MX2007011125A

MX2007011125A - Uso de proteinas como agentes de desemulsionantes.

Info

Publication number: MX2007011125A
Application number: MX2007011125A
Authority: MX
Inventors: Thomas Subkowski; Dietmar Posselt; Claudius Kormann; Marcus Guzmann; Hans-Georg Lemaire; Claus Bollschweiler; Ulf Baus; Werner Schmitt; Matthias Kiefer; Marvin Karos
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 2005-04-01
Filing date: 2006-03-29
Publication date: 2007-10-23
Also published as: NO20074580L; EP1868698A1; CA2599985A1; BRPI0609776A2; KR20070118157A; US20100170142A1; WO2006103251A1; CN101151081B; CA2599985C; CN101151081A

Abstract

La invencion se relaciona con el uso de cuando menos una proteina, especialmente cuando menos una hidrofobina o cuando menos un derivado de la misma, pera mejorar la separacion de fase en composiciones que contienen cuando menos dos fases liquidas. La invencion tambien se relaciona con un metodo para separar cuando menos dos fases liquidas en una composicion que contiene cuando menos dos fases liquidas, y formulaciones que contienen cuando menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en combustibles liquidos, combustibles, petroleo crudo o soluciones de polimero solubles en agua o solubles en aceite, y cuando menos una proteina, especialmente cuando menos una hidrofobina o derivados de la misma.

Description

USO DE PROTEÍNAS COMO AGENTES DE DESEMULSIONANTES Descripción La presente invención se relaciona con el uso de cuando menos una idrofobina o cuando menos un derivado de la misma, para mejorar la separación de fase en composiciones que comprenden cuando menos dos fases liquidas, con métodos para separar cuando menos dos fases liquidas en una composición que comprende por lo menos dos fases liquidas, y con formulaciones que comprenden cuando menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en combustibles líquidos, combustibles, petróleos crudos o soluciones de polímero solubles en agua o solubles en aceite y cuando menos una hidrofobina o derivados de la misma. Las hidrofobinas son proteínas pequeñas de alrededor de 100 a 150 aminoácidos y que son características para hongos filamentosos, por ejemplo Schizophillu commu e . Como regla, poseen 8 unidades de cisteína. Las hidrofobinas exhiben una afinidad marcada para interfaces y, por lo tanto, son apropiadas para revestir superficies a fin de alterar las propiedades de las interfaces formando membranas anfipáticas. De esta manera, el Teflón, por ejemplo, se puede revestir con hidrofobinas, obteniendo de esta manera una superficie hidrofílica.

Las hidrofobinas se pueden aislar de fuentes naturales. Los métodos para preparar hidrofobinas, y derivados de las mismas, también se conocen. Por ejemplo, DE 10 2005 007 480.4 describe un método para preparar hidrofobinas y sus derivados. El ramo anterior propone usar hidrofobinas para una variedad de aplicaciones. WO 96/41882 propone utilizar hidrofobinas como emulsionantes, espesadores o substancias superficialmente activas para hidrofilizar superficies hidrofóbicas, para mejorar la resistencia al agua de substratos hidrofílicos o para preparar emulsiones de aceite en agua o emulsiones de agua en aceite. El documento también propone aplicaciones farmacéuticas, tales comola preparación de ungüentos o cremas, y también aplicaciones cosméticas, tales como protección de la piel o la preparación de champús o enjuagues para el cabello. Además de estos, WO 96/41882 reivindica composiciones, en particular composiciones para aplicaciones farmacéuticas, que comprenden hidrofobinas. EP-A 1 252 516 describe el revestimiento de ventanas, lentes de contacto, biosensores, dispositivos médicos, receptáculos para implementar experimentos o para almacenamiento, retenedores de embarque, partículas sólidas o marcos o carrocerías de autos de pasajeros con una solución que comprende hidrofobinas a una temperatura de 30 a 80°C. WO 03/53383 describe el uso de hidrofobinas para tratar materiales de queratina en aplicaciones cosméticas. WO 03/10331 describe que las hidrofobinas exhiben propiedades superficialmente activas. De esta manera, el documento describe un sensor, por ejemplo un electrodo de medición, que está revestido con hidrofobina y al que otras substancias, v.gr., substancias electroactivas, anticuerpos o enzimas, están ligadas no covalentemente. WO 2004/000880 también describe el revestimiento de superficies con hidrofobina o substancias semejantes a hidrofobina. Además se describe que emulsiones de aceite en agua o agua en aceite también se pueden estabilizar añadiendo hidrofobinas. WO 01/74864, que se relaciona con proteínas semejantes a hidrofobina, también describe que estas proteínas se pueden utilizar como dispersiones y emulsiones de estabilización. En principio se sabe usar proteínas para separación de fase. GB 195,876 describe un método para romper emulsiones de agua en aceite utilizando coloides. Los coloides que se mencionan por vía de ejemplo son proteínas tales como gelatina, caseína y albúmina, o polisacáridos tales como goma arábiga o goma de tragacanto. JP-A 11-169177 describe el uso de proteínas que poseen actividad de lipasa para romper emulsiones. WO 06/60916 describe el uso de mezclas libres de agentes tensioactivos, compuestas de cuando menos una proteína soluble en agua, cuando menos un polisacárido soluble en agua y por lo menos un polímero soluble en agua tal como óxido de polietileno, para diferentes aplicaciones que también incluyen desmulsionar petróleo crudo. Ninguno de los documentos citados describe el uso de hidrofobinas para separación de fase. El uso de proteínas tiene la ventaja de que son substancias que también ocurren naturalmente y son biológicamente degradables y, consecuentemente, no conducen a ninguna contaminación permanente del medio ambiente. En el caso de muchas aplicaciones industriales a gran escala, por ejemplo cuando se separan emulsiones de petróleo crudo-agua, es importante que las fases se separen tan rápidamente como sea posible. El objeto de la invención era proporcionar un método mejorado para separación de fase usando proteínas.

De conformidad con la invención, este objeto se logra utilizando cuando menos una hidrofobina para mejorar la separación de fase en composiciones que comprenden cuando menos dos fases líquidas. A este respecto, la hidrofobina puede, en principio, de conformidad con la invención, emplearse en cualquier cantidad arbitraria en tanto que esta asegure que la separación de fase en las composiciones que comprenden cuando menos dos fases líquidas se mejore. Dentro del contexto de la presente invención, "mejorar la separación de fase" se entiende como que significa que la separación de dos fases líquidas cuando una substancia se añade a una mezcla ocurre más rápidamente que en la misma mezcla sin la adición de la substancia, o que la separación de dos fases líquidas solamente se hace posible añadiendo la substancia. Dentro del contexto de la presente invención, una hidrofobina también se entiende como siendo derivados de la misma o hidrofobina modificada. Las hidrofobinas modificadas o derivadas, por ejemplo, pueden ser proteínas de fusión de hidrofobina o proteínas que no tienen una secuencia de aminoácido que exhibe cuando menos 60%, por ejemplo cuando menos 70%, en particular cuando menos 80%, particularmente de preferencia cuando menos 90%, en particular de preferencia cuando menos 95%, de identidad con la secuencia de una hidrofobina y que también llenan las propiedades biológicas de una hidrofobina hasta un grado de 50%, por ejemplo hasta un grado de 60%, en particular hasta un grado de 70%, particularmente de preferencia hasta un grado de 80%, en particular la propiedad que las propiedades superficiales se alteran revistiendo con estas proteínas de modo que el ángulo de contacto de una gota de agua antes y después del revestimiento de una superficie de vidrio con la proteína se aumente por cuando menos 20%, de preferencia cuando menos 25°, en particular cuando menos 30°. Se ha encontrado, sorprendentemente, que las hidrofobinas o derivados de las mismas mejoran la separación de cuando menos dos fases líquidas. Esto es particularmente ventajoso cuando la separación de fase rápida se va a activar o la ocurrencia de emulsiones se va a impedir. Aún cantidades pequeñas son extremadamente efectivas a este respecto. Esta propiedad se puede usar asimismo cuando las emulsiones ya existentes se van a romper. Los compuestos que rompen las emulsiones también se denominan desemulsionantes. La presente invención, por lo tanto, también se relaciona con un uso, como se describe arriba, de cuando menos una hidrofobina o cuando menos un derivado de la misma, con cuando menos una hidrofobina o cuando menos un derivado de la misma siendo empleado como un desemulsionante. A este respecto, la especificidad estructural, y no la especificidad de secuencia, de las hidrofobinas es de importancia decisiva para definir hidrofobinas. Mientras que las secuencias de aminoácidos de las hidrofobinas naturales son muy diversas, todas tienen un patrón altamente característico de 8 residuos de cisteína conservados. Estos residuos forman cuatro puentes de disulfuro intramoleculares. Los términos N y los términos C son variables a través de una escala relativamente amplia. Proteínas asociadas de fusión que tienen una longitud de 10 a 500 aminoácidos y encontradas, por ejemplo, de conformidad con técnicas biológicas moleculares que se conocen por la persona experta, se pueden añadir a estos términos. Además de esto, las proteínas que tienen estructura y equivalencia funcional similares se deben entender como siendo hidrofobinas y derivados de las mismas dentro del significado de la presente invención. Dentro del significado de la presente invención, el término "hidrofobinas*" se debe entender como que hace referencia, en que sigue, a polipéptidos de la fórmula estructural (I) Xn-C -X?-5o-C~-Xo-5*_C _X?-?oo_C -Xi-ioo-C -X1-50-C -Xo-5-C —X1-50—C -Xm (I) en donde X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gin, Arg, lie Met, Thr, Asn, Lyz, Val, Ala, Asp, Glu y Glyd) . X aqué en cada caso puede ser idéntico o diferente. En la fórmula, los índices en X son en cada caso el número de aminoácidos, C es cisteína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, cuando menos cuatro de los radicales designados C siendo cisteína, y los índices n y m son, independientes uno del otro, números naturales entre 0 y 500, de preferencia entre 15 y 300. Los polipéptidos de conformidad con la fórmula (I) se caracterizan además por la propiedad que, a temperatura ambiente, después de revestir una superficie de vidrio, ocasionan un aumento en el ángulo de contacto de una gota de agua por cuando menos 20°, de preferencia cuando menos 25° y particularmente de preferencia 30° en cada caso comparado con el ángulo de contacto que una gota de agua del mismo tamaño hace con la superficie de vidrio no revestida. Los aminoácidos denominados C1 a C8 son de preferencia cisteínas; sin embargo, también se pueden reemplazar por otros aminoácidos que exhiben llenado de espacio similar, de preferencia por alanina, serina, treonina, metionina o glicina. Sin embargo, cuando menos cuatro, de preferencia cuando menos 5, particularmente de preferencia cuando menos 6, y en particular cuando menos 7, de las posiciones de C1 a C8 deben comprender cisteínas. Las cisteínas, en las proteínas de la invención, pueden estar presentes en el estado reducido o formar puentes de disulfuro entre sí. Se da preferencia particular a la formación intramolecular de puentes de C-C, en particular aquella que involucra cuando menos uno, de preferencia 2, particularmente de preferencia 3, y muy particularmente de preferencia 4, puentes de disulfuro intramoleculares. En conexión con la reposición arriba descrita de cisteínas por aminoácidos con un relleno de espacio similar, las posiciones C que son capaces de formar puentes de disulfuro intramolecular entre sí se reemplazan ventajosamente en pares. Si las cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninaso treoninas también se usan en las posiciones designadas por X, la numeración de las posiciones C individuales en las fórmulas generales pueden cambiar correspondientemente . Se da preferencia a utilizar hidrofobinas de la fórmula II n~ ?3-25 ^ ?o-2 ^ ?5-50-I ?2-35 ^ 2-15~^ ?Q-2 ^ ?3-35- . ~?m (II) en donde X, C y los índices en X y C tienen el significado anterior, los Índices n y m son números entre 0 y 300, y las proteínas además se caracterizan por el cambio de ángulo de contacto antes mencionado, para implementar la presente invención, con cuando menos 6 de los residuos nombrados C también siendo cisteina. Se da preferencia particular a todos los residuos C siendo cisteína. Se da preferencia particular a utilizar hidrofobinas de la fórmula (III) n~C —X5-.9-C —C _Xll-39-C —X2-23-C -X5-9-C —C -X6-18-C -Xm (III) en donde X, C y los índices en X tienen el significado anterior, los índices n y m son números entre 0 y 200, las proteínas se caracterizan además por el cambio de ángulo de contacto arriba mencionado, y cuando menos 6 de los residuos denominados C son cisteína. Se da preferencia particular a todos los residuos C que son cisteína. Los residuos Xn y Xm pueden ser secuencias de péptido que también están naturalmente enlazadas a una hidrofobina. Sin embargo, uno o ambos residuos también pueden ser secuencias de péptido que no están naturalmente enlazadas a una hidrofobina. Esto también se debe entender como que incluye los residuos Xn y/o Xm en los que una secuencia de péptido que ocurre naturalmente en una hidrofobina se extiende por una secuencia de péptido que no ocurre naturalmente en una hidrofobina. Si Xn y/o Xm son secuencias de péptido que no estén enlazadas naturalmente en hidrofobinas, estas secuencias como regla son de cuando menos 20, de preferencia cuando menos 35, particularmente de preferencia cuando menos 50, y muy particularmente de preferencia 100 aminoácidos de longitud. Dichyo residuo, que no está naturalmente enlazado a una hidrofobina, también se puede denominar socio de fusión en aquel que sigue. Esto se pretende de esta manera para expresar el hecho de que las proteínas pueden estar compuestas de cuando menos una fracción de hidrofobina y una fracción de sodio de fusión que no están ligados juntos en esta forma en naturaleza. La fracción de socio de fusión se puede seleccionar de un número grande de proteínas. También es posible que varios socios de fusión estén enlazados a una fracción de hidrofobina, por ejemplo, en el término amino (Xn) y en el término carboxi (Xm) de la fracción de hidrofobina. Sin embargo, también es posible, por ejemplo, para que dos socios de fusión se enlacen a una posición (Xn o Xm) de la proteína de conformidad con la invención. La proteínas que ocurren naturalmente en microorganismos, en particular en E. coli o Bacillus subtilis, son socios de fusión particularmente apropiados. Ejemplos de estos socios de fusión son las secuencias yaad (SEC ID NO: 15 y 16), yaae (SEC ID NO: 17 y 18) y tioredoxina. Los fragmentos o derivados de estas secuencias mencionadas que solamente comprenden una parte, por ejemplo de 70 a 99%, de preferencia de 5 a 50%, y particularmente de preferencia de 10 a 40%, de las secuencias, o en las que los aminoácidos o nucleótidos individuales se cambian en comparación con la secuencia, también son muy apropiados, con los valores de porcentaje en cada caso haciendo referencia al número de aminoácidos. En otra modalidad preferida, la fusión de hidrofobina también exhibe, además del socio de fusión como un grupo Xn o Xm, que se denomina un dominio de afinidad (etiqueta de afinidad/cola de afinidad) . Los dominios de afinidad, de una manera que es conocida en principio, son grupos de anclaje que son capaces de interactuar con grupos complementarios determinados y que se pueden usar para simplificar el trabajo y purificación de las proteínas. Los ejemplos de estos dominios de afinidad incluyen grupos (His) i, (Arg)k, (Asp)k, (Phe)k y (Cys)k, con k en general siendo un número natrual de 1 a 10. El dominio de afinidad de preferencia puede ser un grupo (His)k, en donde k es de 4 a 6. Las secuencias de polipéptido de las proteínas que se usan de conformidad con la invención como hidrofobinas o derivados de las mismas también se pueden modificar, por ejemplo mediante glicosilación o acetilación o bien mediante reticulación química, por ejemplo usando glutaraldehído. Una propiedad de las hidrofobinas, o derivados de las mismas, que se usan de conformidad con la invención es el cambio en propiedades superficiales cuando las superficies se revisten con las proteínas. El cambio en las propiedades superficiales se pueden determinar experimentalmente, por ejemplo, midiendo el ángulo de contacto de una gota de agua antes y después de revestir la superficie con la proteína y determinar la diferencia en las dos mediciones. La medición de ángulos de contacto se conoce en principio por la persona experta. Las mediciones están basadas en temperatura ambiente y gotas de agua de 5 ul y el uso de plaquetas de vidrio como substrato. Las condiciones experimentales precisas para un método apropiado, por ejemplo, para medir el ángulo de contacto se describen en la sección experimental. Bajo las condiciones especificadas en la sección experimental, las proteínas de fusión que se usan de conformidad con la invención poseen la propiedad de aumentar el ángulo de contacto por cuando menos 20°, de preferencia cuando menos 25° , particularmente de preferencia cuando menos 30°, en cada caso comparado con el ángulo de contacto que una gota de agua del mismo tamaño hace con la superficie de vidrio no revestida. Las hidrofobinas que son particularmente preferidas para implementar la presente invención son las hidrofobinas del tipo de A, rodA, hypA, hypB, sc3, basfrl, basf2, que se caracterizan estructuralmente en la enumeración de secuencia que sigue. Sin embargo, las hidrofobinas también pueden ser solamente partes o derivados de estas hidrofobinas. También es posible que varias partes de hidrofobina, de preferencia 2 o 3, de estructura idéntica o diferente, que se van a enlazar entre sí y se van a enlazar a una secuencia de polipéptido apropiada correspondiente que no está naturalmente asociada con una hidrofobina. Las proteínas de fusión yaad-Xa-de A-his (SEC ID NO: 20), YAAD-Xa-rodA-his (SEC ID No 22) o yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) que tiene las secuencias de polipéptido dadas entre paréntesis, así como las secuencias de ácido nucleico que las codifica, en particular las secuencias ilustradas en SEC ID NO: 19, 21 y 23, también son particularmente apropiadas de conformidad con la invención. Las proteínas que se derivan de las secuencias de polipéptido ilustradas en SEC ID NO: 20, 22 y 24 mediante la substitución, inserción u omisión de cuando menos uno hasta 10, de preferencia 5, particularmente de preferencia 5% de todos los aminoácidos, y que todavía poseen cuando menos 50% de la propiedad biológica de las proteínas de partida, son también modalidades particularmente preferidas. En este contexto, la propiedad biológica de las proteínas se entiende como sie3ndo el cambio en el ángulo de contacto por cuando menos 20°, como ya se describió . Los derivados que son particularmente apropiados para implementar la invención son residuos que se derivan de yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 20), YAAD-Xa-rodA-his (SEC ID NO: 22) o yaad-Xa-basfl-his (SEC ID NO: 24) truncando al socio de fusión yaad. En lugar del socio de fusión yaad completo (SEC ID NO: 16) que comprende 294 aminoácidos, es ventajosamente posible para usar un residuo de yaad truncado.

Sin embargo, el residuo truncado debe comprender cuando menos 20, de preferencia cuando menos 35, aminoácidos. Por ejemplo, es posible utilizar un residuo truncado que tiene de 20 a 293, de preferencia de 25 a 250, particularmente de preferencia de 35 a 150, y por ejemplo, de 35 a 100 aminoácidos . Un sitio de separación entre la hidrofobina y el socio de fusión o los socios de fusión se pueden usar liberando la hidrofobina pura en forma no derivada (por ejemplo por medio de separación de BrCN en metionina, separación de factor Xa, separación de enteroquinasa, separación de trombina, separación TEV, etc.). Además es posible generar proteínas de fusión de un socio de fusión, por ejemplo yaad o yaae, y varias hidrofobinas, incluyendo de diferente secuencia (por ejemplo, De A-RodA o Sc3-De A, o Sc3-RodA) uno detrás del otro. Asimismo es posible usar fragmentos de hidrofobina (por ejemplo los truncados N- o C-terminales) o muteína que exhiben hasta 70% de homología. Las construcciones ópticas en cada caso se seleccionan con relación al uso proporcionado, es decir, las fases líquidas que se van a separar. Las hidrofobinas usadas de conformidad con la invención, o las hidrofobinas presentes en las formulaciones de conformidad con la invención se pueden preparar químicamente utilizando métodos conocidos de síntesis de péptido, por ejemplo por medio de síntesis de fase sólida de Merrifield. Las hidrofobinas que ocurren naturalmente también se pueden aislar de fuentes naturales utilizando métodos apropiados. Se menciona como referencia para el lector, a Wósten y col., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO 96/41882. De preferencia es posible preparar proteínas de fusión por medio de métodos recombinantes en los que una secuencia de ácido nucleico, en particular secuencia de ADN, codificación del socio de fusión, y una codificación la fracción de hidrofobina se combinan de modo que se produzca la proteína deseada en un organismo huésped como resultado de la secuencia de ácido nucleico combinada siendo expresada. Un método de preparación de esta naturaleza se describen, por ejemplo, en DE 102005007480.4. A este respecto, los organismos huésped apropiados (organismos de producción) para dicho método de preparación pueden per procariotas (ncluyendo la Archaea) o eucariotas, particularmente bacterias que incluyen halobacterias y metanococos, hongos, células de insecto, células de planta y células de mamífero, particularmente de preferencia Escherichia coli, a Bacillus subtilis, Bacillus megaterium Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus Níger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lacto bacilli, Harnsenula polimorfa, Trichoderma reesei, SF9 (o células relacionadas) y otras . La invención también se relaciona con el uso de construcciones de expresión que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se usa de conformidad con la invención, bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico reguladoras, y también vectores que comprenden cuando menos una de estas construcciones de expresión. Las construcciones que se emplean de preferencia comprendern un promotor 5' corriente arriba de la secuencia de codificación determinada y una secuencia 3' de terminador corriente abajo también, si es apropiado, otros elementos reguladores acostumbrados, cada uno de los cuales está enlazado operativamente a la secuencia de oodicificación. Dentro del contexto de la presente invención, "enlace operativo" se entiende como que significa la disposición en secuencia de promotor, secuencia de codificación, terminador y, si es apropiado, elementos reguladores adicionales de modo que cada uno de los elementos reguladores puedan cumplir su función, de conformidad con su uso pretendido, en conexión con la secuencia de codificación que se está expresando. Ejemplos de secuencias operativamente enlazables son secuencias de meta así como agentes de mejora, señales de poliadenilación y lo semejante. Otros elementos reguladores comprenden marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de réplica y lo semejante. Las secuencias reguladoras apropiadas se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Además de estas secuencias reguladoras, la regulación natural de estas secuencias todavía puede estar presente corriente arriba de los genes estructurales reales y, si es apropiado, se han alterado genéticamente de modo que la regulación natural se ha cambiado y la expresión de los genes se ha aumentado. Una construcción de ácido nucleico preferida también comprende ventajosamente una o más secuencias de mejora que están funcionalmente enlazadas al promotor y que permiten que la expresión de la secuencia de ácido nucleico se aumente. Secuencias ventajosas adicionales, tales como elementos reguladores o terminadores adicionales, también se pueden insertar en el extremo 3' de las secuencias de ADN. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en la construcción en una o más copias. También es posible que la construcción comprenda marcadores adicionales tales como resistencias antibióticas o genes que complementan las auxotrofias, si es apropiado para seleccionar la construcción. Las secuencias reguladoras que son ventajosas para la preparación están presentes, por ejemplo, en promotores tales como los promotores cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac-, Iaciq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6, lambda-PR o imlambda-P, cuyos promotores se pueden usar ventajosamente en bacterias Gram-negativas . Los ejemplos de otras secuencias reguladoras ventajosas están presentes en los promotores Gra -positivos amy y SP02, y en la levadura o promotores fúngales ACD1, Mfalfa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28 y ADH. También es posible usar promotores artificiales para la regulación. Para el propósito de ser expresado en un organismo huésped, la construcción de ácido nucleico se inserta ventajosamente en un vector, tal como un plásmido o un fago, que permite que los genes sean expresados de manera óptima en el huésped. Además de plásmidos y fagos, también los fectores se deben entender como siendo cualesquiera otros vectores conocidos a la persona experta, es decir, por ejemplo, vuris tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposons, elementos IS, fásmidos, cósmidos y ADN lineal o circular, así como el sistema Agrobecterium. Estos vectores se pueden replicar autónoma o cro osómicamente en el organismo huésped. Los ejemplos de plásmidos apropiados son pLG338, pACYC184, pBR322, pUCld, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-Bl, tgt11 y pBdCI en E. coli, piJIOl, pIJ364, pIJ702 y pIJ361 en Streptomyces, pUBUO, pC194 y pBD214 en Bacillus, pSA77 o pAJ667 en Corynebacterium, pALSl, pIL2 y PBB116 en hongos, 2alfa, poAG-1, Yep6, Pepl3 y pEMBLYe23 en levaduras, y pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 y pDH51 en plantas. Estos plásmidos representan una pequeña selección de los plásmidos posibles. Otros plásmidos son conocidos a la persona experta y se pueden encontrar, por ejemplo, en el libro Cloning Voctores (Eds. Pouwels P. H. Y col. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBM 0444 904018) . Para expresar los otros genes que están presentes, la construcción de ácido nucleico ventajosamente t comprende secuencias reguladoras 3' -terminales y/o 5' -terminales para aumentar expresión, cuyas secuencias se seleccionan para expresión óptima dependiendo del organismo huésped seleccionado y gene o genes. Estas secuencias reguladoras se pretenden para permitir que los genes y proteínas se expresen selectivamente. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que el gene solamente se expresa o sobre expresa después de la inducción o que se expresa y/o sobre expresa inmediatamente. A este respecto, las secuencias o factores reguladores de preferencia pueden influencias positivamente, y de esta manera aumentar, la expresión de los genes que se han insertado. De esta manera, los elementos reguladores se pueden aumentar ventajosamente en el nivel de transcripción usando señales de transcripción fuertes tales como promotores y/o amplificadores. Además de eso, sin embargo, también es posible aumentar la traslación, por ejemplo, mejorando la estabilidad del mRNA. En otra modalidad del vector, el vector que comprende la construcción de ácido nucleico o el ácido nucleico también se puede introducir ventajosamente en los microorganismos en la forma de un ADN lineal y se integre en el genoma del organismo huésped por medio de recombinación heteróloga u homologa. Este ADN lineal pueden comprender un vector linealizado, tal como un plásmido, o solamente comprende la construcción de ácido nucleico o el ácido nucleico . A fin de que los genes heterólogos se expresen de manera óptima en organismos, es ventajoso que las secuencias de ácido nucleico se alteren de conformidad con el uso de codón específico que se emplea en el organismo. El uso de codón se puede determinar fácilmente usando análisis de computadora de otros genes conocidos del organismo relacionado. Se prepara un cassette de expresión fusionando un promotor apropiado a una secuencia de nucleótido de codificación apropiada y una señal de terminador o señal de poliadenilación. Técnicas de recombinación y clonación acostumbradas, como se describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, k NY (1989) así como en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. And Wiley Interscience 81987) se usan para este propósito. Para expresión en un organismo huésped apropiado, la construcción de ácido nucleico recombinante o construcción de gene se inserta ventajosamente en un vector específico de huésped que permite que los genes se expresen de manera óptima en el huésped. Los vectores son bien conocidos a la persona experta y se pueden encontrar, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. y col., Eds. Elsevier, Ámsterdam-NewYork-Oxrod, 1985) . Do los fectores, es posible preparar microorganismos recombinantes que se transforman, por ejemplo, con cuando -menos un vector y se pueden emplear para producir las hidrofobinas, o derivados de las mismas, que se usan de conformidad con la invención. Las construcciones recombinantes arriba descritas se introducen ventajosamente e, y se expresan en un sistema huésped apropiado. A este respecto, se da preferencia a utilizar métodos comudnes de clonación y transfección que son conocidos por la persona experta, tales como coprecipitación, fusión de protoplasto, electroporación, transfección retroviral y lo semejante, a fin de expresar los ácidos nucleicos en el sistema de expresión dado. Los sistemas apropiados se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel y col., Eds., Wiley Interscience, New York 1997, o Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 Edición Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989. También es posible preparar microorganismos ho ólogamente recombinados . Esto involucra preparar un vector que comprende cuando menos un segmento de un gene o secuencia de codificación que se va a usar en el que, si es apropiado, cuando menos una omisión, adición o substitución de aminoácido se ha introducido a fin de alterar, v.gr., interrumpir funcionalmente (vector agotado) la secuencia. La secuencia introducida, por ejemplo, puede ser un homólogo de un microorganismo relacionado o bien ser derivado de una fuente de mamífero, levadura o insecto. El vector que se usa para la recombinación homologa se puede diseñar alternativamente de modo que el gene endógeno se mute o altere de alguna otra forma, en conexión con la recombinación homologa, pero todavía codifica la proteína funcional (v.gr., la región reguladora de corriente arriba se puede alterar de modo que la expresión de la proteína endógena se altere de esta manera) . El segmento alterado del gene empleado de conformidad con la invención está en el vector de recombinación homologa. La construcción de vectores que son apropiados para recombinación homologa se describe, por ejemplo, en Thomas, K. R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503. En principio, cualesquiera organismos procarióticas o eucarióticos son apropiados para ser usados como organismos de huésped recombinante para estos ácidos nucleicos o estas construcciones de ácido nucleico. Los microorganismos tales como bacterias, hongos o levaduras se usan ventajosamente como organismos huésped. Las bacterias Gram-positivas o Gramnegativas, de preferencia bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycecetaceae o Nocardiaceae, particularmente de preferencia bacterias de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, burkholderia, Salmonella, Agrobacterium y Rhodococcus, se usan ventajosamente . Los organismos que se usan en el método arriba descrito para preparar proteínas de fusión se desarrollan o cultivan de una manera conocida por la persona experta y dependiendo del organismo huésped. Los microorganismo, como regla, se desarrollan en un medio líquido que comprende una fuente de carbono, usualmente en la forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, usualmente en la forma de fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracto de levadura o sales tales como sulfato de amonio, elementos de vestigio tales como sales de hierro, manganeso y magnesio, y también, si es apropiado, vitaminas, a temperaturas de entre 0 y 100°C, de preferencia a de 10 a 60°C, y mientras que se están gasificando con oxígeno. A este respecto, el pH del líquido nutriente se puede mantener a un valor fijo, que se regula o no durante el crecimiento. El crecimiento puede ocurrir por lotes, semi lotes o continuamente. Las substancias nutrientes se pueden introducir inicialmente al principio de la fermentación o alimentarse subsecuentemente de manera semi continua o continuamente. Las enzimas se pueden aislar de los organismos usando el método descrito en los ejemplos o se pueden usar para la reacción como un extracto crudo. Las hidrofobinas, o fragmentos funcionales, biológicamente activos de las mismas, que se usan de conformidad con la invención se pueden preparar por medio de un método para preparación recombinante, con un microorganismo productor de polipéptido que se está cultivando, si es apropiado, la expresión de la proteína que se está induciendo y estas proteínas siendo aisladas del cultivo. Las proteínas también se pueden producir en esta forma en una escala industrial si así se desea. El microorganismo recombinante se puede cultivar y fermentar utilizando métodos conocidos. Las bacterias, por ejemplo, pueden propagarse en medio de TB o LB a una temperatura de 20 a 40°C y un pH de 6 a 9. Las condiciones de cultivo apropiadas y descritas con detalle en TI Maniatis, E. Fritsch y J. Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), por ejemplo. Si las proteínas no se secretan hacia el medio de cultivo, las células luego se interrumpen y el producto se obtiene del lisado utilizando métodos conocidos para aislar proteínas. Las células se pueden interrumpir, como se desee, por medio de ultrasonicación de alta frecuencia, por medio de alta presión, por ejemplo en una celda de presión Frencha, por medio de osmolisis, mediante la acción de detergentes, enzimas líticas o solventes orgánicos, usando homogeneizadores o utilizando una combinación de varios de los métodos arriba mencionados. Las proteínas se pueden purificar usando métodos cromatográficos conocidos, tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración de gel), tal como cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de intercambio de iones y cromatografía hidrofóbica, así como usando otros métodos acostumbrados tales como ultrafiltración, cristalización, eliminación de sal, diálisis o electroforesis de gel nativo. Los métodos apropiados se describen, por ejemplo, en Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden {Métodos de trabajo bioquímicos}, Verlag Walter de Gruyter, Berlín y New York, o en Scopes, R., Protein Purification, Springer verlag, New York, Heidelberg y Berlín. Puede ser particularmente ventajoso, para facilitar el asial iento y purificación, proporcionar las fusiones de hidrofobina con grupos de anclaje especiales que son capaces para ligarse a grupos complementarios correspondientes en soportes sólidos, en particular polímeros apropiados. Estos soportes sólidos, por ejemplo, se pueden usar como el relleno para columnas de cromatografía, y la eficiencia de la separación, como regla, puede ser marcadamente aumentada de esta manera. Estos métodos de separación también son conocidos como cromatografía de afinidad. A fin de incorporar los grupos de anclaje, es posible, cuando se preparan las proteínas, usar sistemas de vector u oligonucleótidos que extienden el cADN mediante secuencias de nucleótido particular y de esta manera codificar proteínas alteradas para proteínas de fusión. Las proteínas que se modifican para purificación más sencilla comprenden que lo que se denomina "etiquetas" que funcionan como anclas, por ejemplo la modificación conocida como una ancla de hexahistidina. Las fusiones de hidrofobina que se modifican con anclas de histidina se pueden purificar cromatográficamente, por ejemplo, usando níquel-sefarosa como el relleno de columna. La fusión de hidrofobina puede entonces eluirse de la columna nuevamente utilizando medios apropiados para la elusión, por ejemplo una solución de imidazol. En un método de purificación simplificado, es posible omitir la purificación cromatográfica. Para esto, las células primeramente se separan del caldo de fermentación utilizando un método apropiado, por ejemplo por medio de microfiltración o centrifucación. Las células luego se interrumpen usando métodos apropiados, por ejemplo, usando los métodos que ya se han mencionado arriba, y el desperdicio de célula se puede separar de los cuerpos de inclusión. El último paso se puede efectuar ventajosamente por medio de centrifugación. Finalmente, los cuerpos de inclusión se pueden interrumpir de una manera conocida en principio a fin de liberar las fusiones de hidrofobina. Esto se puede efectuar, por vía de ejemplo, usando ácidos, bases y/o detergentes. Los cuerpos de inclusión que comprenden las fusiones de hidrofobina que se usan de conformidad con la invención, como regla, pueden estar ya disueltos completamente dentro de aproximadamente 1 hora usando 0.1 M de NaOH. La pureza de las fusiones de hidrofobina que se obtienen usando este método simplificado, como regla, es de 60 ai0%en peso basado en la cantidad de todas las proteínas. Las soluciones que se obtienen usando el método de purificación simplificado que se ha descrito se puede usar para implementar esta invención sin ninguna purificación adicional . Las hidrofobinas que se han preparado como se describe se pueden usar ya sea directamente como proteínas de fusión o como hidrofobinas "puras", después de que el socio de fusión se ha separado y removido. Cuando la remoción del socio de fusión se contempla, es aconsejable incorporar un sitio de separación potencial (sitio de reconocimiento específico para proteasas) hacia la proteína de fusión entre la fracción de hidrofobina y la fracción de socio de fusión. Los sitios de separación apropiados son, en particular, secuencias de péptido que no ocurren de otra manera ya sea en la fracción de hidrofobina o en la fracción de socio de fusión, algo que se puede determinar fácilmente usando herramientas bioinformáticas . La separación de BrCN en metionina, o separación mediada por proteasa usando factor Xa, enterocinasa, trombina o proteasa TEV (virus de grabado de tabaco) , por ejemplo, son particularmente apropiadas. De conformidad con la invención, las hidrofobinas o derivados de las mismas se pueden usar para mejorar la separación de fase en composiciones que comprenden cuando menos dos fases líquidas. A este respecto, las composiciones pueden ser cualesquiera composiciones en tanto que posean cuando menos dos fases líquidas. En particular, las composiciones también pueden ser composiciones que, antes de la adición de la cuando menos una hidrofobina o derivados de la misma, están presentes en la forma de una emulsión. A este respecto, la composición, dentro del contexto de la presente invención, también pueden poseer fases extra además de las cuando menos dos fases líquidas. Las cuando menos dos fases líquidas son dos fases líquidas de densidad diferente, por ejemplo un aceite y agua, dos soluciones acuosas de densidad diferente, dos soluciones orgánicas de densidad diferente, y combustible y agua, un combustible y agua o un solvente y agua. A este respecto, una solución acuosa se entiende, dentro del contexto de la presente invención, como significando soluciones que comprenden agua, si es apropiado en combinación con un solvente adicional. A este respecto, cada una de las fases liquidas, dentro del contexto de la presente invención, puede comprender substancias adicionales. De conformidad con la invención, un petróleo es de preferencia un petróleo crudo. Los solventes apropiados son cualesquiera líquidos que forman mezclas de dos fases con agua, en particular solventes orgánicos, por ejemplo éter, compuestos aromáticos tales como tolueno o benceno, alcoholes, alcanos, alquenos, cicloalcanos, cicloalquenos, esteres, cetonas, naftenos o hidrocarburos halogenados. De conformidad con otra modalidad, la presente invención, por lo tanto, se relaciona con el uso, como se describió anteriormente, de cuando menos una hidrofobina o cuando menos un derivado de la misma, en donde la composición que comprende cuando menos dos fases líquidas se selecciona del grupo que consiste de: composiciones que comprenden petróleo, de preferencia petróleo crudo, y agua, composiciones que comprenden un combustible líquido o combustible y agua, mezclas de reacción que comprenden cuando menos dos fases líquidas. Dentro del contexto de la presente invención, la composición también puede comprenden fases adicionalmente, por ejemplo una fase sólida o líquida, en particular una fase sólida. Es posible usar las hidrofobinas o derivados de las mismas para cualesquiera aplicaciones conocidas por la persona experta dentro de este contexto. Dentro del contexto de la presente invención, el uso como un desemulsionante en mezclas de gasolina/agua y como un desemulsionante en otras mezclas de combustible líquido o combustible/agua, separación de fase en conexión con reacciones químicas, en particular en conexión con procesos industriales a escala grande, rompiendo las emulsiones entre petróleo crudo y agua en conexión con extracción de petróleo crudo o producción de petróleo crudo, k así como el desalado de petróleo crudo extrayendo petróleo crudo con agua y luego rompiendo la emulsión resultante, se deben mencionar en particular. Los procesos químicos industriales a escala grande apropiados son todos aquellos en los que la separación de fase se debe ocasionar, por ejemplo la hidroformilación de poliisobuteno utilizando catalizadores de cobalto, con los catalizadores siendo separados bajo condiciones acuosas. Las hidrofobinas o derivados de las mismas también se usan, de conformidad con la invención, para mejorar la separación de fase de composiciones que comprenden cuando menos dos fases líquidas y que se suscitan durante el curso de una reacción, es decir, que se forman durante el curso de una reacción que se suscita debido a la adición de un solvente o de un componente. El uso, de conformidad con la invención, de hidrofobinas o derivados de las mismas abrevia el tiempo de separación de fase y puede reducir la pérdida de productos de valor. Asimismo es posible, de conformidad con la invención, mejorar la separación de fase de composiciones que comprenden dos fases acuosas de densidad diferente, con una fase acuosa siendo entendida como siendo una fase que comprende agua, si es apropiado en combinación con otro solvente. De conformidad con la invención, las hidrofobinas o derivados de las mismas, por ejemplo, se pueden usar fara mejorar la separación de fase en conexión con polímeros de fraccionación en sistemas acuosos. Los polímeros solubles en agua, en particular, se fraccionan en esta conexión. De una manera general, se debe hacer mención de que todos los polímeros solubles en agua y solubles en petróleo conocidos a la persona experta, en poliacrilatos particulares y sus copolímeros que, determinados por la preparación, crecen con una distribución de masa molar o polidispersidade mayor de 1.1. Las emulsiones se pueden romper añadiendo desmulsionantes . De esta manera, por ejemplo, el petróleo mineral extraído, como regla, está presente como una emulsión de agua en aceite relativamente estable que puede comprender hasta 90% en peso de agua dependiendo de la naturaleza del depósito. Cuando el petróleo crudo se trabaja y purifica, un petróleo crudo crece, después de que una parte mayor del agua se ha separado, que todavía comprende de aproximadamente 2 a 3% en peso de agua. Esta última forma una emulsión estable con el petróleo, cuya emulsión no se puede separar completa enteaún mediante centrifugación y añadiendo desemulsionantes convencionales. Esto constituye un problema en tanto que, en primer lugar, el agua comprende un contenido elevado de sal y de esta manera tiene un efecto de corrosión y, en segundo lugar, el agua residual aumenta el volumen que tiene que transportarse y almacenarse, con esto conduciendo a un aumentoen costos. De conformidad con la invención, se encontró que las hidrofobinas o derivados de las mismas se pueden usar de manera particularmente ventajosa para mejorar la separación de fase en estas composiciones. Se logra una separación muy rápida. A este respecto, el desemulsionante debe estar adaptado a la naturaleza de los aceites y grasas emulsionados, así como a cualesquiera emulsionantes y agentes tensioactivos que pueden estar presentes, a fin de lograr un efecto óptimo. La rotura de emulsiones se puede sustentar adicionalmente por una temperatura elevada, por ejemplo una temperatura de 0 a 100°C, por ejemplo de 10 a 80°C, en particular de 20 a 60°C. Ejemplos de otras aplicaciones de conformidad con la invención incluyen la desemulsionación de emulsiones de impregnación en la industria de tablero de chip y textil y de emulsiones de medicamento. Otra aplicación es la desemulsionación de efluentes orgánicamente tratados, por ejemplo efluentes industriales y comerciales, en particular de trabajo de metal, por ejemplo fluidos de corte de trabajo de metal de curtidurías y de refinerías de petróleo mineral y fuentes domésticas, en las que crecen emulsiones de petróleo/agua. Estos efluentes se suscitan, por ejemplo, en conexión con procesamiento de petróleo mineral en refinerías y plantas petroquímicas. Antes de que estos efluentes se puedan conducir a la planta de clarificación, es necesario separar los residuos de petróleo, que están frecuentemente presentes en la forma de una emulsión. Otra aplicación de conformidad con la invención es la desemulsionación de mezclas de aceite en agua o agua en aceite, por ejemplo emulsiones que se han usado como fluidos cortantes y se van a reciclar. Las mezclas de agua/aceite también crecen, por ejemplo, como agua de sentina a borde de barcos que van al mar. A este respecto, es necesario separar emulsiones a fin de poder separar el agua y reducir la cantidad de solvente que tiene que desecharse. La cantidad de la hidrofobina o derivado de la misma que se usa puede variar a través de una escala amplia, con la cantidad haciéndose coincidir ventajosamente con la composición en sí y, si es apropiado, a otros componentes presentes en la composición. Si, por ejemplo, la composición comprende substancias, por ejemplo agentes tensioactivos o emulsionantes, que retrasan o dañan la separación de las cuando menos dos fases líquidas, una mayor cantidad de una hidrofobina o un derivado de la misma luego se emplea ventajosamente . Puestoque los petróleos, en particular petróleos 9 crudos, se componen de una mezcla de muchos compuestos químicos, es necesario, debido a la diferente composición química del petróleo y del agua y fracciones de sal, así como las condiciones específicas de la desemulsionación, tales como temperatura, duración de la desmulsionación, naturaleza de la proporción e interacciones con otros componentes de la mezcla, coincidan con el desemulsionador a las condiciones específicas . Se ha encontrado, sorprendentemente, que aún cantidades pequeñas de una hidrofobina o derivado de la misma conducen a una mejora en la separación de fase. De conformidad con la invención, la cuando menos una hidrofobina o derivado de la misma se puede utilizar en cualquier cantidad apropiada. La cuando menos una hidrofobina o derivado de la misma se usa, como regla, en una cantidad de 0.0001 a 1000 ppm, basada en la composición total; de preferencia en una cantidad de 0.001 a 500 ppm, particularmente de preferencia de 0.01 a 200 ppm o de 0.01 a 100 ppm y muy particularmente de preferencia de 0.1 a 50 ppm. En el contexto de la presente invención, ppm denota mg por kg. De conformidad con otra modalidad, la presente invención, por lo tanto, se relaciona con un uso como se describió previamente en donde la cuando menos una hidrofobina o el cuando menos un derivado de la misma se emplea en una cantidad de 0.0001 a 1000 ppm, basada en la composición total. La concentración empleada se e3specifica por la persona experta dependiendo de la naturaleza de la composición que se va a desemulsionar. Si la composición es una composición que comprende combustible líquido o combustibles y agua, la hidrofobina o derivado de la misma se emplea, como regla, en una cantidad de 0.001 a 100 ppm, de preferencia de 0.005 a 2 ppm, en particular de 0.01 a 1 ppm, particularmente de preferencia de 0.05 a 0.5 ppm y más preferentemente de 0.01 a 0.1 ppm. Si la composición es una composición que comprende petróleo crudo y agua, la hidrofobina o derivado de la misma se emplea, como regla, en una cantidad de 1 a 1000 ppm, de preferencia de 1 a 800 ppm, en particular de 5 a 500 ppm, particularmente de preferencia de 10 a 200 ppm y más preferentemente de 15 a 100 ppj , y por ejemplo, de 20 a 50 ppm. Si la composición es una composición que comprende dos fases acuosas de diferente densidad, cuyas fases se pueden suscitar, por ejemplo, en conexión con fraccionación de polímeros solubles en agua, la hidrofobina o derivado de la mism a se emplea, como regla, en una cantidad de 1 a 1000 ppm, de preferencia de 1 a 500 ppm, en particular de 5 a 250 ppm, particularmente de preferencia de 10 a 200 ppm y más preferentemente de 15 a 100 ppm. De conformidad con la invención, también es posible que la composición comprende compuestos adicionales que mejoran la separación de fase, además de la cuando menos una hidrofobina o derivados de la misma. A este respecto, los compuestos pueden ser cualesquiera compuestos que son conocidos a la persona experta para aplicaciones de esta naturaleza. Ejemplos de compuestos que son apropiados para uso como compuestos adicionales para mejorar la separación de fase, en particular para la aplicación como desemulsionantes en conexión con producción de petróleo crudo, se encuentran resinas de fenol formaldehído oxialquilado, copolímeros de bloque de EO/PO, diepóxidos reticulados, poliamidas o sus alcoxilatos, sales de los ácidos sulfónicos, aminas grasas etoxiladas, succinatos y los compuestos que se especifican en DE 10 2005 006 030.7 para aplicaciones de esta naturaleza. De conformidad con otra modalidad, la presente invención, por lo tanto, se relaciona con un uso como se describió anteriormente, en donde cuando menos un compuesto adicional que mejora la separación de fase se emplea en adición a la cuando menos una hidrofobina o el cuando menos un derivado de la misma. De conformidad con otro aspecto, la presente invención también se relaciona con un método para separar cuando menos dos fases liquidasen una composición que comprende cuando menos dos fases líquidas, con el método comprendiendo la adición de por lo menos una hidrofobina o por lo menos un derivado de la misma a la composición. A este respecto, la composición puede ser una composición como se describió anteriormente que comprende cuando menos dos fases líquidas. De conformidad con una modalidad preferida, la presente invención, por lo tanto, se relaciona con un método de esta naturaleza, en donde la composición que comprende cuando menos dos fases líquidas se selecciona del grupo que consiste de composiciones que comprenden petróleo, k de preferencia petróleo crudo y agua, composiciones que comprenden un combustible líquido o combustible y agua, mezclas de reacción que comprenden cuando menos dos fases líquidas. En principio, las hidrofobinas o derivados de las mismas pueden, dentro del contexto de la presente invención, emplearse en cualesquiera cantidades arbitrarias siempre que la separación de fase se mejore. El uso de una hidrofobina o derivado de la misma en una cantidad de 0.0001 a 1000 ppm, basada en la composición total, es particularmente apropiado. La presente invención se relaciona asimismo con un método previamente descrito en donde la cuando menos una hidrofobina o el cuando menos un derivado de la misma se emplea en una cantidad de 0.0001 a 1000 ppm, basada en la composición total. Las cantidades preferidas para los sistemas respectivos ya se mencionaron. El método de conformidad con la invención puede comprender pasos adicionales, por ejemplo pasos que mejoran la separación de fase o la rotura de emulsiones. A este respecto, el paso, por ejemplo, puede ser un aumento en temperatura o una centrifugación. Dicho paso se puede efectuar antes, durante o después de la adición de la cuando menos una hidrofobina o derivado de la misma. De conformidad con otra modalidad, la presente invención, por lo tanto, se relaciona con un método como se describió anteriormente, en donde el método comprende, antes o después de la adición de la cuando menos una hidrofobina o el cuando menos un derivado de la misma, aumentar la temperatura de la composición que comprende cuando menos dos fases líquidas. De conformidad con la invención, las hidrofobinas o derivados de la misma se pueden añadir, por ejemplo, a formulaciones que comprenden combustibles líquidos o combustibles. Esto permite que ocurra la segregación rápida cuando la formulación se pone en contacto con agua, o impide la formación de emulsiones. La formación de emulsiones en tanques de almacenamiento, por ejemplo, haría necesario someter la formulación a pasos de purificación elaborados. Asimismo es ventajoso añadir hidrofobinas o derivados de las mismas a petróleos crudos, por ejemplo, para prevenir la formación de emulsiones. A este respecto, la formulación que comprende combustibles líquidos o combustibles, dentro del contexto de la presente invención, puede comprender aditivos adicionales que están presentes de manera acostumbrada en formulaciones de esta naturaleza. Los aditivos apropiados se especifican, por ejemplo, en WO 2004/087808. La presente invención, por lo tanto, también se relaciona con una formulación que comprende cuando menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en combustibles líquidos, combustibles, petróleos crudos o soluciones de polímero solubles en agua o solubles en aceite y cuando menos una hidrofobina o derivados de la misma. La cantidad de la hidrofobina o derivado de la misma empleada puede variar, dependiendo de las otras substancias añadidas, en tanto que se asegure una mejora en separación de fase cuando la formulación se pone en contacto con agua. De conformidad con la invención, la cantidad de la hidrofobina o derivado de la misma empleada está de preferencia en la escala de 0.0001 a 1000 ppm, de preferencia de 0.001 a 500 ppm, particularmente de preferencia de 0.01 a 100 ppm. La presente invención, por lo tanto, también se relaciona con una formulación como se describió anteriormente, en donde la hidrofobina o el derivado de la misma está presente en la formulación en una cantidad de 0.0001 a 1000 ppm, basada en la formulación total. Si la formulación es una mezcla que comprende un petróleo crudo, la hidrofobina o derivado de la misma se añade a esta formulació, como regla, en una cantidad de 1 a 1000 ppm, de preferencia de 1 a 800 ppm, en particular de 10 a 500 ppm.

Si la formulación es una mezcla que comprende combustibles líquidos o combustibles, la hidrofobma o derivado de la misma se añade a esta formulación, como regla, en una cantidead de 0.001 a 0.5 ppm, de preferencia de 0.005 a 0.3 ppm, en particular de 0.01 a 0.2 ppm. Por lo tanto, de conformidad con otra modalidad, la presente invención se relaciona con una formulación como se describió anteriormente, en donde la formulación comprende cuando menos un combustible líquido o combustible y la hidrofobma o el derivado de la misma está presente en la formulación en una cantidad de 0.001 a 0.5 ppm, basada en la formulación total. Dentro del contexto de la presente invención, los combustibles se entienden como siendo, por ejemplo, aceites de calentamiento ligero, medio o pesado. Dentro del contexto de la presente invención, los combustibles líquidos se entienden como siendo, por ejemplo, gasolinas, combustibles diesel o combustibles de turbina. Son de preferencia particularmente gasolinas. Los combustibles líquidos pueden comprender aditivos adicionales. La persona experta en principio está familiarizada con aditivos acostumbrados. Aditivos y solventes apropiados se especifican, por ejemplo, en WO 2004/087808. De conformidad con la invención, los aditivos que tienen un efecto detergente y) ¡/o que tienen un efecto de inhibición de desgaste de asiento de válvula (denominados aditivos detergentes en lo que sigue) son, por ejemplo, apropiados para uso como componentes aditivos adicionales. Este aditivo detergente posee cuando menos un residuo de hidrocarburo hidrofóbico que tiene un peso molecular promediado en número Mn de 85 a 20,000 g/mol y cuando menos un agrupamiento polar seleccionado de: (a) grupos monoamino o poliamino que tienen hasta 6 átomos de nitrógeno, con cuando menos un átomo de nitrógeno poseyendo propiedades básicas; (b) grupos nitro, si es apropiado, en combinación con grupos hidroxilo; (c) grupos hidroxilo en combinación con gñrupos monoamino o poliamino, con cuando menos un átomo de nitrógeno que posee propiedades básicas; (d) grupos carboxilo o sus sales de metal alcalino o metal alcalino terreo; (e) grupos de ácido sulfónico o sus sales de metal alcalino o metal alcalino terreo; (f) agrupaciones polioxi-C2 a alquileno-C4 que están terminadas por grupos hidroxilo, grupos monoamino o poliamino, con cuando menos un átomo de nitrógeno que posee propiedades básicas, o grupos carbamato, (g) grupos de éster carboxílico; (h) agrupaciones derivadas de anhídrido succínico que poseen grupos hidroxilo y/o amino y/o amido y/o imido; y/o (i) agrupaciones producidas por la reacción de Mannich de fenoles substituidos con aldehidos y monoaminas o poliaminas. El residuo de hidrocarburo hidrofóbico en los aditivos detergentes anteriores, cuyo residuo es responsable para la solubilidad adecuada en el combustible líquido, tiene un peso molecular promediado en número (Mn) de 85 a 20,000, en particular de 113 a 10,000, especialmente de 300 a 5000. Los residuos de polipropenilo, polibutenilo y poliisobutenilo, que tienen en cada caso un Mn = 300 a 5000, en particular 500 a 2500, especialmente 700 a 2300, se tomen en consideración como residuos de hidrocarburo hidrofóbicos típicos, en particular en combinación con los agrupamientos polares (a) , (c) , (h) e (i) . Lo siguiente se puede mencionar como ejemplos de los grupos anteriores de aditivos detergentes.

Aditivos que comprenden grupos monhoamino o poliamino (a) son de preferencia monoaminas de polialqueno o poliaminas de polialqueno basadas en polipropileno o polibuteno convencional (es decir, que posee enlaces dobles que están principalmente colocados centralmente) o poliisobuteno que tienen un Mn de 300 a 5000. si polibuteno o poliisobuteno que tienen enlaces dobles que están colocados predominantemente de manera central (usualmente en las posiciones beta y gamma) se usan como el material de partida para preparar los aditivos, las rutas de preparación mediante cloración y luego aminación o mediante oxidación del enlace doble con aire u ozono para proporcionar el compuesto carbonilo o carboxilo y luego aminar bajo condiciones reductivas (hidrogenación) son entonces apropiados. En este caso, las aminas, tales como amoníaco, monoaminas o poliaminas, tales como dimetilaminopropilaraina, etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetramina o tetraetilenpentamina se pueden usar para la aminación. Aditivos correspondientes basados en polipropileno se describen, en particular, en WO 94/24231. Otros aditivos preferidos que comprenden grupos monoamino (a) son los productos de hidrogenación de los productos que se suscitan de la reacción de poliisobutenos que tienen un grado promedio de polimerización P *= 5 a 100 con óxidos de nitrógeno o mezclas de óxido de nitrógeno y oxígeno, como se describen, en particular, en WO 97/03946. Otros aditivos preferidos que comprenden grupos monoamino (a) son los compuestos que se pueden obtener de epóxidos de poliisobuteno mediante reacción con aminas y deshidratación y reducción subsecuentes de los alcoholes amino, como se describen, en particular, en DE-A 196 20 262. Los aditivos que comprenden grupos nitro (b) , si es apropiado en combinación con grupos hidroxilo, son de preferencia productos de la reacción de poliisobutenos que tienen un grado promedio de polimerización P = 5 a 100 o 10 a 100 con óxidos de nitrógeno o mezclas de óxidos de nitrógeno y oxígeno, como se describen, en particular, en WO 96/03367 y WO 96/03479. Estos productos de reacción, como regla, son mezclas de nitropoliisobutenos puros (vgr., alfa, beta-dinitropoliisobuteno) e hidroxinitropoliisobutenos mixtos (v.gr., alfa-nitro-beta-hidroxipoliisovuteno) . Los aditivos que comprenden grupos hidroxilo en combinación con grupos monoamino o poliamino (c) son, en particular, productos de la reacción de epóxidos de poliisobuteno que se pueden obtener de poliisobuteno que posee enlaces dobles que de preferencia son predominantemente terminales y tiene un Mn = 300 a 5000 usando amoníaco o monoaminas o poliaminas, son como se describe, en particular, en EP-A 0 476 485. Los aditivos que comprenden grupos carboxilo o sus sales dee metal alcalino o metal alcalino terreo (d) son de preferencia copolímeros de olefinas de C2-C40 con anhídrido maleico que tiene una masa molar total de 500 a 10,000 cuyos grupos carboxilo se hacen reaccionar total o parcialmente para proporcionar sales de metal alcalino o metal alcalino terreo y un resto de los grupos carboxilo haciéndose reaccionar con alcoholes o aminas. Estos aditivos se describen, en particular, en EP-A 0 307 815. Los aditivos de esta naturaleza se usan principalmente para prevenir el desgaste de asiento de válvula y pueden, como se describe en WO 87/01126, emplearse ventajosamente en combinación con detergentes de combustible acostumbrados tales como poli (iso) butenaminas o aminas de poliéter. Los aditivos que comprenden grupos de ácido sulfónico o sus sales de metal alcalino o metal alcalino terreo (e) son de preferencia sales de metal alcalino o de metal alcalino terreo de un sulfosuccinato de alquilo, como se describe, por ejemplo, en EP-A 0 639 632. Los aditivos de esta naturaleza se usan principalmente para prevenir el desgaste de asiento de válvula y se pueden emplear ventajosamente en combinación con detergentes de combustible acostumbrados tales como poli (iso) ubtenaminas o aminas de poliéter. Los aditivos que comprenden agrupaciones de polioxi-C2-C4-alquileno (f) son de preferencia poliéteres o aminas de poliéter que se pueden obtener haciendo reaccionar alcanoles de C2-C60, alquendioles de C6-C30, mjono- o di-alquilaminas de C2-C30, alquiciclohexanoles de C1-C30 o alquilfenoles de C1-C30 con de 1 a 30 moles de óxido de etileno y/u óxido de propileno y/u óxido de butileno por grupo hidroxilo o grupo amino y, en el caso de las aminas de poliéter, mediante aminación reductiva subsecuente con amoníaco, monoaminas o poliaminas. Los productos de esta naturaleza se describen, en particular, en EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 y Us 4,877,416. En el caso de poliéteres, estos productos también satisfacen las calidades de petróleo de flotación. Ejemplos típicos a este respecto son tridecanol o butoxilatos de isotridecanol, butoxilatos de isononilfenol y butoxílatos de poliisobutenol y propoxilatos así como los productos correspondientes de reacción con amoníaco. Los aditivos que comprenden grupos de éster carboxílico (g) de preferencia son esteres de ácidos de mono-di- o tricarboxílicos con alcanoles o polioles de cadena larga, en particular aquellos que tienen una viscosidad mínima de 2 mm2/s a 100°C, como se describen, en particular, en DE-A 38 38 918. Los ácidos mono-, di- o tricarboxílicos que se pueden usar son ácidos alifáticos o aromáticos, mientras que alcoholes o polioles de éster apropiados son, en particular representantes de cadena larga que tienen, por ejemplo, de 6 a 24 átomos de C. Los adipatos, ftalatos, isoftalatos, tereftalatos y trimelitatos de isooctanol, isononanol, isodecanol e isotridecanol son representantes típicos de los esteres. Los productos de esta naturaleza también satisfacen la calidades de petróleo de flotación. Los aditivos que comprenden agrupaciones derivadas de anhídrido succínico que tienen grupos hidroxilo y/o amino y/o amido y/o imido (h) son de preferencia derivados correspondientes de anhídrido poliisobutenilsuccínico que se puede obtener mediante la reacción de poliisobuteno convencional o altamente reactivo que tiene un Mn = 300 a 5000 con anhídrido maleico ya sea por medio de calentamiento o a través del poliisobuteno clorado. Son de interés particular a este respecto derivados con poliaminas alifáticas tales como etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetraamina, o tetraetilenpentamina. Los aditivos de gasolina de esta naturaleza se describen, en particular, en US 4,849,572. Los aditivos que comprenden las agrupaciones (i) producidas por la reacción de Mannich de fenoles substituidos con aldehidos y monoaminas o poliaminas son de preferencia productos de la reacción de fenoles substituidos con poliisobuteno con formaldehído y monoaminas o poliaminas tales como etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetraamina, tetraetilenpentamina o dimetilaminopropilamina. Los fenoles substituidos con poliisobutenilo se pueden derivar de poliisobuteno convencional o altamente reactivo que tiene un Mn = 300 a 5000. "Las bases de Mannich de poliisobuteno" de esta naturaleza se describen, en particular, en EP-A 0 831 141. Para el propósito de definir más precisamente los aditivos de gasolina individuales que se enumeran, las exposiciones de los documentos arriba mencionados del ramo anterior se incorporan expresamente en la presente por referencia. A este respecto, dichos aditivos se emplean en cantidades que parecen apropiadas a la persona experta para la aplicación determinada.

Además de esto, las formulaciones' de conformidad con la invención también se pueden combinar con otros componentes y aditivos acostumbrados. Los aceites de flotación sin ningún efecto detergente pronunciado se pueden mencionar aquí por vía de ejemplo. Los aceites de flotación minerales apropiados son fracciones que crecen en conexión con procesamiento de aceite mineral, tal como lubricante de petróleo residual, o aceites de base que tienen viscosidades tales como, por ejemplo, de la clase SN 500-2000; y también hidrocarburo aromático, hidrocarburos parafínicos y alcoxialcanoles. Una fracción que crece en conexión con refinación de petróleo mineral y se conoce como "petróleo de hidrofisuración" (corte de destiladoal vacío que tiene una escala de ebullición de alrededor de 360 a 500°C y que se puede obtener de petróleo mineral natural que se ha hidrogenado catalíticamente e isomerizado bajo presión elevada y también desparafinados) es asimismo apropiado de conformidad con la invención. Mezclas de los petróleos de flotación mineral arriba mencionados también son apropiados. Los ejemplos de petróleos de flotación sintéticos que se pueden usar de conformidad con la invención se seleccionan de: poliolefinas (poli alfa olefinas o poli olefinas internas), (poli) esteres, (poli) alcoxilatos, poliéteres, aminas de poliéter alifáticos, poliéteres iniciados con alquilfenol, aminas de poliéter iniciadas con alquilfenol y esteres carboxílicos de alcanoles de cadena larga. Los ejemplos de poliolefinas apropiadas son polímeros de olefina que tienen un Mn = 400 a 1800, especialmente sobre una base de polibuteno o poliisobuteno (hidrogenadas o no hidrogenadas). Los ejemplos de poliéteres apropiados o aminas de poliéter son, de preferencia, compuestos que comprenden agrupaciones de polioxi-C2-C4-alquileno y que se pueden obtener haciendo reaccionar alcanoles de C2-C60, alcandioles de C6-C30, mono- o dialquilaminas de C2-C30, alquilciclohexanoles de C1-C30, o alquilfenoles de C1-C30 con de 1 a 30 moles de óxido de etileno y/u óxido de propileno y/u óxido de butileno por grupo hidroxilo o grupo amino, y en caso de las aminas de poliéter, mediante aminación reductiva subsecuente con amoníaco, monoaminas o poliaminas. Los productos de esta naturaleza se describen, en particular, en EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 y US 4,877,416. Los ejemplos de polieteraminas que se pueden usar son aminas de óxido de poli-C2-C6. -alquileno, o derivados funcionales de las mismas. Los ejemplos típicos de este son tridecanol o butoxilatos de isotridecanol, butoxilatos de isononilfenol y butoxilatos y propoxilatos de poliisobutenol, así como los productos de reacción correspondientes con amoníaco. Los ejemplos de esteres carboxílicos de alcanoles de cadena larga son, en particular, esteres de ácidos mono-, di- o tricarboxílicos con alcanoles o polioles de cadena larga, como se describen, en particular, en DE-A 38 38 918. Los ácidos mono-, di- o tricarboxílicos que se pueden usar son ácidos alifáticos o aromáticos, mientras que los alcoholes de éster apropiados o polioles son, en particular, representantes de cadena larga que tienen, por ejemplo, de 6 a 24 átomos de C. Los representantes típicos de los esteres son adipatos, ftalatos, isoftalatos, tereftalatos y trimelitatos de isooctanol, isononanol, isodecanol e isotridecanol, tal como por ejemplo, di (n- o iso-tridecil) ftalato. Los ejemplos de otros sistema se petróleo de flotación apropiados se describen en DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074, EP-A 0 452 328 y EP-A 0 548 617, que se incorporan expresamente por la presente por referencia. Los ejemplos de petróleos de flotación sintéticos particularmente apropiadeos son poliéteres iniciados con alcohol que tienen de alrededor de 5 a 35, por ejemplo de alrededor de 5 a 30, unidades de óxido de alquileno de C3-C6, que se seleccionan, por ejemplo, de óxido de propileno, óxido de n-butileno, y unidades de óxido de i-butileno, o mezclas de los mismos. Los ejemplos no limitativos de alcoholes iniciadores apropiados son alcanoles de cadena larga o fenoles substituidos con alquilo de cadena larga, con el radical alquilo de cadena larga en particular siendo un radical alquilo de C6-C18 de cadena recta o ramificada. El tridecanol y nonilfenol se pueden mencionar como ejemplos preferidos. Aceites de flotación sintéticos apropiados adicionales son alquilfenoles alcoxilados, como se describen en DE-A 10 102 913.6. A este respecto, los aceites de flotación se emplean en cantidades que parecen apropiadas a la persona experta para la aplicación determinada. Otros aditivos acostumbrados son inhibidores de corrosión, por ejemplo basado en sales de amonio de ácidos carboxílicos orgánicos, cuyas sales tienden a formar películas, o en compuestos aromáticos heterocíclícos en el caso de protección de corrosión de metal no ferroso; antioxidantes o estabilizadores, por ejemplo basados en aminas tales como p-fenilendíamina, diciciohexilamina, o derivados de los mismos, o en fenoles tales como 2,4-di-ter-butilfenol o ácido 3, 5-di-ter-butil-4-hidroxifenilpropiónico; desemulsionantes convencionales adicionales; agentes antiestáticos; metalocenos tales como ferroceno; tricarbonilo de metilciclopentadienil manganeso; aditivos de lubricidad tal como ciertos ácidos grasos, esteres alquenilsuccínicos, aminas de bis (hidroxialquilo) grasas, hidroxiacetamidas o aceite de ricdino; y también tintes (marcadores) . Si es apropiado, las aminas también se añaden para el propósito de reducir el pH del combustible líquido. Dichos aditivos detergentes que contienen las agrupaciones polares (a) a (i) se añaden de manera acostumbrada al combustible líquido en una cantidad de 10 a 5000 ppm en peso, en particular de 50 a 1000 ppm en peso. Los otros componentes y aditivos mencionados, si se desea, se añaden en cantidades que son acostumbradas para este propósito. Los combustibles líquidos y combustibles que son apropiados de conformidad con la invención son cualesquiera combustibles líquidos y combustibles conocidos a la persona experta, por ejemplo gasolinas como se describen, por ejemplo, en Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5a edición, 1990, Volumen A16, p"ag. 719ff. El combustible líquido diesel, queroseno y combustible de chorro también son combustibles apropiados de conformidad con la invención. En particular, una gasolina que tiene un contenido de compuesto aromático de cuando mucho 60, por ejemplo cuando mucho 42% en volumen, y un contenido de azufre de cuando mucho 2000, por ejemplo cuando mucho 150 ppm en peso, es apropiada. El contenido de compuesto aromático de la gasolina es, por ejemplo, de 10 a 50, por ejemplo de 30 a 42% en volumen, en particular de 32 a 40% en volumen. El contenido de azufre de la gasolina es, por ejemplo, de 2 a 500, por ejemplo de 5 a 150 ppm en peso, o de 10 a 100 ppm en peso. Además, una gasolina apropiada, por ejemplo, puede tener un contenido de olefina de hasta 50% en volumen, por ejemplo de 6 a 21% en volumen, en particular de 7 a 18% en volumen; un contenido de benceno de hasta 5% en volumen, pro ejemplo de 0.5 a 1.0% en volumen, en particular de 0.6 a 0.9% en volumen, y/o un contenido de oxígeno de hasta 25% en peso, por ejemplo de hasta 105 en peso o de 1.0 a 2.75 en peso, en particular de 1.2 a 2.05 en peso. En particular, se puede hacer mención, por vía de ejemplo, de gasolinas que simultáneamente tienen un contenido de compuesto aromático de cuando mucho 38% en volumen, un contenido de olefina de cuando mucho 21% en volumen, un contenido de azufre de cuando mucho 50 OO en peso, un contenido de benceno de cuando mucho 1.05 en volumen y un contenido de oxígeno de 1.0 a 2.7% en peso. El contenido de alcoholes y éteres en la gasolina puede variar a través de una escala amplia. Los ejemplos de contenidos máximos típicos son 15% en volumen en el caso de metanol, 65% en volumen en el caso de etanol, 205 en volumen en el caso de isopropanol, 15% en volumen en el caso de ter-butanol, 205 en volumen en el caso de isobutanol y 30% en volumen en el caso de éteres que tienen 5 o más átomos de c en la molécula. La presión de vapor Sommer de una gasolina que es apropiada de conformidad con la invención es de manera acostumbrada cuando mucho 70 kPa, en particular 60 kPa (en cada caso 37°C) . Como regla, el RON de la gasolina es de 75 a 105. una escala acostumbrada para el MON correspondiente es de 65 a 95. Las especificaciones se determinan usando métodos acostumbrados (DIN EN 228) .

La invención se explica con mayor detalle abajo por medio de ejemplos. Ejemplos Ejemplo 1 Trabajo preliminar para clonar yaad-His6/yaaE-His6 Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa usando los oligonucleótidos Hal570 y Hal571 (Hal 572/Hal 573) . El ADN genómico de la bacteria Bacillus subtilis se usó como el ADN de plantilla. El fragmento de PCR resultante comprendió la secuencia de codificación del gene de Bacillus subtilis yaaD/yaaE y en cada caso un Ncol y, respectivamente sitio de separación de restricción de Bglll en los extremos. El fragmento de PCR se purificó y cortó con las endonucleasas de restricción Ncol y Bglll. Este fragmento de ADN se usó como una inserción y se clonó hacia el vector Qiagen pQE60, que se ha linealizado previamente con las endonucleasas de restricción Ncol y Bglll. Los vectores se obtuvieron de esta forma, es decir, pQE60YAAD#2/-pQE60YaaE#5, se pueden usar para expresar proteínas que comprenden YAAD::HIS6 y, respectivamente, YAAE::HIS6. Hal570 : gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagcdgcgttcttgcatac Hal572 : ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573 : gcagatcttacaagtgccttttgc5ttatattcc Ejemplo 2 Lonación de hidrofobina yaad DewA-His6 Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa usando los oligonucleótidos KaM 416 y KaM 417. el ADN genómico del molde Aspergillus nidulans se usó como el ADN de plantilla. El fragmento de PCR resultante compredió la secuencia de codificación del gene de hidrofobina dewA y una secuencia que codifica un factor N-terminal Xa de sitio de separación de proteinaza. El fragmento de PCR se purificó y cortó con la endonucleasa de restricción BamHl. Este fragmento de ADN se usó como una inserción y se clono en el vector pQE60YAAD#2, que se había linealizado previamente con la endonucleasa de restricción Bglll. El vector #508, que se obtuvo de esta manera, se puede usar para expresar una proteína de fusión que comprende YAD: :Xa: :dewA: :HIS6. KaM416 : GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417 : CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC Ejemplo 3 Clonación de hidrofobina yaad RodA-His6 El plásmido #513 se clonó en analogía con el plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM 434 y KaM 435.

KaM434 : GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435 : CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Ejemplo 4 Clonación de yadd-hidrofobina BASFl-Hise El plásmidop #507 se clonó en analogía con el plásmicdo #508 usando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. Una secuencia de ADN artificialmente sintetizada, es decir, hidrofobina BASFl, se usó como el ADN de plantilla (ver Anexo, SEC ID NOS 11 y 12) . KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418 : CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 5 Clonación de yaad-hidrofobina BASF2-HÍS6 El plásmido #506 se clonó en analogía con el plásmido#508 usando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. Una secuencia de ADN artificialmente sintetizada, es decir, hidrofobina BASF2, se usó comoel ADN de plantilla (ver Anexo, SEQ ID NOS. 13 y 14) . KaM417 : CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC Kaitl418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 6 Clonación de yaad-hidrofobina SC3-Hisd El plásmido #526 se clonó en analogía con el plásmido #508 usando los oligonucleótidos KaM464 y KaM465. Se usó cADN de Schyzophyllum commune como el ADN de plantilla (ver Anexo, SEC ID NOS. 9 y 10) . KaM464 : CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT Ejemplo 7 Fermentación de la cepa de E.coli recombinante yaad-hidrofobina DewA-Hisß Inoculación de 3 ml demedio líquido Lb con una cepa de E.coli que expresa yaad-hidrofobina DewA-His6 - en tubos Greiner de 15 ml . Incubación a 37°C durante 8 horas en un agitador a 200 rpm. En cada caso 2 matraces Erlenmeyer de 21 que poseen tabiques de desviación y que contienen 250 ml de medio LB (+ 100 ug de ampicilina/ml) se inocularon con en cada caso 1 ml del cultivo preliminar y se incubaron a 37 °C durante 9 h en un agitador a 180 rpm. 13.5 1 de medio LB (+100 ug de ampicilina/ml) en un fermentador de 20 1 se inoculan con 0.5 1 de cultivo preliminar (OD60on 1:10 medido contra H20) . 140 ml de 100 mM de IPTG se añaden a un OD50nm de -3.5. Después de 3 h, el fermentador se enfría a 10°C y el caldo de fermentación se centrífuga. El granulo de célula se usa para la purificación adicional .

Ejemplo 8 Purificación de la proteína de fusión de hidrofobina recombinante (Purificación de proteínas de fusión de hidrofobina que poseen una etiqueta C-terminal His6) . 100 g de granulo de célula (100-500 mg de hidrofobina) se forman hasta un volumen total de 200 ml con 50 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7.5, y se resuspendieron. La suspensión se trata con un Ultraturrax tipo T25 (Janke and Kunkel; IKA-Labortechnik) durante 10 minutos y luego se incuban con 500 unidades de Benzonase (Marek, Marmstadt; Orden No. 1.01697.0001, a temperatura ambiente durante 1 hora, a fin de romper los ácidos nucleicos. Antes de la disrupción de célula, se lleva a cabo la filtración usando un cartucho de vidrio (Pl) . Dos corridas de homogeneizador a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH, Microfluidics Corp.) se llevan a cabo a fin de interrumpir las células y cortar el ADN genómico restante. El homogenado se centrífuga (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, copas de centrifugación de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12,000 rpm, 23,000 g) , el sobrenadante se coloca sobre hielo y el granulo se resuspende en 100 ml de tampón de fosfato de sodio, pH 7.5. La centrifugación y resuspensión se repiten tres veces, con el tampón de fosfato de sodio comprendiendo 1% de SDS para la tercera repetición. Después de la resuspensión, la mezcla se agita durante una hora y se lleva a cabo una centrifugación final (Sorvall RC-5B, rotor GSA, copas decentrifugación de250 ml, 60 minutos, 4°C, 12,00 rpm, 23,000 g) . El análisis de SDS-PAGE indica que, después de la centrifugación final, la hidrofobina está en el sobrenadante (Figura 1) . Los experimentos muestran que la hidrofobina está probablemente presente en la forma de cuerpos de inclusión en las células de E.coli correspondientes. 50 ml del sobrenadante que comprende hidrofobina se cargan en una columna de 50 ml de n'ñiquel-Sefarosa de alto funcionamiento 17-5268-02 (Amersham) que se equilibró con 50 mM de Tris-Cl, pH 8.0, tampón. La columna se lava con 50 mM de tampón de Tris-Cl, pH 8.0, y la hidrofobina luego se eluye con 50 mM de tapón deTris-Cl, pH 8.0, que comprende 200 M de imidazol. A fin de remover el imidazol, la solución se dializa contra 50 mM de Tris-Cl, pH 8.0, tampón. La Figural muestra la purificación de la hidrofobina que se preparó: Vía A: Material cargado en la columna de níquel-sefarosa (diluido 1:10) Vía B: Flujo pasante = eluato de paso de lavado Vías C-E: máximas de OD 280 de las fracciones de elución (WP1, WP2, WP3) La Vía F muestra el marcador aplicado. La hidrofobina en la Figura 1 tiene un peso molecular de aproximadamente 53 kD. Algunas de las bandas menores representan productos de interrupción de la hidrofobina Ejemplo 9 Prueba de Aplicación; caracterización de la hidrofobina mediante el cambio en el ángulo de contacto de una gota de agua sobre vidrio Substrato: Vidrio (vidrio de ventana, Süddeutsche Glas, Mannheim) : Se usó la hidrofobina que se purificó como se describe en el ejemplo 8. concentración de la hidrofobina en la solución: 100 ug/ml, la solución comprendió adicionalmente 50 mM de tampón de acetato de Na y también 0.1% de monolaurato de polioxietileno (20) (Tween® 20)), pH de la solución: 4 plaqueta de vidrio sumergida en esta solución durante la noche (tempeatura 80°C) después de eso, la plaqueta de vidrio revestida con hidrofobina se separó de la solución y se lavó en agua destilada, después de eso, la incubación, 10 min/80°C/l% de solución de SDS, en agua destilada lavado renovado en agua destilada después de eso, incubado a 80°C durante 10 min/1% de solución de SDS en agua destilada lavado nuevamente en agua destilada Las muestras se secan en aire y el ángulo de contacto (en grados) de una gota de 5 ul de agua con la superficie de vidrio revestida se determina a temperatura ambiente . La medición de ángulo de contacto se realizó en un instrumento Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0 (noviembre de 2002). La medición se llevó a cabo de conformidad con las instrucciones del fabricante. El vidrio no tratado dio un ángulo de contacto de 30 + 5°; La plaqueta de vidrio revestida con la hidrofobina de conformidad con el Ejemplo 8 (yaad-dewA-hisß) dio un ángulo de contacto de 75 + 5°. "^ aumento en el ángulo de contacto: 45°.

Ejemplo 10 Uso de concentrado de hidrofobina (yaad-Xa-dewA-Hisß) como un aditivo en combustibles líquidos Principio del experimento: Los combustibles líquidos modernos comprenden de forma acostumbrada un número de aditivos diferentes (los que se llaman paquetes de aditivo) . Si, durante el curso de su producción o ruta de mercadeo, el combustible líquido se pone en contacto con agua, estos aditivos pueden mostrar un efecto emulsionante y conducir a la formación de emulsiones de combustible líquido-agua no deseables. A fin de evitar este efecto, los desemulsionantes por lo tanto se añaden en forma acostumbrada a los combustibles líquidos. Los experimentos de desmulsionación se llevaron a cabo usando un concentrado de hidrofobina como se describe en el Ejemplo 8 (SEC ID NOS. 19 y 20) . El concentrado de hidrofobina se diluyó con etanol y se añadió a un combustible Eurosuper comercialmente disponible (de conformidad con EN 228) que ya comprendía 725 mg de un paquete de aditivo de funcionamiento especial A/kg. Este paquete de aditivo comprende principalmente el Kerocom PIBA de poliisobutenamina, mezclas de aceite de flotación, solventes, inhibidor de corrosión y modificador de fricción.

Las muestras de combustible líquido que comprenden 0.01, 0.03, 0.05, 0.07, 0.14 y 0.28 mg de hidrofobina/kg se prepararon. El combustible líquido al que solamente se había añadido A, y que no contenía hidrofobina, sirvió como referencia (10 - VI) . En otro experimento comparativo (10 -V2) , 1.45 mg de un desemulsionante D comercialmente disponible basado en las resinas de fenol (ADX 606, de Lubrizol) se usaron/kg. Las pruebas de emulsión se llevaron a cabo de conformidad con DIN 51415 usando cada una de las muestras de combustible líquido. A este respecto, en cada caso, 80 ml de combustible líquido y 20 ml de agua se mezclaron completamente entre sí. Después de eso, el proceso de desmezclado dependiente de tiempo se observó. El análisis ocurre usando normas que están preestablecidas en la norma, con 1 representando muy buen desmezclado y números mayores representando desmezclado cada vez más inferior. Los detalles están contenidos en la norma DIN citada. El Cuadro 1 resume los resultados obtenidos en los experimentos. El cuadro enumera las determinaciones de las capas de separación de fase que en cada caso están hechas después de 1 min, 5 min, 30 min y 60 min. Como regla, una determinación de 1 o lb después de 5 minutos se demanda.

Comentario: Solamente se observa una desemulsionación muy lenta cuando no se añade desemulsionante. La determinación 4 es inaceptable; se forma una emulsión estable. Las hidrofobinas exhiben un efecto desemulsionante muy bueno cuando está presente en cantidades extremadamente pequeñas. 0.01 ppm de hidrofobina es suficiente para conducir a un resultado aceptable dentro de 1 ín. 1.45 mg del desemulsionante comercialmente disponible basado en resinas de fenol tienen que añadirse a cada kg de combustible líquido a fin de lograr el mismo efecto que aquel logrado con 0.07 mg de hidrofobina/kg. Consecuentemente, cuando se usa hidrofobina, solo aproximadamente 1/20 de la cantidad de un desemulsionante convencional se requiere a fin de lograr el mismo efecto Ejemplo comparativo 11 Uso de otras proteínas como aditivos en combustibles líquidos Se probaron proteínas sin hidrofobina para uso en combustibles líquidos en analogía con el ejemplo 10. Los experimentos se llevaron a cabo usando albúmina de suero bovino (BSA) y caseína. Estas proteínas están comercialmente disponibles, el yaad se ilustra en SEC ID No. 15 y 16, es decir, el socio de fusión por sí solo sin estar enlazado a una hidrofobina, también se usó. La proteína respectiva se añadió, a una concentración de 0.07 mg/kg, a un combustible líquido Eurosuper comercialmente disponible (de conformidad con EN 228) que ya comprendía 1000 mg del paquete A/kg de aditivo de funcionamiento arriba mencionado. El combustible al que solamente A, y ninguna proteína, se había añadido sirvió como la referencia. Las pruebas de emulsión se llevaron a cabo en cada caso de conformidad con DIN 51415, como se describe arriba, Cuadro 2 Comentario: Sin la adición de un desemulsionante, la separación de la emulsión prosigue justo tan lentamente como en el ejemplo 10. La determinación 4 es inaceptable; se forma una emulsión estable. Mientras que las proteínas que se usan tienen un efecto desemulsionante, el régimen de la desemulsionación es inferior a cuando se usan hidrofobinas. Ejemplo 12 Uso de un concentrado de hidrofobina (Yaad-Xa-dewA-Hisß) como un ruptor de emulsión para petróleo crudo. El experimento se llevó a cabo usando un concentrado de hidrofobina como se describe en el Ejemplo 8 (SEC ID NOS. 19 y 20) . En los experimentos que se llevaron a cabo, diversas cantidades de concentrado de hidrofobina se añadieron a 50 ml de petróleo crudo (muestra ex Wintershall AG, Emlichheim, pozo 301; contenido de agua residual después de usar desemulsionantes convencionales, aproximadamente 3%). La concentración de la hidrofobina en el petróleo crudo fue 1 ppm, 10 ppm y 40 ppm. Después de la homogeneización, lasmezclas se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos. Los resultados se proporcionan en el Cuadero 3. Cuadro 3 Después de 10 y 40 ppm de concentrado de hidrofobina se hubieron añadido, la fase de agua libre formó el componente principal . Ejemplo 13 Uso de un concentrado de hídrofobina (Yaad-Xa-dewA-His6) para polímeros de fraccionación El experimento se llevó a cabo usando un concentrado de hidrofobina como se describe en el Ejemplo 8 (SEC ID NOS 19 y 20) . En cada caso, 150 g de un ácido poliacrílico enh la forma de una sal de sodio (Sokalan® CP 10 S; Mw 4000 g/mol, de conformidad con DE 199 50 941 Al9 se introdujeron inicialmente en vasos picudos de vidrio después de lo cual se añadieron 75 g de isopropanol en cada caso. Las mezclas se agitaron durante 5 minutos, después de lo cual en cada caso 146 g de isopropanol/agua (en una relación de 1/1) se añadieron y las mezclas se añadieron durante 5 min. 50 ppm de hidrofobina (1.64 m, 11.3 mg/ml) se añadieron a un vaso picudo A de vidrio y la mezcla se agitó durante 5 minutos. La hidrofobina produjo bandas blancas en la solución clara, con las bandas siendo luego completamente disueltas después de 5 minutos. 59.75 g de NaOH al 50% se añadieron a ambos vasos picudos de vidrio y las mezclas se agitaron durante 15 min. Una solución lechosa se formó inmediatamenteen presencia déla hidrofobina mientras que se formó una solución fuertemente opaca en ausencia de hidrofobina añadida. Después de un tiempo de agitación de 15 minutos, los contenidos de los vasos picudos de vidrio fueron en cada caso transferidosa un embudo de separación de 500 ml, después de lo cual los embudos se agitaron brevemente y se observó que determinan la longitud de tiempo tomada para que las fases se separen. En el caso de la muestra que comprende hidrofobina, se vio una separación de fase clara después de 10 minutos; en ausencia de hidrofobina añadida, una "capa intermedia" espumosa se formó inicialmente; que es un límite de fase clara no se3 formó. En ausencia de hidrofobina añadida, un límite de fase clara solamente se formó después de 40 minutos. Período de separación hasta que apareció un límite de fase agudo: con hidrofobina: 12 minutos sin hidrofobina: 40 minutos Ejemplo 14. Ejemplo comparativo 15 Uso de una fusión de hidrofobina (Yaad-Xa-dewA-His6) y albúmina de suero bovino (BSA) como desemulsionantes para una emulsión de aceite-agua a 55°C. El experimento se llevó a cabo usando un concentrado de hidrofobina como se describe en el ejemplo 8 (SEC ID Nos. 19 y 20) así como usando una solución comercialmente disponible de albúmina de suero bovino (BSA) . La capacidad de desemulsionación se probó como sigue: El aceite empleado fue un aceite hidráulico. 40 ml de agua destilada se introdujeron inicialmente en un cilindro medidor de 100 ml y la proteína relevante se añadió en una cantidad de 5 ppm basada en el agua o 2.5 ppm basada en el sistema total. 40 ml de aceite hidráulico luego se añadieron y el sistema se equilibró a 55 °C en un baño de agua. El tiempo de equilibrio de temperatura fue 20 minutos. Después de eso, el aceite y el agua se emulsionaron a 1500 rpm durante 5 minutos usando una mezcladora de aspas. Esto emulsiona el aceite en la fase de agua. Después de esto, se observó la separación de las fases. Aquella que se proporciona es en cada caso la cantidad de la fase de agua, en ml , que se reseparó. En una serie experimental, las soluciones acuosas de las dos proteínas se usaron sin cambiar. Los resultados se ilustran en la figura 2. En una segunda serie experimental, las soluciones de las dos proteínas primeros se ajustaron todas, a temperatura ambiente, a pH 1 usando HCl y luego se dejaron a pH 1 durante 24 h. Después de eso, se ajustaron nuevamente a pH 7 usando NaOH. Los resultados se ilustran en la figura 3. Desemulsionación de una emulsión de aceite-agua, usando 2.5 ppm de proteínas Comentario : BSA solamente mejora el régimen de la desemulsionhación de la emulsión de aceite-agua hasta un ligero grado en comparación con una muestra sin desemusionador . Por otra parte, una aceleración muy marcada en la dese ulsionación se observa cuando se añaden hidrofobinas .

Claims

REIVINDICACIONES 1. - El uso de cuando menos una hidrofobina para mejorar la separación de fase en una composición que comprende cuando menos dos fases líquidas. 2. - El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la cuando menos una hidrofobina se emplea como un desemulsionador . 3. - El uso de conformidad con la reivindicación 1 o 2 , en donde cuando menos una hidrofobina es una fusión de hidrofobina. 4.- El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la fusión de hidrofobina es cuando menos una selecciona del grupo de (SEC ID No.l 20), (SEC ID No : 22) y (SEC ID No: 24) . 5. - El uso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición que comprende cuando menos dos fases líquidas se selecciona del grupo que consiste en composiciones que comprenden aceite y agua, - composiciones que comprenden un combustible líquido o combustible y agua, mezclas de reacción que comprenden cuando menos dos fases líquidas. 6.- El uso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cuando menos una hidrofobina se emplea en una cantidad de 0.0001 a 1000 ppm, basada en la composición total . 7. - El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde la composición es una composición de petróleo crudo-agua y la cuando menos una hidrofobina se emplea en una cantidad de 1 a 800 ppm, basada en la composición total. 8.- El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde la composición es una composición de combustible líquido/combustible-agua y la cuando menos una hidrofobina se emplea en una cantidad de 0.001 a 10 ppm, basada en la composición total . 9.- el uso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde cuando menos un compuesto adicional que mejora la separación de fase se emplea además de la cuando menos una hidrofobina. 10.- Un método para separar cuando menos dos fases líquidas en una composición que comprende cuando menos dos fases líquidas, que comprende la adición de cuando menos una hidrofobina a la composición. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde la cuando menos una hidrofobina es una fusión de hidrofobina o un derivado de la misma. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la fusión de hidrofobina es cuando menos una seleccionada del grupo de (SEC ID No. 20), (SEC ID No. 22) y (SEC ID No: 24) . 13. - El método de conformidad con una de las reivindicaciones 10 a 12, en donde la composición que comprende cuando menos dos fases líquidas se selecciona del grupo que consiste de - composiciones que comprenden aceite y agua, composiciones que comprenden un combustible líquido o combustible y agua, mezclas de reacción que comprenden cuando menos dos fases líquidas. 14. - El método de conformidad con una de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la cuando menos una hidrofobina se emplea en una cantidad de 0.0001 a 1000 ppm, basada en la composición total 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la composición es una composición de petróleo crudo-agua y la cuando menos una hidrofobina se emplea en una cantidad de 1 a 800 ppm, basada en la composición total . 16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la composición es una composición de combustible líquido/combustible-agua y la cuando menos una hidrofobina se emplea en una cantidad de 0.001 a 10 ppm, basada en la composición total . 17.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 10 a 16, en donde el método comprende aumentar la temperatura de la composición que comprende cuando menos dos fases líquidas antes o después de añadir la cuando menos una hidrofobina. 18.- Una formulación, que comprende cuando menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en combustibles líquidos, combustibles, petróleos crudos o soluciones de polímero solubles en agua o solubles en aceite y cuando menos una hidrofobma, en donde la hidrofobma está presente en la formulación en una cantidad de 0.0001 a 1000 ppm, basada en la formulación total . 19.- La formulación de conformidad con la reivindicación 18, en donde la formulación comprende cuando menos un combustible líquido o combustible y la hidrofobina está presente en la formulación en una cantidad de 0.001 a 0.5 ppm, basada en la formulación total 20.- La formulación de conformidad con la reivindicación 19, en donde el combustible líquido o combustible es un combustible que se selecciona del grupo de gasolines, combustibles diesel y combustibles de turbina. 21.- La formulación de conformidad con una de las reivindicaciones 18 a 20, en donde la cuando menos una proteína es una proteína de fusión de hidrofobina. 22. - La formulación de conformidad con la reivindicación 21, en donde la fusión de hidrofobina es cuando menos una seleccionada del grupo de (SEC ID No: 20), (SEC I)D No: 22) y (SEC ID No: 24) .