KR20070118157A - 해유화제로서의 단백질의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2 이상의 액상을 포함하는 조성물의 상 분리를 개선하기 위한 1종 이상의 단백질, 특히 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체의 용도, 2 이상의 액상을 포함하는 조성물 중 2 이상의 액상을 분리하는 방법, 및 연료, 가연성 물질, 미정제 오일 또는 수용성 또는 지용성 중합체 용액 및 1종 이상의 단백질, 특히 1종 이상의 하이드로포빈 또는 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 제제에 관한 것이다.

Description

해유화제로서의 단백질의 용도{USE OF PROTEINS AS DEMULSIFYING AGENTS}
본 발명은 2 이상의 액상을 포함하는 조성물에서 상 분리를 개선하기 위한 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체, 2 이상의 액상을 포함하는 조성물에서 2 이상의 액상을 분리하는 방법, 및 연료, 가연성 물질, 원유 또는 수용성 또는 지용성 중합체 용액 및 1종 이상의 하이드로포빈 또는 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 제제에 관한 것이다.
하이드로포빈은 필라멘트형 진균류, 예를 들어 스키조필럼 커뮨(Schizophyllum commune)의 특징인 약 100개 내지 150개의 아미노산으로 이루어진 소형 단백질이다. 이 단백질은 일반적으로 8개의 시스테인 단위를 포함한다.
하이드로포빈은 경계면에 대해 현저한 친화도를 나타내므로 양친매성 막을 형성하여 경계면의 특성을 변경시키도록 표면을 코팅하는 데 적합하다. 따라서, 예를 들어, 테플론은 하이드로포빈으로 코팅하여 친수성 표면을 얻을 수 있다.
하이드로포빈은 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 하이드로포빈, 및 이의 유도체를 제조하는 방법은 역시 공지되어 있다. 예를 들어, DE 10 2005 007 480.4는 하이드로포빈 및 이의 유도체를 제조하는 방법에 관해 기술하고 있다.
선행 기술은 다양한 분야에 있어서의 하이드로포빈의 용도를 제안하고 있다.
WO 96/41882는 소수성 표면을 친수화하기 위해, 친수성 기재의 내수성을 향상시키기 위해 또는 수중유형 에멀션 또는 유중수형 에멀션을 제조하기 위해 유화제, 증점제 또는 표면 활성 물질로서 하이드로포빈의 용도를 제안한다. 또한 상기 문헌은 약학 분야, 예컨대 연고 또는 크림의 제조, 또, 미용 분야, 예컨대 피부 보호 또는 모발 샴푸 또는 모발 린스의 제조에 있어서의 용도도 제안한다. 이외에도, WO 96/41882는 조성물, 특히 하이드로포빈을 포함하는 약제 분야 조성물을 청구한다.
EP-A　1　252　516은 30∼80℃의 온도에서 창문, 콘텍트 렌즈, 바이오센서, 의료 장치, 실험 수행용 또는 저장용 용기, 선창, 고체 입자 또는 승용차의 동체 또는 프레임을 하이드로포빈 함유 용액으로 코팅하는 방법을 개시한다.
WO　03/53383은 미용 분야에서 케라틴 물질을 처리하기 위한 하이드로포빈의 용도를 개시한다.
WO　03/10331은 다른 물질, 예를 들어 전기 활성 물질, 항체 또는 효소가 비공유 결합으로 결합되어 있는 하이드로포빈 코팅 센서(예를 들어 측정용 전극)를 개시한다.
WO 2004/000880은 또한 표면을 하이드로포빈 또는 하이드로포빈 유사 물질로 코팅하는 방법을 개시한다. 또한 수중유형 또는 유중수형 에멀션도 역시 하이드로포빈을 첨가하여 안정화될 수 있음을 개시한다.
하이드로포빈 유사 단백질에 관한 WO 01/74864는 또한 이러한 단백질은 분산제 및 에멀션을 안정화하기 위해 사용될 수 있음을 개시한다.
상 분리를 위해 단백질을 사용하는 것은 대체로 알려져 있다.
GB 195,876은 콜로이드를 사용하여 유중수형 에멀션을 분해하는 방법을 개시한다. 예로써 언급된 콜로이드는 단백질 예컨대 겔라틴, 카세인 및 알부민, 또는 다당류 예컨대 검 아라빅 또는 검 트래거캔스이다.
JP-A 11-169177은 에멀션을 분해하는 리파제 활성을 보유하는 단백질의 용도를 개시한다.
WO 06/60916은 또한 원유의 유화를 방해하는 단계를 포함하는 다른 분야에 있어서, 1종 이상의 수용성 단백질, 1종 이상의 수용성 다당류 및 1종 이상의 수용성 중합체 예컨대 산화폴리에틸렌으로 구성되는 계면활성제 무함유 혼합물의 용도를 개시한다.
상기 인용된 문헌 중 어느 것도 상 분리를 위한 하이드로포빈의 용도를 개시하는 것은 없다.
단백질의 이용은 이것이 역시 자연적으로 존재하고 생물학적으로 분해가능하며 결과적으로 어떠한 영구적 환경 오염도 일으키지 않는 물질이라는 이점을 가진다.
다수의 대규모 산업 분야의 경우에서, 예를 들어 미정제 수중유형 에멀션을 분리하는 경우, 상은 가능한 한 신속하게 분리되도록 하는 것이 중요하다. 본 발명의 목적은 단백질을 이용하여 개선된 상 분리 방법을 제공하는 것이었다.
본 발명에 따라, 본 목적은 2 이상의 액상을 포함하는 조성물의 상 분리를 개선하기 위해 1종 이상의 하이드로포빈을 사용하여 실현된다.
이와 관련하여, 본 발명에 따른 하이드로포빈은 대체로, 이것이 2 이상의 액상을 포함하는 조성물의 상 분리를 개선함이 확보되는 한, 어떤 임의의 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 명세서 내에서, "상 분리 개선"은 물질이 혼합물에 첨가되는 경우 2종의 액상의 분리가 물질 첨가가 없는 동일한 혼합물에서보다 더 신속하게 일어나거나, 또는 2종의 액상의 분리가 물질 첨가에 의해서만 가능하게 된다는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 명세서 내에서, 하이드로포빈은 또한 이의 유도체이거나 개질된 하이드로포빈인 것으로 이해된다. 개질 또는 유도체화된 하이드로포빈은, 예를 들어, 하이드로포빈의 서열과, 예를 들어 60% 이상, 70% 이상, 특히 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지고, 또한 하이드로포빈의 생물학적 특성을, 예를 들어, 50% 정도로, 60% 정도로, 특히 70% 정도로, 특히 바람직하게는 80% 정도로 이행하며, 특히 표면 특성이, 단백질로 유리 표면을 코팅하기 전과 후 물방울의 접촉각을 20˚ 이상, 바람직하게는 25˚ 이상, 특히 30˚ 이상 증가시키도록, 이러한 단백질로 코팅하여 변경되는 특성을 이행하는 하이드로포빈 융합 단백질 또는 단백질일 수 있다.
놀랍게도, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는 2 이상의 액상의 분리를 개선함을 발견하였다.
이는 특히 신속한 상 분리가 수행되어야 하거나 에멀션의 발생을 예방하여야 하는 경우 유익하다. 이와 관련하여 동일한 소량이 매우 효과적이다. 이러한 특성은 이미 존재하는 에멀션이 분해되어야 하는 경우에도 역시 사용될 수 있다. 에멀션을 분해하는 화합물은 또한 해유화제라고도 명명된다.
따라서, 본 발명은 또한, 전술한 바와 같이, 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체가 해유화제로서 사용되는, 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
이와 관련하여, 하이드로포빈의 서열 특이성이 아닌 구조적 특이성은 하이드로포빈을 한정하는 데 결정적으로 중요하다. 천연 하이드로포빈의 아미노산 서열이 매우 다양할지라도, 이들 모두는 8개의 보존된 시스테인 잔기로 이루어진 매우 특징적인 패턴을 갖는다. 이러한 잔기는 4개의 분자내 이황화 가교 결합을 형성한다.
N 말단 및 C 말단은 비교적 광범위하게 가변적이다. 10∼500 아미노산 길이를 가지며, 예를 들어, 당업자에게 알려진 분자 생물학적 기법에 따라서 확인되는 융합 파트너 단백질은 이러한 말단에 첨가될 수 있다.
이외에도, 유사한 구조 및 기능적 동등성을 가지는 단백질은 본 발명의 의미 내의 하이드로포빈 및 이의 유도체인 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 의미 내에서, "하이드로포빈(hydrophobin)"이란 용어는 하기 일반 구조식 (I)의 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)
상기 식에서, X는 20개의 천연 아미노산(Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu 및 Gly) 중 어느 하나일 수 있다. 여기서 각 경우에 X는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 구조식에서, X의 지수는 각 경우에 아미노산의 수이며, C는 시스테인, 알라닌, 세린, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이고, C로 표시되는 라디칼 중 적어도 4개는 시스테인이며, 지수 n 및 m은 서로 독립적으로 0∼500, 바람직하게는 15∼300인 자연수이다.
일반식 (I)의 폴리펩티드는, 실온에서, 유리 표면을 코팅한 후, 동일한 크기의 물방울이 비코팅 유리 표면과 함께 형성한 접촉각과 비교하여 각 경우에, 물방울의 접촉각을 20˚ 이상, 바람직하게는 25˚ 이상, 특히 바람직하게는 30˚ 이상 증가시키는 특성을 추가 특징으로 한다.
C1 내지 C8로 표시되는 아미노산은 시스테인인 것이 바람직하나; 이들은 또한 유사한 부피를 나타내는 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 글리신으로 치환될 수도 있다. 그러나, C1 내지 C8 위치 중 4개 이상, 바람직하게는 5개 이상, 특히 바람직하게는 6개 이상, 및 특히 7개 이상은 시스테인으로 구성되어야 한다. 본 발명의 단백질 중 시스테인은 환원형으로 존재하거나 서로 이황화 가교 결합을 형성할 수 있다.
특히 1개 이상, 바람직하게는 2개, 특히 바람직하게는 3개, 및 매우 특히 바람직하게는 4개의 분자내 이황화 가교 결합을 포함하는, C-C 가교 결합의 분자내 형성이 특히 바람직하다. 전술한 바와 같이 시스테인이 유사한 부피의 아미노산으로 치환되는 경우, 서로 간에 분자내 이황화 가교 결합을 형성할 수 있는 상기 C 위치는 유리하게는 쌍으로 치환된다.
시스테인, 세린, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이 또한 X로 표시된 위치에 이용될 경우, 상기 일반식에 있어서 개개의 C 위치의 넘버링은 그에 따라 변경될 수 있다.
하기 일반식 (II)의 하이드로포빈을 사용하는 것이 바람직하다.
Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)
상기 식에서, X, C 및 X와 C의 지수는 상기 의미와 같고, 지수 n 및 m은 0∼300인 수이며, 상기 단백질은 본 발명을 실시하기 위한, 전술한 접촉각 변화를 추가 특징으로 하고, 또한 C로 표시되는 잔기 중 6개 이상은 시스테인이다. 모든 C 잔기가 시스테인인 것이 특히 바람직하다.
하기 일반식 (III)의 하이드로포빈을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III)
상기 식에서, X, C 및 X의 지수는 상기 의미와 같고, 지수 n 및 m은 0∼200 범위의 수이며, 상기 단백질은 전술한 접촉각 변화를 추가 특징으로 하고, C로 표시된 잔기 중 6개 이상은 시스테인이다. 모든 C 잔기가 시스테인인 것이 특히 바람직하다.
잔기 Xn 및 Xm은 하이드로포빈에 자연적으로 또한 연결되는 펩티드 서열일 수 있다. 그러나, 잔기 중 어느 하나 또는 둘 다 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 펩티드 서열일 수 있다. 이것은 또한, 하이드로포빈에 자연적으로 존재하는 펩티드 서열이 하이드로포빈에 자연적으로 존재하지 않는 펩티드 서열에 의해 연장된 Xn 및/또는 Xm 잔기를 포함한다.
Xn 및/또는 Xm이 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 펩티드 서열일 경우, 그러한 서열 길이는 일반적으로 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 35개 이상의 아미노산, 특히 바람직하게는 50개 이상의 아미노산, 매우 특히 바람직하게는 100개 이상의 아미노산이다. 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 이러한 잔기는 이하에서 융합 파트너로 또한 명명될 것이다. 이것은 상기 단백질이 자연에서는 이러한 형태로 함께 발견되지 않는 융합 파트너 부분과 1개 이상의 하이드로포빈 부분으로 구성될 수 있다는 사실을 이로써 나타내기 위한 것이다.
상기 융합 파트너 부분은 다수의 단백질로부터 선택될 수 있다. 몇몇 융합 파트너를 하나의 하이드로포빈 부분에, 예를 들어 하이드로포빈 부분의 아미노 말단(Xn) 또는 카르복시 말단(Xm)에 연결시키는 것도 가능하다. 그러나, 예를 들어, 2개의 융합 파트너를 본 발명에 따른 단백질의 한 위치(Xn 또는 Xm)에 연결시키는 것도 가능하다.
특히 적절한 융합 파트너는 미생물, 특히 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에 자연적으로 존재하는 폴리펩티드이다. 그러한 융합 파트너의 예로는 서열 yaad(서열 번호 15 및 16), yaae(서열 번호 17 및 18) 및 티오레독신이 있다. 상기 서열의 단지 일부분, 예를 들어 70∼99%, 바람직하게는 5∼50%, 및 특히 바람직하게는 10∼40%를 포함하거나, 상기 서열과 비교하여 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 변경된, 이러한 상기 서열의 단편 또는 유도체 역시 매우 적합하며, 각 경우에 백분율 값은 아미노산 수를 지칭한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 하이드로포빈은 또한 융합 파트너에 더하여 친화력 도메인(친화력 태그/ 친화력 테일)로 명명되는 Xn기 또는 Xm기로서 나타난다. 친화력 도메인은, 대체로 알려진 방법으로, 소정의 상보적 기와 상호 작용할 수 있고 단백질의 후처리 및 정제를 단순화하는 데 사용될 수 있는 정착기이다. 이러한 친화력 도메인의 예로는 (His)k, (Arg)k, (Asp)k, (Phe)k 및 (Cys)k 기를 들 수 있으며, k는 일반적으로 1∼10인 자연수이다. 친화력 도메인은 k가 4∼6인 (His)k 기인 것이 바람직하다.
하이드로포빈 또는 이의 유도체로서 본 발명에 따라 사용되는 단백질의 폴리펩티드 서열은, 또한 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 또는 그외, 예를 들어 글루타르알데히드를 사용한 화학적 가교 결합에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 하이드로포빈 또는 이의 유도체의 일 특성은 표면을 단백질로 코팅할 경우 표면 특성이 변화된다는 것이다. 표면 특성에 있어서의 변화는, 예를 들어, 표면을 단백질로 코팅하기 전과 후에 물방울의 접촉각을 측정하고 두 측정값 간의 차이를 측정하여 실험적으로 측정할 수 있다.
접촉각 측정 방법은 당업자에게 대체로 알려져 있다. 측정은 실온 및 물방울 5 μl 및 기재로서 유리 슬라이드(platelet)의 사용을 기준으로 한다. 예를 들어, 접촉각을 측정하기 위한 적절한 방법에 있어서의 정확한 실험 조건은 실험 부분에서 기술한다. 실험 부분에 명시된 조건 하에, 본 발명에 따라 사용되는 융합 단백질은 동일한 크기의 물방울이 비코팅 유리 표면과 함께 형성한 접촉각과 비교하여 각 경우에, 접촉각을 20˚ 이상, 바람직하게는 25˚ 이상, 특히 바람직하게는 30˚ 이상 증가시키는 특성을 보유한다.
본 발명을 실시하는 데 있어서 특히 바람직한 하이드로포빈은 유형 dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2의 하이드로포빈이며, 이들은 하기 서열 목록에서 구조적으로 특징된다. 그러나, 상기 하이드로포빈은 또한 이러한 하이드로포빈의 단지 일부분 또는 유도체일 수도 있다. 동일하거나 상이한 구조의 몇몇 하이드로포빈 부분, 바람직하게는 2개 또는 3개의 부분을 서로, 또, 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 적절한 해당 폴리펩티드 서열에 연결하는 것도 가능하다.
브래킷에서 제공되는 폴리펩티드 서열을 가지는 융합 단백질 yaad-Xa-dewA-his(서열 번호 20), yaad-Xa-rodA-his(서열 번호 22) 또는 yaad-Xa-basf1-his(서열 번호 24) 및 이들을 코팅하는 핵산 서열, 구체적으로 서열 번호 19, 21 및 23에 나타낸 서열은, 또한 본 발명에 따라 특히 적합하다. 전체 아미노산 중 1개 이상, 최대 10개, 바람직하게는 5개, 특히 바람직하게는 5%가 치환, 삽입 또는 결실됨으로써 서열 번호 20, 22 또는 24에 나타낸 폴리펩티드 서열로부터 유래하고, 여전히 출발 단백질의 생물학적 특성의 50% 이상을 보유하는 단백질은 또한 특히 바람직한 실시형태이다. 본 명세서에서 단백질의 생물학적 특성은, 이미 기술된 바와 같이, 접촉각의 변화가 20˚ 이상인 것으로 이해된다.
본 발명을 실시하는 데 특히 적절한 유도체는 yaad 융합 파트너를 절두(truncating)하여 yaad-Xa-dewA-his(서열 번호 20), yaad-Xa-rodA-his(서열 번호 22) 또는 yaad-Xa-basf1-his(서열 번호 24)로부터 유래한 잔기이다. 294 아미노산을 포함하는 완전한 yaad 융합 파트너(서열 번호 16) 대신, 유리하게는 절두형 yaad 잔기를 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 절두형 잔기는 20개 이상, 바람직하게는 35개 이상의 아미노산을 포함해야한다. 예를 들어, 아미노산이, 예를 들어, 20∼293개, 바람직하게는 25∼250개, 특히 바람직하게는 35∼150개 및 35∼100개인 절두형 잔기를 사용하는 것이 가능하다.
하이드로포빈과 융합 파트너 또는 융합 파트너들 사이의 절단 부위는 (예를 들어 메틴오닌에 대한 BrCN 절단, Xa 인자 절단, 엔테로키나제 절단, 트롬빈 절단, TEV 절단 등에 의해) 유도체화되지 않은 형태의 순수한 하이드로포빈을 방출시키는 데 사용될 수 있다.
또한 상이한 서열(예를 들어, DewA-RodA 또는 Sc3-DewA, 또는 Sc3-RodA)을 차례로 포함하는, 몇몇 하이드로포빈, 및 하나의 융합 파트너, 예를 들어 yaad 또는 yaae로부터의 융합 단백질을 생성하는 것이 가능하다. 또한 최대 70%의 상동성을 나타내는 뮤테인 또는 하이드로포빈 단편(예를 들어 N- 또는 C-말단 절단편)을 사용하는 것이 가능하다. 최적의 구성체는 각 경우에 소정의 용도, 즉 분리하고자 하는 액상과 관련하여 선택된다.
본 발명에 따라 사용되는 하이드로포빈, 또는 본 발명에 따른 제제에 존재하는 하이드로포빈은 통상의 펩티드 합성 기법, 예를 들어 메리필드(Merrifield) 고상 합성법으로 화학적으로 제조할 수 있다.
천연 하이드로포빈은 또한 적절한 방법을 이용하여 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 독자는, 예를 들어, 문헌[Woesten et al., Eur. J. Cell Bio. 63, 122-129 (1994)] 또는 WO 96/41882를 참조할 수 있다.
바람직하게는 융합 파트너를 코딩하는 1개의 핵산 서열, 특히 DNA 서열과, 하이드로포빈 부분을 코딩하는 1개의 핵산 서열을 조합하여, 조합된 핵산 서열의 발현에 의해 숙주 유기체에서 원하는 단백질이 생성되도록 하는 재조합 방법으로 융합 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 이러한 종류의 제조 방법은, 예를 들어, DE 102005007480.4에 개시되어 있다.
이와 관련하여, 전술한 제조 방법에 적절한 숙주 유기체(생산 유기체)로는 원핵 생물(고세균 포함) 또는 진핵 생물, 특히 호염성 박테리아 및 메탄 생성균(methanococci)을 비롯한 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포, 특히 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스, 바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium), 아스퍼질러스 오리지(Aspergillus oryzea), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 락토바실러스(lactobacilli), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), SF9(또는 관련 세포) 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에, 본 발명에 따라 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구성체와, 또한, 이러한 발현 구성체 중 적어도 하나를 포함하는 벡터의 사용에 관한 것이다.
사용된 구성체는 소정의 코딩 서열의 5'쪽 상류의 프로모터와 3'쪽 하류의 종결 서열 및, 경우에 따라, 각각 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 다른 통상적인 조절 요소를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 명세서 내에서, "작동 가능한 연결(operative linkage)"이란 각각의 조절 요소가 코딩 서열을 발현하는 것과 관련하여, 그 의도된 용도에 따라, 그 기능을 충족할 수 있도록, 프로모터, 코딩 서열, 종결 서열과, 경우에 따라, 추가 조절 요소가 순차적으로 배열되어 있는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
작동 가능하게 연결할 수 있는 서열의 예로는 표적화 서열과, 또 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등이 있다. 그 밖의 조절 요소는 선별 마커, 증폭 신호, 복제 기점 등을 포함한다. 적절한 조절 서열에 관해서는, 예를 들어, 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.
상기 조절 서열 이외에도, 실제적 구조 유전자의 상류에 상기 서열의 천연 조절 요소가 존재할 수도 있으며, 경우에 따라, 천연 조절 요소가 차단되어 유전자의 발현이 증대될 수 있도록 천연 조절 요소를 유전적으로 변형시킬 수 있다.
바람직한 핵산 구성체는 또한 프로모터에 기능적으로 연결되어 있고 핵산 서열의 발현을 증대시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 인핸서 서열을 포함한다. 추가적인 조절 요소 또는 종결 서열 등의 유용한 추가 서열을 DNA 서열의 3' 말단에 삽입시킬 수도 있다.
핵산 서열은 1 카피 이상이 구성체 내에 존재할 수 있다. 상기 구성체는 또한, 경우에 따라 상기 구성체의 선별을 목적으로, 추가적인 마커, 예컨대 항생제 내성 또는 영양 요구성 보완 유전자를 포함할 수 있다.
본 방법에 유용한 조절 서열은, 예를 들어 cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, 람다-PR 또는 임람다-P 프로모터 등의 프로모터에 존재하며, 상기 프로모터는 그램 음성 박테리아에 유용하게 사용될 수 있다. 그 밖의 유용한 조절 서열의 예는 그램 양성 프로모터 amy 및 SP02, 효모 또는 진균류 프로모터 ADC1, MF알파, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28 및 ADH에 존재한다.
조절을 위해 인공 프로모터를 사용하는 것도 가능하다.
숙주 유기체에서 발현시키기 위해, 숙주에서의 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 파지에 핵산 구성체를 삽입시키는 것이 바람직하다. 벡터는, 플라스미드 및 파지뿐 아니라 당업자에게 공지되어 있는 임의의 다른 벡터, 즉, 예를 들어 SV40, CMV, 배큘로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스, 트랜스포존, IS 엘리먼트, 파지미드, 코스미드 및 선형 또는 원형 DNA와, 또한 아그로박테리아 시스템인 것으로 또한 이해되어야 한다.
이러한 벡터는 숙주 유기체에서 자율적으로 또는 염색체를 통해 복제할 수 있다. 적절한 플라스미드의 예로는 이. 콜라이용 플라스미드, 즉 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-B1, tgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스용 플라스미드, 즉 plJ101, plJ364, plJ702 또는 plJ361, 바실러스용 플라스미드, 즉 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리아용 플라스미드, 즉 pSA77 또는 pAJ667, 진균류용 플라스미드, 즉 pALS1, plL2 또는 pBB116, 효모용 플라스미드, 즉 2알파, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23, 또는 식물용 플라스미드, 즉 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이 있다. 그 밖의 플라스미드도 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN　0 444 904018)]에서 찾아볼 수 있다.
핵산 구성체는, 존재하는 다른 유전자를 발현시키기 위해, 선택된 숙주 유기체 및 유전자(들)에 따라 최적 발현을 위해 서열이 선택되는, 발현 증대를 위한 3' 말단 및/또는 5' 말단의 조절 서열을 또한 포함하는 것이 바람직하다.
이러한 조절 서열들은 유전자 및 단백질이 선택적으로 발현될 수 있도록 하기 위한 것이다. 숙주 유기체에 따라, 이것은, 예를 들어, 유전자가 유도 후에만 발현 또는 과발현되는 것, 또는 유전자가 즉시 발현 및/또는 과발현되는 것을 의미할 수 있다.
이와 관련하여, 조절 서열 또는 인자가 긍정적으로 영향을 미쳐서, 삽입되는 유전자의 발현을 증대시킬 수 있는 것이 바람직하다. 따라서 조절 요소는 프로모터 및/또는 인핸서 등의 강력한 전사 신호를 이용하여 전사 수준을 증대시키는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 이 외에도, 예를 들어 mRNA의 안정성을 향상시킴으로써 번역을 증대시키는 것도 가능하다.
벡터의 또 다른 실시형태로서, 핵산 구성체 또는 핵산을 포함하는 벡터를 선형 DNA의 형태로 미생물에 도입하여 이종성 또는 상동성 재조합에 의해 숙주 유기체의 게놈으로 통합되도록 하는 것이 바람직할 수도 있다. 상기 선형 DNA는 플라스미드와 같은 선형화된 벡터로 구성되거나 핵산 구성체 또는 핵산으로만 구성될 수 있다.
유기체에서의 이종성 유전자의 최적 발현을 위해서는, 그 유기체에서 이용되는 특정 코돈 이용 방식에 따라 핵산 서열을 변형시키는 것이 바람직하다. 코돈 이용 방식은 해당 유기체의 다른 공지 유전자의 컴퓨터 분석을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다.
적절한 코딩 뉴클레오티드 서열 및 종결 또는 폴리아데닐화 신호에 적절한 프로모터를 융합하여 발현 카세트를 제조한다. 예를 들어, 문헌[T. Maniatis, E.　F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], 문헌[T. J. Silhavy, M.　L.　Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 문헌[Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기재된 바와 같은 통상적인 재조합 및 클로닝 기법을 상기 목적에 이용한다.
적절한 숙주 유기체에서의 발현을 위해서는, 재조합 핵산 구성체 또는 유전자 구성체를, 그 숙주에서의 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 숙주 특이적 벡터에 삽입시키는 것이 바람직하다. 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Eds, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]으로부터 정보를 입수할 수 있다.
벡터를 이용하여, 예를 들어, 적어도 하나의 벡터로 형질전환되고 본 발명에 따라 사용되는 하이드로포빈, 또는 이의 유도체를 제조하는 데에 이용될 수 있는 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 전술한 재조합 구성체는 적절한 숙주 시스템에 도입하여 발현시키는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 상기 핵산이 소정의 발현 시스템에서 발현되도록 하기 위해, 당업자에게 공지된 통상의 클로닝법 및 형질감염법, 예를 들어 공침전법, 원형질 융합법, 전기천공법, 레트로바이러스 형질감염법 등을 이용하는 것이 바람직하다. 적절한 시스템은, 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.　Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997] 또는 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다.
상동성 재조합 미생물을 제조하는 것도 가능하다. 이는, 서열을 변형시키기 위해, 예를 들어 기능을 파괴하기 위해(넉아웃 벡터), 경우에 따라 하나 이상의 아미노산 결실, 추가 또는 치환이 도입된, 사용되는 코팅 서열 또는 유전자의 적어도 일부분을 포함하는 벡터를 제조한다. 도입된 서열은, 예를 들어, 관련 미생물 유래의 상동체이거나, 그 외 포유동물, 효모 또는 곤충 기원에서 유래된 것일 수도 있다. 대안으로, 상동성 재조합에 사용되는 벡터는, 상동성 재조합의 경우, 내인성 유전자가 돌연변이되거나 몇몇 다른 방식으로 변경되지만, 여전히 기능성 단백질을 코딩하도록 디자인될 수 있다(예를 들어, 내인성 단백질의 발현이 변화되도록 상류 조절 영역을 변경할 수 있다). 본 발명에 따라 사용되는 유전자의 변경된 부분은 상동성 재조합 벡터 내에 존재한다. 상동성 재조합에 적절한 벡터의 구성에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503]에 기재되어 있다.
대체로, 임의의 원핵 또는 진핵 유기체는 상기 핵산 또는 핵산 구성체의 재조합 숙주 유기체로서 사용하기에 적합하다. 박테리아, 진균류 또는 효모 등의 미생물이 숙주 유기체로서 사용되는 것이 바람직하다. 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아, 바람직하게는 장내세균(Enterobacteriaceae) 과, 슈도모나스과(Pseudomonadaceae) 과, 리조비아(Rhizobiaceae) 과, 스트렙토마이세스(Streptomycetaceae) 과 또는 노카디아(Nocardiaceae) 과 박테리아를 사용하는 것이 바람직하고, 에스케리키아 속, 슈도모나스 속, 스트렙토마이세스 속, 노카디아 속, 부르크홀더리아(Burkholderia) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 아그로박테리아(Agrobacterium) 속 또는 로도코쿠스(Rhodococcus) 속의 박테리아를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
전술한 방법에서, 융합 단백질의 제조 방법에 사용되는 유기체는, 숙주 유기체에 따라, 당업자에게 공지된 방법으로 생육 또는 배양한다. 미생물은 통상, 일반적으로 당 형태의 탄소원, 일반적으로 유기 질소원 형태의 질소원, 예컨대 효모 추출물 또는 염(예컨대, 황산암모늄염, 미량 원소의 염, 예컨대 철염, 망간염 및 마그네슘염)과, 경우에 따라 비타민을 포함하는 액상 배지에서, 산소를 공급하면서, 0℃∼100℃, 바람직하게는 10℃∼60℃의 온도에서 배양한다. 이와 관련하여, 영양 배지액의 pH는 고정값으로 유지할 수 있으며, 즉, 배양 도중에 조절할 수 있고 조절하지 않을 수도 있다. 배양은 회분식, 반회분식 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 영양분은 발효 초반부에 초기에 공급하거나 반연속식 또는 연속식으로 추후에 공급할 수 있다. 효소는 실시예에 기재된 방법으로 유기체로부터 분리하거나, 미정제 추출물로서 반응에 사용할 수 있다.
폴리펩티드 생산 미생물을 배양하고, 경우에 따라 단백질의 발현을 유도하며, 상기 단백질을 배양액으로부터 분리하여, 본 발명에 따라 사용되는 하이드로포빈, 또는 생물학적 활성을 갖는 이의 기능성 단편을 재조합 제조 방법으로 제조할 수 있다. 단백질은 상기 방식으로 필요에 따라 산업적 규모로 제조할 수도 있다. 재조합 미생물은 공지의 방법으로 배양하고 발효시킬 수 있다. 박테리아는, 예를 들어, TB 배지 또는 LB 배지에서 온도 20∼40℃ 및 pH 6∼9에서 증폭시킬 수 있다. 적절한 배양 조건에 대해서는, 예를 들어, 문헌[T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 상세히 기재되어 있다.
단백질이 배양 배지로 분비되지 않는다면, 그 후 세포를 파괴하고, 공지된 단백질 분리 방법을 이용하여 용해물로부터 생성물을 얻는다. 세포는, 필요에 따라 고주파 초음파에 의해, 예를 들어 프렌치(French) 압력 셀에서와 같이 고압에 의해, 삼투압 분해에 의해, 세정제, 용해성 효소 또는 유기 용매의 작용에 의하거나, 균질화기를 이용하거나, 또는 상기 방법 중 몇몇을 병용하여 파괴할 수 있다.
단백질은 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 예컨대 Q 세파로스 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피 등의 공지된 크로마토그래피법을 이용하고, 또한, 한외 여과, 결정화, 염석, 투석 및 네이티브(native) 겔 전기영동 등의 다른 통상적인 방법을 이용하여 정제할 수 있다. 적절한 방법은, 예를 들어 문헌[Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York] 또는 문헌[Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기재되어 있다.
분리 및 정제를 용이하게 하기 위하여, 고상 지지체 상의 대응하는 상보적 기에 결합할 수 있는 특정 정착기, 특히 적절합 중합체와 함께 하이드로포빈 융합체를 제공하는 것은 특히 바람직할 수 있다. 이러한 고상 지지체는, 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼의 충전재로서 사용할 수 있으며, 이러한 방식으로 분리 효율을 대체로 현저하게 증대시킬 수 있다. 이러한 분리 방법은 또한 친화성 크로마토그래피로서 공지되어 있다. 정착기를 포함하기 위하여, 단백질을 제조하는 경우, 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 cDNA를 확장시켜 변형된 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 더 간단한 정제를 위해 개질된 단백질은, 예를 들어, 헥사히스티딘 앵커로서 알려진 개질물인 앵커로서 작용하는 "태그"로 명명되는 것을 포함한다. 히스티딘 앵커로 개질된 하이드로포빈 융합체는, 예를 들어, 칼럼 충전재와 같은 니켈 세파로스를 이용하여 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있다. 그 후 하이드로포빈 융합체는 용리하기 위한 적절한 수단, 예를 들어 이미다졸 용액을 사용하여 다시 한 번 칼럼으로부터 용리할 수 있다.
단순화한 정제 방법으로서, 크로마토그래피 정제를 하지 않는 것도 가능하다. 이를 위해, 무엇보다도 적절한 방법을 이용하여, 예를 들어 미세여과 또는 원심분리에 의해 세포를 발효 배양액으로부터 분리한다. 그 후 적절한 방법을 이용하여, 예를 들어 이미 전술한 방법을 이용하여 세포를 파괴할 수 있으며, 세포 잔해는 봉입체로부터 분리할 수 있다. 후반 단계는 원심분리에 의해 이루어지는 것이 바람직할 수 있다. 최종적으로, 봉입체는 하이드로포빈 융합체를 방출시키기 위해 대체로 공지된 방법으로 파괴될 수 있다. 이는, 예를 들어, 산, 염기 및/또는 세정제를 이용하여 이루어질 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 하이드로포빈을 포함하는 봉입체는 대체로 약 1시간 이내로 0.1 M NaOH를 이용하여 완전히 용해시킬 수 있다. 이러한 단순화한 방법을 이용하여 얻은 하이드로포빈 융합체의 순도는 대체로 단백질 전량을 기준으로 하여 60∼80 중량%이다. 기술된 단순화한 정제 방법을 이용하여 얻은 용액은 임의의 추가 정제 없이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다.
기술한 바와 같이 제조된 하이드로포빈은, 융합 파트너를 분리시키고 제거한 후, 융합 단백질로서 또는 "순수한" 하이드로포빈으로서 직접 사용될 수 있다.
융합 파트너를 제거하고자 한다면, 하이드로포빈 부분과 융합 파트너 부분 간의 융합 단백질에 잠재적 절단 부위(프로테아제에 대한 특이적 인식 부위)를 포함시키는 것이 바람직하다. 적절한 절단 부위로는, 특히, 생물정보학 도구를 이용하여 쉽게 결정할 수 있는 것과 같은, 하이드로포빈 부분에도 융합 파트너 부분에도 존재하지 않는 펩티드 서열을 들 수 있다. 예를 들어, 메티오닌에 대한 BrCN 절단, 또는 Xa 인자, 엔테로키나제 절단, 트롬빈, TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제를 이용한 프로테아제 매개 절단이 특히 적절하다.
본 발명에 따라, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는 2 이상의 액상을 포함하는 조성물의 상 분리를 개선하는 데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 조성물은 2 이상의 액상을 보유하는 한 임의의 조성물일 수 있다.
특히, 상기 조성물은 또한, 1종 이상의 하이드로포빈 또는 이의 유도체를 첨가하기 전에는, 에멀션 형태로 존재하는 조성물일 수 있다.
이와 관련하여, 상기 조성물은, 본 발명의 명세서 내에서, 2 이상의 액상 이외에도 추가 상을 보유할 수 있다.
2 이상의 액상은 상이한 밀도로 구성되는 2종의 액상, 예를 들어 오일과 물, 상이한 밀도로 구성되는 2종의 수용액, 상이한 밀도로 구성되는 2종의 유기 용액, 연료와 물, 가연성 물질과 물 또는 용매와 물이 있다. 이와 관련하여, 수용액은, 본 발명의 명세서 내에서, 경우에 따라 추가 용매와 조합하여, 물을 포함하는 용액을 의미하는 것으로 이해된다. 이와 관련하여, 액상 각각은, 본 발명의 명세서 내에서, 추가 물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 오일은 미정제 오일이 바람직하다.
적절한 용매는 물, 특히 유기 용매, 예를 들어, 에테르, 방향족 화합물 예컨대 톨루엔 또는 벤젠, 알코올, 알칸, 알켄, 시클로알칸, 시클로알켄, 에스테르, 케톤, 나프텐 또는 할로겐화 탄화수소와 함께 2상 혼합물을 형성하는 임의의 액체이다.
그러므로, 또 다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 전술한 바와 같이, 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체의 용도에 관한 것이며, 2 이상의 액상을 포함하는 조성물은,
- 오일, 바람직하게는 미정제 오일, 및 물을 포함하는 조성물,
- 연료 또는 가연성 물질 및 물을 포함하는 조성물,
- 2 이상의 액상을 포함하는 반응 혼합물
로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 명세서 내에서, 조성물은 추가 상, 예를 들어 고상 또는 액상, 특히 고상을 포함할 수도 있다.
본 명세서 내에서 당업자에게 공지된 임의의 분야에 있어 하이드로포빈 또는 그 유도체를 사용하는 것은 가능하다. 본 발명의 명세서 내에서는, 특히 가솔린/물 혼합물에서 해유화제로서의 용도 및 다른 연료 또는 가연성 물질/물 혼합물에서 해유화제로서의 용도, 화학 반응과 관련하여, 특히 대규모 산업 공정과 관련하여 상의 분리, 미정제 오일 추출물 또는 미정제 오일 생성물과 관련하여 미정제 오일과 물 간의 에멀션의 분해, 및 미정제 오일을 물로 추출한 후 그 결과 생성된 에멀션을 분해하여 미정제 오일을 탐염하는 것이 언급되어야 한다. 적절한 대규모 산업 화학 공정은 상 분리가 수행되어야 하는 모든 공정, 예를 들어 수성 조건 하에서 분리되는 촉매인, 코발트 촉매를 사용한 폴리이소부텐의 하이드로포밀화 공정이다.
하이드로포빈 또는 이의 유도체는 또한, 본 발명에 따라, 2 이상의 액상을 포함하고 반응 과정 중에 발생하는, 즉 반응 과정 중에 형성되거나 일 용매 또는 일 성분의 첨가로 인하여 발생하는 조성물의 상 분리를 개선하는 데 사용된다. 본 발명에 따른, 하이드로포빈 또는 이의 유도체의 이용은 상 분리 시간을 단축시키고 생성물의 손실 값을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따라서, 상이한 밀도로 구성되는 2종의 수성 상을 포함하고, 수성 상은, 경우에 따라 또 다른 용매와 조합하여, 물을 포함하는 상인 것으로 이해되는, 조성물의 상 분리를 개선하는 것도 가능하다. 본 발명에 따라, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는, 예를 들어, 수성 시스템 중 중합체를 분별하는 것과 관련하여 상 분리를 개선하는 데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 특히, 수용성 중합체가 분별된다.
일반적으로, 제조로 인하여 1.1 초과의 다분산도 또는 몰질량 분포가 되는, 당업자에게 공지된 모든 수용성 및 지용성 중합체, 특히 폴리아크릴레이트 및 이의 공중합체를 언급할 수 있다.
에멀션은 해유화제를 첨가하여 파괴할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 추출된 광유는 대체로 저장소(deposit)의 특성에 따라 최대 90 중량%의 물을 함유할 수 있는 비교적 안정한 유중수형 에멀션으로 존재한다. 미정제 오일을 후처리하고 정제하는 경우, 대부분의 물이 분리된 후, 여전히 물을 약 2∼3 중량%로 포함하는, 미정제 오일이 생긴다. 이러한 후자는 오일과 함께 안정한 에멀션을 형성하며, 이 에멀션은 원심분리에 의해서도 또 종래의 해유화제를 첨가하여서도 완전히 분리할 수 없다. 이는, 한편으로는, 물이 고함량의 염을 포함하여 부식 효과를 나타내고, 다른 한편으로는, 잔류수가 수송 및 저장해야하는 부피를 증대시켜 비용 증가를 유발시킨다는 점에서, 문제가 된다. 본 발명에 따라서, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는 이러한 조성물의 상 분리를 개선하는 데 특히 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다. 매우 신속한 분리가 이루어진다.
이와 관련하여, 해유화제는 최적의 효과를 달성하기 위하여 유화된 오일 및 지방의 특성, 뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 유화제 및 계면활성제에 순응해야 된다. 에멀션의 분해는 추가로 고온, 예를 들어 0∼100℃, 예를 들어 10∼80℃, 특히 20∼60℃의 온도로 지지될 수 있다.
본 발명에 따른 다른 용도의 예로는 칩보드 및 직물 산업에서 함침 에멀션의 해유화 및 약제 에멀션의 해유화를 들 수 있다. 또 다른 용도는 유기물 처리된 폐수, 예를 들어 공업 및 상업 폐수, 특히 금속 가공 유래의 폐수, 예를 들어, 금속 가공 유래의 절삭유(cutting fluid), 오일/물 에멀션이 발생되는, 광유 정제소와 가정 공급원 및 무두질 공장 유래의 폐수의 해유화가 있다. 이러한 폐수는, 예를 들어, 정제소 및 석유화학 공장에서의 광유 처리와 관련하여 발생한다. 이러한 폐수가 정화 공장으로 수송되기 전에, 에멀션의 형태로 흔히 존재하는 오일 잔류물을 분리하는 것이 필요하다.
본 발명에 따른 또 다른 용도는 수중유형 또는 유중수형 혼합물, 예를 들어 절삭제로서 사용되고 재생되어야 하는 에멀션의 해유화이다. 물/오일 혼합물은 또한, 예를 들어, 외항선의 선저폐수(bilge water)로서 축적된다. 이와 관련하여, 물을 분리하고 처리되어야 하는 용매의 양을 감소시킬 수 있도록 에멀션을 분리하는 것이 요구된다.
사용되는 하이드로포빈 또는 이의 유도체의 양은 광범위하게 다양할 수 있으며, 상기 양은 조성물 그 자체에 매치되고, 경우에 따라, 조성물에 존재하는 다른 성분에 매치되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 조성물이 물질, 예를 들어 2 이상의 액상 분리를 지연시키거나 약화시키는 계면활성제 또는 유화제를 포함하는 경우에는, 그 후 다량의 하이드로포빈 또는 이의 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.
오일, 특히 미정제 오일은 다수 화합물의 혼합물로 구성되어 있으므로, 특정 조건에 해유화제를 매치하는 것이 요구되는데, 그 이유는 오일, 물 및 염 부분의 다른 화학적 조성, 및 해유화제의 특정 조건, 예컨대 온도, 해유화제의 지속 시간, 혼합물의 다른 성분과의 상호 작용 및 비율 특성 때문이다.
놀랍게도, 오히려 소량의 하이드로포빈 또는 이의 유도체가 상 분리 개선을 유도함이 확인되었다.
본 발명에 따라, 1종 이상의 하이드로포빈 또는 이의 유도체가 임의의 적절한 양으로 사용될 수 있다. 1종 이상의 하이드로포빈 또는 이의 유도체는 대체로, 총 조성물을 기준으로 하여, 0.0001∼1,000 ppm의 양으로, 바람직하게는 0.001∼500 ppm의 양으로, 특히 바람직하게는 0.01∼200 ppm 또는 0.01∼100 ppm의 양으로, 매우 특히 바람직하게는 0.1∼50 ppm의 양으로 사용된다.
본 발명의 명세서에서, ppm은 kg 당 mg을 나타낸다.
또 다른 실시형태에 따라, 따라서 본 발명은 전술한 바와 같은 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체를, 총 조성물을 기준으로 하여, 0.0001∼1,000 ppm의 양으로 사용하는 용도에 관한 것이다. 사용되는 농도는 해유화되는 조성물의 특성에 따라 당업자에 의해 구체화된다.
조성물이 연료 또는 가연성 물질 및 물을 포함하는 조성물인 경우, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는, 대체로, 0.001∼10 ppm, 바람직하게는 0.005∼2 ppm, 특히 0.01∼1 ppm, 특히 바람직하게는 0.05∼0.5 ppm 및 더 바람직하게는 0.01∼0.1 ppm의 양으로 사용된다.
조성물이 미정제 오일 및 물을 포함하는 조성물인 경우, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는, 대체로, 1∼1,000 ppm, 바람직하게는 1∼800 ppm, 특히 5∼500 ppm, 특히 바람직하게는 10∼200 ppm 및 더 바람직하게는 15∼100 ppm 및, 예를 들어, 20∼50 ppm의 양으로 사용된다.
조성물이 상이한 밀도로 구성되는 2종의 수성 상을 포함하는 조성물이고, 상은, 예를 들어, 수용성 중합체를 분별하는 것과 관련하여 발생하는 경우, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는, 대체로, 1∼1,000 ppm, 바람직하게는 1∼500 ppm, 특히 5∼250 ppm, 특히 바람직하게는 10∼200 ppm 및 더 바람직하게는 15∼100 ppm의 양으로 사용된다.
본 발명에 따라, 1종 이상의 하이드로포빈 또는 이의 유도체 이외에도, 조성물이 상 분리를 개선하는 추가 화합물을 포함하는 것이 또한 가능하다. 이와 관련하여, 화합물은 이러한 종류의 용도에 있어서 당업자에게 공지되어 있는 임의의 화합물일 수 있다. 상 분리를 개선하는 추가 화합물로서의 용도, 특히 미정제 오일 생성과 관련한 해유화제로서의 용도에 적합한 화합물의 예로는, 옥시알킬화 페놀 포름알데히드 수지, EO/PO 블록 공중합체, 가교성 디에폭사이드, 폴리아미드 또는 이의 알콕시화, 술폰산 염, 에톡시화 지방 아민, 숙시네이트 및 이러한 종류의 용도에 있어서 DE 10 2005 006 030.7에 명시된 화합물이 있다.
또 다른 실시형태에 따라, 따라서 본 발명은 전술한 바와 같이, 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체 이외에도 상 분리를 개선하는 1종 이상의 추가 화합물을 사용하는 용도에 관한 것이다.
또 다른 양상에 따라, 또한 본 발명은 2 이상의 액상을 포함하는 조성물에서 2 이상의 액상을 분리하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체를 상기 조성물에 첨가하는 단계를 포함한다.
이와 관련하여, 조성물은 전술한 바와 같이 2 이상의 액상을 포함하는 조성물일 수 있다.
바람직한 실시형태에 따라, 따라서 본 발명은 2 이상의 액상을 포함하는 조성물이
- 오일, 바람직하게는 미정제 오일, 및 물을 포함하는 조성물,
- 연료 또는 가연성 물질 및 물을 포함하는 조성물,
- 2 이상의 액상을 포함하는 반응 혼합물
로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 이러한 특성을 갖는 방법에 관한 것이다.
대체로, 본 발명의 명세서 내에서, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는 상 분리가 개선된다면 어떤 임의의 양으로 사용될 수 있다. 총 조성물을 기준으로 하여, 하이드로포빈 또는 이의 유도체를 0.0001∼1,000 ppm의 양으로 사용하는 것은 특히 적절하다.
또한 본 발명은 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체가, 총 조성물을 기준으로 하여, 0.0001∼1,000 ppm의 양으로 사용되는 전술한 방법에 관한 것이다. 각 시스템의 바람직한 양은 이미 언급하였다.
본 발명에 따른 방법은 추가 단계, 예를 들어, 상 분리를 개선하거나 에멀션을 분해하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 단계는, 예를 들어, 원심분리 또는 온도 증가일 수 있다. 이러한 단계는 1종 이상의 하이드로포빈 또는 이의 유도체의 첨가 전에, 중에 또는 후에 일어날 수 있다.
또 다른 실시형태에 따라, 따라서 본 발명은 1종 이상의 하이드로포빈 또는 1종 이상의 이의 유도체의 첨가 전 또는 후에, 방법이 2 이상의 액상을 포함하는 조성물의 온도를 증가시키는 단계를 포함하는, 전술한 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 하이드로포빈 또는 이의 유도체는, 예를 들어, 연료 또는 가연성 물질을 포함하는 제제에 첨가될 수 있다. 이는 제제가 물과 접촉하게 되는 경우 신속한 분리의 수행을 가능하게 하거나, 또는 에멀션의 형성을 막는다. 예를 들어, 저장 탱크에서의 에멀션의 형성은 정교한 정제 단계에 상기 제제를 투여하는 것을 필요하게 한다.
또한, 예를 들어, 에멀션의 형성을 막기 위해 미정제 오일에 하이드로포빈 또는 이의 유도체를 첨가하는 것이 바람직하다.
이와 관련하여, 연료 또는 가연성 물질을 포함하는 제제는, 본 발명의 명세서 내에서, 통상적으로 이러한 종류의 제제에 존재하는 추가적인 첨가제를 포함할 수 있다.
적절한 첨가제는, 예를 들어, WO 2004/087808에 명시되어 있다.
따라서, 본 발명은 또한 연료, 가연성 물질, 미정제 오일 또는 수용성 또는 지용성 중합체 용액 및 1종 이상의 하이드로포빈 또는 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 제제에 관한 것이다.
사용되는 하이드로포빈 또는 이의 유도체의 양은, 제제가 물과 접촉하게 되는 경우 상 분리에 대한 개선이 확보되는 한, 첨가되는 다른 물질에 따라 다양할 수 있다.
본 발명에 따라, 사용되는 하이드로포빈 또는 이의 유도체의 양은 0.0001∼1,000 ppm, 바람직하게는 0.001∼500 ppm, 특히 바람직하게는 0.01∼100 ppm의 범위가 바람직하다.
따라서 본 발명은 또한, 하이드로포빈 또는 이의 유도체가, 총 제제를 기준으로 하여, 0.0001∼1,000 ppm의 양으로 제제에 포함되는, 전술한 바와 같은 제제에 관한 것이다.
제제가 미정제 오일을 포함하는 혼합물인 경우, 하이드로포빈 또는 이의 유도체가 상기 제제에, 1∼1,000 ppm, 바람직하게는 10∼800 ppm, 특히 10∼500 ppm의 양으로 첨가된다.
제제가 연료 또는 가연성 물질을 포함하는 혼합물인 경우, 하이드로포빈 또는 이의 유도체가 상기 제제에, 0.001∼0.5 ppm, 바람직하게는 0.005∼0.3 ppm, 특히 0.01∼0.2 ppm의 양으로 첨가된다.
따라서, 또 다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 제제가 1종 이상의 연료 또는 가연성 물질을 포함하고 하이드로포빈 또는 이의 유도체가 상기 제제에, 총 제제를 기준으로 하여, 0.001∼0.5 ppm의 양으로 포함되는, 전술한 바와 같은 제제에 관한 것이다.
본 발명의 명세서 내에서, 가연성 물질은, 예를 들어, 빛, 매질 또는 중질난방유(heavy heating oil)인 것으로 이해된다.
본 발명의 명세서 내에서, 연료는, 예를 들어, 가솔린, 디젤 연료 또는 터빈 연료인 것으로 인해된다. 이는 가솔린이 특히 바람직하다.
연료는 추가적인 첨가제를 포함할 수 있다. 당업자는 대체로 통상의 첨가제에 정통해 있다. 적합한 첨가제 및 용매는, 예를 들어, WO 2004/087808에 명시되어 있다.
본 발명에 따라, 세정 효과를 갖거나 및/또는 밸브 시트 마모 억제 효과를 갖는 첨가제(이하 세정 첨가제로 명명)는, 예를 들어, 추가적인 첨가제 성분으로 사용하기에 적절하다. 이러한 세정 첨가제는 하기의 군으로부터 선택되는 1종 이상의 극성 그룹 및 수평균 분자량 Mn이 85∼20,000 g/mol인 1종 이상의 하이드로포빅 탄화수소 잔기를 보유한다:
(a) 1종 이상의 질소 원자가 염기 특성을 보유하는, 최대 6개의 질소 원자를 가지는 모노아미노 또는 폴리아미노 기;
(b) 경우에 따라 히드록실기와 조합한 니트로기;
(c) 1종 이상의 질소 원자가 염기 특성을 보유하는, 모노아미노 또는 폴리아미노 기와 조합한 히드록실기;
(d) 카르복실기 또는 이의 알칼리 금속 또는 알칼리성 토금속 염;
(e) 술폰산 기 또는 이의 알칼리 금속 또는 알칼리성 토금속 염;
(f) 1종 이상의 질소 원자가 염기 특성을 보유하는, 모노아미노 또는 폴리아미노 기, 히드록실기, 또는 카르바메이트기에 의해 종결되는 폴리옥시-C2∼C4-알킬렌 그룹;
(g) 카르복실산 에스테르기;
(h) 히드록실 및/또는 아미노 및/또는 이미도 기를 보유하는 숙신산 무수물-유래 그룹; 및/또는
(i) 모노아민 또는 폴리아민 및 알데히드와 치환 페놀의 만니히(Mannich) 반응에 의해 생성된 기.
잔기가 연료에서 적절한 용해도에 관여하는 상기 세정 첨가제의 하이드로포빅 탄화수소 잔기는 수평균 분자량(Mn)이 85∼20,000, 특히 113∼10,000, 특히 300∼5,000이다. 각각의 경우에 Mn이 300∼5,000, 특히 500∼2,500, 특히 700∼2,300인 폴리프로페닐, 폴리부테닐 및 폴리이소부테닐 잔기는 통상의 하이드로포빅 탄화수소 잔기, 특히 극성 그룹 (a), (c), (h) 및 (i)와 조합하여 고려된다.
하기는 세정 첨가제의 상기 그룹의 예로서 언급될 수 있다:
모노아미노 또는 폴리아미노 기 (a)를 포함하는 첨가제는 폴리프로필렌 또는 Mn이 300∼5,000인 종래의(즉, 주로 중앙에 위치한 이중 결합을 보유하는) 폴리부텐 또는 폴리이소부텐을 기초로 한 폴리알켄 모노아민 또는 폴리알켄 폴리아민이 바람직하다. (대개 베타 및 감마 위치에서) 주로 중앙에 위치한 이중 결합을 갖는 폴리부텐 또는 폴리이소부텐이 첨가제를 제조하기 위한 출발 물질로서 사용된다면, 염소화한 후 아민화함에 의한 또는 카르보닐 또는 카르복실 화합물을 수득하기 위해 이중 결합을 산소 또는 오존으로 산화한 후 환원(수소화) 조건 하에 아민화함에 의한 제조 경로는 그 후 적절하다. 이 경우에, 아민, 에컨대 암모니아, 모노아민 또는 폴리아민, 예컨대 디메틸아미노프로필아민, 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민 또는 테트라에틸렌펜트아민이 아민화에 사용될 수 있다. 폴리프로필렌을 기초로 한 해당 첨가제는, 특히, WO 94/24231에 기술되어 있다.
모노아미노기 (a)를 포함하는 다른 바람직한 첨가제는, 특히, WO 97/03946에 기술된 바와 같이, 산화질소 또는 산화질소 및 산소의 혼합물과 평균 중합화도 P가 5∼100인 폴리이소부텐의 반응으로부터 발생하는 생성물의 수소화 생성물이다.
모노아미노기 (a)를 포함하는 다른 바람직한 첨가제는, 특히, DE-A 196 20 262에 기술된 바와 같이, 아민과 반응한 후 탈수화 및 아민 알코올의 환원에 의해 폴리이소부텐 에폭사이드로부터 얻을 수 있는 화합물이다.
경우에 따라 히드록실기와 조합하여, 니트로기 (b)를 포함하는 첨가제는, 특히, WO 96/03367 및 WO 96/03479에 기술된 바와 같이, 산화질소 또는 산화질소 및 산소의 혼합물과 평균 중합화도 P가 5∼100 또는 10∼100인 폴리이소부텐의 반응으로부터 발생하는 생성물이 바람직하다. 이러한 반응 생성물은 대체로 혼합된 히드록시니트로폴리이소부텐(예를 들어, 알파-니트로-베타-히드록시폴리이소부텐) 및 순수한 니트로폴리이소부텐(예를 들어, 알파, 베타-디니트로폴리이소부텐)의 혼합물이다.
모노아미노 또는 폴리아미노 기와 조합하여 히드록실기 (c)를 포함하는 첨가제는, 특히, EP-A 0 476 485에 기술된 바와 같이, 암모니아 또는 모노아민 또는 폴리아민을 이용한 바람직하게는 주로 말단에 있는 이중 결합을 보유하고 Mn이 300∼5,000인 폴리이소부텐으로부터 얻을 수 있는 폴리이소부텐 에폭사이드의 반응 생성물이다.
카르복실기 또는 이의 알칼리 금속 또는 알칼리성 토금속 (d)을 포함하는 첨가제는 카르복실기가 완전히 또는 부분적으로 반응하여 알칼리 금속 또는 알칼리성 토금속 염을 수득하고 상기 카르복실기의 나머지는 알코올 또는 아민과 반응하는 총 몰질량이 500∼20,000인 말레산 무수물과 C2-C40 올레핀의 공중합체가 바람직하다. 이러한 첨가제는, 특히, EP-A 0 307 815에 기술되어 있다. 이러한 종류의 첨가제는 주로 밸브 시트 마모를 예방하기 위해 사용되며, WO 87/01126에 기술된 바와 같이, 바람직하게는 통상의 연료 세정제 예컨대 폴리(이소)부텐아민 또는 폴리에테르 아민과 병용할 수 있다.
술폰산 기 또는 이의 알칼리 금속 또는 알칼리성 토금속 염 (e)을 포함하는 첨가제는, 예를 들어, EP-A 0 639 632에 기술된 바와 같이, 알킬 술포숙시네이트의 알칼리 금속 또는 알칼리성 토금속 염이 바람직하다.
이러한 종류의 첨가제는 주로 밸브 시트 마모를 예방하기 위해 사용되며, 바람직하게는 통상의 연료 세정제 예컨대 폴리(이소)부텐아민 또는 폴리에테르 아민과 병용할 수 있다.
폴리옥시-C2-C4-알킬렌 그룹 (f)을 포함하는 첨가제는 히드록실기 또는 아미노기 당 1∼30 mol의 산화에틸렌 및/또는 산화프로필렌 및/또는 산화부틸렌과 C2-C60-알칸올, C6-C30-알칸디올, 모노- 또는 디-C2-C30-알킬아민, C1-C30-알킬시클로헥산올 또는 C1-C30-알킬페놀을 반응시키고, 폴리에테르 아민의 경우에는, 그 후 암모니아, 모노아민 또는 폴리아민으로 환원 아민화하여 얻을 수 있는 폴리에테르 또는 폴리에테르 아민이 바람직하다. 이러한 종류의 생성물은, 특히, EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 및 US 4,877,416에 기술되어 있다. 폴리에테르의 경우에, 이러한 생성물은 또한 부유 선광 오일(floatation oil)의 질을 만족시킨다. 이 점에 있어서 통상의 예는 트리데칸올 또는 이소트리데칸올 부톡실레이트, 이소노닐페놀 부톡실레이트 및 폴리이소부텐올 부톡실레이트 및 프로폭실레이트 뿐만 아니라 암모니아와 반응하는 해당 생성물이다.
카르복실산 에스테르 그룹 (g)을 포함하는 첨가제는, 특히 DE-A 38 38 918에 기술된 바와 같이, 장쇄 알칸올 또는 폴리올을 포함하는 모노-, 디- 또는 트리카르복실산의 에스트르, 특히 최소 점도가 100℃에서 2 mm2/s인 것이 바람직하다. 사용될 수 있는 상기 모노-, 디- 또는 트리카르복실산은 지방족 또는 방향족 산이며, 동시에 적절한 에스테르 알코올 또는 폴리올은, 특히, 예를 들어 탄소 원자수가 6∼24인 장쇄 대표물이다. 이소옥탄올의 트리멜리테이트, 아디페이트, 프탈레이트, 이소프탈레이트 및 테레프탈레이트, 이소노난올, 이소데칸올 및 이소트리데칸올은 에스테르의 전형적인 대표물이다. 이러한 종류의 생성물은 또한 부유 선광 오일의 질을 만족시킨다.
히드록실 및/또는 아미노 및/또는 이미도 기를 보유하는 숙신산 무수물-유래 그룹 (h)을 포함하는 첨가제는 가열에 의해 또는 염소화된 폴리이소부텐에 의해 말레산 무수물과 Mn이 300∼5,000인 종래의 또는 고반응성 폴리이소부텐의 반응에 의해 얻을 수 있는 폴리이소부테닐숙신산 무수물의 해당 유도체가 바람직하다. 이와 관련하여 지방족 폴리아민 예컨대 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민 또는 테트라에틸렌펜트아민을 포함하는 유도체가 특히 흥미롭다. 이러한 종류의 가솔린 첨가제는, 특히, US 4,849,572에 기술되어 있다.
모노아민 또는 폴리아민 및 알데히드와 치환 페놀의 만니히 반응에 의해 생성된 기 (i)를 포함하는 첨가제는 포름알데히드 및 모노아민 또는 폴리아민 예컨대 에틸렌디아민, 디에틸렌트트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜트아민 또는 디메틸아미노프로필아민과 폴리이소부텐-치환 페놀의 반응 생성물이 바람직하다. 폴리이소부테닐-치환 페놀은 Mn이 300∼5,000인 종래의 또는 고반응성 폴리이소부텐으로부터 유래될 수 있다. 이러한 종류의 "폴리이소부텐 만니히 염기"는, 특히, EP-A 0 831 141에 기술되어 있다.
기재된 개별 가솔린 첨가제를 더 정확히 한정할 목적으로, 전술한 선행 기술에 대한 문헌의 개시 내용을 참고로 본 명세서에 특별히 인용한다.
이와 관련하여, 상기 첨가제는 특정 분야의 당업자에게 적절하다고 보여지는 양으로 사용된다.
이외에도, 본 발명에 따른 제제는 또한 다른 통상의 성분 및 첨가제와 배합될 수 있다. 임의의 뚜렷한 세정 효과가 없는 부유 선광 오일은 예로써 본 명세서에서 언급될 수 있다.
적절한 부유 선광 광유는 광유 처리 공정과 관련하여 축적되는 유분, 예컨대 브라이트스톡(brightstock), 또는 예를 들어, SN 500-2000 유형과 같은 점도를 가지는 염기 오일; 및 또한 방향족 탄화수소, 파라핀 탄화수소 및 알콕시알칸올이 있다. 제련된 광유와 관련하여 축적되고, "수소화 분해 오일 "(비점이 약 360∼500℃의 범위이고 고압 하에서 촉매적으로 수소화되고 이성질체화되며 또한 탈파라핀화되는 천연 광유로부터 얻을 수 있는 진공 유분(vacuum distillate cut))으로서 알려진 유분은 또한 본 발명에 따라 적절하다. 전술한 부유 선광 광유의 혼합물도 역시 적절하다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 합성 부유 선광 오일의 예는 폴리올레핀(폴리 알파 올레핀 또는 폴리 내부 올레핀), (폴리)에스테르, (폴리)알콕실레이트, 폴리에테르, 지방족 폴리에테르 아민, 알킬페놀-출발 폴리에테르, 알킬페놀-출발 폴리에테르 아민 및 장쇄 알칸올의 카르복실산 에스테르로부터 선택된다.
적절한 올리올레핀의 예는, 특히 (수소화된 또는 비수소화된) 폴리부텐 또는 폴리이소부텐을 기초로 하여 Mn이 400∼1,800인 올레핀 중합체이다.
적절한 폴리에테르 또는 폴리에테르 아민의 예는, 바람직하게는, 히드록실기 또는 아미노기 당 1∼30 mol의 산화에틸렌 및/또는 산화프로필렌 및/또는 산화부틸렌과 C2-C60-알칸올, C6-C30-알칸디올, 모노- 또는 디-C2-C30-알킬아민, C1-C30-알킬시클로헥산올 또는 C1-C30-알킬페놀을 반응시키고, 폴리에테르 아민의 경우에는, 그 후 암모니아, 모노아민 또는 폴리아민으로 환원 아민화하여 얻을 수 있고, 폴리옥시-C2-C4-알킬렌 그룹을 포함하는 화합물이다. 이러한 종류의 생성물은, 특히, EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 및 US 4,877,416에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 폴리에테르아민의 예는 폴리-C2-C6-산화알킬렌 아민, 또는 이의 기능적 유도체이다. 이의 통상의 예는 트리데칸올 또는 이소트리데칸올 부톡실레이트, 이소노닐페놀 부톡실레이트 및 폴리이소부텐올 부톡실레이트 및 프로폭실레이트, 뿐만 아니라 암모니아와의 해당 반응 생성물이다.
장쇄 알칸올의 카르복실산 에스테르의 예는, 특히, DE-A 38 38 918에 기술된 바와 같이, 장쇄 알칸올 또는 폴리올을 포함하는 모노-, 디- 또는 트리카르복실산의 에스트르이다. 사용될 수 있는 상기 모노-, 디- 또는 트리카르복실산은 지방족 또는 방향족 산이며, 동시에 적절한 에스테르 알코올 또는 폴리올은, 특히, 예를 들어 탄소 원자수가 6∼24인 장쇄 대표물이다. 에스테르의 전형적인 대표물은 이소옥탄올의 트리멜리테이트, 아디페이트, 프탈레이트, 이소프탈레이트 및 테레프탈레이트, 이소노난올, 이소데칸올 및 이소트리데칸올, 예를 들어, 디-(n- 또는 이소-트리데실)프탈레이트가 있다.
다른 적절한 부유 선광 시스템의 예는 본 명세서에 참고로 특별히 인용되는, DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074, EP-A 0 452 328 및 EP-A 0 548 617에 기술되어 있다.
특히 적절한 합성 부유 선광 오일의 예는, 예를 들어, 산화프로필렌, 산화 n-부틸렌 및 산화 i-부틸렌 단위, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 C3-C6-산화알킬렌 단위가 약 5∼35개, 예를 들어, 약 5∼30개인 알코올-출발 폴리에테르이다. 적절한 출발 알코올의 비제한적인 예는 장쇄 알킬 라디칼 특히 직쇄 또는 분지쇄 C6-C18 알킬 라디칼을 포함하는, 장쇄 알칸올 또는 장쇄 알킬-치환 페놀이다.
트리데칸올 및 노닐페놀은 바람직한 예로서 언급될 수 있다.
추가적인 적절한 합성 부유 선광 오일은 DE-A 10 102 913.6에 기술된 바와 같은 알콕시화 알킬페놀이다.
이와 관련하여, 상기 첨가제는 특정 분야의 당업자에게 적절하다고 보여지는 양으로 사용된다.
다른 통상의 첨가제는, 예를 들어, 염이 필름을 형성하는 경향이 있는 유기 카르복실산의 암모늄 염을 기초로 하거나, 또는 비철 금속 부식 보호의 경우에 복소환 방향족 화합물을 기초로 하는 부식 억제제; 예를 들어, 아민 예컨대 p-페닐렌디아민, 디시클로헥실아민, 또는 이의 유도체를 기초로 하거나, 또는 폐놀 예컨대 2,4-디-tert-부틸페놀 또는 3,5-디-tert-부틸-4-히드록시페닐프로피온산을 기초로 하는 항산화제 또는 안정제; 추가적인 종래의 해유화제; 대전 방지제; 페로센과 같은 메탈로센; 메틸시클로펜타디엔일 망간 트리카르보닐; 윤활 첨가제 예컨대 특정 지방산, 알케닐숙신산 에스테르, 비스(히드록시알킬)지방 아민, 히드록시아세트아미드 또는 캐스터 오일; 및 또한 염료(마커)이다. 경우에 따라, 연료의 pH를 낮출 목적으로 아민도 역시 첨가된다.
극성 그룹 (a)∼(i)를 함유하는 상기 세정 첨가제는 통상적으로 10∼5,000 중량ppm, 특히 50∼1,000 중량ppm의 양으로 연료에 첨가된다. 언급된 다른 성분 및 첨가제는, 원하는 경우, 본 목적의 통상의 양으로 첨가된다.
본 발명에 따라 적절한 연료 및 가연성 물질은, 예를 들어, 문헌[UIImann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th edtn. 1990, Volume A16, pp. 719ff.]에 기술된 바와 같이, 당업자에게 공지된 임의의 연료 및 가연성 물질, 예를 들어 가솔린이다. 제트 연료 또한 본 발명에 따른 적절한 연료이다.
특히, 방향족 화합물 함량이 최대 60, 예를 들어 최대 42 부피%, 및 황 함량이 최대 2,000, 예를 들어 최대 150 중량ppm인 가솔린이 적절하다.
가솔린의 방향족 화합물 함량은, 예를 들어, 10∼50, 예를 들어 30∼42 부피%, 특히 32∼40 부피%이다. 가솔린의 황 함량은, 예를 들어, 2∼500, 예를 들어 5∼150 중량ppm, 또는 10∼100 중량ppm이다.
또한 적절한 가솔린은, 예를 들어, 올레핀 함량이 최대 50 부피%, 예를 들어 6∼21 부피%, 특히 7∼18 부피%이고, 벤젠 함량이 최대 5 부피%, 예를 들어 0.5∼1.0 부피%, 특히 0.6∼0.9 부피%이며, 및/또는 산소 함량이 최대 25 중량%, 예를 들어 최대 10 중량% 또는 1.0∼2.7 중량%, 특히 1.2∼2.0 중량%일 수 있다.
특히, 예로써, 동시에 방향족 화합물 함량이 최대 38 부피%, 올레핀 함량이 최대 21 부피%, 황 함량이 최대 50 중량ppm, 벤젠 함량이 최대 1.0 부피% 및 산소 함량이 1.0∼2.7 중량%인 가솔린이 언급될 수 있다.
가솔린의 알코올 및 에테르 함량은 광범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 전형적인 최대 함량의 예는 메탄올의 경우 15 부피%, 에탄올의 경우 65 부피%, 이소프로판올의 경우 20 부피%, tert-부탄올의 경우 15 부피%, 이소부탄올의 경우 20 부피% 및 분자 내 탄소 원자수가 5 이상인 에테르의 경우에 30 부피%이다.
본 발명에 따라 적절한 가솔린의 서머(Sommer) 증기압은 통상적으로 최대 70 kPa, 특히 60 kPa(각 경우 37℃)이다.
대체로, 가솔린의 연구 옥탄가(RON)는 75∼105이다. 해당 모터 옥탄가(MON)의 통상 범위는 65∼95이다.
상기 세부 사항은 통상의 방법(DIN EN 228)을 이용하여 측정된다.
하기 실시예를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명하고자 한다.
실시예 1
yaad-His 6 /yaaE-His 6 의 클로닝을 위한 예비 작업
올리고뉴클레오티드 Hal570 및 Hal571(Hal 572/Hal 573)을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 이용된 주형 DNA는 박테리아 바실러스 섭틸리스의 게놈 DNA였다. 얻어진 PCR 단편은 바실러스 섭틸리스 yaaD/yaaE 유전자의 코딩 서열과, 각각의 경우에 그 말단에 위치한 NcoI 및 BglII 제한 절단 부위를 포함하였다. 상기 PCR 단편을 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BglII로 절단하였다. 이 DNA 단편을 삽입체로 사용하여, 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BglII로 미리 선형화한 벡터 pQE60으로 클로닝하였다. 이와 같이 하여 얻은 벡터 pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5를 각각 YAAD::HIS6 및 YAAE::HIS6로 구성된 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
실시예 2
yaad 하이드로포빈 DewA-His 6 의 클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM 416 및 KaM 417을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 이용된 주형 DNA는 아스퍼질러스 니둘란스의 게놈 DNA였다. 얻어진 PCR 단편은 하이드로포빈 유전자 dewA의 코딩 서열 및 N-말단의 Xa 인자 프로테인아제 절단 부위를 포함하였다. 이 PCR 단편을 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 절단하였다. 이 DNA 단편을 삽입체로 사용하여, 제한 엔도뉴클레아제 BglII로 미리 선형화한 pQE60YAAD#2 벡터로 클로닝하였다.
이와 같이 하여 얻은 벡터 #508은 YAAD::Xa::dewA::HIS6로 구성된 융합 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
실시예 3
yaad 하이드로포빈 RodA-His 6 의 클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM 434 및 KaM 435를 이용하여, 플라스미드 #513을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
실시예 4
yaad 하이드로포빈 BASF1-His 6 의 클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 이용하여, 플라스미드 #507을 플 라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.
이용된 주형 DNA는 인공적으로 합성된 DNA 서열, 즉, 하이드로포빈 BASF1이었다(첨부물 서열 번호 11 및 12 참조).
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
실시예 5
yaad 하이드로포빈 BASF2-His 6 의 클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 이용하여, 플라스미드 #506을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 이용된 주형 DNA는 인공적으로 합성된 DNA 서열, 즉, 하이드로포빈 BASF2(첨부물 서열 번호 13 및 14 참조)였다.
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
실시예 6
yaad 하이드로포빈 SC3-His 6 의 클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM464 및 KaM465를 이용하여, 플라스미드 #526을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.
이용된 주형 DNA는 스키조필럼 커뮨 cDNA였다(첨부물 서열 번호 9 및 10 참조).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
실시예 7
재조합 이. 콜라이 균주 yaad 하이드로포빈 DewA-His 6 의 발효
15 ㎖ 그라이너 튜브에서, LB 액상 배지 3 ㎖에, yaad 하이드로포빈 DewA-His6를 발현하는 이. 콜라이 균주를 접종하였다. 37℃, 200 rpm의 진탕기에서 8시간 동안 배양하였다. 각 경우, 배플이 구비되어 있고 LB 배지(100 ㎍/㎖의 암피실린 함유) 250 ㎖를 포함한 2개의 1 ℓ 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에, 사전 배양물 1 ㎖를 접종하여, 37℃, 180 rpm의 진탕기에서 9시간 동안 배양하였다.
20 ℓ 용량의 발효기에서, LB 배지(100 ㎍/㎖의 암피실린 함유) 13.5 ℓ에, 사전 배양물 0.5 ℓ(OD600 nm 1:10, H2O에 대하여 측정)를 접종하였다. OD60 nm 약 3.5에서 100 mM IPTG 140 ㎖를 첨가하였다. 3시간 후, 발효기를 10℃로 냉각시키고, 원심분리로 발효액을 제거하였다. 세포 펠릿을 추가 정제에 사용하였다.
실시예 8
재조합 하이드로포빈 융합 단백질의 정제
(C-말단 His 6 태그를 보유하는 하이드로포빈 융합 단백질의 정제)
세포 펠릿 100 g(하이드로포빈 100∼500 mg)에, 총 부피 200 ㎖가 되도록 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5)을 첨가하여 재현탁시켰다. 이 현탁액을 울트라투락스(Ultraturrax) 타입 T25(Janke and Kunkel; IKA-Labortechnik)로 10분 동안 처리하고, 이어서 핵산의 분해를 위해, 벤조나제(Merck, Darmstadt; 주문 번호 1.01697.0001) 500 유닛과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 파괴하기 전에, 유리 카트리지(P1)를 사용하여 여과를 행하였다. 세포 파괴와 잔류 게놈 DNA의 전단을 위해, 1500　바에서 균질화기를 이용한 처리를 2회 행하였다(Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). 균질물을 원심분리하고(Sorvall RC-5B, GSA 로터, 250 ㎖ 원심분리용 비커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000　g), 상청액을 얼음 위에 놓고, 펠릿을 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 100 ㎖에 재현탁시켰다. 원심분리 및 재현탁은 3회 반복하였으며, 3 회차에 사용된 인산나트륨 완충액은 1% SDS를 포함하였다. 재현탁 후, 상기 용액을 1시간 동안 교반하고, 이어서 최종 원심분리(Sorvall RC-5B, GSA 로터, 250 ㎖ 원심분리용 비커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000 g)를 행하였다. SDS-PAGE 분석에 의하면, 하이드로포빈은 최종 원심분리 후 상청액에 존재하였다(도 1). 이 실험은 하이드로포빈이 해당 이. 콜라이 세포 내에 아마도 봉입체 형태로 존재함을 보여준다. 하이드로포빈 함유 상청액 50 ㎖를, 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 평형화시킨 50　㎖ 니켈-세파로스 고성능 17-5268-02 컬럼(Amersham)에 적용하였다. 이 컬럼을 50　mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 세척하고, 그 후 하이드로포빈을 200 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 용출시켰다. 이미다졸의 제거를 위해, 용액을 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)에 대해 투석하였다.
도 1은 제조된 하이드로포빈의 정제 상태를 도시한다:
레인 A: 니켈-세파로스 컬럼에 적용된 용액(1:10 희석)
레인 B: 통과액(flow-through) = 세척 단계의 용출액
레인 C∼E: 용출 분획(WP1, WP2, WP3)의 OD280 최대값
레인 F는 사용 마커를 나타낸다.
도 1의 하이드로포빈은 분자량이 약 53 kD이었다. 작은 밴드 중 몇 개는 하이드로포빈의 분해 생성물을 나타낸다.
실시예 9
성능 테스트: 유리 위 물방울의 접촉각 변화에 의한 하이드로포빈의 특성 분석
기재:
유리(창문 유리, 독일 만하임 소재의 Sueddeutsche Glas):
실시예 8에 기술된 바와 같이 정제된 하이드로포빈을 사용하였다.
- 용액 중 하이드로포빈 농도: 100 ㎍/㎖, 상기 용액은 추가로 50 mM 아세트산나트륨 및 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트(Tween® 20)(용액 pH 4)를 포함하였다.
- 유리 슬라이드를 밤새 상기 용액에 이머싱(immersing)하였다(온도 80℃).
- 이어서 하이드로포빈 코팅을 포함하는 유리 슬라이드를 용액으로부터 회수하고 증류수로 세척하였다.
- 그 후, 80℃에서 증류수 중의 1 중량% SDS 용액에서 10분 동안 항온처리하였다.
- 증류수로 다시 세척하였다.
- 그 후, 80℃에서 증류수 중의 1 중량% SDS 용액에서 10분 동안 항온처리하였다.
- 증류수로 다시 세척하였다.
샘플을 공기 건조시키고, 실온에서 코팅된 유리 표면과 5 ㎕ 물방울의 접촉각(단위: ˚)을 측정하였다.
접촉각 측정은 장치, Dataphysics Contact Angle System OCA 15+에서 소프트웨어 SCA 20.2.0.(2002년 11월)을 사용하여 행하였다. 측정은 제조업자의 설명서에 따라 행하였다.
미처리 유리의 경우 접촉각이 30±5˚였다.
실시예 8에 따른 하이드로포빈(yaad-dewA-his6)으로 코팅된 유리 슬라이드의 경우 접촉각이 75±5˚였다.
==> 접촉각의 증가도: 45˚
실시예 10
연료 내 첨가제로서의 하이드로포빈 농축물(yaad-Xa-dewA-his 6 )의 이용
실험 원리:
최신 연료는 통상 다수의 다른 첨가제(첨가제 패키지로 명명되는 것)를 포함한다. 이의 생산 또는 판로 과정 중에, 연료가 물과 접촉하게 되는 경우, 이러한 첨가제는 유화 효과를 나타낼 수 있고 원하지 않은 연료-물 에멀션의 형성을 유도할 수 있다. 이러한 결과를 방지하기 위하여, 해유화제는 따라서 통상적으로 연료 에 첨가된다.
실시예 8(서열 번호 19 및 20)에 기술된 바와 같은 하이드로포빈 농축액을 사용하여 해유화제 실험을 행하였다.
하이드로포빈 농축액을 에탄올로 희석하였고 이미 특정 성능 첨가제 패키지 A/kg 725 mg을 포함하는 시판되는 (EN 228에 따른) Eurosuper fuel에 첨가하였다. 이러한 첨가제 패키지는 대체로 폴리이소부텐아민 Kerocom PIBA, 부유 선광 오일 혼합물, 용매, 부식 억제제 및 마찰 개질제를 포함한다.
하이드로포빈 0.01, 0.03, 0.05, 0.07, 0.14 및 0.28 mg을 포함하는 연료 샘플을 제조하였다. A만이 첨가되고, 하이드로포빈을 함유하지 않는 연료는 참조예(10-V1)로 하였다. 또 다른 비교 실험예(10-V2)로서는, 페놀 수지(ADX 606, Lubrizol사)를 기초로 한 시판되는 해유화제 D 1.45 mg/kg을 사용하였다.
DIN 51415에 따라 각각의 연료 샘플을 이용하여 에멀션 테스트를 행하였다. 이와 관련하여, 각 경우 연료 80 ml 및 물 20 ml를 서로 완전히 혼합하였다. 이어서, 종속 상태로 해혼합 공정을 제때에 관찰하였다. 분석은, 1은 매우 우수한 해혼합을 나타내고 더 큰 수는 점점 더 열등한 해혼합을 나타내는 기준으로 미리 셋팅된 표준 기법을 이용하여 수행하였다. 상세한 설명은 인용된 DIN 기준에 나타나 있다.
하기 표 1은 실험에서 관찰된 결과를 요약하고 있다. 하기 표는 각 경우 1분, 5분, 30분 및 60분 후에 이루어진 상 분리 층의 평가를 기재하고 있다. 대체로, 5분 후의 1 또는 1b 평가가 요구된다.
No. 1분 5분 30분 60분
10-V1 (비교예) A 4 4 2 1b
10-V2 (비교예) A + D 1.45 mg/kg 1b 1 1 1
10-1 A + H. 0.01 mg/kg 1b 1 1 1
10-2 A + H. 0.03 mg/kg 1b 1 1 1
10-3 A + H. 0.05 mg/kg 1b 1 1 1
10-4 A + H. 0.07 mg/kg 1b 1 1 1
10-5 A + H. 0.14 mg/kg 1b 1 1 1
10-6 A + H. 0.28 mg/kg 1 1 1 1
주석: 해유화제가 첨가되지 않은 경우에는 매우 느린 해유화만이 관찰된다. 4 평가는 허용할 수 없으며, 안정한 에멀션이 형성된다.
하이드로포빈은 극히 소량으로 존재하는 경우 매우 우수한 해유화 효과를 나타낸다. 0.01 ppm의 하이드로포빈은 1분 이내에 허용가능한 결과를 유도하는 데 충분하다. 0.07 mg/kg의 하이드로포빈으로 실현되는 바와 같은 동일한 효과를 달성하기 위하여 페놀 수지를 기초로 하는 시판되는 해유화제 1.45 mg을 각 연료(kg)에 첨가하여야 한다. 결과적으로, 하이드로포빈이 사용되는 경우, 종래의 해유화제의 약 1/20의 양만이 동일한 효과를 달성하기 위해 요구된다.
비교 실험예 11
연료 내 첨가제로서 다른 단백질의 이용
실시예 10과 유사한 연료 내 사용을 위해 비하이드로포빈 단백질을 테스트하였다.
우혈청 알부민(BSA) 및 카세인을 사용하여 본 실험을 행하였다. 이러한 단백질은 시판되고 있다. 서열 번호 15 및 16에 나타낸 바와 같은 yaad, 즉, 하이드로포빈에 연결되지 않은 그 자체의 융합 파트너를 또한 사용하였다.
각각의 단백질을, 0.07 mg/kg의 농도로, 이미 전술한 성능 첨가제 패키지 A/kg 1,000 mg을 포함하는 시판되는 (EN 228에 따른) Eurosuper fuel에 첨가하였다. 단백질이 아닌, A만이 첨가되는 연료를 참고예로 하였다.
전술한 바와 같이, DIN 51415에 따라 각 경우에 에멀션 테스트를 행하였다.
No. 1분 5분 30분 60분
11-V3 (비교예) A 4 4 2 1b
11-1 A + BSA 0.07 mg/kg 2 1 1 1
11-2 A + yaad 0.07 mg/kg 3 1 1 1
11-2 A + 카세인 0.07 mg/kg 3 1b 1 1
주석: 해유화제의 첨가 없이는, 에멀션 분리는 단지 실시예 10에서와 같이 느리게 진행한다. 4 평가는 허용할 수 없으며, 안정한 에멀션이 형성된다. 사용되는 단백질이 해유화 효과를 나타낼지라도, 해유화의 비율은 하이드로포빈을 이용하는 경우보다 더 낮다.
실시예 12
미정제 오일용 에멀션 분해제로서 하이드로포빈 농축물(Yaad-Xa-dewA-His 6 )의 이용
실시예 8(서열 번호 19 및 20)에 기술된 바와 같은 하이드로포빈 농축물을 사용하여 본 실험을 행하였다.
수행하는 본 실험에서, 다양한 양의 하이드로포빈 농축물을 50 ml 미정제 오일(샘플 예 엠리히하임(Emlichheim) 소재의 Wintershall AG사, 웰 301; 종래 해유화제를 사용한 후의 잔류수 함량, 약 3%)에 첨가하였다. 상기 미정제 오일 내 하이드로포빈의 농축물은 1 ppm, 10 ppm 및 40 ppm이었다. 균질화 후, 2,000 rpm에서 혼합물을 10분 동안 원심분리하였다. 이 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
하이드로포빈 첨가량 유리수 상 에멀션 상
무첨가 0.4% 2.4%
1 ppm 0.8% 2.0%
10 ppm 2.4% 0.4%
40 ppm 2.4% 0.4%
하이드로포빈 농축물 10 및 40 ppm을 첨가한 후, 유리수 상은 주 성분을 형성하였다.
실시예 13
중합체를 분별하기 위한 하이드로포빈 농축물(Yaad-Xa-dewA-His 6 )의 이용
실시예 8(서열 번호 19 및 20)에 기술된 바와 같은 하이드로포빈 농축물을 사용하여 본 실험을 행하였다.
각각의 경우에, 이소프로판올 75 g을 첨가한 후 2개의 유리 비커 내로 폴리아크릴산 150 g을 나트륨 염(DE 199 50 941 A1에 따른, Sokalan® CP 10 S; Mw 4,000 g/mol)의 형태로 최초 도입하였다. 각 경우에, 이소프로판올/물(1:1 비) 146 g을 첨가하고 혼합물을 5분 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 5분 동안 교반하였다.
하이드로포빈(1.64 m, 11.3 mg/ml) 50 ppm을 유리 비커 A에 첨가하고 이 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 하이드로포빈은 투명 용액에서 백색 스트리크(streak)를 생성하였으며 그 후 이 스트리크는 5분 후에 완전히 용해되었다. 50% NaOH 19.75 g을 양 유리 비커에 첨가하였으며 이 혼합물을 50분 동안 교반하였다.
첨가된 하이드로포빈의 부존 하에서는 매우 불투명한 용액을 형성하는 반면, 하이드로포빈의 존재 하에서는 유백색 용액을 즉시 형성하였다. 교반 시간 15분 후, 각 경우에 유리 비커의 내용물을, 깔때기를 간단히 교반한 후, 500 ml 분리 깔때기에 이송하였고, 상이 분리되는 데 소모되는 시간 길이를 측정하기 위해 관찰하였다.
하이드로포빈을 포함하는 샘플의 경우, 첨가되는 하이드로포빈의 부존 하에 10분 후 투명 상 분리를 나타내었고, 발포성 "매개층"이 최초 형성되었다(즉, 투명 상 경계가 형성되지 않았다). 첨가되는 하이드로포빈의 부존 하에, 투명 상 경계는 40분 후에만 형성되었다.
상 경계가 뚜렷하게 나타날 때까지의 분리 시간
- 하이드로포빈 첨가: 12분
- 하이드로포빈 무첨가: 40분
실시예 14, 비교예 15
55℃에서 수중유형 에멀션용 해유화제로서 하이드로포빈 융합체( Yaad - Xa -dewA-His 6 ) 및 우혈청 알부민( BSA )의 사용
실시예 8(서열 번호 19 및 20)에 기술된 바와 같은 하이드로포빈 농축물을 사용할 뿐만 아니라 시판되는 우혈청 알부민(BSA) 용액을 사용하여 본 실험을 행하였다.
하기와 같이 해유화제 능력을 테스트하였다:
사용된 오일은 유압유였다.
40 ml 증류수를 100 ml 측정용 실린더에 최초 도입하였고 관련 단백질을 물을 기초로 하여 5 ppm의 양으로 또는 총 시스템을 기초로 하여 2.5 ppm의 양으로 첨가하였다. 그 후 40 ml 유압유를 첨가하였고 시스템을 수조에서 55℃로 평형화하였다. 온도 평형 시간은 20분이었다. 이어서, 오일 및 물을 1,500 rpm에서 블레이드 혼합기를 사용하여 5분 동안 유화하였다. 이는 수상 중의 오일을 유화하였다. 그 후, 상의 분리가 관찰되었다. 각 경우에, 다시 분리된 수상의 양을 ml로 나타내었다.
제1 실험 시리즈에서, 2종의 단백질로 구성된 수용액을 변화시키지 않고 사용하였다. 그 결과는 그래프 1에 도시하였다.
제2 실험 시리즈에서, 먼저 2종의 단백질 용액을 RT에서 HCl을 사용하여 pH 1로 조절한 후 pH 1에서 24시간 동안 방치하였다. 이어서, 이를 NaOH를 사용하여 다시 한 번 pH 7로 조절하였다. 그 결과는 그래프 2에 도시하였다.
그래프 1
Figure 112007077849837-PCT00001
그래프 2
Figure 112007077849837-PCT00002
주석:
BSA는 단지 해유화제가 없는 샘플과 비교하여 볼 때 사소한 정도로 수중유형 에멀션의 해유화의 비율을 개선한다. 반면, 하이드로포빈을 첨가한 경우에는 매우 현저한 해유화의 가속화가 관찰된다.
SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Verwendung von Proteinen als Demulgatoren <130> AE 200500040 <160> 24 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 405 <212> DNA <213> basf-dewA <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <223> <400> 1 atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48 Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96 Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30 gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144 Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45 atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192 Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60 agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80 ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288 Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu 85 90 95 gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc 336 Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val 100 105 110 gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384 Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125 ggc gct ggt acc aag gct gag 405 Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135 <210> 2 <211> 135 <212> PRT <213> basf-dewA <400> 2 Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30 Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45 Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80 Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu 85 90 95 Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val 100 105 110 Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125 Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135 <210> 3 <211> 471 <212> DNA <213> basf-rodA <220> <221> CDS <222> (1)..(471) <223> <400> 3 atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48 Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96 Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30 ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144 Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45 acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct 192 Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser 50 55 60 tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240 Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80 ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt 288 Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly 85 90 95 gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct 336 Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala 100 105 110 gtc ctc att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac 384 Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn 115 120 125 att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att 432 Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile 130 135 140 ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc 471 Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155 <210> 4 <211> 157 <212> PRT <213> basf-rodA <400> 4 Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30 Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45 Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser 50 55 60 Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80 Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly 85 90 95 Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala 100 105 110 Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn 115 120 125 Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile 130 135 140 Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155 <210> 5 <211> 336 <212> DNA <213> basf-HypA <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> <400> 5 atg atc tct cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt 48 Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 gtt act gca act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc agc agt cag tgc 96 Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys 20 25 30 gac gtc ggt gaa atc cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144 Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His 35 40 45 acc agc gcc gcc gcg tct ggt ttg ctt ggt gtt ccc atc aac ctt ggt 192 Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly 50 55 60 gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt 240 Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80 ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc 288 Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe 85 90 95 acc gca ttg att aac gct ctt gac tgc tct cct gtc aat gtc aac ctc 336 Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 110 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> basf-HypA <400> 6 Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys 20 25 30 Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His 35 40 45 Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly 50 55 60 Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80 Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe 85 90 95 Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 110 <210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> basf-HypB <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> <400> 7 atg gtc agc acg ttc atc act gtc gca aag acc ctt ctc gtc gcg ctc 48 Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 ctc ttc gtc aat atc aat atc gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag 96 Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys 20 25 30 cat tgt agc acc ggt cct atc gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct 144 His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser 35 40 45 aag agc cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192 Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu 50 55 60 ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc agc cct 240 Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 75 80 atc acg gca att ggt att ggc tcc ggc agc caa tgc tct ggc cag acc 288 Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr 85 90 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att ttg ccg ggc ggt 144 Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly 35 40 45 gag agc acg acg atg cgc cgt ttg atc gat acg tat caa ttc atg gag 192 Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu 50 55 60 ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt 240 Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80 gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288 Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro 85 90 95 cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336 His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg 100 105 110 cag gtt gac agc ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384 Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu 115 120 125 cct ttt act ggg gta ttc atc cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt 432 Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly 130 135 140 gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt 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tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc gcg gcc ctc cct 960 Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt ggc aac aag ggc 1008 Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335 aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc aag cag 1056 Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln 340 345 350 gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc aac aag 1104 Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365 gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt ctg tct 1152 Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380 ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa ggt ctt 1200 Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400 ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc att ggc 1248 Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly 405 410 415 atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc 1296 Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430 cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt ctc 1344 Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445 cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc gga tct cat cac cat cac cat 1392 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460 cac 1395 His 465 <210> 22 <211> 465 <212> PRT <213> basf-yaad-Xa-rodA-his <400> 22 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335 Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln 340 345 350 Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365 Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380 Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400 Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly 405 410 415 Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430 Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460 His 465 <210> 23 <211> 1407 <212> DNA <213> basf-yaad-Xa-BASF1-his <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <223> <400> 23 atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct 960 Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc 1008 Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335 cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc 1056 Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly 340 345 350 gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc gac 1104 Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365 gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc ctc aag aac 1152 Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380 ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc ttc gac cag 1200 Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln 385 390 395 400 tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc cct atc cag 1248 Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln 405 410 415 gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc 1296 Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 420 425 430 tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 1344 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445 ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tct cat 1392 Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460 cac cat cac cat cac 1407 His His His His His 465 <210> 24 <211> 469 <212> PRT <213> basf-yaad-Xa-BASF1-his <400> 24 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335 Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly 340 345 350 Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365 Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380 Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln 385 390 395 400 Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln 405 410 415 Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 420 425 430 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445 Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460 His His His His His 465

Claims (23)

  1. 2 이상의 액상을 포함하는 조성물에서 상 분리를 개선하기 위한 1종 이상의 하이드로포빈의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 하이드로포빈은 해유화제로서 사용되는 것인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1종 이상의 하이드로포빈은 하이드로포빈 융합체인 용도.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하이드로포빈 융합체는 yaad-Xa-dewA-his(서열 번호 20), yaad-Xa-rodA-his(서열 번호 22) 및 yaad-Xa-basf1-his(서열 번호 24)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, yaad는 또한 20∼293개의 아미노산을 가지는 절두형(truncated) 융합 파트너 yaad'일 수 있는 것인 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2 이상의 액상을 포함하는 상기 조성물은
    - 오일 및 물을 포함하는 조성물,
    - 연료 또는 가연성 물질 및 물을 포함하는 조성물,
    - 2 이상의 액상을 포함하는 반응 혼합물
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 하이드로포빈은, 총 조성물을 기준으로 하여, 0.0001∼1,000 ppm의 양으로 사용되는 것인 용도.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 미정제 오일-물 조성물이고, 상기 1종 이상의 하이드로포빈은, 총 조성물을 기준으로 하여, 1∼800 ppm의 양으로 사용되는 것인 용도.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 연료/가연성 물질-물 조성물이고, 상기 1종 이상의 하이드로포빈은, 총 조성물을 기준으로 하여, 0.001∼10 ppm의 양으로 사용되는 것인 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 하이드로포빈 이외에도 상 분리를 개선시키는 1종 이상의 추가 화합물을 사용하는 것인 용도.
  10. 2 이상의 액상을 포함하는 조성물에서 2 이상의 액상을 분리하는 방법으로서, 상기 조성물에 1종 이상의 하이드로포빈을 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 1종 이상의 하이드로포빈은 하이드로포빈 융합체 또는 이의 유도체인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 하이드로포빈 융합체는 yaad-Xa-dewA-his(서열 번호 20), yaad-Xa-rodA-his(서열 번호 22) 및 yaad-Xa-basf1-his(서열 번호 24)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, yaad는 또한 20∼293개의 아미노산을 가지는 절두형 융합 파트너 yaad'일 수 있는 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 2 이상의 액상을 포함하는 상기 조성물은
    - 오일 및 물을 포함하는 조성물,
    - 연료 또는 가연성 물질 및 물을 포함하는 조성물,
    - 2 이상의 액상을 포함하는 반응 혼합물
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 하이드로포빈은, 총 조성물을 기준으로 하여, 0.0001∼1,000 ppm의 양으로 사용되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 미정제 오일-물 조성물이고 상기 1종 이상의 하이드로포빈은, 총 조성물을 기준으로 하여, 1∼800 ppm의 양으로 사용되는 것 인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 연료/가연성 물질-물 조성물이고, 상기 1종 이상의 하이드로포빈은, 총 조성물을 기준으로 하여, 0.001∼10 ppm의 양으로 사용되는 것인 방법.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 하이드로포빈을 첨가하기 전 또는 후에 2 이상의 액상을 포함하는 상기 조성물의 온도를 증가시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 연료, 가연성 물질, 미정제 오일 또는 수용성 또는 지용성 중합체 용액 및 1종 이상의 하이드로포빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 하이드로포빈은, 총 제제를 기준으로 하여, 0.0001∼1,000 ppm의 양으로 상기 제제에 포함되는 것인 제제.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 제제는 1종 이상의 연료 또는 가연성 물질을 포함하고, 상기 하이드로포빈 또는 이의 유도체는, 총 제제를 기준으로 하여, 0.001∼0.5 ppm의 양으로 상기 제제에 포함되는 것인 제제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 연료 또는 가연성 물질은 가솔린, 디젤 연료 및 터빈 연료로 구성된 군으로부터 선택되는 연료인 제제.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 단백질은 하이드로포빈 융합체 또는 이의 유도체인 제제.
  23. 제22항에 있어서, 상기 하이드로포빈 융합체는 yaad-Xa-dewA-his(서열 번호 20), yaad-Xa-rodA-his(서열 번호 22) 및 yaad-Xa-basf1-his(서열 번호 24)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, yaad는 또한 20∼293개의 아미노산을 가지는 절두형 융합 파트너 yaad'일 수 있는 것인 제제.
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