CN101175540B - 疏水蛋白作为相稳定剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及尤其适于稳定双相液体系统的疏水蛋白。
Description
本发明涉及疏水蛋白和/或其衍生物之一用于在包含至少两种液体相，特别是油和水的组合物中稳定相的用途。
疏水蛋白是约100到150个氨基酸的小蛋白质，其是丝状真菌，例如裂褶菌(Schizophyllum commune)特有的。它们通常具有8个半胱氨酸单位。
疏水蛋白都对界面具有显著的亲和力并且因此适于涂布表面，例如，以便通过形成两亲性膜改变界面的性质。例如，可以通过疏水蛋白涂布特氟隆以得到亲水表面。
可以从天然来源分离疏水蛋白。此外，疏水蛋白和它们的衍生物的生产方法是已知的。例如，德国专利申请DE 10 2005 007 480公开了疏水蛋白和其衍生物的生产方法。
现有技术已经提出了疏水蛋白对于多种应用的用途。
WO 96/41882提出使用疏水蛋白作为乳化剂、增稠剂、表面活性物质，用于使疏水表面亲水、提高亲水基质的防水性，产生水包油乳剂或者油包水乳剂。还提出了药学应用，如生产软膏剂或者乳膏，和美容应用，如护肤或者生产洗发剂或者染发液。WO 96/41882还描述了包含疏水蛋白的组合物，特别是用于药物应用的组合物。
EP-A 1 252 516公开了用包含疏水蛋白的溶液在30到80℃的温度下涂布窗户、隐形眼镜、生物传感器、医学装置、用于进行测试或者贮存的容器、船体、固体颗粒或者交通工具的框架或者底盘。
WO 03/53383描述了疏水蛋白在美容应用中用于处理角蛋白物质的用途。
WO 03/10331公开了疏水蛋白具有表面活性性质。例如，公开了疏水蛋白涂布的传感器，例如测试电极，其非共价结合其他物质，例如，电活性 物质、抗体或者酶。
WO 2004/000880给出了用疏水蛋白或者疏水蛋白样物质涂布表面。
WO 01/74864涉及疏水蛋白样蛋白质，也陈述它们可以用于稳定分散体和乳剂。
蛋白质用于相分离的用途原则上也是已知的。
例如，EP-A 05 016 962描述了使用蛋白质改进例如油/水或者燃料/水混合物的相分离。本领域技术人员公知取决于使用浓度和周围的介质，两亲性分子对相界面可以具有稳定或者去稳定作用。
GB 195,876公开了使用胶体破裂油包水乳剂的方法。提到的胶体是例如蛋白质如明胶、酪蛋白、白蛋白或者多糖，如阿拉伯胶或西黄蓍胶。
JP-A 11-169177描述了使用具有脂肪酶活性的蛋白质破裂乳剂的用途。
WO 01/60916描述了至少一种水溶性蛋白质、至少一种水溶性多糖和至少一种水溶性聚合物，例如，聚氧乙烯的无表面活性剂的混合物的用途，关于多种用途，也包括用于去乳化原油。
然而，所引用的文献没有一种公开了使用疏水蛋白防止再乳化的用途。
使用蛋白质具有普遍的优点，它们是天然存在的物质，可以生物降解，所以不导致环境的持久污染。
在许多工业规模的应用中，例如，在原油-水乳液的分离中，一个重要的因素是非常快速相分离，另一种因素是避免或者防止相的再乳化。本发明的一个目的是提供通过使用蛋白质稳定相的改进方法。
根据本发明，通过在包含至少两种液相，特别是油和水的组合物中使用至少一种疏水蛋白实现了该目的。
根据本发明，疏水蛋白原则上可以以任何量使用，条件是确保提高包含至少两种液相的组合物中的相稳定。
在本发明的上下文中，“相稳定的提高”理解为指对于向混合物中加入物质的情况，两种液相的再乳化比不加入该物质的相同混合物中进行的更慢，或者加入该物质防止两种液相的再乳化。
在本发明的上下文中，还将疏水蛋白理解为指其衍生物或者经修饰的疏 水蛋白。经修饰或衍生的疏水蛋白可以例如是疏水蛋白融合蛋白或者氨基酸序列与疏水蛋白的序列有至少60％，例如至少70％，尤其至少80％，更优选至少90％，特别优选至少95％同一性的蛋白质，并且其还在50％程度上，例如60％程度上，尤其70％程度上，更优选80％程度上满足疏水蛋白的生物学性质，特别是这样的性质：通过用这些蛋白质涂布改变表面性质使得用所述蛋白质涂布玻璃表面前后水滴的接触角增加至少20°，优选至少25°，尤其至少30°。
已经令人惊奇的发现相分离完成后，疏水蛋白或者其衍生物减小或者防止新形成乳液。当长期存在两相或者将防止新乳液的发生时，也是特别有利的。在该上下文中，即使少量的疏水蛋白也是非常有效的。
对于疏水蛋白的定义，其对于结构特异性是关键的并且对于疏水蛋白的序列特异性不是关键的。天然疏水蛋白的氢基酸序列非常多样化，但是它们都具有8个保守半胱氨酸残基的高度特征性模式。这些残基形成四个分子内二硫键。
N末端和C末端在相对宽范围内可变。这里可能通过本领域技术人员已知的分子生物学技术加到具有10到500个氨基酸长度的融合配偶体蛋白上。
此外，在本发明上下文中将疏水蛋白和其衍生物理解为指具有相似结构和功能等价性的蛋白质。
在本发明的上下文中，术语“疏水蛋白”将在下文中理解为指结构通式(I)的多肽
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)
其中X可以是20种天然存在的氨基酸(Phe，Leu，Ser，Tyr，Cys，Trp，Pro，His，Gln，Arg，Ile，Met，Thr，Asn，Lys，Val，Ala，Asp，Glu，Gly)的任一种。在该式中，X在每种情况下可以是相同或不同的。X旁的下标都是氨基酸数目，C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或者苏氨酸，其中用C表示的至少四个残基是半胱氨酸，并且下标n和m各自独 立地是0到500，优选15到300之间的自然数。
式(I)的多肽的特征还为这样的性质，在室温下，涂布玻璃表面后，在每种情况下与同等大小的水滴和未涂布的玻璃表面的接触角相比，它们引起水的接触角增加至少20°，优选至少25°，更优选30°。
用C1到C8表示的氨基酸优选为半胱氨酸；然而，它们还可以用具有相似空间填充的其他氨基酸替换，优选用丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或者甘氨酸替换。然而，C1到C8位的至少4个，优选至少5个，更优选至少6个，尤其至少7个位置应该由半胱氨酸组成。在本发明蛋白质中，半胱氨酸可以以还原的形式存在或者相互形成二硫桥。尤其优选分子内形成C-C桥，特别具有至少一个分子内二硫桥，优选2个，更优选3个，最优选4个分子内二硫桥。对于上述半胱氨酸用具有相似空间填充的氨基酸交换的情况，此类C位置有利地成对交换，其可以相互形成分子内二硫桥。
如果在称作X的位置中也使用半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或者苏氨酸，那么可以对应地改变通式中各个C位置的编号。
优选使用通式(II)的疏水蛋白
Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)
进行本发明，其中当X，C和X和C旁的下标每个如上定义时，下标n和m每个是0到300之间的数字，并且该蛋白质额外特征是上述接触角的改变，和此外至少6个用C表示的残基是半胱氨酸。更优选地，所有C残基是半胱氨酸。
尤其优选使用通式(IIl)的疏水蛋白
Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm(III)
其中当X，C和X旁的下标每个如上定义时，下标n和m每个是0到200之间的数字，并且该蛋白质额外特征是上述接触角的改变，和至少6个用C表示的残基是半胱氨酸。更优选地，所有C残基是半胱氨酸。
Xn和Xm残基可以是天然地也结合到疏水蛋白的肽序列。然而，一个或两个残基也可以是天然不结合疏水蛋白的肽序列。这理解为指那些Xn和/ 或Xm残基，其中在疏水蛋白中天然存在的肽序列通过在疏水蛋白中天然不存在的肽序列加长。
如果Xn和/或Xm是天然不结合到疏水蛋白的肽序列，那么此类序列长为通常至少20个，优选至少35个，更优选至少50个，最优选至少100个氨基酸。此类不天然结合到疏水蛋白的残基在下文中也称作融合配偶体。这意在表达蛋白质可以由至少一个疏水蛋白部分和在自然中不以该形式一起发生的融合配偶体部分组成。
融合配偶体部分可以选自多种蛋白质。还可能的是多个融合配偶体将结合到一个疏水部分，例如，在疏水蛋白部分上的氨基末端(Xn)和羧基末端(Xm)。然而，还可能例如两个融合配偶体将结合到本发明蛋白质的一个位置(Xn或Xm)。
尤其适宜的融合配偶体是在微生物，特别在大肠杆菌(E.coli)或者枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中天然存在的蛋白质。此类融合配偶体的实例是序列yaad(SEQ ID NO：15和16)、yaae(SEQ ID NO：17和18)，和硫氧还蛋白。还非常适宜的是这些序列的片段或衍生物，其包含所提到序列的仅仅一些，例如，70到99％，优选5到50％，更优选10到40％，或者其中与所提到的序列相比个别氨基酸或者核苷酸已经改变，在该情况中百分数各自是基于氨基酸数目。
在进一步优选的实施方案中，融合疏水蛋白，以及作为Xn和Xm基团的融合配偶体，也具有所称作的亲和结构域(亲和标记/亲和尾)。以原理上已知的方式，这包含锚定基团，其可以与特定互补基团相互作用并且可以用于蛋白质的更容易的操作和纯化。此类亲和结构域的实例包含(His)k、(Arg)k、(Asp)k、(Phe)k或(Cys)k基团，其中k通常是从1到10的自然数。它可以优选是(His)k基团，其中k为4到6。
根据本发明用作疏水蛋白或者其衍生物的蛋白质还可以在它们的多肽序列中修饰，例如，通过糖基化、乙酰化或者通过化学交联，例如，用戊二醛化学交联。
根据本发明使用的疏水蛋白或者其衍生物的一个性质是当用该蛋白质 涂布表面时，表面性质改变。可以通过实验确定表面性质的改变，例如，通过测量用蛋白质涂布表面之前和之后水滴的接触角，并确定这两次测量的差异。
接触角测量的进行原则上是本领域技术人员已知的。测量是基于室温和5μl水滴和使用玻璃板作为基质。在实验部分给出了测量接触角的合适方法的实例的确切的实验条件。在所提到的条件下，在每种情况下与相等大小的水滴和未涂布的玻璃表面的接触角相比较，根据本发明使用的融合蛋白具有增加接触角至少20°，优选至少25°，更优选至少30°的性质。
用于进行本发明的尤其优选的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2型疏水蛋白，其结构特征在于下面的序列表。它们也可以仅仅是其部分或者衍生物。还可能的是多个、优选2或者3个相同或者不同结构的疏水蛋白部分相互结合和结合到对应的合适的多肽序列，该多肽序列在自然中不结合疏水蛋白。
根据本发明还尤其合适的是融合蛋白yaad-Xa-dewA-his(SEQ IDNO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ IDNO：24)，其多肽序列在括号中指出，和编码所述多肽序列的核酸序列，特别是根据SEQ ID NO：19，21，23的序列。这样的蛋白质也是尤其优选的实施方案，所述蛋白质通过交换、插入或者缺失至少一个到10个，优选5个氨基酸，更优选5％的所有氨基酸，从SEQ ID NO：20，22或24中所示的多肽序列加工而来，并且仍然在至少50％的程度上保留起始蛋白质的生物学性质。蛋白质的生物学性质在本文中理解为指接触角改变至少20°，其已经描述。
尤其适于进行本发明的衍生物是从yaad-Xa-dewA-his(SEQ IDNO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ IDNO：24)通过截短yaad融合配偶体衍生的残基。代替具有294个氨基酸的完整的yaad融合配偶体(SEQ ID NO：16)，可以有利地使用截短的yaad残基。然而，截短的残基将包含至少20，更优选至少35个氨基酸。例如，可以使用具有20到293，优选25到250，更优选35到150，例如35到100 个氨基酸的截短的基团。
疏水蛋白和一个或多个融合配偶体之间的切割位点可以用于以非衍生的形式释放纯的疏水蛋白(例如，通过在甲硫氨酸BrCN切割，因子Xa切割，肠激酶切割，凝血酶切割，TEV切割，等等)。
还可能从一个融合配偶体，例如，yaad或者yaaed，和甚至不同序列的多个疏水蛋白，如DewA-RodA或者Sc3-DewA，Sc3-RodA连续产生融合蛋白。同样可能使用疏水蛋白片段(例如，N-或C-末端截短)或者突变蛋白，其具有高达70％同源性。在每种情况下，最佳的构建体都关于特定用途，即将分离的液相来选择。
根据本发明使用或者本发明组合物中存在的疏水蛋白可以通过已知的肽合成方法，例如，通过Merrifield固相合成化学制备。
通过合适的方法可以从天然来源分离天然存在的疏水蛋白。参考例如，W
sten et.al.，Eur.J Cell Bio.63，122-129(1994)或WO 96/41882。
优选通过遗传工程方法可以制备融合蛋白，其中编码融合配偶体的一种核酸序列，特别是DNA序列与编码疏水蛋白部分的一种核酸序列以这样的方式组合使得由于组合的核酸序列的基因表达的结果，在宿主生物中产生所希望的蛋白质。此类制备方法例如公开在德国专利申请DE102005007480.4中。
用于所提到的制备方法的合适的宿主生物(生产生物)可以是原核生物(包括古细菌)或者真核生物，特别是包括嗜盐菌和methanococcia的细菌、真菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，更优选大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)、米曲霉(Aspergillus oryzea)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、假单胞菌(Pseudomonas spec.)、乳杆菌(Lactobacilli)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、SF9(或相关细胞)，等等。
本研究还涉及表达构建体的用途，所述构建体包含处于调节核酸序列的遗传控制下的核酸序列，其编码用于本发明的多肽，和包含至少一个这些 表达构建体的载体。
使用的构建体优选包含从特定编码序列的5’上游的启动子，和3’下游的终止子序列，和如果合适，其他常用的调节元件，在每种情况下有效连接到编码序列。
在本发明上下文中，“有效连接”理解为指启动子、编码序列、终止子和如果合适，其他调节元件的顺序排列，使得每个调节元件可以完成它的如在编码序列的表达中预期的功能。
可有效连接的序列的实例是寻靶序列，和增强子、多聚腺苷酸化信号，等等。其他调节元件包括选择标记、扩增信号、复制起点，等等。合适的调节序列例如描述于Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。
除了这些调节序列外，这些序列的天然调节可以存在于实际的结构基因的上游，并且如果合适，已经被遗传修饰以便关闭天然调节和增加所述基因的表达。
优选的核酸构建体也有利地包含一个或多个所称作的“增强子”序列，其功能上连接启动子，能够增加核酸序列的表达。还在DNA序列的3’末端，可能插入额外的有利的序列，如其他调节元件或者终止子。
核酸可以以一个或多个拷贝存在于构建体中。如果合适，在构建体中还可能存在其他标记，如抗生素抗性或者互补营养缺陷型的基因的其他标记用于构建体的选择。
用于制备的有利的调节序列存在于例如启动子中，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、Iaclq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、lambda-PR或imlambda-P启动子，其有利地用于革兰氏阴性细菌中。其他有利的调节序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SP02和酵母或者真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。
还可能使用合成的启动子用于调节。
为了在宿主生物中表达，将核酸构建体有利地插入到载体，如质粒或者 噬菌体中，其能够在宿主中最佳地表达基因。除了质粒和噬菌体外，还将载体理解为本领域技术人员已知的所有其他载体，如病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、粘粒、和线性或环状DNA，以及农杆菌系统。
这些载体可以在宿主生物中自主复制或者在染色体中复制。合适的质粒为例如，在大肠杆菌中，pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III”3-B1、tgt11或pBdCI、在链霉菌中，pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌中，pUB110、pC194或pBD214，在棒杆菌中，pSA77或pAJ667、在真菌中，pALS1、pIL2或pBB116，在酵母中，2alpha、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或在植物中，pLGV23、pGHIac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所提到的质粒构成了可能的质粒的一小部分。其他质粒是本领域技术人员已知的并且可以例如从书籍Cloning Vectors(Eds.Pouwels P.H.等人 Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)得到。
有利地，用于表达存在的其他基因的核酸构建体还包含用于增强表达的3’-和/或5’-末端调节序列，其取决于所选的宿主生物和基因被选择用于最佳表达。
这些调节序列意在使得能够控制基因表达和蛋白质表达。取决于宿主生物，这可以指例如仅在诱导后基因表达或过表达，或者它可以立即表达和/或过表达。
调节序列或者因子可以优选地积极地影响从而增加所导入的基因的基因表达。从而，通过使用强转录信号，如启动子和/或增强子，可以在转录水平上有利地实现调节元件的扩增。此外，还可能通过例如提高mRNA的稳定性增强翻译。
在载体的另一实施方案中，包含核酸构建体或者核酸的载体还可以有利地以线性DNA的形式被导入微生物中并且通过异源或者同源重组整合到宿主生物的基因组中。该线性DNA可以由线性化的载体如质粒组成，或 者仅仅由核酸构建体或者核酸组成。
对于异源基因在生物中的最佳表达，有利地根据该生物中使用的特定“密码子选择”改变核酸序列。按照其他已知基因在所述生物中的计算机评估，可以容易地确定“密码子选择”。
通过合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止子信号或者多聚腺苷酸化信号的融合，可以制备表达盒。为此，使用常规的重组和克隆技术，例如见T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，CoId Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)。
为了在合适的宿主生物中表达，有利地将重组核酸构建体或者基因构建体插入到宿主特异性载体中，该载体使得所述基因在宿主中最佳表达。载体是本领域技术人员已知的并且可以例如从“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人，编著，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)得到。
借助载体，可能制备重组微生物，其已经例如用至少一种载体转化并且可以用于生产根据本发明使用的疏水蛋白或者其衍生物。有利地，将上述重组构建体导入合适的宿主系统中并表达。优选使用本领域技术人员熟悉的克隆和转染方法，例如，共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等等，以便引起所提到的核酸在特定表达系统中表达。合适的系统描述于例如Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等人，编著，Wiley Interscience，New York 1997或Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。
还可能制备同源重组的微生物。为此，制备包含至少一部分将使用的基因或者编码序列的载体，其中如果合适，已经导入至少一个氨基酸缺失、 添加或者替代以便改变，例如功能性破坏该序列(“敲除”载体)。所导入的序列例如还可以是相关微生物的同源物或者来自哺乳动物、酵母或者昆虫来源。用于同源重组的载体可以备选地这样构造使得对于同源重组的情况，内源基因已经以另一种方式突变或者改变，但是仍然编码功能蛋白质(例如，可以改变上游调节区使得内源蛋白质的表达改变)。根据本发明使用的基因的改变的部分在同源重组载体中。用于同源重组的合适的载体的构建描述于例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503中。
原则上，对于此类核酸或者此类核酸构建体，所有原核或者真核生物都可以用作重组宿主生物。有利地，使用的宿主生物是微生物，如细菌、真菌或者酵母。
有利地，使用革兰氏阳性或者革兰氏阴性细菌，优选来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)，更优选埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。
用于上述融合蛋白的制备方法中的生物取决于宿主生物，以本领域技术人员已知的方式生长或培养。微生物通常在液体培养基中在0到100℃，优选10到60℃的温度下用氧气喷射下生长，该培养基包含碳源(通常为糖的形式)、氮源(通常为有机氮源的形式，如酵母抽提物)，或者盐，如硫酸铵、微量元素，如铁、锰和镁盐，以及如果合适，维生素。营养物液体的pH可以保持在固定值，即在生长期间受到调节或者不受调节。可以以分批式、半分批式或者连续发酵式实现培养。营养物可以在发酵开始时导入或者半连续或者连续补充。酶可以通过实施例中描述的方法从生物分离或者作为粗提物用于反应。
可以通过用于重组制备的方法制备用于本发明的疏水蛋白、或者其功能性的生物活性片段，在该方法中，培养产生多肽的微生物，如果合适诱导蛋白质的表达，并将它们从培养物分离。如果希望，还可以在工业规模上以这种方式生产蛋白质。可以通过已知的方法培养和发酵重组微生物。细菌可以例如在TB或者LB培养基中和20到40℃的温度和6到9的pH下繁殖。合适的培养条件特别描述于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)。
如果蛋白质不分泌到培养基中，那么将细胞破碎并通过已知的蛋白质分离方法从裂解物得到产物。如果需要，可以通过高频超声波、通过高压、例如，在弗氏压碎器中，通过渗透裂解，通过去污剂的作用，裂解酶或者有机溶剂，通过匀浆器或者通过多种所列方法的组合破碎细胞。
通过已知的层析方法可以纯化蛋白质，所述方法为诸如分子筛层析(凝胶过滤)，如Q琼脂糖(Sepharose)层析、离子交换层析和疏水层析，以及使用其他常规的方法，如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法描述于例如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden[生物化学技术]，Verlag Water de Gruy-ter，Berlin，New York或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin。
可以尤其有利的是通过对融合疏水蛋白提供特定的锚定基团而容易分离和纯化所述融合疏水蛋白，所述锚定基团可以结合到固相支持体，特别是合适的聚合物上对应的互补基团。此类固相支持体可以例如用作层析柱的填料，并且以这种方式一般可以显著提高分离效率。此类分离方法也称作亲和层析。为了掺入锚定基团，在蛋白质的制备中，可以使用载体系统或者寡核苷酸，其延长cDNA特定的核苷酸序列并且因此编码改变的蛋白质或者融合蛋白。为了更容易纯化，经修饰的蛋白质包含作为锚的所称作的“标记”，例如称作六组氨酸锚的修饰。用组氨酸锚修饰的融合疏水蛋白可以层析纯化，例如，使用镍-琼脂糖(Sepharose)作为柱填料。可以通过合适的洗脱剂，如咪唑溶液从柱子随后再次洗脱融合疏水蛋白。
在简化的纯化方法中，可以免除层析纯化。为此，通过合适的方法，例如，首先通过微滤或者通过离心从培养液除去细胞。随后，通过合适的方法，例如，通过已经在上面提到的方法破碎细胞，可以分离细胞碎片和内含体。所述分离可以有利地通过离心实现。最后，可以原则上以已知的方式破碎内含体以便释放融合疏水蛋白。这可以例如通过酸、碱和/或去污剂进行。具有用于本发明的融合疏水蛋白的内含体可以一般完全溶解，甚至使用0.1M NaOH在约1小时内完全溶解。以这种简化的方法得到的融合疏水蛋白的纯度基于所有蛋白质的量按重量计一般为60到80％。通过所述简化的纯化方法得到的溶液可以不用进一步纯化而用于进行该发明。
如所述的制备的疏水蛋白可以直接用作融合蛋白，或者脱离和除去融合配偶体后，用作“纯的”疏水蛋白。
当意在除去融合配偶体时，适当的是在融合蛋白中疏水蛋白部分和融合配偶体部分之间掺入潜在的切割位点(蛋白酶的特定识别位点)。合适的切割位点特别是在疏水蛋白部分和在融合配偶体部分中都不发生的那些肽序列，其可以用生物信息学工具容易地确定。特别合适的实例是甲硫氨酸处的BrCN切割，或者蛋白酶介导的切割与因子Xa切割，肠激酶切割，凝血酶切割，TEV(烟草蚀纹病毒蛋白酶)切割。
根据本发明，疏水蛋白或者其衍生物可以用于稳定包含至少两个液相的组合物中已经分离的相。组合物原则上可以是任何组合物，只要它们具有至少两种液相。
具体地，组合物可以是这样的组合物，在加入至少一种疏水蛋白或者其衍生物前，组合物以乳液的形式存在，然后在延长的过程(优选大于1分钟，特别大于5分钟)中分离成两相，然后仅仅与疏水蛋白混合。
在本发明上下文中，组合物以及至少两个液相可以原则上还包含其他相。
所述至少两种液相是不同密度的两种液相，优选油和水，不同密度的两种有机溶液，燃料和水或者溶剂和水。在本发明上下文中，水性溶液是包含水，任选与其他溶剂组合的溶液。在本发明上下文中，每种液相可以包含其他物质。
根据本发明，油优选原油。
合适的溶剂是与水形成两相混合物的所有液体，特别是有机溶剂，如醚、芳族化合物，如甲苯或者苯，醇、烷、烯、环烷、环烯、酯、酮、环烷或者卤化烃。
在另一实施方案中，本发明因此涉及至少一种疏水蛋白或者其至少一种衍生物的如上述的用途，所述组合物包含油，优选原油，和水，或者其他燃料和水。
在本发明上下文中，组合物可以还包含其他相，如固相或者液相，特别是固相。
疏水蛋白或者其衍生物可以用于本领域技术人员已知的所有用途。具体地，在本发明上下文中，应该提及用作汽油燃料/水混合物、其他燃料/水混合物、原油提取或者原油运输中的原油和水相，和通过用水提取原油对原油脱盐和随后所得相的进一步处理中的相稳定剂。
可能通过加入破乳剂破乳。例如，提取的原油通常以相对稳定的油包水乳液存在，根据沉积的类型，可以占高达水重量的90％。在原有的操作和纯化中，除去大部分水后，原油将仍然包含按重量计约2到3％的所得到的水。这与油形成稳定的乳液，其甚至通过离心和加入常规的破乳剂也不能完全除去。这是有问题的，因为水首先具有高盐含量，因此具有腐蚀作用，并且残留的水还增加将运输和储存的体积，其导致成本增加。已经发现可以使用疏水蛋白或者其衍生物以便改善这些组合物中的相分离。实现了非常快速的分离。
在该情况中，必须根据将乳化的油和脂肪和存在的任何乳化剂和表面活性剂调节破乳剂，以便实现最佳的作用。乳液的破碎还可以额外通过升高温度来促进，例如0到100℃，例如，10到80℃，特别是20到60℃的温度。
另一发明性用途是水包油或者油包水混合物中的相稳定，例如，二相系统，其已经用作冷却润滑剂并且将被回收。还例如在船上得到水/油混合物作为船底污水。在该情况中，乳液的分离和分离相的保持是必要的，以便能够可靠地除去水。
使用的疏水蛋白或衍生物的量可以在宽范围内改变，有利地将根据组合物自身和组合物中存在的任何其他组分调节用量。
当例如组合物包含延迟或者恶化至少两种液相的相分离的物质，如表面活性剂或者乳化剂时，有利地使用更大量的疏水蛋白或者衍生物。
因为油，特别是原油由许多化合物组成，由于油的不同的化学组成，水和盐含量和乳液分裂的特定条件，如温度、乳液分裂的持续时间、定量加入的类型和与混合物中其他组分的相互作用，必须根据特定条件调节破乳剂。
已经令人惊奇地发现，甚至少量的疏水蛋白或者其衍生物也可导致相稳定的提高。
根据本发明，疏水蛋白或者其衍生物可以以任何合适的量使用。通常，至少一种疏水蛋白或者其衍生物基于总体组成以0.001到100ppm的量；优选0.001到80ppm的量，更优选0.001到20ppm，最优选0.01到10ppm的量使用。
在本发明的上下文中，单位ppm指mg/kg。
在另一实施方案中，本发明因此涉及如上述的用途，其中疏水蛋白或者其至少一种衍生物基于总体组成以0.001到100ppm的量使用。本领域技术人员根据待稳定的相组合物的类型确定使用的浓度。
当组合物是包含燃料和水的组合物时，疏水蛋白或者其衍生物通常以0.001到20ppm，优选0.005到2ppm，特别0.01到1ppm，更优选0.05到1ppm的量使用。
当组合物是包含原油和水的组合物时，疏水蛋白或者其衍生物通常以0.01到100ppm，优选0.1到80ppm，特别0.1到50ppm，更优选0.1到20ppm的量使用。
根据本发明，还可能的是所述组合物以及至少一种疏水蛋白或者其衍生物包含提高相稳定的其他化合物。所述化合物可以是本领域技术人员已知用于此类应用的所有化合物。用于提高相稳定，特别用作原油生产中的乳液破碎剂的合适的其他化合物的实例是烷氧基化的苯酚-甲醛树脂、 EO/PO嵌段共聚物、交联的双环氧化合物、聚酰胺或者其烷氧基化物，磺酸盐、乙氧基化脂肪胺、琥珀酸盐和DE 10 2005 006 030.7中指出的用于此类用途的化合物。
在另一实施方案中，本发明涉及如上述的用途，其中使用提高相稳定的至少一种其他化合物以及至少一种疏水蛋白或者其至少一种衍生物。
在另一方面，本发明还涉及稳定包含至少两种液相的组合物中液相的方法，其包括向该组合物中加入至少一种疏水蛋白或者其至少一种衍生物。
组合物可以是如上述的组合物，包含至少两种液相，例如，包含油，优选原油，和水的组合物，或者包含燃料和水的组合物。
根据本发明的方法可以包含其他步骤，例如，首先进行乳液的相分离或者破碎，随后向水相中加入疏水蛋白。
根据本发明，可以将疏水蛋白或者其衍生物加入2相系统的水相中，或者加入包含燃料的制剂中。该制剂与水接触时，这使得稳定相或者防止再乳化。
同样有利的是向原油-水相中加入疏水蛋白或者其衍生物以便例如，在运输过程中防止乳液的再次形成。
在本发明的上下文中，包含燃料的制剂可以包含通常存在于此类制剂中的其他添加剂。合适的添加剂例如在WO 2004/087808中指出。
在本发明的上下文中，将燃料理解为指轻的、中等的或者重的燃料油。
在本发明的上下文中，将燃料理解为指汽油燃料、柴油机燃料或者气轮机燃料。燃料更优选是汽油燃料。
所提到的添加剂以本领域技术人员认为适合具体应用的量使用。
本发明的制剂可以还与其他常规组分和添加剂组合。这里应该提到例如没有显著的去污剂作用的载体油。
合适的矿物载体油是原油加工中得到的馏分，如例如来自SN 500-2000类的具有粘性的光亮油或者基油；以及芳香烃、石蜡烃和烷氧基链烷醇。根据本发明同样合适的是称作“加氢裂解油”并且在石油精炼中得到的馏分(具有360到500℃沸腾范围的真空切取馏分，可以从天然石油催化加氢和 异构化以及在高压下脱蜡得到)。同样合适的是上述矿物载体油的混合物。
根据本发明使用的合成的载体油的实例选自：聚烯烃(聚α-烯烃或者聚内烯烃)、聚酯、聚烷氧化物、聚醚、脂族聚醚胺、烷基酚-开始的聚醚、烷基酚-开始的聚醚胺和长链链烷醇的羧基酯。
其他合适的载体油系统例如在DE-A 38 26 608、DE-A 41 42 241、DE-A43 09 074、EP-A 0 452 328和EP-A 0 548 617中描述，将它们明确引入作为参考。
其他合适的合成的载体油是烷氧基化烷基酚，如DE-A 10 102 913.6中所述。
所提到的载体油以本领域技术人员对于具体应用认为合适的量使用。
其他常规的添加剂是腐蚀抑制剂，如基于有机羧酸的铵盐的腐蚀抑制剂，所述铵盐倾向于形成膜，或者对于非铁的金属腐蚀保护，基于杂环芳香化合物的腐蚀抑制剂；抗氧化剂或者稳定剂，例如基于胺如对-苯二胺、二环己胺或者其衍生物的抗氧化剂或者稳定剂，或者基于酚，如2，4-二-叔丁基苯酚或者3，5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酸的抗氧化剂或者稳定剂；其他常规破乳剂；抗静电剂；金属茂，如二茂铁；甲基环戊二烯三羰基锰；润滑性改进剂(润滑性添加剂)，如特定脂肪酸，烯基琥珀酸酯，二(羟基烷基)脂肪胺，羟基乙酰胺或者蓖麻油；和染料(标记)。如果合适，还加入胺以降低燃料的pH。
将所提到的具有极性部分(a)到(i)的去污剂添加剂通常以按重量计10到5000ppm，特别按重量计50到1000ppm的量加入到燃料中。如果需要，将所提到的其他组分和添加剂以常规量加入。
根据本发明，合适的燃料是本领域技术人员已知的所有燃料，例如，汽油，如Ullmann的Encyclopedia of Industrial Chemistry，第五版1990，A16卷，p.719ff中所述。根据本发明，合适的燃料是内燃机燃料、煤油和喷气式飞机燃料。
具体地，具有按体积计不多于60％，例如按体积计不多于42％的芳香族化合物含量和按重量计不多于2000ppm，例如按重量计不多于150ppm的 硫含量的汽油燃料是合适的。
汽油燃料中的芳香族化合物含量为例如按体积计10到50％，例如，按体积计30到42％，特别按体积计32到40％。汽油燃料中的硫含量为例如按重量计2到500ppm，例如，按重量计5到150％，或者按重量计10到100ppm。
此外，合适的汽油燃料可以具有例如按体积计高达50％，例如按体积计6到21％，特别按体积计7到18％的烯烃含量；按体积计高达5％，例如按体积计0.5到1.0％，特别按体积计0.6到0.9％的苯含量，和/或按重量计高达25％，例如按重量计高达10％，或者按重量计1.0到2.7％，特别按重量计1.2到2.0％的氧含量。
具体地，作为实例可以提及那些汽油燃料，其通常具有按体积计不多于38％的芳香族化合物含量，按体积计不多于21％的烯烃，按重量计不多于50ppm硫含量，按体积计不多于1.0％的苯含量和按重量计1.0到2.7％的氧含量。
汽油燃料中醇和醚的含量可以在宽范围内变动。典型的最大含量的实例是按体积计15％甲醇，按体积计65％乙醇，按体积计20％异丙醇，按体积计15％叔丁醇，按体积计20％异丁醇和按体积计30％的在分子中具有5个或更多碳原子的醚。
根据本发明合适的汽油燃料的夏天蒸汽压通常不大于70kPa，特别60kPa(每种情况下在37℃)。
汽油燃料的RON通常为75到105。对应的MON的常规范围为65到95。
所提到的规格通过常规方法(DIN EN 228)确定。
在下文通过实施例详细阐明本发明。
实施例
实施例1
克隆yaad-His6/yaaE-His6的准备
用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)进行聚合酶链式反应。使用的模板DNA是枯草芽孢杆菌的基因组DNA。所得的PCR片段包含枯草芽孢杆菌yaaD/yaaE基因的编码序列，在每端分别具有NcoI和BgIII限制性切割位点。纯化PCR片段并用限制性内切核酸酶NcoI和BglII切割。该DNA片段用作插入片段并克隆到来自Qiagen的载体pQE60中，其已经事先用限制性内切核酸酶NcoI和BgIII线性化。所形成的载体pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 可以用于表达由 YAAD::HIS6或YAAE::HIS6组成的蛋白质。
Hal570：gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
Hal571：gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572：ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573：gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
实施例2
克隆yaad疏水蛋白DewA-His6
用寡核苷酸KaM 416和KaM 417进行聚合酶链式反应。使用的模板DNA是构巢曲霉的基因组DNA。所得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的编码序列和N-末端因子Xa蛋白酶切割位点。纯化PCR片段并用限制性内切核酸酶BamHI切割。该DNA片段用作插入片段并克隆到事先用限制性内切核酸酶BgIII线性化的载体pQE60YAAD#2中。
所形成的载体#508可以用于表达由YAAD::Xa::dewA::HIS6组成的融合蛋白。
KaM416：GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-
GAAGTTCTCCGTCTCCGC
实施例3
克隆yaad疏水蛋白RodA-His6
类似地使用寡核苷酸KaM 434和KaM 435将质粒#513克隆到质粒#518 中。
KaM434：GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435：CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
实施例4
克隆yaad疏水蛋白BASF1-His6
类似地使用寡核苷酸KaM 417和KaM 418将质粒#507克隆到质粒#508中。
使用的模板DNA是合成的DNA序列(疏水蛋白BASF1)(见附件，SEQID NO：11和12)。
KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG
C
KaM418：CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
实施例5
克隆yaad疏水蛋白BASF2-His6
类似地使用寡核苷酸KaM 417和KaM 418将质粒#506克隆到质粒#508中。
使用的模板DNA是合成的DNA序列(疏水蛋白BASF2)(见附件，SEQID NO：13和14)。
KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG
C
KaM418：CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
实施例6
克隆yaad疏水蛋白SC3-His6
类似地使用寡核苷酸KaM 464和KaM 465将质粒#526克隆到质粒#508中。
使用的模板DNA是来自Schyzophyllum commune的cDNA(见附件，SEQ ID NO：9和10)。
KaM464：CGTTAAGGATCCGAGGATGATTGATGGGGGTGC
KaM465：GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
实施例7
重组大肠杆菌菌株yaad疏水蛋白DewA-His6的发酵
在15ml Greiner管中的3ml LB液体培养基中接种表达yaad疏水蛋白DewA-His6的大肠杆菌菌株。在摇床上37℃下以200rpm(转/分钟)培养8小时。在每种情况下，两个1升的带挡板的锥形瓶和250ml LB培养基(+100μg/ml氨苄青霉素)在每种情况下接种1ml初步培养物并在摇床上以180rpm在37℃下培养9小时。
在20升发酵罐中用0.5升初步培养物(OD600nm 1∶10，对H2O测量)接种13.5升LB培养基(+100μg/ml氨苄青霉素)。在～3.5的OD600nm下，加入140ml100mM IPTG。3小时后，冷却发酵罐到10℃并离心除去发酵液。细胞沉淀用于进一步纯化。
实施例8
纯化重组的疏水蛋白融合蛋白
将100g细胞沉淀(100-500mg疏水蛋白)用pH 7.5的50mM磷酸钠缓冲液补充到总体积200ml，并重悬浮。将悬浮液用Ultraturrax型T25(Janke和Kunkel；IKA-Labortechnik)处理10分钟并随后在室温下用500单位Benzonase(Merck，Darmstadt；订单号1.01697.0001)温育1小时以降解核酸。细胞破碎前，用玻璃柱体(P1)实现过滤。对于细胞破碎和断裂剩余的基因组DNA，在1500巴下进行两次匀浆器循环(Microfluidizer M-110EH；Microfluidics Corp.)。离心匀浆物(Sorvall RC-5B，GSA-转子，250ml离心杯，60分钟，4℃，12000rpm，23000g)，将上清液置于冰上并将沉淀物重悬浮在100ml磷酸钠缓冲液，pH7.5中。
重复离心和重悬浮3次，在第三次重复时磷酸钠缓冲液包含1％SDS。重悬浮后，搅拌混合物1小时并进行最后的离心(Sorvall RC-5B，GSA-转子，250ml离心杯，60分钟，4℃，12000rpm，23000g)。
根据SDS-PAGE分析，最后离心后，在上清液中存在疏水蛋白(图1)。实验表明疏水蛋白可能以内含体的形式存在于对应的大肠杆菌细胞中。向用50mM Tris-Cl pH8.0缓冲液平衡的50ml镍-琼脂糖HP(SepharoseHigh Performance)17-5268-02柱(Amersham)应用50ml包含疏水蛋白的上清液。用50mM Tris-Cl pH8.0缓冲液洗涤柱子并随后用包含200mM咪唑的50mM Tris-Cl pH8.0缓冲液洗脱疏水蛋白。为了除去咪唑，对50mM Tris-Cl pH8.0缓冲液透析溶液。
图1显示了所制备的疏水蛋白的纯化：
泳道A：应用于镍-琼脂糖柱(1∶10稀释)
泳道B：穿过液-洗涤步骤洗脱液
泳道C-E：OD280最大值的洗脱级分(WP1，WP2，WP3)
泳道F显示了应用的标记。
图1的疏水蛋白具有约53kD的分子量。一些较小的带代表疏水蛋白的降解产物。
实施例9
性能测试；通过玻璃上水滴的接触角的改变表征疏水蛋白基质：
玻璃(窗玻璃，Süddeutsche Glas，Mannheim)：
使用根据实施例8纯化的疏水蛋白。
-溶液中疏水蛋白的浓度：100μg/ml，溶液还包含50mM乙酸钠缓冲液和0.1％聚氧乙烯(20)-单月桂酸山梨聚糖( 
20)，溶液的pH：4
-将玻璃板浸入该溶液中过夜(温度80℃)
-然后将疏水蛋白涂布的玻璃板从溶液取出并用蒸馏水洗涤，
-然后温育10分钟/80℃/蒸馏水中1％SDS溶液
-用蒸馏水再次洗涤
在空气中干燥样品，并在室温下测定5μl水滴与经涂布的玻璃表面的接触角(度)。
在Dataphysics OCA 15+接触角系统，软件SCA 20.2.0.(2002年11月)上测量接触角。根据生产商的使用说明书实现测量。
未处理的玻璃得到30±5°的接触角。
用根据实施例8的疏水蛋白(yaad-dewA-his6)涂布的玻璃板得到75±5°的接触角。
＝＞接触角增加：45°
实施例10
疏水蛋白的相稳定实验
在每种情况下，向snap lid玻璃瓶中引入50ml原石油(同质的原石油，Wintershall AG，Emiichheim，探头60、64、83、87、301和507)的乳液和水。通过Ultraturrax搅拌器(24000rpm下4分钟的搅拌时间)在约50ml水中乳化1000ppm原石油制备乳液。
向该乳液中加入：
在A例中不加入破乳剂，
在B例中10ppm来自实施例8的疏水蛋白
在C例中10ppm PolyDADMAC(固体含量为28到32％的破乳剂(ISO3251)，粘度从200到800mPas(ISO2595))
在D例中10ppm Lupasol SK(用聚乙烯亚胺接枝的聚氨基胺，生产商：Nippon Shokubai，Japan)
之后，让样品静置3天，期间乳液分离(见图2中的图示，上排)。
然后用手通过多次圆形移动轻微摇动样品。在A、C和D例中，这再次形成高不透明性(乳液形成)；对于B例(包含疏水蛋白)，保留相分离。
在各例中，在包含10ppm的疏水蛋白的样品B中还形成薄片，但是它们立即上升到上面的油相(见图2图示的下排)。
这些实验表明疏水蛋白比商业破乳剂更好地稳定已经分离成两个分离相的乳液。
也可以在乳液分裂后向水相中加入疏水蛋白。
实施例11
相稳定化的比较
首先以3∶1二甲苯/异丙醇混合物(基于体积)制备表中所列的破乳剂的按重量计5％的溶液。
加入前1小时，将实施例8的疏水蛋白用蒸馏水制备为1％溶液(0.25％活性物质)。
例如，使用的破乳剂为：
Pluronic
PE 6800：(氧化乙烯/氧化丙烯共聚物)
Basorol
P380：(三元醇多元醇聚醚)
Basorol
HP：(四元醇-氧化乙烯/氧化丙烯共聚物)
将原油乳液((Wintershall AG，Emlichheim，探头60、64、83、87、301和507，水含量按体积计为62％，通过DIN ISO 3733蒸馏方法测定)在密封容器中水浴中加热到52℃约2小时。
通过摇动原油乳液约30秒匀浆并且在每种情况中，将100ml原油乳液填充到100ml摇动圆筒中。将装油的摇动圆筒置于水浴中。
将Eppendorf移液器在每种情况中用于计量50μl按重量计50％的上述破乳剂溶液到包含原油乳液的摇动圆筒中，将圆筒用玻璃塞封住。之后，从水浴取出摇动圆筒，摇动60次并减压。然后将摇动圆筒放回到水浴中(52℃)并在30和240分钟读出分离的水的体积。结果在下面的表中给出。
240分钟后，通过注射器将表中陈述的疏水蛋白的量导入在每种情况下通过一次性注射器分离的水中。随后，在每种情况下摇动混合物30秒。之后，让样品在52℃静置1分钟，然后测定分离的水的量。结果在表中编辑。
| 破乳剂 | 一定时间(分钟)后分离的水(ml) | 加入水相的蛋白质的量 | 分离的水(ml) |
| 30 | 240 | 1分钟后 |
Pluronic |
2 | 39 | 0ppm | 34 |
Pluronic |
6 | 39 | 1.0PPm | 39 |
Pluronic |
3 | 39 | 3.0ppm | 39 |
Basorol |
56 | 60 | 0ppm | 56 |
Basorol |
55 | 60 | 1.0ppm | 58 |
Basorol |
54 | 60 | 0.5ppm | 58 |
Basorol |
50 | 59 | 0ppm | 57 |
Basorol |
53 | 59 | 1.0ppm | 59 |
Basorol |
50 | 59 | 0.5ppm | 58 |
可以清楚地看出疏水蛋白的加入加速了相的再分离。因此，通过该蛋白质似乎减小了水相向油相的再乳化。
还令人惊奇的是从0.1到1ppm低浓度的疏水蛋白足够实现所述结果。
对序列表中DNA和多肽序列的序列名称的指定
| dewA DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：1 |
| dewA多肽序列 | SEQ ID NO：2 |
| rodA DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：3 |
| rodA多肽序列 | SEQ ID NO：4 |
| hypA DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：5 |
| hypA多肽序列 | SEQ ID NO：6 |
| hypB DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：7 |
| hypB多肽序列 | SEQ ID NO：8 |
| sc3DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：9 |
| sc3多肽序列 | SEQ ID NO：10 |
| basf1DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：11 |
| basf1多肽序列 | SEQ ID NO：12 |
| basf2DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：13 |
| basf2多肽序列 | SEQ ID NO：14 |
| yaad DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：15 |
| yaad多肽序列 | SEQ ID NO：16 |
| yaae DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：17 |
| yaae多肽序列 | SEQ ID NO：18 |
| yaad-Xa-dewA-his DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：19 |
| yaad-Xa-dewA-his多肽序列 | SEQ ID NO：20 |
| dewA DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：1 |
| yaad-Xa-rodA-his DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：21 |
| yaad-Xa-rodA-his多肽序列 | SEQ ID NO：22 |
| yaad-Xa-basf1-his DNA和多肽序列 | SEQ ID NO：23 |
| yaad-Xa-basf1-his多肽序列 | SEQ ID NO：24 |
序列表
<110>巴斯福股份公司
<120>疏水蛋白作为相稳定剂的用途
<130>AE 200500040
<160>24
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>405
<212>DNA
<213>basf-dewA
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(405)
<223>
<400>1
atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1 5 10 15
acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20 25 30
gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35 40 45
atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50 55 60
agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85 90 95
gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc 336
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100 105 110
gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115 120 125
ggc gct ggt acc aag gct gag 405
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
130 135
<210>2
<211>135
<212>PRT
<213>basf-dewA
<400>2
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20 25 30
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35 40 45
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50 55 60
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85 90 95
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100 105 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
130 135
<210>3
<211>471
<212>DNA
<213>basf-rodA
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(471)
<223>
<400>3
atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20 25 30
ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35 40 45
acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct 192
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50 55 60
tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65 70 75 80
ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt 288
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
85 90 95
gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct 336
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
100 105 110
gtc ctc att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac 384
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
115 120 125
att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att 432
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
130 135 140
ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc 471
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145 150 155
<210>4
<211>157
<212>PRT
<213>basf-rodA
<400>4
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35 40 45
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50 55 60
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65 70 75 80
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
85 90 95
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
100 105 110
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
115 120 125
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
130 135 140
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145 150 155
<210>5
<211>336
<212>DNA
<213>basf-HypA
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<223>
<400>5
atg atc tct cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt 48
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
gtt act gca act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc agc agt cag tgc 96
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
20 25 30
gac gtc ggt gaa atc cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
35 40 45
acc agc gcc gcc gcg tct ggt ttg ctt ggt gtt ccc atc aac ctt ggt 192
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
50 55 60
gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt 240
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65 70 75 80
ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc 288
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
85 90 95
acc gca ttg att aac gct ctt gac tgc tct cct gtc aat gtc aac ctc 336
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
100 105 110
<210>6
<211>112
<212>PRT
<213>basf-HypA
<400>6
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
20 25 30
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
35 40 45
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
50 55 60
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65 70 75 80
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
85 90 95
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
100 105 110
<210>7
<211>357
<212>DNA
<213>basf-HypB
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<223>
<400>7
atg gtc agc acg ttc atc act gtc gca aag acc ctt ctc gtc gcg ctc 48
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
ctc ttc gtc aat atc aat atc gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag 96
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20 25 30
cat tgt agc acc ggt cct atc gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct 144
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35 40 45
aag agc cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50 55 60
ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc agc cct 240
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65 70 75 80
atc acg gca att ggt att ggc tcc ggc agc caa tgc tct ggc cag acc 288
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85 90 95
gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc 336
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100 105 110
act ccc att aat gcc aat gtg 357
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
115
<210>8
<211>119
<212>PRT
<213>basf-HypB
<400>8
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20 25 30
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35 40 45
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50 55 60
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65 70 75 80
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85 90 95
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100 105 110
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
115
<210>9
<211>408
<212>DNA
<213>basf-sc3
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(408)
<223>
<400>9
atg ttc gcc cgt ctc ccc gtc gtg ttc ctc tac gcc ttc gtc gcg ttc 48
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1 5 10 15
ggc gcc ctc gtc gct gcc ctc cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acg 96
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20 25 30
ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc tcg acg acg 144
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35 40 45
acc atc gcc gcc ggt ggc acg tgt act acg ggg tcg ctc tct tgc tgc 192
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50 55 60
aac cag gtt caa tcg gcg agc agc agc cct gtt acc gcc ctc ctc ggc 240
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65 70 75 80
ctg ctc ggc att gtc ctc agc gac ctc aac gtt ctc gtt ggc atc agc 288
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85 90 95
tgc tct ccc ctc act gtc atc ggt gtc gga ggc agc ggc tgt tcg gcg 336
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100 105 110
cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg atc aac atc 384
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115 120 125
ggt tgc acc ccc atc aac atc ctc 408
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130 135
<210>10
<211>136
<212>PRT
<213>basf-sc3
<400>10
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1 5 10 15
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20 25 30
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35 40 45
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50 55 60
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65 70 75 80
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85 90 95
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100 105 110
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115 120 125
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130 135
<210>11
<211>483
<212>DNA
<213>basf-BASF1
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(483)
<223>
<400>11
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
tac gcc ggc gac gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc 240
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65 70 75 80
ctc ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc 288
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
85 90 95
ctc ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc 336
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
100 105 110
atc cct atc cag gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag 384
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
115 120 125
aac atc gcc tgc tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc 432
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
130 135 140
gtc aac ctc ggc ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat 480
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145 150 155 160
atg 483
Met
<210>12
<211>161
<212>PRT
<213>basf-BASF1
<400>12
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65 70 75 80
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
85 90 95
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
100 105 110
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
115 120 125
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
130 135 140
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145 150 155 160
Met
<210>13
<211>465
<212>DNA
<213>basf-BASF2
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(465)
<223>
<400>13
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
tac gcc ggc gac gtc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc 240
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65 70 75 80
ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc 288
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85 90 95
ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc 336
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100 105 110
cct atc cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc 384
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
115 120 125
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 432
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130 135 140
aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg 465
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145 150 155
<210>14
<211>155
<212>PRT
<213>basf-BASF2
<400>14
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65 70 75 80
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85 90 95
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100 105 110
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln AsnIle Ala Cys
115 120 125
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130 135 140
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145 150 155
<210>15
<211>882
<212>DNA
<213>basf-yaad
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(882)
<223>
<400>15
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1 5 10 15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65 70 75 80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225 230 235 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg 882
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Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
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Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
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Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
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Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
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Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu
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cac atc cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct ggt ctt gtc gta aaa 96
His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys
20 25 30
cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt 144
Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly
35 40 45
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Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu
50 55 60
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Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys
65 70 75 80
gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288
Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro
85 90 95
cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
100 105 110
cag gtt gac agc ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384
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115 120 125
cct ttt act ggg gta ttc atc cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt 432
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130 135 140
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Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala
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aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tca ttc cat ccg gag ctg aca gaa 528
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130 135 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
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Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
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Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
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Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
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atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
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Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
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Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225 230 235 240
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245 250 255
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355 360 365
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu
385 390 395 400
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
405 410 415
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
420 425 430
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu
435 440 445
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His
450 455 460
His
465
<210>23
<211>1407
<212>DNA
<213>basf-yaad-Xa-BASF1-his
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1407)
<223>
<400>23
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1 5 10 15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65 70 75 80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225 230 235 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290 295 300
gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct 960
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305 310 315 320
cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc 1008
Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe
325 330 335
cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc 1056
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
340 345 350
gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc gac 1104
Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp
355 360 365
gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc ctc aag aac 1152
Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn
370 375 380
ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc ttc gac cag 1200
Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln
385 390 395 400
tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc cct atc cag 1248
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln
405 410 415
gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc 1296
Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
420 425 430
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 1344
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
435 440 445
ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tct cat 1392
Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
450 455 460
cac cat cac cat cac 1407
His His His His His
465
<210>24
<211>469
<212>PRT
<213>basf-yaad-Xa-BASF1-his
<400>24
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1 5 10 15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65 70 75 80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala G1n Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290 295 300
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305 310 315 320
Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe
325 330 335
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
340 345 350
Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp
355 360 365
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Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
420 425 430
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
435 440 445
Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
450 455 460
His His His His His
465
Claims (12)
1.在包含至少两种液相的组合物中稳定液相的方法，其包括向组合物中加入0.001到100ppm量的至少一种疏水蛋白，其中所述组合物是包含原油和水的组合物或者包含燃料和水的组合物，并且其中燃料指轻的、中等的或者重的燃料油、汽油燃料、柴油机燃料或者气轮机燃料。
2.根据权利要求1的方法，其中所述疏水蛋白是融合疏水蛋白或者其衍生物，并且其中衍生物指具有相似结构和功能等价性的蛋白质。
3.根据权利要求2的方法，其中所述融合疏水蛋白是选自yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ ID NO：24)的至少一种，其中yaad也可以是yaad的具有20到293个氨基酸的截短的融合配偶体。
4.根据权利要求1到3任一项的方法，其中所述疏水蛋白以基于总的组合物0.001到80ppm的量使用。
5.根据权利要求1到3任一项的方法，其中所述组合物是原油-水组合物并且疏水蛋白以基于总的组合物0.001到20ppm的量使用。
6.根据权利要求1到3任一项的方法，其中所述组合物是燃料-水组合物并且疏水蛋白以基于总的组合物0.001到20ppm的量使用，并且其中燃料指轻的、中等的或者重的燃料油、汽油燃料、柴油机燃料或者气轮机燃料。
7.根据权利要求1到3任一项的方法，其中首先将相分离，然后向水相中加入疏水蛋白。
8.制剂，其包含由燃料和/或原油组成的至少一种有机相和包含基于总的制剂0.001到80ppm量的至少一种疏水蛋白的水相，并且其中燃料指轻的、中等的或者重的燃料油、汽油燃料、柴油机燃料或者气轮机燃料。
9.根据权利要求8的制剂，其中所述制剂包含至少一种燃料并且所述疏水蛋白或者其衍生物以基于总的制剂0.01到1ppm的量存在于制剂中，其中衍生物指具有相似结构和功能等价性的蛋白质，并且其中燃料指轻的、中等的或者重的燃料油、汽油燃料、柴油机燃料或者气轮机燃料。
10.根据权利要求9的制剂，其中所述燃料是选自汽油燃料、柴油机燃料或者气轮机燃料的燃料。
11.根据权利要求8或9的制剂，其中所述疏水蛋白是融合疏水蛋白或者其衍生物，其中衍生物指具有相似结构和功能等价性的蛋白质。
12.根据权利要求11的制剂，其中所述融合疏水蛋白是选自yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ ID NO：24)的至少一种，其中yaad也可以是yaad的具有20到293个氨基酸的截短的融合配偶体。
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