynthetically active organisms such as plants and cyanobacteria.
  • Vitamin E is part of all membranes of animal cells, but is formed only by photosynthetically active organisms such as plants and cyanobacteria.
  • Four of the eight known forms of vitamin E are called tocopherols (alpha-tocopherol, beta-tocopherol, gamma-tocopherol and delta-tocopherol).
  • the other four forms of vitamin E heretofore known are tocotrienols (alpha tocotrienol, beta tocotrienol, gamma tocotrienol and delta tocotrienol).
  • derivatives of these substances such as alpha-tocopheryl acetate may also be advantageous.
  • Vitamin A and its derivatives and provitamins advantageously show a particular skin-smoothing effect.
  • vitamins, provitamins or vitamin precursors of the vitamin B group or derivatives thereof which are preferably to be used according to the invention and the derivatives of 2-furanone include, inter alia: Vitamin Bl, common name thiamin, chemical name 3 - [(4'-amino-2'-methyl-5'-pyrimidinyl) methyl] -5- (2-hydroxyethyl) -4-methylthiazolium chloride.
  • Vitamin B2 common name riboflavin, chemical name 7,8-dimethyl
  • riboflavin 10- (l-D-ribityl) benzo [g] pteridine-2,4 (3H, 10H) -dione.
  • riboflavin z As in whey, other riboflavin derivatives can be isolated from bacteria and yeasts.
  • a stereoisomer of riboflavin which is likewise suitable according to the invention is the lyxoflavin which can be isolated from fishmeal or liver and carries a D-arabityl residue instead of the D-ribityl.
  • Vitamin B3 the compounds nicotinic acid and nicotinamide (niacinamide) are often performed. According to the invention, the nicotinic acid amide is preferred.
  • Vitamin B5 pantothenic acid and panthenol
  • Panthenol is preferably used.
  • Suitable derivatives of panthenol according to the invention are, in particular, the esters and ethers of panthenol and also cationically derivatized panthenols.
  • pantothenic acid or panthenol in addition to pantothenic acid or panthenol, too
  • derivatives of 2-furanone are used. Particularly preferred derivatives are the commercially available substances dihydro-3-hydroxy-4,4-dimethyl-2 (3H) -furanone with the trivial name pantolactone (Merck), 4-hydroxymethyl- ⁇ -butyrolactone (Merck), 3,3 -Dimethyl-2-hydroxy- ⁇ -butyrolactone (Aldrich) and 2,5-dihydro-5-methoxy-2-furanone (Merck), expressly including all stereoisomers.
  • Vitamin B6 which is understood hereunder no uniform substance, but the known under the common names pyridoxine, pyridoxamine and pyridoxal derivatives of 5-hydroxymethyl-2-methylpyridin-3-ol.
  • Vitamin B7 also known as vitamin H or "skin vitamin”.
  • Biotin is (3aS, 4S, 6aR) -2-oxohexahydrothienol [3,4-d] imidazole-4-valeric acid.
  • vitamins salts, esters, sugars, nucleotides, nucleosides, peptides and lipids
  • suitable derivatives of vitamins salts, esters, sugars, nucleotides, nucleosides, peptides and lipids
  • nucleic acids such as DNA and RNA may be suitable effector molecules, e.g. as a moisturizer.
  • Preferred lipophilic, oil-soluble antioxidants from this group are tocopherol and its derivatives, gallic acid esters, flavonoids and carotenoids, and butylhydroxytoluene / anisole.
  • As water-soluble antioxidants are amino acids, eg. As tyrosine and cysteine and their derivatives and tanning agents, especially those of plant origin are preferred.
  • Triterpenes in particular triterpenic acids such as ursolic acid, rosmarinic acid, betulinic acid, boswellic acid and bryonic acid are also preferred.
  • Further preferred effector molecules are, preferably low-dose, fruit acids (alpha hydroxy acids) such as malic acid, citric acid, lactic acid, tartaric acid, glycolic acid. These can be used in concentrations of 0.1% to 35%, preferably 0.1% to 10%, in particular 1% to 10%, 1% to 5%, based on the total weight of the composition.
  • fruit acids alpha hydroxy acids
  • Further preferred effector molecules are urea and derivatives thereof, since they can care for the skin. These may be present in concentrations of 0.1% to 25%, preferably 0.1% to 10%, in particular 1% to 10%, 1% to 5%, based on the total weight of the composition.
  • UV photoprotective agents in particular the UV filters mentioned in WO 2006/136607.
  • Such further cosmetically active ingredients are keratin-care substances and skin-care substances, in particular water-soluble vitamins, antioxidants, UV filters, glucans, flavonoids, and caffeine.
  • vitamin C from the group of water-soluble vitamins are in turn preferably one or more of the vitamins selected from the group consisting of vitamin C, vitamin B1, vitamin B2, niacin (nicotinic acid, nicotinamide, vitamin B3), pantothenic acid, pantolactone and panthenol (vitamin B5), vitamin B6 , Biotin (vitamin B7, vitamin H), vitamin B9 (folic acid) and vitamin B 12 or their derivatives.
  • Panthenol, pantolactone, nicotinic acid amide, sodium ascorbyl phosphate and biotin are very particularly preferred according to the invention.
  • UV filters water-soluble UV filters are again preferred, Uvinul MS 40, Uvinul P 25, Uvinul DS 49 and Z-COTE being particularly preferred, and Uvinul MS 40 and P 25 being very particularly preferred.
  • phenolic acids and polyphenols are preferred.
  • the cosmetically active ingredients selected from the group consisting of panthenol, ascorbic acid and its derivatives, water-soluble UV filters, caffeine.
  • Aqueous extracts of fruits and herbs may also be part of the compositions of the invention.
  • the agent according to the invention is for
  • the present invention furthermore relates to a process for the preparation of crop protection agents containing hydrophobin as spreading agent.
  • the hydrophobin in addition to the hydrophobin additionally at least one crop protection agent whose absorption and / or effect is improved by the presence of hydrophobin, applied to the treated surface.
  • the inventive compositions in addition to hydrophobin additionally contain at least one phytoprotective ingredient whose absorption and / or effect is preferably improved by the presence of hydrophobin, or this ingredient is applied separately (in pure form or as part of a composition).
  • the additional phytoprotective active ingredient is preferably hydrophilic.
  • a particular embodiment of the invention relates to the formulation of pesticides for crop protection, in particular of herbicides, fungicides, nematicides, acaricides, insecticides and agents that regulate plant growth.
  • pesticide here refers to at least one active ingredient selected from the group of fungicides, insecticides, nematicides, herbicides, acaricides and / or safeners or growth regulators. Mixtures of pesticides from one, two or more of the above classes may also be used.
  • One skilled in the art will be familiar with such pesticides as described, for example, in Pesticide Manual, 13th Ed. (2003), The British Crop Protection Council, London.
  • fungicidal active compounds that can be formulated as active ingredient composition according to the invention include:
  • acylalanines such as benalaxyl, metalaxyl, ofurace, oxadixyl; Amine derivatives such as aldimorph, dodine, dodemorph, fenpropimorph, fenpropidin, guazatine, iminoctadine, spiroxamine, tridemorph;
  • Anilinopyrimidines as pyrimethanil, mepanipyrim or Cyrodinyl
  • antibiotics such as cycloheximide, griseofulvin, kasugamycin, natamycin, polyoxin and streptomycin; Azoles such as bitertanol, bromoconazole, cyproconazole, difenoconazole,
  • dicarboximides such as iprodione, myclozoline, procymidone, vinclozolin; • dithiocarbamates as ferbam, nabam, maneb, mancozeb, metam, metiram, propineb, polycarbamate, thiram, ziram, zineb;
  • heterocyclic compounds such as anilazine, benomyl, boscalid, carbendazim, carboxin, oxycarboxin, cyazofamid, dazomet, dithianon, famoxadone, fenamidone, fenarimol, fuberidazole, flutolanil, furametpyr, isoprothiolane, mepronil, nuarimol, Picobezamid, Probenazole, proquinazid, pyrifenox, pyroquilon, Quinoxyfen, Silthiofam; Thiabendazoles, thifluzamide, thiophanate-methyl, tiadinil, tricyclazoles, triforins;
  • Phenylpyrroles as fenpiclonil and fludioxonil
  • unclassified fungicides such as acibenzolar-S-methyl, benthiavalicarb, carpropamid, chlorothalonil, cyflufenamid, cymoxanil, diclomezine, diclocymet, diethofencarb, edifenphos, ethaboxam, fenhexamid, fentin-acetate, fenoxanil, Ferimzone, Fluazinam, Fosetyl, Fosetyl-aluminum, iprovalicarb , Hexachlorobenzene, metrafenone, pencycuron, propamocarb, phthalides, toloclofos-methyl, quintozene, zoxamide;
  • strobilurins such as those described in WO 03/075663 by the general formula I, such as azoxystrobin, dimoxystrobin, fluoxastrobin, kresoxim-methyl, metominostrobin, orysastrobin, picoxystrobin, pyraclostrobin and trifloxystrobin;
  • sulfenic acid derivatives such as captafol, captan, dichlofluanid, folpet, tolylfluanid;
  • 6-aryl [l, 2,4] triazolo [l, 5-a] pyrimidines as described for example in WO 98/46608, WO 99/41255 or WO 03/004465 each by the general formula I (page 1 , Line 8 to page 11, line 45, as well as compounds shown in formula IA in conjunction with tables 1 to 44 and table A of WO 03/00465); • Amidfungizide as Cyclofenamid and (Z) -N- [ ⁇ - (Cyclopropylmethoxyimino) - 2,3-difluoro-6- (difluoromethoxy) benzyl] -2-phenylacetamide.
  • 1,3,4-thiadiazoles such as buthidazoles and cyprazoles
  • aminophosphoric as bilanafos, buminafos, glufosinate-ammonium, glyphosate, sulfosate;
  • anilides as anilofos, mefenacet
  • Aryloxyalkanoic acid such as 2,4-D, 2,4-DB, Clomeprop, dichlorprop, dichlorprop-P, dichlorprop-P, fenoprop, fluroxypyr, MCPA, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, napropamide, napro-panilide, triclopyr ;
  • carbamates such as carbetamide, chlorbufam, Chlorpro-pham, desmedipham, phenmedipham, vernolate;
  • dihydrofuran-3-ones such as flurtamones
  • dinitroanilines such Benef ⁇ n, butraline, dinitramine, ethalfluralin, fluchloralin, isopropalin, nitralin, oryzalin, pendimethalin, Prodi amines profluralin, trifluralin, dinitrophenols as bromofenoxim, dinoseb, dinoseb-acetate, dinoterb, DNOC, Minoterb acetate;
  • diphenyl ethers such as acifluorfen-sodium, aclonifen, bifenox, chlornitrofen, difenoxuron, ethoxyfen, fluorodifen, fluoroglycofen-ethyl, fomesafen, furyloxyfen, lactofen, nitrofen, nitrofluorfen, oxyfluorfen; Dipyridyls such as cyperquat, difenzoquat-methylsulfate, diquat, paraquat-dichloride;
  • imidazolinones such as imazamethapyr, imazapyr, imazaquin, Imazethabenz-methyl, imazethapyr, imazapic, imazamox;
  • Phenols such as bromoxynil, ioxynil
  • phenoxyphenoxypropionic esters such as clodinafop, cyhalofop-butyl, Diclofop- methyl, fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-p-ethyl, Fenthiapropethyl, fluazifop-butyl, fluazifop-p-butyl, haloxyfop-ethoxy-ethyl, haloxyfop-methyl, haloxyfop-p-methyl , Isoxapyrifop, propaquizafop, quizalofop-ethyl, quizalofop-p-ethyl, quizalofop-tefuryl;
  • Phenylacetic acids such as chlorfenac;
  • ppi active ingredients such as benzofenap, cinidon-ethyl, flumiclorac-pentyl, flumioxazin, flumipropyn, flupropacil, pyrazoxyfen, sulfentrazone, thidiazimin;
  • pyrazoles such as Nipyraclofen
  • pyridazines as chloridazon, maleic hydrazide, norflurazon, pyridate
  • pyridine carboxylic acids such as clopyralid, dithiopyr, picloram, thiazopyr;
  • sulfonamides such as flumetsulam, metosulam
  • Triazole carboxamides such as triazofenamide
  • uracils such as bromacil, lenacil, terbacil
  • Benazoline Benfuresate, Bensulide, Benzofluor, Bentazone, Butamifos, Cafenstrole, Chlorthal-dimethyl, Cin-methylin, Dichlobenil, Endothall, Fluorbentranil, Mefluidide, Perfluidone, Piperophos, Topramezone and Prohexandione-Calcium;
  • sulfonylureas as amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron-methyl, chlorimuron-ethyl, chlorsulfuron, cinosulfuron, cyclosulfamuron, ethametsulfuron-methyl, flazasulfuron, halosulfuron-methyl, imazosulfuron, metsulfuron-methyl, nicosulfuron, primisulfuron, prosulfuron, Pyrazosulfuron- ethyl, rimsulfuron, sulfometuron methyl, thifensulfuron-methyl, triasulfuron, tribenuron-methyl, triflusulfuron-methyl, tritosulfuron;
  • Cyclohexenone-type plant protection agents such as alloxydim, clethodim, cloproxydim, cycloxydim, sethoxydim and tralkoxydim.
  • Very particularly preferred cyclohexenone-type herbicidal active compounds are: tepraloxydim (compare AGROW, No. 243, 3.11.95, page 21, caloxydim) and 2- (l- [2- ⁇ 4-
  • pyrethroids such as bifenthrin, cyfluthrin, cycloprothrin, cypermethrin, deltamethrin, esfenvalerate, ethofenprox, fenpropathrin, fenvalerate, cyhalothrin, lambda-cyhalothrin, permethrin, silafluofen, tau-fluvalinate, tefluthrin, tralomethrin, alpha-cypermethrin, zeta-cypermethrin, permethrin;
  • Arthropod growth regulators a) chitin synthesis inhibitors eg benzoylureas such as chlorofluorazuron, diflubenzuron, flucycloxuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, novaluron, teflubenzuron, triflumuron; Buprofezin, diofenolan, hexythiazox, etoxazole, clofentazine; b) ecdysone antagonists such as halofenozides, methoxyfenozides, tebufenozides; c) juvenoids such as pyriproxyfen, methoprene, fenoxycarb; d) lipid biosynthesis inhibitors such as spirodiclofen;
  • chitin synthesis inhibitors eg benzoylureas such as chlorofluorazuron, diflubenzuron, flucyclo
  • neonicotinoids such as flonicamid, clothianidin, dinotefuran, imidacloprid, thiamethoxam, nitenpyram, nithiazine, acetamiprid, thiacloprid; • Other unclassified insecticides such as abamectin, acequinocyl, acetamiprid, amitraz, azadirachtin, bensultap bifenazate, cartap, chlorfenapyr, chlordimeform, cyromazine, diafenthiuron, dinetofuran, diofenolan, emamectin, endosulfan, ethiprole, fenazaquin, fipronil, formetanate, formetanate hydrochloride, gamma HCH hydramethylnone, imidacloprid, indoxacarb, isoprocarb, metolcarb, pyridaben
  • R 11 and R 12 independently of one another are hydrogen, halogen, CN, C 1 -C 4 -alkyl, C 1 -C 4 -alkoxy, C 1 -C 4 -haloalkyl or C 1 -C 4 -haloalkoxy and R 13 is C 1 -C 4 -alkoxy, Cl C4-haloalkyl or C1-C4-haloalkoxy, for example compound IV, wherein R 1! for 3-CF 3 and R 12 for 4-CN and R 13 is 4-OCF 3 .
  • Useful growth regulators are e.g. Chlormequat chloride, mepiquat chloride, prohexadione calcium or the group of gibberellins. These include e.g. the gibberellins GA1, GA3, GA4, GA5 and GA7 etc. and the corresponding exo-16,17-dihydrogibberellins and the derivatives thereof, e.g. the esters with C1-C4 carboxylic acids. According to the invention, the exo-16,17-dihydro GA5-13-acetate is preferred.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the use according to the invention of hydrophobin for the preparation of aqueous active compound compositions of fungicides, in particular strobilurins, azoles and
  • Aryltriazolo [l, 5a] pyrimidines as described for example in WO 98/46608, WO 99/41255 or WO 03/004465 in each case by the general formula I (page 1, line 8 to page 11, line 45, and compounds shown in formula IA in Compound with Tables 1 to 44 and Table A of WO 03/00465), in particular of active compounds of the general formula V,
  • R x is a group NR 14 R 15 , or linear or branched C 1 -C 8 -alkyl which is unsubstituted or substituted by halogen, OH, C 1 -C 4 -alkoxy, phenyl or C 3 -C 6 -cycloalkyl, C 2 -C 6 -alkyl Alkenyl, C 3 -C 6 -cycloalkyl, C 3 -C 6 -cycloalkenyl, phenyl or naphthyl, where the four last-mentioned radicals 1, 2, 3 or 4 substituents selected from halogen, OH, C 1 -C 4 -alkyl, C 1 -C 4 -haloalkoxy, C 1 -C 4 alkoxy and C 1 -C 4 haloalkyl;
  • R 14 , R 15 independently of one another are hydrogen, C 1 -C 8 -alkyl, C 1 -C 8 -haloalkyl, C 3 -C 10 -cycloalkyl, C 3 -C 6 -halocycloalkyl, C 2 -C 8 -alkenyl, C 4 -C 10 -alkadienyl, C 2 -C 8 -cycloalkyl Haloalkenyl, C3-C6-cycloalkenyl, C2-C8-halocycloalkenyl, C2-C8-alkynyl, C2-C8-haloalkynyl or C3-C6-cycloalkynyl,
  • R 14 and R 15 together with the nitrogen atom to which they are attached, five- to eight-membered heterocyclyl which is bonded via N and one, two or three further heteroatoms from the group O, N and S as a ring member and / or one or several substituents from the group halogen, C 1 -C 6 -alkyl, C 1 -C 6 -haloalkyl, C 2 -C 6 -alkenyl, C 2 -C 6 -haloalkenyl, C 1 -C 6 -alkoxy, C 1 -C 6 -haloalkoxy, C 3 -C 6 -alkyl, Alkenyloxy, C3-C6-haloalkenyloxy, (exo) -Cl-C6-alkylene and oxy-C1-C3-alkyleneoxy; L is selected from halo, cyano, C 1 -C 6 alkyl, C 1 -C 4 haloalkyl, C
  • L 1 is halogen, C 1 -C 6 -alkyl or C 1 -C 6 -haloalkyl and in particular fluorine or chlorine;
  • X represents halogen, C 1 -C 4 -alkyl, cyano, C 1 -C 4 -alkoxy or C 1 -C 4 -haloalkyl and preferably represents halogen or methyl and in particular chlorine.
  • hydrophobins used in the examples were prepared according to the examples of Part A of WO 2007/014897.
  • hydrophobin A used in the examples is given in WO 2007/014897 under SEQ ID NO: 19 and 20 ( Figures 11 and 12 of this application).
  • This "hydrophobin A” is the hydrophobin dewA, which was fused with the protein yaad.
  • the construct also contains an Xa interface and a His tag (yaad-Xa-dewA-his).
  • the sequence of the "hydrophobin B” used in the examples is given in WO 2007/014897 under SEQ ID NO: 25 and 26 ( Figures 13 and 14 of this application).
  • This "hydrophobin B” is the hydrophobin dewA fused to a truncated yaad protein.
  • the construct also contains an Xa interface and a His tag (yaad40-Xa-dewA-his).
  • TBS 2OmM Tris; 15 mM NaCl pH 7.5
  • TTBS TBS + 0.05% Tween20
  • the first step is the transfer of the outer keratin layer from the skin to a stable carrier.
  • a transparent adhesive strip was firmly applied to depilated human skin and removed again. The test can be done directly on the
  • Binding was carried out as follows: for incubation with the various reagents Transfer into a Falcon vessel, if necessary add ethanol for degreasing, remove ethanol and dry the slides Ih incubated at room temperature with blocking buffer
  • Phosphatase conjugates diluted 1: 5000 in TBS + 0.01% blocking - 2x 5 min washed with TTBS
  • the binding to nails can be determined analogously by incubating the hydrophobins to be investigated directly with the nail surface and measuring them accordingly.
  • composition s.u. Allow the reaction to go blue (about 1:30 minutes).
  • the absorbance was measured at 405 nm.
  • Peroxidase substrate (prepare shortly before): 0, 1 ml TMB solution (42 mM TMB in DMSO) + 10 ml substrate buffer (0.1 M sodium acetate pH 4.9) + 14.7 ⁇ l H 2 O 2 3%
  • the binding to mucous membrane can be measured by taking a sample of mucous membrane (for example, human oral mucosa) by means of a transparent adhesive strip, which can then be examined for binding effect.
  • a sample of mucous membrane for example, human oral mucosa
  • Peroxidase Conjugate produced in mouse, lyophilized powder, Sigma Company] can convert a colorless substrate (TMB) into a colored product which is photometrically measured at 405 nm.
  • TMB colorless substrate
  • the amount of absorption indicates the amount of bound hydrophobin or control protein.
  • yaad from B. subtilis was chosen as the comparison protein, which likewise had a His tag for detection, as is necessary for this test. Instead of the His tag, other specific antibodies conjugated to peroxidase may also be used. 5 mg of hair (human) are cut into 5 mm long pieces and transferred into Eppendorf tubes (protein lowbind) to perform the binding detection:
  • PBS phosphate buffered saline
  • Tween 20 polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n about 20
  • hydrophobin-based binding test on hair showed a clear superiority of the binding of hydrophobin to hair versus a substantially poorer binding of the control protein yaad:
  • Table 1 Quantitative Hydrophobin Activity Test Hair: 1) Buffer; 2) comparative protein yaad; 3) hydrophobin.
  • the table shows the measured absorbance values at 405 nm.
  • a coupling of dyes to hydrophobins can take place via the SH groups of the cysteines.
  • the disulfide bridges of the hydrophobin are cleaved: 1 mg hydrophobin 0.5 ml buffer (75 mM Tris pH 8.0 2.5 mM EDTA
  • the coupling of the dye is carried out according to the manufacturer's instructions (Alexa 532 Protein Labeling Kit, Molecular Probes, MP-A-10236).
  • the coating of human hair with Alexa-coupled hydrophobin is performed as follows: Incubate 10 mg of human hair with 50 ⁇ g / ml Alexa-hydrophobin or control protein yaad or uncoupled dye Alexa 532 in buffer TBS for 24 hours at room temperature. Wash twice with TBS / 0.05% Tween 20 - Wash Ix with TBS
  • Example 5 Test for determining the spreading behavior
  • a glass plate (20 cm x 6.5 cm x 0.2 cm) was covered with 2 strips of filter paper (type: Pörringer 1243/90) with a length of about 17 cm and a width of 1 cm.
  • filter paper type: Pörringer 1243/90
  • test substance e.g.
  • Luvitol Lite (INCI: hydrogenated polyisobutene) 64
  • hydrophobin increased the running distances of the test substances mentioned above by up to 10%, thus improving their flow properties - the spreading behavior.
  • a comparable measurement on pig skin provides correlative results such as the filter paper method.
  • hydrophobin 0.1% hydrophobin (final concentration) may also be added as a component to the test substance and emulsified. Even then show prolonged running distances of the test substances on the surfaces described.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel, insbesondere in kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen. Sie betrifft ferner Zusammensetzungen zur Behandlung von Oberflächen, insbesondere kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen zur topischen Anwendung, welche Hydrophobin als Spreitmittel enthalten.

Description

Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel
Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel, insbesondere in kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen. Sie betrifft ferner Zusammensetzungen zur Behandlung von Oberflächen, insbesondere kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen zur topischen Anwendung, welche Hydrophobin als Spreitmittel enthalten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Die Spreitfähigkeit (synonym: Spreit(ungs)vermögen) beschreibt die Fähigkeit von Substanzen oder Substanzgemischen (z.B. Ölen und Cremes), sich auf einem Festkörper, z.B. der Haut, spontan auszubreiten und dadurch einen dünnen Film zu bilden. Dieses Spreiten an der Oberfläche ist abhängig von der Viskosität und Oberflächenspannung der Substanzen, dem Vorkommen von oberflächenaktiven Stoffen, und den Eigenschaften der Oberfläche (wie z.B. dem Feuchtigkeitsgehalt der Haut und dem Talggehalt der Hornschicht). Gutes Spreitvermögen ist z.B. in Hautpflegemitteln von Vorteil.
Als Spreitmittel werden Substanzen bezeichnet, deren Zusatz zu einer flüssigen oder halb festen Zusammensetzung zu einer Vergrößerung der durch die Zusammensetzung bedeckten Oberfläche fuhrt. Spreitmittel wirken, indem sie z.B. die Oberflächenspannung einer Zusammensetzung verringern oder indem sie die Benetzbarkeit der behandelten Oberfläche erhöhen. Sie erleichtern dadurch die gleichmäßige Verteilung der Zusammensetzung und deren Inhaltsstoffe, sowie die Ausbildung eines gleichmäßigen Films auf der behandelten Oberfläche. Das Spreitmittel unterbindet die Tendenz von Zusammensetzungen mit hoher Oberflächenspannung (wie z.B. wässrigen Lösungen), auf der behandelten Oberfläche Tröpfchen zu formen, die zu fleckförmiger Aufkonzentration der in der Zusammensetzung enthaltenen Stoffe führen würde (sog. „Spotting").
Die Spreitung von Zusammensetzungen auf Oberflächen, z.B. von kosmetischen oder pharmazeutischen Produkten auf der Haut, ist messbar (z.B. Zeidler, U. (1985) Fette, Seifen, Anstrichmittel 87:403), das Messergebnis wird als Spreitwert bezeichnet. Auch B. W. Barry u. A. J. Grace entwickelten eine Methode zur Bestimmung des Spreitvermögens (J. Pharm. Sei. 61, 335(1972)) und C. Beyer entwickelte ein Modell-Testsystem zur Prüfung des Spreitvermögens (Arch. Pharm. [Weinh.] 310, 473, 729 u. 858 (1977); C. A. 88, 79017 (1978); ZbI. Pharm. 118, 51 (1979)).
Als Spreitungsspannung wird das Bestreben einer Flüssigkeit, sich auf einer festen Oberfläche auszubreiten, quantitativ durch die Differenz zwischen der Benetzungs- spannung und der Oberflächenspannung der Flüssigkeit ausgedrückt. Diese Grosse bezeichnet man nach DIN 53900 als Spreitungskoeffϊzient. Ist dieser Wert positiv, so breitet (spreitet) sich die Flüssigkeit spontan auf der Oberfläche aus.
Spreitungsvermögen ist nach DIN 53900 die Fähigkeit eines Stoffes, eine Oberfläche einer Flüssigkeit oder auch eines Festkörpers spontan zu bedecken. Spreitvermögen wird daher in der Kosmetik als die Eigenschaft einer Substanz, sich auf der Haut zu verteilen, verstanden. Die Maßeinheit des Spreitungskoeffizienten ist die des Quotienten aus der Spreitungsfläche, über die die Spreitung erfolgt, und der Spreitungszeit, in der die Spreitung erfolgt. Sie wird üblicherweise in [mm2/Minuten] angegeben.
Spreitmittel werden in einer Vielfalt von Erzeugnissen benötigt, u.a. in Pflanzenschutzmitteln, Mitteln zur Pflege technischer Oberflächen, Kosmetika und Arzneimitteln.
Pflanzenschutzmittel werden üblicherweise auf die behandelten Pflanzen aufgesprüht und müssen sich möglichst gleichmäßig und schnell auf den Pflanzen verteilen, um eine schnelle und gleichmäßige Verteilung des Wirkstoffes zu gewährleisten, bevor er z.B. durch Regen abgespült werden kann.
Im kosmetischen und pharmazeutischen Bereich interessieren vor allem die
Spreiteigenschaften von Emulsionen, Cremes, Salben, Gelen, Pasten, Körpermilchen und Ölen. Kosmetische und pharmazeutische Zusammensetzungen sind häufig OfW- oder W/O-Emulsionen. Die Spreiteigenschaften von Emulsionen werden in der Regel durch deren Ölkomponente(n) (Synonym: Ölkörper) bestimmt.
Im folgenden werden Spreitmittel am Beispiel von Mitteln zur Behandlung der Haut näher erläutert. Diese Erläuterungen sind analog auch auf Spreitmittel in Zusammensetzungen für andere technische Gebiete wie z.B. den Pflanzenschutz anwendbar.
Spreitmittel lassen sich in niedrigspreitende (Spreitwert: < 300 mm2/10 min), mittelspreitende (ca. 300 - 1000 mm2/ 10 min) und hochspreitende Spreitmittel (> 1000 mm2/ 10 min) einteilen. Dies beschreibt nicht nur ihr Verhalten auf der Haut hinsichtlich ihrer Verteilbarkeit, sondern auch die Intensität und Dauer ihrer glättenden Wirkung. Spreitmittel sind meist Öle oder Fette, daher sollen diese im Folgenden exemplarisch näher erläutert werden.
Schnell spreitende Öle verteilen sich sehr gut, dringen rasch in die Vertiefungen der Hautoberfläche ein und erzeugen ein schnelles Glättegefühl, das jedoch ebenso schnell wieder auf das alte Niveau zurückfällt.
Schnelle Spreiter sind vor allem Öle mit vielen kurzkettigen Fettsäuren (C6 bis ClO), z. B. Kokosöl und Babassuöl, aber auch Pflanzenbutter. Daneben ist Squalan eine sehr schnell spreitende Fettkomponente.
Mittel spreitende Öle verteilen sich gut, zeigen ein angenehmes Einziehverhalten und glätten über einen deutlich längeren Zeitraum. Dies sind Öle mit mittellangen Fettsäureketten (C 12 bis C 16) oder mit einem hohen Lecithin- oder Squalengehalt, z.B. Avocadoöl, Sesamöl, Traubenkernöl oder Amaranthöl. Die Begleitstoffe dieser Öle verändern ihre Oberflächenspannung (Lecithine gehören z. B. zu den Phospho- lipiden und sind grenzflächenaktive Lipide) und bewirken dadurch ein schnelleres Spreiten auf der Haut (im Vergleich zu ihrem aufgrund ihres Fettsäurespektrums zu erwartenden Spreitverhaltens) und ein besseres Einziehvermögen.
Langsam spreitende Öle führen zu einem deutlich geringer ausgeprägten Glättegefühl, das jedoch lange anhält. Zu dieser Gruppe gehören vor allem Öle mit langkettigen Fettsäuren (C 18 bis C24), z. B. Nachtkerzen-, Borretsch-, Hanf- und Wildrosenöl.
Um eine Rezeptur zu optimieren, können Öle oder andere Spreitmittel nach ihrem Spreitverhalten miteinander oder mit anderen Substanzen kombiniert werden. So gewährleistet eine Emulsion, die schnell, mittel und langsam spreitende Öle nebeneinander enthält, ein angenehmeres Auftragsverhalten und Hautgefühl als Emulsionen mit nur einem Öl. Diese Kombination wird auch als Spreitkaskade bezeichnet. Rezepturen, die nicht Spreitmittel aller drei Kategorien berücksichtigen, weisen in der Regel eine Spreitlücke auf, d. h. es fehlt eine Komponente mit einer spezifischen Wirkung, die die Dauer oder Schnelligkeit des Glättegefühls bestimmt.
Es liegt auf der Hand, dass die Entwicklung derartiger Spreitkaskaden mit Aufwand verbunden und daher verbesserungsbedürftig ist. Überdies ist die Spreitung bei derartigen Mehrkomponentensystemen schwer dosier- und vorhersagbar. Dazu kommt, dass viele als Spreitmittel eingesetzte Öle und Fette einen unerwünschten glänzenden Film auf der Haut hinterlassen oder sogar zu unerwünschter Versiegelung der Haut führen können. Vom Konsumenten gewünscht werden aber Produkte, die ein rasch eintretendes und langanhaltendes Gefühl der Hautglätte und - geschmeidigkeit vermitteln und gleichzeitig weder ein klebriges, fettiges Gefühl noch einen fettig schimmernden Film auf der Haut hinterlassen. Es kann auch zu unerwünschten Inkompatibilitätsreaktionen zwischen dem Spreitmittel und anderen Komponenten der Zusammensetzung oder der behandelten Oberfläche kommen.
Auf der anderen Seite führt das völlige Weglassen eines Spreitmittels insbesondere bei wässrigen Lösungen zu schlechtem Spreitverhalten und dessen unmittelbaren Folgen, wie z.B. Spotting. Der Einsatz von Ölen als Spreitmittel in wässrigen Systemen ist jedoch häufig unerwünscht oder bei fehlender Mischbarkeit eines Öls mit Wasser nur unter Zusatz von Emulgatoren möglich.
Unter diesen Umständen besteht das Bedürfnis nach einem Spreitmittel, das nicht die Nachteile von Ölen als Spreitmittel aufweist und diese teilweise oder vollständig in einer Zusammensetzung ersetzen kann und insbesondere mit Wasser mischbar ist. Dies gilt nicht nur für kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, sondern auch für nicht-kosmetische/nicht-pharmazeutische Zubereitungen, wie z.B. Polituren, Schuhcreme, Pflanzenschutzmittel etc. In allen diesen Anwendungsgebieten besteht das Bedürfnis nach Zusammensetzungen, die nicht „spotten" und keine Fettrückstände hinterlassen. Hydrophobine sind eine Klasse kleiner, cysteinreicher Proteine mit einer Länge von etwa 100-150 Aminosäuren, die in der Natur nur in fϊlamentösen Pilzen vorkommen. Sie sind amphiphil und können auf der Oberfläche eines Gegenstands eine wasserunlösliche Schicht ausbilden. Ihre natürlichen Funktionen umfassen u.a. die Beschichtung von Pilzsporen, so dass diese nicht miteinander verkleben, die Beschichtung von Lufthyphen zur Herabsetzung der Oberflächenspannung von Wasser und somit zur Erleichterung der Wasseraufnahme, und möglicherweise die Signalübermittlung zwischen einem Pilz und seiner Umwelt (Whiteford, J.F. Spanu, P.D. (2001), Fungal Genet. Biol. 32(3): 159-168; Wösten et al. (1999) Current Biol. 19: 1985-88; Bell et al. (1992), Genes Dev. 6: 2382-2394).
Die erste Isolierung und Reinigung von Hydrophobin erfolgte aus Schizophyllum commune im Jahre 1999. Mittlerweile wurden Hydrophin-Gene in Ascomyceten, Deuteromyceten und Basiodiomyceten identifiziert. Manche Pilze enthalten mehr als ein Hydrophobin-Gen, z.B. Schizophyllum commune, Coprinus cinereus und Aspergillus nidulans.
Basierend auf Unterschieden hinsichtlich der Hydropathie und der biophysikalischen Eigenschaften der Hydrophobine sind diese in zwei Kategorien eingeteilt worden: Klasse I und Klasse IL Komplementierungsexperimente haben gezeigt, dass Hydrophobine der einen Klasse Hydrophobine der anderen Klasse bis zu einem gewissen Grade funktionell ersetzen können. Die verschiedenen Hydrophobine scheinen an verschiedenen Pilzentwicklungsstadien beteiligt zu sein und darin unterschiedliche Funktionen zu erfüllen (van Wetter et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:201-210; Kershaw et al. (1998) Fungal Genet. Biol. 23: 18-33).
Hydrophobine weisen in aller Regel acht Cystein-Einheiten auf. Sie können aus natürlichen Quellen isoliert werden, aber auch mittels gentechnischer Verfahren gewonnen werden, wie beispielsweise in WO 2006/082251 und WO 2006/131564 beschrieben.
Die Verwendung von Hydrophobin in kosmetischen Zubereitungen ist an sich bekannt. US 2003/0217419 Al beschreibt die Verwendung des Hydrophobins SC3 aus S. commune für die Behandlung von Keratin-haltigen Materialien. Dabei bilden sich kosmetische Depots, die mehreren Wäschen mit Shampoo widerstehen sollen. Das Hydrophobin wird entweder gleichzeitig mit oder nach dem kosmetisch aktiven Inhaltsstoff aufgebracht, aber nicht vor Aufbringen des kosmetischen Wirkstoffes.
WO 2006/136607 A2 beschreibt die Verwendung von Hydrophobin und von Hydro- phobin-Konjugaten in kosmetischen Zubereitungen zur Haarpflege.
WO 2006/082251 beschreibt Hydrophobin-Proteine, ihre Produktion und ihre Verwendung zur Oberflächenbeschichtung von Glas und Teflon.
WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen u.a. als oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate und zur Herstellung von Emulsionen, Salben, Cremes, Haarshampoos und Spülungen vor.
ZIEL DER ERFINDUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Spreitmittel für Zusammensetzungen zur Oberflächenbehandlung, insbesondere für topisch anzuwendende kosmetische und pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe besteht darin, Zusammensetzungen bereitzustellen, in denen Öle und Fette als Spreitmittel teilweise oder vollständig durch mindestens ein anderes Spreitmittel ersetzt sind.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung von nichtfettenden Zusammensetzungen, insbesondere wässrigen Zusammensetzungen, mit guten Spreiteigenschaften.
Das erfmdungsgemäße Spreitmittel soll auf einer Vielzahl von Oberflächen einsetzbar sein, vor allem auf natürlichen Oberflächen wie der menschlichen und tierischen Haut oder Pflanzenoberflächen.
Diese und andere Ziele, wie sie aus der folgenden Beschreibung der Erfindung hervorgehen, werden durch die vorliegende Erfindung gemäß den unabhängigen Ansprüche gelöst. Besondere Ausführungsformen der Erfindung sind den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen zu entnehmen. Ferner umfasst die Erfindung auch Kombinationen dieser bevorzugten Ausführungsformen.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin als
Spreitmittel. Sie betrifft des Weiteren eine Zusammensetzung, welche Hydrophobin als Spreitmittel enthält.
Gutes Spreitverhalten einer Zusammensetzung ist vorteilhaft, wenn sich die Zusammensetzung auf einer Oberfläche gleichmäßig verteilen soll. Diese Anforderung wird durch die erfindungsgemäßen Verwendungen und Zusammensetzungen erfüllt. Erfindungsgemäß kann Hydrophobin als Spreitmittel in Zusammensetzungen zur Behandlung verschiedenster Oberflächen eingesetzt werden, wie z.B. zur Behandlung technischer Oberflächen (Lack, Metall, Kunststoff) und natürlicher Oberflächen (Haut, Haare, Zähne, Nägel, Leder, Textilien, Wolle, pflanzliche Oberflächen). Bevorzugt dient es als Spreitmittel in einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung oder in einem Pflanzenschutzmittel.
Die Verwendung von Hydrophobin führt bevorzugt dazu, dass der für das Spreiten erforderliche Ölgehalt in den Zusammensetzungen im Vergleich zu Zusammensetzungen ohne Hydrophobin vermindert werden kann, beispielsweise um von 50 % bis zu 100 %. Hyrophobin kann somit erfindungsgemäß als teilweiser oder vollständiger Ölkörperersatz dienen. Ein weiterer Effekt ist, dass hierdurch ein Glänzen der behandelten Oberfläche wie z.B. der Haut vermindert oder verhindert wird, weil weniger oder gar kein Öl oder Fett auf die Oberfläche aufgetragen wird.
Die Verwendung von Hydrophobin kann des Weiteren zu einer verbesserten Aufnahme und/oder Anlagerung anderer Bestandteile der Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung führen. Bevorzugt bewirkt sie eine verbesserte Aufnahme und/oder Anlagerung eines oder mehrere Wirkstoffe, z.B. kosmetischer und/oder pharmazeutischer Wirkstoffe, in/an das mit der Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung behandelte Gewebe wie beispielsweise die Haut. Dies betrifft insbesondere hydrophile Stoffe wie kosmetisch oder pharmazeutisch aktive Wirkstoffe, z.B. Panthenol. Die Wirkstoffe wirken dadurch intensiver, denn sie gelangen schneller, gleichmäßiger und/oder in höherer lokaler Konzentration an und/oder in die behandelte Oberfläche, und/oder die Zeit bis zum kompletten Abwaschen dieser Stoffe verlängert sich. Auch die Aufnahme und Verteilung von Pflanzenschutz- Wirkstoffen kann durch Hydrophobin als Spreitmittel verbessert werden. Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung folgende Gegenstände bzw. Ausführungsformen:
(1) die Verwendung von Hydrophobin, z.B. von Hydrophobin der Strukturformel (I), als Spreitmittel in einem Mittel bzw. einer Zusammensetzung zur Behandlung von Oberflächen;
(2) die Verwendung von Hydrophobin, z.B. von Hydrophobin der Strukturformel (I), als Spreitmittel gemäß Ausführungsform (1) in einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere einer Zusammensetzung zur Behandlung der menschlichen oder tierischen Haut; (3) die Verwendung gemäß Ausführungsform (1) oder (2), wobei zusätzlich mindestens ein Wirkstoff auf die behandelte Oberfläche aufgetragen wird, dessen Aufnahme in die Oberfläche und/oder dessen Wirkung auf die Oberfläche durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird; und (4) eine Zusammensetzung zur Oberflächenbehandlung, welche mindestens ein Hydrophobin, z.B. Hydrophobin der Strukturformel (I), enthält und bevorzugt eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Pflanzenschutzmittel ist.
DEFINITIONEN
Die folgenden Begriffe, Definitionen und Abkürzungen werden verwendet: übliche Drei- und Ein-Buchstaben-Codes für Aminosäuren und Nukleotide.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung schließt die Singularform "ein(e)"auch den jeweiligen Plural mit ein, soweit sich aus dem Zusammenhang nichts anderes ergibt. Der Begriff „ein Hydrophobin" kann also auch mehr als ein Hydrophobin-Molekül umfassen, nämlich zwei, drei vier, fünf usw. Hydrophobine einer Sorte.
„Mindestens ein" bedeutet „ein oder mehrere", „mindestens" gefolgt von einem Zahlenwert bedeutet „dieser oder ein höherer Zahlenwert". Der Begriff „etwa" oder „ca." im Zusammenhang mit einem Zahlenwert oder einer Parameterbereichsgrenze bezeichnet einen Unschärfebereich, in welchem nach Auffassung des Fachmanns der technische Effekt des betroffenen Merkmals immer noch gewährleistet ist. Der Begriff bedeutet typischerweise eine Abweichung vom angegebenen Zahlenwert um +/- 10 %, bevorzugt +/- 5 %.
Soweit nicht anders angegeben, liegen Säuren entweder als freie Säure oder als teilweises oder vollständiges Salz der Säure oder als eine Mischung der Säure mit ihrem Salz vor. Umgekehrt können Basen, insbesondere Amine, als freie Base oder als teilweises oder vollständiges Salz der Base oder als eine Mischung der Base mit ihrem Salz vorliegen.
"Nativ" ist synonym zu "Wildtyp-" und "natürlicherweise (vorkommend)". Eine "natürlicherweise" vorkommende Verknüpfung zweier Polypeptide ist eine
Verknüpfung wie sie in naturam vorgefunden wird, also z.B. in einem Wildtyp- Protein. Ein Wildtyp- oder natives Protein oder Polpeptid ist - soweit nicht anders angegeben - die üblicherweise natürlich vorkommende Form dieses Proteins/Polypeptids .
"Rekombinant" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung "hergestellt mit Hilfe oder das Ergebnis von gentechnischen Methoden".
Ein "Fragment" einer Aminosäuresequenz resultiert aus dem Fehlen einer oder mehrerer aufeinanderfolgender Aminosäuren am N- und/oder C-Terminus der genannten ursprünglichen Sequenz.
Ein "Homolog" einer Aminosäuresequenz im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Protein oder Polypeptid, das sich von der ursprünglichen Sequenz durch die Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheidet. Bevorzugt wird die Funktion und/oder Konformation des Proteins durch diese Substitution nicht beeinträchtigt. Besonders bevorzugt ist die Aminosäuresubstitution ein konservativer Aminosäureaustausch, die ausgetauschten Aminosäuren werden also durch Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften ersetzt, z.B. VaI durch AIa.
Besonders bevorzugt finden konservative Aminosäureaustausche zwischen den Mitgliedern der folgenden Gruppen statt: saure Aminosäuren (Aspartat und Glutaminsäure); basische Aminosäuren (Lysin, Arginin, Histidin); - hydrophobe Aminosäuren (Leucin, Isoleucin, Methionin, Valin, Alanin); hydrophile Aminosäuren (Serin, Glycin, Alanin, Threonin);
Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten (Glycin, Alanin, Valin, Leucin,
Isoleucin);
Aminosäuren mit hydroxyaliphatischen Seitenketten (Serin, Threonin); - Aminosäuren mit Amid-Gruppen in der Seitenkette (Asparagin, Glutamin);
Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten (Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan);
Aminosäuren mit Schwefel in der Seitenkette (Cystein, Methionin).
Spezifisch bevorzugte konservative Aminosäureaustausche sind:
Ursprüngliche Aminosäure Substitut
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn; GIn
He Leu; VaI
Leu He; VaI
Lys Arg; GIn; GIu Met Leu; He
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
VaI He; Leu
Der Begriff "isoliert" bedeutet "getrennt oder gereinigt vom Ursprungsorganismus". Ein isoliertes Hydrophobin ist folglich nicht mehr Bestandteil des Pilzes, in welchem es in der Natur vorkommt. Auch rekombinant hergestellte Hydrophobine sind „isolierte" Hydrophobine.
Die Begriffe „hydrophil" und „hydrophob" haben die in der chemischen Fachsprache übliche Bedeutung. Ein "hydrophiler" Stoff ist also ein Stoff, der bevorzugt in Wasser und/oder polaren Lösemitteln löslich ist. Hydrophile Stoffe sind typischerweise polare Verbindungen, die entweder ionisch sind, ein Dipolmoment aufweisen und/oder elektronegative Gruppen enthalten. Ein „hydrophober" Stoff löst sich dagegen bevorzugt in unpolaren Medien und besitzt keine ionischen funktionellen Gruppen und nur schwach elektronegative funktionelle Gruppen.
Der Begriff „nicht fettend" hat die für Pharmazeutika und Kosmetika in der
Fachterminologie übliche Bedeutung. Eine „nicht fettende" Creme hinterlässt in der Regel keine Fett- oder Ölschicht und kein klebriges Gefühl auf der Haut.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel sowie entsprechende Hydrophobin-enthaltende Zusammensetzungen.
Die Formulierung von Produkten enthaltend Ölkörper als Spreitmittel, insbesondere von Kosmetika, Pharmazeutika und Pflanzenschutzmitteln, ist Stand der Technik. In der vorliegenden Erfindung bestand die Aufgabe darin, Formulierungen zu entwickeln, die trotz eine reduzierten Gehalts an Ölkörper sehr gute Eigenschaften besitzen, insbesondere eine gute Verteilbarkeit aufweisen. Hinsichtlich kosmetischer und pharmazeutischer Zusammensetzungen bewirkt die erfindungsgemäße Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel bevorzugt auch gute sensorische Eigenschaften, insbesondere seidiges Hautgefühl, hohe Gleitfähigkeit nach Einzug des Produktes auf der Haut sowie geringe Klebrigkeit.
Dass Hydrophobin statt der üblichen Ölkörper als Spreitmittel dienen kann, war überraschend, da Hydrophobin ein Protein ist und Proteine üblicherweise nicht als Spreitmittel zum Einsatz kommen.
Bei der Verwendung gemäß Ausführungsform (1) weist die Zusammensetzung eine Ölkörperkonzentration auf, die geringer ist als die Ölkörperkonzentration in einer Zusammensetzung aus denselben Inhaltsstoffen, jedoch ohne Hydrophobin und mit einem höheren Ölkörperanteil, wenn beide Zusammensetzungen dasselbe Spreitverhalten aufweisen. Bevorzugt weist die Zusammensetzung bei der Verwendung gemäß Ausführungsform (1) eine Ölkörperkonzentration von 0 bis 20 Gew.%, besonders bevorzugt von 0 bis 10 Gew.%, ganz besonders bevorzugt von 0 bis 5 Gew.% auf.
Das Spreitmittel hat eine benetzende Funktion und bewirkt, dass es zu einer optimalen Verteilung der übrigen Komponenten über eine große Fläche kommt. Es wird dadurch erreicht, dass es auf der behandelten Oberfläche nicht zu partiellen Überkonzentrierungen kommt, die als Verfleckungen (Spotting) sichtbar wären.
Der Zusatz von Hydrophobin als Spreitmittel führt weiterhin zu einer verbesserten Verteilbarkeit einer Zusammensetzung auf der Oberfläche, z.B. einer kosmetischen Zusammensetzung auf der Haut. Diese Verteilbarkeit ist insbesondere für eine wirkstoffhaltige Zubereitung wesentlich, um eine gute, gleichmäßige Verteilung der Wirkstoffe auf der Oberfläche, z.B. der Haut, zu gewährleisten. Kriterium für eine gute Verteilbarkeit ist dabei das Spreitvermögen des Hydrophobins.
Die in allen Ausführungsformen der Erfindung vorhandene Zusammensetzung, welche Hydrophobin als Spreitmittel enthält, ist in der Regel eine flüssige oder halbfeste Zusammensetzung. „Halbfeste Zusammensetzungen" haben dabei jene Eigenschaften, die ihnen in der im Europäischen Arzneibuch (Ph. Eur., 6. Ausgabe) gegebenen Definition zugeschrieben werden. Allerdings handelt es sich bei den im Rahmen der Erfindung verwendeten Zusammensetzungen nicht ausschließlich um pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzungen. Erfmdungsgemäß sind alle Zusammensetzungen, die der Behandlung von Oberflächen dienen. Bevorzugt wird das Hydrophobin jedoch in einer pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammensetzung als Spreitmittel verwendet.
Eine erfmdungsgemäße Zusammensetzung kann eine Emulsion, eine Creme, ein Gel, eine Paste, eine Salbe, eine Körpermilch, eine Lotion, ein Schaum, eine Suspension, eine Milch oder eine Paste sein. Bei den erfmdungsgemäßen Hautpflegemitteln handelt es sich insbesondere um W/O- oder O/W-Emulsionen. Speziell sind erfmdungsgemäße Hautpflegemittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hautcremes, Tag- und Nachtcremes, Augencremes, Gesichtscremes, Antifalten- cremes, Sonnenschutzcremes, Feuchthaltecremes, Bleichcremes, Selbstbräunungscremes, Vitamincremes, Hautlotionen, Pflegelotionen und Feuchthaltelotionen. Auch eine Lösung, wie sie z.B. bei einem Spray verwendet wird, ist möglich. Hierbei wird eine wässrige Lösung bevorzugt. Lösungen sind insbesondere bei der Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel in einem Pflanzenschutzmittel bevorzugt.
In einem bevorzugten Aspekt ist die erfmdungsgemäße Zusammensetzung, in welcher Hydrophobin als Spreitmittel verwendet wird, eine hydrophile Zusammensetzung, insbesondere eine Lösung, eine hydrophile Salbe oder hydrophile Creme. Zur erfindungsgemäßen Verwendung ist das Hydrophobin vorteilhafterweise in einer Zusammensetzung enthalten, die bevorzugt auch ein akzeptables Trägermedium enthält, je nach Anwendungsgebiet z.B. ein kosmetisch, pharmazeutisch oder pflanzenschutztechnisch akzeptables Trägermedium. Die erfmdungsgemäße Zusammensetzung gemäß Ausführungsform (4), in welcher das Hydrophobin gemäß einer der Ausführungsformen (1) bis (3) als Spreitmittel genutzt wird, ist in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung in welcher das Trägermedium Wasser, ein oder mehrere hydrophile Lösemittel, oder eine Mischung aus Wasser und einem oder mehreren hydrophilen Lösemitteln ist. Der Anteil von Wasser und/oder hydrophilen Lösemitteln in der Zusammensetzung beträgt bevorzugt mehr als 40 Gew.%, besonders bevorzugt mehr als 50 Gew.%, ganz besonders bevorzugt mehr als 60 Gew.%, 70 Gew.%, 80 Gew.%, 90 Gew.% oder 95 Gew.%. Insbesondere bevorzugt ist, dass als Trägermedium ausschließlich Wasser und/oder hydrophile Lösemittel verwendet werden. Ganz bevorzugt ist das einzige Trägermedium Wasser.
Spreitende Zusammensetzungen wie Cremes, Lotionen oder Milchen, z.B. Körperpflegeprodukte, enthalten üblicherweise Ölkörper (synonym: Ölkomponente), die dazu beitragen, das Spreitverhalten zu optimieren. Diese Ölkörper sind üblicherweise in einer Gesamtmenge von über 50 Gew.% , meist von 5 bis 50 Gew.%, überwiegend von 5 bis 25 Gew.% in herkömmlichen Zusammensetzungen enthalten.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird das Hydrophobin erfϊndungsgemäß in Zusammensetzungen verwendet, welche wenig oder kein Fett oder Öl, also wenig oder keine Ölkomponente enthalten. Ölkomponenten sind insbesondere Öl, Fette, Wachse und Silikonverbindungen, speziell hydrophobe Lipide wie Kohlenwasserstoffe, Silikonöle, Fettalkohole und Fettsäurester.
Bevorzugt enthalten erfmdungsgemäße Zusammensetzungen mit Hydrophobin als Spreitmittel weniger als 50 Gew.% Ölkomponente, besonders bevorzugt weniger als 40 Gew.%, ganz besonders bevorzugt weniger als 25 Gew.%, 20 Gew.%, 15 Gew.%, 10 Gew.%. insbesondere weniger als 5 Gew.%, und am meisten bevorzugt 0 Gew.% Ölkomponente. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Hydrophobin als Spreitmittel in einer Zusammensetzung verwendet, die frei von Ölkomponenten ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Hydrophobin in einer Zusammensetzung verwendet, die weniger als 5 Gew.% Emulgatoren enthält und besonders bevorzugt frei von Emulgatoren ist. Hierdurch wird ein Nachteil von Emulgatoren vermieden: das während der Hautreinigung auftretende unerwünschte Auswaschen von Fetten aus der Haut durch Emulgatoren, die auf oder in der Haut verblieben sind.
Ganz besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, in welcher für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weder Emulgatoren noch Ölkomponenten verwendet werden.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Hydrophobin als Spreitmittel in einer nicht fettenden Zusammensetzung verwendet, insbesondere in einer nicht fettenden Creme oder Lotion wie z.B. einer Hautcreme.
Zusammensetzungen mit Hydrophobin als Spreitmittel kommen mit einem Minimum an Ölkomponente aus und benötigen keine weiteren Hilfsstoffe zur Emulsionsbildung oder zur Verbesserung des Spreitverhaltens. Dies kommt insbesondere sensibler Haut sehr entgegen.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung dient der Behandlung von Oberflächen. Die erfmdungsgemäße Zusammensetzung gemäß Ausführungsform (4), in welcher das Hydrophobin gemäß einer der Ausführungsformen (1) bis (3) als Spreitmittel genutzt wird, ist ein Mittel zur Behandlung von Oberflächen. Erfindungsgemäß zu behandelnde Oberflächen sind alle Oberflächen, auf denen eine Ausbreitung des Mittels zur Oberflächenbehandlung nach Auftrag auf die Oberfläche gewünscht ist. Dies beinhaltet technische und natürliche Oberflächen.
Zu den technischen Oberflächen, die erfmdungsgemäß behandelbar sind, zählen Oberflächen aus Kunststoff, Papier, Metall, Lack, Textilien, Leder oder anderen Naturstoffen, insbesondere Keratin-haltige Textilien, Leder und Papier. Damit sind erfindungsgemäße Mittel zur Oberflächenbehandlung z.B. auch Autopolituren, Reinigungsmittel, Imprägnierungsmittel, Mittel zur Papierbehandlung und Schuhcreme.
Zu den natürlichen Oberflächen, die erfindungsgemäß behandelbar sind, zählen pflanzliche und tierische Materialien, insbesondere pflanzliche, menschliche oder tierische Körperoberflächen.
In einem Aspekt sind die bevorzugten natürlichen Oberflächen menschliche oder tierische Körperoberflächen. Bevorzugt sind dies Keratin-haltige Oberflächen, wie Haut, Haar, Nägel, Hörn, Wolle, Leder, Fell, Pelz und Federn. Besonders bevorzugt sind Haar und Haut. Ganz besonders bevorzugt wird Hydrophobin erfϊndungsgemäß als Spreitmittel in einer Zusammensetzung zur Behandlung von Haut angewandt und ist die Zusammensetzung gemäß Ausführungsform (4) zur Behandlung der Haut geeignet. Menschliche Haut ist bevorzugt.
In einem zweiten Aspekt sind die bevorzugten natürlichen Oberflächen aus pflanzlichem Material, insbesondere Pflanzenoberflächen, wie sie z.B. beim Auftrag von Pflanzenschutzmitteln durch diese Mittel benetzt werden. In einem weiteren bevorzugten Aspekt ist die bevorzugte behandelte Oberfläche aus pflanzlichem Material eine Cellulose-haltige Oberfläche, insbesondere Papier.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Hydrophobin zur Herstellung eines der genannten Mittel zur Behandlung von Oberflächen, insbesondere eines Pflanzenschutzmittels, eines Kosmetikums oder eines Arzneimittels.
Für den Auftrag der Hydrophobin-haltigen Zusammensetzungen kommen grundsätzlich alle für den gezielten Auftrag eines flüssigen oder halbfesten Mediums auf eine technische oder natürliche Oberfläche zu Verfügung stehenden Methoden und Techniken in Betracht. Bei technischen Oberflächen sind dies beispielsweise Tauch-, Druck-, Lackier- oder Sprühverfahren sowie das Aufbringen mittels Pinseln, Rakeln oder Riffelwalzen. Bei natürlichen Oberflächen sind dies insbesondere Verstreichen (Eincremen), Einschäumen, Aufsprühen und Bepinseln. Die zum
Aufbringen der Zusammensetzung auszuwählende Technik richtet sich nach der Art der Beschaffenheit der zu beschichtenden Oberfläche, bzw. der Form des die Oberfläche aufweisenden Körpers. Zur Behandlung von z.B. Metall oder Papier können übliche Lackierverfahren zum Einsatz kommen, wohingegen bei gewölbten Formen Sprühtechniken besser geeignet sind. Zur Behandlung von z.B. Haut ist Eincremen oder -sprühen bevorzugt, während die Behandlung von Haar bevorzugt durch Einschäumen oder Besprühen erfolgt.
Die Verwendung gemäß Ausführungsform (1) bis (3) und die Oberflächen- behandlung mit der Zusammensetzung gemäß Ausführungsform (4) der vorliegenden Erfindung erfordern das Vorhandensein mindestens eines Hydrophobins in einer Zusammensetzung, die der Oberflächenbehandlung dient. Diese Zusammensetzung enthält bevorzugt noch weitere Inhaltsstoffe, insbesondere mindestens einen Stoff, welcher der Pflege der behandelten Oberfläche dient, wie z.B. Panthenol, Vitamine oder Bisabolol bei kosmetischen und pharmazeutischen Haut- order Haarpflegeprodukten. In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltend Hydrophobin als Spreitmittel können eine Vielzahl unterschiedlicher Wirk- und Effektstoffe formuliert werden. Ist die Zusammensetzung eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, so enthält sie bevorzugt neben Hydrophobin weitere pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptable Inhaltsstoffe. Auf Einzelheiten zu diesen Inhalts Stoffen wird weiter unten eingegangen.
Unter "Hydrophobin" bzw. "Hydrophobine" werden im Kontext aller Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt Polypeptide der allgemeinen Formel (I)
Xn-ci-xi.so-c^xo-s-c^xi.ioo-c^xi-ioo-c^xi-so-cö-xo-s-c^xi-so-c8-
Xm (I)
verstanden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können die Reste X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren in der jeweiligen Teilsequenz X dar.
Die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen. Im Allgemeinen sind weder m noch n Null, sondern betragen in der Regel 1 oder mehr. Beispielsweise können m und n unabhängig voneinander von 1 bis 500 betragen. Bevorzugt sind m und n unabhängig voneinander von 15 bis 300.
Die mit C* bis C° benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens fünf, besonders bevorzugt mindestens sechs und insbesondere mindestens sieben der Positionen C* bis C° durch Cystein besetzt sein. Cysteine an den Positionen C* bis C° können in den erfϊndungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die Ausbildung von mindestens einer, bevorzugt zwei, besonders bevorzugt drei und ganz besonders bevorzugt vier intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die bei Vorliegen von Cys an den betroffenen Positionen intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls an den mit X bezeichneten Positionen ebenfalls ein Cystein, Serin, Alanin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-Positionen in den allgemeinen Hydrophobin-Formeln entsprechend verändern. Zusätzliche Cysteine an X-Positionen sind ebenfalls zur Ausbildung von Disulfidbrücken in der Lage.
Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)
Xn-C1-X3.25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8- Xm (II)
zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X und C sowie die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben. Die Indizes n und m stehen für natürliche Zahlen einschließlich der Zahl Null. Im Allgemeinen sind weder m noch n Null, sondern betragen in der Regel 1 oder mehr. Beispielsweise können m und n unabhängig voneinander von 1 bis 500 betragen. Bevorzugt sind m und n unabhängig voneinander von 15 bis 300. Des Weiteren bevorzugt handelt es sich bei mindestens sechs der mit C benannten Reste um Cystein, besonders bevorzugt bei allen Resten C um Cystein. Ganz besonders bevorzugt bilden mindestens ein Paar dieser Cysteine eine Disulfidbrücke, und die Ausbildung von mehr als einer Disulfidbrücke, also von 2, 3 oder 4 dieser Brücken, ist am meisten bevorzugt.
Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)
X :n-C1-X5.9-C2-C3-Xi i.39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III)
zur Ausfuhrung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X und C sowie die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben. Insbesondere stehen die Indizes n und m für natürliche Zahlen von 1 bis 200. Im Allgemeinen handelt es sich bei mindestens sechs der mit C benannten Reste um Cystein. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein. Ganz besonders bevorzugt bilden mindestens ein Paar dieser Cysteine eine Disulfidbrücke, und die Ausbildung von mehr als einer Disulfidbrücke, also von 2, 3 oder 4 dieser Brücken, ist am meisten bevorzugt.
Bei den Gruppen Xn und Xm in jeder der Formeln (I) bis (III) kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise mit den anderen Bestandteilen des Hydrophobins verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einer oder bei beiden Gruppen um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit den anderen Bestandteilen des Hydrophobins verknüpft sind. Darunter sind auch solche Gruppen Xn und/oder Xm zu verstehen, in denen eine natürlicherweise im Protein vorkommende Peptidsequenz durch eine nicht natürlicherweise im Protein vorkommende Peptidsequenz verlängert ist. Die Gruppe Xn und/oder Xm kann ganz oder teilweise Peptidsequenzen enthalten, die nicht natürlicherweise im Hydrophobin-Protein vorkommen. Die nicht natürlicherweise im Protein vorkommenden Peptidsequenzen, aus denen die Gruppe Xn und/oder Xm teilweise oder ganz bestehen kann, werden im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet. Diese Fusionspartner sind in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren lang. Es kann sich beispielsweise um Sequenzen aus von 20 bis 500, bevorzugt von 30 bis 400 und besonders bevorzugt von 35 bis 100 Aminosäuren handeln.
Der Fusionspartner kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es kann nur ein einziger Fusionspartner mit dem Rest des Polypeptids verknüpft sein, oder es können auch mehrere Fusionspartner mit dem Rest des Polypeptids verknüpft werden. Es können beispielsweise zwei Fusionspartner an einer der Positionen Xn oder Xm mit dem Rest des Polypeptids verknüpft werden, oder es befinden sich auf jeder der beiden Positionen einer oder mehrere Fusionspartner.
Geeignete Fusionspartner sind beispielsweise in WO 2006/082251, WO 2006/082253, WO 2006/131564 und WO 2007/014897 offenbart. Diese Fusionspartner sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte Fusionspartner.
Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, bevorzugt in Prokaryoten, insbesondere in Escherichia coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für besonders geeignete Fusionspartner sind die Polypeptide mit den Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251, siehe Abbildung 1 dieser Anmeldung; SEQ ID NO: 15 bzw. 16 in WO 2007/014897, siehe Abbildung 9 bzw. 10 dieser Anmeldung), yaae (SEQ ID NO: 18 in WO 2006/082251, siehe Abbildung 2 dieser Anmeldung), Ubiquitin und Thioredoxin. Insbesondere geeignet als Fusionspartner sind yaad und daraus abgeleitete verkürzte Sequenzen, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und in WO 2006/082251 und WO 2007/014897 beschrieben sind. Ganz besonders geeignet sind yaad und yaad40. Ein Beispiel für ein derartiges Protein ist yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO. '26 aus WO 2007/014897), welches einen auf 40 Aminosäuren verkürzten yaad-Rest aufweist.
Gut geeignet sind auch Fragmente oder Homologe dieser genannten Sequenzen, die nur einen zusammenhängenden Teil, beispielsweise von 70 bis 99 %, bevorzugt von 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt von 10 bis 40 % der Aminosäuren der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz ausgetauscht sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Gesamtanzahl der Aminosäuren bezieht. Bevorzugte Austausche sind oben unter „Definitionen" beschrieben.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Hydrophobin - gegebenenfalls bevorzugt neben einem der bereits genannten Fusionspartner - als eine der Gruppen Xn oder Xm oder als terminalen Bestandteil einer solchen Gruppe noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affmity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirken und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)k-, (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe)k- oder (Cys)k-
Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt handelt es sich um eine (His)k-Gruppe, wobei k für eine der Zahlen vier bis sechs steht. Hierbei kann die Gruppe Xn und/oder Xm ausschließlich aus einer derartigen Affmitätsdomäne bestehen oder aber aus natürlicherweise oder nicht natürlicherweise mit dem Rest des Polypeptids verknüpften Aminosäuren oder Polypeptiden und einer derartigen Affinitätsdomäne. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Hydrophobin zusätzlich an seiner Polypeptidsequenz modifiziert, beispielsweise durch Glycosylierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.
Hydrophobine, ihre Sequenzen und ihre Herstellung sind beispielsweise in WO 2006/082251 offenbart, dessen diesbezügliche Inhalte hiermit ausdrücklich in die vorliegende Erfindung einbezogen werden. Die in WO 2006/082251 beschriebenen Hydrophobine sind für die Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, ganz besonders Hydrophobine des Typs dewA (in den Beispielen in den Fusionsproteinen „Hydrophobin A" bzw. „Hydrophobin B" enthalten), hypA und hypB, insbesondere Hydrophobine des Typs dewA. Diese Hydrophobine und ihre Sequenzen sind beispielsweise in WO 2006/082251 und WO 2007/014897 offenbart, deren diesbezügliche Inhalte hiermit ausdrücklich in die vorliegende Erfindung einbezogen werden. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die nachfolgend angegebenen Sequenznamen und SEQ ID-Nummern auf in WO 2006/082251 offenbarte Sequenzen. Eine Übersichtstabelle mit den SEQ ID-Nummern aus WO 2006/082251 befindet sich in WO 2006/082251 auf Seite 20 (Abbildung 15 dieser Anmeldung).
Erfindungsgemäß insbesondere geeignet sind Hydrophobine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO:20, Abbildung 4 dieser Anmeldung), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO:22, Abbildung 6 dieser Anmeldung) und yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO:24, Abbildung 8 dieser Anmeldung) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21, 23 (Abbildungen 3, 5, 7 dieser Anmeldung). Besonders bevorzugt kann yaad-Xa-dewA- his (SEQ ID NO:20 in WO 2006/082251 bzw. SEQ ID NO: 19 und 20 in WO 2007/014897, siehe Abbildungen 4 bzw. 11 und 12 dieser Anmeldung) eingesetzt werden. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO:20, 22 oder 24 (Abbildungen 4, 6 oder 8 dieser Anmeldung) dargestellten Polypeptid- Sequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bevorzugt bis hin zu 5% aller Aminosäuren, besonders bevorzugt bis hin zu zehn, ganz besonders bevorzugt bis hin zu fünf Aminosäuren, ergeben, und welche die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die unten beschriebene Änderung des Kontaktwinkels und/oder die unten beschriebene Wirkung auf Haut und/oder Keratin verstanden.
Besonders zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignete Hydrophobine sind des Weiteren von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO:20, Abbildung 4 dieser Anmeldung), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO:22, Abbildung 6 dieser Anmeldung) oder yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO:24, Abbildung 8 dieser Anmeldung) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Hydrophobine. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16, Abbildung 1 dieser Anmeldung) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürzter yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 zusammenhängende Aminosäuren der yaad-Sequenz umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis 150 und ganz besonders bevorzugt 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden. Ein insbesondere geeignetes Protein ist yaad40-Xa- dewA-his (SEQ ID NO:25 und 26 in WO 2007/014897, siehe Abbildungen 13 und 14 dieser Anmeldung), welches einen auf 40 Aminosäuren verkürzten yaad-Rest aufweist. Eine Spaltstelle zwischen dem Fusionspartner bzw. Fusionspartnern und dem Rest des Polypeptids kann dazu genutzt werden, den Fusionspartner abzuspalten (beispielsweise durch BrCN-Spaltung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin-, TEV-Spaltung etc.). Besonders bevorzugt ist eine Xa-Schnittstelle, z.B. eine Schnittstelle der in den Beispielen verwendeten Hydrophobine.
Wie bereits oben dargestellt, sind Hydrophobine oberflächenaktive Polypeptide. Sie können aus natürlichen Quellen isoliert werden, können aber auch mittels gentechnischer Verfahren gewonnen werden. Prinzipiell sind sowohl Hydrophobine der einen wie der anderen Herkunft zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet.
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.
Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al, Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.
Ein gentechnisches Herstellverfahren für Hydrophobine aus Talaromyces thermophilus, die keinen Fusionspartner enthalten, ist z.B. in US 2006/0040349 beschrieben.
Die Herstellung von Hydrophobinen, die einen Fusionspartner enthalten, kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Rest des Polypeptids codierende Nukleinsäure- sequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren beispielsweise ist von WO 2006/082251 oder WO 2006/082253 offenbart. Die Fusionspartner erleichtern die Herstellung der Hydrophobine erheblich. Hydrophobine, die einen Fusionspartner enthalten, werden bei den gentechnischen Verfahren mit deutlich besseren Ausbeuten produziert als Hydrophobine, die keinen Fusionspartner enthalten.
Die nach dem gentechnischen Verfahren von den Wirtsorganismen produzierten Hydrophobine können in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgearbeitet und mittels bekannter chromatographischer Methoden gereinigt werden.
Im Allgemeinen werden isolierte, insbesondere gereinigte Hydrophobine zur Ausführung der Erfindung genutzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das in WO 2006/082253, Seiten 11/12 offenbarte, vereinfachte Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren eingesetzt werden.
Hierzu werden die fermentierten Zellen zunächst aus der Fermentationsbrühe abgetrennt, aufgeschlossen und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern
(inclusion bodies) getrennt. Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Einschlusskörper, beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergentien in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Hydrophobine freizusetzen. Die Einschlusskörper mit den erfmdungsgemäß verwendeten Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0,1 M NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden. Die erhaltenen Lösungen können, gegebenenfalls nach Einstellen des gewünschten pH- Wertes, ohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden. Die Hydrophobine können aus den Lösungen aber auch als Feststoff isoliert werden. Bevorzugt kann die Isolierung mittels Sprühgranulieren oder Sprühtrocknen erfolgen, wie in WO 2006/082253, Seite 12 beschrieben. Die nach dem vereinfachten Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren erhaltenen Produkte umfassen neben Resten von Zelltrümmern in der Regel ca. 80 bis 90 Gew.% Proteine. Die Menge an Hydrophobinen beträgt je nach Fermentationsbedingungen in der Regel von 30 bis 80 Gew.% bezüglich der Menge aller Proteine.
Die isolierten Hydrophobin-enthaltenden Produkte können als Feststoffe gelagert werden.
Die Hydrophobine können als solche oder auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners zur Ausführung dieser Erfindung verwendet werden. Eine
Spaltung nimmt man vorteilhaft nach der Isolierung der Einschlusskörper und deren Auflösung vor.
Eine biologische Eigenschaft der Hydrophobine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn eine Oberfläche, z.B. eine Glasoberfläche, mit Hydrophobin-Proteinen beschichtet wird. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell beispielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit den Proteinen gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen werden beispielsweise bei Raumtemperatur mit einem Wassertropfen von 5 μl und unter Verwendung von Glasplättchen als Substrat durchgeführt. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im Beispiel 10 der WO 2006/136607 dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen können die verwendeten Hydrophobine den Kontaktwinkel vergrößern. So können die Hydrophobine den Kontaktwinkel beispielsweise um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30°, mindestens 40°, mindestens 45°, insbesondere mindestens 50° vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird Hydrophobin als Spreitmittel eingesetzt. Hinsichtlich des Kontaktwinkels bedeutet dies, dass das Hydrophobin den Kontaktwinkel einer erfindungsgemäßen Hydophobin-haltigen Zusammensetzung mit einer Oberfläche vergrößert, beispielsweise um mindestens 5 %, bevorzugt mindestens 20°, besonders bevorzugt mindestens 25°, mindestens 30°; mindestens 40°; mindestens 45°, insbesondere mindestens 50° vergrößert, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Tropfens der Zusammensetzung ohne Hydrophobin mit der unbehandelten Oberfläche. Alternativ erhöht das Hydrophobin als Spreitmittel den Kontaktwinkel im gleichem Maße, wenn eine Oberfläche zunächst mit Hydrophobin und dann mit einer weiteren Zusammensetzung behandelt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Wirkung von Hydrophobin auf das Spreitverhalten von Zusammensetzungen, insbesondere von kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen. Die Bindung von Hydrophobin an Haut und Haar kann wie in Beispielen 1 bis 4 (identisch zu Beispielen 11 bis 14 der WO 2006/136607) beschrieben getestet werden. Das Spreitverhalten kann wie in Beispiel 5 beschrieben getestet werden. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung gemäß Ausführungsform (4), und die durch die Verwendung von Hydrophobin gemäß Ausführungsform (1) bis (3) entstehenden Zusammensetzungen enthalten das Hydrophobin vorzugsweise in einer Konzentration von 0,001 bis 10 Gew.%, bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.%, besonders bevorzugt eine Menge von 0,05 bis 3 Gew.%, ganz besonders bevorzugt von 0,1 bis 1 Gew.% Gesamt-Hydrophobin bezogen auf die Gesamt-Zusammensetzung. Am meisten bevorzugt ist eine Hydrophobin-Konzentration von bis zu 0,2 Gew.%, insbesondere von 0,01 bis 0,05 Gew.%, vor allem von 0,025 Gew.%. Das Gesamt- Hydrophobin ist die Gesamtmenge der Hydrophobin-Moleküle einer oder mehrerer Hydrophobin-Molekülarten in der Zusammensetzung.
Diese Konzentrationsbereiche geben auch die bevorzugten Konzentrationen an, in denen das Hydrophobin bei der Verwendung nach Ausführungsform (1) bis (3) auf die behandelte Oberfläche aufgebracht wird.
Die genannten Hydrophobin-Konzentrationen liegen beispielsweise entweder bereits in den erfmdungsgemäßen Zusammensetzungen gemäß Ausführungsform (4), bzw. den bei Verwendung des Hydrophobins gemäß Ausführungsform (1) bis (3) verwendeten Zusammensetzungen vor, oder sie werden durch Verdünnen eines Konzentrats vor Verwendung der Zusammensetzung erhalten.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann nur ein Hydrophobin oder aber auch eine Kombination von verschiedenen Hydrophobinen enthalten, z.B. eine Zusammensetzung, die zwei oder drei Hydrophobine umfasst. Gleichermaßen können gemäß Ausführungsform (1) bis (3) ein Hydrophobin oder eine Kombination von verschiedenen Hydrophobinen verwendet werden. Die neben Hydrophobin in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltenen Stoffe können grundsätzlich hydrophob oder hydrophil sein. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein weiterer Inhaltsstoff neben dem Hydrophobin und dem Trägermedium in den Ausführungsformen (1) bis (4) ein hydrophiler Inhaltstoff, insbesondere ein hydrophiler Wirkstoff oder ein hydrophiles Effektormolekül. Das Hydrophobin verbessert insbesondere dessen Bindung an die Oberfläche des behandelten Gewebes, wie z.B. der Haut, da es die Oberfläche hydrophiler machen kann.
Auf der anderen Seite können hydrophobe Stoffe eine Hydrophobin-Schicht auf der Oberfläche durchdringen und sich in die tieferen Schichten einlagern. Derart stabilisierte hydrophobe Stoffe verbleiben länger auf dem behandelten Gewebe. Ihre Verwendung als Inhaltsstoffe in einer erfindungsgemäßen Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung ist daher ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Verwendung zumindest eines hydrophilen Wirkstoffs wird in allen erfindungsgemäßen Verwendungen und Zusammensetzungen bevorzugt. Besonders bevorzugt ist der größere Teil der vorhandenen Wirkstoffe hydrophil (mehr als 50 Gew.% bezogen auf die gesamten Wirkstoffe), ganz besonders bevorzugt sind alle vorhandenen Wirkstoffe hydrophil. Dasselbe gilt für Effektormoleküle.
Schließlich kann Hydrophobin auch die Aufnahme und Verweilzeit von Wirkstoffen verbessern, die gleichzeitig mit oder nach dem Hydrophobin auf die Oberfläche aufgetragen werden. Hydrophobin kann insbesondere als Penetrationsverstärker dienen, also zur Erhöhung der Menge eines weiteren Stoffes, insbesondere eines Wirkstoffes, die pro Zeiteinheit in die Oberfläche eindringt oder durch die Oberfläche hindurchtritt. Hydrophobin als Spreitmittel kann des Weiteren die Oberflächeneigenschaften der behandelten Oberfläche so verändern, dass sich das Ausbreitungsverhalten von anschließend aufgebrachten Zusammensetzungen verändert. Dies gilt insbesondere bei einer Vorbehandlung der zu behandelnden Oberfläche mit einer Hydrophobin- enthaltenden Zusammensetzung vor Aufbringen einer weiteren Zusammensetzung, deren Ausbreitung auf der Oberfläche durch das Hydrophobin als Spreitmittel gefördert werden soll.
Die Verwendung gemäß Ausführungsform (1) bis (3) kann im Rahmen eines Verfahrens erfolgen, das einen oder mehrere Schritte umfasst. Bevorzugt umfasst das Verfahren mindestens die folgenden Schritte:
(a) Aufbringen mindestens eines Hydrophobins, z.B. eines Hydrophobins der Strukturformel (I), auf die zu behandelnde Oberfläche; und
(b) Aufbringen mindestens einer weiteren, üblicherweise nicht Hydrophobin- enthaltenden Zusammensetzung auf die Hydrophobin-behandelte Oberfläche, wobei die Schritte (a) und (b) entweder gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden.
Werden die Schritte (a) und (b) gleichzeitig durchgeführt, so wird nur eine Zusammensetzung aufgebracht, die dann sowohl das Hydrophobin als auch die Inhaltsstoffe der weiteren Zusammensetzung enthält. Diese nur eine Zusammensetzung kann durch Vermischen zweier getrennter Zusammensetzungen, von denen die eine das Hydrophobin enthält, hergestellt werden.
Werden die Schritte (a) und (b) nacheinander durchgeführt (also Schritt (a) vor Schritt (b)), so wird zunächst das Hydrophobin, bevorzugt in Form einer Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung, auf die behandelte Oberfläche, z.B. die Haut, aufgebracht. Diese Zusammensetzung wirkt eine gewisse Einwirkzeit lang auf die Oberfläche ein. Danach wird eine weitere Zusammensetzung auf die Oberfläche aufgetragen. Der Auftrag der letztgenannten Zusammensetzung kann sich unmittelbar an die Einwirkzeit der Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung anschließen, oder es werden zwischen Schritt (a) und (b) noch weitere Schritte (also einer oder mehrere Schritte) durchgeführt.
Diese weiteren Schritte können alle Maßnahmen sein, die zur Oberflächenbehandlung dienen, solange sie weder die Hydrophobinschicht entfernen noch das Endergebnis der Oberflächenbehandlung beeinträchtigen. Bevorzugt ist ein solcher Schritt das Trocknen der Oberfläche nach dem Aufbringen der Hydrophobin-haltigen Zusammensetzung.
Die Schritte des Verfahrens können auch mehrfach wiederholt werden.
Die Abfolge und Art der einzelnen Schritte in Beispiel 5 ist eine bevorzugte Art der Durchführung des erfmdungsgemäßen Verfahrens (1). Aus diesen Schritten kann auch eine Auswahl getroffen werden, soweit diese den oben genannten Vorgaben entspricht.
In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Hydrophobin als Spreitmittel in einer pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammensetzung verwendet. Bevorzugt sind kosmetische Zusammensetzungen.
Bezüglich der erfindungsgemäß neben dem Hydrophobin in pharmazeutischen und kosmetischen Zusammensetzungen einsetzbaren Inhaltsstoffe wird ausdrücklich verwiesen auf die online-Datenbank „Coslng" der Europäischen Union (http://ec.europa.eu/enterprise/cosmetics/cosing/), welche das "Europäische Inventar der Kosmetik-Rohstoffe", herausgegeben von der Europäischen Gemeinschaft, umfasst, und innerhalb dieser Datenbank insbesondere auf Substanzen mit der Funktion „skin conditioning", „skin protecting" und/oder „smoothing", sowie auf das "Europäische Inventar der Kosmetik-Rohstoffe" selbst, herausgegeben von der Europäischen Gemeinschaft, erhältlich vom Bundesverband Deutscher Industrie-und Handelsunternehmen für Arzneimittel, Reformwaren und Körperpflegemittel e.V., Mannheim.
Neben den kosmetischen Zubereitungen gibt es eine Vielzahl an medizinisch topischen Zusammensetzungen, die in der Regel ein oder mehrere pharmazeutisch aktive Substanzen in wirksamer Konzentration enthalten. Auch diese Zusammen- Setzungen bedürfen der Verbesserung sowohl hinsichtlich ihrer Verteilbarkeit auf der Haut als auch ihrer sensorischen Eigenschaften. Zur Unterscheidung zwischen kosmetischer und medizinischer Anwendung und entsprechenden Produkten wird auf die gesetzlichen Bestimmungen der Bundesrepublik Deutschland verwiesen (z. B. Kosmetikverordnung, Lebensmittel- und Arzneimittelgesetz).
In einem bevorzugten Aspekt der Ausführungsformen (1) bis (4) ist das Hydrophobin Bestandteil eines Mittels zur Behandlung äußerer Körperoberflächen wie der Haut, der Haare oder der Nägel, insbesondere zur Behandlung von menschlichen Haaren, Haut oder Nägeln. Besonders bevorzugt ist das Mittel eine Creme, eine Salbe, eine Lotion oder eine wässrige Lösung wie z.B. ein Spray. Ganz besonders bevorzugt ist es ein Mittel zur Behandlung großer Hautflächen, wie ein Sonnenschutzmittel (Spray, Lotion oder Creme), ein Hautpflegeprodukt, oder ein Insektenschutzmittel. Oder es ist ein pigment- oder farbstoffhaltiges Mittel, dessen gleichmäßige Verteilung wünschenswert ist, um ungleichmäßige Verfärbungen der Haut oder des Haars zu vermeiden, wie ein Selbstbräuner, eine Grundierung, ein Make-up oder ein Haarfärbemittel. Gerade bei derartigen Zubereitungen ist ein gutes Spreitverhalten erwünscht, um eine einfache und gleichmäßige Verteilung der Zubereitung über die gesamte große Hautfläche zu erleichtern. Eine erfindungsgemäße kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung enthält neben dem Hydrophobin in der Regel zumindest ein kosmetisch oder pharmazeutisch akzeptables Trägermedium und kann daneben noch weitere in Kosmetika oder Pharmazeutika übliche Inhaltsstoffe enthalten.
Es hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel weitere vorteilhafte Effekte neben den oben genannten Vorteilen haben kann. So erhöht das Aufbringen von Hydrophobin die Intensität und Beständigkeit der Färbung durch Haarfärbemittel (vgl. EP 08 16 2556.8) und kann auch die Verweilzeit anderer kosmetischer Inhaltsstoffe auf Haar verlängern (US 2003/0217419 Al).
Die erfmdungsgemäßen kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten neben Hydrophobin in der Regel ein kosmetisch bzw. pharmazeutisch annehmbares Medium sowie geeignete weitere Inhaltsstoffe, die die kosmetische bzw. pharmazeutische Wirkung unterstützen, insbesondere in Kosmetika und Pharmazeutika übliche Hilfsstoffe und Zusatzstoffe. Diese Bestandteile sollten das Behandlungsergebnis nicht nachteilig beeinflussen. Derartige Basisrezepturen für kosmetische und pharmazeutische Zusammensetzungen und die dafür geeigneten Inhaltsstoffe sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und in Kosmetik-Handbüchern zu finden, wie z.B. in Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Verlag, Heidelberg, 1989, oder Umbach, Kosmetik: Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel, 2. erweiterte Auflage, 1995, Georg Thieme Verlag, oder Bauer, Frömming, Führer, Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 7. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 2002.
Die erfmdungsgemäßen Zusammensetzungen werden u.a. als kosmetische oder pharmazeutische Zubereitungen, beispielsweise als Cremes, Emulsionen, Gele oder auch tensidhaltige schäumende Lösungen, z.B. Shampoos, Schaumaerosole oder andere Zubereitungen, die für die Anwendung auf Körperoberflächen, insbesondere auf Haut und/oder Haar, geeignet sind, konfektioniert.
Übliche Bestandteile solcher wasserhaltiger kosmetischer bzw. pharmazeutischer Zubereitungen sind z. B. Netz- und Emulgiermittel, wie anionische, nichtionische und ampholytische Tenside, z. B. Fettalkoholsulfate, Alkansulfonate, α-Olefinsulfonate, Fettalkoholpolyglykolethersulfate, Ethylenoxidanlagerungs- produkte an Fettalkohole, Fettsäuren und Alkylphenole, Sorbitanfettsäureester und Fettsäurepartialglyceride, Fettsäurealkanolamide sowie Verdickungsmittel, wie z. B. Methyl- oder Hydroxyethylcellulose, Stärke, Fettalkohole, Paraffmöle, Fettsäuren, ferner Parfumöle und haut- und/oder haarpflegende Zusätze, wie z. B. wasserlösliche kationische ampholytische und anionische Polymere, Proteinderivate, Pantothen- säure, Cholesterin, Farbstoffe, Wirkstoffe wie Panthenol, Allantoin, Pyrrolidon- carbonsäuren und deren Salze, Pflanzenextrakte und Vitamine, Lichtschutzmittel, Konsistenzgeber wie Zuckerester, Polyolester oder Polyolalkylether, Wachse, wie Bienenwachs und Montanwachs, Komplexbildner wie EDTA, NTA und Phosphon- säuren, Quell- und Penetrationsstoffe wie Glycerin, Propylenglykolmonoethy lether, Carbonate, Hydrogencarbonate, Guanidine, Harnstoffe sowie primäre, sekundäre und tertiäre Phosphate, Perlglanzmittel wie Ethylenglykolmono- und -distearat,
Treibmittel wie Propan-Butan-Gemische, N2O, Dimethylether, CO2 und Luft sowie Antioxidantien.
Weitere übliche Bestandteile und die Zubereitung wasserhaltiger Kosmetika und Pharmazeutika sind dem Fachmann bekannt und werden beispielsweise in Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hüthig Buch Verlag, Heidelberg, 2. Aufl., 1989, sowie in WO 2007/063024 und in WO 2006/136607 als kosmetisch geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe beschrieben. Hierauf wird ausdrücklich Bezug genommen. Die Bestandteile der kosmetischen Träger werden zur Herstellung der erfmdungsgemäßen Zusammensetzungen in für diese Zwecke üblichen Mengen eingesetzt. Jedoch ist der Gehalt an Ölkomponenten und/oder Emulgatoren gegenüber herkömmlichen pharmazeutischen und kosmetischen Zusammen- Setzungen vorzugsweise reduziert, besonders bevorzugt fehlen Ölkörper und Emulgatoren in den erfmdungsgemäßen Zusammensetzungen völlig.
Im Regelfall wird die kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung zur Applikation auf der Haut (topisch), Zähne oder Haar verwendet. Unter topischen Zubereitungen sind dabei solche Zubereitungen zu verstehen, die dazu geeignet sind, einen oder mehrere Wirkstoffe in feiner Verteilung und bevorzugt in einer durch die Haut resorbierbaren Form auf die Haut aufzubringen. Hierfür eignen sich z.B. erfindungsgemäß wässrige und wässrig-alkoholische Lösungen, Sprays, Schäume, Schaumaerosole, Salben, wässrige Gele, Emulsionen vom O/W- oder W/O-Typ, Mikroemulsionen oder kosmetische Stiftpräparate. Zubereitungen, welche keinen oder nur eine geringe Menge (bevorzugt weniger als 20 Gew.%, besonders bevorzugt weniger als 10 Gew.%, ganz besonders bevorzugt weniger als 5 Gew.%) Ölkörper beinhalten, sind bevorzugt.
Das erfindungsgemäße kosmetische oder pharmazeutische Mittel zur Oberflächenbehandlung enthält einen Träger. Bevorzugt als Träger ist Wasser, eine Wasser-basierte oder hydrophile Flüssigkeit, ein Gel, eine Salbe, eine Creme, eine Emulsion oder Mikroemulsion, eine Dispersion oder eine Mischung davon. Die genannten Träger zeigen eine gute Hautverträglichkeit. Besonders vorteilhaft sind hydrophile Gele, hydrophile Salben oder hydrophile Cremes.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können unabhängig von der Art der kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung z. B. als Creme, Gel oder Shampoo einen schwach sauren, neutralen oder alkalischen pH- Wert haben. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von 6 bis 8. Die Einstellung des pH- Wertes erfolgt mit Hilfe üblicher pH- Stellmittel, jedoch bevorzugt nicht mit Ammoniak oder anderen als schädlich angesehenen Chemikalien.
In einem bevorzugten Aspekt wird neben dem Hydrophobin zusätzlich mindestens ein kosmetisch oder pharmazeutisch aktiver Inhaltsstoff, dessen Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird, auf die behandelte Oberfläche aufgetragen. In diesem bevorzugte Aspekt enthalten entweder die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen neben Hydrophobin zusätzlich mindestens einen kosmetisch oder pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoff, dessen
Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird, oder dieser kosmetisch oder pharmazeutisch aktive Inhaltsstoff wird separat (in Reinform oder als Bestandteil einer Zusammensetzung) aufgetragen.
Die jeweiligen quantitativen und qualitativen Auswirkungen werden durch die einzelnen kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffe und deren Anwendungsgebiet bestimmt. Insbesondere weitere Bestandteile von Cremes, z.B. Pflegestoffe, können durch die Anwesenheit von Hydrophobin intensiver wirken.
Der zusätzliche kosmetisch oder pharmazeutisch aktive Inhaltsstoff ist bevorzugt hydrophil.
Die erfmdungsgemäße Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel stellt bevorzugt keine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers dar. Sie dient in dieser Hinsicht lediglich nichttherapeutischen Zwecken, wie der
Verbesserung der Verteilung der Hydrophobin- haltigen Zusammensetzung auf der behandelten Oberfläche. Im Zusammenhang mit der Behandlung von menschlicher Haut und anderen menschlichen Körperoberflächen dient sie insbesondere kosmetischen Zwecken, ist also bevorzugt eine kosmetische Verwendung. Bevorzugte kosmetisch aktive Inhaltsstoffe, deren Aufnahme durch Hydrophobin verbessert wird, sind in WO 2006/136607 als „Effektormoleküle" beschrieben, auf deren entsprechende Passagen hiermit ausdrücklich verwiesen wird.
In den erfmdungsgemäßen Zusammensetzungen können in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Effektormoleküle als kosmetisch aktive Inhaltsstoffe eingesetzt werden. Als Effektormoleküle werden im folgenden Moleküle verstanden, die eine bestimmte, vorhersehbare Wirkung aufweisen. Dies können entweder proteinartige Moleküle, wie Enzyme, oder auch nicht-proteinogene Moleküle wie Farbstoffe, Lichtschutzmittel, Vitamine und Fettsäuren, Zucker oder Metallionen- enthaltende Verbindungen sein.
Unter den Zuckern sind Glucane und insbesondere Zucker natürlichen Ursprungs, wie z.B. aus Honig oder Getreide, bevorzugt.
Unter den proteinartigen Effektormolekülen sind Enzyme, Peptide und Antikörper bevorzugt.
Unter den Enzymen sind folgende als Effektormoleküle bevorzugt: Oxidasen, Peroxidasen, Proteasen, Tyrosinasen, metallbindende Enzyme, Lactoperoxidase, Lysozym, Amyloglycosidase, Glucoseoxidase, Superoxiddismutase, Photolyase, Catalase.
Gut geeignet als proteinartige Effektormoleküle sind auch Hydrolysate von Proteinen aus pflanzlichen und tierischen Quellen, beispielsweise Hydrolysate von Proteinen marinen Ursprungs, Milch- oder Seidenhydrolysate.
Besonders gut geeignet sind definierte Peptide, die zum Anti-Aging eingesetzt werden, wie Matrixyl (INCI Name Glycerin-Water-Butylene Glycol-Carbomer- Polysorbate 20-Palmitoyl Pentapeptide-4), Argireline (INCI Name Aqua, Acety- Hexapeptide-3), Rigin (INCI Name Water (and)-Glycerin (and) Steareth-20 (and) Palmitoyltetrapeptide-7), Eyeliss (INCI Name Water-Glycerin-Hespiridin Methyl Chalcone-Steareth-20-Dipeptide-2-Palmitoyl Tetrapeptide-7), Regu-Age (INCI Name Oxido Reductases-Soy Peptides-Hydrolyzed Rice Bran Extract) und Melanostatin-5 (INCI Name Aqua-dextran-Nonapetide-1).
Unter den nicht-proteinartigen Effektormolekülen sind Nicht-Protein- Anti-Aging- Agents wie z.B. Koffein, und Antioxidantien als Effektormoleküle bevorzugt. Antioxidantien, die auch als Radikalfänger bezeichnet werden, sind in der Lage, sog. freie Radikale zu neutralisieren. Dies sind aggressive Verbindungen, die physiologischerweise bei zahlreichen Stoffwechselvorgängen und der Energiegewinnung entstehen. Sie sind für Abwehrreaktionen des Körpers wichtig, können aber auch Schäden an der Erbsubstanz (DNA), den Zellmembranen und Körpereiweißen hervorrufen. Diese Schädigungen können zu vorzeitiger
Gewebealterung, Gewebetod und Krebs führen. Zu den Antioxidantien zählen Carotinoide, Ascorbinsäure (Vitamin C, E 300) wie auch Natrium-L-Ascorbat (E 301) und Calcium-L-Ascorbat (E 302); Ascorbylpalmitat (E 304); Butylhydroxyanisol (E 320); Butylhydroxytoluol (E 321); Calcium-Dinatrium- EDTA (E 385); Gallat wie auch Propylgallat (E 310), Octylgallat (E 311 ) und Dodecylgallat (Laurylgallat) (E 312); Isoascorbinsäure (E 315) wie auch Natriumisoascorbat (E 316); Lecithin (E 322); Milchsäure (E 270); Mehrfach- Phosphate wie Diphosphate (E 450), Triphosphate (E 451) und Polyphosphate (E 452); Schwefeldioxid (E 220) wie auch Natriumsulfit (E 221), Natriumbisulfit (E 222), Natriumdisulfit (E 223), Kaliumsulfit (E 224), Calciumsulfit (E 226),
Calciumhydrogensulfit (E 227) und Kaliumbisulfit (E 228); Selen; Tocopherol (Vitamin E, E 306) wie auch Alpha-Tocopherol (E 307), Gamma-Tocopherol (E 308) und Delta-Tocopherol (E 309); Zinn-II-Chlorid (E 512); Zitronensäure (E 330) wie auch Natriumeitrat (E 331) und Kaliumeitrat (E 332); L-Gluthation, L-Cystein, Polyphenole, Phenolsäuren, Flavonoide, Phytoöstrogene, Glutathion und die antioxidativen Enzyme Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase und Katalase. Erfindungsgemäß wird als Antioxidans mindestens eine Verbindung aus der oben genannten Gruppe von Antioxidantien ausgewählt.
Weitere geeignete Effektormoleküle sind Carotinoide. Unter Carotinoiden sind erfindungsgemäß folgende Verbindungen zu verstehen: beta-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Cryptoxanthin, Citranaxanthin, Canthaxanthin, Bixin, beta- Apo-4-carotinal, beta-Apo-8-carotinal, beta-Apo-8-carotinsäureester, einzeln oder als Mischung. Bevorzugt verwendete Carotinoide sind beta-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Citranaxanthin und Canthaxanthin.
Unter Retinoiden sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Vitamin A Alkohol (Retinol) und seine Derivate wie Vitamin A Aldehyd (Retinal), Vitamin A Säure (Retinsäure) und Vitamin A Ester (z.B. Retinylacetat, Retinylpropionat und Retinylpalmitat) zu verstehen. Der Begriff Retinsäure umfasst dabei sowohl all-trans Retinsäure als auch 13-cis Retinsäure. Die Begriffe Retinol und Retinal umfassen bevorzugt die all-trans Verbindungen. Als bevorzugtes Retinoid verwendet man all- trans-Retinol, im Folgenden als Retinol bezeichnet.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind Vitamine, insbesondere Vitamin A, und deren Ester.
Vitamine sind essentielle organische Verbindungen, die im tierischen und menschlichen Organismus entweder nicht oder nur in unzureichenden Mengen synthetisiert werden. Aufgrund dieser Definition wurden 13 Komponenten oder Gruppen von Komponenten als Vitamine klassifiziert. Zu den fettlöslichen Vitaminen gehören Vitamin A (Retinole), Vitamin D (Calciferole), Vitamin E (Tocopherole, Tocotrienole) und Vitamin K (Phylloquinone). Zu den wasserlöslichen Vitaminen gehören Vitamin Bl (Thiamin), Vitamin B2 (Riboflavin), Vitamin B6 (Pyridoxalgruppe), Vitamin B 12 (Cobalamine), Vitamin C (L-Ascorbinsäure), Pantothensäure, Biotin, Folsäure und Niacin.
Vitamine, Provitamine und Vitaminvorstufen aus den Gruppen A, C, E und F, insbesondere 3,4-Didehydroretinol, beta-Carotin (Provitamin des Vitamin A),
Ascorbinsäure (Vitamin C), sowie die Palmitinsäureester, Glucoside oder Phosphate der Ascorbinsäure, Tocopherole, insbesondere a-Tocopherol sowie seine Ester, z.B. das Acetat, das Nicotinat, das Phosphat und das Succinat; weiterhin Vitamin F, worunter essentielle Fettsäuren, besonders Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure, verstanden werden.
Vitamin E ist ein Sammelbegriff für eine Gruppe von (bis heute) acht fettlöslichen Sub-stanzen mit antioxidativen und nicht-antioxidativen Wirkungen. Vitamin E ist Bestandteil aller Membranen tierischer Zellen, wird jedoch nur von photosynthetisch aktiven Organismen wie Pflanzen und Cyanobakterien gebildet. Vier der acht bekannten Vitamin E-Formen werden Tocopherole (alpha-Tocopherol, beta- Tocopherol, gamma-Tocopherol und delta-Tocopherol) genannt. Die anderen bisher bekannten vier Formen von Vitamin E werden Tocotrienole (alpha-Tocotrienol, beta- Tocotrienol, gamma-Tocotrienol und delta-Tocotrienol) genannt. Ferner können auch Derivate dieser Substanzen wie alpha-Tocopherylacetat vorteilhaft sein.
Vitamin A und seine Derivate und Provitamine zeigen vorteilhafterweise einen besonderen hautglättenden Effekt.
Zu den erfindungsgemäß bevorzugt einzusetzenden Vitaminen, Provitaminen oder Vitaminvorstufen der Vitamin B-Gruppe oder deren Derivaten sowie den Derivaten von 2-Furanon gehören unter anderem: Vitamin Bl, Trivialname Thiamin, chemische Bezeichnung 3-[(4'-Amino-2'- methyl-5 ' -pyrimidinyl)methyl] -5 -(2-hydroxyethyl)-4- methylthiazoliumchlorid.
Vitamin B2, Trivialname Riboflavin, chemische Bezeichnung 7,8-Dimethyl-
10-(l-D-ribityl)-benzo[g]pteridin-2,4(3H,10H)-dion. In freier Form kommt Riboflavin z. B. in Molke vor, andere Riboflavin-Derivate lassen sich aus Bakterien und Hefen isolieren. Ein erfindungsgemäß ebenfalls geeignetes Stereoisomer des Riboflavins ist das aus Fischmehl oder Leber isolierbare Lyxoflavin, das statt des D-Ribityl- einen D-Arabityl-Rest trägt.
Vitamin B3. Unter dieser Bezeichnung werden häufig die Verbindungen Nicotinsäure und Nicotinsäureamid (Niacinamid) geführt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nicotinsäureamid.
Vitamin B5 (Pantothensäure und Panthenol). Bevorzugt wird Panthenol eingesetzt. Er-fmdungsgemäß einsetzbare Derivate des Panthenols sind insbesondere die Ester und Ether des Panthenols sowie kationisch derivatisierte Panthenole. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können zusätzlich zu Pantothensäure oder Panthenol auch
Derivate des 2-Furanon eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Derivate sind die auch im Handel erhältlichen Substanzen Dihydro-3-hydroxy-4,4- dimethyl-2(3H)-furanon mit dem Trivialnamen Pantolacton (Merck), 4- Hydroxymethyl-γ-butyrolacton (Merck), 3,3-Dimethyl-2-hydroxy-γ- butyrolacton (Aldrich) und 2,5-Dihydro-5-methoxy-2-furanon (Merck), wobei ausdrücklich alle Stereoisomere eingeschlossen sind.
Vorteilhafterweise verleihen dies Verbindungen den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen feuchtigkeitsspendende und hautberuhigende Eigenschaften. Vitamin B6, wobei man hierunter keine einheitliche Substanz, sondern die unter den Trivialnamen Pyridoxin, Pyridoxamin und Pyridoxal bekannten Derivate des 5-Hydro-xymethyl-2-methylpyridin-3-ols versteht.
Vitamin B7 (Biotin), auch als Vitamin H oder "Hautvitamin" bezeichnet. Bei Biotin handelt es sich um (3aS,4S, 6aR)-2-Oxohexahydrothienol[3,4- d]imidazol-4-valeriansäure.
- Vitamin B9 und Vitamin B 12.
Erfindungsgemäß können geeignete Derivate von Vitaminen (Salze, Ester, Zucker, Nukleotide, Nukleoside, Peptide und Lipide) ebenfalls genutzt werden.
Auch Nukleinsäuren, wie DNA und RNA, können geeignete Effektormoleküle sein, z.B. als Feuchtigkeitsspender.
Als lipophile, öllösliche Antioxidantien aus dieser Gruppe sind Tocopherol und dessen Derivate, Gallussäureester, Flavonoide und Carotinoide sowie Butylhydroxytoluol/anisol bevorzugt. Als wasserlösliche Antioxidantien sind Aminosäuren, z. B. Tyrosin und Cystein und deren Derivate sowie Gerbstoffe, insbesondere solche pflanzlichen Ursprungs bevorzugt.
Triterpene, insbesondere Triterpensäuren wie Ursolsäure, Rosmarinsäure, Betulinsäure, Boswelliasäure und Bryonolsäure sind ebenfalls bevorzugt.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind, bevorzugt niedrig dosierte, Fruchtsäuren (Alphahydroxysäuren) wie zum Beispiel Apfelsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Glykolsäure. Diese können in Konzentrationen von 0.1% bis 35%, bevorzugt 0.1% bis 10%, insbesondere 1% bis 10%, 1% bis 5% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung vorliegen.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind Harnstoff und Derivate davon, da diese die Haut pflegen können. Diese können in Konzentrationen von 0.1% bis 25%, bevorzugt 0.1% bis 10%, insbesondere 1% bis 10%, 1% bis 5% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung vorliegen.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind UV-Lichtschutzfϊlter, insbesondere die in WO 2006/136607 genannten UV-Filter.
Besonders bevorzugte derartige weitere kosmetisch aktive Inhaltsstoffe sind Keratin- Pflegestoffe und Hautpflegestoffe, insbesondere wasserlösliche Vitamine, Antioxidantien, UV-Filter, Glucane, Flavonoide, und Koffein.
Aus der Gruppe der wasserlöslichen Vitamine sind wiederum bevorzugt eines oder mehrere der Vitamine aus der Gruppe bestehend aus Vitamin C, Vitamin Bl, Vitamin B2, Niacin (Nicotinsäure, Nicotinsäureamid, Vitamin B3), Pantothensäure, Pantolacton und Panthenol (Vitamin B5), Vitamin B6, Biotin (Vitamin B7, Vitamin H), Vitamin B9 (Folsäure) und Vitamin B 12 oder deren Derivate. Panthenol, Pantolacton, Nicotinsäureamid, Natriumascorbylphosphat, sowie Biotin sind erfmdungsgemäß ganz besonders bevorzugt.
Aus der Gruppe der UV-Filter sind wiederum wasserlösliche UV-Filter bevorzugt, Uvinul MS 40, Uvinul P 25, Uvinul DS 49 und Z-COTE besonders bevorzugt, und Uvinul MS 40 und P 25 ganz besonders bevorzugt.
Aus der Gruppe der Antioxidantien sind wiederum Flavonoide, Phenolsäuren und Polyphenole bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind eine oder mehrere der kosmetisch aktiven Inhaltsstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Panthenol, Ascorbinsäure und deren Derivate, wasserlösliche UV-Filter, Koffein.
Wässrige Extrakte von Früchten und Kräutern, also insbesondere Pflanzenextrakte, Fruchtextrakte oder Kräuterextrakte, wie z.B. aus Trauben, Limette, Grapefruit, Hafer, Weizen, Reis, Soja, Gingseng, Pefferminze etc., können ebenfalls Bestandteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sein.
Die jeweiligen quantitativen und qualitativen Auswirkungen werden durch die einzelnen kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffe und deren Anwendungsgebiet bestimmt. Insbesondere weitere Bestandteile von Cremes, z.B. Pflegestoffe, können durch die Anwesenheit von Hydrophobin intensiver wirken.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt ist das erfindungsgemäße Mittel zur
Oberflächenbehandlung ein Pflanzenschutzmittel. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzenschutzmitteln enthaltend Hydrophobin als Spreitmittel. In diesem Aspekt der Erfindung wird neben dem Hydrophobin zusätzlich mindestens ein Pflanzenschutz- Wirkstoff, dessen Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird, auf die behandelte Oberfläche aufgetragen. In diesem bevorzugte Aspekt enthalten entweder die erfmdungsgemäßen Zusammensetzungen neben Hydrophobin zusätzlich mindestens einen pflanzenschützenden Inhaltsstoff, dessen Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin vorzugsweise verbessert wird, oder dieser Inhaltsstoff wird separat (in Reinform oder als Bestandteil einer Zusammensetzung) aufgetragen.
Der zusätzliche pflanzenschützend aktive Inhaltsstoff ist bevorzugt hydrophil. Eine besondere Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft die Formulierung von Pestiziden für den Pflanzenschutz, insbesondere von Herbiziden, Fungiziden, Nematiziden, Akariziden, Insektiziden sowie Wirkstoffen, die das Pflanzenwachstum regulieren. Der Begriff Pestizid bezeichnet hier mindestens einen Wirkstoff ausgewählt aus der Gruppe der Fungizide, Insektizide, Nematizide, Herbizide, Akarizide und/oder Safener oder Wachstumsregulatoren. Auch Mischungen von Pestiziden aus einer, zwei oder mehr der vorgenannten Klassen können verwendet werden. Der Fachmann ist vertraut mit solchen Pestiziden, die beispielsweise in Pesticide Manual, 13th Ed. (2003), The British Crop Protection Council, London, gefunden werden können.
Beispiele für fungizide Wirkstoffe, die als erfindungsgemäße Wirkstoffzusammensetzung formuliert werden können, umfassen:
• Acylalanine wie Benalaxyl, Metalaxyl, Ofurace, Oxadixyl; • Aminderivate wie Aldimorph, Dodine, Dodemorph, Fenpropimorph, Fenpropidin, Guazatine, Iminoctadine, Spiroxamin, Tridemorph;
• Anilinopyrimidine wie Pyrimethanil, Mepanipyrim oder Cyrodinyl;
• Antibiotika wie Cycloheximid, Griseofulvin, Kasugamycin, Natamycin, Polyoxin und Streptomycin; • Azole wie Bitertanol, Bromoconazol, Cyproconazole, Difenoconazol,
Dinitroconazol, Epoxiconazol, Fenbuconazol, Fluquiconazol, Flusilazol, Flutriafol, Hexaconazol, Imazalil, Ipconazol, Metconazol, Myclobutanil, Penconazol, Propiconazol, Prochloraz, Prothioconazol, Tebuconazol, Tetraconazol, Triadimefon, Triadimenol, Triflumizol, Triticonazol; • 2-Methoxybenzophenone, wie sie in EP-A 897904 durch die allgemeine Formel I beschrieben werden, z.B. Metrafenon;
• Dicarboximide wie Iprodion, Myclozolin, Procymidon, Vinclozolin; • Dithiocarbamate wie Ferbam, Nabam, Maneb, Mancozeb, Metam, Metiram, Propineb, Polycarbamat, Thiram, Ziram, Zineb;
• Heterocyclische Verbindungen wie Anilazine, Benomyl, Boscalid, Carbendazim, Carboxin, Oxycarboxin, Cyazofamid, Dazomet, Dithianon, Famoxadon, Fenamidon, Fenarimol, Fuberidazole, Flutolanil, Furametpyr, Isoprothiolane, Mepronil, Nuarimol, Picobezamid, Probenazole, Proquinazid, Pyrifenox, Pyroquilon, Quinoxyfen, Silthiofam; Thiabendazole, Thifluzamid, Thiophanat-methyl, Tiadinil, Tricyclazole, Triforine;
• Nitrophenylderivative wie Binapacryl, Dinocap, Dinobuton, Nitrophthal- isopropyl;
• Phenylpyrrole wie Fenpiclonil sowie Fludioxonil;
• nicht klassifizierte Fungizide wie Acibenzolar-S-methyl, Benthiavalicarb, Carpropamid, Chlorothalonil, Cyflufenamid, Cymoxanil, Diclomezin, Diclocymet, Diethofencarb, Edifenphos, Ethaboxam, Fenhexamid, Fentin-Acetat, Fenoxanil, Ferimzone, Fluazinam, Fosetyl, Fosetyl-Aluminum, Iprovalicarb, Hexachlorobenzol, Metrafenon, Pencycuron, Propamocarb, Phthalide, Toloclofos-Methyl, Quintozene, Zoxamid;
• Strobilurine wie sie in WO 03/075663 durch die allgemeine Formel I beschrieben werden, beispielsweise Azoxystrobin, Dimoxystrobin, Fluoxastrobin, Kresoxim- methyl, Metominostrobin, Orysastrobin, Picoxystrobin, Pyraclostrobin sowie Trifloxystrobin;
• Sulfensäure-Derivative wie Captafol, Captan, Dichlofluanid, Folpet, Tolylfluanid;
• Zimtsäureamide und Analoga wie Dimethomorph, Flumetover, Flumorp;
• 6-Aryl-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pyrimidine wie sie z.B. in WO 98/46608, WO 99/41255 oder WO 03/004465 jeweils durch die allgemeine Formel I beschrieben werden (Seite 1, Zeile 8 bis Seite 11, Zeile 45, sowie Verbindungen dargestellt in Formel IA in Verbindung mit Tabellen 1 bis 44 und Tabelle A der WO 03/00465); • Amidfungizide wie Cyclofenamid sowie (Z)-N-[α-(Cyclopropylmethoxyimino)- 2,3-difluoro-6-(difluoromethoxy)benzyl]-2-phenylacetamid.
Beispiele für Herbizide, die als erfindungsgemäße Wirkstoffzusammensetzung formuliert werden können, umfassen:
1,3,4-Thiadiazole wie Buthidazole und Cyprazole;
• Amide wie Allidochlor, Benzoylpropethyl, Bromobutide, Chlorthiamid, Dimepiperate, Dimethenamid, Diphenamid, Etobenzanid, Flampropmethyl, Fosamin, Isoxaben, Metazachlor, Alachlor, Acetochlor, Metolachlor, Monalide, Naptalame, Pronamid, Propanil;
• Aminophosphorsäuren wie Bilanafos, Buminafos, Glufosinateammonium, Glyphosate, Sulfosate;
• Aminotriazole wie Amitrol;
• Anilide wie Anilofos, Mefenacet; • Aryloxyalkan-säure wie 2,4-D, 2,4-DB, Clomeprop, Dichlorprop, Dichlorprop-P, Dichlorprop-P, Fenoprop, Fluroxypyr, MCPA, MCPB, Mecoprop, Mecoprop-P, Napropamide, Napro-panilide, Triclopyr;
• Benzoesäuren wie Chloramben, Dicamba;
• Benzothiadiazinone wie Bentazon; • Bleacher wie Clomazone, Diflufenican, Fluorochloridone, Flupoxam, Fluridone, Pyrazolate, Sulcotrione;
• Carbamate wie Carbetamid, Chlorbufam, Chlorpro-pham, Desmedipham, Phenmedipham, Vernolate;
• Chinolinsäuren wie Quinclorac, Quinmerac; • Dichlorpropionsäuren wie Dalapon; • Dihydrobenzofurane wie Ethofumesate;
• Dihydrofuran-3-one wie Flurtamone;
• Dinitroaniline wie Benefϊn, Butralin, Dinitramin, Ethalfluralin, Fluchloralin, Isopropalin, Nitralin, Oryzalin, Pendimethalin, Prodiamine, Profluralin, Trifluralin, Dinitrophenole wie Bromofenoxim, Dinoseb, Dinoseb-acetat, Dinoterb, DNOC, Minoterb-Acetat;
• Diphenylether wie Acifluorfen-sodium, Aclonifen, Bifenox, Chlornitrofen, Difenoxuron, Ethoxyfen, Fluorodifen, Fluoroglycofen-ethyl, Fomesafen, Furyloxyfen, Lactofen, Nitrofen, Nitrofluorfen, Oxyfluorfen; • Dipyridyle wie Cyperquat, Difenzoquat-methylsulfat, Diquat, Paraquat-dichlorid;
• Imidazole wie Isocarbamid;
• Imidazolinone wie Imazamethapyr, Imazapyr, Imazaquin, Imazethabenz-methyl, Imazethapyr, Imazapic, Imazamox;
• Oxadiazole wie Methazole, Oxadiargyl, Oxadiazon; • Oxirane wie Tridiphane;
• Phenole wie Bromoxynil, Ioxynil;
• Phenoxyphenoxypropionsäureester wie Clodinafop, Cyhalofop-butyl, Diclofop- methyl, Fenoxaprop-ethyl, Fenoxaprop-p-ethyl, Fenthiapropethyl, Fluazifop-butyl, Fluazifop-p-butyl, Haloxyfop-ethoxy-ethyl, Haloxyfop-methyl, Haloxyfop-p-methyl, Isoxapyrifop, Propaquizafop, Quizalofop-ethyl, Quizalofop-p-ethyl, Quizalofop- tefuryl;
• Phenylessigsäuren wie Chlorfenac;
• Phenylpropionsäuren wie Chlorophenprop-methyl;
• ppi- Wirkstoffe wie Benzofenap, Cinidon-Ethyl, Flumiclorac-pentyl, Flumioxazin, Flumipropyn, Flupropacil, Pyrazoxyfen, Sulfentrazone, Thidiazimin;
• Pyrazole wie Nipyraclofen; • Pyridazine wie Chloridazon, Maleic hydrazide, Norflurazon, Pyridate;
• Pyridincarbonsäuren wie Clopyralid, Dithiopyr, Picloram, Thiazopyr;
• Pyrimidylether wie Pyrithiobacsäure, Pyrithiobac-sodium, KIH-2023, KIH-6127;
• Sulfonamide wie Flumetsulam, Metosulam; • Triazolcarboxamide wie Triazofenamid;
• Uracile wie Bromacil, Lenacil, Terbacil;
• ferner Benazolin, Benfuresate, Bensulide, Benzofluor, Bentazon, Butamifos, Cafenstrole, Chlorthal-dimethyl, Cinmethylin, Dichlobenil, Endothall, Fluorbentranil, Mefluidide, Perfluidone, Piperophos, Topramezone und Prohexandion-Calcium;
• Sulfonylharnstoffe wie Amidosulfuron, Azimsulfuron, Bensulfuron-methyl, Chlorimuron-ethyl, Chlorsulfuron, Cinosulfuron, Cyclosulfamuron, Ethametsulfuron-methyl, Flazasulfuron, Halosulfuron-methyl, Imazosulfuron, Metsulfuron-methyl, Nicosulfuron, Primisulfuron, Prosulfuron, Pyrazosulfuron- ethyl, Rimsulfuron, Sulfometuron-methyl, Thifensulfuron-methyl, Triasulfuron, Tribenuron-methyl, Triflusulfuron-methyl, Tritosulfuron;
• Pflanzenschutz- Wirkstoffe vom Cyclohexenon-Typ wie Alloxydim, Clethodim, Cloproxydim, Cycloxydim, Sethoxydim und Tralkoxydim. Ganz besonders bevorzugte herbizide Wirkstoffe vom Cyclohexenon-Typ sind: Tepraloxydim (vgl. AGROW, Nr. 243, 3.11.95, Seite 21, Caloxydim) und 2-(l-[2-{4-
Chlorphenoxy } propyl-oxyimino]butyl)-3 -hydroxy-5 -(2H-tetrahydrothiopyran-3 -yl)- 2-cyclohexen-l-on und vom Sulfonylharnstoff-Typ: N-(((4-methoxy-6- [trifluormethyl]-l,3,5-triazin-2-yl)amino)carbo-nyl)-2-(trifluormethyl)- benzolsulfonamid.
Beispiele für Insektizide, die als erfmdungsgemäße Wirkstoffzusammensetzung formuliert werden können, umfassen: • Organophosphate wie Acephate, Azinphos-methyl, Chlorpyrifos, Chlorfenvinphos, Diazinon, Dichlorvos, dimethylvinphos, dioxabenzofos, Dicrotophos, Dimethoate, Disulfoton, Ethion, EPN, Fenitrothion, Fenthion, Isoxathion, Malathion, Methamidophos, Methidathion, Methyl-Parathion, Mevinphos, Monocrotophos, Oxydemeton-methyl, Paraoxon, Parathion, Phenthoate, Phosalone, Phosmet, Phosphamidon, Phorate, Phoxim, Pirimiphos-methyl, Profenofos, Prothiofos, Primiphos-ethyl, Pyraclofos, Pyridaphenthion, Sulprophos, Triazophos, Trichlorfon; Tetrachlorvinphos, Vamidothion
• Carbamate wie Alanycarb, Benfuracarb, Bendiocarb, Carbaryl, carbofuran, Carbosulfan, Fenoxycarb, Furathiocarb, Indoxacarb, Methiocarb, Methomyl,
Oxamyl, Pirimicarb, Propoxur, Thiodicarb, Triazamate;
• Pyrethroide wie Bifenthrin, Cyfluthrin, Cycloprothrin, Cypermethrin, Deltamethrin, Esfenvalerate, Ethofenprox, Fenpropathrin, Fenvalerate, Cyhalothrin, Lambda-Cyhalothrin, Permethrin, Silafluofen, Tau-Fluvalinate, Tefluthrin, Tralomethrin, alpha-Cypermethrin, Zeta-Cypermethrin, Permethrin;
• Arthropode Wachstumsregulatoren: a) Chitinsyntheseinhibitoren z.B. Benzoylharnstoffe wie Chlorfluazuron, Diflubenzuron, Flucycloxuron, Flufenoxuron, Hexaflumuron, Lufenuron, Novaluron, Teflubenzuron, Triflumuron; Buprofezin, Diofenolan, Hexythiazox, Etoxazole, Clofentazine; b) Ecdysone Antagonisten wie Halofenozide, Methoxyfenozide, Tebufenozide; c) Juvenoide wie Pyriproxyfen, Methoprene, Fenoxycarb; d) Lipid-Biosyntheseinhibitoren wie Spirodiclofen;
• Neonicotinoide wie Flonicamid, Clothianidin, Dinotefuran, Imidacloprid, Thiamethoxam, Nitenpyram, Nithiazin, Acetamiprid, Thiacloprid; • Weitere unklassifϊzierte Insektizide wie Abamectin, Acequinocyl, acetamiprid, Amitraz, Azadirachtin, Bensultap Bifenazate, Cartap, Chlorfenapyr, Chlordimeform, Cyromazine, Diafenthiuron, Dinetofuran, Diofenolan, Emamectin, Endosulfan, Ethiprole, Fenazaquin, Fipronil, Formetanate, Formetanate hydrochlorid, gamma- HCH Hydramethylnon, Imidacloprid, Indoxacarb, Isoprocarb, Metolcarb, Pyridaben, Pymetrozine, Spinosad, Tebufenpyrad, Thiamethoxam, Thiocyclam, XMC und Xylylcarb;
• N-Phenylsemicarbazone, wie sie in EP-A 462 456 durch die allgemeine Formel I beschrieben werden, insbesondere Verbindungen der allgemeinen Formel IV
worin R11 und R12 unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, CN, C1-C4- Alkyl, Cl-C4-Alkoxy, Cl-C4-Haloalkyl oder Cl-C4-Haloalkoxy stehen und R13 für Cl-C4-Alkoxy, Cl-C4-Haloalkyl oder Cl-C4-Haloalkoxy steht, z.B. Verbindung IV, worin R1 ! für 3-CF3 und R12 für 4-CN stehen und R13 4-OCF3 bedeutet.
Brauchbare Wachstumsregulatoren sind z.B. Chlormequat-chlorid, Mepiquatchlorid, Prohexadion-Calcium oder die Gruppe der Gibberelline. Dazu gehören z.B. die Gibberelline GAl, GA3, GA4, GA5 und GA7 etc. und die entsprechenden exo- 16,17-Dihydrogibberelline sowie die Derivate davon, z.B. die Ester mit C1-C4- Carbonsäuren. Erfmdungsgemäß bevorzugt ist das exo-16,17-Dihydro-GA5-13- acetat.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die erfmdungsgemäße Verwendung von Hydrophobin zur Herstellung wässriger Wirkstoffzusammen- Setzungen von Fungiziden, insbesondere Strobilurinen, Azolen und 6-
Aryltriazolo[l,5a]pyrimidinen, wie sie z.B. in WO 98/46608, WO 99/41255 oder WO 03/004465 jeweils durch die allgemeine Formel I beschrieben werden (Seite 1, Zeile 8 bis Seite 11, Zeile 45, sowie Verbindungen dargestellt in Formel IA in Verbindung mit Tabellen 1 bis 44 und Tabelle A der WO 03/00465), insbesondere von Wirkstoffen der allgemeinen Formel V,
worin: Rx für eine Gruppe NR14R15 steht, oder lineares oder verzweigtes Cl-C8-Alkyl, das gegebenenfalls durch Halogen, OH, Cl-C4-Alkoxy, Phenyl oder C3-C6-Cycloalkyl substiuiert ist, C2-C6-Alkenyl, C3-C6-Cycloalkyl, C3-C6-Cycloalkenyl, Phenyl oder Naphthyl, wobei die vier zuletzt genannten Reste 1, 2, 3 oder 4 Substituenten ausgewählt unter Halogen, OH, Cl-C4-Alkyl, Cl-C4-Halogenalkoxy, C1-C4- Alkoxy und C 1 -C4-Halogenalkyl aufweisen können;
R14, R15 unabhängig voneinander für Wasserstoff, Cl-C8-Alkyl, C1-C8- Halogenalkyl, C3-C10-Cycloalkyl, C3-C6-Halogencycloalkyl, C2-C8-Alkenyl, C4- C10-Alkadienyl, C2-C8-Halogenalkenyl, C3-C6-Cycloalkenyl, C2-C8- Halogencycloalkenyl, C2-C8-Alkinyl, C2-C8-Halogenalkinyl oder C3-C6- Cycloalkinyl,
R14 und R15 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, fünf- bis achtgliedriges Heterocyclyl, welches über N gebunden ist und ein, zwei oder drei weitere Heteroatome aus der Gruppe O, N und S als Ringglied enthalten und/oder einen oder mehrere Substituenten aus der Gruppe Halogen, Cl-C6-Alkyl, C1-C6- Halogenalkyl, C2-C6-Alkenyl, C2-C6-Halogenalkenyl, C 1 -C6-Alkoxy, C 1 -C6- Halogenalkoxy, C3-C6-Alkenyloxy, C3-C6-Halogenalkenyloxy, (exo)-Cl-C6- Alkylen und Oxy-Cl-C3-alkylenoxy tragen kann; L ausgewählt ist unter Halogen, Cyano, Cl-C6-Alkyl, Cl-C4-Halgoenalkyl, C1-C6- Alkoxy, Cl-C4-Halgoenalkoxy und Cl-C6-Alkoxycarbonyl;
L1 Halogen, Cl-C6-Alkyl oder Cl-C6-Halogenalkyl und insbesondere Fluor oder Chlor bedeutet; X für Halogen, C 1 -C4-Alkyl, Cyano, C 1 -C4-Alkoxy oder C 1 -C4-Halogenalkyl und vorzugsweise für Halogen oder Methyl steht und insbesondere Chlor bedeutet.
Beispiele für Verbindungen der Formel V sind
5-Chlor-7-(4-methylpiperidin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin, 5-Chlor-7-(4-methylpiperazin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)- [1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin, 5-Chlor-7-(morpholin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-
[l,2,4]triazolo[l,5-a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(piperidin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(morpholin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[l ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(isopropylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin, 5-Chlor-7-(cyclopentylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin,
5-Chlor-7-(2,2,2-trifluorethylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin,
5-Chlor-7-( 1,1,1 -trifluorpropan-2-ylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)- [l,2,4]triazolo[l,5-a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(3,3-dimethylbutan-2-ylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-
[l,2,4]triazolo[l,5-a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(cyclohexylmethyl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin, 5-Chlor-7-(cyclohexyl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(2-methylbutan-3-yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(3-methylpropan- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin, 5-Chlor-7-(4-methylcyclohexan- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)- [ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(hexan-3-yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(2-methylbutan- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin, 5-Chlor-7-(3-methylbutan- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- a]pyrimidin,
5-Chlor-7-(l -methylpropan- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin, 5-Methyl-7-(4-methylpiperidin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-
[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin, 5-Methyl-7-(4-methylpiperazin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin,
5-Methyl-7-(morpholin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin,
5-Methyl-7-(piperidin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin, 5-Methyl-7-(morpholin- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- a]pyrimidin,
5-Methyl-7-(isopropylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- a]pyrimidin,
5-Methyl-7-(cyclopentylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin,
5-Methyl-7-(2,2,2-trifluorethylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin,
5-Methyl-7-(l , 1 , 1 -trifluorpropan-2-ylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-
[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin, 5-Methyl-7-(3,3-dimethylbutan-2-ylamino)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-
[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin,
5-Methyl-7-(cyclohexylmethyl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin,
5-Methyl-7-(cyclohexyl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin, 5-Methyl-7-(2-methylbutan-3-yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[l,2,4]triazolo[l,5- a]pyrimidin, 5-Methyl-7-(3-methylpropan- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)- [l,2,4]triazolo[l,5-a]pyrimidin, 5-Methyl-7-(4-methylcyclohexan-l-yl)-6-(2,4,6- trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin,
5-Methyl-7-(hexan-3-yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin, 5-Methyl-7-(2-methylbutan- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5- ajpyrimidin, 5-Methyl-7-(3-methylbutan- 1 -yl)-6-(2,4,6-trifluorphenyl)- [ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin und 5-Methyl-7-(l -methylpropan- 1 -yl)-6-(2,4,6- trifluorphenyl)-[ 1 ,2,4]triazolo[ 1 ,5-a]pyrimidin.
Einzelne Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele im Detail beschrieben. Diese Beispiele dienen lediglich der Illustration der Erfindung und dürfen nicht als Einschränkung des Gegenstands der Erfindung ausgelegt werden.
BEISPIELE
Soweit nicht anderweitig angegeben, waren alle verwendeten Reagenzien von der höchstmöglichen kommerziell erhältlichen Reinheit und wurden alle kommerziell erhältlichen Reagenzien, Geräte, Antikörper und Kits nach Herstellervorschrift verwendet.
Die in den Beispielen verwendeten Hydrophobine wurden gemäß der Beispiele aus Teil A der WO 2007/014897 hergestellt.
Die Sequenz des in den Beispielen verwendeten "Hydrophobin A" ist in der WO 2007/014897 unter SEQ ID NO: 19 und 20 (Abbildungen 11 und 12 dieser Anmeldung) angegeben. Bei diesem "Hydrophobin A" handelt es sich um das Hydrophobin dewA, das mit dem Protein yaad fusioniert wurde. Des Weiteren enthält das Konstrukt noch eine Xa- Schnittstelle und einen His-tag (yaad-Xa-dewA- his). Die Sequenz des in den Beispielen verwendeten "Hydrophobin B" ist in der WO 2007/014897 unter SEQ ID NO:25 und 26 (Abbildungen 13 und 14 dieser Anmeldung) angegeben. Bei diesem "Hydrophobin B" handelt es sich um das Hydrophobin dewA, das mit dem einem verkürztem Protein yaad fusioniert wurde. Des Weiteren enthält das Konstrukt noch eine Xa- Schnittstelle und einen His-tag (yaad40-Xa-dewA-his).
Beispiel 1: Bindung an Haut 1 (qualitativ)
Es wurde ein visueller qualitativer Test entwickelt, um zu überprüfen, ob Hydrophobin an Haut bindet.
Verwendete Lösungen:
Blockierungslsg: DIG Wash+Bufferset 1585762 Boehringer MA (lOxLsg) in TBS verdünnt
TBS: 2OmM Tris; 15OmM NaCl pH 7,5
TTBS: TBS + 0,05% Tween20
Der erste Schritt ist der Transfer der äußeren Keratinschicht von der Haut auf einen stabilen Träger. Dazu wurde ein Klarsichtklebestreifen fest auf enthaarte menschliche Haut aufgebracht und wieder entfernt. Der Test kann direkt auf dem
Klarsichtklebestreifen durchgeführt werden oder die anhaftende Keratinschicht durch erneutes Aufkleben auf einen Glasobjektträger überführt werden. Der Nachweis von
Bindung wurde wie folgt vorgenommen: zur Inkubation mit den verschiedenen Reagenzien Transfer in ein Falcongefäß ggf. Zugabe von Ethanol zur Entfettung, Entfernung von Ethanol und Trocknung der Objektträger Ih bei Raumtemperatur inkubiert mit Blocking Puffer
2x 5 min gewaschen mit TTBS
Ix 5 min gewaschen mit TBS
Inkubation mit dem zu testenden Hydrophobin (gekoppelt an tag - z.B. His6, HA etc.) bzw. Kontrollprotein in TBS / 0,05% Tween 20 während 2-
4 h bei Raumtemperatur
Entfernung des Überstands
3x Waschen mit TBS
Ih bei Raumtemperatur Inkubation mit Monoclonal Anti-poly-Histidin Antikörper, verdünnt 1 :2000 in TBS + 0,01% Blocking
2x 5min gewaschen mit TTBS
Ix 5 min gewaschen mit TBS
Ih bei Raumtemperatur Inkubation mit Anti-Mouse IgG Alkalische-
Phosphatase-Conjugate, verdünnt 1:5000 in TBS + 0,01 % Blocking - 2x 5 min gewaschen mit TTBS
1x 5 min gewaschen mit TBS
Zugabe von Phosphatasesubstrat (NBT-BCIP; Boehringer MA lTablette/40 ml Wasser 2,5 min; Stopp: mit Wasser)
Optische Detektion des Farbniederschlages mit bloßem Auge oder im Mikroskop. Ein blauer Farbniederschlag zeigt an, dass Hydrophobin an die Haut gebunden hat.
Die Bindung an Nägel kann analog ermittelt werden, indem die zu untersuchenden Hydrophobine direkt mit der Nageloberfläche inkubiert und entsprechend vermessen werden.
Beispiel 2: Bindung an Haut 2 (quantitativ)
Es wurde ein quantitativer Test entwickelt, mit dem sich die Haut-Bindungsstärke des Hydrophobins mit unspezifischen Proteinen vergleichen lässt (Abb. 2). Aus einem aufgetauten trockenem Stück Haut ohne Haare (human oder Schwein), wurde mit einem 5 mm Korkbohrer ein Stück herausgebohrt (bzw. bei einem Oberflächentest ein Stück Haut in ein Falcondeckel eingepasst). Die Hautprobe wurde dann auf eine Dicke von 2-3 mm gebracht um evt. vorhandenes Gewebe zu entfernen. Die Hautprobe wurde anschließend in ein Eppendorfgefäß (Protein- Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen (siehe auch Abbildung 2):
2x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20 - Zugabe von 1 ml 1% BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei
Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen (900 rpm).
Entfernung des Überstands
Zugabe von 100 μg Hydrophobin in PBS+0,05 % Tween 20; Inkubation 2 h bei Raumtemperatur und leichten Schwenkbewegungen (900 rpm). - Entfernung des Überstands
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Inkubation mit 1 ml monoklonalem Maus anti-tag-Hisβ bzw. HA- spezifischem Antikörper mit Peroxidase Conjugate (1:2000 in PBS /
0,05% Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei
Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung (900 rpm)
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Zugabe von Peroxidasesubstrat (ImI / Eppendorfgefäß;
Zusammensetzung s.u.) - Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 1:30 Minuten).
Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen.
Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.
Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzen): 0,l ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig
Eine Steigerung der Absorption gegenüber einer Probe ohne Hydrophobin zeigt an, dass Hydrophobin an die Haut gebunden hat. Hintergrund siehe Bsp.3.
Analog kann auch die Bindung an Schleimhaut gemessen werden, indem man von Schleimhaut (beispielsweise menschlicher Mundschleimhaut) mittels eines Klarsichtklebestreifens eine Probe entnimmt, die anschließend auf Bindungswirkung untersucht werden kann.
Beispiel 3: Bindung an Haar (quantitativ)
Um die Bindungsstärke des Hydrophobins an Haar auch im Vergleich zu anderen Proteinen nachweisen zu können, wurde ein quantitativer Assay entwickelt (Abb. 2 in WO 2006/136607). Bei diesem Test wurde zunächst Haar mit Hydrophobin inkubiert und überschüssiges Hydrophobin abgewaschen. Anschließend wurde eine Antikörper-Peroxidase-Konjugat über das His-Tag des Hydrophobins gekoppelt. Nicht gebundenes Antikörper-Peroxidase-Konjugat wurde erneut abgewaschen. Das gebundene Antikörper-Peroxidase-Konjugat [Monoclonal AntipolyHistidin
Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] kann ein farbloses Substrat (TMB) in ein farbiges Produkt umsetzen, das photometrisch bei 405 nm vermessen wird. Die Stärke der Absorption zeigt die Menge an gebundenem Hydrophobin bzw. Vergleichsprotein an. Als Vergleichsprotein wurde z.B. yaad aus B. subtilis gewählt, das ebenfalls - wie es für diesen Test nötig ist - ein His-Tag zur Detektion aufwies. Anstatt des His-Tag können auch andere, spezifische Antikörper konjugiert mit Peroxidase verwendet werden. 5 mg Haare (human) werden in 5 mm lange Stücke geschnitten und in Eppendorfgefäße (Protein-Lowbind) überführt, um den Bindungsnachweis durchzuführen:
Zugabe von 1 ml Ethanol zur Entfettung - Zentrifugation, Entfernung von Ethanol und Waschung der Haare mit
H2O
Zugabe von 1 ml 1% BSA in PBS und Inkubation während 1 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegungen. Zentrifugation, Entfernung des Überstands - Zugabe des zu testenden Hydrophobins (gekoppelt an tag - z.B. HiS6, HA etc.) bzw. Kontrollprotein in 1 ml PBS / 0,05 % Tween 20; Inkubation für 16 h bei 4° C (oder mindestens 2 h bei Raumtemperatur) bei leichten Schwenkbewegungen. Zentrifugation, Entfernung des Überstands - 3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20
Inkubation mit 1 ml monoklonalen Maus anti-tag-(His6 bzw. HA)- Antikörper mit Peroxidase-Konjugat (1:2000 in PBS / 0,05 % Tween 20) [Monoclonal AntipolyHistidin Peroxidase Conjugate, produced in mouse, lyophilized powder, Firma Sigma] während 2-4 h bei Raumtemperatur, leichte Schwenkbewegung
3x Waschen mit PBS / 0,05 % Tween 20 Zugabe von Peroxidasesubstrat (1 ml / Eppendorfgefäß) Reaktion bis zur Blaufärbung laufen lassen (ca. 2 Minuten). Mit 100 μl 2 M H2SO4 die Reaktion abstoppen. - Die Absorption wird bei 405 nm gemessen
Peroxidasesubstrat (kurz vorher ansetzten):
0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) + 10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) + 14,7 μl H2O2 3%ig BSA = Bovine serum albumin
PBS = Phosphat gepufferte Salzlösung
Tween 20 = Polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n ca. 20
TMB = 3,5,3/5' Tetramethylbenzidin
Ein beispielhaft für Hydrophobin durchgeführter Bindungs-Test an Haar zeigte eine deutliche Überlegenheit der Bindung von Hydrophobin an Haar gegenüber einer wesentlichen schlechteren Bindung des Vergleichsproteins yaad:
Tabelle 1: Quantitativer Hydrophobin Aktivitäts-Test Haar: 1) Puffer; 2) Vergleichsprotein yaad; 3) Hydrophobin. Die Tabelle zeigt die gemessenen Absorptionswerte bei 405 nm.
Beispiel 4: Derivatisierung von Hydrophobin mit Farbstoff „Alexa" und Bindung an Haar
Eine Kopplung von Farbstoffen an Hydrophobine kann über die SH-Gruppen der Cysteine erfolgen. Vor Kopplung des Farbstoffes Alexa Fluor 532 werden die Disulfidbrücken des Hydrophobins gespalten: 1 mg Hydrophobin 0,5 ml Puffer (75 mM Tris pH 8,0 2,5 mM EDTA
1 mM DTT) Inkubation für 30 Minuten bei 37°C
Alexa Fluor 532
Die Kopplung des Farbstoffes erfolgt nach Herstellerangaben (Alexa 532 Protein Labeling Kit; Molecular Probes; MP-A- 10236).
Die Beschichtung von humanem Haar mit Alexa-gekoppeltem Hydrophobin wird wie folgt durchgeführt: 10 mg humanes Haar mit 50 μg/ml Alexa-Hydrophobin bzw. Kontrollprotein yaad bzw. ungekoppeltem Farbstoff Alexa 532 in Puffer TBS 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren 2x waschen mit TBS/0,05% Tween 20 - Ix waschen mit TBS
Ix waschen mit TBS/1% SDS
Detektion im Fluoreszenzmikroskop (Abb. 4 der WO 2006/136607)
Beispiel 5: Test zur Ermittlung des Spreitverhaltens
In diesem Test kann das Spreitverhalten anderer Substanzen im Vergleich zu Paraffinöl (dünnflüssig) als Referenzsubstanz beurteilt werden.
Eine Glasplatte (20 cm x 6,5 cm x 0,2 cm) wurde mit 2 Streifen Filterpapier (Typ: Pörringer 1243/90) mit einer Länge von ca. 17 cm und Breite von 1 cm bespannt. Als Abstandshalter zur Glasplatte wurden Holzstäbe mit einem Durchmesser von 0,2 cm benutzt. Hiermit sollte gewährleistet werden, dass die Messung nicht durch einen Kontakt des Filterpapiers mit der Glasplatte beeinflusst wird.
Mittels einer Pipette (Direktverdrängung) wurde 50 μl Testsubstanz (z.B. die
Referenz Substanz Paraffinöl oder die Testsubstanzen Luvitol oder Dimethicone, alle in Reinform) mittig auf den Filterpapierstreifen aufgebracht. Nach 5 Minuten wurde die Länge der Ausbreitungsstrecke der Testsubstanz auf dem Filterpapier ausgehend vom Auftragungspunkt ausgemessen.
Referenzbeispiele
Ergebnis der Längenmessung vom Ausgangspunkt [mm]: Paraffinöl (dünnflüssig) 36
Luvitol Lite (INCI: hydrogenated polyisobutene) 64
Dimethicone 22
Wenn man Paraffinöl (dünnflüssig) als Referenzsubstanz und als Wert 1 nimmt, ergeben sich folgende relative Spreitwerte:
Luvitol Lite: 1,78 Dimethicone: 0,61
Werte über 1 entsprechen einem besseren und unter 1 einem schlechteren Spreitverhalten als Paraffinöl (dünnflüssig).
Anwendungsbeispiele mit Hydrophobin
Um eine verbesserte Spreitwirkung durch Hydrophobin zu testen, werden die
Papierstreifen über Nacht in einer wässrigen 0,1% (w/v) Hydrophobin B-Lösung bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend getrocknet. Auf diesen behandelten Streifen wird dann das Spreitverhalten von Paraffin (dünnflüssig) beurteilt in Bezug auf unbehandeltes Filterpapier.
Bei Durchführung dieses Tests zeigte sich, dass Hydrophobin die Laufweiten der oben angegebenen Testsubstanzen um bis zu 10% erhöhte, also deren Fließeigenschaften - das Spreitverhalten - verbessert. Eine vergleichbare Messung auf Schweinehaut liefert korrelierende Ergebnisse wie die Filterpapiermethode.
Anstatt die Testoberfläche mit Hydrophobin zu behandeln, kann auch 0,1% Hydrophobin (Endkonzentration) als Komponente in die Testsubstanz gegeben und emulgiert werden. Auch dann zeigen sich verlängerte Laufstrecken der Testsubstanzen auf den beschriebenen Oberflächen.

Claims

ANSPRUCHE
1. Verwendung von Hydrophobin als Spreitmittel in einer Zusammensetzung zur Behandlung von Oberflächen.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Hydrophobin ein Hydrophobin der Strukturformel (I) ist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung eine Ölkörperkonzentration von 0 bis 20 Gew.% aufweist.
4. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung ist.
5. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Oberfläche eine menschliche oder tierische Körperoberfläche ist.
6. Verwendung gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die Oberfläche Haut ist.
7. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung ein Pflanzenschutzmittel ist.
8. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1, 2, 3 oder 6, wobei die Oberfläche eine Oberfläche aus pflanzlichem Material ist.
9. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die Oberfläche eine Pflanzenoberfläche ist.
10. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die Oberfläche Cellulose-haltig und bevorzugt Papier ist.
11. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zusammensetzung Hydrophobin in einer Konzentration von 0,001 bis 10 Gew.% enthält.
12. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Hydrophobin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydrophobinen des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl und basf2, und bevorzugt ein Hydrophobin des Typs dewA, hypA oder hypB ist.
13. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Hydrophobin Bestandteil eines Fusionsproteins ist, und wobei ein Fusionspartner bevorzugt yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2007/014897) oder ein verkürztes yaad ist.
14. Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Hydrophobin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO:20 in WO 2006/082251), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO:22 in
WO 2006/082251), yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO:24 in WO 2006/082251) und aus durch Verkürzung des yaad- Fusionspartners
(SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251) abgeleiteten Hydrophobinen, insbesondere yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO:26 in WO 2007/014897).
15. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, wobei zusätzlich mindestens ein Wirkstoff auf die behandelte Oberfläche aufgetragen wird, dessen Aufnahme in die Oberfläche und/oder dessen Wirkung auf die Oberfläche durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird.
16. Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei der Wirkstoff ein
Pflanzenschutz- Wirkstoff oder ein kosmetisch oder pharmazeutisch aktiver Wirkstoff ist.
17. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16, wobei auf die zu behandelnde Oberfläche zwei Mittel aufgetragen werden: zunächst ein Mittel enthaltend Hydrophobin, und anschließend ein weiteres Mittel zur Behandlung der Oberfläche.
18. Zusammensetzung zur Oberflächenbehandlung, welche mindestens ein
Hydrophobin wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 definiert enthält.
19. Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, welche nicht fettend ist.
20. Zusammensetzung gemäß Anspruch 18 oder 19, welche eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung ist.
21. Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, zusätzlich enthaltend mindestens einen kosmetisch oder pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoff, dessen
Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird.
22. Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, welche ein Pflanzenschutzmittel ist.
23. Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, zusätzlich enthaltend mindestens einen Pflanzenschutz- Wirkstoff, dessen Aufnahme und/oder Wirkung durch die Anwesenheit von Hydrophobin verbessert wird.
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